WO2010130864A1 - Retrotranscriptasa del vih-1 de grupo o modificada - Google Patents

Retrotranscriptasa del vih-1 de grupo o modificada Download PDF

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WO2010130864A1
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retrotranscriptase
amino acid
nucleic acid
acid sequence
seq
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Luis MENÉNDEZ ARIAS
Tania Matamoros Grande
Mª del Mar ÁLVAREZ GARCÍA
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses

Definitions

  • the present invention falls within the field of biotechnology. More specifically, it refers to isolated retrotranscriptases of a human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) of group O and modified that have high fidelity of copy and thermostability, as well as its use to carry out the back transcription, amplification or sequencing of a template nucleic acid.
  • the invention also relates to a method for obtaining said retrotranscriptases.
  • RT retrotranscriptase
  • reverse transcriptase The enzyme responsible for the replication of the genome of retroviruses.
  • This enzyme converts the single stranded genomic RNA into double stranded DNA capable of integrating into the genome of the host cell [reviewed by Telesnitsky and Goff. In Retroviruses. Coffin et al. (ed.), p. 121-160, CoId Spring Harbor Lab. Press, Plainview USA, 1997]. It is a polymerase capable of synthesizing DNA, using RNA or DNA as a template, interchangeably.
  • RT has endonuclease activity (RNase H), which allows the RNA template to be degraded during the RNA-dependent DNA synthesis process.
  • retrovirus RTs are useful enzymes for obtaining complementary DNA (cDNA) from messenger RNA, which once amplified by conventional techniques [polymerase chain reaction (PCR), for example] can be used to detect gene expression in organisms or tissues. From cDNA libraries it is possible to select gene transcripts that once amplified by PCR can be cloned into plasmids or viral vectors. For these applications it is interesting to have RTs that have greater thermal stability, that is, to retain polymerase activity at relatively high temperatures, since under these conditions the secondary structure levels in the RNA and It would improve the amplification process.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RTs are enzymes that lack exonuclease activity and therefore, are polymerases with a relatively high error rate, so an increase in their fidelity would be desirable if what is intended is to clone products derived from the generated cDNA during the retrotranscription.
  • RTs from various retroviruses have been isolated and purified.
  • AMV bird myeloblastosis virus
  • MMV Moloney virus of the mouse leukemia
  • Virus Res 2008; 134: 186-202 of the equine infectious anemia virus (EIAV), of the feline immunodeficiency virus (IVF), of the bovine immunodeficiency virus (BIV), of the mouse mammary tumor virus (MMTV), of the bovine leukemia virus (BLV), and of foam-retrovirus (reviewed in Hizi and Herschhorn. Virus Res 2008; 134: 203-220); in addition to the RTs of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and type 2 (HIV-2) and simian immunodeficiency (SIV).
  • HMV-1 human immunodeficiency virus type 1
  • HV-2 type 2
  • SIV simian immunodeficiency
  • the most commercially used RTs in amplification reactions are those of MLV, AMV and HIV-1.
  • the reference enzyme in this type of analysis is a "wild-type" variant, which is phylogenetically classified as belonging to subtype B (group M).
  • the HIV-1 RT (subtype B) is more stable than the MLV RT at temperatures above 45 or V "and.
  • the furthest are those belonging to the O group, which are characterized by having about 20% different amino acids when compared with prototype "wild-type" sequences of subtype B (Qui ⁇ ones-Mateu et al.
  • Group O "wild-type" RTs are naturally resistant to nevirapine and other non-nucleoside-like inhibitors and present greater stability in the presence of urea than subtype B RTs (Menéndez-Arias et al. J. Biol. Chem. 2001; 276: 27470-27479). However, its expression and purification is difficult due to the poor performance of the procedures described to date.
  • RTs obtained by directed mutagenesis have allowed us to study the role of different amino acid changes on copy fidelity, as well as the inactivation of the RNase H activity of the HIV-1 RT (subtype B).
  • the context of the sequence has proven to be of great importance (Taube et al. Eur. J. Biochem. 1997; 250: 106-114), so it seems unlikely that a mutation analyzed in the RT of HIV- 1 subtype B can exert the same effect in a variant of HIV-1 phylogenetically remote as the RT of HIV-1 of group O.
  • the present invention relates to retrotranscriptases (RTs) isolated from a virus of human immunodeficiency type 1 (HIV-1) of group O and modified that have a high fidelity of copy and thermostability, as well as its use to carry out Ia retrotranscription, amplification or sequencing of a template nucleic acid.
  • RTs retrotranscriptases isolated from a virus of human immunodeficiency type 1 (HIV-1) of group O and modified that have a high fidelity of copy and thermostability, as well as its use to carry out Ia retrotranscription, amplification or sequencing of a template nucleic acid.
  • HIV-1 human immunodeficiency type 1
  • the invention also relates to a method for obtaining said RTs.
  • Retrovirus RTs are useful enzymes, for example, for obtaining complementary DNA from messenger RNA, which once amplified can be cloned into a vector. It is desirable that the RTs used for this purpose have high thermal stability, since under these conditions the levels of secondary structure in the RNA would decrease and the amplification process would improve. However, RTs are enzymes that lack error-correcting exonuclease activity and therefore have a relatively high error rate, so an increase in their fidelity would be desirable in order to be used for this purpose.
  • mutants of an isolated RT of a group O HIV-1 (group O HIV-1 RT) whose p66 subunit has been modified by replacing the valine 75 with isoleucine (mutation V75I) are described ), so that an increase in its fidelity of copy is observed with respect to that of the unmodified RT.
  • group O HIV-1 RTs carrying this mutation have higher copy fidelity and thermostability than the RTs present in isolates or strains of group M HIV-1 subtype B (HIV-1 RT subtype B), currently employed for the same purpose.
  • the V75I mutation in the RT of group O HIV-1 leads to a loss of thermostability with respect to the unmodified RT.
  • a second amino acid change (mutation) consisting in the replacement of glutamic acid of position 478 of the p66 subunit by glutamine allows to increase its thermostability with respect to the RT that only presents The V75I mutation. Therefore, the present invention provides RTs with high thermostability and fidelity of copy, appropriate to carry out the retrotranscription, amplification or sequencing of a template nucleic acid.
  • a first aspect of the present invention relates to a modified group O HIV-1 RT comprising an amino acid sequence that has a mutation that modifies said amino acid sequence in the residue corresponding to position 75 of SEQ ID NO : 1, in which the modified RT has an increased copy fidelity, in relation to the corresponding unmodified RT.
  • said RT comprises an amino acid sequence that has a mutation so that the residue corresponding to position 75 of SEQ ID NO: 1 of this amino acid sequence is isoleucine.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to an RT of the modified group O HIV-1, which comprises an amino acid sequence, mutated as described above, and which also has another mutation that modifies said amino acid sequence in the residue corresponding to position 478 of SEQ ID NO: 1, in which the modified RT has an increased thermostability in relation to the modified RT in the residue corresponding to position 75 of SEQ ID NO: 1.
  • said RT comprises an amino acid sequence that has a mutation so that the residue corresponding to position 478 of SEQ ID NO: 1 of this amino acid sequence is glutamine.
  • RT of the invention refers to a modified RT according to any of the characteristics described above in this description.
  • the amino acid sequence comprised by the RT of the invention has an identity of at least 90%, more preferably, of at least 95% and, even more preferably, of at least 98% with SEQ ID NO: 1.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a modified group O HIV-1 RT comprising SEQ ID NO: 2.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a modified group O HIV-1 RT comprising SEQ ID NO: 3.
  • HIV-1 and HIV-2 Human immunodeficiency viruses
  • retroviridae Retrovirus
  • HIV-1 has been classified into three groups: M, O and N.
  • At least 10 AK subtypes are known from the M group, in addition to multiple recombinants of these subtypes (Buonaguro et al. J. Virol 2007; 81: 10209-10219; Ram ⁇ rez et al. Virus Res. 2008; 134: 64-73).
  • HIV-1 group O The first isolate of HIV-1 group O was obtained from infected patients in 1987, and its nucleotide sequence was published three years later (De Leys et al. J. Virol. 1990; 64: 1207-1216).
  • variants of HIV-1 group O for example, strain MVP5180 / 91
  • NIH AIDS Research & Reference Reagent Program http://www.aidsreagent.org
  • the HIV-1 RT is a multifunctional enzyme that exhibits RNA and DNA-dependent DNA polymerase activities and endonuclease or ribonuclease H (RNase H) activity. It is a heterodimer consisting of two subunits, called p66 and p51.
  • the p51 subunit has 440 amino acids while the p66 has 560.
  • p51 and p66 share the same primary structure in their first 440 residues, the different subdomains contained in their respective sequences are oriented differently in both subunits.
  • the p66 subunit participates in an important way in the formation of the groove in which the complexer-primer interacts either RNA / DNA or DNA / DNA, in addition to the active center involved in the catalysis that leads to the formation of phosphodiester bonds between deoxyribonucleotides 5 'triphosphate (dNTP) and the free 5' end of the DNA strand being synthesized.
  • dNTP deoxyribonucleotides 5 'triphosphate
  • the p51 subunit has a mainly structural function.
  • the p51 and p66 subunits are generated from the processing of the Gag-Pol polyprotein. Although it is not known exactly which are the intermediaries in the Gag-Pol processing that lead to the formation of the functional p66 / p51 heterodimer, it is known that in vitro, p66 / p66 homodimers can be converted into p66 / p51 heterodimers by the action of Ia viral protease
  • This enzyme makes an endoproteolytic cut, between amino acids 440 and 441, in one of the two chains that form the homodimer.
  • RT of group O HIV-1 refers to an isolated retrotranscriptase of a human type 1 immunodeficiency virus of group O.
  • HIV-1 RT of subtype B refers to an isolated retrotranscriptase of a human immunodeficiency virus type 1 of group M subtype B.
  • retrotranscriptase isolated from human immunodeficiency virus type 1 refers to a protein with retrotranscriptase activity that is substantially or completely free of the components that normally accompany or interact with it in its natural form. It can be obtained, for example, by amplification by means of the polymerase chain reaction (PCR) of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the p66 subunit of the retrotranscriptase from the viral RNA obtained from an isolate of the virus of Ia human immunodeficiency type 1, and subsequent cloning in an expression vector.
  • PCR polymerase chain reaction
  • SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the p66 subunit of the RT isolated from a strain or an isolate of HIV-1 group O.
  • the p66 subunit of the RT isolated from other strains or other isolates of HIV-1 Group O has an identity in its amino acid sequence with SEQ ID NO: 1 of up to 90%.
  • amino acid sequence or “protein” are used interchangeably herein, and refer to a polymeric form of amino acids of any length, which may or may not be chemically or biochemically modified.
  • identity refers to the proportion of identical amino acids between two amino acid sequences that are compared. The percentage of identity existing between two sequences can be easily identified by a person skilled in the art, for example, with the help of an appropriate computer program to compare sequences.
  • copy fidelity refers to the accuracy of the polymerization, or the ability of the RT to discriminate between the correct and incorrect substrates (for example, nucleotides) when it is synthesizing nucleic acid molecules that are complementary to a nucleic acid mold.
  • the fidelity of the RT of the present invention can be analyzed by different types of analysis, such as, but not limited to, fidelity assays in cell cultures or in vitro fidelity assays (genetic or biochemical).
  • Fidelity assays in cell cultures are based on the use of a retroviral vector that contains a marker gene (such as, but not limited to, lacZa, thymidine kinase or neomycin), in addition to all the elements necessary for transcription to take place. of viral proteins, their encapsidation, and the synthesis of proviral DNA.
  • This vector from which essential genes such as gag, pol, env, and / or accessory genes have been removed, is introduced into a packaging cell line that provides these genes in trans, and the virus produced is used to infect target cells. In these cells, the vector is able to complete a round of replication and integrate into the genome of the target cell to form provirus.
  • a single round of replication involves a stage of RNA transcription by the cellular RNA polymerase Il, and a retrotranscription stage that includes the RNA-dependent DNA synthesis of a proviral DNA chain, and the subsequent synthesis of the second DNA chain through the DNA-dependent DNA polymerase activity of the RT. Since the provirus is unable to express essential viral proteins, no additional replication cycles occur. By selecting an appropriate cell culture, the natural or mutant phenotypes of the marker gene can be detected, and thus obtain mutation frequencies.
  • the purified RT is used for the determination of kinetic constants on an RNA or DNA template, under conditions determined (pH, substrate concentration, etc ...) - In this way the kinetic parameters of the DNA copy fidelity (dependent on RNA or DNA) of the RT can be obtained, both in stationary and pre-stationary state.
  • the biochemical tests of erroneous incorporation in the steady state are based on the determination of the kinetic constants (k cat and K m ) for the incorporation of nucleotides at the 3 'end of a primer and provide an estimate of the selectivity of the RT by the nucleotide
  • the determination of the kinetic parameters is carried out by measuring the incorporation of nucleotides at the 3 'end of the primer, previously labeled at its 5' end with [ ⁇ 32 P] ATP, in the presence of different concentrations of dNTP, once formed the RT / mold-primer binary complex.
  • the resulting products are analyzed by electrophoresis in polyacrylamide gels.
  • the data obtained are consistent with the Michaelis-Menten equation, and the parameters k cat (incorporation rate) and K m (Michaelis-Menten constant) are determined for the correct and incorrect nucleotides.
  • the efficiency of erroneous incorporation ⁇ f ⁇ nc is defined as the relationship between the catalytic efficiency (/ Cca ⁇ / Km) obtained for the incorrect nucleotide and the catalytic efficiency obtained for the correct nucleotide.
  • greater fidelity of the RT implies a lower efficiency of erroneous incorporation.
  • the RT In order for the fixing of an error in the nascent DNA to occur, the incorporation of an incorrect nucleotide is not sufficient, the RT must also be able to elongate the missing end that is generated as a result of this erroneous incorporation.
  • This fidelity measurement is carried out by extension tests of missing ends. In these tests, the steady state kinetic constants are calculated for the incorporation of a correct nucleotide on two types of complexer-primer complex: the complex with the 3 'end properly matched and the same complex with the 3' end missing.
  • the extension efficiency of missing ends (f ext ) is defined as the ratio between k ca t / K m obtained for the extension of the missing end and the one obtained for the extension of the correctly paired end.
  • Biochemical tests in the pre-stationary state examine the ability of RT to bind and incorporate dNTP at very short times (such as, for example, in the order of milliseconds). In this way, it is possible to calculate the affinity constant (K d ) for the interaction between the dNTP and the binary complex RT / mold-primer, and the polymerization constant (/ c po / ).
  • K d affinity constant
  • the efficiency of erroneous incorporation and extension of missing ends is determined from the values of k po ⁇ / Kd obtained for the incorporation of correct or incorrect nucleotides, or those obtained for the incorporation of correct nucleotides on mold-primer complexes containing a 3'OH end paired or missing.
  • the most used genetic assays are usually carried out using as a template-primer of the DNA synthesis reaction, the double stranded DNA of phage M13mp2, from which the zone corresponding to the lacZ gene of One of the threads.
  • the DNA synthesis reaction is carried out in the presence of RT and high concentrations of dNTPs. After the bacterial transformation with the reaction product, the mutants are identified as blue / white plates in culture medium containing X-GaI (5-bromo-4-chloro-3-indole- ⁇ -galactopyranoside) and IPTG (isopropyl - ⁇ -thio-galactopyranoside).
  • the result is a dark blue plate.
  • the introduction of one or several errors implies the partial or total loss of the ⁇ -complementation, which translates into light blue or white plates.
  • the DNA recovered from these plates can be sequenced, to determine exactly the number, type and position in the genome of the mutations introduced by the RT.
  • Another type of genetic assays are reversal assays. These tests are based on the use of molds that contain an inactivating mutation (typically, termination codons or insertions of a nucleotide). The reversal of the mutation results in the correction of the error and therefore in the restoration of the activity of the marker gene.
  • an inactivating mutation typically, termination codons or insertions of a nucleotide.
  • the "increase in copy fidelity" can be measured by comparing parameters indicative of the copy fidelity of the RTs of the invention and the unmodified RT. These parameters can be analyzed, for example, but not limited, by any of the methods previously described in this document.
  • An RT with an "increased” or “increased” copy fidelity is defined as an RT that has a significant increase or increase (applying statistical criteria) in the copy fidelity with respect to the unmodified RT, typically of at least , 1.5 times, more preferably at least 2 times, and even more preferably at least 3 times, and even more preferably at least 4 times.
  • an increase in fidelity is considered when the value obtained for the modified RT is significantly higher than that of the unmodified RT (applying statistical criteria), typically, at least, 1, 5 times, preferably, at least 2 times, more preferably at least 3 times, and even more preferably at least 4 times.
  • increased fidelity is considered when there is a significant increase (applying statistical criteria) in the frequency of mutant obtained by the modified RT, typically of at least 50% (1, 5 times), preferably, at least 2 times, more preferably at least 3 times, and even more preferably at least 4 times.
  • thermostability refers to the stability shown by an RT when it is subjected to an elevated temperature, for example, typically, a temperature of at least 45 0 C, preferably at least 55 0 C, more preferably of at least 60 0 C and even more preferably of at least 65 or Vy.
  • thermostability of the RT of the present invention can be analyzed by different types of analysis.
  • the thermostability of the RT of the present invention can be estimated, for example, but not limited, by measuring the specific DNA polymerase activity at different elevated temperatures, using a template-primer complex, analyzing the residual RT activity after subjecting the enzyme to an incubation at elevated temperature during different time intervals, analyzing the half-life of the RT or measuring the quantity and / or the length of the product synthesized by the RT at a high temperature.
  • the "half-life" of a protein is a parameter that allows measuring its thermostability.
  • the half-life of the RT activity refers to the time in which the polymerase activity (dependent on RNA or DNA) is reduced by half when the synthesis reaction (dependent on RNA or DNA) is carried out at a high temperature.
  • thermostability of a RT are the quantity and / or the length of the product synthesized by the RT when the synthesis reaction is carried out at a high temperature.
  • an estimate of the stability of the RT can be obtained, analyzing the quantity of the product obtained by means of the RT in an RT-PCR.
  • a retrotranscription reaction can be performed first using as a nucleic acid total RNA template at an elevated temperature, and then the complementary DNA obtained from the retrotranscription can be amplified the reaction product by
  • a "high temperature synthesis reaction”, as used in the present description, refers to a reaction and, more preferably, a back transcription (or reverse transcription) reaction, which is carried out at a temperature of at least , 45 0 C, preferably at least 55 0 C, more preferably at least 60 0 C and even more preferably at least 65 0 C.
  • the RT of the invention may show an increase in thermostability in the presence or absence of the template nucleic acid. It is known in the state of the art that RTs are typically more stable in the presence of the template nucleic acid.
  • the term "increased thermostability”, as used in the present description refers to the fact that the modified group O HIV-1 RT, which comprises an amino acid sequence, mutated in the residues corresponding to positions 75 and 478 of SEQ ID NO: 1, retains its activity at a higher synthesis reaction temperature, or acts longer at the same temperature, than the RT that only has a mutation in the residue corresponding to position 75 of the SEQ ID NO: 1.
  • thermostability is defined as an RT that has a significant increase or increase (applying statistical criteria) in the thermostability, typically at least 1.5 times, more preferably at least , 2 times, and even more preferably, at least 3 times, and even more preferably at least 4 times, with respect to the RT which only has a mutation in the residue corresponding to position 75 of the SEQ ID NO: 1.
  • a significant increase or increase typically at least 1.5 times, more preferably at least , 2 times, and even more preferably, at least 3 times, and even more preferably at least 4 times, with respect to the RT which only has a mutation in the residue corresponding to position 75 of the SEQ ID NO: 1.
  • the RT in an RT-PCR it is considered that the RT has a fidelity of copy increased when the quantity of product obtained by means of RT-PCR has a significant increase or increase (applying statistical criteria), typically of at least 1.5 times, preferably of at least 3 times, and even more preferably of, at least 4 times, with respect to the RT that only has a mutation in the residue that corresponds to position 75 of SEQ ID NO: 1.
  • mutation refers to a substitution of one amino acid for another different amino acid.
  • the individual amino acids in a sequence are represented here as XN, in which X is the amino acid in the sequence (designated by the code of a letter universally accepted in the amino acid nomenclature), and N is the position in the sequence.
  • Point substitution mutations in an amino acid sequence are represented here as XiNX 2 , in which Xi is the amino acid in the non-mutated protein sequence, X 2 is the amino acid in the mutated protein sequence, and N is the position in The amino acid sequence.
  • the amino acid sequence comprised by the RT of the invention can be obtained by genetic or recombinant engineering techniques well known in the state of the art. They can be obtained, for example, by mutating the RT gene by randomized or directed mutagenesis. Preferably, the mutation is introduced into the amino acid sequence by means of a suitable codon change in the polynucleotide encoding the RT. More preferably, the mutants of the present invention can be obtained by the oligonucleotide-directed mutagenesis technique. This technique consists in the ringing of a complementary oligonucleotide (except for
  • oligonucleotide-directed mutagenesis can be carried out, for example, by PCR.
  • Another aspect of the present invention refers to a polynucleotide that encodes the amino acid sequence included in the RT of the invention.
  • nucleotide sequence refers to a polymeric form of nucleotides of any length, which may be, or no, chemically or biochemically modified.
  • Another aspect of the present invention refers to a vector comprising the polynucleotide that encodes the amino acid sequence included in the RT of the invention.
  • the vector can be, for example a cloning vector or an expression vector.
  • said vector is an appropriate vector for the expression and purification of the RT of the invention.
  • cloning vector refers to a DNA molecule in which another DNA fragment can be integrated, without losing the capacity for self-replication.
  • expression vectors are, but are not limited to, plasmids, cosmids, DNA phages or artificial yeast chromosomes.
  • expression vector refers to a cloning vector suitable for expressing a nucleic acid that has been cloned therein after being introduced into a cell, called host cell. Said nucleic acid is, in general, operatively linked to control sequences.
  • expression refers to the process by which a polypeptide is synthesized from a polynucleotide. It includes the transcription of the polynucleotide in a messenger RNA (mRNA) and the translation of said mRNA into a protein or a polypeptide.
  • mRNA messenger RNA
  • host cell refers to any prokaryotic or eukaryotic organism that is the recipient of an expression vector, of cloning or of any other DNA molecule.
  • control sequence refers to nucleotide sequences that are necessary to effect the expression of the sequences to which they are linked. It is intended that the term “control sequences” includes, at a minimum, all components whose presence is necessary for expression, and may also include additional components whose presence is advantageous. Examples of control sequences are, for example, but not limited to, promoters, transcription initiation signals, transcription termination signals, polyadenylation signals or transcriptional activators.
  • operatively linked refers to a juxtaposition in which the components thus described have a relationship that allows them to function in the intended manner.
  • a control sequence "operatively linked" to a polynucleotide is linked in such a way that the expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.
  • promoter refers to a region of DNA, generally “upstream” or “upstream” of the starting point of Ia transcription, which is capable of initiating transcription in a cell. This term includes, for example, but not limited to, constitutive promoters, cell or tissue specific promoters or inducible or repressible promoters.
  • control sequences depend on the origin of the cell in which the nucleic acid is to be expressed.
  • prokaryotic promoters include, for example, but not limited to, promoters of the trp, recA, lacZ, lacl, tet, gal, trc, or tac genes of E. coli, or the promoter of the ⁇ -amylase gene of B. subtilis
  • promoters of the trp, recA, lacZ, lacl, tet, gal, trc, or tac genes of E. coli or the promoter of the ⁇ -amylase gene of B. subtilis
  • Appropriate control sequences for the expression of a polynucleotide in eukaryotic cells are known in the state of the art.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a vector comprising a polynucleotide that encodes the amino acid sequence included in the RT of the invention, wherein said polynucleotide is operatively linked to at least one control sequence of the Ia list comprising:
  • a) a promoter b) a transcription initiation signal, c) a transcription termination signal, d) a polyadenylation signal, or e) a transcriptional activator.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a vector comprising a polynucleotide that encodes the amino acid sequence comprised by the RT of the invention, wherein said polynucleotide is linked in reading phase to a nucleotide sequence encoding a purification tag.
  • purification tag or "affinity tag”, as used in the present description refers to an amino acid sequence that has been incorporated (generally, by genetic engineering) into a protein to facilitate its purification.
  • the tag which can be another protein or a short amino acid sequence, allows the purification of the protein, for example, by affinity chromatography.
  • Some examples of purification labels known in the state of the art are, for example, but not limited to: the calmodulin-binding peptide (CBP), the glutathione-S-transferase enzyme (GST) or a tail of histidine residues .
  • the purification tag consists of at least 6 histidine residues.
  • first vector of the invention refers to a vector comprising a polynucleotide that encodes the sequence included in the RT of the invention, where said vector has any of the characteristics described above in the present description.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a vector that comprises a polynucleotide that encodes the amino acid sequence comprised by the RT of the invention and that, in addition, comprises a polynucleotide that codes for a protease capable of performing an endoproteolytic cut. in the amino acid sequence included in the RT of the invention between the residues corresponding to positions 440 and 441 of SEQ ID NO: 1.
  • second vector of the invention refers to a vector comprising a polynucleotide encoding the sequence included in the RT of the invention, wherein said vector has any of the characteristics of the first vector of the invention, and also comprising a polynucleotide encoding a protease capable of making an endoproteolytic cut in the amino acid sequence comprised in the RT of the invention between the residues corresponding to positions 440 and 441 of SEQ ID NO: 1.
  • the protease capable of performing an endoproteolytic cut in the amino acid sequence included in the RT of the invention between the residues corresponding to positions 440 and 441 of SEQ ID NO: 1 is the HIV-1 protease, a variant of the HIV-1 protease or a fragment thereof, as long as said variant or said fragment is functionally equivalent.
  • HIV-1 protease refers to a protease isolated from a human immunodeficiency virus type 1.
  • protease isolated from human immunodeficiency virus type 1 refers to a protease capable of making an endoproteolytic cut in the amino acid sequence included in the RT of the invention between the residues corresponding to positions 440 and 441 of SEQ ID NO: 1, which is substantially or completely free of the components that normally accompany or interact with it in its natural form.
  • the HIV-1 protease has the amino acid sequence SEQ ID NO: 4.
  • SEQ ID NO: 4 corresponds to the sequence of the HIV-1 protease isolated from the prototypic strain of group M-subtype B NL4-3 .
  • said protease forms homodimers by means of non-covalent binding of its subunits.
  • variant refers to a protein substantially homologous to HIV-1 protease.
  • a variant includes additions, deletions or substitutions of amino acids.
  • variant also includes proteins resulting from posttranslational modifications such as, but not limited to, glycosylation, phosphorylation or methylation.
  • a protein is "substantially homologous" to the HIV-1 protease when its amino acid sequence has a good alignment with the amino acid sequence SEQ ID NO: 4, that is, when its amino acid sequence has a degree of identity with respect to the amino acid sequence SEQ ID NO: 4, of at least 50%, typically of at least 80%, advantageously of at least 85%, preferably of at least 90%, more preferably of at least 95%, and even more preferably of at least 99%.
  • fragment refers to a portion of the HIV-1 protease or one of its variants.
  • Another aspect of the present invention relates to a cell comprising the first vector of the invention. From now on we will use the expression "first cell of the invention” to refer to a cell comprising the first vector of the invention.
  • the cell of the invention can be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • the cell of the invention is a prokaryotic cell.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for producing the amino acid sequence comprised in the RT of the invention comprising:
  • step (a) culturing the cell of the invention, and b) isolating the amino acid sequence comprised in the RT expressed in step (a) by said cell.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for producing the RT of the invention comprising:
  • step (a) a) cultivate the cell of the invention, and b) isolate the RT expressed in step (a) by said cell.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the RT of the invention for the RT of a template nucleic acid, preferably mRNA.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the RT of the invention for the amplification of a template nucleic acid, preferably mRNA.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the RT of the invention for the sequencing of a template nucleic acid, preferably mRNA.
  • Another aspect of the present invention relates to a method of RT of a template nucleic acid, preferably mRNA, comprising:
  • step (a) a) mixing said template nucleic acid with the RT of the invention, and b) incubating the mixture of step (a) under conditions that allow the synthesis of DNA complementary to the template nucleic acid.
  • Another aspect of the present invention relates to a method of amplifying a template nucleic acid, preferably mRNA, comprising:
  • step (a) mixing said nucleic acid with the RT of the invention and with at least one DNA-dependent DNA polymerase, and b) incubating the mixture of step (a) under conditions that allow the amplification of DNA complementary to the template nucleic acid.
  • Another aspect of the present invention relates to a method of sequencing a nucleic acid, preferably mRNA, comprising:
  • retrotranscription or reverse transcription
  • reverse transcription refers to the synthesis of a DNA complementary to an RNA.
  • amplification refers to the increase in the number of copies of a template nucleic acid. In a preferred embodiment, the amplification takes place by PCR.
  • sequencing refers to the determination of the order of the nucleotides of a template nucleic acid.
  • template nucleic acid refers to a single or double chain nucleic acid molecule that is going to be retrotranscribed, amplified or sequenced.
  • condition that allow the synthesis of complementary DNA refers to the conditions under which the incorporation of nucleotides into nascent DNA can take place by means of complementarity of bases with the template nucleic acid.
  • the conditions in which the DNA synthesis takes place include: (a) contacting said template nucleic acid with the RT of the invention in a mixture that also comprises a primer, a bivalent cation, for example, Mg 2+ , and nucleotides, and (b) subjecting said mixture to a temperature sufficient for a DNA polymerase, for example, the RT of the invention, to initiate the incorporation of nucleotides to the primer by means of complementarity of bases with the template nucleic acid, and of Place a population of complementary DNA molecules of different sizes.
  • the separation of said population of complementary DNA molecules allows determining the nucleotide sequence of the template nucleic acid.
  • the synthesized DNA chain may not be exactly complementary to the mold nucleic acid.
  • condition that allow the synthesis of a population of DNA molecules complementary to the template nucleic acid refers to the conditions in which the sequencing is performed, and which generally include (a) contacting said template nucleic acid with the RT of the invention in a mixture that also comprises a primer, a bivalent cation, (for example, Mg 2+ ), and nucleotides, generally, dNTPs and, at least, a ddNTP, and (b) subjecting said mixture to a temperature sufficient for a DNA polymerase, for example, the RT of the invention, to initiate the incorporation of the nucleotides to the primer by means of complementarity of bases with the template nucleic acid, and thus giving rise to a population of complementary DNA molecules of different sizes.
  • the separation of said population of complementary DNA molecules generally, by electrophoresis, allows to determine the nucleotide sequence.
  • primer refers to an oligonucleotide capable of acting as the starting point of DNA synthesis when hybridized with the template nucleic acid.
  • the primer is a deoxyribose oligonucleotide.
  • the primers can be prepared by any suitable method, including, but not limited to, cloning and restriction of appropriate sequences and direct chemical synthesis.
  • the primers can be designed to hybridize with specific nucleotide sequences in the template nucleic acid (specific primers) or can be synthesized at random (arbitrary primers).
  • primer refers to a primer whose sequence is complementary to a specific nucleotide sequence in the template nucleic acid that is intended to be re-transcribed, amplified or sequenced.
  • arbitrary primer refers to a primer whose sequence is synthesized at random and that is used to initiate the synthesis of DNA at random positions of the template nucleic acid that is intended to be re-transcribed, amplified or sequenced. A population of different arbitrary primers is often used.
  • arbitrary primers refers to a set of primers whose sequence is synthesized at random and that is used to initiate the synthesis of DNA at random positions of the template nucleic acid that is intended to be re-transcribed, amplified or sequenced.
  • hybridization refers to the pairing of two complementary single stranded nucleic acid (DNA and / or RNA) molecules to give a double stranded molecule.
  • the complementarity is 100%. That is, in the region of complementarity each nucleotide of one of the two nucleic acid molecules can form hydrogen bonds with a nucleotide present in the other nucleic acid molecule.
  • hybridize one of the two nucleic acid molecules that possess a region with complementarity less than 100% can also hybridize.
  • nucleotide refers to an organic molecule formed by the covalent junction of a pentose, a nitrogenous base and a phosphate group.
  • nucleotide includes deoxyribonucleoside triphosphates, such as, but not limited to, dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, or derivatives thereof.
  • nucleotide also includes dideoxypyribonucleoside triphosphates (ddNTPs), such as ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP, ddTTP or derivatives thereof.
  • a "nucleotide” or a “primer” can be labeled or labeled by techniques well known in the state of the art.
  • Detectable tags include, for example, radioactive isotopes, fluorescent tags, chemiluminescent tags, tags bioluminescent or enzymatic labels.
  • DNA dependent DNA polymerase refers to a DNA polymerase capable of catalyzing the polymerization of deoxynucleotides using DNA as a template nucleic acid.
  • DNA-dependent DNA polymerase examples include the DNA polymerases of Thermus thermophilus (Tth), Thermus aquaticus (Taq), Thermotoga neapolitana (Tne), Thermotoga maritima (Tma), Thermococcus litoralis (TIi or VENTTM), Pyrococcus furiosis (Pfu), Pyrococcus species GB-D (Deep Vent TM), Pyrococcus woosii (Pwo), Bacillus stearo-thermophilus (Bst), Bacillus caldophilus (Bca), Sulfolobus acidocaldarius (Sac), Thermoplasma acidophil
  • Tth Thermus thermophilus
  • Taq Thermus aquaticus
  • Tne Thermotog
  • Another aspect of the present invention relates to a kit comprising the elements necessary to carry out any of the methods described above in the present description.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a kit for carrying out any of the methods described above in the present description, which comprises:
  • Figure 1 Shows the electrophoresis in polyacrylamide gel and SDS of the RT of HIV-1 group O "wild-type" resulting from purification.
  • M molecular weight markers
  • wells 1-4 bovine serum albumin (66.2 kDa) (0.5, 1, 2 and 4 ⁇ g respectively);
  • wells 5-7 aliquots of the purified HIV-1 RT group O.
  • the purification yield was greater than 3 mg of RT per liter of processed culture.
  • Figure 2 Shows the efficiency of extension of missing ends obtained with the three mutants analyzed.
  • Figure 3 It shows the amplification by RT-PCR of fragments of RNA coding for actin, of (A) 500 and (B) 1000 base pairs, from total RNA of mouse liver. Amplification was carried out with the indicated enzymes [HIV-1 RT group "wild-type" (RTO), HIV-1 RT subtype B BH 10 (RTB), mutant V75I in the context of RTO (RTO V75I ) and the double mutant V75I / E478Q in the context of RTO (RTO V75I / E478Q)].
  • the indicated empires refer to the reaction of the DNA copying synthis.
  • Esias enzymes efficiency compared ⁇ ambién Ia Ia RT virus Moloney leukemia caren ⁇ e Ia Raion ac ⁇ ividad RNase H (MLV) (see reactions at higher ⁇ empera ⁇ uras re ⁇ ro ⁇ ranscrip
  • EXAMPLE 1 Generation, expression and purification of the RTs of type 1 "wild type" HIV virus and mutants.
  • plasmid p66RTB (Boretto et al. Anal. Biochem. 2001; 292: 139-147; Matamoros et al. J. Mol. Biol. 2005; 349: 451 -463), which contains the ampicillin resistance gene and in which we clone the coding region of the p66 subunit of the RT of an isolate of group O HIV-1 (Menéndez-Arias et al. J. Biol. Chem. 2001; 276: 27470-27479).
  • the plasmid p66RTB carrying the SS RT enzyme (described in Matamoros et al. J.
  • the p66 subunit modified at the N-terminal end by the presence of three amino acids: Met-Asn-Ser, and at the C-terminal end by the presence of a 9 amino acid tail (Glu-Ser-Thr- His-His-His-His-His-His), which contains the six histidine residues, which facilitate its purification.
  • the p51 subunit is generated by the proteolytic processing of p66, by the HIV-1 protease co-expressed by the use of the plasmid pATprotease (Boretto et al. Anal. Biochem. 2001; 292: 139-147).
  • Plasmids for the expression of the mutant RTs RTO_V75I and RTO_V75I / E478Q were obtained by directed mutagenesis using Stratagene's "Quik-Change Site-Directed Mutagenesis" kit, following the manufacturer's instructions.
  • mutagenic oligonucleotides were used: SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 to introduce the V75I mutation, and SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 for E478Q.
  • As a template for the introduction of V75I the plasmid carrying the sequence encoding p66 of HIV-1 (group O), described above, was used.
  • the E478Q mutation was introduced into the V75I carrier plasmid.
  • the p66 subunit (with its modified ends) is coexpressed in E. coli XL1 Blue with the HIV-1 protease (subtype B) using the vector pATprotease (Boretto et al. Anal. Biochem. 2001; 292: 139-147), Kanamycin resistance carrier. 3 cultures of 1 liter each were obtained (Luria-Broth standard medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin and 50 ⁇ g / ml kanamycin) of E.
  • coli carrying the expression plasmids of RT group O ("wild-type” or the corresponding mutants) and pATprotease, in exponential phase of growth, and the expression of RT was induced with isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) for 20-24 hours.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the proportion of active enzyme obtained was equal to or greater than 40%.
  • the purity of the RT obtained was greater than 95% according to estimates carried out with polyacrylamide gels and SDS ( Figure 1). These yields are significantly higher than those obtained using previously described protocols, in which the yield did not exceed 50-100 ⁇ g for the same volume of starting culture (Qui ⁇ ones-Mateu et al. Virology 1997; 236: 364-373).
  • the copy fidelity of the RTs has been determined by kinetic tests of nucleotide incorporation in the pre-stationary state, using 31T / 21 P template-primer complexes in which the 3'OH end may be correctly or incorrectly paired (Matamoros et al. J. Mol. Biol. 2008; 375: 1234-1248), and by genetic testing using the plasmid M13mp2 lacZa (Bebenek and Kunkel. Methods Enzymol. 1995; 262: 217-232; Matamoros et al. J. Mol. Biol. 2008; 375: 1234-1248).
  • the group O RT carrying the change V75I retains catalytic activity similar to the "wild-type" RT and has a lower capacity to extend primers containing a missing 3 'end (Table 1; Figure 2).
  • Table 1 Figure 2
  • the presence of the V75I mutation causes a decrease in the efficiency of extension of missing ends of 3.5 times for the G pair : T; 2.9 times for the G: G pair and 3.7 times for the G: A pair, when compared with the HIV-1 RT group "wild-type", and 2 to 6 times when compared with the RT of HIV-1 subtype B (prototype strain BH 10).
  • fidelity was measured in complementation assays using phage derivatives M13mp2 in which the lacZ gene is present.
  • the frequency with which mutants were obtained was determined when the synthesis process is performed with the different recombinant RTs (Table 2).
  • An increase in copy fidelity is reflected in the appearance in the assay of a smaller number of mutant plates.
  • the RT of the HIV-1 group "wild-type" presented a fidelity increase of 2.5 times with respect to the RT of the HIV-1 subtype B ("wild-type" BH10), while the presence of the mutation V75I in the context of the RT of HIV-1 group O improved the copy fidelity by 4.7 times with respect to the RT of subtype B.
  • the double mutant V75I / E478Q has a copy fidelity similar to that of V75I, in complementation assays using M13mp2 phage derivatives in which the lacZ gene is present.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) group O (RTO_V75I and RTO_V75I / E478Q), estimated by genetic tests (M13mp2 lacZa "forward mutation assay").
  • the back-transcription reaction was carried out in a volume of 20 ⁇ l [4 ⁇ l of 250 mM Tris-HCI buffer (pH 8.3 at 25 0 C) containing 375 mM KCI, 15 mM MgCl 2 and 50 mM dithiothreitol ; 1 ⁇ l of total RNA isolated from mouse liver (1 ⁇ g / ⁇ l); 4 ⁇ l of a mixture of the 4 dNTPs (at 2.5 mM each); 1 ⁇ l of oligo-dT (100 ⁇ M); 0.5 ⁇ l of RNase inhibitor (40 units / ⁇ l); Ia RT at an approximate concentration of 150 nM and the rest up to 20 ⁇ l of water].
  • RNA and oligo dT incubated at 68 0 C for 3 min. Then the other components of the reaction are added and incubated for 1 hour at the desired temperature to see thermostability. Finally, the reaction is stopped by incubating 10 min at 92 0 C, to obtain cDNA.
  • This is amplified by PCR under standard conditions, using Taq polymerase and primers ACT1 and ACT2 (500 base pair fragment) or ACT1 and ACT3 (1000 base pair fragment).
  • the sequences of the primers used are: ACT1: SEQ ID NO: 15, ACT2: SEQ ID NO: 16, and ACT3: SEQ ID
  • EXAMPLE 4 Loss of the RNase H activity in the RT carriers carrying the E478Q change.
  • thermostability studies carried out with the four RTs of HIV-1 (HIV-1 group O "wild-type", HIV-1 group O mutant V75I, HIV-1 group O mutant V75I / E478Q and HIV-1 subtype B "wild-type BH10") and the Moloney virus RT of mouse leukemia (MLV) demonstrated that the three enzymes derived from HIV-1 group O were the most thermostable ( Figure 3).
  • the presence of V75I decreased the thermostability of the enzyme, while when accompanied by the change E478Q, there was an improvement in its stability that was reflected in an increase in the intensity of the amplified band. This is due to the fact that the presence of the E478Q mutation leads to the loss of RNase H activity of the enzyme ( Figure 4), which facilitates the stability of the RNA in amplification reactions.
  • the RNase H activity of the generated mutants was determined with a template-primer complex, whose structure appears in the lower part.
  • the template RNA is labeled at its 5 'end with 32 P and the reaction is carried out at 37 0 C, in the presence of template-primer RNA / DNA 50 nM and Ia RT corresponding to 100 nM, in a buffer contained: 50 mM Tris-HCI (pH 8.0), 50 mM NaCI and 5 mM MgCl 2 .
  • the reactions were started after adding 1 ⁇ l of the concentrated RT and MgCl 2 . Aliquots were taken at 0, 15, 60, 120, 240 and 480 s, and the reaction was stopped by adding 10 mM EDTA dissolved in 90% formamide.

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Abstract

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. Más concretamente, se refiere a retrotranscriptasas aisladas de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-I) de grupo O, con las mutaciones V75I y E478Q, que presentan una elevada fidelidad de copia y termoestabilidad, así como a su uso para llevar a cabo la retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde. La invención se refiere, además, a un método para obtener dichas retrotranscriptasas.

Description

RETROTRANSCRIPTASA DEL VIH-1 DE GRUPO O MODIFICADA.
La presente invención se encuadra dentro del campo de Ia biotecnología. Más concretamente, se refiere a retrotranscriptasas aisladas de un virus de Ia inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1 ) de grupo O y modificadas que presentan una elevada fidelidad de copia y termoestabilidad, así como a su uso para llevar a cabo Ia retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde. La invención se refiere, además, a un método para obtener dichas retrotranscriptasas.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La enzima responsable de Ia replicación del genoma de los retrovirus se denomina retrotranscriptasa (RT) (o transcriptasa inversa). Esta enzima convierte el ARN genómico monocatenario en ADN bicatenario capaz de integrarse en el genoma de Ia célula hospedadora [revisado por Telesnitsky y Goff. En Retroviruses. Coffin et al. (ed.), p. 121-160, CoId Spring Harbor Lab. Press, Plainview EE.UU., 1997]. Se trata de una polimerasa capaz de sintetizar ADN, utilizando como molde ARN ó ADN, indistintamente. Además, Ia RT posee actividad endonucleasa (RNasa H), que Ie permite degradar el molde ARN durante el proceso de síntesis de ADN dependiente de ARN.
Por tanto, las RTs de retrovirus son enzimas útiles para Ia obtención de ADN complementario (ADNc) a partir de ARN mensajero, que una vez amplificado por técnicas convencionales [reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR), por ejemplo] puede utilizarse para detectar expresión génica en organismos o tejidos. A partir de librerías de ADNc es posible seleccionar transcritos de genes que una vez amplificados por PCR pueden ser clonados en plásmidos o vectores virales. Para estas aplicaciones resulta interesante disponer de RTs que presenten una mayor estabilidad térmica, es decir, que retengan actividad polimerasa a temperaturas relativamente elevadas, ya que en estas condiciones disminuirían los niveles de estructura secundaria en el ARN y mejoraría el proceso de amplificación. Por otro lado, las RTs son enzimas que carecen de actividad exonucleasa y por tanto, son polimerasas con una tasa de error relativamente alta, por Io que un aumento de su fidelidad sería deseable si Io que se pretende es clonar los productos derivados del ADNc generado durante Ia retrotranscripción.
Se han aislado y purificado RTs de diversos retrovirus. Entre ellas podemos citar, las del virus de mieloblastosis de aves (AMV), del virus Moloney de Ia leucemia de ratón (MLV) (Cote y Roth. Virus Res 2008; 134: 186-202), del virus de Ia anemia infecciosa equina (EIAV), del virus de Ia inmunodeficiencia de felinos (FIV), del virus de Ia inmunodeficiencia de bóvidos (BIV), del virus del tumor mamario de ratón (MMTV), del virus de Ia leucemia de bóvidos (BLV), y de espuma-retrovirus (revisado en Hizi y Herschhorn. Virus Res 2008; 134: 203-220); además de las RTs de virus de Ia inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1 ) y tipo 2 (VIH-2) y de Ia inmunodeficiencia de simios (SIV).
Desde un punto de vista metodológico las RTs más utilizadas comercialmente en reacciones de amplificación son las de MLV, AMV y VIH-1. En el caso de Ia RT del VIH-1 , Ia enzima de referencia en este tipo de análisis es una variante "wild-type", que se clasifica filogenéticamente como perteneciente a subtipo B (grupo M). La RT del VIH-1 (subtipo B) es más estable que Ia RT del MLV a temperaturas superiores a 45or V"y .
La expansión de Ia epidemia del SIDA y Ia caracterización de aislados virales del VIH en diferentes partes del mundo ha permitido constatar su gran heterogeneidad y ha conducido a Ia identificación de variantes de Ia RT alejadas filogenéticamente de Ia RT del VIH-1 de subtipo B. Entre ellas, las más alejadas son las pertenecientes al grupo O, que se caracterizan por presentar alrededor de un 20% de aminoácidos distintos cuando se comparan con secuencias prototipo "wild-type" de subtipo B (Quiñones-Mateu et al.
Virology 1997; 236: 364-373). Las RTs "wild-type" de grupo O son resistentes naturales a nevirapina y otros inhibidores no análogos a nucleósido y presentan mayor estabilidad en presencia de urea que las RTs de subtipo B (Menéndez- Arias et al. J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 27470-27479). Sin embargo, su expresión y purificación es difícil debido al escaso rendimiento de los procedimientos descritos hasta Ia fecha.
La caracterización de RTs obtenidas mediante mutagénesis dirigida ha permitido estudiar el papel de distintos cambios de aminoácido sobre Ia fidelidad de copia, así como Ia inactivación de Ia actividad RNasa H de Ia RT del VIH-1 (subtipo B). Sin embargo, el contexto de Ia secuencia ha demostrado ser de gran importancia (Taube et al. Eur. J. Biochem. 1997; 250: 106-114), por Io que no parece probable que una mutación analizada en Ia RT del VIH-1 subtipo B pueda ejercer el mismo efecto en una variante del VIH-1 filogenéticamente alejada como Ia RT del VIH-1 de grupo O.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a retrotranscriptasas (RTs) aisladas de un virus de Ia inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1 ) de grupo O y modificadas que presentan una elevada fidelidad de copia y termoestabilidad, así como a su uso para llevar a cabo Ia retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde. La invención se refiere, además, a un método para obtener dichas RTs.
Las RTs de retrovirus son enzimas útiles, por ejemplo, para Ia obtención de ADN complementario a partir de ARN mensajero, que una vez amplificado puede ser clonado en un vector. Es deseable que las RTs que se utilicen con este fin presenten elevada estabilidad térmica, ya que en estas condiciones disminuirían los niveles de estructura secundaria en el ARN y mejoraría el proceso de amplificación. Sin embargo, las RTs son enzimas que carecen de actividad exonucleasa correctora de errores y por tanto, tienen una tasa de error relativamente alta, por Io que un aumento de su fidelidad sería deseable para poder ser empleadas con este fin. En los ejemplos de Ia presente invención se describen mutantes de una RT aislada de un VIH-1 de grupo O (RT del VIH-1 de grupo O) cuya subunidad p66 ha sido modificada mediante Ia sustitución de Ia valina 75 por isoleucina (mutación V75I), de manera que se observa un incremento en su fidelidad de copia con respecto a Ia de Ia RT no modificada. Es importante tener en cuenta que las RTs del VIH-1 de grupo O portadoras de esta mutación presentan mayor fidelidad de copia y termoestabilidad que las RTs presentes en aislados o cepas del VIH-1 de grupo M subtipo B (RT del VIH-1 de subtipo B), empleadas actualmente con el mismo fin.
Sin embargo, Ia mutación V75I en Ia RT del VIH-1 de grupo O conduce a una pérdida de termoestabilidad con respecto a Ia RT no modificada. En los ejemplos de Ia presente invención se demuestra como Ia introducción de un segundo cambio de aminoácido (mutación) consistente en Ia sustitución del ácido glutámico de Ia posición 478 de Ia subunidad p66 por glutamina permite aumentar su termoestabilidad con respecto a Ia RT que únicamente presenta Ia mutación V75I. Por tanto, Ia presente invención, proporciona RTs con elevada termoestabilidad y fidelidad de copia, apropiadas para llevar a cabo Ia retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde.
Un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a una RT del VIH-1 de grupo O modificada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una mutación que modifica dicha secuencia de aminoácidos en el residuo que corresponde a Ia posición 75 de Ia SEQ ID NO: 1 , en el que Ia RT modificada tiene una fidelidad de copia incrementada, con relación a Ia RT no modificada correspondiente.
Preferiblemente, dicha RT comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una mutación de manera que el residuo que se corresponde con Ia posición 75 de Ia SEQ ID NO: 1 de esta secuencia de aminoácidos es isoleucina.
Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una RT del VIH-1 de grupo O modificada, que comprende una secuencia de aminoácidos, mutada según se ha descrito anteriormente, y que además tiene otra mutación que modifica dicha secuencia de aminoácidos en el residuo que corresponde a Ia posición 478 de Ia SEQ ID NO: 1 , en el que Ia RT modificada tiene una termoestabilidad incrementada con relación a Ia RT modificada en el residuo que corresponde a Ia posición 75 de Ia SEQ ID NO: 1.
Preferiblemente, dicha RT comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una mutación de manera que el residuo que se corresponde con Ia posición 478 de Ia SEQ ID NO: 1 de esta secuencia de aminoácidos es glutamina.
De ahora en adelante utilizaremos Ia expresión "RT de Ia invención" para referirnos a una RT modificada según cualquiera de las características descritas anteriormente en Ia presente descripción.
Preferiblemente, Ia secuencia de aminoácidos comprendida por Ia RT de Ia invención presenta una identidad de, al menos, un 90%, más preferiblemente, de, al menos, un 95% y, aún más preferiblemente, de, al menos un 98% con Ia SEQ ID NO: 1.
Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una RT del VIH-1 de grupo O modificada que comprende Ia SEQ ID NO: 2.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una RT del VIH-1 de grupo O modificada que comprende Ia SEQ ID NO: 3.
Los virus de Ia inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2) son los agentes etiológicos del SIDA en el hombre. Pertenecen al género lentivirus dentro de Ia familia Retroviridae (retrovirus), que poseen como una de sus principales características una enorme diversidad genética. El VIH-1 se ha clasificado en tres grupos: M, O y N. Del grupo M se conocen al menos 10 subtipos A-K, además de múltiples recombinantes de dichos subtipos (Buonaguro et al. J. Virol. 2007; 81 : 10209-10219; Ramírez et al. Virus Res. 2008; 134: 64-73). El primer aislado de VIH-1 grupo O se obtuvo de pacientes infectados en 1987, y su secuencia de nucleótidos se publicó tres años más tarde (De Leys et al. J. Virol. 1990; 64: 1207-1216). Actualmente, se pueden obtener variantes del VIH- 1 grupo O (por ejemplo, Ia cepa MVP5180/91 ) a través del NIH AIDS Research & Reference Reagent Program (http://www.aidsreagent.org) (Germantown, Maryland, EE.UU.)
La RT del VIH-1 es una enzima multifuncional que presenta actividades ADN polimerasa dependiente de ARN y de ADN y actividad endonucleasa o ribonucleasa H (RNasa H). Es un heterodímero constituido por dos subunidades, denominadas p66 y p51. La subunidad p51 posee 440 aminoácidos mientras que Ia p66 tiene 560. Aunque p51 y p66 comparten idéntica estructura primaria en sus primeros 440 residuos, los distintos subdominios contenidos en sus secuencias respectivas se orientan de forma diferente en ambas subunidades. La subunidad p66 participa de forma importante en Ia formación del surco en el que interacciona el complejo molde- cebador ya sea ARN/ADN o ADN/ADN, además del centro activo que interviene en Ia catálisis que conduce a Ia formación de enlaces fosfodiéster entre desoxirribonucleótidos 5'-trifosfato (dNTP) libres y el extremo 5' de Ia cadena de ADN que está siendo sintetizada. Por el contrario, Ia subunidad p51 tiene una función principalmente estructural.
Las subunidades p51 y p66 se generan a partir del procesamiento de Ia poliproteina Gag-Pol. Aunque no se conoce con exactitud cuáles son los intermediarios en el procesamiento de Gag-Pol que llevan a Ia formación del heterodímero funcional p66/p51 , se sabe que in vitro, homodímeros p66/p66 pueden convertirse en heterodímeros p66/p51 por acción de Ia proteasa viral.
Esta enzima realiza un corte endoproteolítico, entre los aminoácidos 440 y 441 , en una de las dos cadenas que forman el homodímero.
El término "RT del VIH-1 de grupo O", tal y como se utiliza en Ia presente descripción se refiere a una retrotranscriptasa aislada de un virus de Ia inmunodeficiencia humana de tipo 1 de grupo O. El término "RT del VIH-1 de subtipo B" se refiere a una retrotranscriptasa aislada de un virus de Ia inmunodeficiencia humana de tipo 1 de grupo M subtipo B.
El término "retrotranscriptasa aislada del virus de Ia inmunodeficiencia humana de tipo 1" se refiere a una proteína con actividad retrotranscriptasa que se encuentra sustancialmente o completamente libre de los componentes que normalmente Io acompañan o interactúan con ella en su forma natural. Puede obtenerse, por ejemplo, por amplificación mediante Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR) de Ia secuencia de nucleótidos que codifica para Ia secuencia de aminoácidos de Ia subunidad p66 de Ia retrotranscriptasa a partir del ARN viral obtenido de un aislado del virus de Ia inmunodeficiencia humana tipo 1 , y posterior clonaje en un vector de expresión.
La SEQ ID NO: 1 es Ia secuencia de aminoácidos de Ia subunidad p66 de Ia RT aislada de una cepa o de un aislado del VIH-1 grupo O. La subunidad p66 de Ia RT aislada de otras cepas u otros aislados del VIH-1 de grupo O presenta una identidad en su secuencia de aminoácidos con Ia SEQ ID NO: 1 de hasta el 90 %.
Los términos "secuencia de aminoácidos" o "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquímicamente modificados.
El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a Ia proporción de aminoácidos idénticos entre dos secuencias de aminoácidos que se comparan. El tanto por ciento de identidad existente entre dos secuencias puede ser identificado fácilmente por un experto en Ia materia, por ejemplo, con Ia ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias. El término "fidelidad de copia" se refiere a Ia precisión de Ia polimerización, o Ia capacidad de Ia RT para discriminar entre los sustratos correctos e incorrectos (por ejemplo, nucleótidos) cuando está sintetizando moléculas de ácido nucleico que son complementarias a un ácido nucleico molde.
La fidelidad de Ia RT de Ia presente invención puede ser analizada mediante diferentes tipos de análisis, como por ejemplo, pero sin limitarnos, ensayos de fidelidad en cultivos celulares o ensayos de fidelidad in vitro (genéticos o bioquímicos).
Los ensayos de fidelidad en cultivos celulares se basan en el uso de un vector retroviral que contiene un gen marcador (como por ejemplo, pero sin limitarnos, lacZa, timidina quinasa o neomicina), además de todos los elementos necesarios para que tenga lugar Ia transcripción de las proteínas virales, su encapsidación, y Ia síntesis del ADN proviral. Este vector, del que se han eliminado genes esenciales como gag, pol, env, y/o genes accesorios, se introduce en una línea celular empaquetadora que Ie proporciona estos genes en trans, y el virus producido se utiliza para infectar células diana. En estas células, el vector es capaz de completar una ronda de replicación y de integrarse en el genoma de Ia célula diana para formar provirus. Una única ronda de replicación implica una etapa de transcripción de ARN por Ia ARN polimerasa Il celular, y una etapa de retrotranscripción que incluye Ia síntesis de ADN dependiente de ARN de una cadena del ADN proviral, y Ia síntesis posterior de Ia segunda cadena del ADN proviral a través de Ia actividad ADN polimerasa dependiente de ADN de Ia RT. Dado que el provirus es incapaz de expresar proteínas virales esenciales, no ocurren ciclos adicionales de replicación. Seleccionando un cultivo celular apropiado, se pueden detectar los fenotipos natural o muíante del gen marcador, y obtener así frecuencias de mutación.
En los ensayos bioquímicos se utiliza Ia RT purificada para Ia determinación de constantes cinéticas sobre un molde ARN o ADN, bajo unas condiciones determinadas (pH, concentración de sustrato, etc...)- De esta manera se pueden obtener los parámetros cinéticos de Ia fidelidad de copia de ADN (dependiente de ARN o ADN) de Ia RT, tanto en estado estacionario como preestacionario.
Los ensayos bioquímicos de incorporación errónea en el estado estacionario, se basan en Ia determinación de las constantes cinéticas (kcat y Km) para Ia incorporación de nucleótidos en el extremo 3' de un cebador y proporcionan una estimación de Ia selectividad de Ia RT por el nucleótido. La determinación de los parámetros cinéticos se lleva a cabo midiendo Ia incorporación de nucleótidos en el extremo 3' del cebador, previamente marcado en su extremo 5' con [γ32P]ATP, en presencia de distintas concentraciones de dNTP, una vez formado el complejo binario RT/molde-cebador. Los productos resultantes son analizados mediante electroforesis en geles de poliacrilamida. Los datos obtenidos se ajustan a Ia ecuación de Michaelis-Menten, y los parámetros kcat (tasa de incorporación) y Km (constante de Michaelis-Menten) son determinados para los nucleótidos correctos e incorrectos. La eficiencia de incorporación errónea {fιnc) se define como Ia relación entre Ia eficacia catalítica (/Ccaí/Km) obtenida para el nucleótido incorrecto y Ia eficacia catalítica obtenida para el nucleótido correcto. Así, una mayor fidelidad de Ia RT implica una menor eficiencia de incorporación errónea.
Para que se produzca Ia fijación de un error en el ADN naciente, no es suficiente Ia incorporación de un nucleótido incorrecto, Ia RT debe ser capaz además, de elongar el extremo desapareado que se genera como consecuencia de esta incorporación errónea. Esta medida de fidelidad se lleva a cabo mediante ensayos de extensión de extremos desapareados. En estos ensayos se calculan las constantes cinéticas en estado estacionario para Ia incorporación de un nucleótido correcto sobre dos tipos de complejo molde- cebador: el complejo con el extremo 3' correctamente apareado y el mismo complejo con el extremo 3' desapareado. La eficiencia de extensión de extremos desapareados (fext) se define como Ia relación entre kcat/Km obtenida para la extensión del extremo desapareado y Ia obtenida para Ia extensión del extremo correctamente apareado.
Los ensayos bioquímicos en el estado preestacionario examinan Ia capacidad de Ia RT para unirse e incorporar el dNTP a tiempos muy cortos (como por ejemplo, del orden de milisegundos). De esta forma, es posible el cálculo de Ia constante de afinidad (Kd) para Ia interacción entre el dNTP y el complejo binario RT/molde-cebador, y de Ia constante de polimerización (/cpo/). La eficiencia de incorporación errónea y de extensión de extremos desapareados se determina a partir de los valores de kpo¡ /Kd obtenidos para Ia incorporación de nucleótidos correctos o incorrectos, o los obtenidos para Ia incorporación de nucleótidos correctos sobre complejos molde-cebador que contienen un extremo 3'OH apareado o desapareado.
Los ensayos genéticos más utilizados, denominados "forward mutation assays", se suelen llevar a cabo usando como molde-cebador de Ia reacción de síntesis de ADN, el ADN bicatenario del fago M13mp2, del cual se ha eliminado Ia zona correspondiente al gen lacZ de una de las hebras. La reacción de síntesis de ADN se realiza en presencia de Ia RT y de concentraciones altas de los dNTPs. Tras Ia transformación bacteriana con el producto de Ia reacción, los mutantes se identifican como placas azules/blancas en medio de cultivo que contiene X- GaI (5-bromo-4-cloro-3-indol-β-galactopiranósido) e IPTG (isopropil-β-tio- galactopiranósido). De este modo, si en Ia reacción de síntesis de ADN no se producen errores, el resultado es una placa azul oscuro. Por el contrario, Ia introducción de uno o varios errores implica Ia pérdida parcial o total de Ia α- complementación, Io que se traduce en placas azul claro o blancas. El ADN recuperado de estas placas puede ser secuenciado, para determinar exactamente el número, el tipo y Ia posición en el genoma de las mutaciones introducidas por Ia RT.
Otro tipo de ensayos genéticos son los ensayos de reversión. Estos ensayos se basan en el uso de moldes que contienen una mutación inactivante (típicamente, codones de terminación o inserciones de un nucleótido). La reversión de Ia mutación se traduce en Ia corrección del error y por Io tanto en Ia restauración de Ia actividad del gen marcador.
El "incremento en Ia fidelidad de copia" puede medirse mediante Ia comparación de parámetros indicativos de Ia fidelidad de copia de las RTs de Ia invención y Ia RT no modificada. Estos parámetros pueden analizarse, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante cualquiera de los métodos anteriormente descritos en este documento.
Una RT con una fidelidad de copia "incrementada" o "aumentada" se define como una RT que tiene un incremento o un aumento significativo (aplicando criterios estadísticos) en Ia fidelidad de copia con respecto a Ia RT no modificada, típicamente de, al menos, 1 ,5 veces, más preferiblemente de, al menos, 2 veces, y aún más preferiblemente de, al menos, 3 veces, y aún más preferiblemente de, al menos, 4 veces. Por ejemplo, en ensayos bioquímicos de incorporación de nucleótido, se considera un aumento de fidelidad cuando el valor obtenido para Ia RT modificada es significativamente superior al de Ia no modificada (aplicando criterios estadísticos), típicamente, de al menos, 1 ,5 veces, preferiblemente, de al menos, 2 veces, más preferiblemente de, al menos, 3 veces, y aún más preferiblemente de, al menos, 4 veces. Por ejemplo, en ensayos genéticos ("forward mutation assays") se considera fidelidad incrementada cuando hay un aumento significativo (aplicando criterios estadísticos) en Ia frecuencia de muíante obtenida por Ia RT modificada, típicamente de, al menos, un 50% (1 ,5 veces), preferiblemente, de al menos, 2 veces, más preferiblemente de, al menos, 3 veces, y aún más preferiblemente de, al menos, 4 veces.
La temperatura a Ia cual Ia actividad polimerasa (dependiente de ARN o ADN) de una RT es máxima se denomina temperatura óptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de Ia reacción debido a Ia temperatura es contrarrestado por Ia pérdida de actividad catalítica debida a Ia desnaturalización térmica de Ia RT, de manera que su actividad polimerasa (dependiente de ADN o ARN) decrece. El término "termoestabilidad" se refiere a Ia estabilidad mostrada por una RT cuando se encuentra sometida a una temperatura elevada, por ejemplo, típicamente, una temperatura de, al menos, 450C, preferiblemente de, al menos, 55 0C, más preferiblemente de, al menos, 60 0C y aun más preferiblemente de, al menos 65 or Vy .
La termoestabilidad de Ia RT de Ia presente invención puede ser analizada mediante diferentes tipos de análisis. La termoestabilidad de Ia RT de Ia presente invención, puede estimarse, por ejemplo, pero sin limitarse, midiendo Ia actividad específica ADN polimerasa a distintas temperaturas elevadas, utilizando un complejo molde-cebador, analizando Ia actividad RT residual después de someter a Ia enzima a una incubación a temperatura elevada durante distintos intervalos de tiempo, analizando Ia vida media de Ia RT o midiendo Ia cantidad y/o Ia longitud del producto sintetizado por Ia RT a una elevada temperatura.
La "vida media" de una proteína es un parámetro que permite medir su termoestabilidad. Por ejemplo, Ia vida media de Ia actividad RT se refiere al tiempo en que Ia actividad polimerasa (dependiente de ARN o ADN) se reduce a Ia mitad cuando Ia reacción de síntesis (dependiente de ARN o ADN) se realiza a una elevada temperatura.
Otros parámetros indicativos de Ia termoestabilidad de una RT son Ia cantidad y/o Ia longitud del producto sintetizado por Ia RT cuando Ia reacción de síntesis se realiza a una elevada temperatura. Por ejemplo, se puede obtener una estimación de Ia estabilidad de Ia RT, analizando Ia cantidad del producto obtenido mediante Ia RT en una RT-PCR. Para ello, se puede realizar primero una reacción de retrotranscripción empleando como ácido nucleico molde ARN total a una temperatura elevada, y después el ADN complementario obtenido de Ia retrotranscripción se puede amplificar el producto de reacción mediante
PCR. La cantidad de producto obtenido en estas reacciones constituye una medida de Ia estabilidad de Ia RT, a Ia temperatura en Ia que se ha llevado a cabo Ia reacción de retrotranscripción.
Una "reacción de síntesis a elevada temperatura", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a una reacción y, más preferiblemente, una reacción de retrotranscripción (o transcripción inversa), que se realiza a una temperatura de, al menos, 450C, preferiblemente de, al menos, 55 0C, más preferiblemente de, al menos 60 0C y aun más preferiblemente de, al menos, 65 0C.
En algunas circunstancias, Ia RT de Ia invención puede mostrar un incremento de Ia termoestabilidad en presencia o en ausencia del ácido nucleico molde. Es conocido en el estado de Ia técnica que las RTs son, típicamente, más estables en presencia del ácido nucleico molde.
La expresión "termoestabilidad incrementada", tal y como se utiliza en Ia presente descripción se refiere a que Ia RT del VIH-1 de grupo O modificada, que comprende una secuencia de aminoácidos, mutada en los residuos que corresponden a Ia posiciones 75 y 478 de Ia SEQ ID NO: 1 , conserva su actividad a una temperatura de reacción de síntesis más elevada, o actúa más tiempo a Ia misma temperatura, que Ia RT que únicamente tiene una mutación en el residuo que corresponde a Ia posición 75 de Ia SEQ ID NO: 1.
Una RT con termoestabilidad "incrementada" o "aumentada" se define como una RT que tiene un incremento o un aumento significativo (aplicando criterios estadísticos) en Ia termoestabilidad, típicamente de, al menos, 1 ,5 veces, más preferiblemente de, al menos, 2 veces, y aún más preferiblemente de, al menos, 3 veces, y aún más preferiblemente de, al menos, 4 veces, con respecto a Ia RT que únicamente tiene una mutación en el residuo que corresponde a Ia posición 75 de Ia SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, cuando se estima Ia termoestabilidad mediante Ia cantidad del producto obtenido mediante
Ia RT en una RT-PCR, se considera que Ia RT tiene una fidelidad de copia incrementada cuando Ia cantidad de producto obtenido mediante Ia RT-PCR tiene un incremento o un aumento significativo (aplicando criterios estadísticos), típicamente de, al menos 1 ,5 veces, preferiblemente de, al menos, 3 veces, y aún más preferiblemente de, al menos, 4 veces, con respecto a Ia RT que únicamente tiene una mutación en el residuo que corresponde a Ia posición 75 de Ia SEQ ID NO: 1.
Tal y como se utiliza en Ia presente descripción, el término "mutación" se refiere a una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido distinto. Los aminoácidos individuales en una secuencia se representan aquí como XN, en Ia que X es el aminoácido en Ia secuencia (designado mediante el código de una letra universalmente aceptado en Ia nomenclatura de aminoácidos), y N es Ia posición en Ia secuencia. Las mutaciones puntuales tipo sustitución en una secuencia de aminoácidos se representan aquí como XiNX2, en Ia que Xi es el aminoácido en Ia secuencia de proteína no mutada, X2 es el aminoácido en Ia secuencia de proteína mutada, y N es Ia posición en Ia secuencia de aminoácidos.
La secuencia de aminoácidos comprendida por Ia RT de Ia invención puede obtenerse mediante técnicas de ingeniería genética o recombinante bien conocidas en el estado de Ia técnica. Pueden obtenerse, por ejemplo, mutando el gen de Ia RT mediante mutagénesis dirigida o al azar. Preferiblemente, Ia mutación se introduce en Ia secuencia de aminoácidos mediante un cambio de codón adecuado en el polinucleótido que codifica para Ia RT. Más preferiblemente, los mutantes de Ia presente invención pueden obtenerse mediante Ia técnica de mutagénesis dirigida por oligonucléotido. Esta técnica consiste en el anillamiento de un oligonucléotido complementario (excepto por
Ia presencia de uno o más nucleótidos desapareados) con Ia secuencia nucleotídica de Ia RT del VIH-1 de grupo O. El oligonucléotido parcialmente desapareado es entonces extendido por una ADN polimerasa, generando una molécula de ADN de cadena doble que contiene el cambio deseado en Ia secuencia de una de las cadenas. Los cambios introducidos en Ia secuencia tienen como consecuencia el cambio de un aminoácido por otro. El polinucléotido de doble cadena puede ser entonces insertado en un vector de expresión apropiado y el polipéptido muíante producido. La mutagénesis dirigida por oligonucleótido puede ser llevada a cabo, por ejemplo, mediante PCR.
Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere a un polinucléotido que codifica Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia RT de Ia invención.
Los términos "secuencia nucleotídica", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucléotido" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquímicamente modificados.
Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere a un vector que comprende el polinucléotido que codifica Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia RT de Ia invención.
El vector puede ser, por ejemplo un vector de clonación o un vector de expresión. Preferiblemente, dicho vector es un vector apropiado para Ia expresión y purificación de Ia RT de Ia invención.
El término "vector de clonación", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a una molécula de ADN en Ia que se puede integrar otro fragmento de ADN, sin que pierda Ia capacidad de autorreplicación. Ejemplos de vectores de expresión son, pero sin limitarse, plásmidos, cósmidos, fagos de ADN o cromosomas artificiales de levadura.
El término vector de "expresión", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a un vector de clonaje adecuado para expresar un ácido nucleico que ha sido clonado en el mismo tras ser introducido en una célula, denominada célula huésped. Dicho ácido nucleico se encuentra, por Io general, unido operativamente a secuencias de control.
El termino "expresión" se refiere al proceso por el cuál se sintetiza un polipéptido a partir de un polinucleótido. Incluye Ia transcripción del polinucleótido en un ARN mensajero (ARNm) y Ia traducción de dicho ARNm en una proteína o un polipéptido.
El término "célula huésped", tal y como se utiliza en Ia presente descripción se refiere a cualquier organismo procariota o eucariota que es recipiente de un vector de expresión, de clonación o de cualquier otra molécula de ADN.
El término "secuencia de control", tal y como se utiliza en Ia presente descripción se refiere a secuencias nucleotídicas que son necesarias para efectuar Ia expresión de las secuencias a las que están ligadas. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para Ia expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa. Ejemplos de secuencias de control, son por ejemplo, pero sin limitarse, promotores, señales de inicio de Ia transcripción, señales de terminación de Ia transcripción, señales de poliadenilación o activadores transcripcionales.
La expresión "unidos operativamente", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a una yuxtaposición en Ia que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en Ia manera intencionada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" a un polinucleótido, está ligada de tal manera que Ia expresión de Ia secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Como se usa aquí, el término "promotor" hace referencia a una región del ADN, generalmente "aguas arriba" o "upstream" del punto de inicio de Ia transcripción, que es capaz de iniciar Ia transcripción en una célula. Este término incluye, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores constitutivos, promotores específicos de tipo celular o de tejido o promotores inducibles o reprimibles.
Las secuencias de control dependen del origen de Ia célula en Ia que se quiere expresar el ácido nucleico. Ejemplos de promotores procariotas incluyen, por ejemplo, pero sin limitarnos, los promotores de los genes trp, recA, lacZ, lacl, tet, gal, trc, o tac de E. coli, o el promotor del gen α-amylase de B. subtilis. Para Ia expresión de un ácido nucleico en una célula procariota también es necesaria Ia presencia de un sitio de unión ribosomal situado "upstream" de Ia secuencia codificante. Secuencias de control apropiadas para Ia expresión de un polinucleótido en células eucariotas son conocidas en el estado de Ia técnica.
Utilizando técnicas bien conocidas, un experto en Ia materia será capaz de obtener un vector adecuado para Ia expresión de Ia secuencia de aminoácidos que comprende Ia RT de Ia invención en cualquier célula procariota o eucariota.
Una realización preferida de este aspecto de Ia invención, se refiere a un vector que comprende un polinucleótido que codifica Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia RT de Ia invención, donde dicho polinucleótido está unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de Ia lista que comprende:
a) un promotor, b) una señal de inicio de Ia transcripción, c) una señal de terminación de Ia transcripción, d) una señal de poliadenilación, o e) un activador transcripcional.
Una realización preferida de este aspecto de Ia invención, se refiere a un vector que comprende un polinucleótido que codifica Ia secuencia de aminoácidos comprendida por Ia RT de Ia invención, donde dicho polinucleótido está unido en fase de lectura a una secuencia nucleotídica que codifica para una etiqueta de purificación.
La expresión "etiqueta de purificación" o "etiqueta de afinidad", tal y como se utiliza en Ia presente descripción se refiere a una secuencia de aminoácidos que ha sido incorporada (generalmente, por ingeniería genética) a una proteína para facilitar su purificación. La etiqueta, que puede ser otra proteína o una secuencia corta de aminoácidos, permite Ia purificación de Ia proteína, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad. Algunos ejemplos de etiquetas de purificación conocidos en el estado de Ia técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse a: el péptido de unión a calmodulina (CBP), Ia enzima glutatión-S- transferasa (GST) o una cola de residuos de histidina. Preferiblemente, Ia etiqueta de purificación consiste en al menos 6 residuos de histidina.
De ahora en adelante utilizaremos Ia expresión "vector primero de Ia invención" para referirnos a un vector que comprende un polinucleótido que codifica Ia secuencia comprendida en Ia RT de Ia invención, donde dicho vector presenta cualquiera de las características descritas anteriormente en Ia presente descripción.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención, se refiere a un vector que comprende un polinucleótido que codifica Ia secuencia de aminoácidos comprendida por Ia RT de Ia invención y que, además, comprende un polinucleótido que codifica para una proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia RT de Ia invención entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de Ia SEQ ID NO: 1. De ahora en adelante utilizaremos Ia expresión "vector segundo de Ia invención" para referirnos a un vector que comprende un polinucleótido que codifica Ia secuencia comprendida en Ia RT de Ia invención, donde dicho vector presenta cualquiera de las características del vector primero de Ia invención, y que además comprende un polinucleótido que codifica para una proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia RT de Ia invención entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de Ia SEQ ID NO: 1.
En una realización preferida, Ia proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia RT de Ia invención entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de Ia SEQ ID NO: 1 es Ia proteasa del VIH-1 , una variante de Ia proteasa del VIH-1 o un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente.
El término "proteasa de VIH-1", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a una proteasa aislada de un virus de Ia inmunodeficiencia humana de tipo 1. El término "proteasa aislada del virus de Ia inmunodeficiencia humana de tipo 1" se refiere a una proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia RT de Ia invención entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de Ia SEQ ID NO: 1 , que se encuentra sustancialmente o completamente libre de los componentes que normalmente Io acompañan o interactúan con ella en su forma natural. Puede obtenerse, por ejemplo, por amplificación mediante Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR) de Ia secuencia de nucleótidos que codifica para Ia secuencia de aminoácidos de Ia proteasa a partir del ARN viral obtenido de un aislado del VIH-1 , y posterior clonaje en un vector de expresión. Preferiblemente, Ia proteasa del VIH-1 tiene Ia secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4. La SEQ ID NO: 4 corresponde a Ia secuencia de Ia proteasa del VIH- 1 aislada de Ia cepa prototípica de grupo M-subtipo B NL4-3. En el virus, dicha proteasa forma homodímeros mediante Ia unión no covalente de sus subunidades.
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "variante" se refiere a una proteína sustancialmente homologa a Ia proteasa del VIH-1. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos. El término "variante" incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postranslacionales como, por ejemplo, pero sin limitarse, glicosilación, fosforilación o metilación.
Tal como aquí se utiliza, una proteína es "sustancialmente homologa" a Ia proteasa del VIH-1 cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con Ia secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a Ia secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, de, al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%, preferentemente de, al menos un 90%, más preferentemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferentemente de, al menos, un 99%.
El término "fragmento", tal y como se utiliza en Ia presente descripción se refiere a una porción de Ia proteasa del VIH-1 o de una sus variantes.
La expresión "funcionalmente equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que Ia proteína o el fragmento de Ia proteína en cuestión mantiene Ia capacidad de realizar un corte endoproteolítico en Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia RT de Ia invención entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de Ia SEQ ID NO: 1.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a una célula que comprende el vector primero de Ia invención. De ahora en adelante utilizaremos Ia expresión "célula primera de Ia invención" para referirnos a una célula que comprende el vector primero de Ia invención.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a una célula que comprende el vector segundo de Ia invención. De ahora en adelante utilizaremos Ia expresión "célula segunda de Ia invención" para referirnos a una célula que comprende el vector segundo de Ia invención. Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a una célula que comprende el vector primero de Ia invención y que, además, comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica para una proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia RT de Ia invención entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de Ia SEQ ID NO: 1. De ahora en adelante utilizaremos Ia expresión "célula tercera de Ia invención" para referirnos a una célula con dichas características.
De ahora en adelante utilizaremos Ia expresión "célula de Ia invención" para referirnos a Ia célula primera, a Ia célula segunda o a Ia célula tercera de Ia invención. La célula de Ia invención puede ser una célula procariota o eucariota. Preferiblemente, Ia célula de Ia invención es una célula procariota.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un método para producir Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia RT de Ia invención que comprende:
a) cultivar Ia célula de Ia invención, y b) aislar Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia RT expresada en el paso (a) por dicha célula.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un método para producir Ia RT de Ia invención que comprende:
a) cultivar Ia célula de Ia invención, y b) aislar Ia RT expresada en el paso (a) por dicha célula.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia RT de Ia invención para Ia RT de un ácido nucleico molde, preferiblemente ARNm.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia RT de Ia invención para Ia amplificación de un ácido nucleico molde, preferiblemente ARNm. Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia RT de Ia invención para Ia secuenciación de un ácido nucleico molde, preferiblemente ARNm.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un método de RT de un ácido nucleico molde, preferiblemente ARNm, que comprende:
a) mezclar dicho ácido nucleico molde con Ia RT de Ia invención, e b) incubar Ia mezcla del paso (a) en condiciones que permitan Ia síntesis de ADN complementario al ácido nucleico molde.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un método de amplificación de un ácido nucleico molde, preferiblemente ARNm, que comprende:
a) mezclar dicho ácido nucleico con Ia RT de Ia invención y con, al menos, una ADN polimerasa dependiente de ADN, e b) incubar Ia mezcla del paso (a) en condiciones que permitan Ia amplificación de ADN complementario al ácido nucleico molde.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un método de secuenciación de un ácido nucleico, preferiblemente ARNm, que comprende:
a) poner en contacto dicho ácido nucleico con Ia RT de Ia invención, b) incubar dicha mezcla en condiciones que permitan Ia síntesis de una población de moléculas de ADN complementario al ácido nucleico molde, y c) separar dicha población de moléculas de ADN complementario para determinar Ia secuencia de nucleótidos.
El término "retrotranscripción" o "transcripción inversa", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a Ia síntesis de un ADN complementario a un ARN. El término "amplificación", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere al aumento del número de copias de un ácido nucleico molde. En una realización preferida, Ia amplificación tiene lugar mediante PCR.
El término "secuenciación", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a Ia determinación del orden de los nucleótidos de un ácido nucleico molde.
El término "ácido nucleico molde", "ácido nucleico templado", "molde" o "templado", tal y como se utiliza en Ia presente descripción se refiere a una molécula de ácido nucleico de cadena simple o de doble cadena que va a ser retrotranscrita, amplificada o secuenciada.
La expresión "condiciones que permitan Ia síntesis de ADN complementario" se refiere a las condiciones en las que puede tener lugar Ia incorporación de los nucleótidos a un ADN naciente mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde.
Generalmente las condiciones en las que tiene lugar Ia síntesis de ADN incluyen: (a) poner en contacto dicho ácido nucleico molde con Ia RT de Ia invención en una mezcla que además comprende un cebador, un catión bivalente, por ejemplo, Mg2+, y nucleótidos, y (b) someter dicha mezcla a una temperatura suficiente para que una polimerasa de ADN, por ejemplo, Ia RT de Ia invención, inicie Ia incorporación de los nucleótidos al cebador mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde, y de lugar una población de moléculas de ADN complementario de diferente tamaño. La separación de dicha población de moléculas de ADN complementario permite determinar Ia secuencia de nucleótidos del ácido nucleico molde.
La incorporación de nucleótidos mal apareados durante Ia síntesis del ADN complementario puede resultar en una o más bases desapareadas. Por tanto, Ia cadena de ADN sintetizada puede no ser exactamente complementaria al ácido nucleico molde.
La expresión "condiciones que permitan Ia síntesis de una población de moléculas de ADN complementario al ácido nucleico molde" se refiere a las condiciones en las cuáles se realiza Ia secuenciación, y que generalmente incluyen (a) poner en contacto dicho ácido nucleico molde con Ia RT de Ia invención en una mezcla que además comprende un cebador, un catión bivalente, (por ejemplo, Mg2+), y nucleótidos, generalmente, dNTPs y, al menos, un ddNTP, y (b) someter dicha mezcla a una temperatura suficiente para que una polimerasa de ADN, por ejemplo, Ia RT de Ia invención, inicie Ia incorporación de los nucleótidos al cebador mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde, y de lugar a una población de moléculas de ADN complementario de diferente tamaño. La separación de dicha población de moléculas de ADN complementario, generalmente, mediante electroforesis, permite determinar Ia secuencia de nucleótidos.
El término "cebador", como se utiliza aquí, se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de inicio de Ia síntesis de ADN cuando híbrida con el ácido nucleico molde. Preferiblemente, el cebador es un oligonucleótido de desoxirribosa.
Los cebadores pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a, Ia clonación y restricción de secuencias apropiadas y Ia síntesis química directa. Los cebadores pueden diseñarse para hibridar con secuencias específicas de nucleótidos en el ácido nucleico molde (cebadores específicos) o pueden ser sintetizados al azar (cebadores arbitrarios).
El término "cebador específico", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a un cebador cuya secuencia es complementaria a una secuencia específica de nucleótidos en el ácido nucleico molde que se quiere retrotranscribir, amplificar o secuenciar. El término "cebador arbitrario" se refiere a un cebador cuya secuencia es sintetizada al azar y que se usa para iniciar Ia síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ácido nucleico molde que se quiere retrotranscribir, amplificar o secuenciar. Con frecuencia se emplea una población de distintos cebadores arbitrarios. El término "cebadores arbitrarios" se refiere a un conjunto de cebadores cuya secuencia es sintetizada al azar y que se usa para iniciar Ia síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ácido nucleico molde que se quiere retrotranscribir, amplificar o secuenciar.
El término "hibridación", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere al apareamiento de dos moléculas de ácido nucleico (de ADN y/o ARN) de cadena simple complementarias para dar una molécula de doble cadena. Preferiblemente, Ia complementariedad es del 100%. Esto es, en Ia región de complementariedad cada nucleótido de una de las dos moléculas de ácido nucleico puede formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido presente en Ia otra molécula de ácido nucleico. Sin embargo, aquellos con una experiencia normal en el campo reconocerán que dos moléculas de ácido nucleico que posean una región con complementariedad menor al 100% también pueden hibridar.
El término "nucleótido", tal y como se utiliza en Ia presente descripción se refiere a un molécula orgánica formada por Ia unión covalente de una pentosa, una base nitrogenada y un grupo fosfato. El término nucleótido incluye desoxirribonucleósidos trifosfato como, por ejemplo, pero sin limitarse, dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, o derivados de los mismos. El término nucleótido incluye también dideoxirribonucleósidos trifosfato (ddNTPs), como por ejemplo, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP, ddTTP o derivados de los mismos.
De acuerdo con Ia presente invención un "nucleótido" o un "cebador" puede ser marcado o etiquetado mediante técnicas bien conocidas en el estado de Ia técnica. Etiquetas detectables incluyen, por ejemplo, isótopos radiactivos, etiquetas fluorescentes, etiquetas quimioluminiscentes, etiquetas bioluminiscentes o etiquetas enzimáticas.
El término "ADN polimerasa dependiente de ADN", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a una ADN polimerasa capaz de catalizar Ia polimerización de desoxinucleótidos utilizando ADN como ácido nucleico molde. Ejemplos de ADN polimerasa dependientes de ADN que pueden se empleadas en el método de amplificación de Ia siguiente invención son, pero sin limitarnos, las ADN polimerasas de Thermus thermophilus (Tth), Thermus aquaticus (Taq), Thermotoga neapolitana (Tne), Thermotoga maritima (Tma), Thermococcus litoralis (TIi or VENTTM), Pyrococcus furiosis (Pfu), Pyrococcus species GB-D (Deep Vent ™), Pyrococcus woosii (Pwo), Bacillus stearo- thermophilus (Bst), Bacillus caldophilus (Bca), Sulfolobus acidocaldarius (Sac), Thermoplasma acidophilum (Tac), Thermus flavus (Tfl/Tub), Thermus ruber (Tru), Thermus brockianus (DyNAzyme™), Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth) o Mycobacterium sp. (Mtb, Mlep).
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un kit que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo cualquiera de los métodos descritos anteriormente en Ia presente descripción.
Una realización preferida de este aspecto de Ia invención, se refiere a un kit para llevar a cabo cualquiera de los métodos descritos anteriormente en Ia presente descripción, que comprende:
a) Ia RT de Ia invención, y b) al menos, un elemento de Ia lista que comprende:
i) un tampón, ii) un cebador, iii) una ADN polimerasa dependiente de ADN, y iv) un nucleótido. A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Muestra Ia electroforesis en gel de poliacrilamida y SDS de Ia RT del VIH-1 grupo O "wild-type" resultante de Ia purificación. M, marcadores de peso molecular, pocilios 1-4: albúmina de suero bovino (66,2 kDa) (0,5, 1 , 2 y 4 μg respectivamente); pocilios 5-7: alícuotas de Ia RT de VIH-1 grupo O purificada. El rendimiento de Ia purificación fue superior a 3 mg de RT por litro de cultivo procesado.
Figura 2. Muestra Ia eficiencia de extensión de extremos desapareados obtenida con los tres mutantes analizados.
Figura 3. Muestra Ia amplificación por RT-PCR de fragmentos de ARN codificante para actina, de (A) 500 y (B) 1000 pares de bases, a partir de ARN total de hígado de ratón. La amplificación se llevó a cabo con las enzimas indicadas [RT de VIH-1 grupo O "wild-type" (RTO), RT de VIH-1 subtipo B BH 10 (RTB), muíante V75I en el contexto de RTO (RTO V75I) y el doble muíante V75I/E478Q en el contexío de RTO (RTO V75I/E478Q)]. Las íemperaíuras indicadas se refieren a Ia reacción de síníesis del ADN copia. La eficiencia de esías enzimas se compara íambién con Ia de Ia RT de virus Moloney de Ia leucemia de raíón careníe de acíividad RNasa H (MLV) (véanse reacciones de reíroíranscripción a íemperaíuras superiores a 650C). Ací neg, conírol negaíivo (sin ADNc); Esc, marcadores de peso molecular. Figura 4. Muestra Ia actividad RNasa H de distintas RTs: RT de VIH-1 grupo O "wild-type" (RTO_WT), RT de VIH-1 subtipo B BH 10 (BH10_WT), mutante V75I en el contexto de RTO (RTO_V75I), mutante E478Q en el contexto de RTO (RTO_E478Q) y el doble mutante V75I/E478Q en el contexto de RTO (RTO V75I/E478Q). En Ia parte inferior se indican las secuencias del molde y del cebador utilizado, indicándose con un asterisco Ia posición del extremo marcado radiactivamente.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran Ia invención sin limitar el campo de aplicación de Ia misma.
EJEMPLO 1. Generación, expresión y purificación Ia RTs del virus VIH de tipo 1 de grupo O "wild type" y mutantes.
La expresión y purificación de las RTs se llevó a cabo con una versión modificada del plásmido p66RTB (Boretto et al. Anal. Biochem. 2001 ; 292: 139- 147; Matamoros et al. J. Mol. Biol. 2005; 349: 451-463), que contiene el gen de resistencia a ampicilina y en el que clonamos Ia región codificante de Ia subunidad p66 de Ia RT de un aislado del VIH-1 de grupo O (Menéndez-Arias et al. J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 27470-27479). Para ello se digirió el plásmido p66RTB portador de Ia enzima SS RT (descrito en Matamoros et al. J. Mol. Biol. 2005; 349: 451-463) con las enzimas EcoRI y Xhol y se clonó el inserto que codifica para Ia subunidad p66 de Ia RT de VIH-1 grupo O, derivado de Ia digestión con las mismas enzimas del plásmido pRT6 (portador de Ia variante ESP49) (Menéndez-Arias et al. J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 27470-27479). La secuencia de nucleótidos que comprende Ia región que codifica para Ia subunidad p66 del VIH-1 (grupo O) en el plásmido de expresión se muestra en Ia SEQ ID NO: 5, mientras que Ia secuencia de aminoácidos de Ia RT obtenida con dicho plásmido se indica en Ia SEQ ID NO: 6. Utilizando esta construcción se produce Ia subunidad p66, modificada en el extremo N-terminal por Ia presencia de tres aminoácidos: Met-Asn-Ser, y en el extremo C-terminal por Ia presencia de una cola de 9 aminoácidos (Glu-Ser-Thr-His-His-His-His-His-His), que contiene los seis residuos de histidina, que facilitan su purificación. La subunidad p51 se genera por el procesamiento proteolítico de p66, por parte de Ia proteasa del VIH-1 co-expresada mediante Ia utilización del plásmido pATproteasa (Boretto et al. Anal. Biochem. 2001 ; 292: 139-147).
Los plásmidos para Ia expresión de las RTs mutantes RTO_V75I y RTO_V75I/E478Q se obtuvieron por mutagénesis dirigida utilizando el kit "Quik- Change Site-Directed Mutagénesis" de Stratagene, siguiendo las instrucciones del fabricante. Como oligonucleótidos mutagénicos se emplearon: SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 para introducir Ia mutación V75I, y SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 para E478Q. Como molde para Ia introducción de V75I, se empleó el plásmido portador de Ia secuencia que codifica Ia p66 de VIH-1 (grupo O), descrito anteriormente. La mutación E478Q se introdujo en el plásmido portador de V75I. Tras Ia mutagénesis se comprobó por secuenciación que Ia región codificante de p66 en dichos plásmidos era correcta y contenía únicamente las mutaciones introducidas. Las secuencias de nucleótidos de los insertos portadores de las mutaciones V75I y V75I/E478Q se muestran en las SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, y las secuencias de aminoácidos de las RTs obtenidas de Ia expresión de los plásmidos mutantes se indican las SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14.
La subunidad p66 (con sus extremos modificados) se coexpresa en E. coli XL1 Blue con Ia proteasa del VIH-1 (subtipo B) empleando el vector pATprotease (Boretto et al. Anal. Biochem. 2001 ; 292: 139-147), portador de resistencia a kanamicina. Se obtuvieron 3 cultivos de 1 litro cada uno (medio estándar Luria- Broth con ampicilina 100 μg/ml y kanamicina 50 μg/ml) de E. coli portadora de los plásmidos de expresión de RT grupo O ("wild-type" o los mutantes correspondientes) y pATproteasa, en fase exponencial de crecimiento, y se indujo Ia expresión de RT con isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) durante 20-24 horas.
Al cabo de ese tiempo se recogieron las bacterias y se procesaron siguiendo el procedimiento descrito por Boretto et al. (Anal. Biochem. 2001 ; 292: 139-147), en el que se incluye una etapa de lisis bacteriana y homogenización, seguida de cromatografías de intercambio iónico (en fosfocelulosa) y de afinidad (en columnas de Ni2+-nitriloacético-agarosa).
El rendimiento obtenido a partir de 3 litros de cultivo (10 g de células) fue de 10 mg, estimado a partir del coeficiente de extinción molar de Ia RT a 280 nm (ε2βo = 260450 M"1cm"1) (Kati et al. J. Biol. Chem. 1992; 267: 25988-25997). La proporción de enzima activa obtenida fue igual o superior al 40%. La pureza de Ia RT obtenida fue superior al 95% de acuerdo a estimaciones llevadas a cabo con geles de poliacrilamida y SDS (Figura 1 ). Estos rendimientos son sensiblemente superiores a los obtenidos utilizando protocolos anteriormente descritos, en los que el rendimiento no superaba los 50-100 μg para el mismo volumen de cultivo de partida (Quiñones-Mateu et al. Virology 1997; 236: 364- 373).
EJEMPLO 2. Efecto de las mutaciones V75I y V75I/E478Q sobre Ia fidelidad de copia.
La fidelidad de copia de las RTs se ha determinado mediante ensayos cinéticos de incorporación de nucleótido en el estado pre-estacionario, utilizando complejos molde-cebador 31T/21 P en los que el extremo 3'OH puede estar correcta o incorrectamente apareado (Matamoros et al. J. Mol. Biol. 2008; 375: 1234-1248), y mediante ensayos genéticos utilizando el plásmido M13mp2 lacZa (Bebenek y Kunkel. Methods Enzymol. 1995; 262: 217-232; Matamoros et al. J. Mol. Biol. 2008; 375: 1234-1248). La RT de grupo O portadora del cambio V75I retiene actividad catalítica similar a Ia RT "wild-type" y presenta una menor capacidad para extender cebadores que contienen un extremo 3' desapareado (Tabla 1 ; Figura 2). En ensayos cinéticos en los que se determina Ia eficacia catalítica de Ia reacción con distintos complejos molde-cebador, se observó que Ia presencia de Ia mutación V75I produce un descenso de Ia eficiencia de extensión de extremos desapareados de 3,5 veces para el par G:T; 2,9 veces para el par G:G y de 3,7 veces para el par G:A, cuando se compara con Ia RT de VIH-1 grupo O "wild- type", y de 2 a 6 veces cuando se compara con Ia RT de VIH-1 subtipo B (cepa prototipo BH 10).
Por otro lado se midió Ia fidelidad en ensayos de complementación que utilizan derivados del fago M13mp2 en los que está presente el gen lacZ. Se determinó Ia frecuencia con que se obtenían mutantes cuando el proceso de síntesis se realiza con las distintas RTs recombinantes (Tabla 2). Un aumento de fidelidad de copia se refleja en Ia aparición en el ensayo de un número menor de placas mutantes. La RT del VIH-1 grupo O "wild-type" presentaba un incremento de fidelidad de 2,5 veces con respecto a Ia RT del VIH-1 subtipo B ("wild-type" BH10), mientras que Ia presencia de Ia mutación V75I en el contexto de Ia RT de VIH-1 grupo O mejoraba Ia fidelidad de copia en 4,7 veces respecto a Ia RT de subtipo B. En el contexto de secuencia de Ia RT de VIH-1 grupo O, el doble muíante V75I/E478Q presenta una fidelidad de copia similar a Ia de V75I, en ensayos de complementación que utilizan derivados del fago M13mp2 en los que está presente el gen lacZ.
Tabla 1. Parámetros cinéticos de extensión de extremos desapareados sobre el complejo molde-cebador 31T/21 P para Ia RT del VIH-1 subtipo B "wild-type" BH10 (BH10_WT), comparada con Ia del VIH-1 grupo O "wild-type" (RTCM/VT) y con el mutante V75I en el contexto de secuencia de VIH-1 grupo O (RTO_V75I), determinados en el estado pre- estacionario.
Figure imgf000033_0001
Tabla 2. Fidelidad de Ia RT del VIH-1 subtipo B "wild-type" BH10 (BH10_WT), comparada con Ia del mutante V75I (en el contexto de secuencia de BH10), con Ia del VIH-1 grupo O "wild- type" (RT0_WT) y con los mutantes V75I y V75I/E478Q en el contexto de secuencia de VIH-1
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) grupo O (RTO_V75I y RTO_V75I/E478Q), estimada mediante ensayos genéticos (M13mp2 lacZa "forward mutation assay").
Figure imgf000034_0001
a Datos para BH10_WT y BH10_V75l, tomados de Matamoros et al. J. Mol. Biol. 2008; 375: 1234-1248.
EJEMPLO 3. Efecto de las mutaciones V75I y V75I/E478Q sobre Ia termoestabilidad.
Para analizar Ia termostabilidad de los mutantes se llevaron a cabo reacciones de retrotranscripción a diferentes temperaturas, y posteriormente los productos de reacción (ADNc) se amplificaron por PCR en condiciones estándar. Típicamente, Ia reacción de retrotranscripción se llevó a cabo en un volumen de 20 μl [4 μl de tampón Tris-HCI 250 mM (pH 8,3 at 250C) que contiene KCI 375 mM, MgCI2 15 mM y ditiotreitol 50 mM; 1 μl de ARN total aislado de hígado de ratón (1 μg/μl); 4 μl de una mezcla de los 4 dNTPs (a 2,5 mM cada uno de ellos); 1 μl de oligo-dT (100 μM); 0,5 μl de inhibidor de RNasa (40 unidades/μl); Ia RT a una concentración aproximada de 150 nM y el resto hasta 20 μl de agua]. Inicialmente se incuba el ARN y el oligo dT a 680C durante 3 min. Después se añaden los demás componentes de Ia reacción y se incuba durante 1 hora a Ia temperatura deseada para ver termostabilidad. Finalmente, Ia reacción se detiene incubando 10 min a 920C, para obtener el ADNc. Este se amplifica por PCR en condiciones estándar, utilizando Taq polimerasa y los cebadores ACT1 y ACT2 (fragmento de 500 pares de bases) o ACT1 y ACT3 (fragmento de 1000 pares de bases). Las secuencias de los cebadores utilizados son: ACT1 : SEQ ID NO: 15, ACT2: SEQ ID NO: 16, y ACT3: SEQ ID
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) NO: 17.
EJEMPLO 4: Pérdida de Ia actividad RNasa H en las RTs portadoras del cambio E478Q.
Los estudios de termostabilidad llevados a cabo con las cuatro RTs de VIH-1 (VIH-1 grupo O "wild-type", VIH-1 grupo O mutante V75I, VIH-1 grupo O mutante V75I/E478Q y VIH-1 subtipo B "wild-type BH10") y Ia RT del virus Moloney de Ia leucemia de ratón (MLV) demostraron que las tres enzimas derivadas de VIH-1 grupo O eran las más termoestables (Figura 3). Sin embargo Ia presencia de V75I disminuía Ia termostabilidad de Ia enzima, mientras que cuando iba acompañada por el cambio E478Q, se producía una mejora en su estabilidad que se reflejaba en un aumento en Ia intensidad de Ia banda amplificada. Esto se debe a que Ia presencia de Ia mutación E478Q conduce a Ia pérdida de actividad RNasa H de Ia enzima (Figura 4), Io que facilita Ia estabilidad del ARN en reacciones de amplificación.
La actividad RNasa H de los mutantes generados se determinó con un complejo molde-cebador, cuya estructura aparece en Ia parte inferior. El molde ARN se encuentra marcado en su extremo 5' con 32P y Ia reacción se lleva a cabo a 370C, en presencia de molde-cebador ARN/ADN a 50 nM y Ia RT correspondiente a 100 nM, en un tampón que contenía: Tris-HCI 50 mM (pH 8.0), NaCI 50 mM y MgCI2 5 mM. Las reacciones se iniciaron tras añadir 1 μl de Ia RT concentrada y MgCI2. Se tomaron alícuotas a 0, 15, 60, 120, 240 y 480 s, y Ia reacción se detuvo añadiendo EDTA 10 mM disuelto en formamida al 90%. Las muestras se analizaron en geles desnaturalizantes de poliacrilamida y urea. Los fragmentos de 26 y 25 nucleótídos se generan como consecuencia de Ia ruptura del molde ARN por parte de Ia actividad RNasa H de Ia RT. La ausencia de degradación del molde de 31 nucleótidos demuestra Ia pérdida de actividad RNasa H por parte de los mutantes portadores del cambio E478Q.
HOJA DE REEMPLAZO íReela 26Ϊ

Claims

REIVINDICACIONES
1. Retrotranscriptasa aislada de un virus de Ia inmunodeficiencia humana de tipo 1 de grupo O y modificada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una mutación que modifica dicha secuencia de aminoácidos en el residuo que corresponde a Ia posición 75 de Ia SEQ ID NO:
1. en el que Ia retrotranscriptasa modificada tiene una fidelidad de copia incrementada con relación a Ia retrotranscriptasa no modificada correspondiente.
2. Retrotranscriptasa según Ia reivindicación 1 , donde el residuo que se corresponde con Ia posición 75 de Ia SEQ ID NO: 1 es isoleucina.
3. Retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde Ia secuencia de aminoácidos presenta una identidad de, al menos, un 90 % con
Ia SEQ ID NO: 1.
4. Retrotranscriptasa según Ia reivindicación 3, donde Ia secuencia de aminoácidos presenta una identidad de, al menos, un 95 % con Ia SEQ ID NO: 1.
5. Retrotranscriptasa según Ia reivindicación 4, donde Ia secuencia de aminoácidos presenta una identidad de, al menos, un 98 % con Ia SEQ ID NO: 1.
6. Retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde Ia secuencia de aminoácidos además tiene otra mutación que modifica dicha secuencia de aminoácidos en el residuo que corresponde a Ia posición 478 de Ia SEQ ID NO: 1 , en el que Ia retrotranscriptasa modificada tiene una termoestabilidad incrementada con relación a Ia retrotranscriptasa modificada en el residuo que corresponde a Ia posición 75 de Ia SEQ ID NO: 1.
7. Retrotranscriptasa según la reivindicación 6, donde el residuo que se corresponde con Ia posición 478 de Ia SEQ ID NO: 1 es glutamina.
8. Retrotranscriptasa según las reivindicaciones 1 a 5, donde Ia secuencia de aminoácidos es Ia SEQ ID NO: 2.
9. Retrotranscriptasa según las reivindicaciones 6 ó 7, donde Ia secuencia de aminoácidos es Ia SEQ ID NO: 3.
10. Polinucleótido que codifica Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Vector que comprende el polinucleótido según Ia reivindicación 10.
12. Vector según Ia reivindicación 11 donde el polinucleótido que codifica Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia retrotranscriptasa está unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de Ia lista que comprende:
a) un promotor, b) una señal de inicio de Ia transcripción, c) una señal de terminación de Ia transcripción, d) una señal de poliadenilación, o e) un activador transcripcional.
13. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12 donde el polinucleótido que codifica Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia retrotranscriptasa está unido en fase de lectura a una secuencia que codifica para una etiqueta de purificación.
14. Vector según Ia reivindicación 13 donde Ia etiqueta de purificación consiste en una cola de residuos de histidina.
15. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que además comprende un polinucleótido que codifica para una proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en Ia secuencia de aminoácidos comprendida Ia en retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de Ia SEQ ID NO: 1.
16. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 que, además, comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica para una proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de Ia SEQ ID NO: 1.
17. Célula que comprende el vector según Ia reivindicación 15.
18. Método para producir Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que comprende:
a) cultivar Ia célula según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, y b) aislar Ia secuencia de aminoácidos comprendida en Ia retrotranscriptasa expresada en el paso (a) por dicha célula.
19. Método para producir Ia retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que comprende:
a) cultivar Ia célula según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, y b) aislar Ia retrotranscriptasa expresada en el paso (a) por dicha célula.
20. Uso de Ia retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para Ia retrotranscripción de un ácido nucleico molde.
21. Uso de Ia retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para Ia amplificación de un ácido nucleico molde.
22. Uso de Ia retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para Ia secuenciación de un ácido nucleico molde.
23. Uso de Ia retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 donde el ácido nucleico molde es ARNm.
24. Método de retrotranscripción de un ácido nucleico molde que comprende:
a) mezclar dicho ácido nucleico molde con Ia retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, e b) incubar Ia mezcla del paso (a) en condiciones que permitan Ia síntesis de ADN complementario al ácido nucleico molde.
25. Método de amplificación de un ácido nucleico molde que comprende:
a) mezclar dicho ácido nucleico con Ia retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y con, al menos, una ADN polimerasa dependiente de ADN, e b) incubar Ia mezcla del paso (a) en condiciones que permitan Ia amplificación de ADN complementario al ácido nucleico molde.
26. Método de secuenciación de un ácido nucleico molde que comprende:
a) poner en contacto dicho ácido nucleico con Ia retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, b) incubar dicha mezcla en condiciones que permitan Ia síntesis de una población de moléculas de ADN complementario al ácido nucleico molde, y c) separar dicha población de moléculas de ADN complementario para determinar Ia secuencia de nucleótidos.
27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26 donde el ácido nucleico molde es ARNm.
28. Kit que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo un método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27 que comprende:
a) Ia retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
9, y b) al menos, un elemento de Ia lista que comprende: i) un tampón, ii) un cebador, iii) una ADN polimerasa dependiente de ADN, y iv) un nucleótido.
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