WO2010058605A1 - 細胞の状態を評価する方法 - Google Patents

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WO2010058605A1
WO2010058605A1 PCT/JP2009/006293 JP2009006293W WO2010058605A1 WO 2010058605 A1 WO2010058605 A1 WO 2010058605A1 JP 2009006293 W JP2009006293 W JP 2009006293W WO 2010058605 A1 WO2010058605 A1 WO 2010058605A1
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sugar chain
cells
differentiation
abundance
type
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PCT/JP2009/006293
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西村紳一郎
天野麻穂
武川泰啓
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国立大学法人 北海道大学
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the state of a cell, for example, a method for evaluating the level of differentiation of a stem cell or progenitor cell that has been induced to differentiate, in particular, the level of differentiation of a stem cell or progenitor cell that has been induced to differentiate into cardiomyocytes or neurons.
  • a method for evaluating the state of a cell for example, a method for evaluating the level of differentiation of a stem cell or progenitor cell that has been induced to differentiate, in particular, the level of differentiation of a stem cell or progenitor cell that has been induced to differentiate into cardiomyocytes or neurons.
  • Non-patent Document 1 since 2000, quantitative RT-PCR has become commonly used, and it has become possible to detect transcription of genes specific for differentiation in an absolute quantitative manner (Non-patent Document 1). . However, there are genes that are transcribed but not translated during cell differentiation, suggesting that the transcription level of the gene does not directly reflect the differentiation level (Non-patent Document 2). .
  • Patent Document 1 There is also a method for performing absolute quantification of differentiation level by detecting a specific protein released into the medium after differentiation induction (Patent Document 1).
  • Patent Document 2 JP2007-228873 (P2007-228873A) JP2007-37434 (P2007-37434A) WO2004 / 058687 Bustin, SA J Mol Endocrinol. 25: 69-193 (2000) Wen, J.
  • Non-patent Document 2 a transcriptional change of a gene accompanying cell differentiation is generally excellent in quantitativeness, but does not necessarily reflect a cell state.
  • detection of a protein that is a translation product can be a reliable evaluation criterion in detecting a cell state such as differentiation.
  • quantitative analysis becomes difficult, and as a result, versatility is lowered.
  • the problem to be solved by the present invention is to find a new index of the state of cells instead of genes and proteins, for example, the level of differentiation, and to find a means that can grasp this new index as quantitatively as possible.
  • another object is to provide means for grasping the differentiation level of a cell differentiated into a specific cell using the new index.
  • glycans from cells before and after differentiation for example, cells are differentiated. They were captured comprehensively and the quantitative expression profiles of sugar chains present in each cell were clarified by mass spectrometry techniques such as MALDI-TOF / MS. Based on this, we found sugar chains that fluctuate in association with cell differentiation levels (cell differentiation stages or types). That is, a sugar chain that serves as a differentiation marker or a fluctuating sugar chain was identified, and a method for quantitatively determining a differentiation level with high sensitivity and specificity was established. Furthermore, based on the information obtained here, by introducing the concept of “glycan type”, it has been found that cells can be subgrouped, and based on this, the degree of cell differentiation can be quantitatively determined. Was completed (FIG. 6).
  • the sugar chain classification method is divided into two types: high mannose type and non-high mannose type, and non-high mannose type is further divided into (1) presence / absence of bisecting and (2) number of fucose
  • cell differentiation can be quantitatively determined by dividing into categories of (0, 1 or 2 or more), (3) presence or absence of sialic acid and the type of modification, and (4) branching degree (2 or 3 or more). It was.
  • the state of cells for example, the level of differentiation of progenitor cells, stem cells, etc., that is, the quality
  • the state of cells can be quantitatively determined by a method having superiority or complementary superiority in sensitivity and specificity. Judgment and management are possible. Furthermore, the high-sensitivity and quantitative measurement of the differentiation level of stem cells and the like is possible, which improves the quality and safety management system, and can be expected to contribute to regenerative medicine.
  • staining about the cell after differentiation induction obtained in Example 2 and the cell before differentiation is shown.
  • the profile of the expression level of each sugar chain obtained in Example 3 is shown.
  • Peak No. 68 is the peak of the internal standard.
  • the profile of the expression level of each sugar chain obtained in Example 3 is shown (the vertical axis in FIG. 3-1 is enlarged).
  • the result obtained by subgrouping the sugar chain types before and after differentiation (bisecto, other than bisecto, high mannose) from the profile obtained in Example 3 is shown.
  • the profile of the expression level of each sugar chain obtained in Example 4 is shown.
  • Peak No. 54 is an internal standard peak.
  • the profile of the expression level of each sugar chain obtained in Example 4 is shown (the vertical axis in FIG. 4-1 is enlarged).
  • Example 4 From the profile obtained in Example 4, the results are shown by subgrouping according to the sugar chain type (mono-Fuc, di-Fuc, non- Fuc, high mannose) before and after differentiation. From the profile obtained in Example 4, the results are shown by subgrouping the sugar chain types (mono-SA, di-SA, non- SA, mono-Gc, di-Gc, high mannose) before and after differentiation. Examples of conventional methods for classifying sugar chains by high mannose type, hybrid type and complex type. The ratio represents percentage (%), and the total represents the expression level (pmol). The result which shows the grade of a cell differentiation to the method of this invention obtained in Example 1 and 2. FIG. The ratio represents percentage (%), and the total represents the expression level (pmol).
  • the first aspect of the present invention is a method for determining the category of sugar chains used for evaluating the state of cells.
  • This method includes the following steps. (1-1) To obtain a quantitative profile of N-linked sugar chains contained in cells before the state change, (1-2) to obtain a quantitative profile of N-linked sugar chains contained in cells after the state change, (1-3) extracting at least a part of a sugar chain group having a variation between abundances in the two quantitative profiles; (1-4) Each sugar chain contained in the extracted sugar chain group is divided into high mannose type and non-high mannose type categories based on the sugar chain type, and the non-high mannose type is further (1) presence or absence of bisecting , (2) the number of fucose (0, 1 or 2 or more), (3) the presence or absence of sialic acid, and (4) the degree of branching (2 or 3 or more), (1-5) Determining at least one sugar chain category suitable for evaluating the state of cells from the above five categories
  • Cell changes in the method for determining a sugar chain category of the present invention include cell division, morphological change, cell death, canceration, etc. in addition to stem cell or progenitor cell differentiation, but the present invention is limited to these. It is not a thing.
  • the cell state includes a static state and a dynamic state (change of state over time) of the cell.
  • the second aspect of the present invention is a method for evaluating the state of a cell.
  • This method is a method for evaluating the state of a cell using at least one of the sugar chain categories determined in the sugar chain category determining method according to the first aspect of the present invention.
  • the method for evaluating the state of a cell according to the second aspect of the present invention comprises: (2-1) obtaining a quantitative profile of N-linked sugar chains contained in cells before and after the state change; (2-2) Regarding at least one of the sugar chain categories determined by the method according to claim 1 from the quantitative profile, the state of the abundance or existence ratio of the sugar chain (group) included in the category This includes determining the change before and after the change.
  • the cell state evaluation method according to the second aspect of the present invention will also be described using a method for evaluating the differentiation level as an example in the method for evaluating the differentiation level of stem cells or progenitor cells induced to differentiate, which will be described later.
  • the third aspect of the present invention is a method for determining the category of a sugar chain used for evaluating the differentiation level of a stem cell or progenitor cell in which differentiation has been induced. This method includes the following steps.
  • step (3-1) a quantitative profile is obtained for N-linked sugar chains contained in stem cells or progenitor cells cultured in the absence of a differentiation-inducing agent.
  • step (3-2) a quantitative profile is obtained for N-linked sugar chains contained in stem cells or progenitor cells cultured in the presence of a differentiation-inducing agent.
  • Steps (3-1) and (3-2) may be performed sequentially or concurrently. When performing sequentially, either process may be implemented first.
  • stem cell means a cell having pluripotency or pluripotency, including the following other aspects.
  • stem cells include embryonic stem cells, tissue stem cells, living stem cells, or induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the cells are not intended to be limited to the above examples as long as the cells have pluripotency or multipotency.
  • the “progenitor cell”, including the following other aspects, is a cell obtained by inducing differentiation of the stem cell and having pluripotency.
  • differentiation of stem cells is induced, depending on the degree of differentiation, the degree of undifferentiation is lower than that of stem cells, but some cells still have pluripotency.
  • these cells are collectively referred to as “progenitor cells”.
  • the “progenitor cell” is not particularly limited as long as it is a pluripotent cell.
  • the P19CL6 and P19C6 cell lines used in Example 1 and Example 2 are both progenitor cells.
  • stem cells and “progenitor cells” can be derived from animals, such as mammals and fish.
  • mammals include humans, mice, rats, sheep, pigs, monkeys, and examples of fishes include medaka and zebrafish. However, it is not intended to be limited to these examples.
  • the culture of stem cells or progenitor cells performed in the absence or presence of a differentiation inducer can be performed by a known method as a method of culturing stem cells or progenitor cells.
  • the differentiation inducer is not particularly limited and can be appropriately selected according to the type of stem cell or progenitor cell.
  • the first aspect of the present invention is a method for determining the category of a sugar chain used for evaluating the differentiation level of stem cells or progenitor cells, differentiation has a high effect of differentiation induction and can surely induce differentiation.
  • the use of an inducer is preferred from the viewpoint of easy determination of the sugar chain category.
  • the differentiation level (cell differentiation stage or type) may differ, so it is not always recommended to use a differentiation inducer that can reliably induce differentiation. Of course, it can be used properly according to the desired differentiation level.
  • the type of differentiation-inducing agent in the culture may be one or a plurality, and the concentration of the differentiation-inducing agent in the culture (medium) can be appropriately selected.
  • the cultured stem cells or progenitor cells are subjected to a process for separating and purifying the N-linked glycans contained in the cells, and it is appropriate to obtain a quantitative profile for the separated and purified N-linked glycans. is there.
  • Separation and purification of N-linked glycans are performed by, for example, the glycoblotting method described in Patent Document 3 and Non-Patent Document 3, so that N-linked glycans can be separated quickly and without leakage. It is preferable from the viewpoint that it can be purified.
  • the quantitative profile is determined so that the differentiation of the stem cells or progenitor cells cultured with the differentiation-inducing agent is more than a certain degree, that is, the progress of differentiation becomes clear.
  • the degree to which the progress of differentiation becomes clear varies depending on the type of cell, the type of differentiation-inducing agent, the culture conditions, etc., and therefore it is appropriate to appropriately determine in consideration of these conditions.
  • the quantitative profile is preferably determined by separating and purifying N-linked glycans from MALDI-TOF / MS (matrix-assisted trixlaser desorption / ionization-time of flight / mass spectrometry) or LC-ESI / SSI-TOF / Obtained by MS (liquid chromatography, electrospray ionization, sonic spray ionization-time, foflight, and massspectrometry)
  • MALDI-TOF / MS or LC-ESI / SSI-TOF / MS N-linked glycans can be quantified quickly and with high accuracy, and a quantitative profile can be obtained.
  • step (3-3) at least a part of the sugar chain group that varies between the abundances in the two quantitative profiles obtained in steps (3-1) and (3-2) is extracted. To do. Further, in step (3-4), each sugar chain included in the sugar chain group extracted in step (3-3) is divided into high mannose type and non-high mannose type categories based on the sugar chain type, and High Mannose type is further classified into (1) Bisect presence, (2) Number of fucose (0, 1 or 2 or more), (3) Presence or absence of sialic acid, and (4) Degree of branching (2 or 3 or more) Divide.
  • the present inventors have found that the above five categories can be listed as the sugar chain categories used for evaluating the differentiation level of stem cells or progenitor cells.
  • the sugar chain group in the quantitative profile may vary depending on the cell type and the direction and degree of differentiation, but is usually about several tens to several hundreds. Among them, at least a part of the sugar chain group whose abundance varies according to the differentiation level is extracted, and the extracted sugar chain group is divided into five categories based on the sugar chain type.
  • At least one sugar chain category suitable for evaluating the cell state is determined from the five categories.
  • the glycan category suitable for assessing the state of the cell is, for example, a stem cell or progenitor cell cultured in the absence of a differentiation-inducing agent, although the variation over time of the abundance or abundance is not significant.
  • a stem cell or progenitor cell cultured in the presence of a differentiation-inducing agent it can be a category in which sugar chains whose change over time in the abundance or abundance is significant are classified.
  • the category of the sugar chain selected and determined here can be used as an evaluation index of the differentiation level in the method for evaluating the differentiation level of the stem cell or progenitor cell in which differentiation is induced, which will be described later.
  • the fourth aspect of the present invention is a method for evaluating the differentiation level of stem cells or progenitor cells in which differentiation has been induced. This method includes the following steps. (4-1) Obtaining a quantitative profile over time for N-linked sugar chains contained in stem cells or progenitor cells cultured in the presence of a differentiation-inducing agent, (4-2) For at least one of the sugar chain categories determined by the method of the third aspect of the present invention from the quantitative profile, the abundance or presence of the sugar chain (group) included in the category Find the percentage change over time.
  • step (4-1) acquisition of a quantitative profile for N-linked glycans contained in stem cells or progenitor cells cultured in the presence of a differentiation-inducing agent was performed in the same manner as in step (3-2) above. can do.
  • the quantitative profile is acquired over time. Specifically, the culture is sampled as the culture time elapses, and a quantitative profile is obtained for the N-linked sugar chain separated and purified from the sampled culture. Acquisition of the quantitative profile over time is performed at least once after the start of the culture, and can be preferably performed twice or more, for example, twice, three times, or four times. However, it can be performed more than 4 times.
  • step (4-2) for at least one of the sugar chain categories determined by the method of the third aspect of the present invention, the presence of the sugar chain (group) included in the category in the quantitative profile Determine the change over time in quantity or abundance.
  • the sugar chain category determination method of the third aspect of the present invention a sugar chain type (sugar chain category) that can be used as a differentiation marker used in the myocardial differentiation level evaluation method and neuronal differentiation level evaluation method described below was found. . Details will be shown in the Examples, the differentiation marker that can be used in the myocardial differentiation level evaluation method is at least one selected from the group consisting of a sugar chain group of a type having one fucose and a sugar chain group of a type having two fucose. It has been found that one can be used.
  • a differentiation marker that can be used in the method for evaluating the differentiation level of nerve cells, it can be seen that at least one selected from a group of sugar chains having a bisecting structure and a group of sugar chains having no bisecting structure can be used. It was issued.
  • the fifth aspect of the present invention is a method for evaluating the myocardial differentiation level of stem cells or progenitor cells.
  • This method (5-1) To obtain a quantitative profile over time for N-linked sugar chains contained in stem cells or progenitor cells cultured in the presence of a myocardial differentiation inducer, (5-2) Abundance or abundance of a type of sugar chain group having one fucose in the quantitative profile, abundance or abundance of a type of sugar chain group having two fucose, and a high-mannose sugar Obtaining at least one selected from the group consisting of the abundance or proportion of the chain group; including.
  • Examples of the myocardial differentiation inducer include dimethyl sulfoxide (DMSO), oxytocin and the like. Acquisition of a quantitative profile for an N-linked sugar chain over time can be performed in the same manner as in step (3-2) of the third aspect.
  • the differentiation inducer used is a myocardial differentiation inducer.
  • the stem cells or progenitor cells used in the method of the present invention are those shown in the first embodiment, and in particular, P19CL6 cells, ES cells, iPS cells and the like are preferable.
  • the myocardial differentiation level can be evaluated based on the abundance or existence ratio of any of these sugar chain groups, but preferably based on the abundance or existence ratio of these three sugar chain groups. , Comprehensive evaluation.
  • Examples of the type of sugar chain group having one fucose are Chemical Formula 3, Chemical Formula 19, and Chemical Formula 31 in Table 1.
  • Examples of the type of sugar chain group having two fucose are Chemical Formula 20, Chemical Formula 28, and Chemical Formula 34 in Table 1.
  • the high mannose type sugar chain group is, for example, Chemical formula 5, Chemical formula 8, and Chemical formula 14 in Table 1.
  • Example 1 in mouse progenitor cells, cells in which the abundance or proportion of a type of sugar chain group having one fucose in the quantitative profile is increased by culture increase the level of myocardial differentiation. It is a thing. Similarly, cells in which the abundance or proportion of the type of sugar chain group having two fucose has been reduced by the culture have increased myocardial differentiation levels.
  • the sixth aspect of the present invention is a method for evaluating the level of differentiation of mouse-derived stem cells or progenitor cells into neurons.
  • This method (6-1) Obtaining a quantitative profile over time for N-linked sugar chains contained in stem cells or progenitor cells cultured in the presence of an agent for inducing differentiation into neurons, (6-2) An abundance or abundance of a type of sugar chain group having a bisecting structure in the quantitative profile, an abundance or abundance of a sugar chain group of a type having no bisecting structure Seeking at least one selected from the group consisting of including.
  • Examples of the nerve cell differentiation inducer include retinoic acid and DMSO. Acquisition of a quantitative profile for an N-linked sugar chain over time can be performed in the same manner as in step (3-2) of the first aspect.
  • the differentiation inducer used is a differentiation inducer for nerve cells.
  • the stem cells or progenitor cells used in the method of the present invention are those shown in the first embodiment, and in particular, P19 cells, P19C6 cells, ES cells, iPS cells and the like are preferable.
  • the abundance or abundance of a type of sugar chain having a bisecting structure, abundance or abundance of a type of sugar chain having no bisecting structure, and a abundance of a high-mannose type sugar chain in the quantitative profile Find at least one selected from the group consisting of abundance.
  • the level of differentiation into nerve cells can be evaluated based on the abundance or abundance ratio of any of these sugar chain groups, but preferably the abundance or abundance ratio of these three sugar chain groups. Overall evaluation based on
  • the bisecting structure is a sugar chain structure having bisecting GlcNAc. It is known that when bisecto GlcNAc is added to the structure of the skeleton sugar chain, further branching will not occur and the sugar chain will not be cleaved. The reaction of bisecting GlcNAc added to the sugar chain structure is catalyzed by an enzyme called GnT-III. (Ikeda, Y., et al., Trends in Glycoscience and Glycotechnology 13: 167-176 (the entire description of this document is specifically incorporated herein by reference).
  • the type of sugar chain group having a bisecting structure is, for example, Chemical formula 15, Chemical formula 45, Chemical formula 64 in Table 2.
  • the types of sugar chains having no bisecting structure are, for example, Chemical Formula 17, Chemical Formula 21, and Chemical Formula 68 in Table 2.
  • the high mannose type sugar chain group is the same as that described in the fifth embodiment.
  • cells in which the abundance or ratio of the type of sugar chain having the bisecto structure increased by culture were those in which the level of differentiation into neurons increased. is there. Furthermore, the cells in which the abundance or the proportion of the sugar chain group of the type not having the bisecting structure is reduced by the culture have an increased level of differentiation into nerve cells. In addition, the cells in which the abundance or existence ratio of the high-mannose sugar chain group has been reduced by the culture have increased levels of differentiation into neurons.
  • Example 3 also in mouse ES cells, cells in which the abundance or existence ratio of a type of sugar chain group having a bisecting structure was increased by culturing increased in the level of differentiation into nerve cells. . Furthermore, the cells in which the abundance or the existence ratio of the type of sugar chain group having no bisect structure is reduced by the culture have an increased level of differentiation into nerve cells. Further, the cells in which the abundance or the existence ratio of the high-mannose sugar chain group is reduced by the culture are those in which the level of differentiation into nerve cells is increased.
  • the seventh aspect of the present invention is a method for evaluating the level of differentiation of human-derived stem cells or progenitor cells into neurons.
  • This method (7-1) to obtain a quantitative profile over time for N-linked sugar chains contained in stem cells or progenitor cells cultured in the presence of a differentiation-inducing agent for neurons, (7-2)
  • An abundance or abundance of a type of sugar chain group having one fucose in the quantitative profile, an abundance or abundance of a type of sugar chain having no sialic acid, and a high mannose type Obtaining at least one change over time selected from the group consisting of abundance or abundance of sugar chains, including.
  • Process (7-1) Examples of the agent for inducing differentiation into nerve cells include retinoic acid, DMSO and the like, as in the step (6-1). Acquisition of a quantitative profile for an N-linked sugar chain over time can be performed in the same manner as in step (3-2) of the first aspect.
  • the differentiation inducer used is a differentiation inducer for nerve cells.
  • the human-derived stem cells or progenitor cells used in the method of the present invention are those shown in the first embodiment, and ES cells, iPS cells and the like are particularly preferable.
  • Process (7-2) The abundance or abundance of a type of sugar chain group having one fucose in a quantitative profile, the abundance or abundance of a type of sugar chain without a sialic acid, and the abundance of a high-mannose type sugar chain group Alternatively, at least one change over time selected from the group consisting of abundance ratios is obtained.
  • the level of differentiation into nerve cells can be evaluated based on the abundance or abundance ratio of any of these sugar chain groups, but preferably the abundance or abundance ratio of these three sugar chain groups. Overall evaluation based on
  • the type of sugar chain having one fucose, the type of sugar chain not having sialic acid, and the type of high-mannose type sugar chain can be, for example, the sugar chains shown in Table 4 of Example 4.
  • Example 4 in human ES cells, cells in which the abundance or existence ratio of a type of sugar chain group having one fucose increased by culturing increased in the level of differentiation into neurons. is there. Furthermore, cells in which the abundance or abundance of a type of sugar chain group (Non-SA) that does not have sialic acid is increased by culturing, and the level of differentiation into neurons is increased. Further, the cells in which the abundance or the existence ratio of the high-mannose sugar chain group is reduced by the culture are those in which the level of differentiation into nerve cells is increased.
  • Cell glycoics used in the examples were performed according to the following protocol. ⁇ Preparation of cell lysate and release of N-Glycan> ⁇ Collect cells from dish using cell scraper in 10 mM EDTA / PBS and wash with PBS ⁇ Add 1% (final concentration) TritonX-100 and incubate on ice for 1 hour to solubilize cells . • Add 80% (final concentration) acetone and incubate overnight at -20 ° C to precipitate the protein fraction. -After centrifugation, the precipitate is washed with acetonitrile to completely remove the acetone.
  • -Trypsin is inactivated at 90 ° C for 10 minutes, and 2 U of Peptide N-Glycanase F is added to release N-linked sugar chains. -The released sugar chain was added with 15 pmol of A2 amide Glycan as an internal standard, and then concentrated with SpeedVac to a final volume of 20 ⁇ L.
  • ⁇ Glyco blotting using BlotGlyco (R) H beads > ⁇ Release with Peptide N-Glycanase F, add 15 pmol of A2 amide Glycan as internal standard, concentrate with SpeedVac, and add N-linked sugar chain to a final volume of 20 ⁇ L to 5 mg of BlotGlyco (R) H beads . Add 180 ⁇ L of acetonitrile containing 2% acetic acid to 1. ⁇ Leave at 80 °C for 45 minutes. • Wash the beads twice with 200 ⁇ L each of 16.6 mM ammonium bicarbonate solution containing 2M guanidine-hydrochloric acid, pure water, and methanol solution containing 1% triethylamine.
  • Example 1 Mouse fetal cancer cell-derived cell P19CL6 was induced to differentiate into cardiomyocytes, and undifferentiated and differentiated cells were subjected to glycomics.
  • 3.7x10 5 cells / 6cm-dish mouse embryonic cancer cell-derived cell P19CL6 was seeded in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, and 1% dimethyl sulfoxide (DMSO) was used for differentiation induction group After the addition, the control group was cultured without any addition. On the 16th day after the start of culture, after confirming the pulsation of the entire differentiation-inducing group, cells were collected from both groups, and all N-linked glycans in the cells were captured and purified by the above-mentioned glycoblotting method. Went. A total cellular protein equivalent to 200 ⁇ g was analyzed, and a quantitative profile was obtained by MALDI-TOF / MS.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • each sugar chain shown in FIG. 1-1 uses the absolute quantitative value of the sugar chain calculated from the area ratio on the spectrum with the known amount oligosaccharide added as an internal standard. From these results, 42 types of sugar chains in which significant fluctuations were observed were confirmed. With the differentiation, sugar chains of one type with Fuc showed an increasing tendency for 11 types of structures, but 6 types of structures of sugar chain types with two Fuc were significantly different in the differentiation-inducing group. Found to decrease. Thus, it was found that the level of cell differentiation can be quantitatively determined by subgrouping by sugar chain type (Fig. 1-2).
  • sarcomericin a protein specific to cardiomyocytes
  • Primary antibody MF20 (mouse monoclonal anti-sarcomere myosin)
  • Secondary antibody HRP-polymer conjugated anti-IgG Chromogenic substrate: Diaminobenzidine (DAB)
  • pulsation was confirmed (visual evaluation) for cells after differentiation induction and cells cultured without differentiation induction. As a result, pulsation was not observed in the group without differentiation induction, but pulsation was observed in about 80% of cells in the group with differentiation induction.
  • the 42 types of sugar chains, 11 types of sugar chains that have one Fuc, 6 types of sugar chains that have 2 Fuc, and high-mannose type sugar chains are shown below. It is as follows.
  • the types of sugar chains that have one fucose are shown in Table 1. Chemical 2, Chemical 3, Chemical 6, Chemical 10, Chemical 12, Chemical 15, Chemical 16, Chemical 19, Chemical 24, Chemical 25, Chemical 27, Chemical These are: Chemical formula 31, Chemical formula 31, Chemical formula 33, Chemical formula 36, Chemical formula 37, Chemical formula 39, Chemical formula 40, Chemical formula 41, Chemical formula 42.
  • the types of sugar chains having two fucose are Chemical Formula 20, Chemical Formula 22, Chemical Formula 28, Chemical Formula 29, Chemical Formula 34, Chemical Formula 35, and Chemical Formula 38 in Table 1.
  • the high mannose sugar chains are Chemical Formula 5, Chemical Formula 8, Chemical Formula 14, and Chemical Formula 17.
  • Example 2 Mouse embryonic tumor cell P19C6 was induced to differentiate into neurons, and the following three steps were performed: undifferentiation, differentiation intermediates, and glycomics after differentiation.
  • Step 1 Adhesive culture of undifferentiated cells P19C6 cells was performed for several days in a cell culture dish using 15% FBS / DMEM as a medium. When the cells were 80-90% confluent, the cells were collected and proceeded to step 2 for glycomics or to induce differentiation.
  • Step 2 Prepare cell suspension by trypsinization of cells that became 80-90% confluent in differentiation intermediate cell step 1 and perform hanging drop culture in bacterial grade petri dishes (dish) It was. At this time, 10 ⁇ L of a cell suspension (10 5 cells / mL) was applied to a lid of a 10 cm dish (100 5 spots) at 100 spots, and suspension culture was performed to form cell aggregates. The medium used was 10% FBS / ⁇ MEM supplemented with 1 ⁇ M retinoic acid to induce differentiation. After 4 days, cell clumps were collected and proceeded to glycomics or step 3 to induce further differentiation.
  • Step 3 trypsinize the aggregate of the cells collected after differentiation , prepare a cell suspension, seed the cells to a polylysine-coated 6 cm dish (dish) at 5 x 10 4 cells / cm 2 , Adhesion culture was performed. As the medium, DMEM / F12 supplemented with N-2 supplement and fibronectin was used. After 5 days, the cells were collected and subjected to glycomics.
  • the type of sugar chain having bisecto GlcNAc, the type of sugar chain not having bisecto GlcNAc, and the high-mannose type sugar chain are as follows.
  • the types of sugar chains having a bisecting structure are shown in Table 2, Chemical Formula 15, Chemical Formula 22, Chemical Formula 23, Chemical Formula 30, Chemical Formula 36, Chemical Formula 37, Chemical Formula 38, Chemical Formula 44, Chemical Formula 45, Chemical Formula 46, Chemical Formula 48, Chemical Formula 53. Chemical formula 55, chemical formula 56, chemical formula 60, chemical formula 61, chemical formula 64, chemical formula 67.
  • the types of sugar chains that do not have a bisecting structure are shown in Table 2, Chemical Formula 8, Chemical Formula 8 to Chemical Formula 10, Chemical Formula 12 to 14, Chemical Formula 17 to Chemical Formula 21, Chemical Formula 25 to Chemical Formula 29, Chemical Formula 32 to Chemical Formula 35, Chemical Formula They are 40 to 43, 47, 50 to 52, 54, 57 to 59, 62, 63, 65 and 66.
  • the high mannose type sugar chain groups are Chemical Formula 5, Chemical Formula 7, Chemical Formula 11, Chemical Formula 16, Chemical Formula 24, Chemical Formula 31, and Chemical Formula 39 in Table 2.
  • Example 3 Mouse ES cells were induced to differentiate with retinoic acid, and the undifferentiated and differentiated cells were subjected to glycomics.
  • the differentiation induction method and the quantitative analysis of the sugar chain expression level were performed in the same manner as in Example 2.
  • the results of quantitative analysis of the sugar chain expression level are shown in FIGS. 3-1 and 3-2 (the vertical axis in FIG. 3-1 is enlarged).
  • subgrouping was performed with a structure that is considered to have bisecto GlcNAc and a sugar chain of a type that does not, and the result is shown in Fig. 3-3. This result shows that cell differentiation can be quantitatively monitored by this method.
  • the type of sugar chain having bisecto GlcNAc, the type of sugar chain not having bisecto GlcNAc, and the high-mannose type sugar chain are as follows.
  • the types of sugar chains having a bisecting structure are shown in Table 3, Chemical Formula 29, Chemical Formula 37, Chemical Formula 38, Chemical Formula 58, Chemical Formula 59, Chemical Formula 60, and Chemical Formula 67.
  • the types of sugar chains that do not have a bisecting structure are shown in Table 3 below: Chemical formula 4, Chemical formula 7, Chemical formula 8, Chemical formula 11, Chemical formula 13, Chemical formula 16, Chemical formula 18, Chemical formula 19, Chemical formula 20, Chemical formula 26, Chemical formula 26, Chemical formula 27, Chemical formula 31, Chemical formula 32, Chemical formula 33, Chemical formula 34, Chemical formula 35, Chemical formula 36, Chemical formula 40, Chemical formula 41, Chemical formula 42, Chemical formula 43, Chemical formula 44, Chemical formula 45, Chemical formula 46, Chemical formula 47, Chemical formula 52, Chemical formula 53, Chemical formula 54 Chemical formula 55, chemical formula 56, chemical formula 57, chemical formula 62, chemical formula 63, chemical formula 64, chemical formula 65, chemical formula 69, chemical formula 70, chemical formula 71, chemical formula 72.
  • the high mannose type sugar chain groups are Chemical Formula 12, Chemical Formula 17, Chemical Formula 22, Chemical Formula 30, Chemical Formula 39, Chemical Formula
  • Example 4 Human ES cells were induced to differentiate by the addition of retinoic acid, and the cells were subjected to glycomics with undifferentiated before addition of retinoic acid and after differentiation after addition.
  • the differentiation induction method and the quantitative analysis of the sugar chain expression level were the same as in Example 2.
  • the results of quantitative analysis of the sugar chain expression level are shown in FIGS. 4-1 and 4-2 (the vertical axis in FIG. 4-1). Furthermore, based on this result, subgrouping was performed for sugar chains of a type having one fucose and a type having no fucose, and the results are shown in FIG. 4-3. Furthermore, subgrouping was performed on sugar chains that do not have sialic acid and those that do not, and the results are shown in Fig. 4-4. These results indicate that cell differentiation can be quantitatively monitored by this method.
  • the type of sugar chain having one fucose the type of sugar chain not having sialic acid, and the high-mannose type sugar chain are as follows.
  • the types of sugar chains that have one fucose are shown in Table 4 below: Chemical formula 6, Chemical formula 11, Chemical formula 13, Chemical formula 17, Chemical formula 19, Chemical formula 32, Chemical formula 36, Chemical formula 37, Chemical formula 39, Chemical formula 44, Chemical formula 47, Chemical formula 50, 51, and 52.
  • the types of sugar chains that do not have sialic acid are shown in Table 4 below: Chemical formula 6, Chemical formula 7, Chemical formula 8, Chemical formula 11, Chemical formula 13, Chemical formula 14, Chemical formula 17, Chemical formula 19, Chemical formula 20, Chemical formula 34, Chemical formula 35, Chemical formula 36, chemical formula 37, chemical formula 38, chemical formula 39, chemical formula 42, chemical formula 44, chemical formula 46, chemical formula 47, chemical formula 49, chemical formula 52.
  • the high mannose type sugar chain groups are shown in Table 4, Chemical Formula 12, Chemical Formula 18, Chemical Formula 22, Chemical Formula 26, Chemical Formula 31, Chemical Formula 40, and Chemical Formula 48.
  • the present invention is useful, for example, in the fields of regenerative medicine and pharmaceutical manufacturing development related to stem cell differentiation.

Abstract

遺伝子やタンパク質に代わる細胞の状態、分化のレベルの新たな指標、この指標を定量的に把握する手段、この指標を用いた特定の細胞の状態、分化レベルを把握する手段を提供する。細胞の状態を評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法。状態変化前の細胞のN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得し、状態変化後の細胞に含まれるN-結合型糖鎖の定量的プロファイルを取得し、前記2つの定量的プロファイル中の存在量の間に変動がある糖鎖群を抽出し、抽出した糖鎖群に含まれる各糖鎖を糖鎖タイプに基づいて、ハイマンノース型とノンハイマンノース型、(1)バイセクトの有無、(2)フコースの数（０、１または２以上）、(3)シアル酸の有無、及び(4)分岐度（２または３以上）]のカテゴリーに分け、前記5つのカテゴリーの中から、細胞状態評価に適した糖鎖のカテゴリーを決定する。決定された糖鎖カテゴリーを用いる細胞状態、細胞分化の評価方法。

Description

細胞の状態を評価する方法 関連出願の相互参照
　本出願は、２００８年１１月２１日出願の日本特願２００８－２９８８１９号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　本発明は、細胞の状態を評価する方法、例えば、分化誘導した幹細胞または前駆細胞の分化のレベルを評価する方法、特に、心筋細胞または神経細胞へ分化誘導した、幹細胞または前駆細胞の分化のレベルを評価する方法に関する。
　細胞工学、再生医療の発展に伴い、細胞の状態を定量的かつ迅速に評価する方法が求められている。従来においては特定の遺伝子やタンパク質の発現レベルから細胞の状態を評価する方法が広く使われている。
　以下一例を挙げる。幹細胞（例えば、iPS細胞、ES細胞等として知られている）や前駆細胞の分化誘導についての研究は、1970年代より行われてきた。1990年代までは主に、特異的抗体を用いた組織染色やフローサイトメトリーにより発現タンパク質を検出することでその細胞の分化のレベルを議論していた。そのため、半定量的な情報しか得られなかった。しかし、2000年以降、定量的RT-PCR法が一般的に使用されるようになり、分化に特異的な遺伝子の転写を絶対定量的に検出することが可能となった (非特許文献1)。しかし、細胞分化に際して、転写はされても翻訳に至らない遺伝子も存在しており、遺伝子の転写レベルがそのまま分化レベルを反映しているわけではないことが示唆されている（非特許文献２）。
　分化誘導後に培地に放出される特異的タンパク質を検出することにより、分化レベルの絶対定量を行う方法も存在する（特許文献1）。しかし、特異的タンパク質を検出するでは、検出感度の悪化が懸念される。その上、適当な分泌タンパク質が存在しない場合にはレポーター遺伝子の導入が必要である（特許文献2）。
特開2007-228873（P2007-228873A） 特開2007-37434（P2007-37434A） WO2004/058687 Bustin, S.A. J Mol Endocrinol. 25: 69-193 (2000) Wen, J. et al., J Cellular Biochem 102: 149-160 (2007) 現代化学、東京化学同人、435、55-61(2007) M. Yamaguchi et al., ABSTRACTS 24thInternational Carbohydrate Symposium. Oslo,  Norway 27. July-1. August, 2008. C-P040上記特許文献1，2及び3、並びに非特許文献1～4の全記載は、ここに特に開示として援用される。
　上述したように、細胞の状態、例えば細胞分化に伴う遺伝子の転写変化の追跡は、一般に定量性に優れてはいるが、必ずしも細胞の状態を反映しているものではない（非特許文献２）。
　一方、翻訳産物であるタンパク質の検出は、分化等の細胞の状態を検出する上で、確かな評価基準となり得る。しかし、適当な特異抗体がなかったり、その検出感度が優れなかったりする場合に、定量的解析が困難となり、結果的に汎用性が低くなってしまう。
　そこで本発明が解決しようとする課題は、遺伝子やタンパク質に代わる細胞の状態、例えば分化のレベルの新たな指標を見出すこと、さらに、この新たな指標を可能な限り定量的に把握できる手段を見出すこと、加えて、この新たな指標を用いて、特定の細胞に分化させた細胞の分化レベルを把握する手段を提供することにある。
　本発明では、細胞の状態の変化、例えば分化状態の変化によりその糖鎖プロファイルが定量的に変化しうることに着目した(非特許文献4)。
　従来の糖鎖構造の分類方法は、その生合成経路に基づき、ハイマンノース型、ハイブリッド型、コンプレックス型の３つに分けるものであった。しかし、図５に示すように、ハイブリッド型とコンプレックス型を分けてしまうと、細胞の分化を判定できないことを本発明者らは見出した。Ratioは百分率（%）、totalは発現量（pmol）を表す。質量分析により糖鎖構造決定を行う方法では、ハイブリッド型かコンプレックス型か、１次解析だけでは決定が不可能な構造がある。このような構造については、図５のグラフ中でN/Iと示した。
　そこで本発明では、西村らにより開発された高速網羅的糖鎖エンリッチ技術（グライコブロッティング法）(特許文献3、非特許文献3)に基づき、細胞の状態変化、例えば分化前後の細胞から糖鎖を網羅的に捕捉し、MALDI-TOF/MS等の質量分析技術により各細胞中に存在する糖鎖の定量的発現プロファイルを明らかにした。これをもとに、細胞の分化レベル（細胞の分化ステージあるいはタイプ）と結びつけ、変動する糖鎖を見出した。つまり、分化マーカーとなる糖鎖、あるいは、変動する糖鎖を同定し、感度・特異性ともに高い、分化レベルを定量的に判定する方法を確立した。さらに、ここで得られる情報をもとに、「糖鎖タイプ」という概念を導入することで、細胞をサブグループ化できることを見出し、これに基づき細胞分化の程度を定量的に判定できるという本発明を完成した（図６）。
　具体的には、糖鎖の分類方法として、ハイマンノース型とそれ以外（ノンハイマンノース）の型の２つに分け、ノンハイマンノース型をさらに(1)バイセクトの有無、(2)フコースの数（０、１または２以上）、(3)シアル酸の有無および修飾の種類、(4)分岐度（２または３以上）のカテゴリーに分けることにより、細胞の分化を定量的に判定できることを見いだした。
　本発明によれば、感度ならびに特異性において従来法を上回る、あるいは相補的な優位性を有した方法により、細胞の状態、例えば前駆細胞や幹細胞などの分化のレベル、すなわち品質を、定量的に判定・管理することが可能となる。さらに、幹細胞などの分化のレベルの高感度かつ定量的な測定が可能となることで、品質と安全性管理のシステムが向上することとなり、再生医療への貢献が期待できる。
実施例１で得た各糖鎖の発現量のプロファイルを示す。 実施例１で得たプロファイルから、糖鎖タイプ(モノ-Fuc、ジ-Fuc、非- Fuc、ハイマンノース)によりサブグループ化して表示した結果を示す。括弧内の数値は検出された糖鎖の種類を示す。 実施例１で得た分化誘導した後の細胞及び分化誘導することなく培養した細胞についての免疫細胞染色の結果を示す。 実施例２で得た各糖鎖の発現量のプロファイルを示す。 実施例２で得たプロファイルから、糖鎖タイプ(バイセクト、バイセクト以外、ハイマンノース)によりサブグループ化して表示した結果を示す。括弧内の数値は検出された糖鎖の種類を示す。 実施例２で得た分化誘導した後の細胞及び分化前の細胞についての免疫細胞染色の結果を示す。 実施例３で得た各糖鎖の発現量のプロファイルを示す。Peak No. 68は内部標準のピークである。 実施例３で得た各糖鎖の発現量のプロファイルを示す(図3-1の縦軸拡大)。 実施例３で得たプロファイルから、分化前後の糖鎖タイプ(バイセクト、バイセクト以外、ハイマンノース)によりサブグループ化して表示した結果を示す。 実施例４で得た各糖鎖の発現量のプロファイルを示す。Peak No. 54は内部標準のピークである。 実施例４で得た各糖鎖の発現量のプロファイルを示す(図4-1の縦軸拡大)。 実施例４で得たプロファイルから、分化前後の糖鎖タイプ(モノ-Fuc、ジ-Fuc、非- Fuc、ハイマンノース)によりサブグループ化して表示した結果を示す。 実施例４で得たプロファイルから、分化前後の糖鎖タイプ(モノ-SA、ジ-SA、非- SA、モノ-Gc、ジ-Gc、ハイマンノース)によりサブグループ化して表示した結果を示す。 従来のハイマンノース型、ハイブリッド型、コンプレックス型による糖鎖構造の分類方法の例。比率は百分率（%）、トータルは発現量（pmol）を表す。 実施例1及び2において得られた本発明の方法に細胞の分化の程度を示す結果。比率は百分率（%）、トータルは発現量（pmol）を表す。
[細胞の状態を評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法]
　本発明の第1の態様は、細胞の状態を評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法である。この方法は、以下の工程を含む。
(1-1)状態変化前の細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
(1-2)状態変化後の細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
(1-3)前記2つの定量的プロファイル中の存在量の間に変動がある糖鎖群の少なくとも一部を抽出すること、
(1-4)抽出した糖鎖群に含まれる各糖鎖を糖鎖タイプに基づいて、ハイマンノース型とノンハイマンノース型のカテゴリーに分け、かつノンハイマンノース型をさらに(1)バイセクトの有無、(2)フコースの数（０、１または２以上）、(3)シアル酸の有無、及び(4)分岐度（２または３以上）のカテゴリーに分けること、
(1-5)前記5つのカテゴリーの中から、細胞の状態を評価するのに適した糖鎖のカテゴリーを少なくとも１つ決定すること
　本発明の上記糖鎖カテゴリーの決定方法における細胞変化は、幹細胞または前駆細胞の分化の他に、細胞分裂、形態変化、細胞死、癌化などが挙げられるが、本発明はそれらに限定されるものではない。また、細胞の状態とは細胞の静的状態及び動的状態(経時的な状態の変化)も含むものである。
　前記(1-1)～(1-5)の各工程については、後述する、分化レベルを評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法において、分化レベルを評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定を例に説明する。
[細胞の状態を評価する方法]
　本発明の第２の態様は、細胞の状態を評価する方法である。この方法は、上記本発明の第１の態様である糖鎖カテゴリーの決定方法において決定された糖鎖のカテゴリーの少なくとも１つを用いて、細胞の状態を評価する方法である。
　本発明の第２の態様である細胞の状態を評価する方法は、
(2-1)状態変化の前後における細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
(2-2)前記定量的プロファイル中から請求項1に記載の方法で決定された糖鎖のカテゴリーの少なくとも１つについて、該カテゴリーに含まれる糖鎖(群)の存在量または存在割合の状態変化の前後における変化を求めること
を含む。
　本発明の第２の態様である細胞状態評価方法についても、後述する、分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価する方法において、分化レベルを評価する方法を例に説明する。
[幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法]
　本発明の第３の態様は、分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法である。この方法は、以下の工程を含む。
(3-1)分化誘導剤の非存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
(3-2)分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
(3-3)前記2つの定量的プロファイル中の存在量に変動がある糖鎖群の少なくとも一部を抽出すること、
(3-4)抽出した糖鎖群に含まれる各糖鎖を糖鎖タイプに基づいて、ハイマンノース型とノンハイマンノース型のカテゴリーに分け、かつノンハイマンノース型をさらに(1)バイセクトの有無、(2)フコースの数（０、１または２以上）、(3)シアル酸の有無、及び(4)分岐度（２または３以上）のカテゴリーに分けること、
(3-5)前記5つのカテゴリーの中から、幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価するのに適した糖鎖のカテゴリーを少なくとも１つ決定すること
工程(3-1)及び(3-2)
　工程(3-1)では、分化誘導剤の非存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得する。工程(3-2)では、分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得する。工程(3-1)及び(3-2)は、逐次で行っても、同時並行して行ってもよい。逐次で行う場合、どちらの工程を先に実施しても構わない。
　本発明において、以下の別の態様も含め、「幹細胞」とは、多能性または多分化能を有する細胞を意味する。「幹細胞」の例としては、例えば、胚性幹細胞、組織幹細胞、生体幹細胞、または人工多能性幹細胞(iPS細胞)を挙げることができる。但し、多能性または多分化能を有する細胞であれば、上記例示に限定される意図はない。
　本発明において、以下の別の態様も含め、「前駆細胞」は、上記幹細胞を分化誘導した細胞であり、かつ多能性を有する細胞である。幹細胞を分化誘導すると、分化の程度により、幹細胞よりは未分化の程度が低いが、依然として多能性を有する細胞がある。本発明においては、これらの細胞の総称として「前駆細胞」と呼ぶ。「前駆細胞」は、多能性を有する細胞であれば、特に制限はない。実施例1および実施例２で使用したP19CL6、P19C6細胞株は、いずれも前駆細胞である。
　上記「幹細胞」及び「前駆細胞」は、動物由来のものであることができ、例えば、哺乳類、魚類等であることができる。哺乳類の例としては、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、サル等を挙げることができ、魚類の例としては、メダカ、ゼブラフィッシュ等を挙げることができる。但し、これらの例に限定される意図ではない。
　本発明の第3の態様においては、分化誘導剤の非存在下または存在下で行う、幹細胞または前駆細胞の培養は、幹細胞または前駆細胞の培養方法として、公知の方法で行うことができる。分化誘導剤は、特に制限はなく、幹細胞または前駆細胞の種類に応じて、適宜選択することができる。但し、本発明の第1の態様は、幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法であるので、分化誘導の効果が高く、確実に分化誘導を起こし得る分化誘導剤を用いる方が、糖鎖のカテゴリーの決定が容易であるという観点からは好ましい。しかし、分化誘導剤の種類によっては、分化レベル(細胞の分化ステージあるいはタイプ)が異なる場合もあることから、常に、確実に分化誘導を起こし得る分化誘導剤を用いることが推奨される訳ではなく、目的とする分化レベルに応じて、使い分けることができることは勿論である。また、培養における分化誘導剤の種類は1つでも複数を組み合わせても良く、また、培養(培地)における分化誘導剤の濃度も適宜選択することができる。
　培養した幹細胞または前駆細胞は、細胞に含まれるN-結合型糖鎖を分離、精製する処理に付され、分離、精製されたN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得することが適当である。N-結合型糖鎖の分離及び精製は、例えば、特許文献3及び非特許文献3に記載されたグライコブロッティング法によりなされることが、N-結合型糖鎖を漏れなく、かつ迅速に分離、精製できるという観点から好ましい。定量的プロファイルは、分化誘導剤とともに培養した幹細胞または前駆細胞の分化がある程度以上、即ち、分化の進捗が明らかになる程度行うことが適当である。但し、分化の進捗が明らかになる程度は、細胞の種類、分化誘導剤の種類、培養の条件等により変動するので、これらの条件を考慮して適宜決定することが適当である。
　定量的プロファイルは、好ましくは、分離、精製されたN-結合型糖鎖をMALDI-TOF/MS (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight/ mass spectrometry）またはLC-ESI/SSI-TOF/MS (liquid chromatography-electrospray ionization/sonic spray ionization-time of flight/ mass spectrometry）により得られる。MALDI-TOF/MSまたはLC-ESI/SSI-TOF/MSを用いることで、迅速にかつ高精度にN-結合型糖鎖を定量し、定量的プロファイルを得ることができる。
工程(3-3)及び(3-4)
　工程(3-3)では、前記工程(3-1)及び(3-2)でそれぞれ得られた2つの定量的プロファイル中の存在量の間に変動がある糖鎖群の少なくとも一部を抽出する。さらに工程(3-4)では、工程(3-3)で抽出した糖鎖群に含まれる各糖鎖を糖鎖タイプに基づいて、ハイマンノース型とノンハイマンノース型のカテゴリーに分け、かつノンハイマンノース型をさらに(1)バイセクトの有無、(2)フコースの数（０、１または２以上）、(3)シアル酸の有無、及び(4)分岐度（２または３以上）のカテゴリーに分ける。
　本発明者らは、実験の結果、幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価するために用いる糖鎖のカテゴリーとしては上記5つのカテゴリーを挙げることができることを見出した。
　定量的プロファイル中の糖鎖群は、細胞の種類並びに分化の方向及び程度によって異なる場合があるが、通常は数十～百数十程度である。その中から、存在量が、分化レベルに応じて変動する糖鎖群の少なくとも一部を抽出し、かつ抽出した糖鎖群を、上記の糖鎖タイプに基づいて5つのカテゴリーに分ける。
工程(3-5)
　工程(3-5)では、前記5つのカテゴリーの中から、細胞の状態を評価するのに適した糖鎖のカテゴリーを少なくとも１つ決定する。細胞の状態を評価するのに適した糖鎖のカテゴリーは、例えば、分化誘導剤の非存在下で培養した幹細胞または前駆細胞においては、存在量または存在割合の経時的変動が有意ではないが、分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞においては、存在量または存在割合の経時的変動が有意である糖鎖が分類されるカテゴリーであることができる。
　ここで選択、決定された糖鎖のカテゴリーは、後述する分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価する方法において、分化レベルの評価指標として使用できる。
[分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価する方法]
　本発明の第４の態様は、分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価する方法である。この方法は以下の工程を含む。
(4-1)分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
(4-2)前記定量的プロファイル中から、本発明の第3の態様の方法で決定された糖鎖のカテゴリーの少なくとも１つについて、該カテゴリーに含まれる糖鎖(群)の存在量または存在割合の経時的変化を求めること。
工程(4-1)
　工程(4-1)における、分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖についての定量的プロファイルの取得は、上記工程(3-2)と同様に実施することができる。但し、工程(4-1)においては、定量的プロファイルは経時的に取得される。具体的には、培養時間の経過にともない、培養物をサンプリングし、サンプリングした培養物から分離、精製されたN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得する。定量的プロファイルの経時的な取得は、培養開始後少なくとも1回は行われ、好ましくは、2回以上、例えば、2回、3回または4回であることができる。但し、4回を超えて行うこともできる。
工程(4-2)
　工程(4-2)においては、本発明の第３の態様の方法で決定された糖鎖のカテゴリーの少なくとも１つについて、定量的プロファイル中の、前記カテゴリーに含まれる糖鎖(群)の存在量または存在割合の経時的変化を求める。
　本発明の第３の態様の糖鎖カテゴリー決定方法によって、以下に説明する心筋分化レベル評価方法及び神経細胞分化レベル評価方法で用いられる分化マーカーとして使用できる糖鎖タイプ(糖鎖カテゴリー)を見出した。詳細は実施例において示すが、心筋分化レベル評価方法に使用できる分化マーカーとしては、フコースを1つ有するタイプの糖鎖群、フコースを2つ有するタイプの糖鎖群から成る群から選ばれる少なくとも1つを用いることができることが見出された。また、神経細胞分化レベル評価方法に使用できる分化マーカーとしては、バイセクト構造を有するタイプの糖鎖群、バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群から選ばれる少なくとも1つを用いることができることが見出された。
　以下に、上記で見出された分化マーカーを用いる分化レベル評価方法について説明する。
[心筋分化レベル評価方法]
　本発明の第５の態様は、幹細胞または前駆細胞の心筋分化レベルを評価する方法である。
　この方法は
(5-1)心筋分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
(5-2)前記定量的プロファイル中のフコースを1つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、フコースを2つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つを求めること、
を含む。
工程(5-1)
　心筋分化誘導剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、オキシトシン等を挙げることができる。N-結合型糖鎖についての定量的プロファイルの経時的取得は、上記第3の態様の工程(3-2)と同様に行うことができる。但し、用いる分化誘導剤は、心筋分化誘導剤である。
　本発明の方法で用いられる幹細胞または前駆細胞は、前記第1の態様で示したものであるが、特に、P19CL6細胞、ES細胞、iPS細胞等が好ましい。
工程(5-2)
　定量的プロファイル中のフコースを1つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、フコースを2つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つを求める。本発明では、これらのいずれかの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、心筋分化レベルを評価することができるが、好ましくはこれら3つの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、総合的に評価する。
　フコースを1つ有するタイプの糖鎖群とは、例えば、表１中の化3、化19、化31である。
　フコースを2つ有するタイプの糖鎖群とは、例えば、表１中の化20、化28、化34である。
　ハイマンノース型の糖鎖群とは、例えば、表１中の化5、化8、化14である。
　実施例１において示すように、マウスの前駆細胞においては、上記定量的プロファイル中のフコースを1つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が培養によって増大した細胞は、心筋分化レベルが高まったものである。同様に、フコースを2つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、心筋分化レベルが高まったものである。
[神経細胞への分化レベル評価方法（１）]
　本発明の第6の態様は、マウス由来の幹細胞または前駆細胞の神経細胞への分化レベルを評価する方法である。
　この方法は、
(6-1)神経細胞への分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
(6-2)前記定量的プロファイル中のバイセクト構造を有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つを求めること、
を含む。
工程(6-1)
　神経細胞への分化誘導剤としては、例えば、レチノイン酸、DMSO等を挙げることができる。N-結合型糖鎖についての定量的プロファイルの経時的取得は、上記第1の態様の工程(3-2)と同様に行うことができる。但し、用いる分化誘導剤は、神経細胞への分化誘導剤である。
　本発明の方法で用いられる幹細胞または前駆細胞は、前記第1の態様で示したものであるが、特に、P19細胞、P19C6細胞、ES細胞、iPS細胞等が好ましい。
工程(6-2)
　定量的プロファイル中のバイセクト構造を有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つを求める。本発明では、これらのいずれかの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、神経細胞への分化レベルを評価することができるが、好ましくはこれら3つの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、総合的に評価する。
　バイセクト構造とは、バイセクトGlcNAcを有する糖鎖の構造である。骨格の糖鎖の構造にバイセクトGlcNAcが付加すると、それ以上枝分かれが伸びたり、糖鎖が切断されることがなくなることが知られている。また、糖鎖構造にバイセクトGlcNAcが付加する反応は、GnT-IIIと呼ばれる酵素により触媒される。(Ikeda, Y., et al., Trends in Glycoscience and Glycotechnology 13: 167-176 (この文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。)
　バイセクト構造を有するタイプの糖鎖群とは、例えば、表２中の化15、化45、化64である。
　バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群とは、例えば、表２中の化17、化21、化68である。
　ハイマンノース型の糖鎖群は、前述の第5の態様で説明したものと同様である。
　実施例２において示すように、マウスの前駆細胞においては、前記バイセクト構造を有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が培養によって増大した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。さらに、前記バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。また、前記ハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。
　実施例３において示すように、マウスのＥＳ細胞においても、バイセクト構造を有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が培養によって増大した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。さらに、バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。また、ハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。
[神経細胞への分化レベル評価方法（２）]
　本発明の第7の態様は、ヒト由来の幹細胞または前駆細胞の神経細胞への分化レベルを評価する方法である。
　この方法は、
(7-1)神経細胞への分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
(7-2)前記定量的プロファイル中のフコースを１つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、シアル酸を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つの経時的変化を求めること、
を含む。
工程(7-1)
　神経細胞への分化誘導剤としては、工程(6-1)と同様に、例えば、レチノイン酸、DMSO等を挙げることができる。N-結合型糖鎖についての定量的プロファイルの経時的取得は、上記第1の態様の工程(3-2)と同様に行うことができる。但し、用いる分化誘導剤は、神経細胞への分化誘導剤である。
　本発明の方法で用いられるヒト由来の幹細胞または前駆細胞は、前記第1の態様で示したものであるが、特に、ES細胞、iPS細胞等が好ましい。
工程(7-2)
　定量的プロファイル中のフコースを１つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、シアル酸を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つの経時的変化を求める。本発明では、これらのいずれかの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、神経細胞への分化レベルを評価することができるが、好ましくはこれら3つの糖鎖群の存在量または存在割合に基づいて、総合的に評価する。
　フコースを1つ有するタイプの糖鎖、シアル酸を有さないタイプの糖鎖及びハイマンノース型の糖鎖は、例えば、実施例4の表４に示した糖鎖であることができる。
　実施例４において示すように、ヒトのＥＳ細胞においては、フコースを１つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が培養によって増大した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。さらに、シアル酸を有さないタイプの糖鎖群（Ｎｏｎ－ＳＡ）の存在量または存在割合が培養によって増大した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。また、ハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである。
　第5の態様～第7の態様では、実施例においては、各糖鎖群の存在量または存在割合の経時的変化の傾向に注目しているが、各糖鎖群の存在量または存在割合の経時的変化と分化のステージやタイプとの関係に関する情報を入手及び集積することで、各糖鎖群の存在量または存在割合から、分化のステージやタイプを定量的に把握することも可能になる。例えば、再生医療において分化細胞を用いる場合、未分化状態の細胞が含まれないことが安全上好ましい。従って、培養により得られた細胞の分化ステージを正確に把握することが重要である。また、目的とする細胞に分化していることを確認することも重要であることから、分化のタイプを正確に把握することも求められる。本発明の方法では、各糖鎖群の存在量または存在割合から、分化のステージやタイプを定量的に把握することも可能である。
　以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
細胞グライコミクスプロトコール
　実施例において用いられた細胞グライコミクス（ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ）は、以下のプロトコールに従って実施した。
＜セルライセートの作製とN-Glycanの遊離＞
　　・　10mM EDTA/PBS中、セルスクレイパーを用いて細胞をディッシュより回収、PBSにて洗浄を行う
　　・　1%（終濃度）TritonX-100を加え、氷上にて１時間インキュベートし、細胞を可溶化する。
　　・　80%（終濃度）acetoneを加え、-20℃にて一晩インキュベートし、タンパク質画分を沈殿させる。
　　・　遠心後、沈殿をacetonitrileにて洗浄し、acetoneを完全に除去する。
　　・　沈殿を風乾後、0.2% PHM (1-propanesulfonic acid, 2-hydroxyl-3-myristamido)を含む80mM ammonium bicarbonateを50μL加え、60℃にて10分間インキュベートし、可溶化する。
　　・　可溶化後のタンパク質画分に、終濃度10mM DTTを加え、60℃にて30分間還元反応を行う。
　　・　20mM iodoacetamideを加え、室温にて30分間、遮光下でインキュベートを行うことで、6.により還元されたアミノ酸残基をアルキル化する。
　　・　800 U Trypsinを加え、37℃で一晩インキュベートする。
　　・　90℃にて10分間Trypsinを失活させ、Peptide N-Glycanase Fを2 U加え、N-結合型糖鎖を遊離させる。
　　・　遊離させた糖鎖は、内部標準として15pmolのA2　amide Glycanを加えた後、SpeedVacにて濃縮し、終容量20μLとした。
＜グライコブロッティング＞
　上記10.で得られたN-結合型糖鎖を、BlotGlyco(R)H(住友ベークライト株式会社)を用いたグライコブロッティング法によりエンリッチした。この方法は、下記の文献に記載の方法に従って実施した。具体的な方法は以下の文献に示す。以下の4つの文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。
    ・Furukawa J-i., et al.,  Anal. Chem., 4: 1094-1101 (2008)
    ・Baudino L., et al.,  J. Immunol., 181: 4107-4112 (2008)
    ・Baudino L., et al.,  J. Immunol., 181: 6664-6669 (2008)
　　・　Uematsu R., et al., Mol. Cell. Proteom., in press (2008)
＜BlotGlyco(R) Hビーズを用いたグライコブロッティング＞
　　・　Peptide N-Glycanase Fにより遊離させ、内部標準として15pmolのA2　amide Glycanを加えた後、SpeedVacにて濃縮し、終容量20μLとしたN-結合型糖鎖をBlotGlyco(R) Hビーズ5mgに加える。
　　・　2% 酢酸を含むアセトニトリル180μLを1.に加える。
　　・　80℃にて45分間静置する。
　　・　2M グアニジン-塩酸を含む16.6mM 重炭酸アンモニウム溶液、純水、1% トリエチルアミンを含むメタノール溶液　各200μLで２回ずつビーズを洗浄する。
　　・　10% 無水酢酸を含むメタノール溶液100μLを加え、室温にて30分間静置する。
　　・　溶液を除いた後、10mM 塩酸、メタノール、ジオキサン　各200μLで２回ずつビーズを洗浄する。
　　・　100mM 3-メチル1-p-トリルトリアゼンを含むジオキサン溶液100μLを加え、60℃にて１時間～１時間半静置する。
　　・　ジオキサン、純水、メタノール、純水の順にそれぞれ200μLずつで洗浄を行う。
　　・　20mMアミノオキシ-WRを20μLと2% 酢酸を含むアセトニトリル180μLを加える。
　　・　80℃にて45分間静置する。
　　・　100μLの純水で溶出する。
実施例1
  マウス胎児性ガン細胞由来細胞P19CL6を心筋細胞へ分化誘導させ、未分化及び分化後の細胞のグライコミクスを行った。
　3.7x105cells/6cm-ディッシ(dish)のマウス胎児性ガン細胞由来細胞P19CL6を、10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地中に撒種し、分化誘導群については1% ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加後、コントロール群についてはそのまま何も添加せず培養を行った。培養開始後16日目に、分化誘導群全体の拍動を確認後、両群とも細胞を回収し、上記グライコブロッティング（Glycoblotting）法により、細胞中の全N-結合型糖鎖の捕捉・精製を行った。200μg相当の全細胞タンパク質について解析を行い、MALDI-TOF/MSにより定量的プロファイルを取得した。図1-1に示す各糖鎖の発現量は、内部標準として加えた既知量オリゴ糖とのスペクトル上の面積比より算出した糖鎖の絶対定量値を用いている。この結果から、有意な変動が認められる42種類の糖鎖を確認できた。分化に伴い、Fucを１つ有するタイプの糖鎖では、11種類の構造について増加傾向が認められたが、Fucを２つ持つ糖鎖タイプの6種類の構造については、分化誘導群で有意に減少することを見出した。このように、糖鎖タイプによりサブグループ化することで、細胞分化のレベルを定量的に判定できることが判明した（図1-2）。
　尚、分化誘導した後の細胞及び分化誘導することなく培養した細胞について以下の条件で免疫細胞染色を行った。その結果は、図1-3に示すように、分化誘導後の細胞においてのみ、心筋細胞に特異的なタンパク質であるサルコメアミオシンの発現が確認され、分化誘導せずに培養した細胞においては、これが見出されなかった。このことから、分化誘導後の細胞のみが、心筋細胞に分化していることが明らかであった。
1次抗体： MF20  (mouse monoclonal anti-sarcomere myosin)
2次抗体 ： HRP-polymer conjugated anti-IgG 
発色基質： Diaminobenzidine (DAB) 
　さらに、分化誘導した後の細胞及び分化誘導することなく培養した細胞について拍動の確認（目視評価）を行った。その結果、分化誘導なしの群では、拍動が観察されなかったが、分化誘導ありの群では、約80%の細胞において、拍動が観察された。
　尚、有意な変動が認められる42種類の糖鎖、Fucを１つ有するタイプの11種類の糖鎖、Fucを２つ持つタイプの6種類の糖鎖、ハイマンノース型の糖鎖はそれぞれ以下のとおりである。
　フコースを1つ有するタイプの糖鎖群とは、表１中　化2、化3、化6、化10、化12、化15、化16、化19、化24、化25、化27、化30、化31、化33、化36、化37、化39、化40、化41、化42である。
　フコースを2つ有するタイプの糖鎖群とは、表１中　化20、化22、化28、化29、化34、化35、化38である。
　ハイマンノース型の糖鎖とは、化5、化8、化14、化17である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例２
　マウス胚性腫瘍細胞P19C6を神経細胞へ分化誘導させ、以下に示す3つの各ステップ、つまり未分化、分化中間体、分化後の細胞のグライコミクスを行った。
ステップ1：未分化細胞
　P19C6細胞を細胞培養皿(cell culture dish)で15%FBS/DMEMを培地として、数日間接着培養を行った。80～90%コンフルエントになったところで、細胞を回収しグライコミクスへ、あるいは分化誘導するためにステップ2へと進めた。
ステップ2：分化中間体細胞
　ステップ1で80～90%コンフルエントになった細胞をトリプシン処理により細胞懸濁液を調製し、バクテリアグレードのペトリ皿(dish)で懸滴培養(Hanging drop culture)を行った。この時、10cm皿(dish) の蓋に10μLの細胞懸濁液(105 cells/mL)を100spotsアプライし、浮遊培養を行い細胞の凝集塊を形成させた。培地には分化を誘導するために1μMのレチノイン酸を添加した10%FBS/αMEMを用いた。４日後に細胞の凝集塊を回収し、グライコミクスへ、あるいはさらに分化誘導するためにステップ3へと進めた。
ステップ3、分化後細胞
　回収した細胞の凝集塊をトリプシン処理により細胞懸濁液を調製し、ポリリジンコートした6cm皿(dish)に5 x 104cells/cm2になるように細胞を播種し、接着培養を行った。培地には、N-2サプリメント及びフィブロネクチンを添加したDMEM/F12を用いた。5日後に、細胞を回収し、グライコミクスを行った。
グライコミクス
　回収した細胞のペレットを1%Triton/PBSでタンパク質を可溶化した後、200μg相当のタンパク質をアセトン沈殿させ、還元アルキル化、トリプシン消化した。その後、PNGaseFによりN-結合型糖鎖を遊離させ、グライコブロッティング（Glycoblotting）法により糖鎖補足・精製を行い、MALDI-TOF/MSにより定量的プロファイルを取得した。未分化、分化中間体、分化後細胞の各スペクトルについて、内部標準として加えた濃度既知のオリゴ糖由来のシグナルの面積と細胞が発現している糖鎖由来シグナルの面積を比較することで、糖鎖発現量を定量的に解析した（図2-1）。その結果、分化に伴い有意に糖鎖構造が変化していることがわかった。この結果をもとに、バイセクトGlcNAcを有すると考えられる構造と、そうでないタイプの糖鎖でサブグループ化を行うと、図2-2のようになり、細胞分化を定量的にモニタリングできることが明らかになった。
　尚、分化誘導した後の細胞及び未分化状態のP19C6細胞について以下の条件で免疫細胞染色を行った。その結果は、図2-3に示すように、分化誘導した後の細胞においてのみ、ニューロンフィラメントが検出され、神経細胞に分化したことが明らかであった。
1次抗体： mouse monoclonal anti-neurofilament 160
2次抗体： HRP-polymer conjugated IgG 
発色基質： Diaminobenzidine (DAB) 
　尚、バイセクトGlcNAcを有するタイプの糖鎖、バイセクトGlcNAcを有さないタイプの糖鎖、さらには、ハイマンノース型の糖鎖は、それぞれ以下のとおりである。
　バイセクト構造を有するタイプの糖鎖群とは、表２中　化15、化22、化23、化30、化36、化37、化38、化44、化45、化46、化48、化53、化55、化56、化60、化61、化64、化67である。
　バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群とは、表２中　化6、化8～化10、化12～14、化17～化21、化25～化29、化32～化35、化40～化43、化47、化50～化52、化54、化57～化59、化62、化63、化65、化66である。
　ハイマンノース型の糖鎖群とは、表２中　化5、化7、化11、化16、化24、化31、化39である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例３
マウスのＥＳ細胞をレチノイン酸で分化誘導させ、未分化、及び分化後の細胞のグライコミクスを行った。分化誘導方法及び糖鎖発現量の定量的な解析は、実施例２と同様に行った。糖鎖発現量の定量的に解析した結果を図3-1及び3-2(図3-1の縦軸拡大)に示した。さらに、この結果をもとに、バイセクトGlcNAcを有すると考えられる構造と、そうでないタイプの糖鎖でサブグループ化を行い、結果を図3-3に示す。この結果は、この方法により細胞分化を定量的にモニタリングできることを示す。
　尚、バイセクトGlcNAcを有するタイプの糖鎖、バイセクトGlcNAcを有さないタイプの糖鎖、さらには、ハイマンノース型の糖鎖は、それぞれ以下のとおりである。
　バイセクト構造を有するタイプの糖鎖群とは、表３中　化29、化37、化38、化58、化59、化60、化67である。
　バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群とは、表３中　化4、化7、化8、化11、化13、化16、化18、化19、化20、化26、化27、化31、化32、化33、化34、化35、化36、化40、化41、化42、化43、化44、化45、化46、化47、化52、化53、化54、化55、化56、化57、化62、化63、化64、化65、化69、化70、化71、化72である。
　ハイマンノース型の糖鎖群とは、表３中　化12、化17、化22、化30、化39、化51、化61である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例４
ヒトのＥＳ細胞をレチノイン酸添加により分化誘導させ、レチノイン酸添加前を未分化、添加後を分化後として細胞のグライコミクスを行った。分化誘導方法及び糖鎖発現量の定量的に解析は、実施例２と同様とした。糖鎖発現量の定量的に解析した結果を図4-1及び4-2(図4-1の縦軸拡大)に示した。さらに、この結果をもとに、フコースを1つ有するタイプと、そうでないタイプの糖鎖でサブグループ化を行い、結果を図4-3に示す。さらに、シアル酸を有さないタイプと、そうでないタイプの糖鎖でサブグループ化を行い、結果を図4-4に示す。これらの結果は、この方法により細胞分化を定量的にモニタリングできることを示す。
　尚、フコースを1つ有するタイプの糖鎖、シアル酸を有さないタイプの糖鎖、さらには、ハイマンノース型の糖鎖は、それぞれ以下のとおりである。
　フコースを1つ有するタイプの糖鎖群とは、表４中　化6、化11、化13、化17、化19、化32、化36、化37、化39、化44、化47、化50、化51、化52である。
　シアル酸を有さないタイプの糖鎖群とは、表４中　化6、化7、化8、化11、化13、化14、化17、化19、化20、化34、化35、化36、化37、化38、化39、化42、化44、化46、化47、化49、化52である。
　ハイマンノース型の糖鎖群とは、表４中　化12、化18、化22、化26、化31、化40、化48である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明は、例えば幹細胞の分化が関連する再生医療や医薬品製造開発の分野に有用である。

Claims (20)

  1. 細胞の状態を評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法であって、
    状態変化前の細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
    状態変化後の細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
    前記2つの定量的プロファイル中の存在量の間に変動がある糖鎖群の少なくとも一部を抽出すること、
    抽出した糖鎖群に含まれる各糖鎖を糖鎖タイプに基づいて、ハイマンノース型とノンハイマンノース型のカテゴリーに分け、かつノンハイマンノース型をさらに(1)バイセクトの有無、(2)フコースの数（０、１、２以上）、(3)シアル酸の有無、及び(4)分岐度（２、３以上）のカテゴリーに分けること、
    前記5つのカテゴリーの中から、細胞の状態を評価するのに適した糖鎖のカテゴリーを少なくとも１つ決定すること
    を特徴とする前記糖鎖カテゴリーの決定方法。
  2. 細胞の状態を評価する方法であって、
    状態変化の前後における細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
    前記定量的プロファイル中から請求項1に記載の方法で決定された糖鎖のカテゴリーの少なくとも１つについて、該カテゴリーに含まれる糖鎖(群)の存在量または存在割合の状態変化の前後における変化を求めること
    を特徴とする、前記細胞状態評価方法。
  3. 分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価するために用いる糖鎖のカテゴリーの決定方法であって、
    分化誘導剤の非存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
    分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを取得すること、
    前記2つの定量的プロファイル中の存在量に変動がある糖鎖群の少なくとも一部を抽出すること、
    抽出した糖鎖群に含まれる各糖鎖を糖鎖タイプに基づいて、ハイマンノース型とノンハイマンノース型のカテゴリーに分け、かつノンハイマンノース型をさらに(1)バイセクトの有無、(2)フコースの数（０、１、２以上）、(3)シアル酸の有無、及び(4)分岐度（２、３以上）のカテゴリーに分けること、
    前記5つのカテゴリーの中から、幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価するのに適した糖鎖のカテゴリーを少なくとも１つ決定すること
    ことを特徴とする、前記糖鎖カテゴリーの決定方法。
  4. 分化を誘導した幹細胞または前駆細胞の分化レベルを評価する方法であって、
    分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
    前記定量的プロファイル中から請求項3に記載の方法で決定された糖鎖のカテゴリーの少なくとも１つについて、該カテゴリーに含まれる糖鎖(群)の存在量または存在割合の経時的変化を求めること
    を特徴とする、前記分化レベル評価方法。
  5. 幹細胞または前駆細胞の心筋分化レベルを評価する方法であって、
    心筋分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
    前記定量的プロファイル中のフコースを1つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、フコースを2つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つの経時的変化を求めること、
    を含む心筋分化レベルを評価する方法。
  6. 前記フコースを1つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって増大した細胞は、心筋分化レベルが高まったものである請求項5に記載の方法。
  7. 前記フコースを2つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、心筋分化レベルが高まったものである請求項5に記載の方法。
  8. 前記ハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、心筋分化レベルが高まったものである請求項5に記載の方法。
  9. マウス由来の幹細胞または前駆細胞の神経細胞への分化レベルを評価する方法であって、
    神経細胞への分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
    前記定量的プロファイル中のバイセクト構造を有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つの経時的変化を求めること、
    を含む神経細胞への分化レベルを評価する方法。
  10. 前記バイセクト構造を有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって増大した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである請求項9に記載の方法。
  11. 前記バイセクト構造を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである請求項9に記載の方法。
  12. 前記ハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである請求項9に記載の方法。
  13. ヒト由来の幹細胞または前駆細胞の神経細胞への分化レベルを評価する方法であって、
    神経細胞への分化誘導剤の存在下で培養した幹細胞または前駆細胞に含まれるN-結合型糖鎖について定量的プロファイルを経時的に取得すること、
    前記定量的プロファイル中のフコースを１つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合、シアル酸を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合及びハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合から成る群から選ばれる少なくとも1つの経時的変化を求めること、
    を含む神経細胞への分化レベルを評価する方法。
  14. 前記フコースを１つ有するタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって増大した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである請求項13に記載の方法。
  15. 前記シアル酸を有さないタイプの糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって増加した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである請求項13に記載の方法。
  16. 前記ハイマンノース型の糖鎖群の存在量または存在割合が前記培養によって減少した細胞は、神経細胞への分化レベルが高まったものである請求項13に記載の方法。
  17. 前記N-結合型糖鎖は、グライコブロッティング法により分離及び精製されたものである請求項1～16のいずれかに記載の方法。
  18. 前記定量的プロファイルは、MALDI-TOF/MSまたはLC-ESI/SSI-TOF/MSにより得られたものである請求項1～17のいずれかに記載の方法。
  19. 幹細胞が、胚性幹細胞、組織幹細胞、生体幹細胞、または人工多能性幹細胞(iPS細胞)である請求項3～18のいずれかに記載の方法。
  20. 前駆細胞は、幹細胞を分化誘導した細胞であり、かつ多能性を有する細胞である請求項3～18のいずれかに記載の方法。
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