WO2010107405A1 - Способ получения пептидов, специфично распознающих определённые типы клеток и предназначенных для терапевтических целей - Google Patents

Способ получения пептидов, специфично распознающих определённые типы клеток и предназначенных для терапевтических целей Download PDF

Info

Publication number
WO2010107405A1
WO2010107405A1 PCT/UA2009/000011 UA2009000011W WO2010107405A1 WO 2010107405 A1 WO2010107405 A1 WO 2010107405A1 UA 2009000011 W UA2009000011 W UA 2009000011W WO 2010107405 A1 WO2010107405 A1 WO 2010107405A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptides
cells
types
minutes
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/UA2009/000011
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Михаил Викторович РАЗУМЕНКО
Original Assignee
Razumenko Mihail Viktorovich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Razumenko Mihail Viktorovich filed Critical Razumenko Mihail Viktorovich
Priority to RU2011140269/10A priority Critical patent/RU2528739C2/ru
Publication of WO2010107405A1 publication Critical patent/WO2010107405A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors

Definitions

  • a method for producing peptides that specifically recognize certain types of cells and are intended for therapeutic purposes is intended for therapeutic purposes.
  • the invention relates to genetic engineering, in particular to methods for producing peptides that are capable of specifically recognizing certain types of cells and can be used in diagnostics, therapy and pharmaceutical applications.
  • Therapeutic inhibitors for vascular smooth muscle cells are known, which are used to suppress cell activity and / or destroy the cell by targeted delivery of therapeutic agents to active proliferation foci (see US Pat. No. ⁇ 6515009 dated February 4, 2003, PCR A61K31 / 40).
  • therapeutic conjugates are used to inhibit the growth of vascular smooth muscle cells that contain a drug associated with a peptide or protein that specifically binds to the cell membrane of vascular smooth muscle cells (for example, monoclonal and polyclonal antibodies, growth factors, polypeptide hormones , cytokines and the like) or with an element of intra- or extracellular matrix (for example, macromolecules that recognize integrins and fibronectin in as well as epitopes of collagen and extracellular glyco- proteins) of these same cells.
  • a drug associated with a peptide or protein that specifically binds to the cell membrane of vascular smooth muscle cells for example, monoclonal and polyclonal antibodies, growth factors, polypeptide hormones , cytokines and the like
  • an element of intra- or extracellular matrix for example, macromolecules that recognize integrins and fibronectin in as well as epitopes of collagen and extracellular glyco- proteins
  • One of these peptides contains an amino acid sequence that specifically recognizes chondroitin sulfate proteoglycan, with an estimated molecular weight of about 250 kilodaltons, expressed on the membranes of vascular smooth muscle cells.
  • the same amino acid sequence is found in the regions causing the com- monoclical tribalism (crazy NR-AN-Ol antibody and / or its functional equivalents.
  • the disadvantages of this invention are the use of peptides that recognize proteins with pronounced expression in a number of other functionally important cells and tissues, which leads to the fact that this therapeutic conjugate can bind with other types of cells of non-smooth muscle origin, such as neuroglia cells. , bone tissue and others, which leads to undesirable accumulation of the drug in these cells and a side cytotoxic effect (undesirable cell death).
  • this therapeutic conjugate can bind with other types of cells of non-smooth muscle origin, such as neuroglia cells. , bone tissue and others, which leads to undesirable accumulation of the drug in these cells and a side cytotoxic effect (undesirable cell death).
  • their size due to the dense extracellular matrix, can become an obstacle to the conjugate penetration into the center of proliferation, and the cross-reactivity of antibodies to other molecular structures reduces their specificity.
  • the task is to create a method of producing peptides that specifically recognize certain types of cells with a high degree of selectivity, which are intended for therapeutic purposes.
  • the task is achieved by implementing a new method for producing peptides that specifically recognize certain types of cells, which involves constructing a phage library of random peptides based on oligonucleotide fragments encoding them, screening them to obtain peptides that bind to a specific cell type, and confirm the specificity of the selected peptides , however, according to the invention,
  • oligonucleotide fragments encoding random peptides are obtained by reverse transcription using random primers and total RNA of a certain type of cells and other types of cells that may be involved in the pathological process or are able to influence its diagnosis and therapy,
  • these oligonucleotide fragments are inserted into bacteriophage vectors in the correct orientation and are used to create phage libraries of random peptides for all types of cells used to isolate total RNA,
  • peptides that specifically recognize certain types of cells are obtained, which can be used to deliver drugs to their places of direct action, to prevent and / or treat disorders related to the functioning of certain types of cells, or to directly use the resulting peptides. as a dosage form in therapeutic applications.
  • the use of such peptides, or their fragments will make it possible to diagnose disorders in the functioning of certain types of cells and to predict their treatment.
  • the claimed method allows to obtain highly specific and highly selective peptides to cells of a particular type.
  • the method for producing peptides is illustrated by diagrams and illustrations, where: FIG. 1 — shows cDNA synthesis and library construction; figure 2 - shows a diagram of single and multi-step screening; fig.Z - shows a diagram of the peptide construct (matrix).
  • the method of producing peptides is carried out in this way. Initially, the selection and division of cell populations into types is carried out: cells that must be specifically recognized by peptides, and cells that may be involved in the pathological process or are able to influence its course, diagnosis and therapy, the recognition of which is not desirable.
  • RNA is isolated by well-known methods with adaptive modifications, followed by, if necessary, purifying it and isolating the fraction of messenger RNA. The quality of such RNA is analyzed and further, RNA is used in reverse transcription reactions directed by primers, both of random origin and complementary to the poly A region of messenger RNAs.
  • RNA separation of total cellular RNA is performed through controlled synthesis of cDNA fragments limited in size and heterogeneity, which is achieved by using different concentrations of ions in the reaction mixture, a combination of primers, the amount of starting material and temperature regimes.
  • RNA secondary separation of cellular RNA is carried out at the stage of fractionation and purification of the obtained cDNA molecules.
  • gel filtration is used in such a way that after elution the cDNA pool of molecules consists of 2 parts: a fraction with a number of nucleotide units of less than 500 base pairs.
  • This separation allows in the first case, the creation of libraries aimed at determining the exact places of interaction of the peptide molecule with molecules on the surface of cells of a recognizable type, and in the second case, to identify the nucleic acid fragment responsible for the synthesis of this peptide or protein fragment.
  • cDNA molecules are doped with oligonucleotide linkers synthetically synthesized and containing recognition sites for restriction endonucleases used for processing and preparing the cloning vector.
  • the ends of the cDNA are first treated with DNA polymerase and only then, such fragments are doped with linkers and incubated with restriction endonucleases.
  • linkers it becomes possible to obtain cDNA fragments that contain recognition sites for restriction endonucleases at different ends, in such an arrangement that they can be freely cloned into a vector in a specific orientation (sense cloning).
  • the bacteriophage vector is treated with restriction endonucleases to obtain fragments suitable for doping with the synthesized cDNA fragments. Obtained as a result of doping of cDNA fragments and vector molecules, recombinant molecules are packaged in vitro and initiate the expression of this fragment through a single replication cycle. Then, the number of recombinants in the library and the absolute number of particles are determined.
  • screening of such libraries is carried out using combinations of certain types of cells and other types of cells that may be involved in the pathological process or are able to influence its course, diagnosis and therapy.
  • screening is performed by repeated repetition of incubation rounds with cells, washing of phage particles that are not bound to cells, solutions of different ionic strength and solutions of different ability to disrupt the protein – protein interactions, followed by elution and amplification of the desired phage particles.
  • the calculated number of phage particles in the buffer is definitely incubated with the material used for cell cultivation, and then the residual fraction (supernatant) containing free phages is transferred to cells of a certain type.
  • multi-step screening namely, the use of combinations of several cell types that may be involved in the pathological process or are able to influence its course, diagnosis and therapy
  • the supernatant after incubation with the material is sent to these cells, after which the supernatant is sent to cells of a recognizable type, or the next type of cells that may be involved in the pathological process or are able to influence its course, diagnosis and therapy, and then the supernatant of the incubi Run with cells of a recognizable type.
  • screening is carried out if cells of a certain type are used and cells of other types that may be involved in the pathological process or are able to influence its course, diagnosis and therapy, in various structural and functional states.
  • the result of multi-step screening is a group of peptides in the composition of phage particles, which has a pronounced specificity for cells of a certain type.
  • the test phage is accumulated (increased) in the required amount, purified and tested as the first antibody in a direct enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), where cultivated cells act as antigens of certain types in different functional states.
  • ELISA direct enzyme-linked immunosorbent assay
  • the original group is dissipated to obtain individual plaques, which are then eluted with buffer for incubation in ELISA and used directly as a source of the first antibody in ELISA, without prior extension or purification.
  • an individual clone is similar to the first case, amplified, purified and incubated simultaneously with cells of a recognizable type and cells that may be involved in the pathological process or able to influence its course, diagnosis and therapy. After that, the cells are washed, the bound particles are eluted and their titer is determined, then it is compared with the titer obtained for cells of another type.
  • PCR polymerase chain reaction
  • bacteriophage DNA is isolated, and oligonucleotide fragments encoding peptides in a phage particle that specifically recognize cells of a certain type are amplified through the polymerase chain reaction.
  • the primary nucleotide sequences of these fragments are determined by Sondere dideoxy sequencing using an automatic sequencer.
  • the resulting nucleotide sequences are translated in reading frame to obtain the amino acid sequences of the peptides contained in the phage particles.
  • carry out a computer analysis of the obtained amino acid sequences using publicly available software packages for the analysis of biological macromolecules, while determining the physico-chemical and structural characteristics of the peptides.
  • matrices are constructed from the amino acid sequences of peptides of specifically recognizing cells of certain types. For this, in the first stage, amino acid sequences are grouped into short (up to 5 amino acid units) matrices, which in the second stage are combined into long matrices (at least 15 amino acid units) combining at least three and shorter matrices. At the final stage, the sequences of the linker and the detection signal are added to the resulting matrices from the amino acid sequences. To obtain peptides in pure form, the sequences of new peptides are read from the designed matrices and they are synthesized chemically. Next, peptides are purified until ready, followed by confirmation of the specificity of the obtained peptides for certain types of cells.
  • Example 1 The choice of cell populations.
  • vascular smooth muscle cells SGMK
  • SGMK vascular smooth muscle cells
  • fibroblasts blood flow cells
  • Cervical canal carcinoma cells - HeLa, and liver carcinoma cells - Hep-G2 are also used as cells that can be involved in the pathological process or can affect its course, diagnosis and therapy.
  • SGMK culture is initiated from the main blood vessels of patients with pathologies of the cardiovascular system.
  • a variety of cell lines are available as commercial preparations. For example, parallel to the cell cultures obtained by treating the arteries and veins of patients, smooth muscle cells of the coronary artery were used (CeIl Sitesms GmbH, Lot # 17151, Catalog # CC-2583). Preparations of the original culture of SGMK are primary in their origin, and have a limited number of duplications, which limits the number of subsequent transfers. Therefore, in all cases, cultures are initiated, for subsequent studies using cell samples with no more than 6 divisions.
  • Vascular smooth muscle cells are cultured using a nutrient medium, which consists of 1/3 of each of the following components - Waumoot (GIBCO BRL Cat. # 31220-023), F 12 (GIBCO BRL Cat. # 31220-023), SMCBM (Protocell Cat. # C-22260). This medium is supplemented by pre-inactivated incubation for 30 minutes at 56 ° C in a water bath, fetal bovine serum (GIBCO BRL Cat.
  • CC-4102 to a final concentration of 15%
  • penicillin / streptomycin solution (GIBCO BRL Cat. 15140-114) to a final concentration of -1.5%.
  • Vascular smooth muscle cells blocked at the growth stage are cultured using a depleted nutrient medium, i.e. without the addition of fetal bovine serum, but with the addition of penicillin / streptomycin solution in the above concentration.
  • vascular smooth muscle cells To block vascular smooth muscle cells at the growth stage, they first cultivated until the size of the monolayer reaches 90% of the entire growth area using an enriched nutrient medium, and only then replaces the enriched nutrient medium with a depleted one and continues incubation for 72 hours, replacing the old nutrient medium with a new one every 24 hours. Endothelial cells are cultured using a nutrient medium -
  • EGM-2 (Clients Compound, Cat. # CC-3202), supplemented by the complementation package attached to it - EGM-2 MV (Climatos Comprap, Cat # CC-4147), which contains growth factors, hormones, and inactivated serum of cow fruit, the final the concentration of which in the medium after complementation is 10%.
  • Endothelial cells are initiated from the drug (Protocell Cat. # CC-2519). Endothelial cells are blocked at the growth stage in the same way as in the case of vascular smooth muscle cells.
  • Fibroblasts are cultured using a nutrient medium based on standard DMEM (GIBCO BRL) supplemented with inactivated cow serum to a final concentration of 10%, and penicillin / streptomycin solution to a final concentration of 1.5%. Fibroblast cell culture is initiated from a preparation of patients with pathologies of the cardiovascular system and blocked as well as described for vascular smooth muscle cells. HeLa 3T3 cells and Hep-G2 cells are immortalized lines, so almost any available sample of cells is used to initiate a culture, however, they try to use cells that have passed no more than 100 divisions.
  • a nutrient medium is used based on one of the MEM compositions (GIBCO BRL) supplemented with bovine fetal serum at a final concentration of 15–20% (as determined by the desired growth rates) and penicillin / streptomycin solution at a final concentration of 1, five %.
  • GEBCO BRL MEM compositions
  • penicillin / streptomycin solution a nutrient medium
  • these cell types are also cultured using a depleted nutrient medium, simulating growth blocking similar to that observed for primary cell types (SGMK, endothelial and fibroblasts).
  • RNA is isolated, both from cells of a certain type and from cells that may be involved in the pathological process or are able to influence its course, diagnosis and therapy.
  • Cells of all types are grown for 5-7 days using vials of the type T75 and 18 ml of nutrient medium, which is replaced every 24 hours.
  • Vascular smooth muscle cells are cultivated in 40 bottles, at the rate of 3.5 * 10 5 cells per vial.
  • Endothelial cells are cultured in 20 bottles, at the rate of 3 * 10 5 cells per vial.
  • HeLa and Hep-G2 cells are cultured in 20 bottles at the rate of 1.6 * 10 5 cells per vial.
  • the cells are washed extensively with 2 times, using 12 ml of HBSS buffer (Hank's balanced salt solution) each time, then treated for 3 minutes, using 6 ml of a solution containing 0.05% trypsin and 0.53 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetate) and neutralized by the addition of 9 ml of HBSS buffer. Collect the cells by centrifugation for 10 minutes on 3000 * g, and wash 3 times using 20 ml HBSS buffer. The number of cells is determined using a cell counting chamber; to do this, 50 ⁇ l of cell suspension is mixed with an equal volume of a 15% solution of trypan blue, which is a vital dye. The number of living cells is fixed and the total number of cells in suspension is calculated.
  • guanidine isothiocyanate both with subsequent precipitation with lithium salts and without precipitation, the cells are concentrated by centrifugation, the supernatant is removed, and the precipitate is resuspended intensively in lysis buffer (5.25M guanidine isothiocyanate; 50mM Tris-Cl, pH 6.4; 20mM EDTA; 1% Triton X-100; 0.1M 2-mercaptoethanol) at a rate of 1 ml per 10 7 cells.
  • lysis buffer 5.25M guanidine isothiocyanate; 50mM Tris-Cl, pH 6.4; 20mM EDTA; 1% Triton X-100; 0.1M 2-mercaptoethanol
  • the cells are concentrated by centrifugation, the supernatant is removed, and the precipitate is resuspended intensively in pre-cooled lysis buffer (0D5M sodium chloride; YumM Tris-Cl, pH 8.5; 0.05% NP -40; 0.01% 3-carboxyauric acid; 0.1 M 2-mercapto-ethanol) at the rate of 1 ml per 5 * 10 cells.
  • pre-cooled lysis buffer (0D5M sodium chloride; YumM Tris-Cl, pH 8.5; 0.05% NP -40; 0.01% 3-carboxyauric acid; 0.1 M 2-mercapto-ethanol
  • the mixture is centrifuged for 2 minutes at 12,000 * g and a temperature of 4 ° C, the supernatant is transferred to a new tube and an equal volume of buffer for proteinase K is added (0.2M Tris - Acetate; 0, 3M sodium acetate; 0.05M EDTA, pH 7 , 5; 2% (by weight) of sodium dodecyl sulfate) containing 400 mg / ml of proteinase K, and incubated for 60 minutes at a temperature of 37 0 C. Next, add 1 volume of the mixture phenol - chloroform - isoamyl alcohol (25:24 ratio: 1) and intensively stirred for 5 minutes at room temperature.
  • buffer for proteinase K 0.2M Tris - Acetate; 0, 3M sodium acetate; 0.05M EDTA, pH 7 , 5; 2% (by weight) of sodium dodecyl sulfate
  • the mixture is centrifuged for 2 minutes at 12,000 * g at room temperature, the resulting aqueous phase is transferred to a new tube, and the extraction with phenol-chloroform-isoamyl alcohol is repeated (25: 24: 1) several times. 2.5 volumes of absolute ethanol are added to the aqueous phase obtained as a result of extraction, intensively mixed, and RNA is precipitated by placing the sample for 30 minutes in a cooler with a temperature of -70 0 C.
  • the solution containing RNA is centrifuged for 10 minutes at 12000 * g at a temperature of 4 0 C, and the precipitate is washed 3 times by centrifugation for 5 minutes at 12000 * g, in the presence of 700 ⁇ l of a 70% solution of ethyl alcohol.
  • the precipitate is dried for 2.5 minutes under vacuum and dissolved in 0.4 ml of water treated with DEPK.
  • the solution of total i-cell RNA obtained as a result of the primary extraction is treated with a deoxyribonuclease of the first type in order to remove DNA fragments that can get into the RNA solution during its extraction and can hinder the further fractionation of such RNA and its use in reverse transcription reactions.
  • a deoxyribonuclease of the first type in order to remove DNA fragments that can get into the RNA solution during its extraction and can hinder the further fractionation of such RNA and its use in reverse transcription reactions.
  • a deoxyribonuclease inhibitor Ivitrogep, Cat # 10777-019
  • 50 ⁇ l of 10-fold standard buffer for deoxyribonuclease and 50 ⁇ l (500 units) of the first type of deoxyribonuclease (GIBCO BRL).
  • the resulting mixture is incubated for 2 hours at a temperature of 37 ° C, and the reaction is stopped by the simultaneous addition of the OD volume of ZM to the sodium acetate solution (pH 5.2), 1.1 volumes of the aqueous phenol solution, 0.3 volumes of chloroform-isoamyl alcohol (in the ratio of 24: 1).
  • the solution is vigorously stirred for 1 minute, incubated for 15 minutes at a temperature of 0 ° C and centrifuged for 10 minutes at 12,000 * g, at a temperature of 4 ° C.
  • the aqueous phase is transferred to a new tube and RNA is precipitated using absolute ethanol, as described above.
  • RNA messenger RNA
  • oligo - (dT) - cellulose Sigma, Cat # 03131
  • bound mRNA is eluted with 1.5 ml of elution buffer.
  • the mRNA contained in the resulting solution is precipitated by the addition of 150 ⁇ l of a solution of ZM sodium acetate (pH 5.2) and 3.75 ml of absolute ethanol.
  • RNA and / or mRNA are used in reverse transcription reactions directed by RNA - dependent - DNA polymerase. To do this, mix 0.001-5,000 mg of total RNA and 1 ⁇ l of primer
  • the resulting mixture is incubated for 5 minutes at a temperature of 65 ° C, cooled rapidly and 4 ⁇ l of 5-fold buffer for the synthesis of the primary cDNA chain (250 mM Tris-Cl, pH 8.3; 375 mM potassium chloride; 15 mM magnesium chloride) are added, 2 ⁇ l of OD M of p-ra dithiotrietol (DTT), 1 ⁇ l (40 units) of ribonuclease inhibitor.
  • the contents of the tube are mixed vigorously and incubated for 2 minutes at a temperature of 42 ° C, after which 1 ⁇ l (200 units) of Surerscrypt II RNA-dependent DNA polymerase (GIBCO BRL, Cat.
  • RNA separation of total RNA is carried out through controlled synthesis of cDNA fragments limited in size and heterogeneity, which is achieved using different concentrations of ions in the reaction mixture, a combination of primers, the amount of starting material and temperature regimes.
  • Synthesis of the cDNA 2nd strand is carried out using the polymerase chain reaction (PCR), for which no more than 10% of the final solution is used after treatment with H.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a ribonuclease Collect the mixture by sequential addition of 5 ⁇ l of 10-fold buffer for PCR (200 mM Tris-Cl, pH 8.4; 500 mM potassium chloride), 1.5 ⁇ l 50 mM p-ra magnesium chloride, 1 ⁇ l 10 mM p-ra deoxyribonucleotides, 0.5 ⁇ l (2.5 units) Taq-DNA- polymerase, 2 ⁇ l p-ra cDNA (the final product of the synthesis reaction of the primary cDNA chain), 38.1 ⁇ l of treated water DEPK. The solution is mixed vigorously and incubated for 2 minutes at a temperature of 94 ° C. Then 15-40 standard PCR amplification cycles are performed.
  • the ends of cDNA molecules are processed and doped with synthetic oligonucleotide linkers, which contain in their composition a recognition site for the restriction endonuclease, Eco Rl, and partially a recognition site for the restriction endonuclease, Hippd III.
  • synthetic oligonucleotide linkers which contain in their composition a recognition site for the restriction endonuclease, Eco Rl, and partially a recognition site for the restriction endonuclease, Hippd III.
  • a solution of cDNA molecules add 3 ⁇ l of a 10-fold buffer for T4 DNA polymerase (200 mM Tris-Cl, pH 8.4; 500 mM potassium chloride), 1.5 ⁇ l 100 mM p-ra DTT, 3 ⁇ l of 1 mM p-ra deoxyribonucleotides, and 1.0 ⁇ l (1.5 units) of T4 -DNA polymerase, and bring the final solution volume to 30.0 ⁇ l using double distilled water treated with DEPK .
  • the solution is stirred slowly and incubated for 20 minutes at a temperature of H 0 C.
  • the reaction is stopped by adding an equal volume of phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25: 24: 1) and then the DNA, which is contained in the aqueous phase, is precipitated by adding sodium acetate and absolute ethanol solutions as described above.
  • the resulting precipitate which contains cDNA molecules, is dissolved in 10 ⁇ l of double-distilled water treated with DEPA.
  • Oligonucleotide linkers are phosphorylated by incubation with T4 - polynucleotide kinase, immediately before use in the doping reaction.
  • the solution is mixed and incubated for 5 minutes at a temperature of 37 ° C.
  • 6-8 units of T4-DNA ligase are added and incubated for 6-20 hours at a temperature of 16 0 C.
  • the cDNA molecules are digested with 2 restriction endonucleases - HiPd III and EcoRl.
  • adding 10 ⁇ l of 10-fold buffer for the restriction endonuclease Hipd III to the cDNA solution, and 10 ⁇ l (100 units) of the restriction endonuclease Hipd III (Ipvitrogep) the volume of this mixture is adjusted to 100 ⁇ l using a double distilled water.
  • the resulting mixture is incubated for 2 hours at 37 0 C.
  • the secondary separation of total RNA is carried out at the stage of fractionation and purification of the obtained cDNA molecules, for which gel filtration is used.
  • a chromatographic column containing particles of sepharose of a certain size is washed 5 times, using 1 ml of buffer to neutralize each time.
  • Split material, a population of cDNA, is applied in a volume of 1 ml and fractions of 25 ⁇ l are collected.
  • Example 4 Cloning and creation of multiple libraries
  • the creation of libraries is carried out according to one model, both for cells of a certain type and for cells that may be involved in the pathological process or are able to influence its course, diagnosis and therapy.
  • DNA of bacteriophage T7 Novagene, T7 Selt 10-3 vector
  • 2 restriction endonucleases - Eco Rl and HiPd III i.e. the same type used to process the ends of the cDNA.
  • a solution of vector DNA molecules and a solution of cDNA molecules are mixed in a ratio of 1: 3, based on the mole of the substance, an equivalent amount of T4 - DNA - ligase (GIBCO BRL) is added and incubated for no more than 28 hours at a temperature of 16 0 C.
  • the reaction is stopped by adding an equal volume mixtures of phenol - chloroform - isoamyl alcohol (25: 24: 1), and then the DNA, which is contained in the aqueous phase, is precipitated by adding solutions of sodium acetate and absolute ethanol as described above.
  • the obtained recombinant cDNA molecules in an amount of not more than 1 ⁇ g, are mixed with 250 ⁇ l of the bacteriophage packaging proteins and incubated for 5 minutes at a temperature of 0 ° C. Then the nutrient medium is added and the incubation is continued for another 60 minutes at 37 0 C. Example 5. Amplification of bacteriophages.
  • Bacteriophage T7 is cultured using E. coli strain BLT5403 as a host.
  • amplification is carried out in several ways. In one case, microamplification, a single plaque or eluate after screening, or some other small amount of bacteriophages, is dissolved in
  • 1 ml of nutrient medium prepared by the method of Luria - Bertani (LB). Then add 1 ml of a culture of the host strain with an optical density of 0.4-0.6 at a wavelength of 600 nm (OP 60 o 0.4-0.6), which is initiated in 50 ml of LB culture medium from 0.5 ml of suspension bacteria, pre-cultured for 16 hours, and grow in 2-3 hours. A mixture of phages and bacteria with a total volume of 2 ml is incubated at 37 ° C and 200 revolutions per minute on a shaker for 3-4 hours, observing complete lysis, which is expressed by bleaching the contents of the tube.
  • LB Luria - Bertani
  • the solution is centrifuged for 10 minutes at 8000 * g, and the precipitate containing phages is dissolved in 1 ml of TBS buffer ( Tris - Borate Buffer) and phage particles are again precipitated by adding a solution of poly ilenglikolya - within 10 minutes grained chlorinated sodium, followed by incubation and centrifugation at 12,000 * g and at 4 0 C.
  • TBS buffer Tris - Borate Buffer
  • Screening of libraries is carried out both by repeated repetition of a single-step procedure and using a multi-step complex procedure involving selection on combinations of various cell types that may be involved in the pathological process or are able to influence its course, diagnosis and therapy.
  • the cells are washed intensively 5 times for 5 minutes, using each once 3 ml of HBSS buffer, followed by elution of specific binding phages with 1 ml of elution buffer, which contains no more than 1.0% sodium dodecyl sulfate, or with 1 ml of freshly prepared daily culture of the strain ozyaina.
  • the titer of phages in the eluate is determined, and the eluate is amplified to obtain at least 10 10 phages, which are incubated with a new portion of preincubation material and a new portion of vascular smooth muscle cells, repeating the selection cycle 3-5 times.
  • phage particles from any library are dissolved in 2 ml of HBSS buffer and incubated for 20 minutes with preincubation material (Petri dish, in which instead of cells contained only medium).
  • preincubation material Petri dish, in which instead of cells contained only medium.
  • the upper phase containing phage-free phages is transferred to pre-washed endothelial cells and incubated for 40 minutes at 4 ° C, followed by transferring the upper phase to a new portion of endothelial cells and similar incubation, which is repeated 2 -3 times and only after that, the upper phase is sent to fibroblasts and carry out a similar selection 2-3 times.
  • the upper phase after incubation on endothelial cells, without additional selection on fibroblasts, is transferred directly to vascular smooth muscle cells and incubated for 40 minutes at 4 0 C. Washing and elution are carried out as described above.
  • the upper phase after incubation with preincubation material (Petri dish, in which instead of cells contained only the medium) is transferred to pre-washed HeLa cells and incubated with them for 40 minutes at 4 0 C, and then the upper phase is transferred to cells Hep-G2 and incubated with them for 40 minutes at a temperature of 4 0 C, after which the upper phase is transferred to a new portion of HeLa cells and Hep-G2 cells, repeating the combined selection 2-3 times.
  • the final upper phase is transferred to vascular smooth muscle cells and incubated for 40 minutes at a temperature of 4 0 C.
  • the material after selection on immortalized cell types, is transferred to endothelial cells and / or fibroblasts and only then to vascular smooth muscle cells.
  • Example 7 Performing combined testing of peptides in the composition of bacteriophage particles.
  • the specificity of individual peptides in the composition of phage particles is assessed using them instead of the first antibody in a direct enzyme immunoassay, where certain types of cells and other types of cells that can be involved in the pathological process or act as antigens are used as antigens. , diagnosis and therapy.
  • cells of all used types are cultivated in 96 well plates, initiating a culture at the rate of 10,000 cells per well.
  • Cells grow within 48 hours, in this case, carry out the replacement of the nutrient medium every 24 hours.
  • the plates are washed intensively 5 times for 5 minutes, each time using 200 ⁇ l of HBSS buffer.
  • 10 b- 10 7 phage particles are incubated with the cells for 1 hour at 4 0 C, followed by intensive washing with HBSS buffer, and incubation with the second antibody, for 1 hour at room temperature.
  • a monoclonal antibody conjugated with horseradish peroxidase and a recognition amino acid motif of 11 amino acids (N'-Met-Ala-Ser-Met-Thr- (Gly) 2 - (Gln) 2 -Met-Gly-C) ( Novagene, Cat. No.69522), located at the N-terminus of the JNeIO protein, which is part of the capsid of bacteriophage T7. Then, the plates are washed again with HBSS buffer and detect the second antibody using peroxidase substrate, the cleavage of which is stopped by the addition of 50 ⁇ l of IM p-ra sulfuric acid. B. Analysis of the binding
  • the binding of individual peptides in the composition of phage particles with cells of various types is examined using one-step selection, in which the analyzed peptide is tested in parallel, for binding to cells of a recognized type and to cells of other types that may be involved in the pathological process or are able to influence its course, diagnosis and therapy.
  • the procedure is performed in parallel, both for vascular smooth muscle cells (recognizable cell type) and for endothelial cells, fibroblasts, HeLa cells and Hep-G2 (cells that may be involved in the pathological process or are able to influence its course, diagnosis and therapy) using 2 temperature modes for cells of all types: 4 ° C and 37 ° C.
  • non-bound particles are intensively washed using HBSS buffer, and then eluted using 1 ml elution buffer. Determine the titer of phages in the eluate and compare the data obtained for all cell types.
  • PCR polymerase chain reaction
  • phage particles is incubated first for 20 minutes with preincubation material (Petri dish, in which only the medium was contained instead of cells), and then the upper fraction is transferred to the test cells previously washed 5 times with HBSS buffer, 5 minutes each.
  • preincubation material Petri dish, in which only the medium was contained instead of cells
  • the procedure is simultaneously performed both for vascular smooth muscle cells (recognizable cell type) and for endothelial cells, fibroblasts, HeLa and Hep-G2 cells (cells that may be involved in the pathological process or are able to influence its course, diagnostics and therapy), using 2 temperature modes for cells of all types: 4 0 C and 37 0 C.
  • phage particles are intensively washed using HBSS buffer, after which the bound phages are eluted using 1 ml elution buffer. Then, the titer of phages in the eluate is determined and equal aliquots of the eluate are dispersed to obtain single plaques. 100 plaques are taken from each plate, distributed in groups of two, and DNA is isolated by lysis of phage particles. To do this, phage particles are incubated in 10 mM EDTA solution for 10 minutes at a temperature of 65 ° C, followed by cooling and centrifugation for 3 minutes at 14,000 * g.
  • the resulting solution containing bacteriophage DNA is used as a template for PCR according to the standard scheme for this vector, directed by primers to the vector sections (T7 "Forward” primer: 5 '- AACSSSTSAAGASSCCTTTA - 3'; T7 "Revier” primer: 5 '- GGAGCTGTCGTATTCCAGTC - 3 '), or specially designed primers. After that, determine the absolute frequency of occurrence of each of the peptides in the composition of phage particles, depending on the cell type.
  • the stability of an individual peptide in a phage particle i.e. the ability to preserve its functional efficiency in the cell as long as possible, which it specifically recognizes in the host organism itself, directly intersects with the ability to efficiently enter the cell, remain active and specifically bombard the intracellular targets.
  • the cells are washed and lysed for 10 minutes using 2 ml of lysis buffer (1 ml of 2% p-ra deoxycholium to-you; 10 mM Tris; 2 mM EDTA, pH 8.0).
  • lysis buffer 1 ml of 2% p-ra deoxycholium to-you; 10 mM Tris; 2 mM EDTA, pH 8.0.
  • the phage containing solution is scattered to single plaques, which are then selected to determine the primary sequence of oligonucleotide fragments encoding the peptides in the composition of the selected phage particles, as well as for additional testing.
  • Example 8 Determination of the primary sequence of oligonucleotide fragments and the amino acid sequences of the peptides encoded by them, followed by computer analysis. Oligonucleotide DNA fragments of the vector genome, representing cDNA inserts and encoding specific peptides, and limited to the primers of the vector, are amplified using PCR, and determine their primary sequence, using Sanger dideoxy sequencing using an automatic sequencer, for example, ABI ⁇ rism 310 (Application Systems Ips.) guided by the manufacturer's recommended reaction protocols.
  • the primary sequence of the oligonucleotide fragments of the inserts is translated in reading frame into the amino acid sequences of the peptides that specifically bind to actively proliferating and arrested in growth forms of smooth muscle cells, and the resulting amino acid sequences are redistributed according to their length and origin.
  • the first group contains peptides with a short amino acid chain (up to 30 links) that recognize only linear epitopes (sections) of receptor proteins located on the surface of smooth muscle cells.
  • peptides with a long amino acid chain and protein fragments are selected that bind to smooth muscle cells, recognizing complex secondary and tertiary structures on their surface.
  • Amino acid sequences in each of the two groups are then sequentially analyzed according to the following algorithm: 1) they look for homology with known amino acid sequences recorded in international molecular biological databases using matching algorithms provided via the BLAST server (www.psc.plm.pih.gov / BLAST /) and ExPaSy (www.expasy.org/tools/#align); 2) determine the primary structure and physicochemical characteristics of the peptides using NHH algorithms provided through the ExPaSy server (http://www.expasy.org/tools/) in combination with stand-alone packages that are freely available.
  • hydrophobicity profile is determined, as well as the average charge and average hydrophobicity in terms of a chain link for the entire peptide molecule; 3) determine the elements of the secondary and tertiary structure of peptides by comparing the sequences from the database of protein molecules (http://www.wwpdb.org/) with the post- specific peptides, for example, using the WebLab WieWerPro v4.0 software package (Molesoular Simulatiops Ips, Sap Diego, CA, USA).
  • Possible binding sites of specific peptides with protein molecules on the surfaces of smooth muscle cells are detected by comparing alignments of peptide fragments in a multidimensional space, using data obtained for the first and second groups of amino acid sequences simultaneously.
  • Example 9 Designing matrices from amino acid sequences, creating a peptide construct and reading new peptides (see FIG. 3). Matrix design is carried out by unifying polypeptide chains, using the smallest number of amino acid units to produce peptides with minimal complexity (to reduce the time and cost of peptide synthesis) and maximum specificity of binding by the cells of the chosen type (to reduce the number of peptides when used in diagnostic and therapeutic applications ).
  • Matrices are constructed from amino acid sequences in 2 steps.
  • a set of short matrices (no more than 5 amino acids) is created by overlapping short sections that occur with the highest frequency in the analyzed amino acid sequences, using, for example, the CLastal W software package (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2 /index.html).
  • short matrices combine in groups of 3 and more with overlapping sites on the C- and N-ends of the peptides of no more than 2 amino acids.
  • a full-sized peptide construct is formed by adding to the C-end of the matrix obtained in the second stage, the sequence of the linker and the detection signal.
  • the resulting peptide constructs are used to read specific peptides in such a way that at least one of the peptides read contains the original sequence of the peptide selected at the selection stage, while the others are the most distinct combinations of amino acid units.
  • the reading of new specific peptides is carried out in blocks comprising at least 2 triplets (6 peptides).
  • Example 10 Chemical synthesis of new peptides.
  • Peptides that specifically recognize a specific cell type are synthesized on a solid carrier using an apparatus for automating the chemical synthesis of peptides, for example, PE Biosystems Pioneer® (Foster Cite, CA, US A.), using a thermostatic column filled with 2-chloroprotein chloride carrier (replacement 0.27 mmol / g of carrier glycine), maintaining a constant temperature of 50 0 C.
  • the attachment of the first amino acid from the C-end of the peptide is carried out according to the technical documentation of the apparatus for automating chemical synthesis.
  • Each subsequent amino acid is attached using a fourfold excess of a mixture of fluoryl-9-ylmethoxycarbonyl amino acids, TBTU (O- (Benzotipol-izol-1-yl) -N, N, N ', N'-T'-tetramethyluronium tetrafluoroborate) and diisopropyl-ylaminoylmethylamine. : 1.7, by volume) in a solution that prevents aggregation (dimethylformamide / N-methylpyrrolidone (3: 1, by volume), 1% Triton X-100 and IM ethylene carbonate).
  • the synthesis process is periodically stopped and a sample is taken to assess the quality of the reaction using mass spectrometry with ionizing sputtering, for example (ESI) -MS, (Perkip Elmer / Ssieh API I, PE Biosystems, Foster Citu, CA, USA).
  • ESI mass spectrometry with ionizing sputtering
  • MS mass spectrometry with ionizing sputtering
  • the crude peptides are reduced within 60 minutes, at a temperature of 60 ° C in a 10-fold excess solution of tric- (2-carboxyethyl) - phosphine hydrochloride, prepared in a buffer solution containing 6M gunidine chloride and O 5 IM sodium citrate (pH 3.0).
  • the peptides are immediately desalinated by liquid chromatography on a C 18 column, for example, Waters Delta-Pak® Ci 8 (15 ⁇ m, 300 A, 25 mm * 100 mm) in solvents saturated with molecular nitrogen, and the accompanying purification oxidation of peptide molecules is controlled.
  • concentration of the peptides after purification is preliminarily estimated by the absorption of tryptophan and tyrosine molecules at a wavelength of 280 nm, and the exact values are calculated using the protein oxidation test with bi-quinone compounds.
  • Example 11 Confirmation of the specificity of new peptides.
  • the confirmation of specific recognition of smooth muscle cells by new synthesized peptides is carried out, for example, by the method of immunofermental analysis described in Example 7, using instead of the first antibody, not a phage particle, but the resulting peptide.
  • 40 ⁇ g of the peptide is incubated with cells for 40 minutes at a temperature of 37 ° C, after which the cells are fixed by placing them in a 100% solution of methyl alcohol for 10 minutes at -20 ° C. Then the cells are washed with HBSS buffer containing 0.1% saponin and 1.0% dry milk (by weight), and incubated for 10 minutes with a solution of the second antibody.
  • the specificity of recognition of smooth muscle cells by new peptides is expressed in relative units and compared with the specificity of any phage particles selected randomly from a variety of libraries described in Example 4 before selection.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к генной инженерии. Способ получения пептидов, специфично распознающих клетки определенных типов, в том числе в различных патологических состояниях, при котором конструируют множество библиотек случайных пептидов на основе олигонуклеотидных фрагментов, кодирующих их, путем фрагментации суммарной РНК клеток определенного типа и клеток других типов, которые могут быть вовлечены в патологический процесс и оказывать влияние на его диагностику и терапию. При этом клонируют указанные фрагменты в правильной ориентации в векторе на основе бактериофага. Затем выполняют скрининг библиотек в несколько этапов с использованием комбинаций клеток определенного типа и клеток других типов с получением групп пептидов, специфично распознающих клетки выбранного типа в составе вектора. Из полученных пептидов, выделяют и тестируют индивидуальные пептиды в составе фаговых частиц с использованием комбинированных тестов для подтверждения их специфичности в отношении клеток определенного типа. Для получения пептидов в чистом виде создают матрицы на основе аминокислотных последовательностей пептидов в составе фаговых частиц, с которых затем считывают последовательности новых пептидов и синтезируют их химическим путем, с последующим подтверждением специфичного распознавания клеток определенного типа.

Description

Способ получения пептидов, специфично распознающих определённые типы клеток и предназначенных для терапевтических целей
Изобретение относится к генной инженерии, в частности к способам получения пептидов, которые способны специфично распознавать определённые типы клеток и могут быть использованы в диагностике, терапии и фармацевтических приложениях.
В настоящее время одной из главных проблем является повышение уровня сердечнососудистых, раковых и иммунных заболеваний. В большинстве случаях, первоисточниками таких нарушений является быстротечная неконтролируемая пролиферация тканево-клеточных структур, что затрудняет и осложняет их диагностику и терапию. Поэтому, первоочередным условием является своевременное выявление патологического состояния, разработка и доставка лекарственных пре- паратов, блокирующих клеточную активность в очагах заболеваний.
Известны терапевтические ингибиторы для сосудистых гладкомышечных клеток, которые используют для подавления клеточной активности и/или уничтожения клетки путем целевой доставки терапевтических агентов в очаги активной пролиферации (см. пат. США Я≥6515009 от 04.02.2003г., МКП A61K31/40). Для ингибирования роста сосудистых гладкомышечных клеток, согласно данного патента, используются терапевтические коньюгаты, которые содержат лекарственный препарат, ассоциированный с пептидом или белком, специфическим образом связывающийся с клеточной мембраной сосудистых гладкомышечных клеток (например, моноклональные и поликлональные антитела, факторы роста, поли- пептидные гормоны, цитокины и им подобные) или с элементом внутри- или внеклеточного матрикса (например, макромолекулы, распознающие рецепторы интегринов и фибронектинов, а также эпитопы коллагена и внеклеточных глико- протеинов) этих же клеток. Один из таких пептидов, например, содержит последовательность аминокислот, специфически узнающую хондроитинсульфат про- теогликан, с предположительным молекулярным весом около 250 килодальтон, экспрессируемым на мембранах сосудистых гладкомышечных клетках. Такая же последовательность аминокислот находится в регионах, обуславливающих ком- плементарность монокл (шального антитела NR-AN-Ol и/или его функциональных эквивалентов.
Недостатками данного изобретения является использование пептидов, которые распознают белки с выраженной экспрессией в ряде других функцио- нально важных клеток и тканей, это ведёт к тому, что данный терапевтический коньюгат может связываться и с другими типами клеток не гладкомышечного происхождения, как, например, клетки нейроглии, костной ткани и другие, что приводит к нежелательной аккумуляции лекарственного препарата в данных клетках и побочному цитотоксическому эффекту (нежелательной клеточной ги- бели). Кроме того, при использовании антител в качестве ведущих составляющих коньюгатов, их размер, ввиду плотного внеклеточного матрикса, может стать препятствием при проникновении коньюгата в очаг пролиферации, причем кросс- реактивность антител к другим молекулярным структурам снижает их специфичность. Известен также способ целенаправленной доставки пептидов к сосудистым гладкомышечным клеткам iп vitrо и iп vivо, с целью доставки лекарственных препаратов к рестенозной бляшке посредством пептидов, встроенных в фаговые частицы, которые связываются с пролиферирующими сосудистыми гладкомышечными клетками из библиотеки синтетических 15-ти членных пептидов, сконструированной случайным образом (см. статью Ingrid N. Мiсhоп еt аl. "Таrgеtiпg оf рерtidеs tо rеstепоtiс vаsсulаr smооth musсlе сеlls usiпg рhаgе disрlау iп vitrо апd iп vivо" в журнале "Вiосhimiса еt Вiорhуsiса Асtа" вып. N21591, 2002г., стр.87-97). Отобранные пептиды посредством многократного повторения одноэтапного скрининга, в дальнейшем проходят подтверждение специфичности, исключительно, методом иммуноферментного анализа и визуализируются с помощью иммунофлюоресценции, при этом обнаруживают два пептида с консервативной аминокислотной последовательностью, такие как 5G6 (N'- СNIWGVVLSWIGVFРЕС-С') И 5E5 (N'-СЕSLWGGLМWТIGLSDС-С).
Недостатками данного способа являются использование одной исход- ной библиотеки на основе синтетических случайно ориентированных пептидов, не имеющих аналогов в природе, что определяет их первично низкую специфичность и селективность, а также высокую иммуногенность. Кроме того, много- кратное повторение одноэтапного скрининга приводит к ослаблению специфических взаимодействий и наращиванию неспецифических.
В основу заявленного изобретения поставлена задача, создать способ получения пептидов, специфично распознающих определённые типы клеток с высокой степенью селективности, которые предназначены для терапевтических целей.
Поставленная задача достигается путем осуществления нового способа получения пептидов, специфично распознающих определённые типы клеток, при котором предусматривают конструирование фаговой библиотеки случайных пеп- тидов на основе кодирующих их олигонуклеотидных фрагментов, её скрининг для получения пептидов, связывающихся с определённым типом клеток, и подтверждают специфичность отобранных пептидов, при этом, согласно изобретению,
- олигонуклеотидные фрагменты, кодирующие случайные пептиды, полу- чают реакцией обратной транскрипции с использованием случайных праймеров и суммарных РНК клеток определённого типа и клеток других типов, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его диагностику и терапию,
- указанные олигонуклеотидные фрагменты встраивают в бактериофаговые векторы в правильной ориентации и используют для создания фаговых библиотек случайных пептидов для клеток всех типов, использованных для выделения суммарных РНК,
- скрининг полученных фаговых библиотек случайных пептидов проводят в два этапа, на первом из которых отбирают пептиды, способные связываться с клетками определённого типа, а на втором - из отобранных на первом этапе пептидов отбирают пептиды, не связывающиеся с клетками других использованных типов,
- подтверждают специфичность пептидов в составе бактериофаговых частиц к клеткам определённого типа, используя комбинации различных тестов, - определяют первичные последовательности олигонуклеотидных фрагментов кодирующих пептиды в составе отобранных фаговых частиц, и транслируют их в аминокислотные последовательности с дальнейшим проведением анализа полученных последовательностей,
- конструируют матрицы из аминокислотных последовательностей пептидов, на основе их физико-химических характеристик, включающие линкер и сиг- нал обнаружения,
- считывают последовательности новых пептидов с матриц и синтезируют такие пептиды химическим путём, с последующим подтверждением специфичности полученных пептидов в отношении клеток определённого типа.
При осуществлении данного способа получают пептиды, специфично рас- познающие клетки определенных типов, которые могут использоваться для доставки лекарственных препаратов в места непосредственного их действия, с целью профилактики и/или терапии нарушений, связанных с функционированием клеток определённых типов, или для непосредственного использования полученных пептидов как лекарственной формы в терапевтических приложениях. Кроме того, использование таких пептидов, или их фрагментов, позволит диагностировать нарушения функционирования клеток определённых типов и прогнозировать их лечение.
Заявленный способ позволяет получать высокоспецифичные и высокоселективные пептиды к клеткам определенного типа. Способ получения пептидов поясняется схемами и иллюстрациями, где: фиг.1 — показано синтез кДНК и конструирование библиотек; фиг.2 - изображена схема одно- и многошагового скрининга; фиг.З — изображена схема пептидного конструкта (матрицы). Способ получения пептидов осуществляют таким образом. Вначале, проводят отбор и разделение клеточных популяций на типы: клетки, которые должны быть специфично распознаны пептидами, и клетки, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию, распознавание которых при этом является не желательным. Затем, конструируют серии библиотек случайных пеп- тидов с использованием суммарной клеточной РНК в векторе вирусного типа на основе ДНК бактериофагов. Сначала изолируют суммарную РНК общеизвестными методами с адаптационными модификациями, с последующей, в случае необходимости, очисткой её и выделением фракции матричной РНК. Качество такой РНК анализируют и в дальнейшем, используют РНК в реакциях обратной транскрипции, направляемых праймерами, как случайного происхождения, так и комплементарными к поли А участку матричных РНК.
На этом этапе осуществляют первичное разделение суммарной клеточной РНК посредством контролируемого синтеза фрагментов кДНК ограниченных в размере и гетерогенности, что достигается использованием различных концен- траций ионов в реакционной смеси, комбинацией праймеров, количеством исходного материала и режимов температур.
Вторичное разделение клеточной РНК осуществляют на этапе фракционирования и очистки полученных молекул кДНК для чего используют гель- фильтрацию таким образом, что после элюции пул кДНК молекул состоит из 2-х частей: фракции с количеством нуклеотидных звеньев менее 500 и фракции состоящей из молекул размером более 500 пар оснований.
Такое разделение позволяет в первом случае, создание библиотек направленных на определение точных мест взаимодействия молекулы пептида с молекулами на поверхности клеток распознаваемого типа, а во втором случае, иден- тифицировать фрагмент нуклеиновой кислоты, ответственный за синтез данного пептида или белкового фрагмента.
Далее, на стадии встраивания фрагментов кДНК в бактериофаговый вектор в правильной ориентации, полученные в результате деления и синтеза, молекулы кДНК легируют с олигонуклеотидными линкерами, синтетически синтезирован- ными и содержащими места узнавания для эндонуклеаз рестрикции, используемых для обработки и подготовки вектора для клонирования. Для этого, концы кДНК вначале обрабатывают с помощью ДНК полимеразы и только потом, такие фрагменты легируют с линкерами и инкубируют с эндонуклеазами рестрикции. Используя данные линкеры, становится возможным получить фрагменты кДНК, которые содержат на разных концах места узнавания для используемых эндонуклеаз рестрикции, в таком расположении, что могут быть беспрепятственно клонированы в вектор в определенной ориентации (смысловое клонирование). Одновременно с этим, бактериофаговый вектор обрабатывают эндонуклеа- зами рестрикции, с целью получения фрагментов пригодных для легирования с синтезированными фрагментами кДНК. Полученные, в результате легирования фрагментов кДНК и молекул вектора, рекомбинантные молекулы, упаковывают iп vitrо и инициируют экспрессию данного фрагмента посредством одного цикла репликации. Затем, определяют количество рекомбинантов в библиотеке и абсолютное число частиц.
После этого, проводят скрининг (отсев) таких библиотек, используя комбинации клеток определённого типа и клеток других типов, которые могут быть во- влечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию. При этом скрининг осуществляют многократным повторением раундов инкубации с клетками, отмывок фаговых частиц, которые не связались с клетками, растворами различной ионной силы и растворами различной способности нарушать белок - белковые взаимодействия, с последующей элюцией и амплификацией искомых фаговых частиц. Причем, в случае прямого скрининга, определённо - рассчитанное количество фаговых частиц в буфере, сначала инкубируют с материалом, который используют для культивирования клеток, а потом остаточную фракцию (супернатант), содержащую свободные фаги, переносят на клетки определённого типа. В случае, многошагового скрининга, а именно, использования комбинаций нескольких типов клеток, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию, супернатант после инкубации с материалом направляют на эти клетки, после которых супернатант направляют либо на клеток распознаваемого типа, либо на следующий тип клеток, которые могут быть во- влечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию, а потом супернатант инкубируют с клетками распознаваемого типа. Аналогично проводят скрининг, если используются клетки определённого типа и клетки других типов, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию, в различных структурно-функциональных состояниях. Таким образом, результатом многошагового скрининга является группа пептидов в составе фаговых частиц, обладающая выраженной специфичностью в отношении клеток определённого типа.
Далее из вышеуказанных групп, выделяют индивидуальные фаговые час- тицы и их тестируют.
В одном случае, тестируемый фаг нарабатывают (наращивают) в необходимом количестве, очищают и испытывают как первое антитело в прямом имму- ноферментном анализе (ИФА), где антигеном выступают культивируемые клетки, определённых типов в различных функциональных состояниях. При исследовании большого количества фаговых частиц, проводят микроселекцию. Для этого, исходную группу рассеивают до получения индивидуальных бляшек, которые затем элюируют буфером для инкубации в ИФА и используют непосредственно, как источник первого антитела в ИФА, без предварительного наращивания и очистки. В другом случае, индивидуальный клон аналогично первому случаю, ам- плифицируют, очищают и инкубируют одновременно с клетками распознаваемого типа и клетками, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию. После чего, отмывают клетки, элюируют связанные частицы и определяют их титр, затем сравнивают его с титром, полученным для клеток другого типа.
В третьем случае, используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР), в анализе специфичности пептидов, в составе фаговых частиц, при этом, несколько фагов очищают и смешивают в одинаковых количествах, потом инкубируют с клетками распознаваемого типа и клетками, которые могут быть вовлечены в па- тологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию, элюируют, рассеивают до отдельных бляшек, которые отбирают парами, выделяют ДНК и используют её в качестве матрицы для ПЦР. Так определяют количественное распределение и степень специфичности пептидов, в составе фаговых частиц. Также определяют стабильность пептидов и способность интернализиро- ваться в составе фаговых частиц, которые проверяют, инкубируя фаг с клетками определённого типа при различных режимах температуры и времени, с последующим элюированием жизнеспособных фагов.
Для получения индивидуальных пептидов распознающих клетки определённого типа вне фаговых частиц, ДНК бактериофага выделяют, и посредством полимеразной цепной реакции амплифицируют олигонуклеотидные фрагменты, кодирующие пептиды в составе фаговой частицы, специфично распознающие клетки определённого типа. Первичные нуклеотидные последовательности этих фрагментов определяют методом дидезокси-секвенирования по Сэнгеру используя автоматический секвенатор. Полученные нуклеотидные последовательности транслируют в рамке считывания для получения аминокислотных последовательностей пептидов находящихся в составе фаговых частиц. Далее проводят компьютерный анализ полученных аминокислотных последовательностей, используя, общедоступные пакеты программ для анализа биологических макромолекул, при этом определяют физико-химические и структурные характеристики пептидов. На основе данных компьютерного анализа, конструируют матрицы из аминокислотных последовательностей пептидов специфично распознающих клетки определённых типов. Для чего, на первом этапе аминокислотные последовательности группируют в короткие (до 5 аминокислотных звеньев) матрицы, которые на втором этапе объединяют в длинные матрицы (не менее 15 аминокислотных звеньев) комбинируя минимум по три и более коротких матриц. На завершающем этапе к полученным матрицам из аминокислотных последовательностей добавляют последовательности линкера и сигнала обнаружения. Для получения пептидов в чистом виде, с конструированных матриц считывают последовательности новых пептидов и синтезируют такие пептиды химическим путём. Далее пептиды очи- щают до готовности, с последующим подтверждением специфичности полученных пептидов к клеткам определённых типов.
Примеры конкретного выполнения заявленного способа.
Пример 1. Выбор клеточных популяций.
Для получения пептидов высокоспецифичных к например, сосудистым гладкомышечным клеткам (СГМК), используют их в качестве клеток распознаваемого типа, а клетки, взаимодействующие с ними, как в составе стенки кровеносного сосуда (эндотелиальные), так и переносимые током крови (фибробласты) используют в качестве клеток, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию. Клетки карциномы цервикального канала - HeLa, и клетки карциномы печени - Hep-G2 также используют, как клетки, которые могут быть вовлечены в патоло- гический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию.
Культуру СГМК инициируют из магистральных кровеносных сосудов пациентов с патологиями сердечнососудистой системы. Целый ряд клеточных линий доступен в виде коммерческих препаратов. Например, параллельно культу- рам клеток, полученным при обработке артерий и вен пациентов, использовали гладкомышечные клетки коронарной артерии (CeIl Sуstеms GmbН, Lot# 17151,Catalog # CC-2583). Препараты исходной культуры СГМК являются первичными в своём происхождении, и имеют ограниченное количество дупликаций, что лимитирует количество последующих пересевов. Поэтому, во всех случаях инициируют культуры, для последующего исследования используя образцы клеток, имеющих не более чем 6 делений. Для культивирования используют пластиковые флаконы, произведенные исключительно для работы с культурами тканей, общей площадью поверхности для роста от 25 до 182 квадратных сантиметров (например, флаконы типов -T25,T75,T182). Сосудистые гладкомышечные клетки культивируют, используя питательную среду, которая состоит на 1/3 из каждого следующего компонента - Wауmоuth (GIBCO BRL Саt. # 31220-023), F 12 (GIBCO BRL Саt. # 31220-023), SMCBM (Рrоmосеll Саt. # C-22260). Такую среду дополняют, предварительно инактивированной инкубацией 30 минут при температуре 56 0C на водяной бане, сывороткой плода коровы (GIBCO BRL Саt. # CC-4102) до конечной концентрации - 15%, а также раствором пенициллина/стрептомицина (GIBCO BRL Саt. # 15140-114) до конечной концентрации -1,5%. Среду, содержащую в своём составе сыворотку плода коровы, называют обогащенной. Сосудистые гладкомышечные клетки, блокированные на стадии роста, культивируют, используя обеднённую питательную среду, т.е. без добавления сыворотки плода коровы, но с добавлением раствора пенициллина/стрептомицина в вышеуказанной концентрации. Для блокирования сосудистых гладкомышечных клеток на стадии роста, их сначала культивируют, пока размер монослоя не достигнет 90% от всей площади роста, используя обогащенную питательную среду, и лишь, затем проводят замену обогащенной питательной среды на обеднённую и продолжают инкубацию в течение 72 часов, проводя замену старой питательной среды на новую, каждые 24 часа. Эндотелиальные клетки культивируют, используя питательную среду -
EGM-2 (Сlопеtiсs Соmрапу, Саt. # CC-3202), дополненную прилагающимся к ней пакетом комплементации - EGM-2 MV (Сlопеtiсs Соmрапу, Саt # CC-4147), который содержит факторы роста, гормоны и инактивированную сыворотку плода коровы, конечная концентрация которой в среде после комплементации составляет 10%. Эндотелиальные клетки инициируют из препарата (Рrоmосеll Саt. # CC- 2519). Блокируют эндотелиальные клетки на стадии роста аналогично тому, как в случае сосудистых гладкомышечных клеток.
Фибробласты культивируют, используя питательную среду, основой которой является стандартная среда DMEM (GIBCO BRL) дополненная инактивиро- ванной сывороткой плода коровы до конечной концентрации 10%, и раствором пенициллина /стрептомицина до конечной концентрации 1,5 %. Инициируют культуру клеток фибробластов из препарата пациентов с патологиями сердечнососудистой системы и блокируют также, как это описано для сосудистых гладко- мышечных клеток. Клетки HeLa ЗТЗ и клетки Hep-G2 представляют собой иммортализован- ные линии, поэтому практически любой доступный образец клеток используют для инициирования культуры, однако, стараются использовать клетки прошедшие не более 100 делений. Для культивирования этих клеток используют питательную среду на основе, какой- либо из MEM - композиций (GIBCO BRL), дополненную сывороткой плода коровы в конечной концентрации 15-20 % (что определяется желаемыми скоростями роста) и раствором пенициллина/стрептомицина в конечной концентрации 1,5 %. Для получения достоверных результатов скрининга данные типы клеток также подвергают культивированию с использованием обеднённой питательной среды, имитируя блокирование роста сходное с таковым на- блюдаемым для первичных типов клеток (СГМК, эндотелиальные и фибробласты).
Пример 2. Выделение РНК и реакции обратной транскрипции (см. фиг. 1) На основе первичного отбора клеточных популяций выделяют РНК, как из клеток определённого типа, так и из клеток, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию. Клетки всех типов наращивают в течение 5-7 суток, используя флаконы типа T75 и 18 мл питательной среды, замену которой производят каждые 24 часа. Сосудистые гладкомышечные клетки культивируют в 40 флаконах, из расчёта 3,5* 105 клеток на флакон. Эндотелиальные клетки культивируют в 20 флаконах, из расчёта 3* 105 клеток на флакон. Клетки HeLa и Hep-G2 культивируют в 20 флаконах, из расчёта 1,6* 105 клеток на флакон. Клетки интенсивно промывают 2 раза, используя 12 мл буфера HBSS (сбалансированный солевой раствор по Хэн- ксу) каждый раз, далее обрабатывают в течение 3 минут, используя 6 мл раствора содержащего 0,05% трипсина и 0,53 мМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетата), и нейтрализуют добавлением 9 мл буфера HBSS. Собирают клетки центрифугиро- ванием в течение 10 минут на 3000*g, и промывают 3 раза, используя 20 мл буфера HBSS. Число клеток определяют с помощью камеры для счёта клеток, для этого смешивают 50 мкл суспензии клеток с равным объёмом 15%-oгo раствора три- панового голубого, являющегося витальным красителем. Число живых клеток фиксируют и рассчитывают общее число клеток в суспензии. В случае использования методов грубой экстракции гуанидинизотиоциана- том, как с последующим осаждением солями лития, так и без осаждения, клетки концентрируют центрифугированием, супернатант удаляют, а осадок ресуспен- дируют интенсивно в буфере для лизиса (5,25M гуанидинизотиоцианата; 50мM Трис-Сl, рН 6,4; 20мM ЭДТА; 1% Тритон X-100; 0,1M 2-мepкaптoэтaнoлa) из рас- чёта 1 мл на 107 клеток. К данному раствору добавляют 0,1 объёма 2M р-ра ацетата натрия, 1 объём р-ра водного фенола, 0,3 объёма смеси хлороформ - изоамило- вый спирт (в соотношении 24:1, по объему) и интенсивно перемешивают в течение 30-60 секунд. Инкубируют полученную смесь 15 минут при температуре O0C, после чего центрифугируют в течение 30 минут на 8000 *g при температуре 40C, с целью разделения водной и органической фаз. Водную фазу после осаждения переносят в новую пробирку и добавляют к ней 0,6 объёма изопропилового спирта, предварительно охлаждённого до температуры -200C, перемешивают и помещают на период не менее 60 минут в охладитель с температурой -700C. После инкубации раствор центрифугируют 30 минут на 12000*g при температуре 40C, супер- натант тщательно удаляют, а осадок промывают несколько раз центрифугированием по 5 минут в присутствии 1 мл 70%-го раствора этилового спирта. Получен- ный осадок растворяют в 0,4 мл воды обработанной диэтилпирокарбонатом (ДЭПК).
В случае применения методов мягкой экстракции с использованием про- теиназы К, клетки концентрируют центрифугированием, супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют интенсивно в предварительно охлаждённом буфере для лизиса (0Д5M хлорида натрия; ЮмМ Трис-Сl, рН 8,5; 0,05% NP-40; 0,01% 3- карбоксиауриновой кислоты; 0,1M 2-мepкaптoэтaнoлa) из расчёта 1 мл на 5*10 клеток. Затем, смесь центрифугируют 2 минуты на 12000*g и температуре 40C, супернатант переносят в новую пробирку и добавляют равный объём буфера для протеиназы К (0,2M Трис - Ацетат; 0,ЗM натрия ацетат; 0,05M ЭДТА, рН 7,5; 2% (по весу) натрия додецил сульфата) содержащего 400 мг/мл протеиназы К, и инкубируют 60 минут при температуре 370C. Далее, добавляют 1 объём смеси фенол - хлороформ - изоамиловый спирт (в соотношении 25:24:1) и интенсивно перемешивают 5 минут при комнатной температуре. После чего, смесь центрифугируют 2 минуты на 12000*g при комнатной температуре, полученную водную фазу переносят в новую пробирку и повторяют экстракцию смесью фенол — хлороформ - изоамиловый спирт (в соотношении 25:24:1) несколько раз. К водной фазе, полученной в результате экстракции, добавляют 2,5 объёма абсолютного этилового спирта, интенсивно перемешивают, и осаждают РНК, помещая образец на 30 минут в охладитель с температурой -700C. Далее раствор, содержащий РНК, цен- трифугируют 10 минут на 12000*g при температуре 40C, и полученный осадок промывают 3 раза центрифугированием 5 минут на 12000*g , в присутствии 700 мкл 70%-го раствора этилового спирта. Осадок осушают 2,5 минуты под вакуумом и растворяют в 0,4 мл воды, обработанной ДЭПК.
Полученный в результате первичной экстракции раствор суммарной iсле- точной РНК, подвергают обработке дезоксирибонуклеазой первого типа, с целью удаления фрагментов ДНК, способных попасть в раствор РНК в процессе ее экстракции и способных затруднять дальнейшее фракционирование такой РНК и ис- пользование её в реакциях обратной транскрипции. Для этого, к 0,4 мл раствора, содержащего 4 мг/мл РНК, добавляют 12 мкл (480 единиц) ингибитора рибонук- леаз (Iпvitrоgеп, Саt # 10777-019), 50 мкл 10-ти кратного стандартного буфера для дезоксирибонуклеазы и 50 мкл (500 единиц) дезоксирибонуклеазы первого типа (GIBCO BRL). Затем, полученную смесь инкубируют 2 часа при температуре 370C, и реакцию останавливают одновременным добавлением ОД объёма ЗМ р-ра ацетата натрия (рН 5,2), 1,1 объёма раствора водного фенола, 0,3 объёма смеси хлороформ - изоамиловый спирт (в соотношении 24:1). Раствор интенсивно перемешивают в течение 1 минуты, инкубируют 15 минут при температуре O0C и центрифугируют 10 минут на 12000*g, при температуре 40C. Водную фазу переносят в новую пробирку и осаждают РНК с помощью абсолютного этилового спирта, как описано выше.
Для выделения фракции матричной РНК (мРНК), 1-2 мг суммарной РНК растворяют в 5 мл буфера для нанесения (прилагается к колонке), и наносят на колонку, содержащую олиго - (дТ) - целлюлозу (Sigmа, Саt #03131), предварительно промытую 3 раза 1 мл буфера для нейтрализации (прилагается к колонке). После экстракции колонку промывают 5 раз, используя 1 мл буфера для нейтрализации и связанную мРНК элюируют 1,5 мл буфера для элюции. В дальнейшем, мРНК, содержащуюся в полученном растворе, осаждают добавление 150 мкл р-ра ЗМ ацетата натрия (рН 5,2) и 3,75 мл абсолютного этилового спирта. Пример 3. Синтез кДНК и фрагментация суммарной РНК. С целью получения молекул кДНК для клонирования, суммарную РНК и/или мРНК используют в реакциях обратной транскрипции направляемых РНК - зависимой - ДНК - полимеразой. Для этого, смешивают 0,001-5,000 мг суммарной РНК и 1 мкл праймера
(500 мкг олиго - (дТ) или 0,050 - 0,250 мкг случайного связывающегося праймера, 5'-TTNNNNNN-3'), к которым добавляют 1 мкл 10 мМ р-ра дезоксирибонуклео- тидов (10 мМ каждого в нейтральном растворе) и доводят объём смеси до 12 мкл используя дважды дистиллированную воду, обработанную диэтилпирокарбона- том. Полученную смесь инкубируют 5 минут при температуре 650C, быстро охлаждают и добавляют 4 мкл 5-ти кратного буфера для синтеза первичной цепи кДНК (250 мМ Трис - Cl, рН 8,3; 375 мМ калия хлорида; 15 мМ хлорида магния), 2 мкл ОД M р-ра дитиотриэтола (ДТТ), 1 мкл (40 единиц) ингибитора рибонукле- аз. Содержимое пробирки интенсивно перемешивают и инкубируют 2 минуты при температуре 420C, после чего, добавляют 1 мкл (200 единиц) Suреrsсriрt II РНК - зависимой - ДНК-полимеразы (GIBCO BRL, Саt. #18064-014) интенсивно перемешивают и инкубируют 60 минут при температуре 42 С. Реакцию обратной транскрипции останавливают посредством инактивации фермента, для чего смесь инкубируют 15 минут при температуре 700C. С целью удаления фрагментов РНК комплементарных новосинтезированным молекулам кДНК и затрудняющих последующую амплификацию кДНК с помощью ПЦР, к раствору добавляют 1 мкл (2 единицы) рибонуклеазы H и инкубируют 20 минут при температуре 370C.
На этом этапе осуществляют первичное разделение суммарной РНК посредством контролируемого синтеза фрагментов кДНК ограниченных в размере и гетерогенности, что достигается использованием различных концентраций ионов в реакционной смеси, комбинацией праймеров, количеством исходного материала и режимов температур.
Синтез 2-ой цепи кДНК осуществляют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), для чего используют не более 10% конечного раствора после обработки рибонуклеазой H. Собирают смесь последовательным добавлением 5 мкл 10-ти кратного буфера для ПЦР (200 мМ Трис- Cl, рН 8,4; 500 мМ хлорида ка- лия), 1,5 мкл 50 мМ р-ра хлорида магния, 1 мкл 10 мМ р-ра дезоксирибонуклео- тидов, 0,5 мкл (2,5 единиц) Таq -ДНК-полимеразы, 2 мкл р-ра кДНК (конечный продукт реакции синтеза первичной цепи кДНК), 38,1 мкл воды обработанной ДЭПК. Раствор интенсивно перемешивают и инкубируют в течение 2 минут при температуре 940C. Затем проводят 15-40 стандартных циклов амплификации ПЦР.
С целью получения фрагментов пригодных для клонирования, концы молекул кДНК обрабатывают и легируют с синтетическими олигонуклеотидными линкерами, которые содержат в своём составе место узнавания для эндонуклеазы рестрикции - Есо Rl и частично место узнавания для эндонуклеазы рестрикции - Нiпd III. Это позволяет получить после обработки таких линкеров соответствующими эндонуклеазами рестрикции, молекулы кДНК способные эффективно легироваться с 5'- конца только с Есо Rl обработанной ДНК, и с 3'- конца только с Hind III обработанной ДНК. Для этого, к 20 мкл (не более 10 мкг) раствора молекул кДНК добавляют 3 мкл 10-ти кратного буфера для T4 ДНК- полимеразы (200 мМ Трис-Сl, рН 8,4; 500 мМ хлорида калия), 1,5 мкл 100 мМ р-ра ДТТ, 3 мкл 1 мМ р-ра дезоксирибонуклеотидов, и 1,0 мкл (1,5 единиц) T4 -ДНК-полимеразы, и доводят конечный объём раствора до 30,0 мкл, используя дважды дистиллированную воду обработанную ДЭПК. Раствор медленно перемешивают и инкубируют в течение 20 минут при температуре H0C. Реакцию останавливают добавлением равного объёма смеси фенол - хлороформ - изоамиловый спирт (в соотношении 25:24:1) и затем ДНК, которая содержится в водной фазе, осаждают до- бавлением растворов ацетата натрия и абсолютного этилового спирта как описано выше. Полученный осадок, который содержит молекулы кДНК, растворяют в 10 мкл дважды дистиллированной воды обработанной ДЭПК. Олигонуклеотидные линкеры фосфориллируют посредством инкубации с T4 - полинуклеотидкиназой, непосредственно перед использованием в реакции легирования. Для этого соби- рают смесь последовательным добавлением к 10 мкл р-ра молекул кДНК (с предыдущего этапа), 2 мкл 10-ти кратного буфера для легирования (10x= 200 мМ Трис-Сl, рН 7,6; 50 мМ хлорида калия), 2 мкл 1 мМ р-ра АТФ, 2 мкл (100 пико- моль) р-ра олигонуклеотидных линкеров (5'-GCTTGAATTCAAGC~3' / 3'- CGAACTTAAGTTCG-5'), 2 мкл 100 мМ р-ра ДТТ, 2,0 мкл (5 единиц) T4 - поли- нуклеотидкиназы. Раствор перемешивают и инкубируют в течение 5 минут при температуре 370C. Затем добавляют 6-8 единиц T4 - ДНК - лигазы и инкубируют в течение 6 - 20 часов при температуре 160C.
Далее молекулы кДНК расщепляют с помощью 2-х эндонуклеаз рестрикции - Нiпd III и ЕсоRl. Для этого к раствору кДНК, добавляют 10 мкл 10-ти крат- ного буфера для эндонуклеазы рестрикции Нiпd III, и 10 мкл (100 единиц) эндо- нуклеазы рестрикции Нiпd III (Iпvitrоgеп), объём такой смеси доводят до 100 мкл с помощью дважды дистиллированной воды. Полученную смесь инкубируют в течение 2-х часов при температуре 370C. Затем добавляют 10 мкл 10-ти кратного буфера для эндонуклеазы рестрикции Есо Rl и 10 мкл (100 единиц) эндонуклеа- зы рестрикции Есо Rl (Iпvitrоgеп), и снова инкубируют в течение 4 часов при температуре 370C. Реакцию останавливают добавлением равного объёма смеси фенол - хлороформ - изоамиловый спирт (в соотношении 25:24:1) и затем ДНК, которая содержится в водной фазе, осаждают добавлением растворов ацетата натрия и абсолютного этилового спирта как описано выше.
Вторичное разделение суммарной РНК осуществляют на этапе фракционирования и очистки полученных молекул кДНК, для чего используют гель-фильт- рацию. Хроматографическую колонку, содержащую частицы сефарозы определённого размера промывают 5 раз, используя 1 мл буфера для нейтрализации каждый раз. Наносят разделяемый материал, популяцию кДНК, в объёме 1 мл и собирают фракции по 25 мкл.
Пример 4. Клонирование и создание множества библиотек Создание библиотек проводят по одной модели, как для клеток определённого типа, так и для клеток, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию. Для этого используют, например, ДНК бактериофага T7 (Nоvаgеп, T7 Sеlесt 10-3 вектор), обработанную с использованием 2-х эндонуклеаз рестрикции - Есо Rl и Нiпd III, т.е. того же типа, которые использовались для обработки концов кДНК. Раствор молекул ДНК вектора и раствор молекул кДНК смешивают в отношении 1 :3, в пересчёте на моль вещества, добавляют эквивалентное количество T4 - ДНК - лигазы (GIBCO BRL) и инкубируют не более 28 часов при температуре 16 0C. Реакцию останавливают добавлением равного объёма смеси фенол - хлороформ - изоамиловый спирт (в соотношении 25:24:1), и затем ДНК, которая содержится в водной фазе, осаждают добавлением растворов ацетата натрия и абсолютного этилового спирта как описано выше.
Полученные рекомбинантные молекулы кДНК, в количестве не более 1 мкг, смешивают с 250 мкл р-ра упаковочных белков бактериофага и инкубируют в течение 5 минут при температуре O0C. Затем добавляют питательную среду и продолжают инкубацию ещё 60 минут при температуре 370C. Пример 5. Амплификация бактериофагов.
Бактериофаг T7 культивируют, используя штамм Е.соli BLT5403 в качестве хозяина. При этом амплификацию проводят несколькими путями. В одном случае, микроамплификация, единичную бляшку или элюат после скрининга, или какое-либо другое малое количество бактериофагов, растворяют в
1 мл питательной среды, приготовленной по методу Луриа - Бертани (ЛБ). Затем добавляют 1 мл культуры штамма-хозяина с оптической плотностью 0,4-0,6 при длине волны 600 нм (OП60o=0,4-0,6), которую инициируют в 50 мл питательной среды ЛБ из 0,5 мл суспензии бактерий, предварительно культивированных в течение 16 часов, и наращивают в течение 2-3 часов. Смесь фагов и бактерий об- щим объемом 2 мл инкубируют при температуре 370C и 200 оборотах в минуту на шейкере в течение 3-4 часов, наблюдая полный лизис, выражающийся просветлением содержимого пробирки.
В другом случае, макроамплификацию проводят, используя колбы посредством инокуляции необходимого числа фагов в 135 мл культуры штамма-хозяина (OП6oo=0,4-0,6) и последующим ростом в течение 4-5 часов до момента полного лизиса.
К лизированным культурам добавляют 0,1 объема 5M р-ра хлорида натрия, интенсивно перемешивают 30 секунд и центрифугируют в течение 3 минут на 7000*g и при температуре 40C. Супернатант переносят в новую пробирку и до- бавляют 1/6 объёма раствора, содержащего 20% полиэтиленгликоля и 2,5M хлорида натрия, интенсивно перемешивают, и инкубируют не менее 3 часов при температуре O0C. Далее, раствор центрифугируют 10 минут на 8000*g , а осадок, содержащий фаги растворяют в 1 мл буфера TBS (Трис - Боратный Буфер) и снова осаждают фаговые частицы добавлением раствора полиэтиленгликоля - хлори- стого натрия с последующей инкубацией и центрифугированием в течение 10 минут на 12000*g и при температуре 40C. Полученный осадок растворяют в 0,2 мл буфера TBS.
Пример 6. Скрининг (см. фиг.2)
Скрининг библиотек осуществляют, как многократным повторением од- ношаговой процедуры, так и с использованием многошаговой комплексной про- цедуры, включающей селекцию на комбинациях различных типов клеток, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию.
Для этого инициируют культуру сосудистых гладкомышечных клеток в чашках Петри диаметром 60 мм из расчёта 64000 клеток на чашку и растят в течение 48 часов. Одновременно, в аналогичных чашках инициируют культуры эн- дотелиальных клеток, фибробластов, HeLa, Hep-G2, соответственно в количествах - 48000, 24000, 16000, 16000 клеток на чашку, и растят в течение 48 часов.
Клетки промывают интенсивно 5 раз по 5 минут, используя каждый раз 3 мл буфера HBSS. При использовании одношаговой процедуры, 1010 фаговых частиц из любой библиотеки, растворяют в 2 мл буфера HBSS и инкубируют 20 минут с пре- инкубационным материалом (пластик). После этого, верхнюю фазу, содержащую не связавшиеся с пластиком фаги, переносят на предварительно промытые сосудистые гладкомышечные клетки и инкубируют 40 минут при температуре 40C. После инкубации, с целью удаления несвязанного материала, клетки интенсивно отмывают 5 раз по 5 минут, используя каждый раз 3 мл буфера HBSS, с последующей элюцией специфично связывающихся фагов с помощью 1 мл буфера для элюции, который содержит в своём составе не более чем 1,0 % додецилсульфата натрия, или с помощью 1 мл свежеприготовленной дневной культуры штамма- хозяина. Титр фагов в элюате определяют, и элюат амплифицируют для получения как минимум 1010 фагов, которые инкубируют с новой порцией преинкубаци- онного материала и новой порцией сосудистых гладкомышечных клеток, повторяя селекционный цикл 3-5 раз.
При использовании многошаговой процедуры, 1010 фаговых частиц из лю- бой библиотеки, растворяют в 2 мл буфера HBSS и инкубируют 20 минут с пре- инкубационным материалом (чашкой Петри, в которой вместо клеток содержалась лишь среда). После этого, верхнюю фазу, содержащую не связавшиеся с пластиком фаги, переносят на предварительно промытые эндотелиальные клетки и инкубируют в течение 40 минут при температуре 40C, с последующим перено- сом верхней фазы на новую порцию эндотелиальных клеток и аналогичной инкубацией, что повторяют 2-3 раза и лишь после этого, верхнюю фазу направляют на фибробласты и проводят сходную селекцию 2-3 раза. Или верхнюю фазу после инкубации на эндотелиальных клетках, без дополнительной селекции на фиброб- ластах, переносят непосредственно на сосудистые гладкомышечные клетки и ин- кубируют в течение 40 минут при температуре 40C. Отмывку и элюцию проводят, как описано выше. В другом случае, верхнюю фазу после инкубации с преинкубационным материалом (чашкой Петри, в которой вместо клеток содержалась лишь среда) переносят на предварительно промытые клетки HeLa и инкубируют с ними в течение 40 минут при температуре 40C, а далее верхнюю фазу переносят на клетки Hep-G2 и инкубируют с ними в течение 40 минут при температуре 40C, после чего верхнюю фазу переносят на новую порцию клеток HeLa и клеток Hep-G2, повторяя комбинированную селекцию 2-3 раза. Конечную верхнюю фазу переносят на сосудистые гладкомышечные клетки и инкубируют в течение 40 минут при температуре 40C. В следующем варианте скрининга, материал, после селекции на имморта- лизованных типах клеток, переносят на эндотелиальные клетки и/или фибробла- сты и лишь затем на сосудистые гладкомышечные клетки.
Пример 7. Выполнение комбинированного тестирования пептидов в составе бактериофаговых частиц. А. Иммуноферментный анализ
Специфичность индивидуальных пептидов в составе фаговых частиц, оценивают, используя их, вместо первого антитела в прямом иммуноферментном анализе, где в качестве антигена выступают клетки определённых типов и клетки других типов, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или спо- собны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию.
Для этого, клетки всех используемых типов культивируют в 96-лyнoчныx планшетах, инициируя культуру из расчёта 10000 клеток на лунку. Клетки растят в течение 48 часов, при этом, проводят замену питательной среды каждые 24 часа. Затем, планшеты промывают интенсивно 5 раз по 5 минут, используя каждый раз 200 мкл буфера HBSS. Далее инкубируют 10б-107 фаговых частиц с клетками в течение 1 часа при температуре 40C, с интенсивной последующей отмывкой буфером HBSS, и инкубацией со вторым антителом, в течение 1 часа при комнатной температуре. В качестве второго антитела используют моноклональное антитело коньюгированное с пероксидазой хрена и распознающее мотив из 11 аминокис- лот (N'-Met-Ala-Ser-Met-Thr-(Gly)2-(Gln)2-Met-Gly-C) (Nоvаgеп, Саt. No.69522), расположенный на N-конце белка JNeIO, входящего в состав капсида бактериофага T7. Затем, планшеты промывают вновь буфером HBSS и производят обнаружение второго антитела, используя субстрат для пероксидазы, расщепление которого останавливают добавлением 50 мкл IM р-ра серной кислоты. Б. Анализ на связывание
Связывание индивидуальных пептидов в составе фаговых частиц с клетка- ми различных типов исследуют, используя одношаговую селекцию, при которой анализируемый пептид тестируют параллельно, на связывание с клетками распознаваемого типа и с клетками других типов, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию. Для этого инициируют культуру клеток СГМК в чашках Петри диаметром
60 мм в расчёте 64000 клеток на чашку и культивируют в течение 48 часов. Одновременно, в аналогичных чашках инициируют культуры эндотелиальных клеток, фибробластов, HeLa, Hep-G2, соответственно в количествах - 48000, 24000, 16000, 16000 клеток на чашку, и растят в течение 48 часов. Используют 109 фаго- вых частиц несущие уникальный пептид, которые растворяют в 2 мл буфера HBSS. Такой раствор инкубируют сначала в течение 20 минут с преинкубацион- ным материалом (чашкой Петри, в которой вместо клеток содержалась лишь среда) и потом переносят верхнюю фракцию на испытуемые клетки, предварительно промытые 5 раз буфером HBSS, длительностью по 5 минут каждый раз. При этом процедуру параллельно совершают, как для сосудистых гладкомышечных клеток (распознаваемый тип клеток), так и для эндотелиальных клеток, фибробластов, клеток HeLa и Hep-G2 (клетки, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию), используя для клеток всех типов 2 режима температур: 40C и 370C. После инкубации, не связавшиеся частицы, интенсивно отмывают, используя буфер HBSS, после чего элюируют используя 1 мл буфера для элюции. Определяют титр фагов в элюате и сравнивают полученные данные для всех типов клеток. При этом, чем больше отношение титра фагов, полученных после элюции с СГМК к титру фагов, полученных с других типов клеток, тем более специфичен пептид в составе фаговой частицы к СГМК, и соответственно, менее специфичен к другим типам клеток.
В. Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) Специфичность индивидуальных пептидов в составе фаговых частиц тестируют, используя ПНР для идентификации клонов, а также для анализа их количественного распределения при взаимодействии с клетками распознаваемого типа и клетками других типов, которые могут быть вовлечены в патологический про- цесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию.
Для этого, инициируют культуру клеток СГМК в чашках Петри диаметром 60 мм в расчёте 64000 клеток на чашку и культивируют в течение 48 часов. Одновременно, в аналогичных чашках инициируют культуры эндотелиальных клеток, фибробластов, HeLa, Hep-G2, соответственно в количествах - 48000, 24000, 16000, 16000 клеток на чашку, и культивируют в течение 48 часов. Фаговые частицы смешивают в эквивалентных количествах, обычно 107 частиц каждого типа, из расчета на конечный объём раствора 2 мл. Полученный раствор фаговых частиц инкубируют сначала в течение 20 минут с преинкубационным материалом (чашкой Петри, в которой вместо клеток содержалась лишь среда) и потом пере- носят верхнюю фракцию на испытуемые клетки, предварительно отмытые 5 раз буфером HBSS, длительностью по 5 минут каждый. При этом, процедуру одновременно совершают, как для сосудистых гладкомышечных клеток (распознаваемый тип клеток), так и для эндотелиальных клеток, фибробластов, клеток HeLa и Hep-G2 (клетки, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию), используя для клеток всех типов 2 режима температур: 40C и 370C. После инкубации, не связавшиеся частицы, интенсивно отмывают, используя буфер HBSS, после чего связанные фаги элюируют, используя 1 мл буфера для элюции. Затем, определяют титр фагов в элюате и рассеивают равные аликвоты элюата до получения еди- ничных бляшек. Отбирают с каждой чашки 100 бляшек, распределяют их группами по две и выделяют ДНК посредством лизиса фаговых частиц. Для этого инкубируют фаговые частицы в 10 мМ растворе ЭДТА в течение 10 минут при температуре 650C, с последующим охлаждением и центрифугированием в течение 3 минут на 14000*g. Полученный раствор, содержащий ДНК бактериофага исполь- зуют в качестве матрицы для ПЦР по стандартной для данного вектора схеме, направляемой праймерами к участкам вектора (T7 "Fоrwаrd" праймер: 5' - ААССССТСААGАСССGТТТА - 3'; T7 "Rеvеrsе" праймер: 5' - GGAGCTGTCGTATTCCAGTC - 3') , или специально разработанными праймера- ми. После этого, определяют абсолютную частоту встречаемости каждого из пептидов в составе фаговых частиц в зависимости от типа клеток.
Г. Тест на стабильность пептида и способность интернализироваться в со- ставе фаговой частицы.
Стабильность индивидуального пептида в составе фаговой частицы, т.е. способность максимально долго сохранять свою функциональную эффективность в клетке, которую он специфически распознаёт и в самом организме хозяина, напрямую пересекается со способностью эффективно проникать в клетку, сохранять активность и специфически бомбардировать внутриклеточные мишени.
Для этого, инициируют культуру клеток СГМК в чашках Петри диаметром 60 мм в расчёте 64000 клеток на чашку и культивируют в течение 48 часов. Одновременно, в аналогичных чашках, инициируют культуры эндотелиальных клеток, фибробластов, HeLa, Hep-G2, соответственно в количествах - 48000, 24000, 16000, 16000 клеток на чашку, и культивируют в течение 48 часов. 1010 фаговых частиц несущих пептиды, распознающие клетки определённого типа в своём составе и представляющих фракцию, полученную после элюции фагов в результате 3-х раундов селекции многошаговым скринингом, инкубируют с сосудистыми гладкомышечными клетками при 2-х режимах температур: 40C и 370C и в течение различных периодов времени. Далее, клетки отмывают и лизируют в течение 10 минут, используя 2 мл буфера для лизиса (1 мл 2%-го р-ра дезоксихолиевой к-ты; 10 мМ Трис; 2 мМ ЭДТА, рН 8,0). После нейтрализации, раствор, содержащий фаги рассеивают до одиночных бляшек, которые затем отбирают с целью определения первичной последовательности олигонуклеотидных фрагментов, коди- рующих пептиды в составе отобранных фаговых частиц, а также для проведения дополнительного тестирования.
Пример 8. Определение первичной последовательности олигонуклеотидных фрагментов и кодируемых ими аминокислотных последовательностей пептидов, с последующим компьютерным анализом. Олигонуклеотидные фрагменты ДНК участка генома вектора, представляющие вставки кДНК и кодирующие специфичные пептиды, и ограниченные праймерами вектора, амплифицируют используя ПЦР, и определяют их первич- ную последовательность, методом дидезокси-секвенирования по Сэнгеру используя автоматический секвенатор, например, ABI Рrism 310 (Аррliеd Вiоsуstеms Iпс.) руководствуясь рекомендованные производителем протоколами проведения реакций. Используя сигналы распознавания в векторе, первичную последовательность олигонуклеотидных фрагментов вставок транслируют в рамке считывания в аминокислотные последовательности пептидов специфично связывающихся с активно пролиферирующими и арестованными в росте формами гладкомышечных клеток, и полученные в результате аминокислотные последовательности перерас- пределяют согласно, их длине и происхождению. В первую группу помещают пептиды с короткой аминокислотной цепью (до 30 звеньев) которые распознают исключительно линейные эпитопы (участки) рецепторных белков расположенных на поверхности гладкомышечных клеток. Во вторую группу при этом отбираются пептиды с длинной аминокислотной цепью и фрагментами белков, которые свя- зываются с гладкомышечными клетками, распознавая сложные вторичные и третичные структуры на их поверхности. Аминокислотные последовательности в каждой из двух групп далее последовательно анализируют согласно следующему алгоритму: 1) ищут гомологию с известными аминокислотными последовательностями, зарегистрированными в международных молекулярно-биологических базах данных, используя алгоритмы совмещения, предоставляемые через сервера BLAST (www.псbi.пlm.пih.gоv/ВLАSТ/) и ExPaSy (www.expasy.org/tools/#align); 2) определяют первичную структуру и физико-химические характеристики пептидов, используя при этом алгоритмы NHH предоставляемые через сервер ExPaSy (http://www.expasy.org/tools/) в комбинации с автономными пакетами, находящи- мися в свободном доступе. При этом определяют такие параметры как частота встречаемости различных классов аминокислот (структурообразующих, гидрофобных, заряженных позитивно, заряженных негативно, полярных без заряда) в каждой из позиций полипептида, начиная с N- конца молекулы. Дополнительно, определяют профиль гидрофобности, а также средний заряд и среднюю гидро- фобность в пересчёте на звено цепи для всей молекулы пептида; 3) определяют элементы вторичной и третичной структуры пептидов, сравнивая последовательности из базы данных по белковым молекулам (http://www.wwpdb.org/) с после- довательностями специфических пептидов, например, используя пакет программ WеbLаb ViеwеrРrо v4.0 (Моlесulаr Simulаtiопs Iпс, Sап Diеgо, CA, U.S.A.).
Возможные участки связывания специфических пептидов с молекулами белков на поверхностях гладкомышечных клеток выявляют, посредством сравне- ния совмещений фрагментов пептидов в многомерном пространстве, используя данные полученных для первой и второй групп аминокислотных последовательностей одновременно.
Пример 9. Проектирование матриц из аминокислотных последовательностей, создание пептидного конструкта и считывание новых пептидов (см. фиг.З). Конструирование матриц осуществляется за счёт унификации полипептидных цепей, предполагающее использование наименьшего количества аминокислотных звеньев для получения пептидов с минимальной комплексностью (для уменьшения времени и затрат на синтез пептидов) и максимальной специфичностью связывания клетками избранного типа (для уменьшения количеств пептидов при использовании в диагностических и терапевтических приложениях).
Конструируют матрицы из аминокислотных последовательностей в 2 этапа. На первом этапе создают набор коротких матриц (не более 5 аминокислот) посредством перекрытия коротких участков встречающихся с наибольшей частотой в анализируемых аминокислотных последовательностях, используя, например, пакет программ Сlаstаl W (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). На втором этапе, короткие матрицы комбинируют в группы по 3 и более с участками перекрывания на С- и N- концах пептидов не более 2-х аминокислот. После этого, формируют полноразмерный пептидный конструкт, добавляя к С- концу матрицы полученной на втором этапе, последовательности линкера и сигнала обнаруже- ния.
Полученные пептидные конструкты используют для считывания специфичных пептидов, таким способом, чтобы, как минимум один из считанных пептидов, содержал оригинальную последовательность пептида отобранного на этапе селекции, а остальные представляли собой максимально различающиеся комби- нации аминокислотных звеньев. Считывание новых специфичных пептидов производят блоками, включающими как минимум 2 триплета (6 пептидов). Пример 10. Химический синтез новых пептидов. Синтез пептидов, специфически распознающих определенный тип клеток, осуществляют на твердофазном носителе с участием аппарата для автоматизации химического синтеза пептидов, например PE Вiоsуstеms Рiопееr® (Fоstеr Сitу, CA, U. S. А.), используя термостатичную колонку, наполненную 2-xлopoтpитил хлоридным носителем (замещение 0,27 ммоль/г носителя глицином), поддерживая постоянную температуру 50 0C. Присоединение первой аминокислоты с C- конца пептида осуществляют согласно технической документации аппарата для автоматизации химического синтеза. Присоединение каждой последующей аминокислоты производят, используя четырёхкратный избыток смеси флyopил-9- илметоксикарбонил аминокислоты, ТБТУ (O-(Бeнзoтpиaзoл-l-ил)-N,N,N',N'- тетраметилурониум тетрафлуороборат) и диизопропилэтиламин (в соотношении 1 :1:1,7 , по объему) в растворе, предотвращающем агрегацию (диметилформамид / N-метилпирролидон (3:1, по объему), 1% Тритон X-100 и IM этиленкарбонат). Цикл присоединения активированных аминокислот повторяют дважды на тех участках пептидной молекулы, для которых синтез является сложным из-за комплексной вторичной структуры цепи, что предварительно выявляют с помощью пакета программ, например, Рерtidе Соmрапiоп (СоshiSоft, AZ, U.S.A.).
Процесс синтеза периодически останавливают и отбирают пробу для оценки качества реакции с помощью масс-спектрометрии с ионизирующим распыле- нием, например (ESI)-MS, (Реrkiп Еlmеr/Sсiех API I, PE Вiоsуstеms, Fоstеr Сitу, CA, U.S.A.). Полученные пептиды отщепляют от носителя и деактивируют, используя смесь из трифторуксусной кислоты, воды, тиоанизола, фенола, этанди- тиола и 3-изoпpoпилcилaнa (в соотношении 82,5:5:5:2,5:2,5:2,5, по объему). Неочищенные пептиды восстанавливают в течение 60 минут, при температуре 600C в 10 кратном избытке раствора тpиc-(2-кapбoкcиэтил) - фосфин гидрохлорида, приготовленном в буферном растворе, содержащим 6M гунидинхлорида и O5IM цитрата натрия (рН 3,0).
Затем пептиды немедленно опресняют посредством жидкостной хроматографии на C18 колонке, например, Wаtеrs Dеltа-Раk® Ci8 (15 μм, 300 А, 25 мм* 100 мм) в растворителях насыщенных молекулярным азотом, а сопутствующее очистке окисление пептидных молекул, контролируют. Концентрацию пептидов после очистки, предварительно оценивают по поглощению молекул триптофана и тирозина на длине волны 280 нм, а точные значения вычисляют с помощью теста на окисление протеинов бихинольными соединениями. Пример 11. Подтверждение специфичности новых пептидов.
Подтверждение специфичного распознавания гладкомышечных клеток новыми синтезированными пептидами проводят, например, методом иммунофер- ментного анализа, описанным в примере 7, используя вместо первого антитела не фаговую частицу, а полученный пептид. При этом 40 мкг пептида инкубируют с клетками в течение 40 минут при температуре 37 0C, после чего клетки фиксируют, помещая их в 100%-ный раствор метилового спирта на 10 минут при температуре -20 0C. Затем клетки промывают буфером HBSS, содержащим 0,1 % сапонина и 1,0 % сухого молока (по массе), и инкубируют в течение 10 минут с раствором второго антитела. Специфичность распознавания гладкомышечных клеток новыми пептидами выражают в относительных единицах и сравнивают её со специфичностью любых фаговых частиц, выбранных случайным образом из множества библиотек, описанных в примере 4, до проведения селекции.
Таким образом, при выполнении заявленного способа получения пептидов специфично распознающих клетки определённого типа, получили ряд пептидов специфичных в отношении гладкомышечных клеток: l.N'-Asn-Ser-Trp-Pro-Leu-Ser-Arg-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Leu-His-Pro-Ser-Leu-Leu- C г. N'-Нis-Аlа-Туr-Lуs-Аlа-Рrо-Нis-Sеr-Рrо-Аlа-Ilе-Рrо-Lеu-Нis-Рrо-Аrg-Рrо-Glу-С' 3. N'-(Arg)2-Tyr-Pro-Leu-Pro-Arg-Pro-Arg-(Leu)2-(Pro)2-Arg-Pro-Arg-(Pro)2-C
4. N'-His-Ser-Trp-Lys-Leu-Pro-His-Pro-Arg-(Leu)2-Ser-Pro-His-Pro-(Ser)2-Pro-Gly-C' 5. N'-Asn-Ser-Tyr-His-Ile-Ser-His-Ser-Arg-Ala-Val-Tyr-Pro-His-Arg-(Leu)2-C'

Claims

Формула изобретения
Способ получения пептидов, специфично распознающих клетки определённых типов и предназначенных для терапевтических целей, при котором, предусматривают конструирование фаговой библиотеки случайных пептидов на основе кодирующих их олигонуклеотидных фрагментов, её скрининг для получения пептидов, связывающихся с клетками определённого типа и подтверждают специфичность отобранных пептидов, отличающийся тем, что: - олигонуклеотидные фрагменты, кодирующие случайные пептиды, получают реакцией обратной транскрипции с использованием случайных праймеров и суммарных РНК клеток определённого типа и клеток других типов, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его диагностику и терапию, - указанные олигонуклеотидные фрагменты встраивают в бактериофаговые векторы в правильной ориентации и используют для создания фаговых библиотек случайных пептидов для всех типов клеток, использованных для выделения суммарных РНК,
- скрининг полученных фаговых библиотек случайных пептидов проводят в два этапа, на первом из которых отбирают пептиды, способные связываться с клетками определённого типа, а на втором — из отобранных на первом этапе пептидов отбирают пептиды, не связывающиеся с клетками других использованных типов,
- подтверждают специфичность пептидов в составе фаговых частиц к клеткам определённого типа, используя комбинации различных тестов, определяют первичные последовательности олигонуклеотидных фрагментов кодирующих пептиды в составе отобранных фаговых частиц, и транслируют их в аминокислотные последовательности с дальнейшим проведением анализа полученных последовательностей, - конструируют матрицы из аминокислотных последовательностей пептидов, на основе их физико-химических характеристик, включающие линкер и сигнал обнаружения, - считывают последовательности новых пептидов с матриц и синтезируют такие пептиды химическим путём, с последующим подтверждением специфичности полученных пептидов к клеткам определённого типа.
PCT/UA2009/000011 2009-03-20 2009-03-27 Способ получения пептидов, специфично распознающих определённые типы клеток и предназначенных для терапевтических целей WO2010107405A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011140269/10A RU2528739C2 (ru) 2009-03-20 2009-03-27 Способ получения пептидов, специфично распознающих определенные типы клеток и предназначенных для терапевтических целей

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
UAA200902499 2009-03-20
UAA200902499A UA93922C2 (ru) 2009-03-20 2009-03-20 Способ получения пептидов, которые специфически распознают клетки определенного типа, и предназначены для терапевтических целей

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010107405A1 true WO2010107405A1 (ru) 2010-09-23

Family

ID=42739879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/UA2009/000011 WO2010107405A1 (ru) 2009-03-20 2009-03-27 Способ получения пептидов, специфично распознающих определённые типы клеток и предназначенных для терапевтических целей

Country Status (3)

Country Link
RU (1) RU2528739C2 (ru)
UA (1) UA93922C2 (ru)
WO (1) WO2010107405A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2572710C1 (ru) * 2014-08-13 2016-01-20 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва" Соединение нибентана с аминокислотой, обладающее противоаритмической активностью, и способ его получения
WO2016061695A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 The Governors Of The University Of Alberta Genetic encoding of chemical post-translational modification for phage-displayed libraries

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6515009B1 (en) 1991-09-27 2003-02-04 Neorx Corporation Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells
UA66110A (en) * 2003-07-28 2004-04-15 Mykhailo Viktorovych Razumenko A method for the preparation of specific peptides for therapeutic purposes
RU2263146C2 (ru) * 2003-07-10 2005-10-27 Михаил Викторович Разуменко Способ получения бактериофагов, специфично связывающихся с клетками-мишенями и предназначенных для терапевтических целей
RU2330886C2 (ru) * 2002-01-22 2008-08-10 Закрытое Акционерное Общество "Евроген Айпи" НОВЫЕ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ БЕЛКИ Aequorea coerulscens И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6515009B1 (en) 1991-09-27 2003-02-04 Neorx Corporation Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells
RU2330886C2 (ru) * 2002-01-22 2008-08-10 Закрытое Акционерное Общество "Евроген Айпи" НОВЫЕ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ БЕЛКИ Aequorea coerulscens И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
RU2263146C2 (ru) * 2003-07-10 2005-10-27 Михаил Викторович Разуменко Способ получения бактериофагов, специфично связывающихся с клетками-мишенями и предназначенных для терапевтических целей
UA66110A (en) * 2003-07-28 2004-04-15 Mykhailo Viktorovych Razumenko A method for the preparation of specific peptides for therapeutic purposes

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAWSON PE ET AL.: "Synthesis of native proteins by chemical ligation", ANNU REV BIOCHEM, vol. 69, 2000, pages 923 - 960, XP008017334 *
INGRID N. MICHON ET AL.: "Targeting of peptides to restenotic vascular smooth muscle cells using phage display in vitro and in vi- vo", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1591, 2002, pages 87 - 97, XP004377271, DOI: doi:10.1016/S0167-4889(02)00254-9
MICHON INGRID N. ET AL.: "Targeting of peptides to restenotic vascular smooth muscle cells using phage display in vitro and in vivo", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1591, 2002, pages 87 - 97, XP004377271 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2572710C1 (ru) * 2014-08-13 2016-01-20 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва" Соединение нибентана с аминокислотой, обладающее противоаритмической активностью, и способ его получения
WO2016061695A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 The Governors Of The University Of Alberta Genetic encoding of chemical post-translational modification for phage-displayed libraries
EP3209819A4 (en) * 2014-10-22 2018-05-16 The Governors Of The University Of Alberta Genetic encoding of chemical post-translational modification for phage-displayed libraries
AU2015336857B2 (en) * 2014-10-22 2020-04-09 The Governors Of The University Of Alberta Genetic encoding of chemical post-translational modification for phage-displayed libraries
EP4350056A3 (en) * 2014-10-22 2024-06-26 48Hour Discovery Inc. Genetic encoding of chemical post-translational modification for phage-displayed libraries

Also Published As

Publication number Publication date
RU2011140269A (ru) 2013-04-27
RU2528739C2 (ru) 2014-09-20
UA93922C2 (ru) 2011-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bonnycastle et al. Probing the basis of antibody reactivity with a panel of constrained peptide libraries displayed by filamentous phage
JP4060886B2 (ja) Ｓｈ３結合ペプチドの単離および利用
AU777043B2 (en) Nucleic acid ligands to CD40ligand
ES2359724T3 (es) Métodos para cribar bancos de anticuerpos.
Lin et al. Analysis of capsid portal protein and terminase functional domains: interaction sites required for DNA packaging in bacteriophage T4
JPH08506487A (ja) 全合成親和性試薬
CN104507961A (zh) 抗炎性肽及包含其的组合物
JPH11509172A (ja) 目的の機能ドメインを有するポリペプチドおよびそれの同定および利用法
WO2020038147A1 (zh) 抗bcma的单域抗体及其应用
Jarray et al. Disruption of phactr-1 pathway triggers pro-inflammatory and pro-atherogenic factors: New insights in atherosclerosis development
JP2004515245A (ja) Ｃ型レクチン様ドメインの骨格構造を有する蛋白質のコンビナトリアルライブラリ
JP2930713B2 (ja) タンパク質ホルモン形成の抑制用の組成物およびその使用法
CN108017712A (zh) 一种鲨鱼抗体来源的蛋白骨架及其应用
KR20200003235A (ko) arm-PCR 및 고속 처리 서열 분석을 이용한 항원 특이적 후천성 면역 반응의 확인
Zhu et al. DELTEX E3 ligases ubiquitylate ADP-ribosyl modification on nucleic acids
Bonadio et al. Designed loop extension followed by combinatorial screening confers high specificity to a broad matrix metalloproteinase inhibitor
AU2002367554A1 (en) Protein complexes and methods for their use
WO2010107405A1 (ru) Способ получения пептидов, специфично распознающих определённые типы клеток и предназначенных для терапевтических целей
CN113667672A (zh) 一种靶向pd-l1胞外片段的dna适配体
JPS62501679A (ja) リポコルチンをコードするｄｎａ分子および形質転換宿主
JP2007197434A (ja) トランスグルタミナーゼ基質反応性を有するペプチド及びその利用
Jespers et al. Epitope mapping by negative selection of randomized antigen libraries displayed on filamentous phage
Li et al. Use of capillary electrophoresis to select a DNA aptamer that recognizes swine anaphylatoxin C5a
US20070122401A1 (en) Methods and compositions for modulating telomerase reverse transcriptase (tert) expression
Pacholczyk et al. Epitope and mimotope for an antibody to the Na, K‐ATPase

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09841985

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2011140269

Country of ref document: RU

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009841985

Country of ref document: EP

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09841985

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1