WO2010079286A1 - Nouveaux peptides anti-age et composition cosmétique et/ou pharmaceutique les contenant - Google Patents

Nouveaux peptides anti-age et composition cosmétique et/ou pharmaceutique les contenant Download PDF

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WO2010079286A1
WO2010079286A1 PCT/FR2010/000008 FR2010000008W WO2010079286A1 WO 2010079286 A1 WO2010079286 A1 WO 2010079286A1 FR 2010000008 W FR2010000008 W FR 2010000008W WO 2010079286 A1 WO2010079286 A1 WO 2010079286A1
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skin
peptide
seq
composition
peptide compound
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PCT/FR2010/000008
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Claude Dak Farra
Nouha Domloge
Jean-Marie Botto
Isabelle Imbert
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Isp Investments Inc.
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Publication date
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
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    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
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    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
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    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61Q17/04—Topical preparations for affording protection against sunlight or other radiation; Topical sun tanning preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/081—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • the present invention is in the fields of cosmetics and dermopharmacy.
  • the present invention relates to peptide compounds of the following general formula (I): R 1 - (AA) n - Xi - Ser - Thr - Pro - X 2 - (AA) P - R 2 , as well as their uses in cosmetics and / or pharmaceutical to prevent and correct the effects of aging and UV aggressions of the skin and superficial body growths.
  • the primary function of the epidemic is to provide a barrier between the external environment and the internal environment. It is the outermost layer of the epidermis, the stratum corneum, which provides this function. It is composed of keratinocytes at the final stage of their differentiation, the corneocytes, sealed to each other by a thick intercellular cement, both flexible and impermeable. This physical barrier of the skin allows the human body to protect itself from many types of aggression. These attacks can have various intrinsic origins, such as chronological aging or biochemical changes that occur during states of fatigue, stress, hormonal changes such as during pregnancy .... Other attacks they have an extrinsic origin such as pollution, sun, diseases ....
  • compositions In order to overcome these disadvantages, many cosmetic compositions have been proposed in recent years. These compositions included the use, alone or in combination, of hydrating agents, soothing, anti-inflammatory, anti-free radicals, anti-seborrhoeic, cicatrizing, lightening, keratolytic ... However, none of these compositions currently allows, to prevent or correct the effects of aging intrinsically or extrinsically origin of the skin.
  • peptide compounds of the following general formula R 1 - (AA) n - X 1 - Ser - Thr - Pro - X 2 - (AA) P - R 2i have an anti-aging effect on the skin by a global action on various characteristic symptoms of the latter.
  • No document of the prior art describes such peptide compounds in order to obtain an anti-aging effect.
  • these peptide compounds are characterized by the fact that they are activating agents of the Clock gene involved in the regulation of the circadian cycle. Therefore, the subject of the present invention is Clock-activating peptide compounds as well as their use in cosmetic and pharmaceutical compositions in order to prevent or correct the signs due to aging and UV aggressions of the skin and superficial body growths.
  • the circadian clock is controlled by a negative regulatory loop involving a set of genes, including Per-1 (Period), Circadian Locomotor Output Cycles (Kaput) and BMAL-I (Brain and Muscle RNAt-like Protein) genes.
  • Per-1 Period
  • Circadian Locomotor Output Cycles Kaput
  • BMAL-I Brain and Muscle RNAt-like Protein
  • X 2 represents an isoleucine, a leucine, a valine, an alanine, a glycine, or is equal to zero
  • AA represents any amino acid except proline, or a derivative thereof, and n and p are integers between 0 and 4,
  • R 1 represents the primary amino function of the N-terminal amino acid, free or substituted by a protecting group which may be chosen from an acetyl group, a benzoyl group, a tosyl group or a benzyloxycarbonyl group,
  • R 2 represents the hydroxyl group of the carboxyl function of the C-terminal amino acid, substituted with a protective group which may be chosen from an alkyl chain of C 1 to C 2 o, or an NH 2, NHY or NYY group with Y representing a alkyl chain -C 4, said sequence of general formula (I) consisting of 3 to 13 amino acid residues, said sequence of general formula (I) may include substitutions of amino acid Xi and X 2 by of other chemically equivalent amino acids.
  • the subject of the present invention is a cosmetic or dermopharmaceutical composition
  • peptide compounds of general formula (I) comprising peptide compounds of general formula (I).
  • the third subject of the present invention is the use of a cosmetic or dermopharmaceutical composition comprising peptide compounds of general formula (I).
  • the fourth subject of the present invention is a method of cosmetic treatment using a composition comprising peptide compounds of general formula (I).
  • the first subject of the invention relates to a peptide compound of general formula (I) below: -AT-
  • Xi represents threonine, serine, or is zero
  • X 2 is isoleucine, leucine, valine, alanine, glycine, or is zero
  • AA represents any amino acid except proline, or a derivative thereof, and n and p are integers from 0 to 4,
  • R 1 represents the primary amino function of the N-terminal amino acid, free or substituted by a protective group which may be chosen from an acetyl group, a benzoyl group, a tosyl group or a benzyloxycarbonyl group,
  • R 2 represents the hydroxyl group of the carboxyl function of the C-terminal amino acid, substituted with a protective group which may be chosen from an alkyl chain of C 1 to C 2 o, or an NH 2, NHY or NYY group with Y representing a alkyl chain -C 4, said sequence of general formula (I) consisting of 3 to 13 amino acid residues, said sequence of general formula (I) may include substitutions of amino acid Xi and X 2 by of other chemically equivalent amino acids.
  • a protected form of the peptide according to the invention In order to improve the resistance to degradation, it may be necessary to use a protected form of the peptide according to the invention.
  • the form of protection must obviously be a biologically compatible form and must be compatible with use in the field of cosmetics or pharmacy.
  • Many forms of biologically compatible protection can be envisaged. They are well known to those skilled in the art such as, for example, acetylation of the amino-terminal ends.
  • an amidation by a NYY group with Y represents a C 1 to C 4 alkyl chain, or the esterification with an alkyl group. It is also possible to protect both ends of the peptide.
  • the peptide compound is protected by acetylation of the amino-terminus.
  • the peptide compound has one of the following sequences: (SEQ ID No. 1) Tyr-Val-Ser-Thr-Pro-Tyr-Asn-NH 2 (SEQ ID No. 2) Val-Ser-Thr-Pro --Glu - NH 2 (SEQ ID NO: 3) Ser - Thr - Pro - NH 2 (SEQ ID NO: 4) Leu - He - Ser - Thr - Pro - NH 2
  • sequence of the peptide compound is the sequence SEQ ID No. 3, that is to say Ser-Thr -Pro-NH 2 .
  • sequence of the peptide compound is the sequence SEQ ID No. 4, that is to say Leu-His-Ser-Thr-Pro-NH 2.
  • the invention relates to a peptide compound as defined above, characterized in that the peptide of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 6 is in a single or double protected form.
  • the invention also relates to homologous forms of these sequences.
  • the term "homologue” denotes, according to the invention, any peptide sequence identical to at least 50%, or preferably at least 80%, and even more preferably to at least 90% of said peptide sequence, chosen from SEQ ID sequences. No. 1 to SEQ ID No. 6.
  • "Peptide sequence identical to at least X%" is intended to designate a percentage identity between the amino acid residues of the two sequences to be compared, obtained after the optimal alignment of the two sequences. Optimal alignment is achieved using local homology algorithms such as those used by BLAST P or T BLAST N computer software available on the NCBI site.
  • the term "homologue” can also refer to a peptide which differs from the sequence of a peptide of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 6 by the substitution of chemically equivalent amino acids, that is to say by the substitution of one residue for another with the same characteristics.
  • the classical substitutions are between Ala, Val, Leu and Ile; between Ser and Thr; between Asp and Glu acid residues; between Asn and GIn; and between the basic residues Lys and Arg; or between the aromatic residues Phe and Tyr.
  • peptide refers to a sequence of two or more amino acids linked together by peptide bonds or modified peptide bonds.
  • peptide is meant the natural or synthetic peptide of the invention as described above, or at least one of its fragments, whether obtained by proteolysis or synthetically, or any peptide natural or synthetic whose sequence is totally or partially constituted by the sequence of the previously described peptide.
  • the peptide of general formula (I) according to the invention can be obtained either by conventional chemical synthesis (in solid phase or in homogeneous liquid phase) or by enzymatic synthesis (Kullman et al., J. Biol Chem 1980, 225 , 8234), from constituent amino acids or their derivatives.
  • the peptide according to the invention may be of natural or synthetic origin.
  • the peptide is obtained by chemical synthesis.
  • the active ingredient may be a single peptide, a mixture of peptides or peptide derivatives and / or consisting of amino acid derivatives.
  • the peptide compound according to the invention can be used as a medicament.
  • compositions comprising said peptide compound of general formula (I).
  • the compositions according to the invention are in a form suitable for topical application comprising a cosmetically or dermatologically acceptable medium.
  • cosmetically or dermatologically acceptable means media which are suitable for use in contact with human skin or integuments, without risk of toxicity, incompatibility, instability, allergic response and the like.
  • said peptide compound is present in the composition at a concentration of between about 0.0005 and 500 ppm, and preferably at a concentration of between 0.01 and 5 ppm.
  • the peptide compound is first solubilized in one or more cosmetically or dermatologically acceptable solvents, such as water, glycerol, ethanol, propylene glycol, butylene glycol, dipropylene glycol, diglycols. ethoxylated or propoxylated, cyclic polyols, petroleum jelly, a vegetable oil or any mixture of these solvents.
  • cosmetically or dermatologically acceptable solvents such as water, glycerol, ethanol, propylene glycol, butylene glycol, dipropylene glycol, diglycols. ethoxylated or propoxylated, cyclic polyols, petroleum jelly, a vegetable oil or any mixture of these solvents.
  • the active principle according to the invention is solubilized beforehand in a cosmetic or pharmaceutical vector such as liposomes or adsorbed on powdery organic polymers, mineral supports such as talcs and bentonites, and more generally solubilized in, or attached to, any physiologically acceptable carrier.
  • a cosmetic or pharmaceutical vector such as liposomes or adsorbed on powdery organic polymers, mineral supports such as talcs and bentonites, and more generally solubilized in, or attached to, any physiologically acceptable carrier.
  • compositions intended to be applied to the skin may be in the form of an aqueous or aqueous-alcoholic solution, a water-in-oil or oil-in-water emulsion, a microemulsion, an aqueous or anhydrous gel, a serum or a dispersion of vesicles, patch, cream, spray, ointment, ointment, lotions, colloid, solution, suspension or others.
  • the compositions may also be applied to the integuments in the form of shampoo, dye or mascara to be applied by brush or comb, in particular on eyelashes, eyebrows or hair, or care for nails such as varnishes .
  • the composition according to the invention further contains at least one other active ingredient promoting the action of said peptide active principle.
  • active ingredient promoting the action of said peptide active principle.
  • the following classes of ingredients may be mentioned, in a non-limiting manner: other peptide active agents, plant extracts, cicatrizing, anti-aging, anti-wrinkle, soothing, anti-radical, anti-UV, agents stimulating the synthesis of dermal macromolecules or energy metabolism, moisturizing, antibacterial, anti-fungal, anti-inflammatory, anesthetic agents, modulating agents differentiation, pigmentation or skin depigmentation, stimulating agents the growth of nails or hair
  • an anti-radical agent or antioxidant or an agent stimulating the synthesis of dermal macromolecules, or an agent stimulating the energy metabolism, will be used.
  • additives such as thickeners, emulsifiers, humectants, emollients, perfumes, antioxidants, film-forming agents, chelating agents, sequestering agents, conditioning agents can be added to the composition.
  • these adjuvants and their proportions are chosen so as not to adversely affect the desirable properties of the composition according to the invention.
  • These adjuvants may, for example, correspond to 0.01 to 20% of the total weight of the composition.
  • the fatty phase may represent from 5 to 80% by weight and preferably from 5 to 50% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the emulsifiers and co-emulsifiers used in the composition will be chosen from those conventionally used in the field under consideration. For example, they can be used in a proportion ranging from 0.3 to 30% by weight, relative to the total weight of the composition.
  • a third subject of the present invention relates to the use of the peptide compound as an activating active ingredient of Clock.
  • the term "Clock activator peptide” is intended to mean any peptide or biologically active derivative capable of increasing the activity of Clock, either by increasing the protein synthesis of Clock (by direct or indirect modulation of the Clock gene expression) or by by other biological processes such as the stabilization of the Clock protein or the stabilization of messenger RNA transcripts.
  • Another object of the present invention relates to the use of a composition according to said invention for preventing or treating cutaneous signs of aging.
  • “Cutaneous signs of aging” include, but are not limited to, all visible manifestations on the skin caused by aging. In particular, we mean wrinkles, fine lines, cracks, enlarged pores, imperfections, loss of firmness, discoloration, age spots, keratoses, loss of collagen, and other changes of the dermis and epidermis ....
  • cutaneous signs “Aging” also means any changes in the external appearance of the skin and skin growth due to aging such as, for example, the superficial roughness of the stratum corneum, wrinkles and fine lines, but also any internal change in the skin that does not systematically result in a modified external appearance such as, for example, the thinning of the dermis or any other internal degradation of the skin following exposure to ultraviolet (UV) radiation.
  • a fourth subject of the present invention relates to the use of a composition according to said invention for protecting the skin against the aggressions due to UV radiation.
  • Another subject of the invention relates to the use of an effective amount of peptide active ingredient according to the invention, for the preparation of a pharmaceutical composition intended to prevent or fight against pathologies related to oxidation processes.
  • a final subject of the present invention relates to a cosmetic treatment method characterized in that a composition containing an effective amount of peptide active principle is applied topically to the skin or integuments to be treated in order to prevent or treat the cutaneous signs of the skin. aging or to protect the skin against the aggressions due to UV radiations. Furthermore, this cosmetic treatment method is characterized in that the composition is applied before bedtime to respect the circadian rhythm of the skin to obtain a rejuvenating effect on the skin. Indeed, during the night, the skin favors renewal functions as well as metabolic processes of synthesis. Therefore, the application of the composition as claimed, respecting the biological rhythm of the skin provides a rejuvenating effect, stimulating cell renewal, and regenerating.
  • a study of the activating effect of peptide SEQ ID No. 3 was carried out by evaluating the expression of Clock proteins in western blot on fibroblasts in culture.
  • the Western blot technique is a semi-quantitative method that can be used to assess the level of Clock proteins in cells.
  • Protocol Fibroblasts in cultures are cultured in 100 mm diameter dishes at 37 ° C. in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 for 18 h in the presence or absence of the peptide SEQ ID No. 3, diluted 1% (from 10 "4 M solution)
  • the cells are rinsed then detached from the support using an extraction buffer (20mM TRIS, 15OmM NaCl, 10mM EDTA, 0.2% Triton X10) in the presence of a cocktail of protease inhibitors (Sigma).
  • the proteins thus extracted are centrifuged at 4 ° C. at 10,000 rpm for 10 minutes before being assayed by the BCA protein assay kit (Pierce).
  • the cell lysates are mixed with a denaturation buffer and subjected to SDS-PAGE electrophoresis.
  • the gel used is a 4-12% broth (invitrogen).
  • the proteins are then transferred to a nitrocellulose membrane (Pal Corporation).
  • the membranes were saturated in PBS-5% milk, 0.1% Tween 20 for 2 hours at room temperature and then incubated at 4 ° C overnight with anti-Clock primary antibody l / 1000th (ABcam) followed by incubation with a secondary antibody Iggy-peroxidase diluted to l / 5000 th revelation is performed by a chemiluminescent substrate.
  • the quantitative evaluation of the proteins present in the cells is carried out using chemiimager software (Alpha innotech Corporation USA). The amount of protein is expressed as a percentage of light intensity compared to the control condition that did not have the treatment.
  • the peptide SEQ ID No. 3 makes it possible to increase the expression of the Clock protein on dermal cells in culture.
  • EXAMPLE 2 Demonstration of the Activating Effect of the Peptide SEQ ID No. 3 on the Expression of the Clock Protein on Skin Biopsies During Aging
  • a study of the activating effect of the peptide SEQ ID No. 3 was carried out by evaluating the expression of the Clock protein on skin models artificially aged in culture. The analysis was carried out after 62 h and 134 h of culture.
  • Skin samples not treated with the peptide SEQ ID No. 3 serve as a control. Skin samples are fixed with 10% formaldehyde and embedded in paraffin. Sections of 3 ⁇ m are made by microtome. Immunostaining is performed after deparaffinization and unmasking of the antigenic sites. The immunostaining is carried out for the Clock protein, an antibody (ABcam) diluted to l / 250th and a secondary antibody to l / 50th coupled to a fluorochrome. The slides are then mounted in a suitable medium and observed under an epifluorescence microscope (Nikon Eclipse E600).
  • the application of the peptide compound SEQ ID No. 3 makes it possible to increase the expression of the Clock protein on skin biopsies treated and artificially aged in culture.
  • Example 3 Demonstration of the anti-aging effect of peptide SEQ ID No. 3 on fibroblasts in culture.
  • beta-galactosidase protein A study of the anti-aging effect of the peptide SEQ ID No. 3 was carried out by evaluating the expression of the beta-galactosidase protein on fibroblasts in culture with short and long term effect. Indeed, the activity of beta-galactosidase is known to be present in senescent cells while no beta-galactosidase activity is found in pre-senescent, quiescent or immortal cells.
  • Fibroblasts in cultures in 8 well labtecks are maintained for 2 weeks (short-term effect) or 7 weeks (long-term effect) in the presence or absence of the peptide SEQ ID No. 3, diluted 1% (from a 10 " solution ). 4 M) The treatment is carried out once a day Untreated cells but kept in culture for 2 or 7 weeks according to the needs of the experiment serve as a control.On the day of the marking, the cells are rinsed, fixed in a mixture (2% glutaraldehyde - 2% formaldehyde) 3 minutes The cells are rinsed and 300 ⁇ l of (5-bromo-4-chloro-3-indolylbD-galactosidase), commonly called X-gal (substrate of beta-galactosidase) is applied.
  • 5-bromo-4-chloro-3-indolylbD-galactosidase commonly called X-gal (substrate of beta-galactosidase
  • the incubation is carried out for 24 hours in the CO2 incubator, then the cells are rinsed and the labteck is rapidly mounted in a suitable medium. The observation is carried out using a transmission microscope. cells are senescent and contain beta-galactosidase the X-gal substrate is cleaved into an insoluble blue product.
  • the beta-galactosidase activity is measured in the untreated control cells by staining them in blue.
  • the beta-galactosidase activity is strongly reduced in the cells treated with the peptide SEQ ID No. 3. This effect is observed both in the cells treated in the short term (2 weeks of experience) but also in the long term when the cells are treated for 7 consecutive weeks.
  • the administration of the peptide SEQ ID No. 3 makes it possible to demonstrate an anti-aging effect on fibroblasts in culture artificially aged for 2 or 7 weeks.
  • Human skin samples are cultured at the air / liquid interface.
  • Peptide SEQ ID No. 3 diluted to 1% (from a 10 ⁇ M solution) is applied topically to these samples for 24 h, the samples are subjected to an irradiation of 100 mJ / cm 2 , then the Peptide at the same dilution is reapplied for 24 h.
  • Irradiated but untreated skin samples serve as controls.
  • Skin samples are fixed with 4% formaldehyde and embedded in paraffin. Sections of 3 microns are made by microtome. Tissue staining is done by hematoxylin (which stains nuclei in blue-black) and eosin which is specific for staining of cytoplasm.
  • Sunburn cells are characterized by a round shape, a highly condensed nucleus and an eosinophilic (rosy) cytoplasm. The slides are then mounted in a suitable medium and observed under a microscope.
  • the peptide SEQ ID NO: 3 effectively protects irradiated skin from damage caused by UVB.
  • the peptide SEQ ID No. 3 decreases the number of sunburn cells and improves the structure of the skin.
  • Human skin samples are cultured at the air / liquid interface.
  • Peptide SEQ ID No. 3 diluted to 1% (from a 10 -4 M solution) is applied topically to these samples for 24 h
  • the samples are subjected to an irradiation of 100 mJ / cm 2 , then the peptide at the same dilution is reapplied for 24 h
  • Irradiated but untreated skin samples serve as a control Skin samples are fixed with 4% formaldehyde and embedded in the paraffin 3.
  • Tissue staining is made by hematoxylin (which stains the nuclei in blue-black) and eosin, which is specific for the cytoplasm staining. This staining makes it possible to highlight apoptotic cells called sunburn cells. cells are characterized by a round form a highly condensed nucleus and an eosinophilic cytoplasm (pink) . The slides are then mounted in a suitable medium and observed under a microscope.
  • SEQ ID NO: 3 peptide effectively protects irradiated skin from UVB damage by decreasing the number of sunburns cells and improving the structure of the skin.
  • a study of the cytoprotective effect of peptide SEQ ID No. 3 was performed by evaluating the damage caused at the DNA level. This test is performed using the comet or SCGE test for "Single CeIl Gel Electrophoresis"; Electro-microphoretic method that allows visualization and quantification of double and single strand breaks of DNA on individual cells.
  • the cells are trypsin and a cell suspension at 100,000 cells / ml is then carried out 500 ⁇ l of this suspension are mixed with a solution of low melting 0.75% agarose cooled to 42 ° C., 250 ⁇ l of the mixture is deposited on a microscope slide previously prepared (on which a thin layer of 1% agarose was deposited). After cooling the slides, the cells are lysed cold for 90 minutes and then the DNA is denatured in an alkaline buffer for 20 minutes. then s or electrophoresis (250 mA for 30 minutes) and evidenced by propidium iodide. The slides are then observed under an epifluorescence microscope.
  • the altered DNA stretches towards the anode in proportion to the number of breaks. A great damage of DNA will be observed in the form of a comet. The more the DNA is altered the longer the tail of the comet is large. On the contrary, a cell that has not been tampered with will be compacted, round; DNA will then be found mostly in the head of the comet.
  • the percentage of degradation of the DNA is carried out by an image analysis software which makes it possible to calculate the parameter of the "tail moment".
  • the "tail moment” represents the product of the length of the comet by the percentage of DNA of its distal part.
  • Peptide SEQ ID NO: 3 plays an important role in protecting the DNA of cutaneous cells subjected to UVB irradiation.
  • Sun protection cream The constituents of phase A and phase B are heated separately between 70 ° C. and
  • Phase B is emulsified in phase A with stirring.
  • Phase C is added at 45 ° C., increasing stirring.
  • Phase D is then added when the temperature is below 40 ° C. Cooling is continued up to 25 ° C. with vigorous stirring.

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Abstract

La présente invention se rapporte à des composés peptidiques de formule générale (I): R1-(AA)n- X1 -Ser - Thr - Pro - X2 - (AA)P - R2. En outre, la présente invention concerne, d'une part, une composition cosmétique ou pharmaceutique, comprenant au moins un peptide de formule générale (I), dans un milieu cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable et, d'autre part, son utilisation pour prévenir ou traiter les signes cutanés du vieillissement et protéger la peau contre les agressions dues aux rayonnements UV. L'invention porte enfin sur un procédé de traitement cosmétique destiné à prévenir et/ou à lutter contre signes cutanés du vieillissement et protéger la peau contre les agressions dues aux rayonnements UV.

Description

NOUVEAUX PEPTIDES ANTI-AGE ET COMPOSITION COSMETIQUE ET/OU PHARMACEUTIQUE LES CONTENANT
La présente invention se situe dans les domaines de la cosmétique et de la dermopharmacie. La présente invention se rapporte à des composés peptidiques de formule générale (I) suivante : Ri-(AA)n- Xi - Ser - Thr - Pro - X2 - (AA)P- R2,ainsi que leurs utilisations en cosmétique et/ou pharmaceutique afin de prévenir et corriger les effets du vieillissement et des agressions UV de la peau et des phanères.
La fonction première de l'épidémie, est de constituer une barrière entre l'environnement extérieur et le milieu intérieur. C'est la couche la plus externe de l'épiderme, le stratum corneum, qui assure cette fonction. Il est composé de kératinocytes au stade ultime de leur différenciation, les cornéocytes, scellés les uns aux autre par un épais ciment intercellulaire, à la fois souple et imperméable. Cette barrière physique qu'est la peau permet au corps humain de se protéger de nombreux types d'agressions. Ces agressions peuvent avoir diverses origines intrinsèques, telles que le vieillissement chronologique ou encore des modifications biochimiques qui ont lieu lors d'états de fatigue, de stress, de changements hormonaux comme lors de la grossesse.... D'autres agressions elles, ont une origine extrinsèque telle que la pollution, le soleil, les maladies.... En réponse à ces agressions, l'aspect de la peau est modifié et l'on voit apparaître alors des rides et ridules, des tâches d'hyper ou d'hypo- pigmentation, une sécheresse voire une déshydratation de la peau, un amincissement de l'épiderme, une élastose, des imperfections, des tâches de vieillesse.... Ces modifications sont dues à l'altération des fonctions de renouvellement cellulaire, de cohésion cellulaire, de synthèse de collagène, d'élastine et d'autres protéines et conduisent finalement à une diminution des qualités de barrière protectrice de la peau et à un aspect peu esthétique de celle-ci. Tous ces changements affectent non seulement la peau, mais également les phanères tels que les ongles et cheveux. Par exemple, les cheveux deviennent ternes, ou grisonnant, ou encore tombent de manière précoce...
Afin de remédier à ces inconvénients, de nombreuses compositions cosmétiques ont été proposées ces dernières années. Ces compositions incluaient l'utilisation, seul ou en combinaison, d'agents hydratants, apaisants, anti-inflammatoires, anti-radicaux libres, anti-séborrhéiques, cicatrisants, éclaircissants, kératolytiques... Cependant, aucune de ces compositions ne permet à l'heure actuelle, de prévenir ou de corriger les effets du vieillissement d'origine intrinsèque ou extrinsèque de la peau.
De manière surprenante, la Demanderesse a découvert que des composés peptidiques de formule générale suivante R1-(AA)n- X1 - Ser - Thr - Pro - X2 - (AA)P - R2i avaient un effet anti-vieillissement sur la peau par une action globale sur divers symptômes caractéristiques de ce dernier. Aucun document de l'art antérieur ne décrit de tels composés peptidiques afin d'obtenir un effet anti-vieillissement. En outre, ces composés peptidiques sont caractérisés par le fait qu'ils sont des agents activateurs du gène Clock impliqués dans la régulation du cycle circadien. Par conséquent, la présente invention a pour objet des composés peptidiques activateurs de Clock ainsi que leur utilisation dans des compositions cosmétiques et pharmaceutiques afin de prévenir ou corriger les signes dus au vieillissement et aux agressions UV de la peau et des phanères.
L'horloge circadienne est contrôlée par une boucle négative de régulation impliquant un ensemble de gènes, notamment les gènes Per-1 (Period), Clock (Circadian Locomotor Output Cycles Kaput) et BMAL-I (Brain and Muscle ARNt-like Protein).
Il a été démontré que le vieillissement s'accompagne d'une modification des rythmes biologiques, avec une diminution de l'amplitude et une tendance à l'avance de phase (Weinert D., Chronobiol. Int. 2000 ; 17 :261-83). En outre, il a été montré que l'horloge circadienne était altérée par ce même vieillissement.
Jusqu'à présent, dans l'art antérieur, de nombreuses applications ont déjà été proposées quant à l'utilisation des nucléotides et/ou de protéines issues des gènes Clock, Per-1 ou BMAL-I. On peut citer par exemple le brevet US 6 291 429 qui décrit l'utilisation du produit du gène Clock pour la resynchronisation du cycle du sommeil ou de processus physiologiques ou endocriniens, la resynchronisation du corps après un décalage horaire.... Cependant, aucun document de l'art antérieur ne décrit l'utilisation de peptides spécifiques activateurs de Clock pour prévenir ou corriger les signes du vieillissement ou encore les conséquences d'agressions UV. La présente invention a pour premier objet des composés peptidiques de formule (I) suivante :
R1-(AA)n- Xi -Ser - Thr - Pro - X2 - (AA)n- R2 Dans laquelle, Xi représente une thréonine, une serine, ou est égal à zéro,
X2 représente une isoleucine, une leucine, une valine, une alanine, une glycine, ou est égal à zéro,
AA représente un acide aminé quelconque à l'exception de la proline, ou un de ses dérivés, et n et p sont des nombres entiers compris entre 0 et 4, Ri représente la fonction aminé primaire de l'acide aminé N-terminal, libre ou substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi un groupement acétyle, un groupement benzoyle, un groupement tosyle ou un groupement benzyloxycarbonyle,
R2 représente le groupe hydroxyle de la fonction carboxyle de l'acide aminé C-terminal, substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi une chaîne alkyle de Ci à C2o, ou un groupement NH2, NHY ou NYY avec Y représentant une chaîne alkyle de Ci à C4, ladite séquence de formule générale (I) étant constituée de 3 à 13 résidus d'acides aminés, ladite séquence de formule générale (I) pouvant comprendre des substitutions des acides aminés Xi et X2 par d'autres acides aminés chimiquement équivalents.
La présente invention a pour second objet une composition cosmétique ou dermopharmaceutique comprenant des composés peptidiques de formule générale (I).
La présente invention a pour troisième objet l'utilisation d'une composition cosmétique ou dermopharmaceutique comprenant des composés peptidiques de formule générale (I).
Enfin, la présente invention a pour quatrième objet un procédé de traitement cosmétique à l'aide d'une composition comprenant des composés peptidiques de formule générale (I).
Le premier objet de l'invention se rapporte à un composé peptidique de formule générale (I) suivante : -A-
Dans laquelle,
R1-(AA)n- X1 -Ser - Thr - Pro - X2 - (AA)P - R2 Dans laquelle,
Xi représente une thréonine, une serine, ou est égal à zéro, X2 représente une isoleucine, une leucine, une valine, une alanine, une glycine, ou est égal à zéro,
AA représente un acide aminé quelconque à l'exception de la proline, ou un de ses dérivés, et n et p sont des nombres entiers compris entre 0 et 4,
Ri représente la fonction aminé primaire de l'acide aminé N-terminal, libre ou substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi un groupement acétyle, un groupement benzoyle, un groupement tosyle ou un groupement benzyloxycarbonyle,
R2 représente le groupe hydroxyle de la fonction carboxyle de l'acide aminé C-terminal, substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi une chaîne alkyle de Ci à C2o, ou un groupement NH2, NHY ou NYY avec Y représentant une chaîne alkyle de Ci à C4, ladite séquence de formule générale (I) étant constituée de 3 à 13 résidus d'acides aminés, ladite séquence de formule générale (I) pouvant comprendre des substitutions des acides aminés Xi et X2 par d'autres acides aminés chimiquement équivalents.
De façon à améliorer la résistance à la dégradation, il peut être nécessaire d'utiliser une forme protégée du peptide selon l'invention. La forme de protection doit évidemment être une forme biologiquement compatible et doit être compatible avec une utilisation dans le domaine des cosmétiques ou de la pharmacie. De nombreuses formes de protection biologiquement compatibles peuvent être envisagées. Elles sont bien connues de l'homme du métier comme, par exemple, l'acétylation des extrémités amino- terminales. Ou encore, on utilise, pour la protection de la fonction hydroxyle de l'extrémité carboxy-terminale, une amidation par un groupement NYY avec Y représentant une chaîne alkyle de Ci à C4, ou l'estérifïcation par un groupement alkyle. Il est également possible de protéger les deux extrémités du peptide. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le composé peptidique est protégé par une acétylation de l'extrémité amino-terminale. Préférentiellement, le composé peptidique présente l'une des séquences suivantes : (SEQ ID n°l) Tyr - Val - Ser - Thr - Pro - Tyr- Asn- NH2 (SEQ ID n°2) Val - Ser - Thr - Pro -Glu - NH2 (SEQ ID n°3) Ser - Thr - Pro - NH2 (SEQ ID n°4) Leu -His - Ser - Thr - Pro - NH2
(SEQ ID n°5) Arg -His - Ser - Thr - Pro -Glu - NH2 (SEQ ID n°6) His - Ser - Thr - Pro -Glu - NH2
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence du composé peptidique est la séquence SEQ ID n°3, c'est-à-dire Ser - Thr -Pro - NH2. Dans un autre mode de réalisation, la séquence du composé peptidique est la séquence SEQ ID n°4, c'est-à-dire Leu -His - Ser - Thr - Pro - NH2
Ainsi, l'invention concerne un composé peptidique tel que défini précédemment, caractérisé par le fait que le peptide de séquence SEQ ID n°l à SEQ ID n°6 est sous forme protégée de façon simple ou double. L'invention concerne aussi des formes homologues de ces séquences. Le terme « homologue » désigne, selon l'invention, toute séquence peptidique identique à au moins 50%, ou de préférence au moins 80%, et encore plus préférentiellement à au moins 90% de ladite séquence peptidique, choisie parmi les séquences SEQ ID n° 1 à SEQ ID n° 6. Par « séquence peptidique identique à au moins X% », on entend désigner un pourcentage d'identité entre les résidus d'acides aminés des deux séquences à comparer, obtenu après l'alignement optimal des deux séquences. L'alignement optimal est obtenu à l'aide d'algorithmes d'homologies locales tels que ceux utilisés par les logiciels informatiques BLAST P ou T BLAST N disponibles sur le site NCBI.
Le terme « homologue » peut également désigner un peptide qui diffère de la séquence d'un peptide de séquence SEQ ID n° 1 à SEQ ID n° 6 par la substitution d'acides aminés chimiquement équivalents, c'est-à-dire par la substitution d'un résidu par un autre possédant les mêmes caractéristiques. Ainsi, les substitutions classiques se font entre AIa, Val, Leu et Ile ; entre Ser et Thr ; entre les résidus acides Asp et Glu ; entre Asn et GIn ; et entre les résidus basiques Lys et Arg ; ou entre les résidus aromatiques Phe et Tyr. Le terme « peptide » désigne un enchaînement de deux ou plusieurs acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques ou par des liaisons peptidiques modifiées. Par « peptide », il faut entendre le peptide naturel ou synthétique de l'invention tel que décrit ci-dessus, ou au moins l'un de ses fragments, qu'il soit obtenu par protéolyse ou de manière synthétique, ou encore tout peptide naturel ou synthétique dont la séquence est totalement ou partiellement constituée par la séquence du peptide précédemment décrit. Le peptide de formule générale (I) selon l'invention peut être obtenu soit par synthèse chimique classique (en phase solide ou en phase homogène liquide), soit par synthèse enzymatique (Kullman et al., J. Biol. Chem. 1980, 225, 8234), à partir d'acides aminés constitutifs ou de leurs dérivés.
Le peptide selon l'invention peut être d'origine naturelle ou synthétique. Préférentiellement selon l'invention, le peptide est obtenu par synthèse chimique.
Enfin, le principe actif peut être un peptide unique, un mélange de peptides ou de dérivés peptidiques et/ou constitués de dérivés d'acides aminés.
Le composé peptidique selon l'invention peut être utilisé à titre de médicament.
Le second objet de la présente invention se rapporte à des compositions cosmétiques comprenant ledit composé peptidique de formule générale (I). De manière préférée, les compositions selon l'invention se présentent sous une forme adaptée à l'application par voie topique comprenant un milieu cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable. Par « cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable », on entend des milieux qui conviennent à une utilisation en contact avec la peau ou les phanères humains, sans risque de toxicité, d'incompatibilité, d'instabilité, de réponse allergique et autres. Préférentiellement, ledit composé peptidique est présent dans la composition à une concentration comprise entre 0,0005 et 500 ppm environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,01 et 5 ppm. Dans les compositions selon l'invention, le composé peptidique est préalablement solubilisé dans un ou plusieurs solvants cosmétiquement ou dermatologiquement acceptables, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, le principe actif selon l'invention est préalablement solubilisé dans un vecteur cosmétique ou pharmaceutique comme les liposomes ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites, et plus généralement solubilisé dans, ou fixé sur, tout vecteur physiologiquement acceptable.
Les compositions destinées à être appliquées sur la peau peuvent se présenter sous forme de solution aqueuse ou hydro- alcoolique, d'émulsion eau dans huile ou huile dans eau, de microémulsion, de gel aqueux ou anhydre, de sérum, ou encore de dispersion de vésicules, de patch, de crème, de spray, d'onguent, de pommade, de lotions, de colloïde, de solution, de suspension ou autres. Les compositions peuvent aussi être appliquées sur les phanères sous forme de shampoing, de teinture ou de mascara à appliquer au pinceau ou au peigne, en particulier sur les cils, les sourcils ou les cheveux, ou encore de soins pour les ongles tels que les vernis.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention contient en outre, au moins un autre principe actif favorisant l'action dudit principe actif peptidique. On peut citer, de manière non limitative, les classes d'ingrédients suivantes : d'autres agents actifs peptidiques, des extraits de végétaux, des agents cicatrisants, anti-âge, antirides, apaisants, anti-radicalaire, anti-UV, des agents stimulant la synthèse de macromolécules dermiques ou le métabolisme énergétique, des agents hydratants, antibactériens, anti-fongiques, anti-inflammatoires, anesthésiques, des agents modulants la différenciation, la pigmentation ou la dépigmentation cutanée, des agents stimulants la pousse des ongles ou des cheveux.... Préférentiellement, on utilisera un agent anti- radicalaire ou antioxydant, ou un agent stimulant la synthèse de macromolécules dermiques, ou encore un agent stimulant le métabolisme énergétique.
En outre, des additifs tels que des agents épaississants, émulsifiants, humectants, émollients, des parfums, des antioxydants, des agents filmogènes, chélatants, séquestrants, conditionnants.... peuvent être ajoutés à la composition.
Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre à 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
Un troisième objet de la présente invention se rapporte à l'utilisation du composé peptidique en tant que principe actif activateur de Clock. On entend par peptide « activateur de Clock», tout peptide ou dérivé biologiquement actif capable d'augmenter l'activité de Clock, soit par augmentation de la synthèse protéique de Clock (par modulation directe ou indirecte de l'expression génique de Clock) soit par d'autres processus biologiques tels que la stabilisation de la protéine Clock ou encore la stabilisation des transcrits d'ARN messager.
Un autre objet de la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une composition selon ladite invention pour prévenir ou traiter les signes cutanés du vieillissement. Les
« signes cutanés du vieillissement » incluent, mais ne se limitent pas à, toutes les manifestations visibles sur la peau causés par le vieillissement. On entend notamment, les rides, ridules, crevasses, pores élargis, imperfections, perte de fermeté, décoloration, tâches de vieillesse, kératoses, perte de collagène, et autres changements du derme et de l'épiderme....Par « signes cutanés du vieillissement », on entend également toutes modifications de l'aspect extérieur de la peau et des phanères dues au vieillissement comme, par exemple, les rugosités superficielles de la couche cornée, les rides et ridules, mais également toute modification interne de la peau qui ne se traduit pas systématiquement par un aspect extérieur modifié comme, par exemple, l'amincissement du derme ou toute autre dégradation interne de la peau consécutive à une exposition aux rayonnements ultraviolets (UV).
Un quatrième objet de la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une composition selon ladite invention pour la protection de la peau contre les agressions dues aux rayonnements UV. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une quantité efficace de principe actif peptidique selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à lutter contre les pathologies liées aux processus d'oxydation.
Un dernier objet de la présente invention se rapporte à un procédé de traitement cosmétique caractérisé en ce que l'on applique topiquement sur la peau ou les phanères à traiter une composition contenant une quantité efficace de principe actif peptidique pour prévenir ou traiter les signes cutanés du vieillissement ou protéger la peau contre les agressions dues aux rayonnements UV. Par ailleurs, ce procédé de traitement cosmétique est caractérisé en ce que la composition est appliquée avant le coucher de façon à respecter le rythme circadien de la peau pour obtenir un effet rajeunissant sur la peau. En effet, durant la nuit, la peau privilégie des fonctions de renouvellement ainsi que des processus métaboliques de synthèse. Par conséquent, l'application de la composition telle que revendiquée, en respectant le rythme biologique de la peau permet d'obtenir un effet rajeunissant, stimulant le renouvellement cellulaire, et régénérant.
Les exemples suivants décrivent et démontrent l'efficacité de composés peptidiques tels que décrits selon l'invention. Les formulations cosmétiques citées sont représentatives de l'invention mais sont données uniquement à titre d'illustration et ne doivent pas être interprétés comme des limitations de la présente invention.
Exemple 1 : Mise en évidence de l'effet activateur du peptide SEQ ID n°3 sur l'expression de la protéine Clock sur des fibroblastes en culture.
Une étude de l'effet activateur du peptide SEQ ID n°3, a été réalisée en évaluant l'expression des protéines Clock en western blot sur des fibroblastes en culture. La technique de western blot est une méthode semi-quantitative qui permet d'apprécier le taux de protéines Clock dans les cellules.
Protocole Des fibroblastes en cultures sont cultivés dans des boîtes de diamètres 100 mm à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2 pendant 18 h en présence ou non du peptide SEQ ID n°3, dilué 1% (à partir d'une solution 10"4M). Les cellules sont rincées puis détachées du support à l'aide d'un tampon d'extraction (2OmM TRIS, 15OmM NaCl, 1OmM EDTA, 0.2% Triton XlO) en présence d'un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Sigma). Les protéines ainsi extraites, sont centrifugées à 4°C à 10000 rpm pendant 10 minutes avant d'être dosées par le kit de dosages des protéines BCA (Pierce). Les .lysats cellulaires sont mélangés à un tampon de dénaturation et soumis à une électrophorèse SDS-PAGE. Le gel utilisé est un Nupage 4-12% (invitrogen). Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose (Pal corporation). Les membranes sont saturées dans du PBS-lait 5%, 0.1% tween 20 2 heures à température ambiante, puis incubées à 4°C toute la nuit avec un anticorps primaire anti-Clock au l/1000eme (ABcam) suivie d'une incubation avec un anticorps secondaire Iggy-peroxydase dilué au l/5000eme La révélation est effectuée par un substrat chimio- luminescent. L'évaluation quantitative des protéines présentes dans les cellules est effectuée grâce au logiciel chemiimager (Alpha innotech Corporation USA). La quantité des protéines est exprimée en pourcentage d'intensité lumineuse comparée à la condition contrôle qui n'a pas eu le traitement.
Résultats :
Les résultats obtenus montrent que le traitement par le peptide SEQ ID n°3, dilué 1% augmente de façon significative la protéine Clock dans les fibroblastes en culture. En effet les résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous.
Figure imgf000011_0001
L'expérience a été réalisée plusieurs fois et démontre par le test statistique du t Student que l'augmentation de l'expression de la protéine Clock est significative (p = 0,0445).
Conclusion :
Le peptide SEQ ID n°3 permet, d'augmenter l'expression de la protéine Clock sur des cellules dermiques en culture. Exemple 2 : Mise en évidence de l'effet activateur du peptide SEQ ID n°3 sur l'expression de la protéine Clock, sur des biopsies de peau au cours du vieillissement
Une étude de l'effet activateur du peptide SEQ ID n°3, a été réalisée en évaluant l'expression de la protéine Clock sur des modèles de peaux, vieillis artificiellement en culture. L'analyse s'est effectuée après 62 h et 134 h de culture.
Protocole
Des études ex vivo par immunomarquage ont permis de mettre en évidence l'expression de la protéine Clock, sur des échantillons de peau vieillis en culture. Des échantillons de peau humaine, sont mis en culture à l'interface air/liquide, pendant 62 h et 134 h. Le peptide SEQ ID n°l dilué à 1% (à partir d'une solution 10^M).est appliqué de façon topique sur ces échantillons à raison de 2 fois par jour pendant le temps de l'expérience.
Des échantillons de peau non traitées par le peptide SEQ ID n°3 servent de contrôle. Les échantillons de peaux sont fixés au formaldéhyde 10% et inclus dans la paraffine. Des coupes de 3μm sont réalisées au microtome. L' immunomarquage est effectué après un déparaffinage et un démasquage des sites antigéniques. L' immunomarquage s'effectue pour la protéine Clock, par un anticorps (ABcam) dilué au l/250ème et un anticorps secondaire au l/50eme couplé à un fluorochrome. Les lames sont alors montées dans un milieu adéquat et observé au microscope à épifluorescence (Nikon Eclipse E600).
Résultats :
Les résultats obtenus montrent que le marquage de la protéine Clock (essentiellement épidermique) est augmenté après 62 heures de culture, par rapport aux lames témoins non traités. Cette augmentation perdure dans le temps puisqu'au bout de 134 heures, le marquage de la protéine Clock est fortement augmenté par rapport aux peaux témoins non traitées. Le tableau ci-dessous donne une évaluation visuelle du marquage.
Figure imgf000012_0001
Conclusion :
L'application du composé peptidique SEQ ID n°3 permet d'augmenter l'expression de la protéine Clock sur des biopsies de peau traitées et vieillies artificiellement en culture.
Exemple 3 : Mise en évidence de l'effet anti-vieillissement du peptide SEQ ID n°3 sur des fibroblastes en culture.
Une étude de l'effet anti-vieillissement du peptide SEQ ID n°3, a été réalisée en évaluant l'expression de la protéine béta-galactosidase sur des fibroblastes en culture à effet court et long terme. En effet, l'activité de la béta-galactosidase est connue pour être présente dans les cellules sénescentes alors qu'on ne trouve pas d'activité béta- galactosidase dans les cellules pré-sénescentes, quiescentes ou immortelles.
Protocole
Des fibroblastes en cultures dans des labteck 8 puits sont maintenus 2 semaines (effet court terme) ou 7 semaines (effet long terme) en présence ou non du peptide SEQ ID n°3, dilué 1% (à partir d'une solution 10"4M). Le traitement est effectué une fois par jour. Les cellules non traitées mais maintenues en culture pendant 2 ou 7 semaines selon les besoins de l'expérience servent de contrôle. Le jour du marquage, les cellules sont rincées, fixées dans un mélange (2% glutaraldéhyde - 2% formaldéhyde) 3 minutes. Les cellules sont rincées et on applique 300μl de (5-bromo-4-chloro-3 indolyl b-D-galactosidase) appelé communément X-gal (substrat de la béta-galactosidase). L' incubation s'effectue 24 h dans l'incubateur à CO2, puis les cellules sont rincées et la labteck est rapidement montée dans un milieu adéquate. L'observation s'effectue au microscope à transmission. Le principe est simple, lorsque les cellules sont sénescentes et contiennent la béta-galactosidase, le substrat X-gal est clivé en un produit bleu insoluble.
Résultats :
L'activité béta-galactosidase est mesurée dans les cellules témoins non traitées par une coloration de celles-ci en bleues. L'activité béta-galactosidase est fortement réduite dans les cellules traitées par le peptide SEQ ID n°3. Cet effet est observé à la fois dans les cellules traitées à court terme (2 semaines d'expérience) mais également à long terme lorsque les cellules sont traitées pendant 7 semaines consécutives. Conclusion :
L'administration du peptide SEQ ID n°3 permet de mettre en évidence un effet antivieillissement sur des fibroblastes en culture vieillis artificiellement pendant 2 ou 7 semaines.
Exemple 4 : Mise en évidence de l'effet protecteur du peptide SEQ ID n°3 sur des biopsies de peau soumises à des rayonnements ultravioletsf UVB)
Une étude de l'effet protecteur du peptide SEQ ID n°3, a été réalisée en évaluant en immunohistologie, au moyen d'une coloration de coupes de peau, les dommages causés par les UVB.
Protocole
Des échantillons de peau humaine, sont mis en culture à l'interface air/liquide. Le peptide SEQ ID n°3 dilué à 1% (à partir d'une solution 10^M).est appliqué de façon topique sur ces échantillons pendant 24 h, les échantillons sont soumis à une irradiation de 100mJ/cm2, puis le peptide à la même dilution est appliqué de nouveau pendant 24 h. Des échantillons de peau irradiées mais non traitées servent de contrôle. Les échantillons de peaux sont fixés au formaldéhyde 4% et inclus dans la paraffine. Des coupes de 3 μm sont réalisées au microtome. Une coloration des tissus est faite par l'hématoxyline (qui colore les noyaux en bleu-noir) et l'éosine qui est spécifique de la coloration des cytoplasmes. Cette coloration permet de mettre en évidence des cellules apoptotiques appelées sunburn cells. Les sunburn cells sont caractérisées par une forme ronde, un noyau très condensé et un cytoplasme éosinophile (rosé). Les lames sont alors montées dans un milieu adéquat et observé au microscope.
Résultats :
Les résultats obtenus montrent que les peaux non traitées avec le peptide SEQ ID n°3 sont fortement endommagées, vacuolées et un grand nombre de sunburn cells sont détectées au niveau basai et supra- basai. Les peaux traitées avec le peptide SEQ ID n°3 ont une structure morphologique bien conservée, les dégâts dus aux UV sont peu visibles et seulement un petit nombre de sunburn cells sont observées. Conclusion :
Le peptide SEQ ID n°3 protège efficacement les peaux irradiées des dommages causés par les UVB. En particulier, le peptide SEQ ID n°3 diminue le nombre de sunburn cells et améliore la structure de la peau.
Exemple 5 : Mise en évidence de l'effet protecteur du peptide SEQ ID n°3 sur des biopsies de peau soumises à des rayonnements ultraviolets (UVB)
Une étude de l'effet protecteur du peptide SEQ ID n°3, a été réalisée en évaluant en immunohistologie, au moyen d'une coloration de coupes de peau, les dommages causés par les UVB.
Protocole
Des échantillons de peau humaine, sont mis en culture à l'interface air/liquide. Le peptide SEQ ID n°3 dilué à 1% (à partir d'une solution 10"4M). est appliqué de façon topique sur ces échantillons pendant 24 h. Les échantillons sont soumis à une irradiation de 100mJ/cm2, puis le peptide à la même dilution est appliqué de nouveau pendant 24 h. Des échantillons de peau irradiées mais non traitées servent de contrôle. Les échantillons de peaux sont fixés au formaldéhyde 4% et inclus dans la paraffine. Des coupes de 3μm sont réalisées au microtome. Une coloration des tissus est faite par l'hématoxyline (qui colore les noyaux en bleu-noir) et l'éosine qui est spécifique de la coloration des cytoplasmes. Cette coloration permet de mettre en évidence des cellules apoptotiques appelées sunburn cells. Les sunburns cells sont caractérisées par une forme ronde un noyau très condensé et un cytoplasme éosinophile (rose).Les lames sont alors montées dans un milieu adéquat et observé au microscope.
Résultats :
Les résultats obtenus montrent que les peaux non traitées avec le peptide SEQ ID n°3 sont fortement endommagées, les cellules sont vacuolées et un grand nombre de sunburn cells sont détectées au niveau basai et suprabasal. Les peaux traitées avec le peptide SEQ ID n°3 ont une structure morphologique bien conservée, les dégâts dus aux UVB sont peu visibles et seul un petit nombre de sunburn cells sont observées. Conclusion :
Le peptide SEQ ID n°3 protège efficacement les peaux irradiées des dommages causés par les UVB, en diminuant le nombre de sunburns cells et en améliorant la structure de la peau.
Exemple 6 : Evaluation de l'effet cytoprotecteur du peptide SEQ ID n°3 sur les cellules cutanées soumises à des rayonnements ultraviolets (UVB)
Une étude de l'effet cytoprotecteur du peptide SEQ ID n°3, a été réalisée en évaluant les dommages provoqués au niveau de l'ADN. Ce test est réalisé au moyen du test des comètes ou SCGE pour « Single CeIl Gel Electrophoresis » ; méthode électro- microphorétique qui permet de visualiser et quantifier les cassures doubles et simples brins de l'ADN sur des cellules individuelles.
Protocole : Des fïbroblastes humains normaux en culture sont ensemencés dans des boîtes de diamètres 100. Lorsque les cellules ont atteint 70% de confluence, les cellules sont traitées 24 h avec le peptide SEQ ID n°3 dilué à 1% (à partir d'une solution 10"4M). Les cellules sont soumises à l'irradiation UVB à 60mj/cm2, puis remise 24 h en présence du peptide. Des boites contrôles non traitées par l'actif mais irradiées servent de témoins. Les cellules sont trypsinées et une suspension cellulaire à 100 000 cellules/ml est ensuite réalisée. 500 μl de cette suspension sont mélangés à une solution de low melting agarose 0,75% refroidi à 42°C, 250 μl du mélange est déposée sur une lame de microscope préalablement préparée (sur laquelle une fine couche d'agarose 1% a été déposée). Après refroidissement des lames, les cellules sont lysées à froid pendant 90 minutes puis l'ADN est dénaturé dans un tampon alcalin pendant 20 minutes. L'ADN est alors soumis à une électrophorèse (250 mA pendant 30minutes) et mis en évidence par l'iodure de propidium. Les lames sont ensuite observées au microscope à épifluorescence.
L'ADN altéré, s'étire vers l'anode proportionnellement aux nombres de cassures. Un grand dommage d'ADN s'observera sous forme d'une comète. Plus l'ADN est altéré plus la queue de la comète est grande. Au contraire, une cellule qui n'aura pas subi d'altération se retrouvera compactée, ronde ; l'ADN se retrouvera alors en majorité dans la tête de la comète.
Le pourcentage de dégradation de l'ADN s'effectue par un logiciel analyseur d'image qui permet de calculer le paramètre du « tail moment ». Le « tail moment » représente le produit de la longueur de la comète par le pourcentage d'ADN de sa partie distale.
Résultats :
Le tableau ci-dessous résume les résultats obtenus « des tails moment » mesurés sur des fïbroblastes irradiées et traités avec le peptide SEQ ID n°3 ou non traités (fibroblastes contrôles).
Figure imgf000017_0001
Les résultats obtenus montrent que les cellules soumises à une irradiation UVB, en l'absence du peptide SEQ ID n°3 (contrôle) présente un Tail Moment important, traduisant d'importants dommages de l'ADN. Au contraire, dans les cellules irradiées et traitées par le peptide SEQ ID n°3 on enregistre un Tail moment plus petit. On constate une amélioration de 40%, c'est à dire que les dommages de l'ADN sont diminués de 40% (résultat significatif par mesure statistique faite au moyen du test de t Student).
Conclusion :
Le peptide SEQ ID n°3 joue un rôle important dans la protection de l'ADN des cellules cutanées soumises à une irradiation UVB.
Exemple 7 : Préparation d'une composition
Crème de protection solaire:
Figure imgf000018_0001
Les constituants de la phase A et de la phase B sont chauffés séparément entre 700C et
75°C. La phase B est émulsionnée dans la phase A sous agitation. La phase C est ajoutée, à 450C, en augmentant l'agitation. La phase D est ensuite additionnée lorsque la température se situe en dessous de 400C. Le refroidissement est poursuivi jusqu'à 25°C sous vive agitation.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé peptidique de formule générale suivante (I) :
Ri-(AA)n- Xi -Ser - Thr - Pro - X2 - (AA)P - R2 Dans laquelle,
Xi représente une thréonine, une serine, ou est égal à zéro,
X2 représente une isoleucine, une leucine, une valine, une alanine, une glycine, ou est égal à zéro,
AA représente un acide aminé quelconque à l'exception de la proline, ou un de ses dérivés, et n et p sont des nombres entiers compris entre 0 et 4,
Ri représente la fonction aminé primaire de l'acide aminé N-terminal, libre ou substituée par un groupement protecte ur pouvant être choisi parmi un groupement acétyle, un groupement benzoyle, un groupement tosyle ou un groupement benzyloxycarbonyle, R2 représente le groupe hydroxyle de la fonction carboxyle de l'acide aminé C-terminal, substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi une chaîne alkyle de Ci à C20, ou un groupement NH2, NHY ou NYY avec Y représentant une chaîne alkyle de Ci à C4, ladite séquence de formule générale (I) étant constituée de 3 à 13 résidus d'acides aminés, ladite séquence de formule générale (I) pouvant comprendre des substitutions des acides aminés Xi et X2 par d'autres acides aminés chimiquement équivalents.
2. Composé peptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est protégé par une acétylation de l'extrémité amino-terminale.
3. Composé peptidique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il correspond à une des formules suivantes :
(SEQ ID n° 1) Tyr - Val - Ser - Thr - Pro - Tyr- Asn- NH2
(SEQ ID n°2) Val - Ser - Thr - Pro -Glu - NH2
(SEQ ID n°3) Ser - Thr - Pro - NH2 (SEQ ID n°4) Leu -His - Ser - Thr - Pro - NH2
(SEQ ID n°5) Arg -His - Ser - Thr - Pro -Glu - NH2
(SEQ ID n°6) His - Ser - Thr - Pro -Glu - NH2
4. Composé peptidique selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il est utilisé à titre de médicament.
5. Composition cosmétique comprenant à titre de principe actif ledit composé peptidique selon l'une des revendications 1 à 3.
6. Composition cosmétique selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme adaptée à l'application par voie topique comprenant un milieu cosmétiquement acceptable.
7. Composition selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que ledit composé peptidique est présent dans la composition à une concentration comprise entre 0,0005 et 500 ppm environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,01 et 5 ppm.
8. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que ledit composé peptidique est solubilisé dans un ou plusieurs solvants, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisée en ce qu'elle contient en outre, au moins un autre principe actif favorisant l'action dudit principe actif peptidique.
10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit principe actif est un agent anti-radicalaire ou antioxydant, ou un agent stimulant la synthèse de macromolécules dermiques, ou encore un agent stimulant le métabolisme énergétique.
11. Utilisation d'un composé peptidique tel que défini dans l'une des revendications 1 à 3, en tant que principe actif activateur de Clock.
12. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisée en ce que ladite composition permet de prévenir ou de traiter les signes cutanés du vieillissement.
13. Utilisation d'une composition selon la revendication précédente, caractérisée en ce que ladite composition permet de protéger la peau contre les agressions dues aux rayonnements UV.
14. Utilisation d'une quantité efficace d'un composé peptidique tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à lutter contre les pathologies liées aux processus d'oxydation.
15. Procédé de traitement cosmétique caractérisé en ce que l'on applique topiquement sur la peau ou les phanères à traiter une composition contenant une quantité efficace d'un composé peptidique, tel que défini dans l'une des revendications 1 à 3, pour prévenir ou traiter les signes cutanés du vieillissement ou protéger la peau contre les agressions dues aux rayonnements UV.
16. Procédé de traitement cosmétique tel que défini dans la revendication précédente, caractérisé en ce que la composition est appliquée avant le coucher de façon à respecter le rythme circadien de la peau pour obtenir un effet rajeunissant sur la peau.
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