WO2010112968A1 - Produit antiviral hydrosoluble a base du momordica balsamina pour le traitement et la prévention du syndrome immuno déficience acquise (sida) et ses variantes. - Google Patents

Produit antiviral hydrosoluble a base du momordica balsamina pour le traitement et la prévention du syndrome immuno déficience acquise (sida) et ses variantes. Download PDF

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    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV

Definitions

  • the invention relates to an antiviral product based on Momordica Balsamina virolysis, viro-static and water-soluble leaf. It is intended for the treatment and prevention of Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) and its variants.
  • AIDS is an infectious disease that strikes the entire planet and particularly African countries. It has been found that AIDS is often accompanied by lymphadenopathic syndromes which in their final stage are manifested by a collapse of the subject's immune defenses. The agent responsible for this pandemic has been isolated since 1983 by Professor Luc MONTAGNIER of the Institut Pasteur. The state of the art known to the inventor made it possible to identify the following documents:
  • OAPI Patent No. 09043 issued to CRUZ Joseph on March 31, 1991 and relating to new antiviral compositions based on extract of the Mimosa Pudica LINN leaf.
  • OAPI Patent No. 11602 issued to Dr. Erick GBODOSSOU and relating to a composition of extracts of 5 (five) plants (Momordica Balsamina, Aframomum Melegueta, Cyperus Articulatus, Ficus Iteophylla, Tamarindus Indica).
  • the absorbed product extirpates the AIDS virus from stool and urine.
  • WO 94/18993 issued September 1994 to PHARMAKON USA, Inc. US Patent 5484889 issued University Apr. 16992.
  • the product, object of the invention is based on leaves of Momordica Balsamina, water-soluble, virolysis and viro static.
  • studies on the botanical, pharmacological and chemical aspects were carried out by the laboratory of the Ministry of Scientific Research of Senegal, and analyzes of the extract of the plant were made by the Morehouse laboratory School of Medicine (Atlanta) USA, based on a repository developed by the inventor.
  • the leaves contain two acidic resins and a bitter substance, momordicin. They are rich in free C vitamins: 0.004 to 0.05% with or without carotene. There is also aminobutyric acid which slows down the evolution and makes the development of the virus static.
  • the extracts of the whole plant gives a hypoglycemic, anticancer action; the antibiotic activity of leaf extracts is proven.
  • the abortive proteins possess, in vitro and in vivo, modulating actions on the immune system. Momorcharins have an inhibitory action on the human immunodeficiency virus.
  • the dried, powdered leaf was donated to the Virology Services team at Morehouse School of Medicine (Atlanta - USA) to verify its in vitro activity on the virus and its variants, based on the inventor's repositories. .
  • the virus and the extract are tested initially from 10 mg per 1 microgram of extract.
  • the extracts must be tested for a current application and show a direct effect on the virus. This could include blocking the g ⁇ 120 virus envelope protein or dissolving the lipids contained in the virus envelope.
  • active ingredients can integrate virions and affect viral capsids or catalytic proteins such as reverse transcription, protease or integrase.
  • the extract / virus mixture After a preliminary incubation of 15 minutes with the extract, the extract / virus mixture must be added to cultures of the tissue from which the support was taken. The virus must absorb it for 30 minutes at a temperature of 37 ° C. The culture is then washed 3 times with PBS and finally stored in fresh medium.
  • the MAGI indicator cells that are HeLa cells that are designed to be infected with HIV-I should be used. Following infection, these cells produce beta-galactosidase, detectable as a blue color on the development of the infection.
  • a comparison of the number of blue cells treated with untreated cells provides a relative indication of inhibition.
  • the virus used in the initial studies must not have any gene and is therefore limited to a single stage of infection of the cell. This single stage of cell infection is by far the most appropriate approach for determining the effects of infection. It is important to establish in these tests an appropriate dose that is not toxic to the cells and that still contains a maximum concentration of soluble substance. If antiretroviral activity is found in the initial test, it will be necessary to determine how much of the viral life cycle is being affected. Specific viral isolators and "indicator" cells can be used to determine the relative performance of virus entry.
  • the entry of the virus is intact, it is possible to determine the extent to which reverse transcription has been affected by using PCR assays that detect different steps of viral DNA formation.
  • the ability to produce intact virions can be directly determined using standard p24 ELISA assays while viral maturation can be determined by viral proteins of pates present in the virions. It must also be able to at least make an initial determination of the nature of the soluble substance. Extrease protease treatment is used to determine whether the proteins present in the extract are responsible for the activity.
  • the soluble fraction is devoid of bacteria.
  • the substances present at the beginning in the dried materials are completely dissolved.
  • the solution obtained is a maximum concentration of the dried powder of about 100 mg / ml.
  • the MAGI cells are genetically engineered by HeLa cells that contain a reporter reporter cassette comprising the viral LTR, located upstream of the E. coli • - gal encoding gene.
  • Gene expression is dependent on activation by the HIV Tat protein, which requires HIV infection.
  • the infected cells turn blue and can be counted using a microscope.
  • the product is not complex and has a set of molecules less than 10,000 Da in size and displays resistance to protease treatment.
  • the antiviral product based on Momordica Balsamina for the treatment and prevention of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) and its variants, object of the present invention is carried out as follows.
  • Momordica Balsamina leaf after collection is dried naturally and is reduced to a fine powder.
  • the dried powder is macerated in water sterilized with 100% methanol.
  • the solution is then passed through a filter 45 microns in diameter and gives an antiviral, virolysis, viro static and water-soluble product.
  • the product can be used as a vaginal microbicide but also in any other form. It is demonstrated after the in vitro tests that the resulting solution blocks the development of Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) virus and its variants and indirectly stimulates and increases the reticuloendothelial system, thus increasing the patient's immune defense.
  • AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome

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Abstract

L'invention concerne un produit antiviral à base du Momordica Balsamina, virolyse, viro statique et hydrosoluble pour le traitement et la prévention du Syndrome Immuno Déficience Acquise (SIDA) et ses Variantes. Elle est réalisée de la façon suivante : La feuille du Momordica Balsamina après prélèvement est séchée de manière naturelle et est réduite en poudre fine. La poudre asséchée est macérée dans de l'eau stérilisée au Méthanol à 100%. - La solution est ensuite passée dans un filtre à 45 microns de diamètre et donne un produit stérilisé antiviral, virolyse, viro statique et hydrosoluble. Les différentes expérimentations montrent que le produit : a une activité antivirale. - a des effets toxiques et destructifs sur les cellules infectées par le virus du SIDA. - active le virus et apparaît comme viro statique. - est hydrosoluble. - Le produit n'est pas complexe et présente un ensemble de molécules inférieures à 10,000 Da en taille et affiche une résistance au traitement de la protéase.

Description

Produit Antiviral hydrosoluble à base du MOMORDICA BALSAMINA pour le Traitement et la Prévention du Syndrome Immuno Déficience Acquise (SIDA) et ses Variantes.
DESCRIPTION
L'invention concerne un Produit antiviral à base de feuille du Momordica Balsamina virolyse, viro statique et hydrosoluble. Il est destiné au traitement et la prévention du Syndrome Immuno Déficience Acquise (SIDA) et ses variantes. Le Sida est une maladie infectieuse qui frappe durement toute la planète et singulièrement les pays Africains. Il a été constaté que le SIDA était souvent accompagné de syndromes lymphadénopathiques qui dans leur stade final se manifestent par un effondrement des défenses immunitaires du sujet. L'agent responsable de cette pandémie a été isolé depuis 1983 par le Professeur Luc MONTAGNIER de l'Institut Pasteur. L'état de la technique connue de l'inventeur a permis d'identifier les documents ci après :
Le brevet OAPI n° 09043 délivré à CRUZ Joseph le 31 mars 1991 et relatif à de nouvelles compositions antivirales à base d'extrait de la feuille de Mimosa Pudica LINN. Le brevet OAPI n° 11602, délivré au Dr Erick GBODOSSOU et relatif à une composition d'extraits de 5 (cinq) plantes (Momordica Balsamina, Aframomum Melegueta, Cyperus Articulatus, Ficus Iteophylla, Tamarindus Indica). Dans sa thérapie, le produit absorbé, extirpe le virus du SIDA part les selles et les urines. Le brevet WO 94 / 18 993 délivré en septembre 1994 à PHARMAKON USA, Inc. Le brevet US 548 4889 délivré University le 16 avrill992. Le brevet WO OO 35 466 délivré à (PAYA BIOTECHNIC INC) le 22 juin 2000. Le brevet US 588 60 29 délivré à (KIRPAL S. DHALIWAL) 23 mars 1999. Toutes les recherches sur le virus du SIDA actuellement menées n'ont pas encore abouties soit à la mise au point d'un vaccin, soit à tuer le virus à l'intérieur de l'organisme. Les antirétroviraux actuels mutent l'agent pathogène en des virus de plus en plus virulents. Depuis plus d'une vingtaine d'années qu'existe la pandémie, des Instituts de Recherche, des Organismes gouvernementaux et non gouvernementaux, des Agences des Nations Unies, bref toute la Communauté Scientifique, Politique, Culturelle et la Société Civile s'est investie dans la lutte contre le VIH/SIDA pour trouver soit un vaccin, soit un antiviral, avec souvent le concours de l'Organisation Mondiale de la Santé ou d'autres partenaires et bailleurs tels que la Fondation Ford.
L'approche conventionnelle des traitements de l'infection au VIH par l'utilisation de substances antivirales comme l'azidothymidine (AZT), le DDC, le 3TC, 1ΑZT/3C, l'indinavir permet de réduire la charge virale plasmatique au niveau le plus bas et le plus longtemps possible. Les résultats, même s'ils sont positifs, restent limités. En moyenne 50% des patients voient leur charge virale plasmatique chutée jusqu'à 50 copies/ml après un traitement d'environ 12 mois. Mais dans l'état actuel des recherches, les problèmes non encore résolus par l'utilisation des antirétroviraux sont encore d'actualité, notamment l'impossibilité d'une éradication totale de l'agent pathogène.
La restauration immunitaire est insignifiante même lorsque le taux de lymphocytes CD4 a beaucoup augmenté, la permanence de la toxicité des antirétroviraux n'est pas encore résolue.
D'autres problèmes ne sont pas encore résolus par l'utilisation des antirétroviraux tel que le risque de développement précoce de résistance aux antirétroviraux, l'incertitude quant à la durée du maintien de l'efficacité des traitements. On doit également noter les contraintes liées à l'utilisation des antirétroviraux actuels, car elle impose aux patients d'absorber chaque jour une vingtaine de produits et leur coût est très élevé par rapport au pouvoir d'achat des populations africaines qui sont les plus exposées à l'infection du VIH/SIDA. Par ailleurs dans l'état d'avancement da la technique actuelle, il n'existe pas encore de produit antirétroviral injectable, hydrosoluble. Aucun produit de ce type n'est connu à ce jour. L'une des recommandations pour la prévention est l'utilisation du condom, or on sait que son utilisation non seulement limite la procréation mais surtout son efficacité n'est pas totale. De plus en plus, la communauté internationale prend conscience de la nécessité d'impliquer les guérisseurs dans la prévention du VIH et de faire appel à la Médecine Traditionnelle. Le produit, objet de l'invention, est à base de feuilles du Momordica Balsamina, hydrosoluble, virolyse et viro statique. Sur la plante retenue, des études portant sur les aspects botaniques, pharmaco logiques et chimiques ont été réalisées par la laboratoire du Ministère de la Recherche Scientifique du Sénégal, et des analyses de l'extrait de la plante ont été faites par le laboratoire de Morehouse School of Médecine (Atlanta) USA, sur la base d'un référentiel élaboré par l'inventeur.
I - ETUDE BOTANIQUE, PHARMACOLOGIQUE ET CHIMIQUE Nom de la plante : Momordica Balsamina.
Aspect botanique
Liane herbacée à grêles rampantes ou grimpantes. Les fleurs sont axillaires. Les fruits sont ovoïdes oranges à maturité, à nombreuses épines moelles non piquantes.
Aspect chimique
Les feuilles contiennent deux résines acides et une substance amère, la momordicine. Elles sont riches en vitamines C libres : 0,004 à 0,05 % avec ou sans carotène. On y trouve également de l'acide aminobutyrique qui freine l'évolution et rend statique le développement du virus.
Aspect pharmaco logique
Les extraits de la plante entière donne une action hypoglycémiante, anticancéreuse ; l'activité antibiotique des extraits de feuilles est avérée. Les protéines abortives (momorcharines) possèdent, in vitro et in vivo des actions 80 modulatrices sur le système immunitaire. Les momorcharines ont une action inhibitrice sur le virus de l'immunodéficience humaine.
II - ETUDE IN VITRO DU MOMORDICA BALSAMINA
La feuille séchée et réduite en poudre a été remise à l'équipe des Services de Virologie de Morehouse School of Médecine (Atlanta - USA) pour vérifier son activité in vitro sur le virus et ses variantes, sur la base des référentiels de l'inventeur.
A - Objectifs
II s'agit de déterminer d'une part si les extraits du Momordica Balsamina bloquent la réplication du virus du SIDA et d'autre part si la poudre séchée du Momordica Balsamina peut être hydrosoluble. La recherche vise aussi à étudier l'effet direct du produit sur des cellules infectées par le virus du Syndrome Immuno Déficience Acquise (SIDA) et ses variantes. B - Mise en oeuyre des tests
Les fractions solubles des extraits de la feuille mixées dans lmg de p24 équivalent au virus (NL4-3KFS). Le virus et l'extrait sont testés initialement à partir de 10 mg pour 1 microgramme d'extrait. Les extraits doivent être testés pour une application courante et montrer un effet direct sur le virus. Cela pourrait inclure le blocage de la protéine de l'enveloppe du virus gρl20 ou la dissolution des lipides contenus dans l'enveloppe du virus.
Alternativement, il est concevable que des ingrédients actifs puissent intégrer les virions et affecter les capsides virales ou les protéines catalytiques telles que la transcription inverse, la protéase ou l'intégras. Après une incubation préliminaire de 15 mn avec l'extrait, il faut ajouter la mixture extrait/virus à des cultures du tissu à partir desquelles le support a été pris. Le virus doit l'absorber pendant 30 mn à une température de 37°C. La culture est ensuite lavée à 3 reprises avec du PBS et finalement conservée en milieu frais. Pour les études initiales, il faut utiliser les cellules de l'indicateur MAGI qui sont des cellules HeLa conçues pour être infectées par le VIH-I. Suite à l'infection, ces cellules produisent le Bêta - Galactosidase, détectable comme une couleur bleue sur le développement de l'infection. Une comparaison du nombre des cellules bleues traitées avec les cellules non traitées fournit une relative indication de l'inhibition. Le virus utilisé lors des études initiales ne doit présenter aucun gène et est donc limité à une unique étape d'infection de la cellule. Cette unique étape d'infection de la cellule est de loin l'approche la plus indiquée pour déterminer les effets relatifs à l'infection. Il est important d'établir dans ces essais une dose appropriée qui n'est pas toxique aux cellules et qui contient encore une concentration maximum de substance soluble. Si une activité antirétrovirale est trouvée dans le test initial, il faudra déterminer quelle part du cycle de vie virale est en train d'être affectée. Les isolants viraux spécifiques et les cellules « indicateurs » peuvent être utilisés pour déterminer la relative performance de l'entrée du virus. Si l'entrée du virus est intacte, il est possible de déterminer à quelle ampleur la transcription inverse a été affectée en utilisant des essais PCR qui détectent des étapes différentes de la formation d'ADN pro virale. La capacité de produire des virions intacts peut être directement déterminée en utilisant des tests standards de p24 ELISA pendant que la maturation virale peut être déterminée par des protéines virales de pâtés présentes dans les virions. Il faut également être en mesure au moins de faire une détermination initiale de la nature de la substance soluble. Le traitement à la protéase d'extraits permet de déterminer si les protéines présentes dans l'extrait sont responsables de l'activité.
Sur la base des objectifs et des directives, des expérimentations ont été menées.
III - EXPERIENCES SUR LA CARACTERISATION DU PRODUIT A- Solubilité de l'extrait du Momordica Balsamina
1 gramme de poudre séchée du Momordica Balsamina est macéré dans de l'eau distillée stérilisée avec du Méthanol à 100% et laissé au repos pendant une heure à une température ambiante. La solution obtenue est ensuite passée dans un appareil de stérilisation ayant un filtre de 0.45 micron pour retenir la matière insoluble restante.
La fraction soluble est dépourvue de bactéries. Les substances présentes au début dans les matières séchées sont complètement dissoutes. La solution obtenue est une concentration maximum de la poudre séchée d'environ lOOmg/ml.
B - Effet du Produit sur les cellules infectées
Pour déterminer si l'extrait soluble a une activité antivirale quelconque, nous avons testé son effet en utilisant la cellule classique MAGI sur des cellules infectées.
Les cellules MAGI sont génétiquement modifiées par les cellules HeLa qui contiennent une cassette gêne reporter comprenant le LTR viral, placé en amont du gène d'encodage E.coli • - gai.
L'expression du gène est dépendante de l'activation par la protéine VIH Tat, qui requiert une infection par le VIH.
Les cellules infectées deviennent bleues et peuvent être comptées en utilisant un microscope.
- Nous avons inoculé 2 plaques avec 1 ng du virus VIH KFS.
Au même moment 200 ul d'extrait sont ajoutés aux cellules et placés en incubation pendant 2 heures. Les cellules sont lavées 2 fois et l'extrait est replacé en milieu frais. Les cellules infectées durant 48 heures disparaissent en présence de l'extrait du produit.
Devant ce constat, on peut affirmer que l'extrait agit directement sur le virus et son effet est prédominant sur les cellules cibles infectées. Pour ce faire, nous avons procédé à l'essai suivant.
Nous avons constitué 2 autres plaques contenant des cellules vivantes non infectées. L'une des plaques est témoin. Dans la 2eme plaque est introduit le produit antiviral à base de Momordica Balsamina. 30 mn après, le virus du SIDA est injecté dans la même plaque contenant les cellules d'essai MAGI avant d'être repassé à la température d'incubation. Ces cellules vivantes n'ont pas virées au bleu, c'est à dire n'ont pas été infectées. Cette expérimentation nous permet de conclure que : Le produit a une activité antivirale. Le produit inactive le virus. - Le produit détruit les cellules infectées par le virus du Syndrome Immuno
Déficience Acquise (SIDA) et ses variantes.
C - Spectrométrie du produit mélangé par SELDI Mass
Le produit après étude, a montré que les principes actifs ne sont pas complexes et les molécules qui s'y trouvent sont inférieures à 10.000 Da de taille et affichent une résistance au traitement de la protéase.
IV- RESULTATS
Ces différentes expérimentations montrent que le produit : a une activité antivirale.
- a des effets toxiques et destructifs sur les cellules infectées par le virus du SIDA. - inactive le virus et apparaît comme viro statique.
- est hydrosoluble.
- Le produit n'est pas complexe et présente un ensemble de molécules inférieures à 10,000 Da en taille et affiche une résistance au traitement de la protéase. Le produit antiviral à base de Momordica Balsamina pour le traitement et la prévention du Syndrome Immuno Déficience Acquise (SIDA) et ses variantes, objet de la présente invention est réalisé de la façon suivante.
La feuille du Momordica Balsamina après prélèvement est séchée de manière naturelle et est réduite en poudre fine. La poudre asséchée est macérée dans de l'eau stérilisée au Méthanol à 100%. La solution est ensuite passée dans un filtre à 45 microns de diamètre et donne un produit antiviral, virolyse, viro statique et hydrosoluble.
Le produit peut être utilisé comme microbicide vaginal mais aussi sous toute autre forme. Il est démontré à la suite des essais in vitro que la solution obtenue bloque le développement du virus du Syndrome Immuno Déficience Acquise (SIDA) et ses variantes et indirectement stimule et augmente le système réticulo-endothélial, accroissant ainsi la défense immunitaire du patient.

Claims

REVENDICATIONS
1- Produit Antiviral à base du MOMORDICA BALSAMINA et son procédé de préparation à usage thérapeutique pour le Traitement et la Prévention du Syndrome Immuno Déficience Acquise (SIDA) et ses Variantes.
2- Produit selon la revendication 1 , caractérisée en ce que son procédé de fabrication se fait en 3 étapes: a) la première est le prélèvement de la feuille du Momordica Balsamina séchée et réduite en poudre fine. b) la deuxième est la macération de la poudre de la feuille du Momordica Balsamina dans de l'eau stérilisée au Méthanol à 100 %. c) la troisième est le passage de la solution dans un filtre à 0,45 micron.
3- Produit selon la revendication 2, caractérisée en ce que le produit est hydrosoluble.
4- Produit selon la revendication 2, caractérisée en ce que le produit a une activité antivirale.
5- Produit selon la revendication 2, caractérisée en ce que le produit a des effets toxiques et destructifs sur les cellules infectées par le virus du Syndrome Immuno Déficience Acquise (SIDA) et ses variantes.
6- Produit selon la revendication2, caractérisée en ce que le produit inactive le virus et apparaît comme viro statique.
7- Produit selon la revendication 2, caractérisée en ce que le produit n'est pas complexe et présente un ensemble de molécules inférieures à 10.000 Da en taille et affiche une résistance au traitement de la protéase.
8- Produit selon les revendications 1 à 7, caractérisées en ce que le produit stimule le système réticulo-endothélial. 9- Produit selon les revendications 1 à 8, caractérisées en ce que le produit peut être utilisé comme un microbicide vaginal et sur toute autre forme.
10- Produit selon l'ensemble des revendications caractérisées en ce que la concentration et la purification de l'extrait de la feuille Momordica Balsamina se réalisent selon les méthodes classiques utilisées en chimie et en biochimie.
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