WO2010112710A2 - Nouveaux peptides anti-age activateurs du proteasome et compositions les contenant - Google Patents

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WO2010112710A2
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Nouha Domloge
Jean-Marie Botto
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Definitions

  • the present invention relates to the field of anti-aging active ingredients and their uses in cosmetics in particular. More particularly, the present invention relates to peptide compounds of general formula (I) below:
  • Aging is the totality of physiological and psychological processes that change the structure and functions of the body from a certain age.
  • Intrinsic aging is due to genetic factors, biochemical changes that take place during states of fatigue, stress, hormonal changes such as during pregnancy ...
  • Extrinsic aging for its part, is due to environmental factors to which the organism is subjected throughout its life, such as pollution, sun, diseases etc. It is a slow and progressive process that reaches all the cells of the body in different ways and manifests itself in different ways.
  • the appearance of the skin is modified by the various types of internal or external aggression and wrinkles and fine lines appear, spots of hyper or hypo- pigmentation, dryness or dehydration of the skin, thinning of the epidermis, elastosis, imperfections, age spots .... All these changes affect not only the skin, but also the integuments such as nails and the hair. These changes are due, among other things, to the alteration of cell renewal, cell cohesion, collagen synthesis, elastin and other protein functions, and ultimately lead to a decrease in the protective barrier qualities of the skin and to an unattractive appearance of it. But one of the main processes responsible for cell aging is undoubtedly the accumulation of damaged proteins in these cells. Indeed, proteins are the target of various abnormal post-translational modifications such as oxidation, glycation, conjugation with products from lipid peroxidation, phenomena whose incidence increases sharply with age.
  • the ubiquitin-proteasome pathway plays a fundamental role in a very large number of biological processes. Indeed, the mechanisms of protein degradation by the proteasome are involved in important cellular mechanisms such as DNA repair, the control of gene expression, the regulation of cell cycle progression, the control of the quality of the neo-synthesized proteins, apoptosis or immune response (Glickman and Ciechanover, 2002).
  • the proteasome present in human cells is a very large multi-protein complex present in the cytoplasm and the nucleus.
  • Purified forms of the proteasome include 2 large subunits; on the one hand, a proteolytic core called the 2OS proteasome and, on the other hand, a 19S regulator complex that binds to both ends of the 2OS proteasome (Coux et al., 1996, Glickman and Coux, 2001).
  • the 2OS proteasome is a hollow cylinder-shaped particle, composed of 28 alpha and beta subunits, distributed in 4 heptameric rings. The peptidase activities are present on the inner surface of the cylinder and influence allosterically.
  • patent FR 2822701 discloses a composition based on an algae phaeodactylum extract to promote the activity of the proteasome.
  • patent application FR 2898808 describes the use of a composition comprising a microalgae extract and arginine ferrulate, always to activate the proteasome.
  • Other compositions for its part comprise chemical compounds capable of modulating the activity of the proteasome to have an anti-aging effect.
  • These compositions are described in patent applications WO 2006/105811 or WO 2005/061530.
  • the proposed peptide type compounds have a large size and it is difficult in the field of cosmetics to use them as such. There is then a need, particularly in the cosmetics industry, for new compounds having a reduced size and effective in their use as a proteasome activator.
  • X 1 represents an aspartic acid, a glutamic acid, a serine, a threonine, or is equal to zero
  • X 2 represents arginine, leucine, isoleucine, or is zero
  • X 3 represents an arginine, a lysine, or is zero
  • X 4 represents an arginine, a proline, a histidine, a lysine, or is equal to zero
  • AA represents any amino acid with the exception of cysteine, or a derivative thereof, and p is an integer from 0 to 2,
  • R 1 represents the primary amino function of the N-terminal amino acid, free or substituted by a protective group which may be chosen from an acetyl group, a benzoyl group, a tosyl group or a benzyloxycarbonyl group,
  • R 2 represents the hydroxyl group of the carboxyl function of the C-terminal amino acid, free or substituted with a protecting group that may be chosen from a C 1 to C 2 0 alkyl chain, or an NH 2, NHY or NYY group with Y represents an alkyl chain of C 1 to C 4 , said sequence of general formula (I) consisting of 3 to 9 amino acid residues, said sequence of general formula (I) possibly comprising substitutions of amino acids X 1 , X 2 , X 3 , and X 4 by other chemically equivalent amino acids.
  • the subject of the present invention is a cosmetic composition comprising, as active ingredient, said peptide compound of formula (I).
  • the third subject of the present invention is the use of a cosmetic composition comprising said peptide compound of formula (I) for preventing and / or treating cutaneous signs of aging and photo-aging and for improving degradation by the proteasome damaged proteins.
  • the fourth subject of the present invention is a process for the cosmetic treatment of the skin or integuments to be treated with the aid of the composition comprising the said peptide compound of formula (I).
  • the subject of the present invention is a peptide compound of the following general formula (I):
  • X 1 represents an aspartic acid, a glutamic acid, a serine, a threonine, or is equal to zero
  • X 2 represents an arginine, a leucine, an isoleucine, or is equal to zero
  • X 3 represents an arginine, a lysine, or is zero
  • X 4 represents an arginine, a proline, a histidine, a lysine, or is equal to zero
  • AA represents any amino acid with the exception of cysteine, or a derivative thereof, and p is an integer from 0 to 2,
  • R 1 represents the primary amino function of the N-terminal amino acid, free or substituted by a protective group which may be chosen from an acetyl group, a benzoyl group, a tosyl group or a benzyloxycarbonyl group,
  • R 2 represents the hydroxyl group of the carboxyl function of the C-terminal amino acid, free or substituted with a protective group which may be chosen from an alkyl chain of C 1 to C 20 , or an NH 2, NHY or NYY group with Y representing an alkyl chain of C 1 to C 4 , said sequence of general formula (I) consisting of 3 to 9 amino acid residues, said sequence of general formula (I) possibly comprising amino acid substitutions X 1 , X 2 , X 3 , and X 4 by other chemically equivalent amino acids.
  • the peptide compound according to the invention is characterized in that it makes it possible to increase the activity of the proteasome.
  • Peptide compound which "increases the activity of the proteasome” means any peptide or biologically active derivative capable of increasing the activity of the proteasome, either by increasing the protein synthesis of the proteasome subunits (by modulation direct or indirect expression of gene expression), or by other biological processes such as the stabilization of the subunits constituting the proteasome or the stabilization of messenger RNA transcripts.
  • the peptide compound according to the invention is characterized in that it makes it possible to activate the degradation by the proteasome of the damaged proteins.
  • “Damaged proteins” means proteins that have undergone oxidation reactions due to reactive oxygen species (free radicals), glycated or conjugated proteins with products derived from lipid peroxidation, etc.
  • the peptide compound is protected by acylation or acetylation of the amino-terminus.
  • the peptide compound corresponds to one of the following formulas:
  • the peptide compound according to the invention corresponds to the sequence ID No. 1, that is to say Asp -Cys -Arg-NH 2 .
  • the peptide compound according to the invention corresponds to the sequence ID No. 4, that is to say Ser-Asp -Cys-Arg-His-Pro.
  • the invention also relates to homologous forms of these sequences.
  • the term "homologue” denotes, according to the invention, any peptide sequence identical to at least 50%, or preferably at least 80%, and even more preferably to at least 90% of said peptide sequence, chosen from SEQ ID sequences. No. 1 to SEQ ID No. 5.
  • “Peptide sequence identical to at least X%” is intended to designate a percentage identity between the amino acid residues of the two sequences to be compared, obtained after the optimal alignment of the two sequences. The optimal alignment is achieved using local homology algorithms such as those used by the BLAST P computer software available on the NCBI site.
  • the term "homologue” can also refer to a peptide which differs from the sequence of a peptide of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 5 by the substitution of chemically equivalent amino acids, that is to say by the substitution of one residue for another with the same characteristics.
  • the classical substitutions are between Ala, Val, Leu and Ile; between Ser and Thr; between Asp and Glu acid residues; between Asn and GIn; and between the basic residues Lys and Arg; or between the aromatic residues Phe and Tyr.
  • amino acids constituting the peptide according to the invention may be in the Lévogyre configuration, that is to say L- and / or Dextrogyre that is to say D-.
  • the peptide according to the invention can therefore be in L-, D- or DL- form.
  • peptide or “peptide compound” refers to a sequence of two or more amino acids linked together by peptide bonds or modified peptide bonds.
  • peptide or “peptide compound” is meant the natural or synthetic peptide of the invention as described above, or at least one of its fragments, whether obtained by proteolysis or synthetically or any natural or synthetic peptide whose sequence is totally or partially constituted by the sequence of the peptide described above.
  • the invention relates to a composition as defined above, characterized in that the peptide of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 5 is in a single or double protected form.
  • an NYY-group amidation with Y representing a C 1 to C 4 alkyl chain or esterification with an alkyl group is used.
  • the peptide of general formula (I) according to the invention can be obtained either by conventional chemical synthesis (in solid phase or in homogeneous liquid phase) or by enzymatic synthesis (Kullman et al., J. Biol Chem 1980, 225 , 8234), from constituent amino acids or their derivatives.
  • the peptide according to the invention may be of natural or synthetic origin.
  • the peptide is obtained by chemical synthesis.
  • the active ingredient may be a single peptide, a mixture of peptides or peptide derivatives and / or consisting of amino acid derivatives.
  • the peptide compound according to the invention can be used as a medicament.
  • the second subject of the present invention relates to a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising as active principle said peptide compound of general formula (I).
  • said peptide compound of general formula (I) Of o
  • the compositions according to the invention are in a form suitable for topical application comprising a cosmetically acceptable medium.
  • Cosmetically acceptable means media which are suitable for use in contact with human skin or integuments, without risk of toxicity, incompatibility, instability, allergic response and the like.
  • said peptide compound is present in the composition at a concentration of between about 0.0005 and 500 ppm, and preferably at a concentration of between 0.01 and 5 ppm.
  • the peptide compound is solubilized in one or more solvents such as water, glycerol, ethanol, propylene glycol, butylene glycol, dipropylene glycol, ethoxylated or propoxylated diglycols, polyols. cyclic, petroleum jelly, a vegetable oil or any mixture of these solvents.
  • solvents such as water, glycerol, ethanol, propylene glycol, butylene glycol, dipropylene glycol, ethoxylated or propoxylated diglycols, polyols. cyclic, petroleum jelly, a vegetable oil or any mixture of these solvents.
  • the active ingredient according to the invention is solubilized in a cosmetic or pharmaceutical vector such as liposomes or adsorbed on powdery organic polymers, mineral supports such as talcs and bentonites, and more generally solubilized in, or fixed on, any physiologically acceptable vector.
  • a cosmetic or pharmaceutical vector such as liposomes or adsorbed on powdery organic polymers, mineral supports such as talcs and bentonites, and more generally solubilized in, or fixed on, any physiologically acceptable vector.
  • compositions intended to be applied to the skin may be in the form of aqueous or aqueous-alcoholic solution, water-in-oil or oil-in-water emulsion, microemulsion, aqueous or anhydrous gel, serum or dispersion of vesicles, patch, cream, spray, ointment, ointment, lotion, colloid, solution, suspension or other.
  • the compositions may also be applied to the integuments in the form of shampoo, dye or mascara to be applied by brush or comb, in particular on eyelashes, eyebrows or hair, or care for nails such as varnishes .
  • the composition according to the invention further contains at least one other active ingredient promoting the action of said peptide compound.
  • active ingredients may be mentioned in a non-limiting manner: other peptide active agents, plant extracts, cicatrizing, anti-aging, anti-wrinkle, soothing, anti-radical and anti-UV agents, agents stimulating the synthesis of dermal macromolecules or energy metabolism, moisturizing, anti-bacterial, antifungal, anti-inflammatory, anesthetic agents, modulating agents differentiation, pigmentation or skin depigmentation, agents stimulating the growth of nails or preferentially, an agent having an activity in the field of anti-wrinkles, such as an anti-radical agent or antioxidant, or an agent stimulating the synthesis of dermal macromolecules, or an agent stimulating the energy metabolism.
  • the active ingredient is chosen from vitamins, phytosterols, flavonoids, DHEA and / or one of its precursors or one of its chemical or biological derivatives, a metalloproteinase inhibitor, or a retinoid.
  • additives such as thickeners, emulsifiers, humectants, emollients, perfumes, antioxidants, film-forming agents, chelating agents, sequestering agents, conditioning agents can be added to the composition.
  • these adjuvants and their proportions are chosen so as not to adversely affect the desirable properties of the composition according to the invention.
  • These adjuvants may, for example, be between 0.01 and 20% of the total weight of the composition.
  • the fatty phase may represent from 5 to 80% by weight and preferably from 5 to 50% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the emulsifiers and co-emulsifiers used in the composition will be chosen from those conventionally used in the field under consideration. For example, they can be used in a proportion ranging from 0.3 to 30% by weight, relative to the total weight of the composition.
  • the invention relates to a composition comprising the said peptide compound in order to increase the proteasome activity and to improve the proteasome degradation of the damaged proteins.
  • a third subject of the invention relates to the use of a cosmetic composition comprising said peptide compound and a cosmetically acceptable medium for preventing and / or treating the cutaneous signs of aging and photo-aging.
  • Skin signs of aging include, but are not limited to, all visible skin manifestations caused by aging. In particular, wrinkles, deep and coarse wrinkles, fine lines, cracks, sagging of skin and subcutaneous tissue, loss of skin elasticity and sluggishness, loss of firmness and tone, and dermal atrophy.
  • the term “cutaneous signs of aging”, enlarged pores, imperfections, discoloration, age spots, keratoses, collagen loss, and other changes in the dermis and epidermis are also included. any changes in the external appearance of the skin and skin appendages due to aging, such as, for example, the superficial roughness of the skin.
  • photo-aging is meant the premature aging of the skin caused by prolonged and cumulative exposure to the sun.
  • the present invention thus relates to the use of a composition for treating or preventing wrinkles, deep and coarse wrinkles, fine lines, cracks, sagging of skin and subcutaneous tissues, loss of skin elasticity. and atony, loss of firmness and tone, and dermal atrophy.
  • said composition according to the invention makes it possible to activate cell renewal and thoroughly clean the cells.
  • compositions according to the invention for protecting the skin against attacks due to UV radiation.
  • the invention relates to the use of a composition comprising the peptide compound for enhancing proteasome activity and enhancing proteasome degradation of damaged proteins.
  • a final subject of the present invention relates to a cosmetic treatment method characterized in that a composition comprising an effective amount of peptide compound according to the invention for preventing and / or treating the skin or integuments to be treated is applied topically to the skin or integuments to be treated. or treat the signs of skin aging and photoaging.
  • this cosmetic treatment method is characterized in that the composition is applied before bedtime to clean cells and skin during the cell renewal cycle. Indeed, during the night, the skin favors the functions of renewal as well as the metabolic processes of synthesis. Therefore, the application of the composition as claimed, respecting the biological rhythm of the skin provides a rejuvenating effect, stimulating cell renewal, and regenerating.
  • NHK cells Normal Human Keratinocytes
  • NHK cells Normal Human Keratinocytes
  • keratinocyte-SFM medium Invitrogen
  • Aged NHK cells are obtained by performing a series of repeated subcultures. Briefly the cells are seeded in flasks of 75 cm 2 , low density and cultured from 5 to 10 days between two passages. The cells are treated or not with the active ingredient, by adding the active ingredient directly into the culture medium 3 times a week.
  • the expression level of these proteins was evaluated by F immunoblotting technique.
  • the technique of immunoblotting is a semi-quantitative method that allows to assess the level of proteins studied in cells, that is to say the level of proteins ubiquitinylated by a specific antibody of the ubiquitin (DAKO), as well as the proteasome 2OS protease rate (C ALBIOCHEM).
  • Aged keratinocytes are cultured in flasks of 75 cm 2 at 37 ° C. in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 for 10, 20, 30 and 40 days. The cells are not treated on the day of the experiment. They are rinsed and then detached from the support with the aid of an extraction buffer (20 mM TRIS, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA,
  • Triton X10 0.2% Triton X10 in the presence of a cocktail of protease inhibitors (Sigma).
  • the proteins thus extracted are centrifuged at 4 ° C. at 10,000 rpm for 10 minutes before being assayed by the BCA protein assay kit (Pierce).
  • the cell lysates are mixed with a denaturation buffer and subjected to SDS PAGE electrophoresis.
  • the gel used is a 4-12% bruising (Invitrogen).
  • the proteins are finally transferred to a nitrocellulose membrane (Pal corporation).
  • the membranes are saturated in PBS- milk 5%, 0.1% tween 20, 2 hours at room temperature, then incubated at 4 ° C overnight with a primary antibody.
  • the primary antibody is an anti-ubiquitin rabbit antibody used at a dilution of l / 500th (DAKO).
  • DAKO anti-ubiquitin rabbit antibody used at a dilution of l / 500th
  • 2OS proteasome primary antibody is a mouse antibody anti 2OS proteasome used at a dilution of l / 1000th (Calbiochem).
  • EXAMPLE 2 Demonstration of the activating effect of the active agent on the measurement of the enzymatic activity of the proteasome 2OS on aged keratinocytes kept in culture.
  • the aged keratinocytes are kept in culture for 15 days.
  • the treatment of the cells is carried out by adding a 1% solution of our peptide SEQ ID No. 1 directly into the medium, renewed 3 times a week during the time of the experiment.
  • the assay of each activity was set up using specific substrates labeled with a fluorescent compound: 7-amido-4-methylcoumarin (AMC). After cleavage, the AMC whose excitation wavelength is 350 nm, the reading of the fluorescence is carried out at 440 nm. The intensity of the fluorescence is proportional to the amount of fluorochrome obtained and accordingly, this amount is proportional to the amount of hydrolyzed substrate.
  • AMC 7-amido-4-methylcoumarin
  • the synthetic Boc-Leu-Arg-Arg-AMC peptide is specific for tryptic activity.
  • Suc-Leu-Leu-Val-Try-AMC synthetic peptide is specific for chymotrypsic activity.
  • the Z-Leu-Leu-Glu-AMC synthetic peptide is specific for peptidylglutamyl peptide hydrolase activity.
  • the cells are detached from the support in extraction buffer. Subsequently, they are sonicated for 1 minute at 4 ° C, and then centrifuged at 15000 g for 30 minutes at 4 ° C.
  • the protein assay is performed by the BCA kit (Pierce). After incubation of the cell lysate with the synthetic substrate specific for the activity studied, the fluorescence is read at the Synergy spectrophotometer (BIOTEK, Vermont, USA) at 440 nm. Results
  • the peptide SEQ ID No. 1 allowed to increase the enzymatic activity of the proteasome 2OS.
  • the trypsin-like activity is increased by 155.3% during the treatment with the active agent, the chymotrypsin-like activity is increased by 130% and an increase of 144.6% is recorded for the peptidylglutamyl-peptide hydrolase activity.
  • Peptide SEQ DD No. 1 used at 1% on keratinocytes aged experimentally in culture makes it possible to increase the specific enzymatic activities of proteasomes 2OS.
  • Example 3 Demonstration of the anti-aging effect of the active ingredient on keratinocytes grown in culture
  • a study of the anti-aging effect of the active agent was carried out by evaluating the expression of the beta-galactosidase protein on keratinocytes aged experimentally in culture. Indeed, the beta-galactosidase activity is known to be present in senescent cells whereas no galactosidase activity is found in the pre-senescent, quiescent or immortal cells.
  • Experimentally aged keratinocytes in 8 well labtecks are cultured and maintained for 20 days in the presence or absence of 1% peptide of SEQ ID No. 1.
  • the treatment is carried out 3 times a week by direct addition in the medium. Untreated cells are maintained in culture during the same time of the experiment and will serve as a control.
  • the cells are rinsed, fixed in a 2% glutaraldehyde - 2% formaldehyde mixture for 3 minutes.
  • the cells are then rinsed and 300 ⁇ l of 5-bromo-4-chloro-3 indolyl ⁇ -D-galactosidase, commonly called X-gal (substrate of beta-galactosidase), are applied.
  • the incubation is carried out for 24 hours in the CO 2 incubator, then the cells are rinsed and the labteck is quickly mounted in a suitable medium.
  • the observation is carried out under a transmission microscope.
  • the principle is simple: when the cells are senescent and contain beta-galactosidase, the X-gal substrate is cleaved into an insoluble blue product. The beta-galactosidase activity is evidenced by staining of the blue cells. The more blue cells there are, the higher the number of senescent cells.
  • beta-galactosidase activity is greatly reduced in treated cells compared to untreated cells.
  • the active agent makes it possible to demonstrate an anti-aging effect on cultured keratinocytes aged experimentally for 20 days of culture.
  • Normal human fibroblasts in culture are seeded in boxes of diameters 100. When the cells have reached 70% confluency, the cells are treated for 48 hours with the peptide of sequence ID No. 1 diluted to 1% in the medium. The The cells are subjected to UVB irradiation at 100 mJ / cm 2 and then put back for 48 hours in the presence of the active agent. Control plates with cells not treated with the active but irradiated serve as a control. The cells are rinsed and detached from the support using a suitable extraction buffer. The proteins thus extracted are centrifuged at 4 ° C. at 10,000 rpm for 10 minutes before being assayed by the BCA protein assay kit (Pierce). The carbonylation of the proteins is carried out by a test based on the immunodetection of the carbonyl groups previously derivatized by 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNP) (SIGMA).
  • DNP 2,4-dinitrophenylhydrazine
  • biotinylated anti-dinitrophenyl antibody of rabbit was diluted to l / 5000 th in buffer 0.1% serum albumin in the presence of 0.1% Tween 20 and incubated in the microplate 1 hour at 37 0 C.
  • incubated streptavidin-peroxidase DAKO
  • DAKO streptavidin-peroxidase
  • the untreated cells are strongly carbonylated and increase by 110% over unirradiated and untreated cells.
  • the carbonylation rate is decreased by 34%.
  • the experiment was carried out several times and a statistical test (statistical test t Student) could be performed.
  • the active agent makes it possible to protect cells against the harmful effects of UV, that is to say against their oxidative effects.
  • the active ingredient makes it possible to reduce the oxidation of proteins by more than 34%.
  • QU ANTIRIDE is an evaluation method that allows to measure the number, length and depth of wrinkles by replicating the skin before and after treatment with the help of a silicone polymer.

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Abstract

La présente invention se rapporte à des composés peptidiques de formule (I) : R1 - X1 - X2 -Asp - Cys - Arg - X3 -X4 - ( AA)p - R2. En outre, la présente invention concerne, d'une part, une composition cosmétique ou pharmaceutique, comprenant au moins un peptide de formule (I), dans un milieu cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable et, d'autre part, son utilisation pour prévenir ou traiter les signes cutanés du vieillissement, du photo-vieillissement et protéger la peau contre les agressions dues aux rayonnements UV. L'invention porte enfin sur un procédé de traitement cosmétique destiné à prévenir et/ou à lutter contre les signes cutanés du vieillissement et du photo- vieillissement.

Description

NOUVEAUX PEPTIDES ANTI- AGE ACTIVATEURS DU PROTEASOME ET COMPOSITIONS LES CONTENANT
La présente invention se rapporte au domaine des actifs anti-âge et de leurs utilisations en cosmétique notamment. Plus particulièrement la présente invention se rapporte à des composés peptidiques de formule générale (I) suivante :
R1 - X1 - X2 -Asp - Cys - Arg - X3 -X4 - (AA)P- R2 ainsi que leurs utilisations en cosmétique et/ou pharmaceutique afin de prévenir et/ou corriger les effets du vieillissement et du photo- vieillissement de la peau et des phanères, et protéger la peau contre les agressions dues aux rayonnements UV.
Le vieillissement correspond à l'ensemble des processus physiologiques et psychologiques qui modifient la structure et les fonctions de l'organisme à partir d'un certain âge. On distingue deux types de vieillissement, d'une part, le vieillissement intrinsèque et, d'autre part, le vieillissement extrinsèque. Le vieillissement intrinsèque est dû à des facteurs génétiques, à des modifications biochimiques qui ont lieu lors d'états de fatigue, de stress, de changements hormonaux comme lors de la grossesse... Le vieillissement extrinsèque, quant à lui, est dû à des facteurs environnementaux auxquels est soumis l'organisme tout au long de sa vie, tels que la pollution, le soleil, les maladies etc. Il s'agit d'un processus lent et progressif qui atteint toutes les cellules de l'organisme par différents moyens et se manifeste de différentes manières. Par exemple, au niveau de la peau, l'aspect de celle-ci est modifié par les divers types d'agressions internes ou externes et l'on voit apparaître alors des rides et ridules, des taches d'hyper ou d'hypo- pigmentation, une sécheresse voire une déshydratation de la peau, un amincissement de l'épiderme, une élastose, des imperfections, des taches de vieillesse.... Tous ces changements affectent non seulement la peau, mais également les phanères tels que les ongles et les cheveux. Ces modifications sont dues entre autres à l'altération des fonctions de renouvellement cellulaire, de cohésion cellulaire, de synthèse de collagène, d'élastine et d'autres protéines, et conduisent finalement à une diminution des qualités de barrière protectrice de la peau et à un aspect peu esthétique de celle-ci. Mais l'un des processus principaux responsables du vieillissement des cellules est sans conteste l'accumulation de protéines endommagées dans ces dernières. En effet, les protéines sont la cible de diverses modifications post-traductionnelles anormales telles que l'oxydation, la glycation, la conjugaison avec des produits issus de la peroxydation lipidique, phénomènes dont l'incidence augmente fortement avec l'âge.
Il est connu que les radicaux libres jouent un rôle clé dans le processus de vieillissement et plus particulièrement dans la formation de protéines oxydées, endommagées (Harman et al. « Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry » J. GerontoL, 11, 298-300). L'accumulation de protéines endommagées pose donc le problème de l'efficacité des systèmes protéolytiques en charge de l'élimination de ces protéines, et particulièrement celle du système protéosomal impliqué non seulement dans l'élimination des protéines altérées, notamment par oxydation, mais aussi dans le renouvellement continu des protéines intracellulaires.
La voie ubiquitine-protéasome joue un rôle fondamental dans un très grand nombre de processus biologiques. En effet, les mécanismes de dégradation des protéines par le protéasome sont impliqués dans des mécanismes cellulaires importants tels que la réparation de FADN, le contrôle de l'expression des gènes, la régulation de la progression du cycle cellulaire, le contrôle de la qualité des protéines néo-synthétisées, l'apoptose ou la réponse immunitaire (Glickman and Ciechanover, 2002).
Le protéasome présent dans les cellules humaines est un complexe multi protéique de très grande taille présent dans le cytoplasme et le noyau. Les formes purifiées du protéasome comprennent 2 grandes sous-unités ; d'une part, un cœur protéolytique appelé protéasome 2OS et, d'autre part, un complexe régulateur 19S qui se lie à chacune des deux extrémités du protéasome 2OS (Coux et al., 1996 ; Glickman et Coux, 2001). Le protéasome 2OS est une particule en forme de cylindre creux, composée de 28 sous-unités alpha et béta, distribuées en 4 anneaux heptamériques. Les activités peptidases sont présentes à la surface interne du cylindre et s'influencent de manière allostérique. Trois activités protéolytiques (« trypsine, chymotrypsine et caspase-like ») ont été associées au protéasome 2OS et concourent à la destruction des protéines en peptides inactifs de 3 à 20 acides aminés. Outre le protéasome 2OS, le protéasome 26S comprend le complexe régulateur 19S de 0,7 MDa constitué de 20 sous-unités environ. Des études récentes d'immunopurification ont montré que d'autres protéines pouvaient être associées au protéasome 2OS et 19S (par exemple le complexe régulateur 1 IS).
Au vu de la diversité des processus cellulaires contrôlés via la dégradation des protéines, il n'est pas surprenant de constater que des altérations de la voie ubiquitine- protéasome sont à l'origine, ou étroitement liées à plusieurs maladies génétiques et à de nombreuses pathologies humaines telles que les cancers colorectaux, les lymphomes, les syndromes inflammatoires, les maladies neuro-dégénératives telles que Parkinson ou Alzheimer....
Des travaux menés ces dernières années ont permis de corréler le vieillissement avec l'activité du protéasome. En effet, alors qu'avec l'âge il y a une augmentation de l'accumulation des protéines oxydées, on a constaté une baisse de l'efficacité du système protéosomal (Petropoulos et al, J. Gerontol. A. Biol. Sci. 2000, 55 A :B220-7). Cette baisse de l'efficacité du système protéosomal était due en fait à une baisse de la quantité de protéasome. Ces résultats ont été confirmés par ceux d'une étude portant sur la quantité et l'activité du protéasome dans des cellules d'individus centenaires versus individus jeunes (Chondrogianni et al., Exp. Gerontol. 2000 ;35 :721-8). Ces études, ainsi que bien d'autres, démontrent bien le lien entre vieillissement et activité du protéasome et l'on peut penser que l'induction de l'expression du protéasome dans des cellules de la peau ou des phanères pourrait avoir une influence positive sur le vieillissement, voire retarder celui-ci.
Dans l'optique de prévenir ou retarder le vieillissement, des compositions cosmétiques « naturelles » ont été proposées : par exemple le brevet FR 2822701 divulgue une composition à base d'un extrait d'algue phaeodactylum pour favoriser l'activité du protéasome. Ou encore, la demande de brevet FR 2898808 décrit l'utilisation d'une composition comprenant un extrait de micro-algue et de ferrulate d'arginine, toujours pour activer le protéasome. D'autres compositions quant à elle comprennent des composés chimiques, capables de moduler l'activité du protéasome pour avoir un effet antivieillissement. Ces compositions sont décrites dans les demandes de brevets WO 2006/105811 ou encore WO 2005/061530. Cependant les composés de type peptidiques proposés présentent une taille importante et il est difficile dans le domaine de la cosmétique de les utiliser tels quels. Il existe alors un besoin, notamment dans l'industrie cosmétique, de nouveaux composés présentant une taille réduite et efficace quant à leur utilisation en tant qu'activateur du protéasome.
C'est ainsi que la Demanderesse a découvert que des composés de formule R1 - X1 - X2 -Asp - Cys - Arg - X3 -X4 - (AA)P - R2. étaient capables d'activer le protéasome et pouvaient ainsi être utiles afin de prévenir ou traiter les signes cutanés du vieillissement ainsi que les agressions dues aux rayonnements UV.
Par conséquent la présente invention a pour premier objet un composé peptidique de formule générale suivante (I) :
R1 - X1 - X2 -Asp - Cys - Arg - X3 -X4 - (AA)P - R2 Dans laquelle,
X1 représente un acide aspartique, un acide glutamique, une serine, une thréonine, ou est égal à zéro,
X2 représente une arginine, une leucine, une isoleucine, ou est égal à zéro, X3 représente une arginine, une lysine, ou est égal à zéro,
X4 représente une arginine, une proline, une histidine, une lysine, ou est égal à zéro,
AA représente un acide aminé quelconque à l'exception de la cystéine, ou un de ses dérivés, et p est un nombre entier compris entre 0 et 2,
R1 représente la fonction aminé primaire de l'acide aminé N-terminal, libre ou substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi un groupement acétyle, un groupement benzoyle, un groupement tosyle ou un groupement benzyloxycarbonyle,
R2 représente le groupe hydroxyle de la fonction carboxyle de l'acide aminé C- terminal, libre ou substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi une chaîne alkyle de C1 à C2o, ou un groupement NH2, NHY ou NYY avec Y représentant une chaîne alkyle de C1 à C4, ladite séquence de formule générale (I) étant constituée de 3 à 9 résidus d'acides aminés, ladite séquence de formule générale (I) pouvant comprendre des substitutions des acides aminés X1, X2, X3, et X4 par d'autres acides aminés chimiquement équivalents. La présente invention a pour second objet une composition cosmétique comprenant à titre de principe actif ledit composé peptidique de formule (I).
En outre, la présente invention a pour troisième objet l'utilisation d'une composition cosmétique comprenant ledit composé peptidique de formule (I) pour prévenir et/ou traiter les signes cutanés du vieillissement et du photo-vieillissement et améliorer la dégradation par le protéasome des protéines endommagées.
Enfin, la présente invention a pour quatrième objet un procédé de traitement cosmétique de la peau ou des phanères à traiter à l'aide de la composition comprenant ledit composé peptidique de formule(I).
La présente invention a pour objet un composé peptidique de formule générale suivante (I) :
R1 - X1 - X2 -Asp - Cys - Arg - X3 -X4 - ( AA)P - R2 Dans laquelle, X1 représente un acide aspartique, un acide glutamique, une serine, une thréonine, ou est égal à zéro,
X2 représente une arginine, une leucine, une isoleucine, ou est égal à zéro,
X3 représente une arginine, une lysine, ou est égal à zéro, X4 représente une arginine, une proline, une histidine, une lysine, ou est égal à zéro,
AA représente un acide aminé quelconque à l'exception de la cystéine, ou un de ses dérivés, et p est un nombre entier compris entre 0 et 2,
R1 représente la fonction aminé primaire de l'acide aminé N-terminal, libre ou substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi un groupement acétyle, un groupement benzoyle, un groupement tosyle ou un groupement benzyloxycarbonyle,
R2 représente le groupe hydroxyle de la fonction carboxyle de l'acide aminé C- terminal, libre ou substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi une chaîne alkyle de Ci à C20, ou un groupement NH2, NHY ou NYY avec Y représentant une chaîne alkyle de C1 à C4, ladite séquence de formule générale (I) étant constituée de 3 à 9 résidus d'acides aminés, ladite séquence de formule générale (I) pouvant comprendre des substitutions des acides aminés X1, X2, X3, et X4 par d'autres acides aminés chimiquement équivalents.
Le composé peptidique selon l'invention est caractérisé en ce qu'il permet d'augmenter l'activité du protéasome.
On entend par composé peptidique qui « permet d'augmenter l'activité du protéasome», tout peptide ou dérivé biologiquement actif capable d'augmenter l'activité du protéasome, soit par augmentation de la synthèse protéique des sous-unités du protéasome (par modulation directe ou indirecte de l'expression génique), soit par d'autres processus biologiques tels que la stabilisation des sous-unités constituant le protéasome ou encore la stabilisation des transcrits d' ARN messager.
Le composé peptidique selon l'invention est caractérisé en ce qu'il permet d'activer la dégradation par le protéasome des protéines endommagées. Par « protéines endommagées » on entend des protéines ayant subi des réactions d'oxydation dues aux espèces réactives de l'oxygène (radicaux libres), des protéines glyquées ou conjuguées avec des produits issus de la péroxydation lipidique etc. Dans un premier mode de réalisation préféré, le composé peptidique est protégé par une acylation ou par une acétylation de l'extrémité amino-terminale.
Dans un second mode de réalisation préféré, le composé peptidique correspond à une des formules suivantes :
(SEQ ID n°l) Asp -Cys -Arg - NH2 (SEQ ID n°2) Asp - Cys -Arg - Lys (SEQ ID n°3) Glu -Leu - Asp -Cys -Arg - Lys - NH2 (SEQ ID n°4) Ser - Asp -Cys -Arg - His - Pro (SEQ ID n°5) Arg - Asp -Cys -Arg - Arg - Phe - NH2
Préférentiellement, le composé peptidique selon l'invention correspond à la séquence ID n°l c'est-à-dire Asp -Cys -Arg - NH2.
Dans un autre mode de réalisation préféré, le composé peptidique selon l'invention correspond à la séquence ID n°4 c'est-à-dire Ser - Asp -Cys -Arg - His - Pro.
L'invention concerne aussi des formes homologues de ces séquences. Le terme « homologue » désigne, selon l'invention, toute séquence peptidique identique à au moins 50%, ou de préférence au moins 80%, et encore plus préférentiellement à au moins 90% de ladite séquence peptidique, choisie parmi les séquences SEQ ID n° 1 à SEQ ID n° 5. Par « séquence peptidique identique à au moins X% », on entend désigner un pourcentage d'identité entre les résidus d'acides aminés des deux séquences à comparer, obtenu après l'alignement optimal des deux séquences. L'alignement optimal est obtenu à l'aide d'algorithmes d'homologies locales tels que ceux utilisés par le logiciel informatique BLAST P disponible sur le site NCBI. Le terme « homologue » peut également désigner un peptide qui diffère de la séquence d'un peptide de séquence SEQ ID n° 1 à SEQ ID n° 5 par la substitution d'acides aminés chimiquement équivalents, c'est-à-dire par la substitution d'un résidu par un autre possédant les mêmes caractéristiques. Ainsi, les substitutions classiques se font entre AIa, Val, Leu et Ile ; entre Ser et Thr ; entre les résidus acides Asp et Glu ; entre Asn et GIn ; et entre les résidus basiques Lys et Arg ; ou entre les résidus aromatiques Phe et Tyr.
Les acides aminés constituant le peptide selon l'invention peuvent être sous configuration Lévogyre c'est-à-dire L- et/ou Dextrogyre c'est-à-dire D-. Le peptide selon l'invention peut donc être sous forme L-, D- ou DL-. Le terme « peptide » ou « composé peptidique » désigne un enchaînement de deux ou plusieurs acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques ou par des liaisons peptidiques modifiées.
Par « peptide » ou « composé peptidique », il faut entendre le peptide naturel ou synthétique de l'invention tel que décrit ci-dessus, ou au moins l'un de ses fragments, qu'il soit obtenu par protéolyse ou de manière synthétique, ou encore tout peptide naturel ou synthétique dont la séquence est totalement ou partiellement constituée par la séquence du peptide précédemment décrit.
De façon à améliorer la résistance à la dégradation, il peut être nécessaire d'utiliser une forme protégée du peptide selon l'invention. La forme de protection doit évidemment être une forme biologiquement compatible et doit être compatible avec une utilisation dans le domaine des cosmétiques ou de la pharmacie.
De nombreuses formes de protection biologiquement compatibles peuvent être envisagées. Elles sont bien connues de l'homme du métier comme, par exemple, l'acylation ou l'acétylation des extrémités amino et/ou carboxy-terminales. Ainsi, l'invention concerne une composition telle que définie précédemment, caractérisée par le fait que le peptide de séquence SEQ ID n°l à SEQ ID n°5 est sous forme protégée de façon simple ou double. De préférence, on utilise, pour la protection de la fonction hydroxyle de l'extrémité carboxy-terminale, une amidation par un groupement NYY avec Y représentant une chaîne alkyle de C1 à C4, ou l'estérification par un groupement alkyle.
Il est également possible de protéger les deux extrémités du peptide.
Le peptide de formule générale (I) selon l'invention peut être obtenu soit par synthèse chimique classique (en phase solide ou en phase homogène liquide), soit par synthèse enzymatique (Kullman et al., J. Biol. Chem. 1980, 225, 8234), à partir d'acides aminés constitutifs ou de leurs dérivés.
Le peptide selon l'invention peut être d'origine naturelle ou synthétique. Préférentiellement selon l'invention, le peptide est obtenu par synthèse chimique.
Enfin, le principe actif peut être un peptide unique, un mélange de peptides ou de dérivés peptidiques et/ou constitué de dérivés d'acides aminés.
Le composé peptidique selon l'invention peut être utilisé à titre de médicament.
Le second objet de la présente invention se rapporte à une composition cosmétique comprenant à titre de principe actif ledit composé peptidique de formule générale (I). De o
manière préférée, les compositions selon l'invention se présentent sous une forme adaptée à l'application par voie topique comprenant un milieu cosmétiquement acceptable. Par « cosmétiquement acceptable », on entend des milieux qui conviennent à une utilisation en contact avec la peau ou les phanères humains, sans risque de toxicité, d'incompatibilité, d'instabilité, de réponse allergique et autres. Préférentiellement, ledit composé peptidique est présent dans la composition à une concentration comprise entre 0,0005 et 500 ppm environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,01 et 5 ppm. Dans les compositions selon l'invention, le composé peptidique est solubilisé dans un ou plusieurs solvants comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, le principe actif selon l'invention est solubilisé dans un vecteur cosmétique ou pharmaceutique comme les liposomes ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites, et plus généralement solubilisé dans, ou fixé sur, tout vecteur physiologiquement acceptable.
Les compositions destinées à être appliquées sur la peau peuvent se présenter sous forme de solution aqueuse ou hydroalcoolique, d'émulsion eau dans huile ou huile dans eau, de microémulsion, de gel aqueux ou anhydre, de sérum, ou encore de dispersion de vésicules, de patch, de crème, de spray, d'onguent, de pommade, de lotion, de colloïde, de solution, de suspension ou autres. Les compositions peuvent aussi être appliquées sur les phanères sous forme de shampoing, de teinture ou de mascara à appliquer au pinceau ou au peigne, en particulier sur les cils, les sourcils ou les cheveux, ou encore de soins pour les ongles tels que les vernis.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention contient en outre, au moins un autre principe actif favorisant l'action dudit composé peptidique. On peut citer, de manière non limitative, les classes d'ingrédients suivantes : d'autres agents actifs peptidiques, des extraits de végétaux, des agents cicatrisants, anti-âge, anti-rides, apaisants, anti-radicalaire, anti-UV, des agents stimulant la synthèse de macromolécules dermiques ou le métabolisme énergétique, des agents hydratants, anti-bactériens, antifongiques, anti-inflammatoires, anesthésiques, des agents modulants la différenciation, la pigmentation ou la dépigmentation cutanée, des agents stimulants la pousse des ongles ou des cheveux.... Préférentiellement, on utilisera un agent présentant une activité dans le domaine des antirides, tel qu'un agent anti-radicalaire ou antioxydant, ou un agent stimulant la synthèse de macromolécules dermiques, ou encore un agent stimulant le métabolisme énergétique. Plus particulièrement, le principe actif est choisi parmi les vitamines, les phytostérols, les flavonoïdes, la DHEA et/ou un de ses précurseurs ou un de ses dérivés chimiques ou biologiques, un inhibiteur de métalloproteinase, ou un rétinoïde. En outre, des additifs tels que des agents épaississants, émulsifiants, humectants, émollients, des parfums, des antioxydants, des agents filmogènes, chélatants, séquestrants, conditionnants....peuvent être ajoutés à la composition.
Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, être compris entre 0,01 et 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés dans une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
Enfin, l'invention se rapporte à une composition comprenant le dit composé peptidique afin d'augmenter l'activité du protéasome et d'améliorer la dégradation par le protéasome des protéines endommagées.
Un troisième objet de l'invention se rapporte à l'utilisation d'une composition cosmétique comprenant ledit composé peptidique et un milieu cosmétiquement acceptable pour prévenir et/ou traiter les signes cutanés du vieillissement et du photo-vieillissement.
Les « signes cutanés du vieillissement » incluent, mais ne se limitent pas à, toutes les manifestations visibles sur la peau causées par le vieillissement. On entend en particulier les rides, les rides profondes et grossières, les ridules, les crevasses, le relâchement des tissus cutanés et sous-cutanés, la perte de l'élasticité cutanée et l'atonie, la perte de fermeté et de tonicité, et l'atrophie dermique. En outre, on entend aussi par « signes cutanés du vieillissement », les pores élargis, les imperfections, la décoloration, les taches de vieillesse, les kératoses, la perte de collagène, et autres changements du derme et de l'épiderme, mais également toutes modifications de l'aspect extérieur de la peau et des phanères dues au vieillissement comme, par exemple, les rugosités superficielles de la couche cornée, mais également toute modification interne de la peau qui ne se traduit pas systématiquement par un aspect extérieur modifié comme, par exemple, l'amincissement du derme. Par « photo-vieillissement » on entend le vieillissement prématuré de la peau causé par l'exposition prolongée et cumulative au soleil.
La présente invention se rapporte donc à l'utilisation d'une composition pour traiter ou prévenir les rides, les rides profondes et grossières, les ridules, les crevasses, le relâchement des tissus cutanés et sous-cutanés, la perte de l'élasticité cutanée et l'atonie, la perte de fermeté et de tonicité, et l'atrophie dermique. En outre, ladite composition selon l'invention permet d'activer le renouvellement cellulaire et de nettoyer en profondeur les cellules.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une composition selon l'invention pour protéger la peau contre les agressions dues aux rayonnements UV. Enfin, l'invention se rapporte à l'utilisation d'une composition comprenant le composé peptidique pour augmenter l'activité du protéasome et améliorer la dégradation par le protéasome des protéines endommagées.
Un dernier objet de la présente invention se rapporte à un procédé de traitement cosmétique caractérisé en ce que l'on applique topiquement sur la peau ou les phanères à traiter, une composition comprenant une quantité efficace de composé peptidique selon l'invention pour prévenir et/ou traiter les signes cutanés du vieillissement et du photovieillissement. En outre, ce procédé de traitement cosmétique est caractérisé en ce que la composition est appliquée avant le coucher de façon à nettoyer les cellules et la peau pendant le cycle de renouvellement cellulaire. En effet, durant la nuit, la peau privilégie les fonctions de renouvellement ainsi que les processus métaboliques de synthèse. Par conséquent, l'application de la composition telle que revendiquée, en respectant le rythme biologique de la peau permet d'obtenir un effet rajeunissant, stimulant le renouvellement cellulaire, et régénérant.
Les exemples suivants décrivent et démontrent l'efficacité de composés peptidiques tels que décrits selon l'invention mais ne doivent pas être interprétés comme une limitation de la présente invention. Exemple 1 : Validation du modèle des kératinocvtes âgés : Immunoblotting des protéines ubiquitinylées et du protéasome 2OS sur kératinocytes âgés
Processus de vieillissement des kératinocvtes en culture Des cellules NHK, Normal Human Kératinocvtes, sont isolées à partir de biopsies de peau humaine. Ces cellules sont maintenues en culture dans un milieu spécial kératinocyte-SFM (Invitrogen) à 37°C sous une atmosphère humide de 5 % CO2. On obtient des cellules NHK vieillies en effectuant une série de sous-cultures répétées. Brièvement les cellules sont ensemencées dans des flasques de 75 cm2, à densité faible et mises en culture de 5 à 10 jours entre 2 passages. Les cellules sont traitées ou non par le principe actif, par ajout de l'actif directement dans le milieu de culture 3 fois par semaine.
Ces cellules sont ensuite maintenues dans ces conditions pendant 45 jours.
Immunoblotting des protéines ubiquitinylées et du protéasome 2OS sur kératinocvtes âgés.
Afin de valider notre modèle, il convenait tout d'abord de démontrer que sur des kératinocytes en culture vieillis expérimentalement, le taux d'expression des protéines ubiquitinylées, ainsi que le taux de protéasome 2OS, conformément à la littérature, diminuaient au cours du temps. Le taux d'expression de ces protéines a été évalué par la technique de F immunoblotting. La technique de l' immunoblotting (ou western blotting) est une méthode semi-quantitative qui permet d'apprécier le taux de protéines étudiées dans les cellules, c'est-à-dire le taux des protéines ubiquitinylées par un anticorps spécifiques de l'ubiquitine (DAKO), ainsi que le taux de protéasome 2OS par un anticorps spécifique du protéasome (C ALBIOCHEM).
Protocole
Des kératinocytes vieillis sont mis en culture dans des flasques de 75 cm2 à 370C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2 pendant 10, 20, 30 et 40 jours. Les cellules ne sont pas traitées, le jour de l'expérience. Elles sont rincées puis détachées du support à l'aide d'un tampon d'extraction (20 mM TRIS, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA,
0.2 % Triton XlO) en présence d'un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Sigma). Les protéines ainsi extraites sont centrifugées à 4°C à 10000 rpm pendant 10 minutes avant d'être dosées par le kit de dosage des protéines BCA (Pierce). Les lysats cellulaires sont mélangés à un tampon de dénaturation et soumis à une électrophorèse SDS PAGE. Le gel utilisé est un Nupage 4-12 % (Invitrogen). Les protéines sont enfin transférées sur une membrane de nitrocellulose (Pal corporation). Les membranes sont saturées dans du PBS- lait 5 %, 0,1% tween 20, 2 heures à température ambiante, puis incubées à 4°C toute la nuit avec un anticorps primaire.
Pour l'étude des protéines ubiquitinylées l'anticorps primaire est un anticorps de lapin anti-ubiquitin utilisé à la dilution de l/500ème (DAKO). Pour l'étude du protéasome 2OS l'anticorps primaire est un anticorps de souris anti- proteasome 2OS utilisé à la dilution de l/1000ème (CALBIOCHEM).
L'incubation avec l'anticorps primaire est suivie d'une incubation avec un anticorps secondaire anti-lapin IgG-péroxydase (MMUNOTECH) dilué au l/1000ème dans le cas des protéines ubiquitinylées, ou avec un anticorps secondaire anti-souris IgG-péroxydase (BVIMUNOTECH) dilué au l/1000ème dans le cas du protéasome. La révélation est effectuée par un substrat chimioluminescent. L'évaluation des protéines exprimées dans les cellules est effectuée grâce au logiciel Chemiimager (Alpha Innotech Corporation USA). La quantité des protéines étudiées est exprimée en pourcentage d'intensité lumineuse comparée à la condition contrôle au temps 0 de l'expérience.
Résultats :
Immunoblotting des protéines ubiquitinylées sur des kératinocytes au cours du vieillissement :
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Immunoblotting du protéasome 2OS sur des kératinocytes au cours du vieillissement
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Conclusion :
Nous avons donc démontré, dans notre système de vieillissement expérimental, que le taux de protéines ubiquitinylées diminuait au cours du temps et, proportionnellement au temps de culture, au bout de 40 jours nous enregistrons une diminution d'environ 56 % par rapport au temps 0. De la même manière nous avons démontré dans notre système de vieillissement expérimental, que le taux de protéasome 2OS diminuait au cours du temps et, proportionnellement au temps de culture, au bout de 40 jours nous enregistrons une diminution d'environ 54 % par rapport au temps 0. Ces 2 expériences nous permettent de conclure que le vieillissement expérimental mis en place au laboratoire est un bon modèle d'étude du vieillissement sur les cellules en culture. Ce modèle pourra donc être utilisé dans les expériences ultérieures pour démontrer l'activité et l'efficacité de notre actif.
Exemple 2 : Mise en évidence de l'effet activateur de l'actif sur la mesure de l'activité enzymatique du protéasome 2OS sur des kératinocvtes vieillis maintenus en culture.
Des kératinocvtes vieillis expérimentalement maintenus en culture pendant 15 jours, sont traités avec 1% de notre peptide SEQ ID n°l. On étudie alors les activités enzymatiques du protéasome 2OS. En effet le protéasome 2OS est la sous-unité responsable de l'hydrolyse enzymatique. Trois activités enzymatiques peuvent être étudiées : l'activité trypsine-like, chimotrypsine-like et peptidylglutamyl-peptide hydrolase (PGPH). Nous nous proposons d'étudier ces activités par un dosage enzymatique spécifique de chaque activité.
Protocole Les kératinocvtes vieillis sont maintenus en culture pendant 15 jours. Le traitement des cellules est effectué par ajout d'une solution à 1 % de notre peptide SEQ ID n°l directement dans le milieu, renouvelé 3 fois par semaine pendant le temps de l'expérience.
Le dosage de chaque activité a été mis en place en utilisant des substrats spécifiques marqués par un composé fluorescent : le 7-amido-4-méthylcoumarine (AMC). Après clivage, l'AMC dont la longueur d'onde d'excitation est de 350nm, la lecture de la fluorescence est effectuée à 440nm. L'intensité de la fluorescence est proportionnelle à la quantité de fluorochrome obtenue et en conséquence, cette quantité est proportionnelle à la quantité de substrat hydrolyse.
Le peptide synthétique Boc-Leu-Arg-Arg-AMC est spécifique de l'activité trypsique.
Le peptide synthétique Suc-Leu-Leu-Val-Try-AMC est spécifique de l'activité chymotrypsique.
Le peptide synthétique Z-Leu-Leu-Glu-AMC est spécifique de l'activité peptidylglutamyl- peptide hydrolase.
Ces peptides ont été fournis et marqués par SIGMA ALDRICH, Saint-Louis, MI, USA.
Les cellules sont détachées du support dans un tampon d'extraction. Par la suite, elles sont soniquées pendant 1 minute à 4°C, puis centrifugées à 15000 g pendant 30 minutes à 4°C. Le dosage des protéines est réalisé par le kit BCA (Pierce). Après incubation du lysat cellulaire avec le substrat synthétique spécifique de l'activité étudiée, la fluorescence est lue au spectrophotomètre Synergy (BIOTEK, Vermont, USA) à 440 nm. Résultats
Nous constatons que pour les 3 activités étudiées, le peptide SEQ ID n°l a permis d'augmenter l'activité enzymatique du protéasome 2OS. L'activité trypsine-like est augmentée de 155.3 % lors du traitement par l'actif, l'activité chymotrypsin-like est augmentée de 130 % et on enregistre une augmentation de 144.6 % pour l'activité peptidylglutamyl-peptide hydrolase.
Conclusions
Le peptide SEQ DD n° 1 utilisé à 1 % sur des kératinocytes vieillis expérimentalement en culture permet d'augmenter les activités enzymatiques spécifiques du protéasomes 2OS.
L'expérience a été réalisée plusieurs fois, et un test statistique (test statistique t-Student) a pu être réalisé. L'augmentation des activités est significative pour l'étude de l'activité trypsine-like, chymotrypsin-like (p=0.033 et p=0.0477 respectivement), et hautement significative pour l'activité peptidylglutamyl-peptide hydrolase (p=0.00053).
Exemple 3 : Mise en évidence de l'effet antivieillissement de l'actif sur des kératinocvtes vieillis en culture Une étude de l'effet anti-vieillissement de l'actif a été réalisée en évaluant l'expression de la protéine bêta-galactosidase sur des kératinocytes vieillis expérimentalement en culture. En effet, l'activité bêta-galactosidase est connue pour être présent dans les cellules sénescentes alors qu'on ne trouve pas d'activité galactosidase dans les cellules pré-sénescentes, quiescentes ou immortelles.
Protocole
Des kératinocytes vieillis expérimentalement dans des labteck 8 puits sont mis en culture et sont maintenus pendant 20 jours en présence ou non de 1 % de peptide de SEQ ID n°l. Le traitement est effectué 3 fois par semaine par ajout direct dans le milieu. Des cellules non traitées sont maintenues en culture pendant le même temps de l'expérience et serviront de contrôle. Le jour du marquage, les cellules sont rincées, fixées dans un mélange 2 % glutaraldéhyde - 2 % formaldéhyde pendant 3 minutes. Les cellules sont ensuite rincées et on applique 300 μl de 5-bromo-4-chloro-3 indolyl β-D- galactosidase appelé communément X-gal (substrat de la bêta-galactosidase). L'incubation s'effectue pendant 24 heures dans l'incubateur à CO2, puis les cellules sont rincées et la labteck est rapidement montée dans un milieu adéquat. L'observation s'effectue au microscope à transmission. Le principe est simple : lorsque les cellules sont sénescentes et contiennent la bêta-galactosidase, le substrat X-gal est clivé en un produit bleu insoluble. L'activité bêta-galactosidase est mise en évidence par une coloration des cellules bleues. Plus il y a de cellules bleues, plus le nombre de cellules sénescentes est élevé.
Résultats / Conclusions :
Nous constatons qu'en présence de l'actif, l'activité bêta-galactosidase est fortement réduite dans les cellules traitées comparée aux cellules non traitées.
Par conséquent, l'actif permet de mettre en évidence un effet antivieillissement sur des kératinocytes en culture vieillis expérimentalement pendant 20 jours de culture.
Exemple 4 : Evaluation de la carbonylation des protéines sur des fïbroblastes traités par l'actif et soumis à des rayonnements ultraviolets (UVB)
Protocole : Des fïbroblastes humains normaux en culture sont ensemencés dans des boites de diamètres 100. Lorsque les cellules ont atteint 70 % de confluence, les cellules sont traitées 48 heures avec le peptide de séquence ID n°l dilué à 1 % dans le milieu. Les cellules sont soumises à l'irradiation UVB à 100mj/cm2, puis remises 48 heures supplémentaires en présence de l'actif. Des boîtes contrôle avec des cellules non traitées par l'actif mais irradiées servent de témoin. Les cellules sont rincées puis détachées du support à l'aide d'un tampon d'extraction adéquat. Les protéines ainsi extraites, sont centrifugées à 4°C à 10000 rpm pendant 10 minutes avant d'être dosées par le kit de dosage des protéines BCA (Pierce). La carbonylation des protéines est réalisée par un test basé sur l'immunodétection des groupements carbonylés préalablement dérivés par le 2,4- dinitrophénylhydrazine (DNP) (SIGMA).
Selon la réaction :
Protéine-C=O + H2N-NH-^4DNP → Protéine-C=N-NH2.4-DNP + H2O
Brièvement, 15 μl de l'échantillon sont mis à réagir avec 45 μl de DNP pendant 45 minutes à température ambiante. Ensuite, 5μl du mélange est dilué dans 1 ml de phosphate buffer saline et 200 μl de cette dilution sont mis dans une plaque 96 puits over night à 40C en présence de 150 μl de BSA (fraction V).
Après 3 lavages en tampon phosphate saline (PBS), l'anticorps biotinylé de lapin anti-dinitrophenyl (CALBIOCHEM) est diluée au l/5000ème dans du tampon 0.1 % sérum albumine en présence de 0.1 % Tween 20 et incubé dans les microplaques 1 heure à 370C. Après 3 lavages, on incube le complexe streptavidine-péroxydase (DAKO) dilué au l/3000ème dans du tampon 0.1 % sérum albumine en présence de 0.1 % Tween 20 et incubé dans les microplaques pendant 1 heure à température ambiante. Après 3 lavages, la révélation est effectuée grâce à 200 μl de tétramethylbenzidine (TMB, SIGMA) 25 minutes à température ambiante. Ensuite, l'ajout de 100 μl d'acide sulfurique à 2,5 M permet de stopper la réaction. La lecture de la DO s'effectue à 490 nm. Afin de convertir la DO obtenue en groupements carbonylés présents dans les échantillons, une courbe étalon a été établie en faisant varier des proportions de 0 à 100 % de BSA oxydée.
Résultats :
En présence d'UVB les cellules non traitées sont fortement carbonylées et augmentent de 110 % par rapport aux cellules non irradiées et non traitées. En présence de l'actif à 1 % le taux de carbonylation est diminué de 34 %. L'expérience a été réalisée plusieurs fois et un test statistique (test statistique t Student) a pu être réalisé. La diminution de la carbonylation est significative et p= 0.0298. En conclusion, l'actif permet de protéger les cellules contre les effets néfastes des UV c'est-à-dire contre leurs effets oxydatifs. L'actif permet de diminuer de plus de 34 % l'oxydation des protéines.
Exemple 5 : Test cliniques
Protocole pour l'évaluation clinique
12 volontaires âgés de 29 à 56 ans ont appliqué soit un placebo, soit l'actif peptidique de séquence ID n°l 2 fois par jour matin et soir, à une dose de 2 mg/cm2 pendant 24 jours. Une évaluation clinique des résultats a permis de mesurer plusieurs paramètres des rides et ridules.
La mesure des rides et ridules a été réalisée grâce au QU ANTIRIDE qui est une méthode d'évaluation qui permet de mesurer le nombre, la longueur et la profondeur des rides en effectuant une réplique de la peau avant et après traitement à l'aide d'un polymère silicone.
Les résultats sont compilés dans les tableaux ci-dessous :
Résultats quantification ride
Figure imgf000018_0001
Conclusions:
Après 24 jours de traitement, nous observons une diminution statistique de la longueur totale des rides chez 83.3 % des sujets traités, ainsi qu'une diminution du nombre de rides chez 75 % des sujets traités. Concernant la longueur des rides, on constate une différence significative entre l'actif et le placebo (p=0,017). Pour la profondeur des rides, la différence entre l'actif et le placebo est aussi significative (p=0,0075) et est observée chez 75 % des volontaires.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé peptidique de formule générale suivante (I) :
R1 - X1 - X2 -Asp - Cys - Arg - X3 -X4 - (AA)p - R2 Dans laquelle,
X1 représente un acide aspartique, un acide glutamique, une serine, une thréonine, ou est égal à zéro,
X2 représente une arginine, une leucine, une isoleucine, ou est égal à zéro,
X3 représente une arginine, une lysine, ou est égal à zéro, X4 représente une arginine, une proline, une histidine, une lysine, ou est égal à zéro,
AA représente un acide aminé quelconque à l'exception de la cystéine, ou un de ses dérivés, et p est un nombre entier compris entre 0 et 2,
R1 représente la fonction aminé primaire de l'acide aminé N-terminal, libre ou substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi un groupement acétyle, un groupement benzoyle, un groupement tosyle ou un groupement benzyloxycarbonyle,
R2 représente le groupe hydroxyle de la fonction carboxyle de l'acide aminé C-terminal, libre ou substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi une chaîne alkyle de Cl à C20, ou un groupement NH2, NHY ou NYY avec Y représentant une chaîne alkyle de Cl à C4, ladite séquence de formule générale (I) étant constituée de 3 à 9 résidus d'acides aminés, ladite séquence de formule générale (I) pouvant comprendre des substitutions des acides aminés X1, X2, X3, et X4 par d'autres acides aminés chimiquement équivalents.
2. Composé peptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond à une des formules suivantes :
(SEQ ID n°l) Asp -Cys -Arg - NH2 (SEQ ID n°2) Asp -Cys -Arg - Lys (SEQ ID n°3) Glu -Leu - Asp -Cys -Arg - Lys - NH2 (SEQ ID n°4) Ser - Asp -Cys -Arg - His - Pro (SEQ ID n°5) Arg - Asp -Cys -Arg - Arg - Phe - NH2
3. Composé peptidique selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il est utilisé à titre de médicament.
4. Composition cosmétique comprenant à titre de principe actif ledit composé peptidique selon l'une des revendications 1 ou 2.
5. Composition cosmétique selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme adaptée à l'application par voie topique comprenant un milieu cosmétiquement acceptable.
6. Composition selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisée en ce que ledit composé peptidique est présent dans la composition à une concentration comprise entre 0,0005 et 500 ppm environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,01 et 5 ppm.
7. Composition selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisée en ce que ledit principe actif peptidique est solubilisé dans un ou plusieurs solvants, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants.
8. Composition selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisée en ce qu'elle contient en outre, au moins un autre principe actif favorisant l'action dudit composé peptidique.
9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit principe actif est un agent présentant une activité dans le domaine des antirides tel qu'un agent anti- radicalaire ou antioxydant, ou un agent stimulant la synthèse de macromolécules dermiques, ou encore un agent stimulant le métabolisme énergétique.
10. Composition selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisée en ce que ledit principe actif est choisi parmi les vitamines, les phytostérols, les flavonoïdes, la DHEA et/ou un de ses précurseurs ou un de ses dérivés chimiques ou biologiques, un inhibiteur de métalloproteinase, ou un rétinoïde.
11. Utilisation d'une composition cosmétique comprenant ledit composé peptidique tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 et un milieu cosmétiquement acceptable pour prévenir et/ou traiter les signes cutanés du vieillissement et du photo- vieillissement.
12. Utilisation d'une composition selon la revendication 11 caractérisée en ce que par signe du vieillissement on entend les rides, les rides profondes et grossières, les ridules, les crevasses, le relâchement des tissus cutanés et sous-cutanés, la perte de l'élasticité cutanée et l'atonie, la perte de fermeté et de tonicité, et l'atrophie dermique.
13. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite composition permet d'activer le renouvellement cellulaire et de nettoyer en profondeur les cellules.
14. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite composition permet de protéger la peau contre les agressions dues aux rayonnements UV.
15. Utilisation selon la revendication 11 d'une composition cosmétique destinée à augmenter l'activité du protéasome et améliorer la dégradation par le protéasome des protéines endommagées.
16. Procédé de traitement cosmétique caractérisé en ce que l'on applique topiquement sur la peau ou les phanères à traiter, une composition comprenant une quantité efficace de composé peptidique tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2, pour prévenir et/ou traiter les signes cutanés du vieillissement et du photo-vieillissement.
17. Procédé de traitement cosmétique, tel que défini dans la revendication précédente, caractérisé en ce que la composition est appliquée avant le coucher de façon à nettoyer la peau pendant le cycle de renouvellement cellulaire.
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