WO2010072048A1 - 一种甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种的选育方法 - Google Patents

一种甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种的选育方法 Download PDF

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WO2010072048A1
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self
brassica napus
line
incompatible
incompatibility
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PCT/CN2009/001437
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French (fr)
Inventor
马朝芝
高长斌
Original Assignee
华中农业大学
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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility

Definitions

  • the invention belongs to the technical field of Brassica napus breeding, and particularly relates to a method for breeding a self-incompatible two-line hybrid of Brassica napus L.
  • CMS cytoplasmic male sterility
  • GMS nuclear male sterility
  • SI self-incompatibility
  • chemical killing chemical killing.
  • the male sterile sterility (GMS) of Brassica napus L. has the advantage of stable sterility, but its fertility is separated. When planting, it is necessary to remove 50% of the fertile plants in the sterile line of Brassica napus. Not only will it reduce seed production, increase seed production costs, but often it is difficult to completely remove fertile plants, affecting seed purity and increasing production risks.
  • the chemical killing route has the disadvantages of polluting the environment and the purity of the hybrids produced.
  • the most internationally recognized cytoplasmic male sterile line of Brassica napus L. is Pol cms, but its fertility is susceptible to environmental conditions.
  • the selection process of maintainer and restorer lines is complex, the cycle is long, and cytoplasm is present.
  • the self-incompatible hybrids of Brassica napus L. have the advantages of short breeding cycle, easy screening to restorer line, no adverse cytoplasmic effect, and high seed production.
  • the present invention proposes a breeding method of the self-incompatibility two-line hybrid of Brassica napus L., which is expected to be selected and produced in production.
  • the large-scale promotion of self-incompatibility hybrids of Brassica napus L. promotes the utilization of heterosis of Brassica napus L.
  • the object of the present invention is to overcome the defects of the prior art and propose a method for breeding a self-incompatible two-line hybrid of Brassica napus L.
  • the present invention proposes a breakthrough and innovation of the existing rapeseed three-line breeding method.
  • the general technical scheme of the present invention comprises the selection and breeding of the self-incompatible line of Brassica napus L., the breeding and breeding of the self-incompatible restorer line of Brassica napus L., and the self-incompatible two-line hybrid of Brassica napus L. Breeding and its seed production methods to accelerate the self-crossing of Brassica napus L. The application of the incompatible two lines in the breeding of realistic heterosis.
  • a method for breeding a self-incompatible two-line hybrid of Brassica napus L. the steps of which are as follows -
  • the seeds are obtained; the affinity index method is used to detect the self-compatibility of the plants, right?
  • the incompatible plants are subjected to stripping and bud self-crossing to obtain F 2; the affinity of the F 2 plants is detected, and the unaffinated plants are selected for artificial stripping and selfing, and the seeds of F 3 are obtained; the seeds of F 3 are seeded, and the seeds are selected.
  • F 3 family self-crossing all the selected strains of the selected strains, and selecting 3-5 individual artificial stripping buds for each line to obtain F 4 seeds; the seeding index of each plant is less than 1 F 3 on seed harvested, select F 4 pedigree: for all strains selected plant bagged, each artificial plant strains selected 3-5 stripping bud selfing selected affinity index of less than 1
  • the F 4 family is the required self-incompatible line of Brassica napus L.; for the F 3 family with unstable self-incompatibility, the above breeding steps are repeated until the self-incompatibility stable cabbage type is selected. Rape self-incompatibility line; the applicant obtained the self-incompatibility line of Brassica napus 07-P63-6 through the above steps;
  • %NaCl solution bee-assisted pollination, inspect the affinity index of each plant, harvest the seeds on the plants with the affinity index less than 1 as the native species of Brassica napus self-incompatibility, and store them in -20 ⁇ refrigerator In the next sowing season, take a small amount of original stock, in the isolation strip Under the flowering stage of Brassica napus L., 3% NaCl solution was sprayed, and honeybee-assisted pollination and self-incompatibility was arranged to obtain the self-incompatible line of Brassica napus L.;
  • Propagation method of self-incompatibility restorer line of Brassica napus L. Breeding self-incompatibility restorer of Brassica napus L. by cytoplasmic male sterility or nuclear male sterility or chemical killing pathway of Brassica napus L. (See : Fu Tingdong, Editor-in-Chief, Breeding and Utilization of Hybrid Rape, Wuhan, Hubei province, Hubei Science and Technology Press, 1995, 145-150);
  • Seed production method of self-incompatible two-line hybrids of Brassica napus L. Brassica napus L. obtained from step (2) using the self-incompatible line of Brassica napus L. obtained in step (1)
  • the self-incompatibility recovery system is the male parent, so that the female parent and the male parent are planted in artificial isolation or natural isolation zone according to the ratio of 2:1 or 3:1 or 4:1, in the flowering of Brassica napus L.
  • the honeybee-assisted pollination is carried out.
  • the parental plant is removed, and in the mature stage of the Brassica napus, the seed of the female plant is harvested, and the self-incompatibility of the Brassica napus is obtained.
  • Sexual two-line hybrid seed At the end of the flowering period of the Brassica napus L.
  • the breeding method of self-incompatibility recovery line (father) of Brassica napus L. is simple, because most of the conventional varieties of Brassica napus can restore the incompatibility of self-incompatible lines of Brassica napus L. The characteristics are thus easy to screen for excellent hybridization combinations.
  • Brassica napus L. self-incompatibility two-line hybrids produce high yield and low seed production cost.
  • Figure 1 is a technical roadmap of the present invention.
  • Fig. 2 is a diagram showing the self-crossing of the self-incompatible line S-1300 of the Brassica napus L. and the seeding of the hybrid Ft in the embodiment of the present invention, wherein ia -d represents the self-incompatible line of Brassica napus L. -1300 sets of bags self-crossing performance is almost non-seed; e indicates that the self-incompatible line S-1300 of Brassica napus L. is the female parent, and the conventional Brassica napus strain Zheyou 18 is the male parent.
  • Figure 3 The reproduction effect of the self-incompatible line S-1300 of Brassica napus L. under the condition of isolation shed.
  • Figure 4 Production of self-incompatible two-line hybrid seeds of Brassica napus L. under the condition of isolation shed (Brassica napus self-incompatibility S-1300 is the female parent, Zhejiang oil 18 is the male parent, female parent and male parent) The line ratio is 2: 1).
  • Figure 5 Production of self-incompatible two-line hybrid seeds of Brassica napus L. under natural isolation zone (Brassica napus self-incompatible line S-1300 is the female parent, Zhongshuang) No.
  • Figure 6 Production of self-incompatible two-line hybrid seeds of Brassica napus L. under the condition of natural isolation zone (Brassica napus L. self-incompatible line S-1300 is the female parent, Brassica napus variety Zhongdu 10: No.
  • Seeding step (1) 1 seed, in the flowering period of Brassica napus, self-crossing the main inflorescence of the hybrid plant, judging its affinity, if! ⁇ Behaves self-interested, then self-interested in bagging, if! ⁇ If the performance is self-incompatible, then the buds are selfed and the seeds of F 2 are obtained;
  • the F 2 plant with the affinity index less than 1 in the seeding step (3) is detached from the seed, and the F 3 family is obtained; the F 3 family is screened according to the breeding target such as seedling growth and growth period, and the selected F is selected. All the individual plants of the three families were self-crossed, self-interested, and self-incompatible, and the self-crossing traits were self-crossed, and the self-crossing seeds of the F 3 pedigrees with a retention index of less than 1 at the maturity stage were harvested. As a seed of the F 4 family;
  • F 4 family were sown, and screened for breeding objectives seedling vigor, growth of other family F 4, F 4 and screening to all plant families bagged, selected from the incompatibility of Fine The strain was artificially stripped and budded; all F 4 families with a single affinity index of less than 1 were the new self-incompatible lines of Brassica napus L.;
  • step (4) is repeated until a new self-incompatible line of Brassica napus L. with stable incompatibility is selected.
  • the applicant has obtained the Brassica napus self-incompatibility line 07-P63-6.
  • step (2) Combining the results of step (2) and step (3), select the material with good FH combination affinity index higher than 10 in the field of Brassica napus self-incompatible line S-1300.
  • Type rapeseed self-incompatibility recovery system Through the above steps, the applicant has obtained the self-incompatibility recovery system of Brassica napus L., Zhejiang Oil ⁇ 8, Huihu Oil 17 and Recovery 5900.
  • the Brassica napus L. self-incompatibility line S-1300 and 07-P63-6 34 were used as the female parent, respectively, and the blue-type rapeseed self-incompatibility recovery system, Hui Zhe oil 18, Hu Hu oil 17 and Hybridization was carried out at 5900 to obtain a hybridization combination.
  • the self-incompatible line S-1300 of Brassica napus L. was planted under the isolation conditions from the end of August to the beginning of September each year.
  • the plant and row spacing were 2 meters and 1 meter respectively.
  • the S-1300 is a single plant, and a bee-assisted pollination is arranged in the nylon yarn; the main inflorescence of the self-incompatible line is bagged to self-intersection, and the affinity of the self-incompatible plant is identified;
  • the self-incompatibility recovery system of Brassica napus L. was propagated by using the hybridization method of cytoplasmic male sterility, nuclear male sterility, chemical killing, etc. in Brassica napus L. (see: Fu Tingdong, Editor-in-Chief, Hybrid Rape Breeding and Utilization, Hubei Science and Technology Press, 1995, 145-150).
  • the self-incompatibility line of Brassica napus L. is the female parent, and the self-incompatibility recovery line of Brassica napus is the male parent.
  • the ratio of the female parent to the male parent is 2: 1 or 3: 1 or 4: 1. Planted in artificial isolation sheds or natural isolation areas, field management and local field production;
  • the main branches were bagged at the initial flowering stage. When 3-5 flowers were opened on the main branches, the flowers on the main branches were destroyed, and the small buds on the top of the inflorescence center were knocked off. Some, then put the main branch and the two side branches with a sulfuric acid paper bag, and use a paper clip to keep it tight. The paper bag is pulled up every other day, and the paper bag is gently patted by the hand during the extraction process to facilitate the pollen of the flower, which plays a role in assisting pollination. When extracting the paper bag, if there are flowers or flower buds on the side buds, it should be knocked out in time to avoid the seeds being impure.
  • SCI Self-compatibility Index
  • step 3 (3) - (6) Using the breeding method of step 3 (3) - (6), in 2006, the self-incompatible line of Brassica napus L. with stable incompatibility and low quality was obtained.
  • the seeds harvested on a single plant with low affinity index, low glucosinolate and erucic acid content, and more self-crossing seeds in the test field of Wuhan Huazhong Agricultural University the test number was 34; 11 In the first month of the month, transplanted to the isolation shed P63-6, the field number is 07-P63-6, 34, and transplanted 5 rows, about 50; in the spring of 2007, the isolation shed is covered with nylon mesh to isolate the external pollen; All plants grew normally, with few self-crossing seeds, an affinity index lower than 1, an erucic acid content ⁇ 1%, and a glucosinolate content ⁇ 301 1 0 1 , which met the double low standard.
  • the self-incompatible line S-1300 of Brassica napus L. was planted under the isolation conditions from the end of August to the beginning of September each year.
  • the plant and row spacing were 2 meters and 1 meter respectively.
  • the S-1300 is a single plant, and a bee-assisted pollination is arranged in the nylon yarn; the main inflorescence of the self-incompatible line is bagged to self-intersection, and the affinity of the self-incompatible plant is identified;
  • step (3) cultivating the original stock of step (3) under isolation conditions in the next breeding season, and spraying 3% NaCl solution once a day in the flowering period of the self-incompatible line, the total spray 20-30 times, the bee assisted pollination was carried out, and the self-incompatibility line of Brassica napus L. was obtained as a production application.

Description

说 明 书 一种甘蓝型渖菜自交不亲和两系杂交种的选育方法
技术领域
本发明属于甘蓝型油菜育种技术领域， 具体涉及一种甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种 的选育方法。
背景技术
国内外大量研究表明甘蓝型油菜品种间杂种具有很强的杂种优势。 目前， 利用甘蓝型 油菜杂种优势的途径包括细胞质雄性不育 (CMS)、细胞核雄性不育 (GMS)、 自交不亲和 (SI) 和化学杀雄等。 甘蓝型油菜细胞核雄性不育 (GMS)具有不育性稳定的优点， 但其育性存在 分离， 在制种时， 需要在甘蓝型油菜初花期拨掉不育系中 50%的可育株， 不仅会降低制种 产量，增加制种成本，而且往往由于可育株难以彻底拔除，影响制种纯度，增加生产风险。 化学杀雄途径存在污染环境和生产出的杂交种纯度不高等缺点。当前国际上公认的最有实 用价值的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系是 Pol cms, 但其育性易受环境条件的影响， 保持 系和恢复系的选育程序复杂， 周期长， 且存在细胞质负效应的潜在危险。与甘蓝型油菜杂 种优势利用的其他途径相比，甘蓝型油菜自交不亲和杂种具有选育周期短、易于筛选到恢 复系、 无不良细胞质效应、 制种产量高等优点。前人提出了自交不亲和单交杂种（自交不 亲和系 A X自交不亲和系 B)、自交不亲和三系杂种（（自交不亲和系 X保持系）X恢复系）、 自交不亲和三交杂种 （（自交不亲和系 AX自交不亲和系 B ) ^<恢复系） 和自交不亲和双 交杂种 （（自交不亲和系 A X自交不亲和系 B ) X (自交不亲和系 C X自交不亲和系 D ) ) 等利用甘蓝型油菜自交不亲和系配置杂交种的可能方法（傅廷栋主编，杂交油菜的育种与 利用， P142-145 , 2000年 8月， 湖北科学技术出版社）。 尽管这些方法已经被提出来很多 年， 因为甘蓝型油菜自交不亲和杂种选育方法的原因， 目煎育种家还没有选育出能在生产 上大面积推广的甘蓝型油菜自交不亲和杂种。 针对现有甘蓝型.油菜自交不亲和杂种选育方 法的缺点，本发明提出一种甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种的选育方法， 该方法有望选 育出能在生产上大面积推广的甘蓝型油菜自交不亲和杂种，促进甘蓝型油菜杂种优势的利 用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提出一种甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种的选 育方法， 本发明的提出将是对现有油菜三系育种方法的一个突破和革新。 本发明的总体技术 方案包括甘蓝型油菜自交不亲和系的选育和繁殖， 甘蓝型油菜自交不亲和恢复系的选育和繁 殖， 甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种的选育及其种子的生产方法， 以加快甘蓝型油菜自交 不亲和两系在现实杂种优势育种中的应用。
本发明通过以下技术方案实现. ·
一种甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种的选育方法， 其步骤如下-
( 1 ) 甘蓝型油菜自交不亲和系的选育： 以甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300 (见文献： 马 朝芝等， 甘蓝型油菜双低自交不亲和系的选育， 华中农业大学学报， 1998, 17 (3 ): 211-213 ) 为母本， 与自交亲和的甘蓝型油菜品系华双 3号 （ 或称为华 （油） 双 3号， 二者为同一 个品种， 中国湖北省武汉市， 华中农业大学选育的油菜品种， 该品种于 1998年 3 月 26 日通过湖北省农作物品种审定委员会审定， 审定证书编号： 鄂种审证字第 156号， 为公开 推广应用的一个甘蓝型油菜新品种） 杂交， 得到 种子； 利用亲和指数法检测 植株的 自交亲和性， 对？, 不亲和的植株进行剥蕾自交， 得到 F2;检测 F2植株的亲和性， 选择不 亲和植株进行人工剥蕾自交， 得到 F3的种子； 播种 F3的种子， 选择 F3家系， 对中选株系 所有单株套袋自交， 每个株系选择 3-5个单株人工剥蕾自交， 得到 F4的种子； 播种单株 亲和指数均小于 1的 F3家系上收获的种子，选择 F4家系, :对中选株系所有单株套袋自交， 每个株系选择 3-5个单株人工剥蕾自交， 选亲和指数均小于 1 的 F4家系为所需要的甘蓝 型油菜自交不亲和系； 对自交不亲和性不稳定的 F3家系， 重复上述选育步骤， 直至选育 出自交不亲和性稳定的甘蓝型油菜自交不亲和系；申请人通过上述步骤得到了甘蓝型油菜 自交不亲和系 07-P63-6育 34;
(2 ) 甘蓝型油菜自交不亲和恢复系的选育： 以甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300为母本， 与自交亲和的油菜品系浙油 18 (商业购买自中国浙江省农业科学院）、沪油 17 (商业购买 自中国上海市农业科学院）和恢 5900 (见文献： 马朝芝等， RAPDs和 RFLPs分析甘蓝型 杂交油菜亲本的遗传多样性， 作物学报， 2003， 29 ( 5 )： , 701-707 ) 杂交， 得到 F1 种子； 种植该 Fl， 考察其自交亲和性； 同时种植所述自交亲和的油菜品系， 考察其产量及产量 相关性状， 选择田间表现较好， 与所述的甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300配制的 组合 的亲和指数高于 10的育种材料作为目标恢复系， 即恢浙油 18、 恢沪油 17和恢 5900;
( 3 )甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种的选育： 以甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300及其 改良的自交不亲和系 07-P63-6育 34 为母本， 以自交不亲和恢复系恢浙油 18、 恢沪油 17 和灰 5900为父本， 配制两系杂交种； 按随机区组排列设计将 Fi组合和对照品种同时种植 在田间， 考察植株的农艺性状、 产量、 抗病性、 生育期和品质性状， 选择得到强优势的杂 交组合， 备用； .
(4 ) 甘蓝型油菜自交不亲和系的繁殖： 采用早播、 稀植和高 措施培育甘蓝型油菜自交 不亲和系壮苗，在隔离条件下于甘蓝型油菜的花期喷施 3%NaCl溶液，配置蜜蜂辅助传粉， 考察每一植株的亲和指数，收获亲和指数小于 1的植株上的种子作为甘蓝型油菜自交不亲 和系原原种， 将其保存于 -20Ό冰箱中备用； 在下一个播种季节取少量原原种， 在隔离条 件下于甘蓝型油菜的开花期喷施 3%NaCl溶液， 配置蜜蜂辅助授粉繁殖自交不亲和系， 得 到甘蓝型油菜自交不亲和系原种；
( 5 ) 甘蓝型油菜自交不亲和恢复系的繁殖方法： 采用甘蓝型油菜细胞质雄性不育或细胞 核雄性不育或化学杀雄途径的方法繁殖甘蓝型油菜自交不亲和恢复系（参见：傅廷栋主编， 杂交油菜的育种与利用,中国湖北省武汉市， 湖北科学技术出版社， 1995， 145-150)；
( 6)甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种的种子生产方法： 以步骤（1 )得到的甘蓝型油菜 自交不亲和系为母本， 以步骤 （2 ) 得到的甘蓝型油菜自交不亲和恢复系为父本， 使母本 与父本按 2: 1或 3 : 1或 4: 1的行比种植在人工隔离条件下或天然隔离区中， 于甘蓝型 油菜的开花期， 配置蜜蜂辅助授粉， 在甘蓝型油菜终花期的末期， 去除父本行的植株， 于 甘蓝型油菜的成熟期，收获所述母本行植株的种子，得到甘蓝型油菜自交不亲和性两系杂 交种种子。
本发明的优点在于：
1. 选育甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种， 克服了甘蓝型油菜自交不亲和杂种不能 在生产上大面积推广的技术难题。
2. 与现有甘蓝型油菜三系杂交种选育方法比较， 甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种 只需要母本和父本两个亲本， 并不涉及保持系和临保系， 具有简化育种程序， 缩短育种周 期， 提高育种效率的优点。
3. 与现有甘蓝型油菜三系杂交种选育方法比较， 母本 （甘蓝型油菜自交不亲和系） 的繁殖方法简单。
4. 甘蓝型油菜自交不亲和恢复系 （父本） 的选育方法简单， 因为绝大多数甘蓝型油 菜常规品种（系）都能恢复甘蓝型油菜自交不亲和系的不亲和特性， 因而容易筛选到优良 的杂交组合。
5.甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种制种产量高， 种子生产成本低。
更详细的技术方案参见 《具体实施方式》。
附图说明
, 图 1 : 是本发明的技术路线图。
图 2: 是本发明实施例中甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300套袋自交及其杂种 Ft的结 籽情况， 图中 i a-d表示甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300套袋自交表现为几乎不结籽； e表 示甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300为母本， 常规甘蓝型油菜品系浙油 18为父本配置的
F,代杂种套袋自交表现为结籽正常。 ，
图 3 : 是甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300在隔离棚条件下的繁殖效果。
图 4: 是隔离棚条件下甘蓝型油菜自交不亲和两系杂种种子生产情况（甘蓝型油菜自 交不亲和 S-1300为母本， 浙油 18为父本， 母本与父本的行比为 2: 1 )。 图 5: 是天然隔离区条件下甘蓝型油菜自交不亲和两系杂种种子生产情况（甘蓝型油 菜自交不亲和系 S-1300为母本、 中双】 0号（中国， 湖北省， 武汉市， 中国农业科学院油 料作物研究所选育的优质甘蓝型油菜品种， 已在生产上大面积推广）为父本， 母本与父本 的行比为 2: 1 ) , 图中显示的时期为甘蓝型油菜的苗期。 '
图 6: 是天然隔离区条件下甘蓝型油菜自交不亲和两系杂种种子生产情况（甘蓝型油 菜自交不亲和系 S-1300为母本、甘蓝型油菜品种中双 10 :号为父本， 其中母本与父本的行 比为 2: 1 ), 图中显示的时期为甘蓝型油菜角果成熟期。
具体实施方式
在下面实施例的描述中凡是涉及到育种 （或称杂交） 所需要的生物材料， 依照本说 明书的《发明内容》很容易理解，这些公开获得生物材料途径申请人已经做出承诺（参见- 承诺证明 1-2) 并为本实施例 1-2所应用。 限于本说明书的篇幅， 在本段实施例 1-2的描 述中申请人将省略了这一部分内容的描述，但是不应当被认为实施例 1-2中申请人缺少对 生物材料的描述。
实施例 1
1、 甘蓝型油菜自交不亲和系的选育， 步骤如下-
( 1 ) 以甘蓝型油菜自交不亲和系品系 S-1300为母本， 与自交亲和的甘蓝型油菜品系 华双 3号杂交， 得到杂种一代 （F^ 种子。
( 2) 播种步骤 （1 ) 的？1种子， 在甘蓝型油菜花期， 对杂种 植株的主花序套袋自 交， 判断其亲和性， 若！^表现自交亲和， 则对其套袋自交， 若！^表现自交不亲和， 则对 其剥蕾自交， 得到 F2的种子；
( 3) 种植步骤 （2) 的 F2种子； 甘蓝型油菜花期， 对每个 F2植株进行套袋自交； 选 择自交不亲和的植株， 进行人工剥蕾自交； 分单株收获 F2植株剥蕾自交种子。
( 4) 播种步骤 （3 ) 的亲和指数小于 1的 F2植株剥蕾自交种子， 得到 F3家系； 根据 苗期长势、生育期等育种目标筛选 F3家系，并对筛选到的 F3家系所有单株进行套袋自交、 选择自交不亲和的优良单株迸行人工剥蕾自交， 成熟期保留亲和指数均小于 1的 F3家系 上收获的剥蕾自交种子作为 F4家系的种子；
( 5) 播种 F4家系的种子， 根据苗期长势、 生育期等育种目标筛选 F4家系， 并对筛 选到的 F4家系所有单株套袋自交， 选择自交不亲和的优良单株进行人工剥蕾自交； 所有 单株亲和指数均小于 1的 F4家系即为新的甘蓝型油菜自交不亲和系；
(6)若没有所有单株亲和指数均小于 1的 F4家系， 则重复步骤（4)， 直到选育出不 亲和性稳定的新甘蓝型油菜自交不亲和系。通过上述步骤申请人己经获得甘蓝型油菜自交 不亲和系 07-P63-6育 34。
2、 甘蓝型油菜自交不亲和恢复系的选育 (1) 以甘蓝型油菜自交不亲和系 s-ποο作母本， 与自交亲和的甘蓝型油菜品种浙油 18、 沪油 17和恢 5900杂交， 得到杂种一代 ) 种子；
(2)播种步骤 1) 的！^种子， 在甘蓝型油菜的幵花期对所有？, 植株套袋自交， 于成 熟期鉴定？!植株的亲和指数；
(3) 在步骤 （2) 进行地同时种植自交亲和的甘蓝型油菜品系， 考察其产量及其相关 性状。
(4)综合步骤（2)和步骤（3) 的结果， 选择田间表现较好、 与甘蓝型油菜自交不亲 和系 S-1300配置的 Ft组合亲和指数高于 10的材料即为甘蓝型油菜自交不亲和恢复系。 通过上述步骤申请人已经获得甘蓝型油菜自交不亲和恢复系恢浙油 〗8、 恢沪油 17和恢 5900。
3、 甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种的选育， 步骤如下：
(1) 以甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300和 07-P63-6育 34为母本， 分别与蓝型油菜 自交不亲和恢复系恢浙油 18、 恢沪油 17和恢 5900杂交， 得到 杂交组合。
(2) 按随机区组试验设计将 组合和对照品种种植在试验田， 2-3次重复、 小区面 积 3-5行， 行长 1.9m， 行宽 25cm， 株距 17cm; 在甘蓝型油莩的成熟期， 每小区随机取 10-15个单株、 并收获小区剩佘的植株， 根据育种目标考察各组合株高、 分枝部位、 单株 产量等农艺性状、 抗病性、 生育期和小区产量， 分析收获种子的含油量、 芥酸含量等品质 性状；
(3)符合育种目标的？,组合， 即为强优势组合， 供下.一步的试验。 通过上述步骤， 本 发明的优势杂交组合的小区产量比对照品种中油杂 2号（中国农业科学院油料作物研究所 选育并通过审定， 全国大面积推广的优质油菜品种） 增产 8-12%。
4、 甘蓝型油菜自交不亲和系的繁殖， 采用如下步骤-
(1) 在中国长江中下游的冬油菜地区于每年的 8月下旬至 9月上旬隔离条件下播种甘蓝 型油菜自交不亲和系 S-1300, 设株、 行距分别为 2米和 1米， 培育尽可能多分枝的大株 型甘蓝型油菜自交不亲和系， 于该自交不亲和系的蕾薹期用 60目的尼龙纱帐套住每一个 甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300单株， 在尼龙纱帐内配置蜜蜂辅助授粉； 对该自交不亲 和系的主花序套袋， 使其自交， 鉴定该自交不亲和系植株的亲和性；
(2)在甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300的开花期， 对隔离条件下的甘蓝型油菜自交不亲 和系 S-B00 株每天上午喷施 3%NaCl溶液 1次， 累计喷 20-30次；
(3) 在甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300的成熟期分单株收获1所述自交不亲和系的种子， 按亲和指数 =籽粒数 /花朵数的公式计算亲和指数， 淘汰亲和指数大于 2的植株， 分析每一 单株种子的芥酸和硫苷含量， 选芥酸含量小于 1%、硫苷含量小于 30umol/g植株的种子作 为原原种， 保存在 -2(TC冰箱中备用， 得到甘蓝型油菜自交不亲和系原原种；
(4)在下一个繁殖季节继续在隔离条件下播种步骤（3 )的原原种， 并在所述的自交不亲 和系的开花期每天上午喷施 3%的 NaCl溶液 1次， 共喷 20-30次， 配置蜜蜂辅助授粉， 收 获得到作为生产上应用的甘蓝型油菜自交不亲和系原种。 !
5、 甘蓝型油菜自交不亲和恢复系的繁殖：
采用甘蓝型油菜细胞质雄性不育、细胞核雄性不育、化学杀雄等杂种优势利用途径恢 复系的繁殖方法来繁殖甘蓝型油菜自交不亲和恢复系（参见： 傅廷栋主编， 杂交油菜的育 种与利用,湖北科学技术出版社， 1995， 145-150)。
6、 甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种的种子生产方法：
Π ) 以甘蓝型油菜自交不亲和系为母本、 甘蓝型油菜自交不亲和恢复系为父本， 母 本与父本按 2: 1或 3 : 1或 4: 1的行比种植在人工隔离棚或天然隔离区， 田间管理同当 地大田生产；
(2 ) 甘蓝型油菜花期， 在人工隔离棚或天然隔离区 K置蜜蜂辅助授粉；
( 3 ) 甘蓝型油菜终花后， 去除父本行植株；
(4 ) 甘蓝型油菜成熟期， 收获母本行植株种子， 得到甘蓝型油菜自交不亲和两系杂 交种种子。
实施例 2 (试验比较）
具体步骤如下-
1、 利用亲和指数法判断甘蓝型油菜的亲和性：
对所调査的甘蓝型油菜植株在初花期进行主枝套袋， 当主枝上有 3-5朵花开放时，把主枝 上所开花打掉， 并把花序中心顶上的小蕾打掉一些，然后把主枝和两个侧枝用硫酸纸袋套上， 用曲别针别紧。 每隔一天把纸袋向上抽提， 并且抽提的过程中用手轻拍纸袋使花粉散落有利 于花朵受粉， 起到辅助授粉的作用。 抽提纸袋时若有侧芽上的花或花蕾露出袋外要及时把它 打掉， 以免所收的种子不纯。 等纸袋内基本所有花授粉结束后， 取下纸袋， 打掉花蕾和未授 粉的花朵， 初歩根据角果发育情况调査亲和性。 收获后脱粒、'考种， 按照公式亲和指数 (Self-compatibility Index, SCI) =籽粒数 /花朵数来计算植株的亲和指数。
2、 甘蓝型油案自交不亲和系 07- P63-6育 34的选育
( 1 ) 1998 年春天， 在中国， 湖北省， 武汉市， 华中农业大学油菜试验田， 用自交不 亲和系 S-1300作母本， 与中国半冬性油菜品系华双 3号杂交， 得到杂种一代（F1 ) 种子。
(2) 1999'年秋天， 播种 F1种子 （2行、 10株 /行）； 2000年春天， 油菜花期对 F1 植 株进行套袋自交以判断 F1的亲和性， 并剥蕾自交； 5月初收获 F1植株， F1植株自交几 乎不结籽。
( 3 ) 2000年秋天， 在武汉华中农业大学油菜试验田种植？1植株的自交种子得 F2植 株（田间编号 01-9-701， 2行区， 每行 10株， 共 20株 F2植株）； 2001年春天于甘蓝型油 菜开花期， 选择 8-10个单株进行自交和剥蕾自交； 5月初油菜角果成熟时， 分单株收获 F2自交种子， 考察其亲和指数， 保留亲和指数小于 1植株的自交种子。
(4 )采用步骤 3 ( 3 ) - ( 6) 的选育方法， 于 2006年得到不亲和性稳定、 品质为双低 的甘蓝型油菜自交不亲和系。
2006年秋天，在武汉华中农业大学试验田育床播种亲和指数较低、硫苷和芥酸含量低、 剥蕾自交种子多的 1个单株上收获的种子，试验号为育 34; 11月上旬移栽到隔离棚 P63-6, 田间号分别为 07-P63-6育 34， 移栽 5行约 50株； 2007年春天， 用尼龙网纱将隔离棚罩 住以隔离外来的花粉； 所有单株均正常生长， 自交结籽很少， 亲和指数低于 1， 芥酸含量 <1%、 硫苷含量<301 101 ， 符合双低标准。
3、 甘蓝型油菜自交不亲和恢复系的选育
( 1 ) 以甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300为母本， 2005年春天于武汉华中农业大学试 验田， 2005 年夏天于甘肃省和政县华中农业大学西北油菜试验基地分别与自交亲和的甘 蓝型油菜材料浙油 18、 沪油 17和恢 5900杂交， 得到 3份 F1种子； 2005年秋天种植 组合在武汉华中农业大学油菜试验田（3行区， 10株 /行）， 2006年春天调查各个组合的自 交结籽情况， 发现这 3个F1组合的亲和指数大于 10， 表明其父本都能恢复甘蓝型油菜自 交不亲和系 S-1300的自交不亲和性。
( 2) 2005年秋天将这 3份自交亲和的甘蓝型油菜材料按随机区组设计 （2次重复， 3 行 /小区， 10株 /行） 种植在华中农业大学油菜试验田， 田间管理同大田生产。
( 3 )观察到这.3份甘蓝型油菜材料田间表现较好，且它们与甘蓝型油菜自交不亲和系. S-1300所配组合的亲和指数大于 10，可作为甘蓝型油菜自交不亲和恢复系，即恢浙油 18、 恢沪油 17和恢 5900， 供进一步进行组合比较试验。 ！
4、 甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种的选育
( 1 ) 2007年春， 分别以甘蓝型油菜自交不亲和系 S-l|300、 07-P63-6育 34为母本， 与 3个甘蓝型油菜自交不亲和恢复系（浙油 18、沪油 17、恢 5900)杂交， 得到 杂交组合。
( 2) 2007年秋天， 将上述的 Fi杂交组合和 1个对照品种：（中油杂 2号） 按随机区组 试验设计 （2 :次重复， 3行 /小区， 10株 /行） 种植在华中农业大学油菜试验田， 田间管理 同大田生产。
( 3 ) 2008年 5月， 每小区随机取样 10株， 考察株高、 分枝部位、 单株产量等农艺性 状， 同时收获剩余植株以考察小区产量， 最后进行品质分析。 通过上述步骤， 本发明的优 势杂交组合的小区产量比对照品种中油杂 2号（中国农业科学院油料作物研究所选育并通 过审定， 全国大面积推广的优质油菜品种）增产 8-12%, 说明甘蓝型油菜自交不亲和杂种 具有很强的杂种优势。 5、 甘蓝型油菜自交不亲和系的繁殖
( 1 ) 在中国长江中下游的冬油菜地区于每年的 8月下旬至 9月上旬隔离条件下播种甘蓝 型油菜自交不亲和系 S-1300, 设株、 行距分别为 2米和 1米， 培育尽可能多分枝的大株 型甘蓝型油菜自交不亲和系， 于该自交不亲和系的蕾薹期用 60目的尼龙纱帐套住每一个 甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300单株， 在尼龙纱帐内配置蜜蜂辅助授粉； 对该自交不亲 和系的主花序套袋， 使其自交， 鉴定该自交不亲和系植株的亲和性；
(2 ) 在甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300的开花期， 对隔离条件下的甘蓝型油菜自交不 亲和系 S-1300植株每天上午喷施 3%NaCl溶液 1次， 累计喷 20-30次；
(3 ) 在甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300的成熟期分单株收获所述自交不亲和系的种子， 按亲和指数 =籽粒数 /花朵数的公式计算亲和指数， 淘汰亲和指数大于 2的植株， 分析每一 单株种子的芥酸和硫苷含量， 选芥酸含量小于 1%、硫苷含量小于 30umol/g植株的种子作 为原原种， 保存在 -20°C冰箱中备用， 得到甘蓝型油菜自交不亲和系原原种；
( 4)在下一个繁殖季节继续在隔离条件下播种步骤（3 )的原原种， 并在所述的自交不亲 和系的开花期每天上午喷施 3%的 NaCl溶液 1次， 共喷 20-30次， 配置蜜蜂辅助授粉， 收 获得到作为生产上应用的甘蓝型油菜自交不亲和系原种。
6、 甘蓝型油菜自交不亲和恢复系的繁殖方法
与甘蓝型油菜细胞质雄性不育、 甘蓝型油菜细胞核雄性不育和甘蓝型油菜化学杀雄等 杂种优势利用途径的恢复系繁殖方法相同。 2006年 9月 25 日， 将甘蓝型油菜自交不亲 和恢复系浙油 18播种于苗床， 11月 5日移栽至 P63-8; 2007年在甘蓝型油菜的初花期， 摘除己开放花朵， 用 60目的尼龙网纱帐将隔离棚罩住以阻止外来的花粉进入， 并配置蜜 蜂辅助授粉； 成熟时， 混合收获隔离棚甘蓝型油菜自交不亲和恢复系浙油 18的种子。
7、 甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种的种子生产方法
( 1 ) 2003年秋天， 分别将甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300 (母本）和甘蓝型油菜自交不 亲和恢复系恢浙油 18 (父本） 播种于苗床； 2003年 11月将母本 （S-1300)和父本（浙油 18 ) 以 2: 1的行比移栽至隔离棚 P63-2, 田间管理同大田生产。 2004年在甘蓝型油菜的 开花期， 在隔离棚 P63-2配置蜜蜂辅助授粉， 终花期后， 拔除父本行植株、 保留母本行植 株； 在甘蓝型油菜的成熟期， 收获母本行植株， 得到甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种种 子。
(2 ) 2007年秋天， 将甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300 (母本）、 甘蓝型油菜自交不亲和 恢复系恢中双 10号（父本）， 以 2: 1的行比种植在一天然隔离区， 田间管理同大田生产。
2008 年在甘蓝型油菜的终花期后， 拔除父本行植株、 保留母本行植株； 在甘蓝型油菜的 成熟期， 收获母本行植株， 得到甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种种子。

Claims

权利要求书
1、 一种甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种的选育方法， 其步骤如下：
( 1 )甘蓝型油菜自交不亲和系的选育： 以甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300为母本， 与自 交亲和的甘蓝型油菜品系华双 3号杂交， 得到 种子； 利用亲和指数法检测！^植株的自 交亲和性， 对？, 不亲和的植株进行剥蕾自交， 得到 F2， 检测 F2植株的亲和性， 选择不 亲和植株进行人工剥蕾自交， 得到 F3的种子； 播种 F3的种子， 选择 F3家系， 对中选株系 所有单株套袋自交， 每个株系选择 3-5个单株人工剥蕾自交， 得到 F4的种子； 播种单株 亲和指数均小于 1的 F3家系上收获的种子，选择 F4家系，对中选株系所有单株套袋自交， 每个株系选择 3-5个单株人工剥蕾自交， 选亲和指数均小于 1的 F4家系为所需要的甘蓝 型油菜自交不 和系； 对自交不亲和性不稳定的 F3家系， 重复上述选育步骤， 直至选育 出自交不亲和性稳定的甘蓝型油菜自交不亲和系； 最终获得甘蓝型油菜自交不亲和系 07-P63-6育 34；
( 2 ) 甘蓝型油菜自交不亲和恢复系的选育: 以甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300为母本， 与自交亲和的油菜品系浙油 18、 沪油 17和恢 5900杂交， 得到 F1 种子； 种植该 Fl， 考 察其自交亲和性； 同时种植所述自交亲和的油菜品系， 考察其产量及产量相关性状， 选择 田间表现较好， 与所述的甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300配制的 组合的亲和指数高于 10的育种材料作为目标恢复系， 即恢浙油 18、 恢沪油 17和恢 5900;
(3 )甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种的选育： 以甘蓝型油菜自交不亲和系 S-1300及其 改良的自交不亲和系 07-P63-6育 34 为母本， 以自交不亲和恢复系恢浙油 18、 恢沪油 17 和灰 5900为父本，；配制两系杂交种； 按随机区组排列设计将？！组合和对照品种同时种植 在田间， 考察植株的农艺性状、 产量、 抗病性、 生育期和品质性状， 选择得到强优势的杂 交组合， 备用；
( 4 ) 甘蓝型油菜自交不亲和系的繁殖： 采用早播、 稀植和高肥措施培育甘蓝型油菜自交 不亲和系壮苗，在隔离条件下于甘蓝型油菜的花期喷施 3%NaCl溶液，配置蜜蜂辅助传粉， 考察每一植株的亲和指数，收获亲和指数小于 1的植株上的种子作为甘蓝型油菜自交不亲 和系原原种， 将其保存于 -20°C冰箱中备用； 在下一个播种季节取少量原原种， 在隔离条 件下于甘蓝型油菜的幵花期喷施 3%NaCl溶液，配置蜜蜂辅助授粉繁殖自交不亲和系， 得 到甘蓝型油菜自交不亲和系原种；
( 5 ) 甘蓝型油菜自交不亲和恢复系的繁殖方法： 采用甘蓝型油菜细胞质雄性不育或细胞 核雄性不育或化学杀雄途径的方法繁殖甘蓝型油菜自交不亲和恢复系； ( 6)甘蓝型油菜自交不亲和两系杂交种的种子生产方法： 以步骤（1 )得到的甘蓝型油菜 自交不亲和系为母本， 以步骤 （2 ) 得到的甘蓝型油菜自交不亲和恢复系为父本，,使母本 与父本按 2: 1或 3 : 1或 4: 1的行比种植在人工隔离条件下或天然隔离区中， 于甘蓝型 油菜的开花期， 配置蜜蜂辅助授粉， 在甘蓝型油菜终花期的末期， 去除父本行的植株， 于 甘蓝型油菜的成熟期，收获所述母本行植株的种子，得到甘蓝型油菜自交不亲和性两系杂 交种种子。
2、 权利要求 1所述的方法在甘蓝型油菜杂种优势利用中的应用。
3、权利要求 2所述的应用，其中包括在甘蓝型油菜自交不亲和两系杂种选育中的应用。
4、 权利要求】所述的方法在甘蓝型油菜自交不亲和两系杂种选育中的应用。
红色为 PCT申请新增加的权利要求。
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