WO2010112696A1 - Bactéries capables de dégrader des composés pétroliers multiples en solution dans des effluents aqueux et procédé de traitement desdits effluents. - Google Patents

Bactéries capables de dégrader des composés pétroliers multiples en solution dans des effluents aqueux et procédé de traitement desdits effluents. Download PDF

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WO2010112696A1
WO2010112696A1 PCT/FR2010/000259 FR2010000259W WO2010112696A1 WO 2010112696 A1 WO2010112696 A1 WO 2010112696A1 FR 2010000259 W FR2010000259 W FR 2010000259W WO 2010112696 A1 WO2010112696 A1 WO 2010112696A1
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WO
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cncm
mixture
bacteria
rhodococcus
bacterium
Prior art date
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PCT/FR2010/000259
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Marc Auffret
Françoise FAYOLLE-GUICHARD
Gérald THOUAND
Charles W. Greer
Diane Labbe
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IFP Energies Nouvelles
Conseil National De Recherche Du Canada
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to microorganisms capable of degrading complex hydrocarbon mixtures in solution in water.
  • methyl-tert-butyl ether (hereinafter referred to as MTBE) is one of the ethers that can be used as an oxygenated additive in unleaded gasolines in the to increase their octane number as well as ethyl / f-butyl ether (hereinafter referred to as ETBE) which is preferably used for several years in France and also in other countries. Because of its qualification as a biofuel.
  • 2-ethylhexyl nitrate (hereinafter referred to as 2-EHN) may be added which can be added to the gas oil at a rate of 0.5% (v / v) to fulfill cetane number specifications. .
  • Benzene for example, which is one of the monoaromatic compounds of gasolines, is a very toxic compound but easily degraded under aerobic conditions.
  • isooctane 2,2,4-trimethylpentane
  • cyclohexane 2,2,4-trimethylpentane
  • the present invention relates to two strains of bacteria isolated from a bacterial microcosm and showing significant biodegradation capabilities of a complex mixture of hydrocarbons dissolved in water.
  • the present invention relates to a process for the treatment of aqueous effluents comprising a complex mixture of substances containing native hydrocarbons of gasolines and additives present in the gasolines or gas oil in which at least one bacterium chosen from aerobic conditions is grown under aerobic conditions.
  • Rhodococcus wratislaviensis bacteria CNCM 1-4088, and Rhodococcus aetherivorans are examples of bacterium chosen from aerobic conditions.
  • CNCM 1-4089 in the presence of a growth substrate containing said mixture as carbon source and at least part of said mixture is degraded by the bacterium to the ultimate degradation products, carbon dioxide, water and the biomass.
  • the invention also relates to the new bacteria Rhodococcus wratislaviensis 1-4088, and Rhodococcus aetherivorans 1-4089, deposited at the Institut Pasteur on 20/11/2008. (CNCM of the Pasteur Institute, 25, rue du Dondel Roux, F-75724 PARIS CEDEX 15).
  • the complex mixture of substances containing native hydrocarbons of gasolines and additives present in petrol or diesel is a mixture of 16 different equimassic compounds. It comprises especially compounds selected from alkanes, monoaromatic hydrocarbons, polycyclic aromatic hydrocarbons, ethers or nitrates.
  • the mixture comprises the following 16 compounds: octane, hexadecane, benzene, ethylbenzene, toluene, m-xylene, p-xylene, o-xylene, cyclohexanol , tert-butanol (hereinafter referred to as TBA), cyclohexane, isooctane, MTBE, I 1 ETBE, 2-ethylhexyl nitrate (hereinafter referred to as 2-EHN) and naphthalene.
  • TBA octane
  • hexadecane benzene
  • ethylbenzene toluene
  • m-xylene p-xylene
  • o-xylene cyclohexanol
  • tert-butanol tert-butanol
  • cyclohexane isooctane
  • the two bacteria Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088, or Rhodococcus aetherivorans CNCM 1-4089 are grown under aerobic conditions in the presence of a growth substrate containing said mixture. as a carbon source and at least partially degrades said mixture by the bacteria to the ultimate degradation products, carbon dioxide, water and biomass.
  • Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088 The two bacteria Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088, and Rhodococcus aetherivorans CNCM 1-4089 were tested alone or in co-culture for their ability to degrade the mixture of the 16 compounds described above.
  • Rhodococcus wratislaviensis CNCM I-4088 When Rhodococcus wratislaviensis CNCM I-4088 is supplied with the above compounds in a mixture, the bacterium has been shown to be able to completely degrade 11 of the above compounds.
  • Isooctane is degraded only slightly (26.3% degradation capacity).
  • TBA is not degraded by this bacteria.
  • the bacterium produces TBA which is added to that provided in the mixture because it is not degraded by this bacterium and accumulates in the growth medium. .
  • the degradation capacities of Rhodococcus aethevorans CNCM 1-4089 are more restricted but, nevertheless, remain interesting. This bacterium completely degrades two of the compounds: hexadecane and, in particular, ETBE. It partially degrades with a degradation capacity of less than 50%, ethylbenzene, MTBE and 2-EHN. The other compounds are not degraded.
  • the bacterium produces TBA during the degradation of I 1 ETBE and MTBE which is added to that provided in the mixture.
  • a consortium containing the three bacteria Rhodococcus wratislaviensis CNCM I-4088, Rhodococcus aetherivorans CNCM I-4089 and Aquincola tertiaricarbonis CNCM I-2052 is grown under aerobic conditions in the presence of a growth substrate containing said mixture as a carbon source and said mixture is partially degraded by the bacteria to the ultimate degradation products, carbon dioxide, water and biomass.
  • the initial composition of the mixture of bacteria is such that an equivalent quantity of each of the bacteria is placed in the medium.
  • the mixture of 16 compounds is degraded in its entirety, with the exception of the only partially degraded isooctane.
  • the implementation of such a consortium for the depollution of effluents contaminated by hydrocarbons of various natures is advantageous because each of the elements of the consortium is well identified which makes it possible to ensure the stability of the consortium during the process of depollution and also to follow its evolution.
  • Another object of the present invention is the new bacteria Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088, and Rhodococcus aetherivorans CNCM 1-4089.
  • HMN 2,2,4,4,6,88-heptamethylnonane
  • these bacteria for the continuous treatment of effluents polluted by hydrocarbons and their additives can be achieved, for example by developing the bacterium or consortium of bacteria on a mineral or organic support in a biofilter system or biobarrier of adequate volume, by introducing effluents to be treated in the presence of air or oxygen in the biofilter or biobarrier and by withdrawing the effluent with a reduced concentration of chemical substances.
  • the bacterium or consortium of bacteria can be added as an inoculum in any other system suitable for water and soil treatment (biobarrier), and in particular for sewage sludge.
  • biobarrier water and soil treatment
  • sewage sludge sewage sludge
  • EXAMPLE 1 Degradation of a mixture of hydrocarbons and gasoline or gas oil additives by a bacterial microcosm originating from the environment.
  • a microcosm is formed by mixing different samples from the environment to obtain maximum degradation capabilities.
  • the microcosm was constituted by the mixing of samples from 4 different origins (Table 1).
  • Each sample is filtered with a 0.22 ⁇ m filter in order to keep as much as possible of the microorganisms and to remove additional substrates that would disrupt the results of the biodegradation test.
  • the microcosm resulting from the mixing of these 4 filtered samples constitutes the bacterial inoculum which was cultured in MM medium (150 mL) in a 500 mL Schott flask.
  • the MM medium has the following composition:
  • the concentrated solution of vitamins has the following composition for 1 liter of distilled water:
  • the concentrated solution of trace elements has the following composition for 1 liter of distilled water: -CuSO 4 , 5H 2 0 0.1 g
  • the final pH of the medium is 6.8.
  • the supplied carbon source consists of a mixture of hydrocarbons and gasoline or gas oil additives at the rate of 23 ⁇ L of the stock mixture mixture described in Table 2.
  • the final concentrations of these materials are: Compounds in contact with water of a "type 7000" gasoline at the pump outlet obtained are generally well below the concentrations used in the biodegradation test. The only cases where the concentration is higher are those of alcohols (TBA and cyclohexanol) and ethers (MTBE and ETBE), these compounds being very soluble in water.
  • Table 2 Composition of the mixture of 16 compounds that constitute the carbon source.
  • a sample of this culture is spread in dilution on plates of rich medium TS agar (Tripticase / Soy). The dishes are incubated at 30 ° C. After growth, the individualized colonies are taken up and isolated on an identical solid medium.
  • Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088 and Rhodococcus aetherivorans CNCM 1-4089 were chosen to determine the capacities of each of these two strains, Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088 and Rhodococcus aetherivorans CNCM 1-4089, towards the 16 compounds individually.
  • the addition of substrate was carried out after dissolution of the substrate in a third solvent (2,2,4,4,6,8,8-heptamethylnonane or HMN), this allowing both to promote the solubilization of the compound in the growth medium and decrease its toxicity to microorganisms.
  • HMN a third solvent
  • the amount of substrate (5 .mu.L) is introduced into 0.5 mL of HMN. Cases where this procedure has been followed are shown directly in Table 4.
  • Degradation tests they are carried out under conditions similar to what is described in the mineralization test.
  • the test witnesses are constituted by a series of vials under the same conditions containing each substrate but not seeded.
  • the residual substrates are measured: either directly from a sample of the aqueous phase in the case of very soluble substrates (the case of MTBE, ETBE of I 1, TBA and cyclohexanol).
  • This assay is performed by CPG / FID equipped with a CP Porabond (Varian) column. or after extraction with pentane containing 1, 1, 2-TCA as internal standard. The pentane after extraction of the residual substrates is injected in CPG / FID on a PONA column.
  • the degradation is not complete whereas it was when the strain was tested on the compounds supplied in a mixture (for example,
  • Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088 tested on benzene It must therefore be taken into account that the concentrations are different in these two experiments: when the benzene is tested individually, it is added to a final concentration of 220 mg.l '1 whereas in the mixture of compounds, it is provided at 7.2 mg.L -1 (see Table 2).
  • Aquincola tertiaricarbonis CNCM I-2052 was previously isolated for its ability to degrade TBA. It was therefore interesting to test it in combination with the two strains Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088 and Rhodococcus a ⁇ therivorans CNCM 1-4089 in order to degrade the TBA which is not consumed by these two strains but on the contrary produced during the degradation.
  • MTBE and I 1 ETBE Pre-cultures of Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088, Rhodococcus aetherivorans CNCM 1-4089 and Aquincola tertiaricarbonis CNCM 1-2052 are carried out in TS medium.
  • Example 2 After centrifugation and washing as described in Example 2, a co-culture containing the 3 strains is prepared and then tested for its ability to degrade the mixture of the 16 compounds under the conditions described in Example 1.
  • the biomass is introduced into the experiments relating to the mixture of the three strains, there is a suspension containing each strain at the same cell concentration and seeded flasks with this mixture so as to also obtain a D0 6 oo of 0.5.
  • the residual substrates After 4 weeks of incubation at 30 ° C., the residual substrates are assayed as previously described and the results are shown in Table 6.

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Abstract

La présente invention porte sur de nouvelles bactéries Rhodococcus wratislaviensis CNCM I-4088, ou Rhodococcus aetherivorans CNCM I-4089 capables de dégrader des composés pétroliers multiples en solution dans des effluents aqueux. L'invention porte également sur un procédé de traitement d'effluents aqueux comprenant un mélange complexe de substances contenant des hydrocarbures natifs des essences et des additifs présents dans les essences ou le gazole dans lequel on fait croître en conditions aérobies lesdites bactéries en présence d'un substrat de croissance contenant ledit mélange comme source de carbone et on fait dégrader au moins en partie ledit mélange par la bactérie jusqu'aux produits ultimes de dégradation, le dioxyde de carbone, l'eau et la biomasse.

Description

BACTÉRIES CAPABLES DE EÉGRADER DES COMPOSÉS PÉTROLIERS MULTIPLES EN SOLUTION DANS DES EFFLUENTS AQUEUX ET PROCÉDÉDE TRAITEMENT DESDITS EFFLUENTS
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne des microorganismes capables de dégrader des mélanges complexes d'hydrocarbures en solution dans l'eau.
Elle s'applique particulièrement à l'industrie du traitement de l'eau principalement mais également des sols et déchets pollués par ces composés.
EXAMEN DE L1ART ANTERIEUR
II est connu que les essences et les gazoles sont des mélanges complexes de composés chimiques différents.- De plus, certains composés sont ajoutés aux essences et au gazole en sortie de raffinage afin de répondre à des spécifications particulières des motoristes. C'est notamment le cas des additifs oxygénés ou éthers-carburants : le méthyl-ferf-butyl éther (désigné ci-après sous le terme de MTBE) est un des éthers qui peut être utilisé comme additif oxygéné dans les essences sans plomb dans le but d'augmenter leur indice d'octane ainsi que l'éthyl- te/f-butyl éther (désigné ci-après sous le terme d'ETBE) qui est préférentiellement utilisé depuis plusieurs années en France et aussi dans d'autres pays d'Europe du fait de sa qualification en tant que biocarburant. Ces composés peuvent être ajoutés aux essences à raison de 15% (v/v). D'autres molécules sont souvent ajoutées au gazole. On citera par exemple le 2-éthyl hexylnitrate (désigné ci-après sous le terme de 2-EHN) qui peut être ajouté au gazole à raison de 0,5% (v/v) pour remplir les spécifications concernant l'indice de cétane.
Le transport d'hydrocarbures, par voie terrestre ou maritime, présente de nombreux risques d'accidents. Le transport terrestre par pipe-lines qui est généralement considéré comme plus sûr que par camion, train ou tanker peut néanmoins induire des pollutions. Il a été estimé que la quantité d'hydrocarbures répandus au cours du transport par les pipe-lines souterrains se situait autour de 60 m3/1000 km de pipe (Académie des Sciences, 2000). Par ailleurs, les pollutions terrestres par les hydrocarbures sont dues à des accidents de camions ou de trains pendant le transport, des accidents durant le remplissage des cuves de stations-service, des fuites sur des cuves de stockage dans des stations-service ou sur des sites industriels. En plus de ces sources majeures de pollution par hydrocarbures, il existe une pollution chronique se produisant durant le remplissage des réservoirs des véhicules dans les stations-service ou due à des fuites sur les réservoirs des véhicules. Dans ces deux derniers cas, cette décharge vers les eaux terrestres représente de faibles quantités mais de façon chronique et a également un impact important.
Parmi les composés des essences, tous n'ont pas la même toxicité et/ou biodégradabilité et ceci va déterminer leur devenir dans l'environnement. Le benzène, par exemple, qui est un des composés monoaromatiques des essences, est un composé très toxique mais facilement dégradé en aérobiose. Parmi les composés natifs des essences qui sont récalcitrants à la biodégradation, on peut citer Ie 2,2,4-triméthylpentane (désigné ci-après sous le terme d'isooctane) ou le cyclohexane, dont les niveaux de toxicité sont moindres que ceux du benzène.
Par ailleurs, l'utilisation croissante d'additifs comme le MTBE, l'ETBE ou le 2-EHN entraîne des volumes importants stockés et transportés, seuls ou en mélange dans les essences ou le gazole. La mauvaise biodégradabilité de ces additifs est un fait avéré. Il est donc nécessaire de connaître le devenir de ces composés en cas de déversement accidentel du produit lui-même ou d'essences ou gazole additivés car ces décharges dans l'environnement conduisent à une pollution des sols et des eaux souterraines ou de surface.
La littérature relative à la biodégradation des composés des essences ou des alcanes par les microorganismes est importante (Microbiologie pétrolière par JP Vandecasteele, 2005 Editions Technip). En revanche, moins d'études sont consacrées aux additifs (MTBE, ETBE, 2-EHN) principalement à cause de la récalcitrance de ces molécules à la biodégradation ou à l'étude de la biodégradation des mélanges complexes qui se retrouvent dissous dans l'eau dans les cas de déversements d'hydrocarbures, et en raison de la difficulté de l'analyse de mélanges complexes. Dans ces cas, il est souvent rapporté dans la littérature la mise en oeuvre de microcosmes dont la composition n'est généralement pas connue et sans doute pas figée par des procédés de bio-épuration (biofiltres, etc.).
Peu de publications ont étudié de façon large les capacités de dégradation d'une souche bactérienne donnée vis-à-vis d'un éventail large d'hydrocarbures ou d'additifs qui lui sont fournis seuls ou en mélange. On peut citer par exemple la publication Solano-Serena et al., 2000, Applied and Environmental Microbiology, 66: 2392-2399 qui décrit les capacités de la souche bactérienne Mycobacterium austroafricanum entre autres à dégrader l'isooctane. Les données sur les capacités de microorganismes isolés de dégrader un large éventail d'hydrocarbures ne sont généralement pas disponibles.
II apparaît donc nécessaire de trouver et d'identifier de nouveaux microorganismes capables de biodégrader les mélanges complexes de substances contenant des hydrocarbures natifs et dés additifs (comme par exemple MTBE1 ETBE, 2-EHN) qui peuvent atteindre les nappes aquifères dans les cas de pollution et d'étudier leur mise en œuvre dans des procédés de traitement de l'eau permettant d'abaisser significativement les concentrations résiduelles en polluants, décrits ci-dessus, d'eaux résiduaires urbaines ou industrielles ou de nappes aquifères contaminées, désignées sous le nom général d'effluents, contaminées par ces composés.
C'est dans ce cadre que s'inscrit la présente invention.
PRESENTATION SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention porte sur deux souches de bactéries isolées à partir d'un microcosme bactérien et montrant des capacités de biodégradation importantes d'un mélange complexe d'hydrocarbures en solution dans l'eau.
Un procédé de traitement d'effluents aqueux contenant au moins un mélange complexe d'hydrocarbures dans lequel on fait croître les. deux souches de bactéries est également décrit.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention porte sur un procédé de traitement d'effluents aqueux comprenant un mélange complexe de substances contenant des hydrocarbures natifs des essences et des additifs présents dans les essences ou le gazole dans lequel on fait croître en conditions aérobies au moins une bactérie choisie parmi les bactéries Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088, et Rhodococcus aetherivorans
CNCM 1-4089, en présence d'un substrat de croissance contenant ledit mélange comme source de carbone et on fait dégrader au moins en partie ledit mélange par la bactérie jusqu'aux produits ultimes de dégradation, le dioxyde de carbone, l'eau et la biomasse. L'invention porte également sur les nouvelles bactéries Rhodococcus wratislaviensis 1-4088, et Rhodococcus aetherivorans 1-4089, déposées à l'Institut Pasteur le 20/11/2008. (CNCM de l'Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS CEDEX 15).
Le mélange complexe de substances contenant des hydrocarbures natifs des essences et des additifs présents dans les essences ou le gazole est un mélange de 16 composés différents à concentration équimassique. Il comprend notamment des composés choisis parmi les alcanes, les hydrocarbures monoaromatiques, les hydrocarbures aromatiques polycycliques, les éthers ou les nitrates.
De façon préférée, le mélange comprend les 16 composés suivants : de l'octane, de l'hexadécane, du benzène, de l'éthylbenzène, du toluène, du m-xylène, du p-xylène, du o-xylène, du cyclohexanol, du ferf-butanol (désigné ci-après sous le terme TBA), du cyclohexane, de l'isooctane, du MTBE, de I1ETBE, du 2-éthylhexyl nitrate (désigné ci-après sous le terme de 2-EHN) et du naphtalène.
Selon un mode de réalisation préféré du procédé de traitement selon l'invention, on fait croître en conditions aérobies les deux bactéries Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088, ou Rhodococcus aetherivorans CNCM 1-4089, en présence d'un substrat de croissance contenant ledit mélange comme source de carbone et on fait dégrader au moins en partie ledit mélange par les bactéries jusqu'aux produits ultimes de dégradation, le dioxyde de carbone, l'eau et la biomasse.
Les deux bactéries Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088, et Rhodococcus aetherivorans CNCM 1-4089 ont été testées seules ou en co-culture pour leurs capacités de dégradation du mélange des 16 composés décrits ci-dessus.
Lorsqu'on fournit à Rhodococcus wratislaviensis CNCM I-4088 les composés ci- dessus en mélange, la bactérie s'est avérée capable de dégrader totalement 11 des
16 composés présents. Trois autres composés, le MTBE, le 2-EHN et l'ETBE, sont dégradés de façon importante (capacité de dégradation supérieure à 50 %).
L'isooctane n'est dégradé que faiblement (capacité de dégradation de 26,3%). Le
TBA n'est pas dégradé par cette bactérie. De plus, lors de la dégradation de I1ETBE et du MTBE, la bactérie produit du TBA qui vient s'ajouter à celui fournit dans le mélange car il n'est pas dégradé par cette bactérie et s'accumule dans le milieu de croissance. Ce fait est bien connu de l'homme de l'art. Les capacités de dégradation de Rhodococcus aetheήvorans CNCM 1-4089 sont plus restreintes mais, néanmoins, restent intéressantes. Cette bactérie dégrade totalement deux des composés : l'hexadécane et, notamment, l'ETBE. Elle dégrade partiellement avec une capacité de dégradation inférieure à 50%, l'éthylbenzène, le MTBE et le 2-EHN. Les autres composés ne sont pas dégradés. Comme dans le cas de Rhodococcus. wratislaviensis CNCM 1-4088, la bactérie produit du TBA lors de la dégradation de I1ETBE et du MTBE qui vient s'ajouter à celui fournit dans le mélange.
On peut associer avantageusement ces deux bactéries pour constituer une co- culture dont la composition initiale est déterminée par l'opérateur, ce qui rend plus facile son contrôle et son suivi. Dans ce cas, 13 composés sur les 16 du mélange sont dégradés totalement, le 2-EHN est dégradé de façon importante (capacité de dégradation supérieure à 50 %) et l'isooctane plus faiblement (capacité de dégradation inférieure à 50%). Dans ce cas, le TBA s'accumule dans le milieu comme décrit dans le cas des souches seules.
En raison de l'absence de capacités de dégradation du TBA dans les deux bactéries, il est très intéressant de compléter le consortium bactérien en y ajoutant une troisième bactérie précédemment décrites par la Demanderesse pour sa capacité à pousser sur TBA. Cette bactérie, précédemment nommée Pseudomonas cepacia CNCM 1-2052 et qui a fait l'objet d'un précédent brevet EP-B-1 099 753, a été récemment renommée Aquincola tertiaricarbonis CNCM I-2052 à la suite de changement dans la classification des microorganismes.
De façon très préférée, dans le procédé de traitement selon l'invention, on fait croître en conditions aérobies un consortium contenant les trois bactéries Rhodococcus wratislaviensis CNCM I-4088, Rhodococcus aetherivorans CNCM I-4089 et Aquincola tertiaricarbonis CNCM I-2052 en présence d'un substrat de croissance contenant ledit mélange comme source de carbone et on fait dégrader au moips en partie ledit mélange par les bactéries jusqu'aux produits ultimes de dégradation, le dioxyde de carbone, l'eau et la biomasse.
Dans les cas des co-cultures, la composition initiale du mélange de bactéries est telle que l'on met une quantité équivalente de chacune des bactéries dans le milieu.
Ainsi, selon ce dernier mode de réalisation, le mélange de 16 composés est dégradé dans sa totalité, exception faite de l'isooctane seulement partiellement dégradé. La mise en oeuvre d'un tel consortium pour la dépollution d'effluents contaminés par des hydrocarbures de natures diverses est avantageuse car chacun des éléments du consortium est bien identifié ce qui permet d'assurer la stabilité du consortium au cours du processus de dépollution et également de suivre son évolution.
Un autre objet de la présente invention est les nouvelles bactéries Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088, et Rhodococcus aetherivorans CNCM 1-4089.
Ces bactéries ont été isolées à partir d'un microcosme provenant de différents environnements qui a été repiqué successivement à trois reprises sur un milieu minimum contenant le mélange des 16 composés décrits ci-dessus comme source de carbone. Ce protocole a été réalisé selon les techniques d'enrichissement en microorganismes bien connues de l'homme du métier.
Les deux souches bactériennes résultantes ont été isolées après ces étapes d'enrichissement spécifique sur des boîtes de pétri contenant du milieu riche classiquement utilisé par l'homme de l'art (milieu Trypticase/Soja ou encore appelé
TS en abrégé). Ces bactéries ont ensuite été identifiées d'après leur séquence du gène d'ARNr 16S et par comparaison avec les banques de données des ADN bactériens puis elles ont été testées pour leurs capacités de dégradation des 16 composés du mélange.
If faut noter que le système dit "en double phase" dans lequel les polluants sont amenés à l'état dissout dans un tiers solvant, comme par exemple, silicone ou 2,2,4,4,6,88-heptaméthyl nonane encore appelé HMN, peut être très avantageux pour déterminer les capacités de dégradation de ces bactéries.
La mise en œuvre de ces bactéries pour le traitement en continu d'effluents pollués par des hydrocarbures et leurs additifs peut être réalisée, par exemple en faisant développer la bactérie ou le consortium de bactéries sur un support minéral ou organique dans un système de biofiltre ou de biobarrière de volume adéquat, en introduisant des effluents à traiter en présence d'air ou d'oxygène dans le biofiltre ou la biobarrière et en soutirant l'effluent avec une concentration réduite en substances chimiques.
La bactérie ou le consortium de bactéries peut être ajouté comme inoculum dans tout autre système adapté au traitement des eaux et des sols (biobarrière), et en particulier à des boues de station d'épuration. La portée de l'invention se comprendra mieux à la lecture des différents exemples détaillés ci-dessous.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Dégradation d'un mélange d'hydrocarbures et d'additifs des essences ou du gazole par un microcosme bactérien provenant de l'environnement.
On constitue un microcosme par le mélange de différents échantillons provenant de l'environnement afin d'obtenir les capacités de dégradation maximales. Le microcosme a été constitué par le mélange d'échantillons de 4 origines différentes (Tableau 1).
Tableau 1 : origine des échantillons de l'environnement
Figure imgf000008_0001
Chaque échantillon est filtré avec un filtre 0,22 μm afin de ne garder le plus possible que les microorganismes et d'éliminer des substrats additionnels qui perturberaient les résultats du test de biodégradation. Le microcosme qui résulte du mélange de ces 4 échantillons filtrés constitue l'inoculum bactérien qui a été mis en culture dans du milieu MM (150 mL) dans un flacon Schott de 500 mL.
Le milieu MM a la composition suivante :
-KH2PO4 1 ,4 g
-K2HPO4 1 ,7 g
-NH4NO3 1,5 g -MgSO4, 7H20 0,5g -CaCI2, 2H20 0,04 g
-FeSO4, 7H20 0,001 g
-Solution concentrée de vitamines 1 ml_
-Solution concentrée d'oligo-éléments 1 ml_ -H2O q.s.p.1 litre
La solution concentrée de vitamines a la composition suivante pour 1 litre d'eau distillée :
-Biotine 200 mg -Riboflavine 50 mg
-Acide nicotinamique 50 mg
-Panthoténate 50 mg
-Acide p-aminobenzoïque 50 mg
-Acide folique 20 mg -Thiamine 15 mg
-Cyanocobalamine 1 ,5 mg
La solution concentrée d'oligo-éléments a la composition suivante pour 1 litre d'eau distillée : -CuSO4, 5 H20 0,1 g
-MnSO4, 2H20 1 g
-ZnSO4, 7 H20 1 g
-AICI3, 6H2O 0,4 g
-NiCI2,6 H20 0,25 g -H3BO3 0,1 g
OoCI2, 6 H2O .........1 g
-Na2MoO4, 2H20 1 g
-Na2WO4, 2H2O2 1 g
Le pH final du milieu est de 6,8.
La source de carbone fournie est constituée d'un mélange d'hydrocarbures et d'additifs des essences ou du gazole à raison de 23 μL de la solution-mère de mélange décrite dans le Tableau 2. Dans ce tableau, les concentrations finales de ces composés lors d'un contact à l'eau d'une essence "type 7000" en sortie de pompe obtenues sont généralement bien inférieures aux concentrations utilisées dans le test de biodégradation. Les seuls cas où la concentration est supérieure sont ceux des alcools (TBA et cyclohexanol) et des éthers (MTBE et ETBE), ces composés étant très solubles dans l'eau.
Tableau 2. Composition du mélange de 16 composés qui constituent la source de carbone.
Figure imgf000010_0001
* Solubilité du MTBE si ajouté dans l'essence à raison de 7% ** Solubilité de I1ETBE si ajouté dans l'essence à raison de 12%
*** Solubilité du 2-EHN si ajouté dans un gazole à raison de 0,5%
Plusieurs cultures identiques sont incubées sous agitation à 3O0C. Ces cultures constituent le Mix1. Le dosage des substrats résiduels est effectué à intervalle réguliers par extraction au pentane contenant du 1 ,1 ,2-TCA (ou 1 ,1 ,2- trichloroéthane) comme standard interne sur la totalité d'une fiole. Le pentane après extraction des substrats résiduels est injecté en chromatographie en phase gazeuse avec détecteur à ionisation de flammes CPG/FID sur une colonne PONA. Lorsque le résultat de la CPG montre que les 16 composés ont été dégradés, on procède à un repiquage de la culture résultante (à 20%, v/v) dans du milieu MM de la même façon que précédemment décrit. Cette deuxième série de cultures constitue le Mix2. Les cultures sont incubées et les substrats résiduels sont mesurés comme décrit dans l'étape précédente. Après consommation des substrats, on procède à un troisième repiquage (Mix3). Étant donné les quantités de Mix2 disponibles au moment de l'ensemencement pour réaliser la culture Mix3, il n'a pas été possible de faire une mesure de la biomasse ajoutée dans la fiole Mix3. Après 196 jours d'incubation, les résultats obtenus montrent les capacités de dégradation décrites dans le Tableau 3.
Tableau 3. Capacités de dégradation des 16 composés de la culture Mix3.
Figure imgf000011_0001
Afin d'identifier les microorganismes responsables de la dégradation, un échantillon de cette culture est étalé en dilution sur boîtes de milieu riche TS gélose (Tripticase/Soja). Les boîtes sont incubées à 3O0C. Après croissance, les colonies individualisées sont reprises et isolées sur un milieu solide identique.
Il a été ainsi possible d'isoler plusieurs bactéries différentes dont Rhodococcus wratislaviensis et Rhodococcus aetherivorans qui ont été déposées à l'Institut Pasteur sous les références CNCM 1-4088 et CNCM 1-4089, respectivement.
EXEMPLE 2 : Capacités de dégradation et de minéralisation des 16 composés testés individuellement par Rhodococcus. wratislaviensis CNCM 1-4088 et Rhodococcus aetherivorans CNCM I-4089
On a voulu déterminer les capacités de chacune de ces deux souches, Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088 et Rhodococcus aetherivorans CNCM 1-4089, envers les 16 composés individuellement.
On effectue des pré-cultures de chacune des souches Rhodococcus wratislaviensis CNCM I-4088 et Rhodococcus aetherivorans CNCM I-4089 sur du milieu riche TS liquide. Les cultures sont centrifugées puis lavées deux fois dans du milieu MM décrit dans l'exemple 1.
1) Test de minéralisation : Ils sont effectués dans des fioles pénicilline de 160 mL dans lesquels on introduit 20 mL de milieu. Les fioles sont ensemencées soit avec Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088 soit avec Rhodococcus aetherivorans CNCM I-4089. La quantité de biomasse introduite dans chacune des fioles est équivalente pour les 2 souches mises en oeuvre et correspond à une valeur de la densité optique à 600 nm (≈DOβoo) finale égale à 0,5. On ajoute alors les substrats (1 substrat/fiole) à raison de 5 μL/fiole. On prépare en parallèle des séries de fioles- témoins dans lesquelles on introduit les souches mais sans substrat. Ces fioles serviront à mesurer la respiration endogène de chacune des souches en l'absence de substrat. Les fioles sont bouchées avec des bouchons butyl et incubées à 300C pendant 8 semaines sous agitation. On ajoute alors à la seringue à travers le bouchon 1 mL de HNO3 (60%)/fiole de manière à chasser le CO2 de la phase aqueuse vers la phase gazeuse. On peut alors mesurer le CO2 total produit dans chaque fiole en prélevant un échantillon du ciel gazeux avec une seringue étanche au gaz. Cette mesure est effectuée sur un CPG équipé d'un catharomètre. Le calcul du CO2 produit sur un substrat donné par chaque souche est effectué après avoir soustrait la valeur de la respiration endogène. Le calcul de la valeur de CO2 est effectué par rapport à un standard gazeux contenant du CO2 à une concentration déterminée. Le calcul de la minéralisation est effectué en rapportant le carbone retrouvé dans le CO2 au carbone amené par le substrat. Les résultats sont présentés dans le Tableau 4.
Dans certains cas, l'addition de substrat a été effectuée après dissolution du substrat dans un tiers solvant (2,2,4,4,6, 88-heptaméthyl nonane ou HMN), ceci permettant à la fois de favoriser la solubilisation du composé dans le milieu de croissance et de diminuer sa toxicité pour les microorganismes. Dans ce cas, la quantité de substrat (5 μL) est introduite dans 0,5 mL de HMN. Les cas où cette procédure a été suivie sont indiqués directement dans le Tableau 4.
2) Tests de dégradation : ils sont effectués dans des conditions similaires à ce qui est décrit dans le test de minéralisation. Dans ce cas, les témoins du test sont constitués par une série de fioles dans les mêmes conditions contenant chaque substrat mais non ensemencées. A la fin du test, les substrats résiduels sont mesurés : -soit directement à partir d'un échantillon de la phase aqueuse dans le cas des substrats très solubles (cas du MTBE, de I1ETBE, du TBA et du cyclohexanol). Ce dosage est effectué par CPG/FID équipée d'une colonne CP PorabondQ (Varian). -soit après extraction au pentane contenant du 1 ,1 ,2-TCA comme standard interne. Le pentane après extraction des substrats résiduels est injecté en CPG/FID sur une colonne PONA.
Les calculs sont effectués par rapport au substrat résiduel mesuré dans les fioles témoins non ensemencées. Les résultats sont présentés dans le Tableau 4.
Tableau 4. Capacité de dégradation et de minéralisation de Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088 et Rhodocόccυs aetherivorans CNCM 1-4089 sur les 16 substrats testés séparément.
Figure imgf000014_0001
a : les substrats ont été introduits directement dans le milieu b : les substrats ont été introduits après dissolution dans du HMN.
Dans certains cas, la dégradation n'est pas totale alors qu'elle l'était lorsque la souche était testée sur les composés fournis en mélange (cas, par exemple de
Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088 testée sur benzène). H faut donc prendre en compte le fait que les concentrations sont différentes dans ces deux expériences : lorsque le benzène est testé individuellement, il est ajouté à une concentration finale de 220 mg.L'1 alors que dans le mélange de composés, il est fourni à 7,2 mg.L"1 (voir Tableau 2).
Une deuxième remarque est que l'addition de m-xylène seul, p-xylène seul, o-xylène seul ou de cyclohexane seul à des concentrations plus élevées (215, 215, 220 ou 195 mg.L"1, respectivement) ne permet pas la biodégradation par Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088. Par contre, ces composés sont dégradés lorsque la même quantité de chacun d'eux (5 μL) est introduite dans un tiers solvant comme le HMN. Ceci est bien illustré dans le Tableau 4.
Dans certains cas, il y a une biodégradation totale des composés et un faible pourcentage de minéralisation : c'est le cas, par exemple de l'ETBE par Rhodococcus aetheήvorans CNCM 1-4089 : ceci s'explique par le fait que seul le fragment en C2 libéré par la coupure de la liaison éther de I1ETBE est utilisé comme substrat par la bactérie et le bilan de minéralisation est calculé par rapport à la quantité totale d'ETBE introduite dans la fiole (5 μL).
EXEMPLE 3 Capacités de dégradation des 16 composés en mélange par Rhodococcus wratislaviensis CNCM I-4088, par Rhodococcus aetherivorans CNCM
I-4089 et par une co-culture des 2 souches.
Des pré-cultures de Rhodococcus wratislaviensis CNCM I-4088 et de Rhodococcus. aetherivorans CNCM I-4089 sont réalisées dans du milieu TS. Après centrifugation et lavage comme décrit dans l'exemple 2, les souches Rhodococcus wratislaviensis CNCM I-4088 et Rhodococcus aetherivorans CNCM I-4089 sont testées pour leurs capacités de dégradation du mélange des 16 composés dans les conditions décrites dans l'exemple 1 , les souches étant testées séparément puis en co-culture. La biomasse introduite dans les expériences concernant les souches testées individuellement correspond à une valeur de DO6oo de 0,5. Lorsqu'il s'agit du mélange des deux souches, on constitue une suspension contenant chaque souche à la même concentration cellulaire et on ensemence les fioles avec ce mélange de manière à obtenir également une D06oo de 0,5. Après incubation à 300C, les substrats résiduels sont dosés après 4 semaines d'incubation comme décrit précédemment. Les résultats sont présentés dans le Tableau 5.
Tableau 5. Dégradation du mélange de 16 substrats par Rhodococcus wratislaviθnsis CNCM 1-4088, par Rhodococcus aetherivorans CNCM I-4089 ou par une co-culture de ces deux souches.
Figure imgf000016_0001
EXEMPLE 4 : Capacités de dégradation des 16 composés en mélange par une co- culture composée de Rhodococcus wratislaviensis CNCM I-4088, Rhodococcus aetherivorans CNCM ï-4089 et Aquincola tertiaricarbonis IFP2003
Aquincola tertiaricarbonis CNCM I-2052 a été préalablement isolée pour ses capacités à dégrader le TBA. Il était donc intéressant de la tester en association avec les deux souches Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088 et de Rhodococcus aβtherivorans CNCM 1-4089 afin de dégrader le TBA qui n'est pas consommé par ces deux souches mais au contraire produit lors de la dégradation du MTBE et de I1ETBE. Des pré-cultures de Rhodococcus wratislaviensis CNCM 1-4088, de Rhodococcus aetherivorans CNCM 1-4089 et de Aquincola tertiaricarbonis CNCM 1-2052 sont réalisées dans du milieu TS. Après centrifugation et lavage comme décrit dans l'exemple 2, une co-culture contenant les 3 souches est préparée puis testée pour ses capacités de dégradation du mélange des 16 composés dans les conditions décrites dans l'exemple 1. La biomasse étant introduite dans les expériences concernant le mélange des trois souches, on constitue une suspension contenant chaque souche à la même concentration cellulaire et on ensemence les fioles avec ce mélange de manière à obtenir également une D06oo de 0,5. Après 4 semaines d'incubation à 3O0C, les substrats résiduels sont dosés comme décrit précédemment et les résultats sont présentés dans le Tableau 6.
Tableau 6. Dégradation du mélange de 16 substrats par une co-culture composée de Rhodococcus wratislaviensis CNCM I-4088, Rhodococcus aetherivorans CNCM I- 4089 et Aαuincola tertiaricarbonis CNCM I-2052.
Figure imgf000018_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de traitement d'effluents aqueux comprenant un mélange complexe de substances contenant des hydrocarbures natifs des essences et des additifs présents dans les essences ou le gazole dans lequel on fait croître en conditions aérobies au moins une bactérie choisie parmi les bactéries Rhodococcus wratislaviensis CNCM I-4088, et Rhodococcus aetherivorans CNCM I-4089, en présence d'un substrat de croissance contenant ledit mélange comme source de carbone et on fait dégrader au moins en partie ledit mélange par la bactérie jusqu'aux produits ultimes de dégradation, le dioxyde de carbone, l'eau et la biomasse.
2. Procédé selon la revendication 1 dans le mélange comprend des composés choisis parmi les alcanes, les hydrocarbures monoaromatiques, les hydrocarbures aromatiques polycycliques, les éthers ou les nitrates.
3. Procédé selon la revendication 2 dans lequel Ie mélange comprend de l'octane, de l'hexadécane, du benzène, de l'éthylbenzène, du toluène, du m-xylène, du p-xylène, du o-xylène, du cyclohexanol, du terf-butanol (désigné ci-après sous le terme TBA), du cyclohexane, de l'isooctane, du MTBE, de l'ETBE, du 2-éthylhexyl nitrate (désigné ci-après sous le terme de 2-EHN) et du naphtalène.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel on fait croître en conditions aérobies les deux bactéries Rhodococcus wratislaviensis CNCM I-4088, et Rhodococcus aetherivorans CNCM I-4089, en présence d'un substrat de croissance contenant ledit mélange comme source de carbone et on fait dégrader au moins en partie ledit mélange par les bactéries jusqu'aux produits ultimes de dégradation, le dioxyde de carbone, l'eau et la biomasse.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel on fait croître en conditions aérobies un consortium contenant les trois bactéries Rhodococcus wratislaviensis CNCM I-4088, Rhodococcus aetherivorans CNCM I-4089 et Aquincola tertiaricarbonis CNCM I-2052 en présence d'un substrat de croissance contenant ledit mélange comme source de carbone et on fait dégrader au moins en partie ledit mélange par les bactéries jusqu'aux produits ultimes de dégradation, le dioxyde de carbone, l'eau et la biomasse.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel on fait développer la bactérie ou le consortium de bactéries sur un support minéral ou organique dans un système de biofiltre ou de biobarrière de volume adéquat, on introduit des effluents à traiter en présence d'air ou d'oxygène dans le biofiltre ou la biobarrière et on soutire l'effluent avec une concentration réduite en substances chimiques.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel la bactérie ou le consortium de bactéries est ajouté comme inoculum à des boues de station d'épuration.
8. Nouvelle bactérie Rhodococcus wratislaviensis déposée à l'Institut Pasteur sous le numéro CNCM 1-4088.
9. Nouvelle bactérie Rhodococcus aetherivorans déposée à l'Institut Pasteur sous le numéro CNCM 1-4089.
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