WO2010060545A1 - Auflösungsgesteigerte mikroskopie - Google Patents

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WO2010060545A1
WO2010060545A1 PCT/EP2009/008117 EP2009008117W WO2010060545A1 WO 2010060545 A1 WO2010060545 A1 WO 2010060545A1 EP 2009008117 W EP2009008117 W EP 2009008117W WO 2010060545 A1 WO2010060545 A1 WO 2010060545A1
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WO
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molecules
activated
luminescent
radiation
areas
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PCT/EP2009/008117
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Ralf Wolleschensky
Ingo Kleppe
Gerhard Krampert
Michael Kempe
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Carl Zeiss Microimaging Gmbh
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Publication date
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
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    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
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    • G02B27/58—Optics for apodization or superresolution; Optical synthetic aperture systems

Definitions

  • a method for spatially high-resolution luminescence microscopy of a sample which is marked with marker molecules which can be activated with a switching signal so that they can be excited only in the activated state to deliver certain luminescence comprising the steps of: a) introducing the switching signal to the sample such that only a subset of the marker molecules present in the sample are activated, wherein in the sample there are subregions in which activated marker molecules have at least a distance to their nearest adjacent activated marker molecules which is greater than or equal to a length which results from a b) excitation of the activated molecules for emission of luminescence radiation, c) detection of the luminescence radiation with the predetermined optical resolution and d) generation of a single image from the luminescence str.
  • step c) the geometric locations of the luminescent radiation-emitting marking molecules are determined with a spatial resolution which is increased above the predetermined optical resolution, wherein the steps are repeated several times and the multiple individual images thus obtained are combined to form an overall image.
  • a classical field of application of light microscopy for the investigation of biological preparations is luminescence microscopy.
  • certain dyes such as phosphors or fluorophores
  • the sample is illuminated with illumination radiation representing excitation radiation and the luminescence radiation stimulated thereby is detected with suitable detectors.
  • a dichroic beam splitter in combination with block filters is provided for this purpose in the microscope, which split off the luminescence radiation from the excitation radiation and permit separate observation.
  • the representation of individual, differently colored cell parts in the microscope is possible.
  • several parts of a preparation can be colored simultaneously with different, specifically attaching to different structures of the preparation dyes. This process is called multiple luminescence. It is also possible to measure samples which luminesce per se, ie without the addition of dye.
  • Luminescence is understood here, as is common practice, as a generic term for phosphorescence and fluorescence, so it covers both processes. As far as fluorescence is concerned here, this is pars pro toto and not restrictive.
  • LSM laser scanning microscopes
  • LSM laser scanning microscopes
  • a confocal detection arrangement for sample examination, it is also known to use laser scanning microscopes (also abbreviated LSM), which from a three-dimensionally illuminated image by means of a confocal detection arrangement (then one speaks of a confocal LSM) or a non-linear sample interaction (so-called multiphoton microscopy) only that plane image, which is located in the focal plane of the lens.
  • An optical section is obtained, and the recording of several optical sections at different depths of the sample then makes it possible, with the aid of a suitable data processing device, to generate a three-dimensional image of the sample, which is composed of the various optical sections.
  • Laser scanning microscopy is thus suitable for the examination of thick specimens.
  • luminescence microscopy and laser scanning microscopy is also used in which a luminescent sample is imaged at different depth levels by means of an LSM.
  • the optical resolution of a light microscope is diffraction-limited by the laws of physics.
  • special lighting configurations are known, such as 4Pi or standing wave field devices.
  • the resolution especially in the axial direction compared to a classic LSM can be significantly improved.
  • the resolution can be further increased to a factor of up to 10 compared to a diffraction-limited confocal LSM.
  • Such a method is described for example in US 5866911. Different approaches are known for the depopulation processes, for example as described in DE 4416558 C2, US Pat. No. 6633432 or DE 10325460 A1.
  • This PALM-abbreviated method uses a marking substance, which can be activated by means of an optical activation signal. Only in the activated state, the marking substance can be excited with excitation radiation for emitting certain fluorescence radiation. Non-activated molecules of the labeling substance emit no or at least no appreciable fluorescence radiation even after irradiation of excitation radiation. The activation radiation thus switches the marking substance into a state in which it can be excited to fluorescence. Other activation, such as thermal type, are possible. Therefore, one generally speaks of a switching signal.
  • the switching signal is now applied so that at least a certain proportion of the activated labeling molecules of adjacent activated molecules are spaced so that they are separated or subsequently separated according to the optical resolution of the microscopy.
  • the activated molecules are thus at least largely isolated.
  • the center of its resolution-limited radiation distribution is then determined for these isolated molecules, and from this the position of the molecules is determined with greater accuracy by computation than the optical image actually permits.
  • the PALM method utilizes the fact that the probability of a label molecule being activated upon receipt of the switching signal of given intensity, eg, a photon of activation radiation, is the same for all molecules.
  • the intensity of the switching signal By means of the intensity of the switching signal, and thus the number of photons falling on a unit area of the sample, it can thus be ensured that the probability of activating marking molecules present in a given area of the sample is so small that there are sufficient areas in which within the optical resolution only distinguishable bare marker molecules emit fluorescence radiation.
  • suitable choice of the intensity, for example the photon density, of the switching signal it is achieved that as far as possible based on the optical resolution, isolated marker molecules are activated and subsequently emit fluorescence radiation.
  • the center of gravity of the diffraction-related intensity distribution and thus the position of the marker molecule with increased resolution is then computationally determined.
  • the isolation of the labeling molecules of the subset by introducing the activation radiation, subsequent excitation and fluorescence radiation imaging is repeated until all possible labeling molecules contained once in a subset and were isolated within the resolution of the image.
  • the PALM method has the advantage that neither for the activation, nor for excitation a high spatial resolution is needed. Instead, both the activation and the excitation in wide field illumination can take place.
  • the marker molecules are statistically activated in subsets by suitable choice of the intensity of the activation radiation. For this reason, a large number of individual images must be evaluated for the generation of an overall image of a sample in which the positions of all the marking molecules can be determined mathematically with, for example, resolution lying beyond the diffraction limit. It can be up to 10,000 frames. As a result, large amounts of data are processed and the measurement takes a correspondingly long time. Even the recording of an overall image requires several minutes, which is essentially determined by the readout rate of the camera used.
  • the position determination of the molecules in the individual images is carried out by complex computational procedures, as described for example in Egner et al., Biophysical Journal, p. 3285-3290, Volume 93, November 2007.
  • the processing of all individual images and the assembling into a high-resolution overall image typically takes four hours.
  • the invention has the object of providing a method for PAL-M microscopy educate so that a faster image acquisition is achieved.
  • the recording of the individual images is now regulated by evaluating a single image or a group of the individual images and deriving from the evaluation a change in a manipulated variable which is relevant for the individual image acquisition, and the corresponding manipulated variable is modified accordingly.
  • the invention thus uses the special type of imaging in the PALM method, which successively combines a high-resolution image from individual images, each of which contains a subset of the molecules to be located.
  • the individual images By analyzing the individual images, at least one parameter for the image recording is now optimized, so that the recording of the entire image is faster.
  • a further advantage of the procedure according to the invention is also that the boundary condition, which has an effect on optimum image acquisition parameters, can now change without affecting the recording time during image acquisition.
  • a simple example of this is the displacement of the sample to select another image section, the Sample areas with different concentration of marker molecules and thus inevitably different optimal switching signal intensity can bring in the current image field.
  • the dynamic optimization method according to the invention by the control of image acquisition parameters as a result of a single image analysis ensures that even with varying boundary conditions, the optimal image acquisition parameters are always quickly reached and thus the total time taken to take an image is reduced.
  • control according to the invention can also ensure device protection functions.
  • the usually used highly sensitive detectors or cameras are accidentally easily damaged by any misalignments on filters, excitation power in relation to fluorescence, etc.
  • the control during the recording of the overall picture prevents such damage.
  • Values for optimum measurement parameters are derived from the individual images and regulated by corresponding manipulated variable changes during the following individual image recordings with regard to the image acquisition speed or other criteria (for example the device protection mentioned).
  • a new frame grabber cycle is performed with settings that have been modified based on previous frame analysis and result in more optimal (e.g., faster) shots.
  • the distribution of the activated (and then later fluorescent) label molecules on the subsets is essential. It is therefore provided in a development of the invention that for the evaluation of a quality function is evaluated and their value is maximized, which is directly or indirectly a measure of the proportion of the labeling molecules in the sample, which are activated and their nearest adjacent activated marker molecules at least have a distance that is resolvable with the predetermined optical resolution.
  • the quality function may in particular be a density measure for the activated and thus fluorescent molecules. The most homogeneous possible brightness of the fluorescent molecules in the individual image is an indication and thus a possible measure of quality for image acquisition which is suitable with regard to the image recording speed.
  • luminescent regions are identified for the evaluation of the quality function in each of the evaluated individual images, which are isolated from adjacent luminescent areas, in the isolated luminescent areas, a measure of the amount of emitted by the respective luminescent luminescent area determined and the proportion of areas for which a measure below a threshold has been determined is taken as the value of the quality function.
  • the threshold value is expediently to be chosen such that it is slightly above the amount of luminescence that corresponds to a region in which only one labeling molecule emitted luminescence radiation.
  • the measure of the emitted luminescence radiation may be the integral of the luminescence intensity over the identified area. Other parameters are possible. Using as a measure the maximum of the luminescence intensity occurring in the luminescent area, it is found that the method is particularly insensitive to defocusing.
  • the measure of the amount of emitted luminescent radiation is an integral of the luminescence radiation intensity or the maximum of the luminescence radiation intensity, respectively, in the identified isolated luminescent region.
  • Another possible indicator of the density of the luminescent label molecules is the distance a luminescent region has to the next adjacent luminescent region. This distance can be measured, for example, by a suitable circular fit around an identified luminescent area.
  • the minimum distance of an identified isolated luminescent region to the next adjacent luminescent region is determined, and the proportion of regions whose minimum distance is greater than a predetermined by the predetermined optical resolution resolution minimum distance or a predetermined multiple of this minimum distance, as a value of the merit function is taken.
  • An alternative approach is to check that all the radiation received around a local fluorescence intensity maximum is within a certain distance of the local maximum. If the local intensity maximum is due to a luminescent marker molecule and if this marker molecule is isolated, the luminescence intensity beyond the resolution limit will have dropped to a defined minimum value rushing through the background. If, on the other hand, such a threshold value has not yet been reached at a predetermined distance around the local maximum, the maximum is due either to more than one luminescent marker molecule, or to another luminescent marker molecule in non-optically resolvable distance.
  • luminescent areas are determined, which are isolated from adjacent luminescent areas, and determined for each of these isolated luminescent areas, the size of this luminescent region based on a predefined by the optical resolution measure and that proportion of the total area of the single image is used as a measure of the quality function, the luminescent areas make up whose extent is smaller by their local maximum than a derived from the optical resolution size, in particular a predetermined multiple of the smallest resolvable length.
  • a circle can be placed around the geometric center or the local intensity maximum of the respective luminescent region, within which the luminescence intensity must have dropped to a certain minimum value or extends to the next adjacent luminescent region.
  • the proportion of areas whose luminescence intensity has fallen below the maximum value within a given circle radius or the proportion of areas whose circle radius is greater than the minimum resolvable distance or a predetermined multiple of the minimum distance is taken as the value of the quality function ,
  • the method can analyze each frame individually, i. It can also be changed from frame to frame between the described image analysis approaches.
  • the stability of the control it is preferred that the same type of individual image evaluation is always carried out. Further, it is advantageous in terms of stability when evaluating a group of successive frames, isolating in each of the evaluated frames luminescent areas isolated from adjacent luminescent areas, and the proportion of luminescent areas that luminesce exactly in a frame of the group, is taken as the value of the quality function.
  • the manipulated variables that are influenced may comprise at least one of the following parameters: filtering, polarization filtering, amplification, detector temperature, integration duration, detection field selection, focus position and size in the detection of the luminescence radiation, power, pulse shape, pulse frequency, wavelengths, irradiation duration, irradiation field selection, penetration depth, TIRF illumination , Focus position and size when introducing the switching signal or when exciting the activated molecules.
  • At least one of the following quantities can be detected and evaluated in the image evaluation: bleaching rate of the marking molecules, excitation and emission spectra of the marking molecules, lifetime of luminescent states of the marking molecules, activation threshold of the marking molecules, blinking rate of the marking molecules, time over which individual marking molecules are visible on average, Number of luminescent label molecules coincident within the optical resolution, number of collected photons per luminescent label molecule, number of activated label molecules per frame, mean localization accuracy of the label molecules per frame.
  • Another optimization approach under the scheme checks how long a molecule fluoresces. Ideally, an activated and stimulated label molecule contributes only exactly to a single image, since then the probability that as many marker molecules are disjoint, maximum is. Molecules that can be excited to luminescence over more than one frame could coalesce into a non-separable luminescent region with marker molecules added in the next step, ie newly activated marker molecules. This is undesirable. The described variant therefore optimizes the number of individual molecules which emit exactly one single image of luminescence radiation.
  • Another size that is particularly advantageous for increasing the image acquisition speed is the synchronization of detection and activation or excitation.
  • dye properties such as e.g. Bleaching rate, switching cycles, excitation and emission spectra, lifetime, etc. are important for optimal PALM image acquisition.
  • the duration for which a single marker molecule lingers in the luminescence-stimulable state for detection of the luminescence radiation in step c) and there in particular to an exposure period should be adjusted so that the marker molecule emits its luminescence radiation as far as possible within a detection step c) and not partially in detection steps for two consecutive frames.
  • the two edge frames represent significant portions of the total luminescence signal collected Image capture and thus eg Therefore, to optimally utilize the integration time of a CCD camera is a time-modulated intensity of the activation radiation to the detector in step c), e.g. to operate a camera, synchronized make so that the excitation probability of a molecule is as possible at the beginning of a frame.
  • 1 is a schematic representation of an activated marker molecule in a resolution-limited volume.
  • FIG. 2 is a schematic representation of the mapping of various activated and non-activated marker molecules onto a spatially resolving detector.
  • FIG. 4 is explanatory diagrams corresponding to the flowchart of FIG. 3 of marking molecules depicted on the detector of FIG. 2;
  • FIG. 5 is a schematic representation of a microscope for PAL microscopy
  • Fig. 6 is a flowchart for the image formation in the PALM method with control of image acquisition parameters
  • Fig. 7 is a microscope similar to that of Fig. 4, which is further developed to select sample areas.
  • Fig. 1 shows schematically a marker molecule 1, which was excited to fluoresce.
  • fluorescence detection requires a variety of excitations because each excitation delivers exactly one fluorescence photon and radiation detection requires integration of many fluorescence photons.
  • the fluorescence radiation emitted by the marking molecule 1 can be detected in a microscope on the basis of physical principles only with a limited optical resolution. Even if the microscope reaches the diffraction limit of the optical resolution, the photons of the fluorescent marker molecule 1 are still scattered due to diffraction and thus in a Diffraction disc 2 detected.
  • the microscope is thus in principle, instead of the geometric extension of the Markiemngsmoleküls 1, which is shown in Fig.
  • diffraction disc 2 The size of the diffraction disc 2 depends on the quality of the microscopy device used and is defined by the half-width of the point spread function of the optical image. In fact, of course, it is not a two-dimensional object, but a diffraction volume into which the fluorescence photons pass. In the two-dimensional representation of FIG. 1, however, this appears as a slice.
  • the term diffraction disc is therefore taken quite generally here for a maximum resolution volume which the optics used can achieve. However, the optics used need not necessarily work on the diffraction limit, even if this is preferable.
  • the PALM method already described above is used. This activates individual marking molecules, in this description quite generally by activating the activation of certain luminescence properties
  • Lumineszenzanreg einreg ein and a change in the luminescence emission spectrum, which corresponds to the switching of certain Lumineszen accordenschaften.
  • the activation is effected by optical activation radiation.
  • other non-optical activation mechanisms are possible.
  • the activation is now such that there are at least some activated molecules that do not have their center of gravity in the diffraction disc of other activated molecules, i. which can at least just be distinguished within the optical resolution.
  • Fig. 2 shows schematically an exemplary situation on a detector 5, which integrates the photons ortauflösenden. As can be seen, there are areas 3 in which the diffraction slices of adjacent marking molecules overlap. In this case, as can be seen in the left-hand area 3 of FIG. 2, only those marking molecules which were previously activated are relevant. Unactivated marker molecules 1 'do not give off the specific fluorescence radiation which is captured on the matrix detector 5, so they do not play a role.
  • marking molecules 1 are present in such a way that their diffraction disks 2 do not overlap with a diffraction disk of another activated marking molecule 1.
  • the right area of the matrix Detector 5 shows that regions 3 in which diffraction slices of activated marker molecules overlap can be quite adjacent to regions 4 where this is not the case.
  • the right-hand region 4 also clarifies that the proximity of an activated marker molecule 1 to an unactivated marker molecule 1 'does not play a role for the detection, since such a marker molecule 1' does not emit the fluorescence radiation detected by the matrix detector 5, ie does not fluoresce.
  • a subset of the labeling molecules is activated by means of a switching signal; They are thus switched from a first state in which they are not excitable to deliver the specific fluorescence radiation, in a second state in which they are excitable to deliver the specific fluorescence radiation.
  • the activation signal can also bring about a selective deactivation, that is, an inverse procedure can also be used in step S1. It is essential that after step S1 only a subset of the labeling molecules can be excited to deliver the determined fluorescence radiation.
  • the activation or deactivation takes place depending on the marker molecules used.
  • a dye e.g. DRONPA, PA-GFP or reversibly switchable synthetic dyes (such as Alexa / Cyan constructs) is activated by optical radiation, so the switching signal is switching radiation.
  • FIG. 4 which is shown in FIG. 3, shows in the partial image a the state after step S1. Only a subset of the label molecules l_n is activated. The labeling molecules of this subset are reproduced with a full black dot. The remaining marker molecules have not been activated in this step. They are designated in partial image a of FIG. 4 with l_n + 1.
  • Labeling molecules that have been activated can then be stimulated to emit fluorescence radiation in a second step S2.
  • Fluorescent dyes which are preferably used are fluorescent proteins known from the prior art, such as PA-GFP or DRONPA.
  • the activation occurs in such molecules with radiation in the range of 405 nm, the excitation to fluorescence radiation at a wavelength of about 488 nm, and the fluorescence radiation is in an area above 490 nm.
  • the emitted fluorescence radiation is detected, for example by integration of the recorded fluorescence photons, so that the situation shown in the underlying sub-image b of FIG. 4 on the matrix detector 5 results.
  • part (b) of FIG. 4 shows (theoretical) diffraction disks of fluorescent molecules which belong to the non-activated group I_n + 1. Since these non-activated marking molecules do not emit fluorescence radiation, no fluorescence radiation lying in their (theoretical) diffraction disks disturbs the detection of the fluorescence radiation of the subset 1_n of the activated marking molecules.
  • the activation energy is adjusted so that the subset l_n only makes up a relatively small proportion of the total amount of the marker molecules, so that statistically many marker molecules based on the the optical arrangement resolvable volumes are distinguishable bar.
  • a fourth step S4 the position of the fluorescent marker molecules is calculated from the diffraction distribution of the fluorescent discs, whereby the resolution with which the position of the activated marker molecules is known is sharpened beyond the resolution of the optical arrangement, like the partial image c of FIG. 4 shows.
  • nonlinear attenuation may be used to attenuate low amplitude or intensity fluorescence signals, whereas strong signals remain at least substantially unattenuated also a combination of non-linear amplifiers reinforcement and damping are used.
  • a fifth step S5 now sets the marking molecules whose position specification is more precise into a single image whose spatial resolution is increased beyond the optical resolution. However, it only contains information about the previously activated subset of the labeling molecules.
  • step S6 the frame is set in a known manner in an overall image. Subsequently, jump back to step S1, wherein the previously fluorescent molecules must be deactivated again. Deactivation can be achieved by separate radiation or by decay of the activation state, depending on the type of marker molecule. It is also possible to bleach already depicted marker molecules by excitation radiation.
  • the overall image is built up from individual images of the individual runs, which indicate the locations of the marking molecules with a spatial resolution that is sharpened with respect to the resolution of the optical image.
  • a high-resolution overall picture is thus gradually built up.
  • the reduction of the diffraction disk preferably takes place in all three spatial dimensions when a plurality of image stacks, which are spaced apart in the z-direction, are recorded. Then the overall picture contains the location of the marker molecules in high resolution in all three spatial directions.
  • FIG. 5 schematically shows a microscope 6 for the high-resolution imaging of a sample 7.
  • the sample is marked, for example, with the dye DRONPA (cf. WO 2007009812 A1).
  • the microscope 6 has a radiation source 8 which has individual lasers 9 and 10 whose beams are brought together via a beam combiner 11.
  • lasers 9 and 10 can emit radiation at 405 nm (activation radiation) and 488 nm (fluorescence excitation and deactivation).
  • Dyes are also known (eg the dye DENDRA (see Gurskaya et al., Nature Biotech., Vol. 24, pp. 461-465, 2006)) in which activation and fluorescence excitation can occur at the same wavelength , Then a laser is enough.
  • An acoustic-optical filter 12 is used for wavelength selection and fast switching I
  • An optical system 13 focuses the radiation via a dichroic beam splitter 14 into a pupil of an objective 15, so that the radiation of the radiation source 8 as wide-field illumination is incident on the sample 7.
  • Fluorescence radiation produced in the sample 7 is collected via the objective 15.
  • the dichroic beam splitter 14 is designed so that it can pass the fluorescence radiation, so that it passes through a filter 16 to a tube lens 17, so that a total of the fluorescent sample 7 is imaged on the detector 5.
  • a control device designed here as a computer 18 with display 19 and keyboard 20.
  • the method steps S2 to S6 take place in the computer 18.
  • the frame rate of the matrix detector is decisive for the total measuring time, so that a matrix detector 5 with the highest possible frame rate is advantageous in order to reduce the measuring time.
  • the described method realizes with the microscope 6 an overall image, e.g. has a spatial resolution increased by a factor of 10 compared with the optical resolution of the microscope.
  • the optical resolution of the microscope 6 may be, for example, 250 nm lateral and 500 nm axial.
  • control device in the form of the computer 18 therefore carries out a control within the scope of the method sequence described with reference to FIG. 3, which is explained with reference to FIG. 6:
  • Fig. 6 shows the process flow, wherein the already shown in Fig. 3 and explained with reference to this figure steps are provided with the same reference numerals, so that can be dispensed with a description repetition.
  • Fig. 6 also shows a step S8, which represents a frame evaluation and manipulated variable modification.
  • this step S8 a previously generated individual image is evaluated, and the evaluation is followed by a modification of operating parameters during the introduction of the switching signal (step S1), fluorescence excitation (step S2) and / or fluorescence detection (step S3).
  • the step S8 does not have to be executed after every generation of a single image.
  • the step S8 can also be executed only after every second, third, etc. run, in which case a single frame or the entire group of frames generated since the last execution of step S8 can be used in the evaluation.
  • the frame evaluation generates a quality function, e.g. is a measure of the separation of the fluorescent label molecules.
  • a quality function e.g. is a measure of the separation of the fluorescent label molecules.
  • the image evaluation can also be directed to explicitly added to the sample markers that do not serve to mark sample elements to be analyzed, but are evaluated only to optimize the single image.
  • Fig. 7 a development of the microscope 6 of FIG. 5 is shown, which in addition to the described PALM method simultaneously also conventional microscopy method, d. H. Microscopy method whose resolution diffraction-limited, can perform. Elements of the microscope 21 shown in Fig. 7, which correspond to those of the microscope 6, are provided with the same reference numerals. The above description applies equally to them, unless otherwise stated.
  • the microscope 21 has a modular structure, and to better explain the invention, it will be described in a comprehensive configuration. But it is also a reduced design with fewer modules possible. Also, the modular structure is not mandatory; a one-piece or non-modular design is also possible.
  • the microscope 21 is constructed on the basis of a conventional laser scanning microscope and detects the sample 7.
  • the microscope 21 has a conventional light microscope module, and the beam path from the sample 7 through the lens 15 and the tube lens 17 to the detector 5 corresponds to a conventional wide-field detection beam path.
  • the beam splitter 14 is preferably exchangeable in order to be able to switch between beam splitters with different dichroic properties or achromatic beam splitters according to US 2008/0088920.
  • a laser scanning module 22 is further connected, whose LSM illumination and detection beam path is coupled via a further, preferably also exchangeable beam splitter 23 in the beam path to the lens 15.
  • the laser scanning module 22 has several components.
  • a laser device 24 comprises a laser 25 which has a controlled phase modulator 26 applied.
  • An optical system 27 then focuses the radiation onto a DMD 28.
  • an LSM detector 29 and a confocal diaphragm 30 located in an intermediate image plane are shown by way of example in FIG.
  • the detection branch is coupled by the beam splitter 23.
  • the beam splitters 14 and 23 are optionally combined to form a beam splitter module 12, which then makes it possible to change them depending on the application.
  • the laser device 24 of the laser scanning module 22 generates radiation required for the PALM operation analogously to the radiation source 8, ie can emit radiation at different wavelengths or comprises a plurality of laser sources.
  • an optional TIRF illumination module 31 is provided, which realizes a switchable TIRF illumination.
  • the TIRF illumination module 31 generates or receives radiation from a radiation source, e.g. a laser over an optical fiber.
  • the TIRF illumination module 31 is configured to irradiate on the objective 15 TIRF illumination at an adjustable angle to the optical axis of the objective 13. In this way, simply the angle of total reflection on the cover glass can be ensured.
  • the TIRF illumination module 31 can operate as a wide field illumination source when it irradiates an illumination beam on the optical axis.
  • the modules and drives and detectors of the microscope 1 are all connected via unspecified (dashed lines) lines with a control device 32. This connection can be made for example via a data and control network 33.
  • the controller 32 controls the microscope 21 in various modes of operation.
  • the control unit 32 is designed to perform microscopy on the microscope 21, ie. H. Far-field microscopy (WF), laser scanning microscopy (LSM) and also fluorescence microscopy with total internal reflection (TIRF) perform and combine them with the high-resolution microscopy PAL-M.
  • WF Far-field microscopy
  • LSM laser scanning microscopy
  • TIRF fluorescence microscopy with total internal reflection
  • FIG. 4 shows a computer with display 19 by way of example, which is likewise connected to the data and control network 33, via which the control device 32 is connected to the individual components of the combination microscope 21.
  • FIG. 4 Also shown in FIG. 4 is a sample stage 42 on which the sample 7 is displaceable under the control of the control device 32.
  • a sample table is of course, like all other details of FIG. 4, also possible in the microscope 6 of FIG. 5.
  • the microscope 21 allows improved activation and / or excitation:
  • regions of special interest (ROI) can be assigned by a user, by himself
  • Activation radiation from the laser device 24 is influenced accordingly.
  • the DMD 28 is used, which is fully illuminated with laser radiation of the laser 24.
  • the individual mirrors of the DMD are now set so that only the selected ROI illuminated and thus only in these regions an optical activation of the marker (eg.
  • the remaining mirrors of the DMD 28 remain in an off position and the radiation conducted thereon is absorbed in a beam trap (not shown).
  • the switched-DMD levels can be time modulated to continuously attenuate the activation power.
  • the activation performance can be adapted to the molecular concentration in an especially advantageous manner for the PAL method, so that the activated molecules are located at a distance greater than the optical resolution of the microscope 21 independently of the local marking molecule concentration.
  • the sample 7 can be measured very quickly, in particular because the activation intensity and / or spatial distribution can be suitably adjusted within the scope of the described control.
  • a local setting is particularly advantageous when strong local concentration changes occur, eg. B. bright areas next to weakly colored areas are present. Next, locally different fading of markers, which z. B. may occur due to structural variations in the sample 7, lead to local concentration changes, which can now be compensated particularly advantageous with the activation control.
  • the ROI pattern can be preformed onto the entire DMD 28, which then only performs a fine tuning.
  • the power of the laser 25 is almost completely used to activate marker molecules in the sample 7.
  • the phase modulator 26 is arranged in a pupil plane in front of the DMD 28 (as viewed from the laser 25) and is located at the distance of the focal length of the optics 27 (which can also be realized by a single lens).
  • the DMD 28 is again located at the same distance after the optics 27.
  • the manipulated variables used for controlling the single image recording can be:
  • Detection side a. Frequency bands / filter; b. Gain factors (e.g., preamp gain, EMCCD gain); c. Temperature of a detector; d. Integration time of the detection; e. Detection modes (e.g., photon counting, baseline clamp) of detection; f. Reading only specific ROIs; G. Polarization of the detected radiation; H. Focus.
  • Gain factors e.g., preamp gain, EMCCD gain
  • Temperature of a detector e.g., temperature of a detector
  • Integration time of the detection e. Detection modes (e.g., photon counting, baseline clamp) of detection
  • f. Reading only specific ROIs e.g., photon counting, baseline clamp
  • Excitation side a. Irradiated excitation and / or activation radiation; i. Pulse shape or CW; ii. Power and pulse rate; iii. Wavelengths; b. Irradiation time; c. Excitation locally specific (pixel exact) or special ROIs or planar; d. Size of the illumination field; e. Penetration depth with TIRF illumination; f. Focus position.
  • the individual image evaluation can in particular provide statements about the following parameters:
  • Dye properties a. Bleaching rate; b. Excitation / emission spectra; c. Lifespan; d. Activation threshold; e. Photon rate per molecule; f. Blink rate;
  • Image / Image Properties a. The shape and intensity of the measured point-swelling functions, not only of the individual activated molecules but also of any markers added to the sample (eg gold beads), difference in shape and intensity of the measured PSFs for different colors; b. Time over which individual molecules are visible on average; c. Number of molecules activated per point spread function that overlap spatially and temporally (measure of "activation density”); d. Labeling molecule density (defined locally) measured by, for example, intensities of fluorescence at a further wavelength. This is possible for dyes that switch / convert between two fluorescent states (eg tdEoS).
  • Labeling molecule density can also be determined by fluorescence at the measuring wavelength by e.g. an early picture on which various already converted, but not bleached marker molecules can be seen.
  • the label density can also be estimated via further correlated staining or other contrast methods; e. Number of photons collected per molecule; f. Number of activated molecules per frame; G. Mean localization accuracy of the molecules per frame; H.
  • the combination of used filters and excitation lines of individual laser wavelengths can be used, on the other hand also the measured intensities of detected fluorescence at other wavelengths; i. Correlation of fluorescence images recorded with u.U. different excitation wavelengths or correlation with images from other contrasting methods such. DIC.

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur PAL-Mikroskopie, wobei Einzelbilder zu einem Gesamtbild zusammengefügt werden und eine Regelung der Aufnahme der Einzelbilder erfolgt, indem zumindest ein Teil oder eine Gruppe der Einzelbilder ausgewertet wird und mindestens eine Stellgröße der Einzelbildaufnahme für folgende Einzelbildaufnahmen modifiziert wird.

Description

Auflösunqsgesteiqerte Mikroskopie
Verfahren zur räumlich hochauflösenden Lumineszenzmikroskopie einer Probe, die mit Markierungsmolekülen markiert ist, welche mit einem Umschaltsignal derart aktivierbar sind, daß sie erst im aktivierten Zustand zur Abgabe bestimmter Lumineszenzstrahlung anregbar sind, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: a) Einbringen des Umschaltsignals auf die Probe derart, daß nur eine Teilmenge der in der Probe vorhandenen Markierungsmoleküle aktiviert werden, wobei in der Probe Teilbereiche bestehen, in denen aktivierte Markierungsmoleküle zu den ihnen nächst benachbarten aktivierten Markierungsmoleküle mindestens einen Abstand haben, der größer oder gleich einer Länge ist, welche sich aus einer vorbestimmten optischen Auflösung ergibt, b) Anregung der aktivierten Moleküle zur Abgabe von Lumineszenzstrahlung, c) Detektion der Lumineszenzstrahlung mit der vorbestimmten optischen Auflösung und d) Erzeugen eines Einzelbildes aus der in Schritt c) aufgenommenen Lumineszenzstrahlung, wobei die geometrischen Orte der Lumineszenzstrahlung abgebenden Markierungsmoleküle mit einer über die vorbestimmte optische Auflösung gesteigerten Ortsauflösung ermittelt werden, wobei die Schritte mehrfach wiederholt und die so erhaltenen, mehreren Einzelbilder zu einem Gesamtbild zusammenfügt werden.
Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Präparaten ist die Lumineszenzmikroskopie. Hierbei werden bestimmte Farbstoffe (sogenannte Phosphore oder Fluorophore) zur spezifischen Markierung von Proben, z.B. von Zellteilen, verwendet. Die Probe wird, wie erwähnt, mit Anregungsstrahlung darstellender Beleuchtungsstrahlung beleuchtet und die dadurch angeregte Lumineszenzstrahlung mit geeigneten Detektoren erfaßt. Üblicherweise ist dazu im Mikroskop ein dichroitischer Strahlteiler in Kombination mit Blockfiltern vorgesehen, die die Lumineszenzstrahlung von der Anregungsstrahlung abspalten und eine getrennte Beobachtung ermöglichen. Durch dieses Vorgehen ist die Darstellung einzelner, verschieden gefärbter Zellteile im Mikroskop möglich. Natürlich können auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen, sich spezifisch an unterschiedliche Strukturen des Präparates anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden. Dieses Verfahren bezeichnet man als Mehrfachlumineszenz. Auch kann man Proben vermessen, die per se, also ohne Farbstoffzugabe lumineszieren.
Lumineszenz wird hier, wie allgemein üblich, als Oberbegriff für Phosphoreszenz und Fluoreszenz verstanden, erfaßt also beide Prozesse. Soweit hier von Fluoreszenz gesprochen wird, ist das pars pro toto und nicht einschränken zu verstehen.
Zur Probenuntersuchung ist es auch bekannt, Laser-Scanning-Mikroskope (auch LSM abgekürzt) zu verwenden, die aus einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild mittels einer konfokalen Detektionsanordnung (dann spricht man von einem konfokalen LSM) oder einer nichtlinearen Probenwechselwirkung (sogenannte Multiphotonenmikroskopie) nur diejenige Ebene abbilden, die sich in der Fokusebene des Objektives befindet. Es wird ein optischer Schnitt gewonnen, und die Aufzeichnung mehrerer optischer Schnitte in verschiedenen Tiefen der Probe erlaubt es anschließend, mit Hilfe eines geeigneten Datenverarbeitungsgerätes ein dreidimensionales Bild der Probe zu generieren, das aus den verschiedenen optischen Schnitten zusammengesetzt ist. Die Laser-Scanning-Mikroskopie ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet.
Natürlich wird auch eine Kombination von Lumineszenzmikroskopie und Laser-Scanning- Mikroskopie verwendet, bei der eine lumineszierende Probe in verschiedenen Tiefenebenen mit Hilfe eines LSM abgebildet wird.
Prinzipiell ist die optische Auflösung eines Lichtmikroskopes, auch die eines LSM, durch die physikalischen Gesetze beugungsbegrenzt. Zur optimalen Auflösung innerhalb dieser Grenzen sind spezielle Beleuchtungskonfigurationen bekannt, wie beispielsweise 4Pi-Anordnung oder Anordnungen mit Stehwellenfeldern. Damit kann die Auflösung, insbesondere in axialer Richtung gegenüber einem klassischen LSM deutlich verbessert werden. Mit Hilfe nicht-linearer Entvölkerungsprozesse kann weiter die Auflösung auf einen Faktor von bis zu 10 gegenüber einem beugungsbegrenzten konfokalen LSM angehoben werden. Ein solches Verfahren ist beispielsweise in der US 5866911 beschrieben. Für die Entvölkerungsprozesse sind verschiedene Ansätze bekannt, beispielsweise wie in der DE 4416558 C2, US 6633432 oder DE 10325460 A1 beschrieben.
Ein weiteres Verfahren zur Auflösungssteigerung wird in der EP 1157297 B1 angesprochen. Dort sollen mittels strukturierter Beleuchtung nichtlineare Prozesse ausgenützt werden. Als Nichtlinearität erwähnt die Druckschrift dabei die Sättigung der Fluoreszenz. Das geschilderte Verfahren nimmt in Anspruch, durch eine strukturierte Beleuchtung eine Verschiebung des Objektraumspektrums relativ zur Übertragungsfunktion des optischen Systems zu realisieren. Konkret bedeutet die Verschiebung des Spektrums, daß Objektraumfrequenzen VO bei einer Raumfrequenz VO - Vm, wobei Vm die Frequenz der strukturierten Beleuchtung ist, übertragen werden. Bei gegebener durch das System maximal übertragbarer Raumfrequenz ermöglicht dies den Transfer von um die Verschiebefrequenz Vm über der maximalen Frequenz der Übertragungsfunktion liegender Raumfrequenzen des Objektes. Dieser Ansatz erfordert einen Rekonstruktionsalgorithmus zur Bilderzeugung und die Verwertung mehrerer Aufnahmen für ein Bild. Auch ist bei diesem Verfahren als nachteilig anzusehen, daß die Probe in Bereichen außerhalb des detektierten Fokus unnötig mit Strahlung belastet wird, da die notwendige strukturierte Beleuchtung das gesamte Probenvolumen durchsetzt. Im übrigen kann dieses Verfahren derzeit bei dicken Proben nicht verwendet werden, da außerfokal angeregte Fluoreszenz als Untergrundsignal mit auf den Detektor gelangt und somit den Dynamikbereich der nachgewiesenen Strahlung drastisch reduziert.
Ein Verfahren, das unabhängig von der Laserscanningmikroskopie eine Auflösung jenseits der Beugungsgrenze erreicht, ist aus der WO 2006127692 und der DE 102006021317 bekannt. Dieses mit PALM abgekürzte Verfahren (Photo Activated Light Microscopy) verwendet eine Markierungssubstanz, welche mittels eines optischen Aktivierungssignals aktiviert werden kann. Nur im aktivierten Zustand kann die Markierungssubstanz mit Anregungsstrahlung zur Abgabe von bestimmter Fluoreszenzstrahlung angeregt werden. Nicht aktivierte Moleküle der Markierungssubstanz senden auch nach Einstrahlung von Anregungsstrahlung keine oder zumindest keine merkliche Fluoreszenzstrahlung ab. Die Aktivierungsstrahlung schaltet die Markierungssubstanz also in einen Zustand, in dem sie zur Floureszenz anregbar ist. Auch andere Aktivierung, z.B. thermischer Art, sind möglich. Man spricht deshalb allgemein von einem Umschaltsignal. Im PALM-Verfahren wird nun das Umschaltsignal so aufgebracht, daß zumindest ein gewisser Anteil der aktivierten Markierungsmoleküle von benachbarten aktivierten Molekülen so beabstandet sind, daß sie gemessen an der optischen Auflösung der Mikroskopie getrennt oder nachträglich trennbar sind. Die aktivierten Moleküle werden also zumindest weitgehend isoliert. Nach Aufnahme der Lumineszenzstrahlung wird für diese isolierten Moleküle wird dann das Zentrum deren auflösungsbegrenzt bedingten Strahlungsverteilung ermittelt und daraus rechnerisch die Lage der Moleküle mit höherer Genauigkeit bestimmt, als es die optische Abbildung eigentlich zuläßt. Diese gesteigerte Auflösung durch rechnerische Schwerpunktbestimmung der Beugungsverteilung wird in der englischen Fachliteratur auch als „superresolution" bezeichnet. Sie erfordert, daß in der Probe zumindest einige der aktivierten Markierungsmoleküle mit der optischen Auflösung mit der die Lumineszenzstrahlung detektiert wird, unterscheidbar, also isoliert sind. Dann kann für solche Moleküle die Ortsangabe mit gesteigerter Auflösung erreicht werden. Zum Isolieren einzelner Markierungsmoleküle nutzt das PALM-Verfahren die Tatsache, daß die Wahrscheinlichkeit, mit der ein Markierungsmolekül nach Empfang des Umschaltsignals gegebener Intensität, z.B. eines Photons der Aktivierungsstrahlung aktiviert wird, für alle Moleküle gleich ist. Über die Intensität des Umschaltsignals und damit die Zahl der Photonen, die auf eine Flächeneinheit der Probe fällt, kann also dafür gesorgt werden, daß die Wahrscheinlichkeit, in einem gegebenen Flächenbereich der Probe vorhandene Markierungsmoleküle zu aktivieren, so gering ist, daß es ausreichend Bereiche gibt, in denen innerhalb der optischen Auflösung nur unterscheid bare Markierungsmoleküle Fluoreszenzstrahlung emittieren. Durch passende Wahl der Intensität, z.B. der Photonendichte, des Umschaltsignals, wird erreicht, daß möglichst nur bezogen auf die optische Auflösung isoliert liegende Markierungsmoleküle aktiviert werden und nachfolgend Fluoreszenzstrahlung aussenden. Für diese isolierten Moleküle wird dann rechnerisch der Schwerpunkt der beugungsbedingten Intensitätsverteilung und damit die Lage des Markierungsmoleküls mit gesteigerter Auflösung ermittelt. Zur Abbildung der gesamten Probe wird die Isolierung der Markierungsmoleküle der Teilmenge durch Einbringen der Aktivierungsstrahlung, nachfolgende Anregung und Fluoreszenzstrahlungsabbildung so lange wiederholt, bis möglichst alle Markierungsmoleküle einmal in einer Teilmenge enthalten und innerhalb des Auflösung der Abbildung isoliert waren.
Das PALM-Verfahren hat dabei den Vorteil, daß weder für die Aktivierung, noch die für Anregung eine hohe Ortsauflösung benötigt wird. Statt dessen kann sowohl die Aktivierung als auch die Anregung in Weitfeldbeleuchtung erfolgen.
Im Ergebnis werden die Markierungsmoleküle durch geeignete Wahl der Intensität der Aktivierungsstrahlung statistisch in Teilmengen aktiviert. Deshalb muß für die Generierung eines Gesamtbildes einer Probe, in dem die Positionen aller Markierungsmoleküle rechnerisch mit z.B. jenseits der Beugungsgrenze liegender Auflösung bestimmt werden können, eine Vielzahl von Einzelbildern ausgewertet werden. Es können bis zu 10.000 Einzelbilder sein. Dies hat zur Folge, daß große Datenmengen verarbeitet werden, und die Messung entsprechend lange dauert. Schon die Aufnahme eines Gesamtbildes erfordert mehrere Minuten, was im wesentlichen durch die Ausleserate der verwendeten Kamera festgelegt ist. Die Positionsbestimmung der Moleküle in den Einzelbildern erfolgt durch aufwendige rechnerische Prozeduren, wie sie beispielsweise in Egner et al., Biophysical Journal, S. 3285-3290, Band 93, November 2007, beschrieben ist. Die Bearbeitung aller Einzelbilder und das Zusammensetzen zu einem hochaufgelösten Gesamtbild, also ein Bild, in dem die Orte der Markierungsmoleküle mit einer jenseits der Beugungsgrenze liegenden Auflösung angegeben sind, dauert typischerweise vier Stunden. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur PAL-M ikroskopie so weiterzubilden, daß eine schnellere Bildgewinnung erreicht ist.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren der eingangs genannten Art gelöst, bei dem eine Regelung der Aufnahme der mehreren Einzelbilder erfolgt, indem nach einer Ausführung des Schrittes d) zumindest ein Einzelbild oder eine Gruppe der Einzelbilder ausgewertet wird und mindestens eine Stellgröße der Schritte a-d für folgende Wiederholungen der Schritte a-d modifiziert wird.
Erfindungsgemäß wird die Aufnahme der Einzelbilder nun geregelt vorgenommen, indem ein Einzelbild oder eine Gruppe der Einzelbilder ausgewertet wird und aus der Auswertung eine Veränderung einer Stellgröße, die für die Einzelbildaufnahme relevant ist, abgeleitet und die entsprechende Stellgröße entsprechend modifiziert wird.
Die Erfindung nutzt also die besondere Art der Bildgebung beim PALM-Verfahren, das ein hochaufgelöstes Bild sukzessive aus Einzelbildern zusammensetzt, die jeweils eine Untermenge der zu lokalisierenden Moleküle enthalten. Durch die Analyse der Einzelbilder wird nun zumindest ein Parameter für die Bildaufnahme optimiert, so daß die Aufnahme des gesamten Bildes schneller von statten geht.
Im Stand der Technik sind viele Parameter bekannt, die bislang vor dem Beginn eines PALM- Mikroskopievorgangs möglichst optimal eingestellt wurden. Durch die erfindungsgemäße Ableitung von Parameteroptimierungen während der Bildaufnahme durch Auswertung eines oder einer Gruppe von Einzelbildern erfolgt nun eine Regelung der Bildaufnahme hin zu einer höheren Aufnahmegeschwindigkeit.
Dies hat nicht nur den Vorteil, daß die Bildaufnahme insgesamt schneller abläuft, sondern auch die Vorbereitungszeit für die Aufnahme eines Bildes ist reduziert. Es muß weniger Aufwand betrieben werden, die Rahmenbedingungen für Betriebsparameter vorher sorgfältig zu ermitteln, um die Bildaufnahmeparameter gleich von Anfang an auf einen optimalen Wert einzustellen. Die optimalen Werte ergeben sich aus der erfindungsgemäßen Regelung während der Bildaufnahme.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Vorgehens liegt auch darin, daß sich die Randbedingung, welche sich auf optimale Bildaufnahmeparameter auswirken, nun ohne Auswirkungen auf die Aufnahmezeit während der Bildaufnahme ändern können. Ein einfaches Beispiel hierfür ist die Verschiebung der Probe zur Wahl eines anderen Bildausschnittes, die Probenbereiche mit unterschiedlicher Konzentration von Markierungsmolekülen und damit auch zwangsläufig unterschiedlich optimaler Umschaltsignalintensität in das aktuelle Bildfeld bringen kann. Das erfindungsgemäße dynamische Optimierungsverfahren durch die Regelung von Bildaufnahmeparametern als Ergebnis einer Einzelbildanalyse ist sichergestellt, daß auch bei variierenden Randbedingungen stets schnell die optimalen Bildaufnahmeparameter erreicht werden und somit insgesamt die Zeit zur Aufnahme eines Bildes reduziert ist.
Eine Variation der Rahmenbedingungen kann sich natürlich auch aus Stabilitätsgrenzen der Aperatur oder der Probe geben, z.B. Fokus-Drifts oder Temperaturänderungen. Auch diese sind nun ohne Auswirkung auf die Aufnahmedauer, daß die Bildaufnahme in der Regelung automatisch reagiert.
Über die Optimierung hinaus kann die erfindungsgemäße Regelung auch Geräteschutzfunktionen gewährleisten. So sind die üblicherweise verwendeten hochempfindlichen Detektoren oder Kameras durch etwaige Falscheinstellungen an Filtern, Anregungsleistung im Verhältnis zur Fluoreszenz etc., versehentlich leicht zu schädigen. Die Regelung während der Aufnahme des Gesamtbildes verhindert solche Schäden.
Bei der PALM-Bildaufnahme steht das Verhältnis von Aktivierung und De-Aktivierung (z.B. durch Bleichen) der Markierungsmoleküle in einem engen Zusammenhang mit der gesamten Bildaufnahmegeschwindigkeit. Es ist bereits in der WO 2006/127692 A2 beschrieben, daß eine asynchrone Aktivierung und Fluoreszenz-Anregung der Geschwindigkeitsoptimierung dienen kann. Die DE 102006021317 B3 gibt sogar Prozentangaben, die sich auf den Teil der konvertierten Moleküle beziehen, die bezogen auf die optische Auflösung des Mikroskops voneinander getrennt, also disjunkt sind. Diese festen Vorgaben sind mit der Erfindung überflüssig und sind allenfalls Startwerte.
Aus den Einzelbildern werden Werte für optimale Meßparameter abgeleitet und durch entsprechende Stellgrößenveränderungen während den folgenden Einzelbildaufnahmen hinsichtlich der Bildaufnahmegeschwindigkeit oder anderer Kriterien (z.B. des erwähnten Geräteschutzes) geregelt. Ein neuer Einzelbildaufnahmezyklus wird also mit Einstellungen durchgeführt, die aufgrund der vorherigen Einzelbildanalyse modifiziert wurden und zu optimaleren (z.B. schnelleren) Aufnahmen führen.
Dabei muß nicht unbedingt eine Beschleunigung auf Einzelbildebene erfolgen. Eine verringerte Aufnahmedauer kann vor allem auch dadurch erreicht werden, daß weniger Einzelbilder benötigt werden, z.B. weil die Aufteilung in Teilmengen verbessert ist. Für eine Beschleunigung der Gesamtbildaufnahme ist die Verteilung der aktivierten (und dann später fluoreszierenden) Markierungsmoleküle auf die Teilmengen (jede Teilmenge entspricht dann einem Einzelbild) wesentlich. Es ist deshalb in einer Weiterbildung der Erfindung vorgesehen, daß zur Regelung eine Gütefunktion ausgewertet und deren Wert maximiert wird, die direkt oder indirekt ein Maß für den Anteil der Markierungsmoleküle in der Probe ist, welche aktiviert sind und zu den ihnen nächst benachbarten aktivierten Markierungsmolekülen mindestens einen Abstand haben, der mit der vorbestimmten optischen Auflösung auflösbar ist. Die Gütefunktion kann dabei insbesondere ein Dichtemaß für die aktivierten und damit fluoreszierende Moleküle sein. Eine möglichst homogene Helligkeit der fluoreszierenden Moleküle im Einzelbild ist ein Indiz und damit mögliches Gütemaß für eine hinsichtlich der Bildaufnahmegeschwindigkeit geeignete Bildaufnahme.
Folgende Überlegung führt zu einer besonders geeigneten Gütefunktion: Idealerweise trägt zur Lumineszenz innerhalb eines örtlich auflösbaren Bereichs/Volumens nur ein einziges Markierungsmolekül bei. Grundsätzlich kann in einem örtlich auflösbaren Volumen nur eine ganzzahlige Anzahl von Molekülen vorliegen. Innerhalb eines durch die örtliche Auflösung definierten Gebietes kann also nur Lumineszenzstrahlung auftreten, die entweder von einem, von zwei, von drei etc. Markierungsmolekülen stammt. Eine Lumineszenzauswertung innerhalb eines lumineszierenden Gebietes, das von benachbarten lumineszierenden Gebieten isoliert ist, erlaubt es also, durch eine Schwellwertanalyse zu erkennen, ob in dem lumineszierenden Gebiet ein Markierungsmolekül lag oder mehrere. Es ist deshalb in einer Weiterbildung bevorzugt, daß zur Auswertung der Gütefunktion in jedem der ausgewerteten Einzelbilder lumineszierte Gebiete identifiziert werden, die von benachbarten lumineszierenden Gebieten isoliert sind, in den isolierten lumineszierten Gebieten ein Maß für die Menge der vom jeweiligen isolierten lumineszierenden Gebiet abgegebenen Lumineszenzstrahlung ermittelt wird, und der Anteil der Gebiete, für die ein unter einem Schwellwert liegendes Maß ermittelt wurde, als Wert der Gütefunktion genommen wird. Der Schwellwert ist dabei zweckmäßigerweise so zu wählen, daß er geringfügig über dem Lumineszenzmengenmaß liegt, das einem Gebiet entspricht, in dem nur ein Markierungsmolekül Lumineszenzstrahlung abgab.
Das Maß für die abgegebene Lumineszenzstrahlung kann das Integral der Lumineszenzintensität über das identifizierte Gebiet sein. Auch andere Parameter sind möglich. Verwendet man als Maß das Maximum der im lumineszierenden Gebiet auftretenden Lumineszenzintensität, zeigt sich, daß das Verfahren besonders unempfindlich gegen Defokussierungen ist.
Bei der Aufnahme eines Bildes spielt natürlich immer Hintergrundrauschen eine Rolle. Soweit in dieser Beschreibung von isolierten Gebieten die Rede ist, ist deshalb darunter zu verstehen, daß die aufgenommene Intensität unter einen Schwellwert sinkt, der jedoch aufgrund von Hintergrundrauschen nicht notwendigerweise Null sein muß.
Es ist deshalb bevorzugt, daß das Maß für die Menge der abgegebenen Lumineszenzstrahlung ein Integral über die Lumineszenzstrahlungsintensität oder das Maximum der Lumineszenzstrahlungsintensität, jeweils im identifizierten isolierten lumineszierenden Gebiet, ist.
Ein weiterer möglicher Indikator für die Dichte der lumineszierenden Markierungsmoleküle ist der Abstand, den ein lumineszierendes Gebiet zum nächst benachbarten lumineszierenden Gebiet hat. Dieser Abstand kann beispielsweise durch einen geeigneten Kreisfit um ein identifiziertes lumineszierendes Gebiet gemessen werden.
Bevorzugt wird der minimale Abstand eines identifizierten isolierten lumineszierenden Gebietes zum nächst benachbarten lumineszierenden Gebiet bestimmt, und der Anteil der Gebiete, deren minimale Abstand größer ist als ein durch die vorbestimmte optische Auflösung vorgegebener auflösbarer Mindestabstand oder ein vorgegebenes Vielfaches dieses Mindestabstandes ist, als Wert der Gütefunktion genommen wird.
Ein alternativer Ansatz ist es, zu prüfen, ob die gesamte aufgenommene Strahlung um ein lokales Fluoreszenzintensitätsmaximum herum innerhalb eines bestimmten Abstandes um das lokale Maximum liegt. Rührt das lokale Intensitätsmaximum von einem lumineszierenden Markierungsmolekül her und ist dieses Markierungsmolekül isoliert, so wird jenseits der Auflösungsgrenze die Lumineszenzintensität auf einen durch das Hintergrund rauschende definierten Mindestwert abgefallen sein. Ist hingegen bei einem vorgegebenen Abstand um das lokale Maximum ein solcher Schwellwert noch nicht erreicht, rührt das Maximum entweder von mehr als einem lumineszierenden Markierungsmolekül her, oder es befindet sich in nicht optisch auflösbarem Abstand noch ein weiteres lumineszierendes Markierungsmolekül.
Es ist deshalb bevorzugt, daß zur Auswertung der Gütefunktion in jedem der ausgewerteten Einzelbilder lumineszierende Gebiete ermittelt werden, die von benachbarten lumineszierenden Gebieten isoliert sind, und für jedes dieser isoliertem lumineszierenden Gebiete die Größe dieses lumineszierenden Gebietes bezogen auf ein durch die optische Auflösung vorgegebenes Maß ermittelt und derjenige Anteil an der Gesamtfläche des Einzelbildes als Maß für die Gütefunktion verwendet wird, den lumineszierende Gebiete ausmachen, deren Ausdehnung um ihr lokales Maximum geringer ist als eine aus der optischen Auflösung abgeleiteten Größe, insbesondere ein vorgegebenes Vielfaches der kleinsten auflösbaren Länge. Für diese beiden Varianten kann ein Kreis um das geometrische Zentrum oder das lokale Intensitätsmaximum des jeweiligen lumineszierenden Gebietes gelegt werden, innerhalb dem die Lumineszenzintensität auf einen bestimmten Mindestwert abgefallen sein muß, oder der bis zum nächst benachbarten lumineszierenden Gebiet reicht. Der Anteil der Gebiete, deren Lumineszenzintensität innerhalb eines vorgegebenen Kreisradius unter den Maximalwert gefallen ist, bzw. der Anteil der Gebiete, deren Kreisradius größer ist als der auflösbare Mindest-Abstand oder ein vorgegebenes Vielfaches des Mindest-Abstandes ist, wird als Wert der Gütefunktion genommen.
Prinzipiell kann das Verfahren jedes Einzelbild individuell analysieren, d.h. es kann auch von Einzelbild zu Einzelbild zwischen den geschilderten Bildauswertungsansätzen gewechselt werden. Bevorzugt ist jedoch im Sinne der Stabilität der Regelung, daß immer dieselbe Art der Einzelbildauswertung vornimmt. Weiter ist es hinsichtlich der Stabilität vorteilhaft, wenn eine Gruppe aufeinanderfolgender Einzelbilder ausgewertet wird, in jedem der ausgewerteten Einzelbilder lumineszierende Gebiete isoliert werden, die von benachbarten lumineszierenden Gebieten isoliert sind, und der Anteil der lumineszierenden Gebiete, die genau in einem Einzelbild der Gruppe lumineszieren, als Wert der Gütefunktion genommen wird.
Die beeinflußten Stellgrößen können mindestens einen der folgenden Parameter umfassen: Filterung, Polarisationsfilterung, Verstärkung, Detektortemperatur, Integrationsdauer, Detektionsfeldwahl, Fokuslage und -große bei der Detektion der Lumineszenzstrahlung, Leistung, Pulsform, Pulsfrequenz, Wellenlängen, Bestrahlungsdauer, Bestrahlungsfeldwahl, Eindringtiefe eine TIRF-Beleuchtung, Fokuslage und -große beim Einbringen des Umschaltsignals oder bei der Anregung der aktivierten Moleküle.
In der Bildauswertung kann mindestens eine der folgenden Größen erfaßt und ausgewertet werden: Bleichrate der Markierungsmoleküle, Anregungs- und Emissionsspektren der Markierungsmoleküle, Lebensdauer von Lumineszenzzuständen der Markierungsmoleküle, Aktivierungsschwelle der Markierungsmoleküle, Blinkrate der Markierungsmoleküle, Zeit, über die einzelne Markierungsmoleküle im Mittel sichtbar sind, Anzahl an innerhalb der optischen Auflösung zusammenfallenden, lumineszierenden Markierungsmolekülen, Anzahl der gesammelten Photonen pro lumineszierendem Markierungsmolekül, Anzahl der aktivierten Markierungsmolekülen pro Einzelbild, mittlere Lokalisierungsgenauigkeit der Markierungsmoleküle pro Einzelbild.
Ein weiterer Optimierungsansatz im Rahmen der Regelung überprüft, wie lange ein Molekül fluoresziert. Idealerweise trägt ein aktiviertes und angeregtes Markierungsmolekül nur genau zu einem Einzelbild bei, da dann die Wahrscheinlichkeit, daß möglichst viele Markierungsmoleküle disjunkt sind, maximal ist. Moleküle, die über mehr als ein Einzelbild zur Lumineszenzstrahlung angeregt werden können, könnten mit im nächsten Schritt hinzutretenden, d.h. neu aktivierten Markierungsmolekülen zu einem nicht trennbaren lumineszierenden Gebiet zusammenwachsen. Dies ist unerwünscht. Die geschilderte Variante optimiert deshalb die Anzahl der Einzelmoleküle, die genau ein Einzelbild Lumineszenzstrahlung abgeben. Bei einer De-Aktivierung von Markierungsmolekülen durch Bleichen, d.h. durch eine Anregung, die so stark ist, daß das Markierungsmolekül dauerhaft oder zumindest zeitweise nicht wieder zur Lumineszenz angeregt werden kann, kann die Optimierung der Markierungsmoleküle, die für ein Einzelbild Lumineszenzstrahlung abgeben, durch Erhöhung der Anregungsintensität erreicht werden. Diese Variante ist ein Beispiel dafür, daß die Stellgröße nicht automatisch bei der Aktivierung der Markierungsmoleküle eingreifen muß, sondern durchaus auch auf die Anregung wirken kann.
Eine weitere Größe, die besonders vorteilhaft für die Steigerung der Bildaufnahmegeschwindigkeit ist, ist die Synchronisation von Detektion und Aktivierung bzw. Anregung. Insbesondere sind Farbstoffeigenschaften, wie z.B. Bleichrate, Schaltzyklen, Anregungs- und Emmisionsspektren, Lebensdauer etc. für optimale PALM-Bildaufnahmen von Bedeutung. Im Mittel sollte die Dauer, für die ein einzelnes Markierungsmolekül im zur lumineszenzanregbaren Zustand verweilt, zur Detektion der Lumineszenzstrahlung im Schritt c) und dort insbesondere zu einer Belichtungsdauer so abgestimmt sein, daß das Markierungsmolekül möglichst innerhalb eines Detektionsschrittes c) seine Lumineszenzstrahlung abgibt und nicht teilweise in Detektionsschritte für zwei aufeinanderfolgende Einzelbilder fällt. Da bei einer optimierten Bildaufnahmegeschwindigkeit die meisten lumineszierenden Markierungsmoleküle nur in sehr wenigen Frames eines Detektionsschrittes sichtbar sind, stellen die beiden Randframes (Frames, in denen ein Molekül die Lumineszenz beginnt bzw. beendet) signifikante Anteile des insgesamt aufgesammelten Lumineszenzsignals dar. Um die Frames bei der Bildaufnahme und damit z.B. die Integrationszeit einer CCD-Kamera möglichst optimal auszunutzen, ist deshalb eine zeitliche modulierte Intensität der Aktivierungsstrahlung zum Detektor in Schritt c), z.B. zum Betrieb einer Kamera, synchronisiert vorzunehmen, so daß die Anregungswahrscheinlichkeit eines Moleküls möglichst zu Beginn eines Frames liegt.
Für manche Arten fotoschaltbarer Proteine ist deren mittlere Anregbarkeitsspanne vor einem reversiblen oder irreversiblen De-Aktivieren eine Funktion der Beleuchtungsbedingungen. Von einem Hintergrundsignal unterscheidet sich die Lumineszenzstrahlung der fotoschaltbaren Proteine durch ihr Bleichverhalten. Ein zuvor ermitteltes Bleichverhalten kann also benutzt werden, die Markierungsmoleküle von Hintergrundstrahlung zu unterscheiden. Alternativ kann die Lebensdauer verwendet werden. Diese Informationen können dazu verwendet werden, Grenzen für den Regelbereich vorzugeben.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine Schemadarstellung eines aktivierten Markierungsmoleküls in einem auflösungsbegrenzten Volumen;
Fig. 2 eine Schemadarstellung der Abbildung verschiedener aktivierter und nicht-aktivierter Markierungsmoleküle auf einen ortsauflösenden Detektor,
Fig. 3 ein Ablaufdiagramm für die Bilderzeugung im PALM-Verfahren,
Fig. 4 zum Ablaufdiagramm der Fig. 3 gehörende Erläuterungsdarstellungen von auf den Detektor der Fig. 2 abgebildeten Markierungsmolekülen,
Fig. 5 ein Schemadarstellung eines Mikroskop zur PAL-Mikroskopie,
Fig. 6 ein Ablaufdiagramm für die Bilderzeugung im PALM-Verfahren mit Regelung von Bildgewinnungsparametern und
Fig. 7 ein Mikroskop ähnlich dem der Fig. 4, das zur Auswahl von Probenbereichen weitergebildet ist.
Fig. 1 zeigt schematisch ein Markierungsmolekül 1 , das zur Fluoreszenz angeregt wurde. Natürlich erfordert die Fluoreszenzdetektion eine Vielzahl von Anregungen, da jede Anregung genau ein Fluoreszenzphoton liefert und die Strahlungsdetektion eine Integration vieler Fluoreszenzphotonen benötigt. Die vom Markierungsmolekül 1 abgegebene Fluoreszenzstrahlung kann in einem Mikroskop aufgrund physikalischer Prinzipien lediglich mit einer begrenzten optischen Auflösung detektiert werden. Selbst wenn das Mikroskop die Beugungsgrenze der optischen Auflösung erreicht, werden die Photonen des fluoreszierenden Markierungsmolekül 1 immer noch beugungsbedingt gestreut und somit in einen Beugungsscheibchen 2 detektiert. Das Mikroskop gibt also prinzipiell statt der geometrischen Ausdehnung des Markiemngsmoleküls 1 , die in Fig. 1 schematisch als schwarzer Kreis gezeichnet ist, ein größeres Objekt wieder, das in Fig. 1 durch das Beugungsscheibchen 2 veranschaulicht ist. Die Größe des Beugungsscheibchens 2 hängt von der Güte der verwendeten Mikroskopieeinrichtung ab und ist durch die Halbwertsbreite der Punktverwaschungsfunktion der optischen Abbildung definiert. Tatsächlich handelt es sich natürlich nicht um ein zweidimensionales Objekt, sondern um ein Beugungsvolumen in das die Fluoreszenzphotonen gelangen. In der zweidimensionalen Darstellung der Fig. 1 erscheint dieses aber als Scheibchen. Der Begriff Beugungsscheibchen wird hier deshalb ganz allgemein für ein maximales Auflösungsvolumen genommen, welches die verwendete Optik erzielen kann. Die verwendete Optik muß aber nicht zwingend an der Beugungsgrenze arbeiten, auch wenn dies zu bevorzugen ist.
Um nun das Markierungsmolekül 1 innerhalb des Beugungsscheibchens 2 genauer lokalisieren zu können, wird das oben bereits allgemein geschilderte PALM-Verfahren eingesetzt. Dieses aktiviert einzelne Markierungsmoleküle, wobei in dieser Beschreibung ganz allgemein unter dem Begriff Aktivierung die Aktivierung bestimmter Lumineszenzeigenschaften der
Markierungsmoleküle verstanden wird, also sowohl ein Einschalten der
Lumineszenzanregbarkeit als auch eine Änderung des Lumineszenzemissionsspektrum, was dem Einschalten bestimmter Lumineszenzeigenschaften entspricht. Im hier beschriebenen
Ausführungsbeispiel wird die Aktivierung durch optische Aktivierungsstrahlung bewirkt. Es sind aber auch andere nicht-optische Aktivierungsmechanismen möglich.
Die Aktivierung erfolgt nun so, daß es zumindest einige aktivierte Moleküle gibt, deren Schwerpunkt nicht im Beugungsscheibchen anderer aktivierter Moleküle liegt, d.h. die innerhalb des optischen Auflösung zumindest gerade noch unterscheiden werden können.
Fig. 2 zeigt schematisch eine exemplarische Situation auf einem Detektor 5, der die Photonen ortauflösenden integriert. Wie zu sehen ist, gibt es Bereiche 3, in denen die Beugungsscheibchen benachbarter Markierungsmoleküle überlappen. Hierbei sind, wie im linken Bereich 3 der Fig. 2 zu sehen ist, jedoch lediglich diejenigen Markierungsmoleküle relevant, die zuvor aktiviert wurden. Nicht aktivierte Markierungsmoleküle 1' geben die bestimmte Fluoreszenzstrahlung, welche auf dem Matrix-Detektor 5 aufgefangen wird, nicht ab, spielen also keine Rolle.
In den Bereichen 4, z.B. dem in der Mitte des Matrix-Detektors 5 gelegenen Bereiches 4, liegen Markierungsmoleküle 1 so, daß ihr Beugungsscheibchen 2 mit keinem Beugungsscheibchen eines anderen aktivierten Markierungsmolekül 1 überlappt. Der rechte Bereich des Matrix- Detektors 5 zeigt, daß Bereiche 3, in denen Beugungsscheibchen von aktivierten Markierungsmolekülen überlappen, zu Bereichen 4, in denen dies nicht der Fall ist, durchaus benachbart liegen können. Der rechte Bereich 4 verdeutlicht zudem, daß die Nachbarschaft eines aktivierten Markierungsmoleküls 1 zu einem nicht aktivierten Markierungsmolekül 1' für die Detektion keine Rolle spielt, da ein solches Markierungsmolekül 1' ja die vom Matrix- Detektor 5 detektierte Fluoreszenzstrahlung nicht abgibt, also nicht fluoresziert.
Zur Aufnahme eines jenseits der apparativ vorgegebenen optischen Auflösung detaillierten Bildes, das im Sinne dieser Beschreibung ein hochaufgelöstes Bild ist, werden nun die in Fig. 3 schematisch dargestellten Schritte eingesetzt.
In einem ersten Schritt S1 wird mittels eines Umschaltsignals eine Teilmenge der Markierungsmoleküle aktiviert; sie werden also von einem ersten Zustand, in dem sie zur Abgabe der bestimmten Fluoreszenzstrahlung nicht anregbar sind, in einen zweiten Zustand geschaltet, in dem sie zur Abgabe der bestimmten Fluoreszenzstrahlung anregbar sind. Natürlich kann das Aktivierungssignal auch eine selektive Deaktivierung bewirken, also in Schritt S1 auch ein inverses Vorgehen verwendet werden. Wesentlich ist, daß nach Schritt S1 lediglich eine Teilmenge der Markierungsmoleküle zur Abgabe der bestimmten Fluoreszenzstrahlung angeregt werden kann. Die Aktivierung bzw. Deaktivierung (nachfolgend wird zur Vereinfachung lediglich der Fall der Aktivierung geschildert) erfolgt abhängig von den verwendeten Markierungsmolekülen. Bei einem Farbstoff wie z.B. DRONPA, PA-GFP oder reversibel schaltbaren synthetischen Farbstoffen (wie Alexa/Cyan-Konstrukten) erfolgt die Aktivierung durch optische Strahlung, ist das Umschaltsignal also Umschaltstrahlung.
Die unter der Fig. 3 dargestellte Fig. 4 zeigt im Teilbild a den Zustand nach Schritt S1. Lediglich eine Teilmenge der Markierungsmoleküle l_n ist aktiviert. Die Markierungsmoleküle dieser Teilmenge sind mit einem voll ausgezeichneten schwarzen Punkt wiedergegeben. Die restlichen Markierungsmoleküle sind in diesem Schritt nicht aktiviert worden. Sie sind in Teilbild a der Fig. 4 mit l_n+1 bezeichnet.
Markierungsmoleküle, die aktiviert wurden, können dann in einem zweiten Schritt S2 zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt werden. Als Fluoreszenzfarbstoffe werden vorzugsweise aus dem Stand der Technik bekannte fluoreszierende Proteine, wie PA-GFP oder auch DRONPA verwendet. Die Aktivierung erfolgt bei solchen Molekülen mit Strahlung im Bereich von 405 nm, die Anregung zur Fluoreszenzstrahlung bei einer Wellenlänge von etwa 488 nm, und die Fluoreszenzstrahlung liegt in einem Bereich oberhalb von 490 nm. In einem dritten Schritt S3 wird die abgegebene Fluoreszenzstrahlung detektiert, beispielsweise durch Integration der aufgenommenen Fluoreszenzphotonen, so daß sich die im darunter liegenden Teilbild b der Fig. 4 dargestellte Situation auf dem Matrix-Detektor 5 ergibt. Wie zu sehen ist, überlappen die Beugungsscheibchen der aktivierten Markierungsmoleküle l_n nicht. Die Größe der Beugungsscheibchen wird durch die optische Auflösung der Abbildung auf den Matrix-Detektor 5 festgelegt. Zusätzlich sind in Teilbild b der Fig. 4 (theoretische) Beugungsscheibchen von Fluoreszenzmolekülen eingezeichnet, die zur nicht-aktivierten Gruppe l_n+1 gehören. Da diese nicht-aktivierten Markierungsmoleküle keine Fluoreszenzstrahlung abgeben, stört keine in deren (theoretischen) Beugungsscheibchen liegende Fluoreszenzstrahlung die Detektion der Fluoreszenzstrahlung der Teilmenge l_n der aktivierten Markierungsmoleküle.
Damit in der Teilmenge l_n möglichst wenige Beugungsscheibchen so überlappen, daß die Markierungsmoleküle gar nicht mehr unterscheidbar sind, wird die Aktivierungsenergie so eingestellt, daß die Teilmenge l_n nur einen vergleichsweise geringen Anteil der Gesamtmenge der Markierungsmoleküle ausmacht, so daß statistisch viele Markierungsmoleküle bezogen auf das mit der optischen Anordnung auflösbare Volumen unterscheid bar sind.
In einem vierten Schritt S4 wird die Lage der floureszenzierenden Markierungsmoleküle rechnerisch aus der Beugungsverteilung der Floureszenzscheibchen ermittelt, wodurch die Auflösung, mit der die Lage der aktivierten Markierungsmoleküle bekannt ist, über die Auflösung der optischen Anordnung hinaus geschärft wird, wie das Teilbild c der Fig. 4 zeigt.
Alternativ ist zu einer rechnerischen Bestimmung ist es ganz grundsätzlich möglich, die aufgenommene Fluoreszenzstrahlung nichtlinear zu verstärken und so mit verringertem Aufwand die Auflösung über die optischen Anordnung hinaus zu schärfen. Die nichtlineare Verstärkung kann beispielsweise gemäß der Funktion S = A • FN (Gleichung 1 ) oder S = A * expF/w (mit w = 10"N (Gleichung 2)) beschrieben werden, wobei F die Amplitude des Fluoreszenzsignals, A ein Normierungsfaktor und N eine ganze Zahl größer 1 ist. Besonders vorteilhaft ist eine starke nichtlineare Abhängigkeit des Parameters S von F, also z.B. hohe Werte für N in den Gleichungen 1 oder 2. Natürlich können auch andere Funktionen verwendet werden. Grundsätzlich ist die Nichtlinearität vorzugsweise so gewählt, daß die Halbwertsbreite der Beugungsscheibe einer angestrebten räumlichen Auflösung für die Ortsangabe der Markierungsmoleküle entspricht. Neben einer nichtlinearen Verstärkung kann auch eine nichtlineare Dämpfung verwendet werden. Hierbei werden Fluoreszenzsignale geringer Amplitude oder Intensität gedämpft, wohingegen starke Signale zumindest weitgehend ungedämpft bleiben. Natürlich kann auch eine Kombination von nichtlinearer Verstärkung und Dämpfung verwendet werden. Ein fünfter Schritt S5 setzt die Markierungsmoleküle, deren Lageangabe präzisiert ist, nun zu einem Einzelbild zusammen, dessen Ortsauflösung über die optische Auflösung hinaus gesteigert ist. Es enthält allerdings nur Informationen über die zuvor aktivierte Teilmenge der Markierungsmoleküle.
In einem sechsten Schritt S6 wird das Einzelbild auf bekannte Weise in ein Gesamtbild eingestellt. Anschließend wird zu Schritt S1 zurückgesprungen, wobei die bisher floureszierenden Moleküle wieder deaktiviert sein müssen. Eine Deaktivierung kann je nach Markierungsmolekülart durch eine separate Strahlung oder durch Abklingen des Aktivierungszustandes erreicht werden. Auch ist es möglich bereits abgebildete Markierungsmoleküle durch Anregungsstrahlung zu bleichen.
Mit jedem Durchlauf wird so ein weiteres Einzelbild erhalten, das zum Gesamtbild beiträgt. Im nächsten Durchlauf wird eine andere Teilmenge der Markierungsmoleküle aktiviert, z.B. die in Fig. 4 dargestellt Teilmenge l_n+1.
Durch den mehrfachen Durchlauf durch die Schritte S1 bis S6 wird das Gesamtbild aus Einzelbildern der einzelnen Durchläufe aufgebaut, welche die Orte der Markierungsmoleküle mit einer Ortsauflösung angeben, die gegenüber der Auflösung der optischen Abbildung geschärft ist. Durch eine entsprechende Anzahl von Iterationen baut sich somit ein hochaufgelöstes Gesamtbild sukzessive auf. Die Reduktion des Beugungsscheibchens erfolgt dabei bei dem Verfahren vorzugsweise in allen drei Raumdimensionen, wenn mehrere Bildstapel, welche in z- Richtung beabstandet sind, aufgenommen werden. Dann enthält das Gesamtbild in allen drei Raumrichtungen hochaufgelöst die Ortsangabe der Markierungsmoleküle.
Fig. 5 zeigt schematisch ein Mikroskop 6 zur hochauflösenden Abbildung einer Probe 7. Die Probe ist beispielsweise mit dem Farbstoff DRONPA (vergleiche WO 2007009812 A1 ) markiert. Zur Aktivierung sowie zur Fluoreszenzanregung weist das Mikroskop 6 eine Strahlungsquelle 8 auf, die über einzelne Laser 9 und 10 verfügt, deren Strahlen über einen Strahlvereiniger 11 zusammengeführt wird. Die Laser 9 und 10 können beispielsweise bei 405 nm (Aktivierungsstrahlung) und 488 nm (Fluoreszenzanregung und Deaktivierung) Strahlung abgeben. Es sind auch Farbstoffe bekannt (z.B. der Farbstoff namens DENDRA (vgl. Gurskaya et al., Nature Biotech., Band 24, S. 461-465, 2006)), bei denen die Aktivierung und Fluoreszenzanregung bei ein- und derselben Wellenlänge erfolgen kann. Dann genügt ein Laser.
Ein akustisch-optischer Filter 12 dient zur Wellenlängenselektion und zum schnellen Schalten I
oder Abschwächen einzelner Laserwellenlängen. Eine Optik 13 fokussiert die Strahlung über einen dichroitischen Strahteiler 14 in eine Pupille eines Objektivs 15, so daß auf der Probe 7 die Strahlung der Strahlungsquelle 8 als Weitfeldbeleuchtung einfällt.
In der Probe 7 entstehende Fluoreszenzstrahlung wird über das Objektiv 15 eingesammelt. Der dichroitische Strahlteiler 14 ist so ausgelegt, daß er die Fluoreszenzstrahlung passieren läßt, so daß sie durch ein Filter 16 zu einer Tubuslinse 17 gelangt, so daß insgesamt die fluoreszierende Probe 7 auf den Detektor 5 abgebildet wird.
Zur Steuerung des Betriebs des Mikroskops 6 ist eine Steuereinrichtung vorgesehen, hier als Computer 18 mit Anzeige 19 und Tastatur 20 ausgebildet. Die Verfahrensschritte S2 bis S6 erfolgen im Computer 18. Dabei ist die Bildrate des Matrix-Detektors ausschlaggebend für die Gesamtmeßzeit, so daß ein Matrix-Detektor 5 mit möglichst hoher Bildrate vorteilhaft ist, um die Meßzeit zu reduzieren.
Das beschriebene Verfahren realisiert mit dem Mikroskop 6 ein Gesamtbild, das z.B. eine um Faktor 10 gegenüber der optischen Auflösung des Mikroskops gesteigerte Ortsauflösung hat. Die optische Auflösung des Mikroskops 6 kann beispielsweise 250 nm lateral und 500 nm axial betragen.
Für den Betrieb des Mikroskops 6 zur PAL-Mikroskopie ist es natürlich wesentlich, daß der Anteil an isolierten Markierungsmolekülen 1 möglichst hoch ist, da dann wenig Einzelbilder vonnöten sind und die Bildaufnahmegeschwindigkeit optimal ist. Die Steuereinrichtung in Form des Computers 18 führt deshalb im Rahmen des anhand der Fig. 3 geschilderten Verfahrensablaufes eine Regelung durch, die anhand Fig. 6 erläutert sei:
Fig. 6 zeigt den Verfahrensablauf, wobei die in Fig. 3 bereits dargestellten und anhand dieser Figur erläuterten Schritte mit denselben Bezugszeichen versehen sind, so daß auf eine Beschreibungswiederholung verzichtet werden kann. Zusätzlich zu einem Startschritt SO und einem Endschritt S9 sowie einer im Verfahrensablauf auch bei Fig. 3 implizit vorgesehenen Abfrage S7, ob die Bildaufnahme abgeschlossen ist, zeigt Fig. 6 noch einen Schritt S8, der eine Einzelbildauswertung und Stellgrößenmodifikation darstellt. In diesem Schritt S8 wird ein zuvor erzeugtes Einzelbild ausgewertet, und aus der Auswertung folgt eine Modifikation von Betriebsparametern bei der Einbringung des Umschaltsignals (Schritt S1 ), bei der Fluoreszenzanregung (Schritt S2) und/oder bei der Fluoreszenzdetektion (Schritt S3). Der Schritt S8 muß dabei nicht nach jeder Erzeugung eines Einzelbildes ausgeführt werden. Je nach angestrebter Regelungsgeschwindigkeit und vertretbarem Regelungsaufwand kann der Schritt S8 auch nur nach jedem zweiten, dritten, etc. Durchlauf ausgeführt werden, wobei dann ein einzelnen Einzelbild oder die gesamte Gruppe der seit der letzten Ausführung des Schrittes S8 erzeugter Einzelbilder in der Auswertung verwendet werden kann.
Die Einzelbildauswertung erzeugt eine Gütefunktion, die z.B. ein Maß für die Separation der fluoreszierenden Markierungsmoleküle ist. Die zuvor allgemein beschriebenen Ansätze können hier einzeln oder in beliebigen Kombinationen zur Anwendung kommen.
Zusätzlich sei noch erwähnt, daß die Einzelbildauswertung sich auch auf explizit der Probe zugesetzten Marker richten kann, die nicht zur Markierung von zu analysierenden Probenelementen dienen, sondern lediglich zur Optimierung der Einzelbildaufnahme ausgewertet werden.
In Fig. 7 ist eine Weiterbildung des Mikroskop 6 der Fig. 5 dargestellt, das zusätzlich zum geschilderten PALM-Verfahren simultan auch klassische Mikroskopieverfahren, d. h. Mikroskopieverfahren deren Auflösung beugungsbegrenzt ist, ausführen kann. Elemente des in Fig. 7 gezeigten Mikroskops 21 , die denen des Mikroskops 6 entsprechen, sind mit denselben Bezugszeichen versehen. Die obige Beschreibung gilt für sie gleichermaßen, soweit nichts anderes vermerkt ist.
Das Mikroskop 21 ist modular aufgebaut, und zur besseren Erläuterung der Erfindung wird es in einer umfangreichen Ausbaustufe beschrieben. Es ist aber auch eine reduzierte Bauweise mit weniger Modulen möglich. Auch ist der modulare Aufbau auch nicht zwingend; eine einteilige oder nicht-modulare Bauform ist ebenfalls möglich. Das Mikroskop 21 ist auf Basis eines herkömmlichen Laser-Scanning-Mikroskops aufgebaut und erfaßt die Probe 7.
Durch das Objektiv 15 läuft die Strahlung für alle Mikroskopieverfahren. Das Objektiv 15 bildet über den Strahlteiler 14 die Probe 7 zusammen mit der Tubuslinse 17 auf den Detektor 5 ab, der allgemein ein Flächendetektor ist. Insofern verfügt das Mikroskop 21 über ein herkömmliches Lichtmikroskopmodul, und der Strahlengang von der Probe 7 durch das Objektiv 15 und die Tubuslinse 17 zum Detektor 5 entspricht einem herkömmlichen Weitfeld- Detektionsstrahlengang. Der Strahlteiler 14 ist vorzugsweise austauschbar, um zwischen Strahlteilern mit verschiedenen dichroitischen Eigenschaften bzw. achromatischen Strahlteilern gemäß US 2008/0088920 wechseln zu können.
In den Strahlengang zum Objektiv 21 ist weiter ein Laser-Scanning-Modul 22 angebunden, dessen LSM-Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang über einen weiteren, ebenfalls vorzugsweise austauschbaren Strahlteiler 23 in den Strahlengang zum Objektiv 15 eingekoppelt ist. Das Laser-Scanning-Modul 22 hat mehrere Komponenten. Eine Lasereinrichtung 24 umfaßt einen Laser 25, der einen angesteuerten Phasenmodulator 26 beaufschlagt. Eine Optik 27 bündelt die Strahlung dann auf ein DMD 28. Für den Detektionszweig des LSM-Moduls ist in Fig. 4 exemplarisch ein LSM-Detektor 29 sowie eine in einer Zwischenbildebene befindliche, konfokale Blende 30 eingezeichnet. Der Detektionszweig ist durch den Strahlteiler 23 angekoppelt. Die Strahlteiler 14 und 23 sind optional zu einem Strahlteilermodul 12 zusammengefaßt, wodurch dann die Möglichkeit besteht, sie anwendungsabhängig zu wechseln.
Die Lasereinrichtung 24 des Laser-Scanning-Moduls 22 erzeugt für den PALM-Betrieb erforderliche Strahlung analog der Strahlungsquelle 8, kann also Strahlung bei verschiedenen Wellenlängen abgeben oder umfaßt mehrere Laserquellen.
Als weiteres Beleuchtungsmodul ist ein optionales TIRF-Beleuchtungsmodul 31 vorgesehen, das eine einschaltbare TIRF-Beleuchtung realisiert. Das TIRF-Beleuchtungsmodul 31 erzeutg Strahlung oder erhält sie von einer Strahlungsquelle, z.B. einem Laser über eine Lichtleitfaser. Das TIRF-Beleuchtungsmodul 31 ist ausgebildet, am Objektiv 15 TIRF-Beleuchtung unter einem einstellbaren Winkel zur optischen Achse des Objektivs 13 einzustrahlen. Auf diese Weise kann einfach der Winkel der Totalreflexion am Deckglas sichergestellt werden. Auch kann das TIRF-Beleuchtungsmodul 31 als Weitfeldbeleuchtungsquelle arbeiten, wenn es einen Beleuchtungsstrahl auf der optischen Achse einstrahlt.
Die Module und Antriebe sowie Detektoren des Mikroskops 1 sind alle über nicht näher bezeichnete (gestrichelt gezeichnete) Leitungen mit einer Steuereinrichtung 32 verbunden. Diese Verbindung kann beispielsweise über ein Daten- und Steuernetzwerk 33 erfolgen. Die Steuereinrichtung 32 steuert das Mikroskop 21 in verschiedene Betriebsmodi.
Das Steuergerät 32 ist ausgebildet, um am Mikroskop 21 klassische Mikroskopie, d. h. Weitfeldmikroskopie (WF), Laserscanningmikroskopie (LSM) und auch Fluoreszenzmikroskopie mit totaler interner Reflexion (TIRF) auszuführen und diese dem hochauflösenden Mikroskopieverfahren PAL-M zu kombinieren.
Weiter ist in Fig. 4 exemplarisch ein Computer mit Anzeige 19 dargestellt, der ebenfalls an das Daten- und Steuernetzwerk 33 angeschlossen ist, über das die Steuereinrichtung 32 mit den einzelnen Komponenten des Kombinations-Mikroskops 21 verbunden ist.
Auch ist in Fig. 4 ein Probentisch 42 dargestellt, auf dem die Probe 7 unter Steuerung der Steuereinrichtung 32 verschieblich ist. Ein solcher Probentisch ist natürlich, wie alle anderen Details der Fig. 4 auch, auch im Mikroskop 6 der Fig. 5 möglich.
Weiter erlaubt das Mikroskop 21 eine verbesserte Aktivierung und/oder Anregung: Zum einen können Regionen besonderen Interesses (ROI) von einem Nutzer selbst, vom
Computer unterstützt oder automatisch ausgewählt werden, und die Steuerung der
Aktivierungsstrahlung aus dem Lasereinrichtung 24 wird entsprechend beeinflußt. Hierzu wird das DMD 28 eingesetzt, das vollflächig mit Laserstrahlung des Lasers 24 ausgeleuchtet ist. Die einzelnen Spiegel des DMD werden nun so gestellt, daß nur die ausgewählten ROI beleuchtet und damit nur in diesen Regionen eine optische Aktivierung des Markierungsstoffes (z. B.
DRONPA oder EOS-FP) durchgeführt wird. Die restlichen Spiegel des DMD 28 verbleiben in einer ausgeschalteten Position, und die darauf geleitete Strahlung wird in einer (nicht dargestellten) Strahlfalle absorbiert.
Zum anderen können die eingeschalteten DMD-Spiegel zeitmoduliert werden, um die Aktivierungsleistung kontinuierlich abzuschwächen. Hierdurch kann, für das PAL-Verfahren besonders vorteilhaft, die Aktivierungsleistung effizient an die Molekülkonzentration angepaßt werden, so daß sich unabhängig von der lokalen Markierungsmolekülkonzentration die aktivierten Moleküle in einem Abstand größer als die optische Auflösung des Mikroskops 21 befinden. Damit kann die Probe 7 besonders schnell vermessen werden, insbesondere da im Rahmen der beschriebene Regelung die Aktivierungsintensität und/oder räumliche Verteilung passend eingestellt werden kann. Eine lokale Einstellung ist besonders vorteilhaft, wenn starke lokale Konzentrationsänderungen auftreten, z. B. helle Bereiche neben schwach gefärbten Bereichen vorhanden sind. Weiter kann lokal unterschiedliches Ausbleichen von Markierungsstoffen, welche z. B. aufgrund von Strukturvariationen in der Probe 7 auftreten kann, zu lokalen Konzentrationsänderungen führen, die nun mit der Aktivierungsregelung besonders vorteilhaft ausgeglichen werden können.
Alternativ oder zusätzlich kann bei einer Aktivierung in vordefinierten ROI mittels des optionalen Phasenmodulators 26 das ROI-Muster vorgeformt auf die gesamte DMD 28 abgebildet werden, welche dann nur noch eine Feinabstimmung vornimmt. So wird die Leistung des Lasers 25 nahezu vollständig zur Aktivierung von Markierungsmolekülen in der Probe 7 eingesetzt. Der Phasenmodulator 26 ist dazu in einer Pupillenebene vor der DMD 28 (vom Laser 25 aus betrachtet) angeordnet und befindet sich im Abstand der Brennweite der Optik 27 (die auch durch eine einzelne Linse realisiert werden kann). Das DMD 28 ist wiederum im selben Abstand nach der Optik 27 lokalisiert. Alternativ kann man auch auf die DMD 28 verzichten, wenn beispielsweise die ROI-Auswahl durch den Phasenmodulator 26 erfolgt und die Intensität der Laserquelle 25 global geregelt wird, z. B. durch einen dem Laser nachgeschalteten Intensitätsmodulator oder eine direkte Intensitätsmodulation des Lasers 25. Die Intensitätsmodulation ist in der beschriebenen Regelung natürlich ganz grundsätzlich möglich, auch bei andersartig gestalteten Mikroskopen. Mit Hilfe des Kombinations-Mikroskops 1 der Fig. 1 oder 4 ist es zusätzliche möglich, sequentiell oder simultan LSM-Mikroskopie-Bilder und PAL-M-M ikroskopie-Bilder aufzuzeichnen und die Aufnahme der PAL-M-M ikroskopie-Bilder nicht nur mittels Informationen, die aus einem oder mehreren PALM-Einzelbildern gewonnen wurden, sondern auch mit Daten, die aus dem LSM-Mikroskopie-Bild erzeugt wurden, zu regeln.
Die zur Regelung der Einzelbildaufnahme verwendeten Stellgrößen können sein:
1. Detektionsseitig: a. Frequenzbänder/Filter; b. Verstärkungsfaktoren (z.B. Preamp Gain, EMCCD Gain); c. Temperatur eines Detektors; d. Integrationszeit der Detektion; e. Detektionsmodi (z.B. Photonenzählung, BaselineClamp) der Detektion; f. Auslesen nur spezieller ROIs; g. Polarisation der detektierten Strahlung; h. Fokus.
2. Anregungsseitig: a. Eingestrahlte Anregungs- und/oder Aktivierungsstrahlung; i. Pulsform oder CW; ii. Leistung und Pulsfrequenz; iii. Wellenlängen; b. Bestrahlungsdauer; c. Anregung lokal spezifisch (pixelgenau) oder spezieller ROIs oder flächig; d. Größe des Beleuchtungsfeldes; e. Eindringtiefe bei TIRF-Beleuchtung; f. Fokuslage.
3. Probenseitig:
Position der Beobachtungsregion in der Probe.
Die Einzelbildauswertung kann insbesondere Aussagen über folgende Parameter liefern:
1. Farbstoffeigenschaften: a. Bleichrate; b. Anregungs-/Emissionsspektren; c. Lebensdauer; d. Aktivierungsschwelle; e. Photonenrate pro Molekül; f. Blinkrate;
2. Abbildungs-/Bildeigenschaften: a. Form und Intensität der gemessenen Punktverwaschungsfunktionen, nicht nur der einzelnen aktivierten Moleküle sondern auch von eventuell der Probe beigesetzten Markern (z.B.: gold beads), Differenz in Form und Intensität der gemessenen PSFs bei unterschiedlichen Farben; b. Zeit, über die einzelne Moleküle im Mittel sichtbar sind; c. Anzahl der pro Punktverwaschungsfunktion aktivierten Moleküle, die sich räumlich und zeitlich überlappen (Maß für "Aktivierungsdichte"); d. Markierungsmoleküldichte (lokal definiert), gemessen durch z.B. Intensitäten der Fluoreszenz bei einer weiteren Wellenlänge. Dies ist für Farbstoffe möglich, die zwischen zwei fluoreszierenden Zuständen schalten/konvertieren (z.B. tdEoS).
Markierungsmoleküldichte kann darüber hinaus auch über Fluoreszenz bei der Meßwellenlänge bestimmt werden durch z.B. ein frühes Bild auf dem diverse bereits konvertierte, aber nicht geblichene Markierungsmoleküle zu sehen sind. Darüber hinaus kann auch über weitere korrelierte Färbungen oder andere Kontrastverfahren die Labeldichte geschätzt werden; e. Anzahl der gesammelten Photonen pro Molekül; f. Anzahl der aktivierten Moleküle pro Einzelbild; g. Mittlere Lokalisationsgenauigkeit der Moleküle pro Einzelbild; h. Zum Kameraschutz kann zum einen die Kombination aus verwendeten Filtern und Anregungsleitungen einzelner Laserwellenlängen verwendet werden, zum anderen aber auch die gemessenen Intensitäten detektierter Fluoreszenz bei anderen Wellenlängen; i. Korrelation von Fluoreszenzbildern aufgenommen mit u.U. unterschiedlichen Anregungswellenlängen oder Korrelation mit Bildern aus weiteren Kontrastverfahren wie z.B. DIC.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur räumlich hochauflösenden Lumineszenzmikroskopie einer Probe, die mit Markierungsmolekülen markiert ist, welche mit einem Umschaltsignal derart aktivierbar sind, daß sie erst im aktivierten Zustand zur Abgabe bestimmter Lumineszenzstrahlung anregbar sind, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: a) Einbringen des Umschaltsignals auf die Probe derart, daß nur eine Teilmenge der in der Probe vorhandenen Markierungsmoleküle aktiviert werden, wobei in der Probe Teilbereiche bestehen, in denen aktivierte Markierungsmoleküle zu den ihnen nächst benachbarten aktivierten Markierungsmoleküle mindestens einen Abstand haben, der größer oder gleich einer Länge ist, welche sich aus einer vorbestimmten optischen Auflösung ergibt, b) Anregung der aktivierten Moleküle zur Abgabe von Lumineszenzstrahlung, c) Detektion der Lumineszenzstrahlung mit der vorbestimmten optischen Auflösung, und d) Erzeugen eines Einzelbildes aus der in Schritt c) aufgenommenen Lumineszenzstrahlung, wobei die geometrischen Orte der Lumineszenzstrahlung abgebenden
Markierungsmoleküle mit einer über die vorbestimmte optische Auflösung gesteigerten Ortsauflösung ermittelt werden, wobei die Schritte mehrfach wiederholt werden und die so erhaltenen, mehreren Einzelbilder zu einem Gesamtbild zusammengefügt, dadurch gekennzeichnet, daß eine Regelung der Aufnahme der mehreren Einzelbilder erfolgt, indem nach Schritt d) zumindest ein Einzelbild oder eine Gruppe der Einzelbilder ausgewertet wird und mindestens eine Stellgröße der Schritte a-d für folgende Wiederholungen der Schritte a-d modifiziert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß bei der Regelung eine Gütefunktion ausgewertet und deren Wert maximiert wird, wobei die Gütefunktion so gewählt wird, daß sie direkt oder indirekt ein Maß für den Anteil der Markierungsmoleküle in der Probe ist, welche aktiviert sind und zu den ihnen nächst benachbarten aktivierten Markierungsmoleküle mindestens den Abstand haben, der mit der vorbestimmten optischen Auflösung auflösbar ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gütefunktion ein Dichtemaß für die aktivierten Moleküle ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auswertung der Gütefunktion in jedem der ausgewerteten Einzelbilder lumineszierende Gebiete ermittelt werden, die von benachbarten lumineszierenden Gebieten isoliert sind, in den isolierten lumineszierenden Gebieten ein Maß für die Menge der vom jeweiligen isolierten lumineszierenden Gebiet abgegebenen Lumineszenzstrahlung ermittelt wird, und der Anteil der Gebiete, für die ein unter einem Schwellwert liegendes Mali auftritt, als Wert der Gütefunktion genommen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Maß für die Menge der abgegebenen Lumineszenzstrahlung ein Integral über die Lumineszenzstrahlungsintensität oder das Maximum der Lumineszenzstrahlungsintensität ist.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auswertung der Gütefunktion in jedem der ausgewerteten Einzelbilder lumineszierende Gebiete ermittelt werden, die von benachbarten lumineszierenden Gebieten isoliert sind, für jedes dieser isolierten lumineszierenden Gebiete der minimale Abstand zum nächst benachbarten lumineszierenden Gebiet bestimmt wird und der Anteil der Gebiete, deren minimaler Abstand größer als ein durch die vorbestimmte optische Auflösung vorgegebener, auflösbarer Mindestabstand oder ein vorgegebenes Vielfaches dieses Abstandes ist, als Wert der Gütefunktion genommen wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung des minimalen Abstandes ein Kreis um das geometrischen Zentrum des jeweiligen lumineszierenden Gebietes gelegt wird, der bis zum nächst benachbarten lumineszierenden Gebietes reicht, und daß der Anteil der Gebiete, deren Kreisradius größer als der Abstand oder ein vorgegebenes Vielfaches des Abstandes ist, als Wert der Gütefunktion genommen wird.
8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Gruppe aufeinanderfolgender Einzelbilder ausgewertet wird, in jedem der ausgewerteten Einzelbilder lumineszierende Gebiete ermittelt werden, die von benachbarten lumineszierenden Gebieten isoliert sind, und der Anteil der lumineszierenden Gebiete, die in genau einem Einzelbild der Gruppe lumineszieren, als Wert der Gütefunktion genommen wird.
9. Verfahren nach eine der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Stellgrößen mindestens einen der folgenden Parameter umfassen:
Filterung, Polarisationsfilterung, Verstärkung, Detektortemperatur, Integrationsdauer, Detektionsfeldwahl, Fokuslage und -große bei der Detektion der Lumineszenzstrahlung; und
Leistung, Pulsform, Pulsfrequenz, Wellenlängen, Bestrahlungsdauer, Bestrahlungsfeldwahl, Eindringtiefe eine TIRF-Beleuchtung, Fokuslage und -große beim Einbringen des Umschaltsignals oder bei der Anregung der aktivierten Moleküle.
10. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der Bildauswertung mindestens eine der folgenden Größen erfaßt und ausgewertet wird: Bleichrate der Markierungsmoleküle, Anregungs- und Emissionsspektren der Markierungsmoleküle, Lebensdauer von Lumineszenzzuständen der Markierungsmoleküle, Aktivierungsschwelle der Markierungsmoleküle, Blinkrate der Markierungsmoleküle, Zeit, über die einzelne Markierungsmoleküle im Mittel sichtbar sind, Anzahl an innerhalb der optischen Auflösung zusammenfallenden, lumineszierenden Markierungsmolekülen, Anzahl der gesammelten Photonen pro lumineszierendem Markierungsmolekül, Anzahl der aktivierten Markierungsmolekülen pro Einzelbild, mittlere Lokalisierungsgenauigkeit der Markierungsmoleküle pro Einzelbild.
11. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß weitere, optische Auflösung aufweisende Fluoreszenzbilder mit mehreren Anregungswellenlängen oder Kontrastverfahren aufgenommen werden und die Einzelbilder für die Auswertung mit diesen Fluoreszenzbildern korreliert werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die weiteren Fluoreszenzbilder während der Aufnahme der Einzelbilder aufgenommen werden.
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