WO2010054455A1 - Processo industrial contínuo para produção de células reativadas de xanthomonas campestris - Google Patents

Processo industrial contínuo para produção de células reativadas de xanthomonas campestris Download PDF

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WO2010054455A1
WO2010054455A1 PCT/BR2009/000372 BR2009000372W WO2010054455A1 WO 2010054455 A1 WO2010054455 A1 WO 2010054455A1 BR 2009000372 W BR2009000372 W BR 2009000372W WO 2010054455 A1 WO2010054455 A1 WO 2010054455A1
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reactor
process according
diluent
cells
concentration
Prior art date
Application number
PCT/BR2009/000372
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English (en)
French (fr)
Inventor
Alessander Acacio Ferro
Marino Tadeu Fabi
José Fernando BARRETO DA SILVA
Lucio José SOBRAL ROCHA
Luca Pessoa Buzanelli
Edson Quirino Buzanelli
Original Assignee
Serviço Nacional De Aprendizagem Industrial- Senai/Dr-Ba
Quantas Biotecnologia S/A
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Publication date
Application filed by Serviço Nacional De Aprendizagem Industrial- Senai/Dr-Ba, Quantas Biotecnologia S/A filed Critical Serviço Nacional De Aprendizagem Industrial- Senai/Dr-Ba
Publication of WO2010054455A1 publication Critical patent/WO2010054455A1/pt

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C12P19/06—Xanthan, i.e. Xanthomonas-type heteropolysaccharides

Definitions

  • the invention relates to a continuous process for the production of reactive cells of Xanthomonas campestris.
  • the present invention relates to a continuous industrial system for the production of a constant and defined concentration dispersion of Xanthomonas campestris cells, such dispersion being usable as an inoculum in a fermentative process for the production of Xanthan Gum under controlled conditions.
  • Xanthan Gum is a biopolymer with utilities in numerous branches of industry which are food, cosmetic, pharmaceutical, textile, explosive and petroleum.
  • such gum exhibits excellent characteristics as a viscosifier and has a significant effect as a stabilizer in emulsions as well as excellent salt resistance and high resistance to pH changes, as well as stability to enzymatic action which makes increasing the use of xanthan gum as an additive important in a considerable plurality of processes and chemicals.
  • Xanthan gum is produced by bacteria of the species Xanthomonas campestris or other species of Xanthomonas in the process of aerobic fermentation from a medium where there is a source of carbon, a source of nitrogen and some mineral nutrients containing potassium, magnesium, phosphate and sulfur to its structure.
  • This biopolymer has a molecular mass in the range of 0.5 to 12 million daltons and consists molecularly of a carbohydrate chain in which glucose, mannose and acid glucuronic acid in the proportion of 2.8: 2.8: 2 are arranged in a major D-glucopyranose Glucan (1,4 glucopyranoses) chain.
  • Glucan (1,4 glucopyranoses) chain.
  • a d-glucuronic acid To this acetylated D-mannose is attached a d-glucuronic acid and it is attached to a second pyruvated D-mannose, as shown below:
  • the polymer is anionic and the sodium cation accompanies the organic molecule in most xanthan gum products.
  • nitrogen contents of the order of 1% may also be present in xanthan gum, as a rule as protein material associated with the main chain.
  • the usual procedure for the production of xanthan gum involves the realization of a fermentation in two differentiated stages.
  • the microorganism to be used is subjected to a suitable small-scale culture in order to obtain a relatively high concentration of bacteria.
  • the bacteria do not produce the exopolymer or produce it in a very low concentration.
  • the population of microorganisms grows significantly at this stage. This is why it is called the germination or growth phase.
  • the material resulting from that first step having a relatively high concentration of bacteria is inoculated into the larger reactor containing a suitable culture medium and under controlled aeration and reaction conditions perfectly adjusted so that the fermentation step itself is carried out therein .
  • This is the stage of production or fermentation as it is also called.
  • X 0 is the initial concentration of biomass at inoculation
  • X (t) is the concentration of cells at time t of cell growth
  • X max is the maximum concentration of cells that grow in a given growth medium condition.
  • the MY growth medium is used by the authors and consists of 0.3% malt, 0.3% yeast, 1% dextrose and 0.5% peptone.
  • said invention proposes a continuous system of production of a dispersion of cells of Xanthomonas campestris or other Xanthomonas species and correlated bacterial microorganisms in aqueous solution with a well defined, adequate and constant cell concentration the direct inoculation in the fermentation reactor for the production of the Xanthan gum biopolymer.
  • the invention provides a control so that the cellular concentration is quantified and known in the solution that is inoculated to the fermenter.
  • Figure 1 shows the flowchart of the process for the preparation of a dispersion of Xanthomonas campestris cells of determined concentration of the present invention.
  • the continuous dispersion preparation system of Xanthomonas campestris cells are composed of three reactors (A), (B) and (C), a diluent storage reservoir (D), a continuous microorganism cell analyzer (R), a filter (F) and a level meter (U), in addition to the pipes, pumps and valves that allow its continuous operation.
  • the reactor (A) is the cell inoculating and feeding reactor to the continuous growth system of these cells.
  • the reactors (B) and (C) are the reacting effectors that allow the continuous process of cell growth.
  • the reactors (B) and (C) both have V (liters) capacity.
  • the volume V is of the order of 2 to 10 liters, better of 3 to 7 liters and still better of 4 to 6 liters.
  • the volume of the reactor (A) is in the order of 1/20 to 1/10 of the volume of the reactor (B) and (C).
  • Volume V is generally equal to 1/10 of the volume of the corresponding fermentation reactor (E) when it has a capacity of 30 to 80 liters.
  • the invention is not restricted to these values alone, and larger volumes may be used when larger quantities of inoculums are used in the fermentation reactors of the xanthan gum production plant.
  • reactors (A, B and C) and also the diluent storage tank (D) are made of glass or stainless steel, usually 316, jacketed and temperature controlled to operate at defined temperatures and constant in the range of 26 to 30 ° C.
  • Such reactors do not have straight corners that cause or any analogous process that may cause contamination of the medium contained therein.
  • Both the reactors and the diluent storage tank (D) are provided with atmospheric vents thereby balancing the pressures, and the air entering the system is filtered and sterilized protecting the system against natural contamination.
  • the reactors have agitators. which are perfectly defined in terms of the shape and speed, thus imparting a speed of agitation, which is controlled and controlled in the medium.
  • the diluent storage tank (D) is capable of feeding each of the reactors (A, B and C) in order to maintain the process dynamics.
  • the reactor feed (A) from the diluent storage tank (D) is controlled by the valve (1) and is carried out per phase when the contents of the reactor (A) are transferred integrally to the reactor (B).
  • the reactor feed (B) from the diluent storage tank (D) is controlled by the valve (2) and by a liquid flow regulating system so that a defined flow is continuously fed to the reactor (B).
  • This flow is established being in the range of 0.5 to 2.0 ml / min depending on the volume of the reactors (A) and (B) themselves.
  • a second pipeline also allows the diluent storage tank (D) to power the reactor (B) by rapidly introducing the diluent into said reactor.
  • the flow of diluent is controlled by the valve (3).
  • the valve (3) when opened causes it to be introduced, in virtually instant time, a volume of diluent equivalent to the capacity of the reactor (B) which is regulated by the level meter (U).
  • This valve 3 is opened each time the contents of the reactor C are transferred to the transfer vial G and thence to the fermentation reactor E. Such transfers are performed synchronously and with the transfer of the content of the reactor (B) to the reactor (C).
  • the reactor feed (C) from the diluent storage tank (D) is controlled by a liquid flow regulator coupled to the analyzer (R) which continuously monitors the cell content present in the reactor (C) .
  • the in-line (R) analyzer is of the spectrophotometric type being operable at a defined wavelength and set at 630 nm. This value is the wavelength value sensitive to small diameter particles in aqueous dispersion. It then points continuously to the cell content in the reactor (C).
  • the value indicated by the analyzer (R) acts on the diluent inlet valve (6) in this same reactor (C). Whenever the cell concentration becomes greater than the set value, which is a function of the cell growth itself, the valve (6) giving access to the reactor is opened and the diluent is introduced causing the cell concentration to drop to the set amount.
  • the filter (F) between the reactors (B) and (C) operates in the direction from (C) to (B).
  • Said filter is a 3 micron Millipore type filter. Its function is to retain cell and debris residues that have been produced by the cell growth process so that the fluid that (B) is clear and without such residues, being recycled to the reactor (C) sufficiently clean and free from such macroscopic by-products of the bacterial development process.
  • the integral content of the reactor (C) is transferred to the process sequence.
  • the cell content in the reactor (B) is considered adequate when it is equivalent to the pre-
  • the volume of the reactor (C) is completely transferred after the valve (4) joining the reactors (B) and (C) is closed. This transfer takes place rapidly and ends the cell growth cycle initiated from the inoculation of the Ependorf contents to the reactor (A).
  • the diluent is immediately introduced into the reactor (B).
  • the valve 4 connecting the reactors B and C is reopened such that the growth cycle already developed in the reactor A and transferred to the reactor B continues uninterrupted. In this way, the cell dispersion production system operates continuously.
  • the diluent mentioned in the dispersion preparation process may, in principle, be any composition which fulfills the purpose of allowing the suitable growth of the microorganisms under consideration. Therefore, the diluent may be the classical growth medium called YM as well as other compositions as long as it allows the growth of cells in a controlled manner. Such dispersion obtained exhibits a constant and predetermined concentration of xanthomonas campestris cells.
  • composition of the YM medium is as follows:
  • YM medium is especially mentioned as diluent.
  • diluent in the present invention, YM medium is especially mentioned as diluent.
  • any aqueous medium in principle, can be used provided it contains a source of 'carbon, a source of nitrogen, some mineral nutrients containing potassium, magnesium, phosphate and sulfur in its structure and a strain of bacteria genus and family xanthomonas.
  • the carbon source should have a low carbohydrate content, preferably being a reducing sugar like glucose, but may also be a disaccharide such as sucrose, dextrose or any other.
  • the source of mineral or organic nitrogen may at first come from a wide variety of possible nitrogenous substances, and may also contain the usual malt and yeast used for cell growth in numerous patents and literature works since the discovery of xanthan gum already known in the state of the art. In the present invention the source of nitrogen used in YM medium was peptone.
  • Mixed dilution media may also be used.
  • a dispersion containing a defined concentration of Xanthomonas campestris cells is continuously prepared in a controlled manner and available to be inoculated in the xanthan gum biopolymer production reactor.
  • the system consists of three reactors (A), (B) and (C) and enclosures constructed of suitable material, glass or 316 stainless steel and confined in a clean environment, preferably within a laminar flow system.
  • the reactors are jacketed and the external fluid maintains the temperature accurately in the range of 27 to 28 ° C.
  • the first reactor (A) is kept under stirring, the magnetic stirrer being especially set for the desired rotation.
  • the stock of a few tens, hundreds or even thousands of Ependorf vials containing frozen solution of the Xanthomonas ca pestris cells is kept in the cryogenic vessel and can be continuously sent, when necessary, to the respective process.
  • a volume of 1 to 2 liters of the product of that system is transferred to Ependorf flasks and these are stored in a cryogenic vessel.
  • the description is presented for any volume V in the range of 2 to 10 liters, preferably 3 to 5 liters.
  • the content of this reactor is transferred to the reactor (B) by opening the valve (5).
  • the reactor (B) contains V / 2 liters of the diluent at the start of the system and receives continuously, controlled by the valve (2), after transferring the contents from (A) to (B), a flow rate of 0.5 to 1, 5 ml / min of diluent and this is kept under stirring for a further 24 hours keeping the valve (4) joining the reactors (B) and (C) closed.
  • the level meter (U) in the reactor (B) defines the opening moment of the valve (4) causing the liquid to enter the reactor (C) after it is filled.
  • the fluid levels in the reactors (B) and (C) equalize and as the feed in (B) proceeds, the level rises until reaching the pipe (t) joining (C) and (B) through the top and wherein a filter (F) is interleaved. Before the filter (F) there is a pump that forces the liquid through the filter (F) without losing displacement velocity.
  • the filtered fluid enters the reactor (B) to close the cycle.
  • FIA flow injection analysis apparatus
  • the contents of the reactor (A) are transferred to the reactor (B).
  • the fluid flows through the reactors (B) and (C) being filtered by the filter (F).
  • the continuous analyzer (R) controls the cell content in the reactor (C) and the valve (4) is kept open by circulating the fluid in the proper direction and being filtered in the corresponding filter (F) by eliminating the cellular debris from its constitution.
  • the system of pumps and valves is all controlled automatically although it allows the manual actuation.
  • a volume of diluent is added in the reactor (C) through the tubing and the valve (6) to the point of diluting the solution until the concentration is adequate.
  • the fluid is circulating and cell growth is established and when the cell content indicated by the analyzer (R) in line is at the appropriate value, the volume V of the reactor (C) is transferred directly to the transfer vial (G).
  • the transfer vial (G) can be preserved leaving the clean room and may be taken for direct inoculation in the fermentation reactor (E).
  • valves 6 and 4 are closed and the valve 7 is opened until the contents of the reactor C are exhausted.
  • valve (4) is again opened and the liquid from the reactor (B) passes to the reactor (C) again causing the cycle to start again with the addition of the additional volume of the diluent sufficiently so that the fluid begins to flow through the filter (F) in the pipe (t).
  • the system will always release a fixed volume V of aqueous dispersion of Xanthomonas campestris at a determined concentration e. fermentation.
  • the reactor (C) is controlled by an automatic spectrophotometric analyzer (R), operating in the visible range at 630 nm.
  • R automatic spectrophotometric analyzer
  • the cell concentration of that aqueous dispersion is continuously measured and regulated at a set value expressed as mg of cell per volume of aqueous dispersion in diluent whose content leads to the improved performance of the xanthan gum production process. This value is chosen experimentally and defined according to the diluent used.
  • This value of 2.45 g of cells per kilogram of growth broth (0.25%) was experimentally determined by Moraine and Rogovin and corresponds to the optimum cell content present in Y fermentation broth after the growth stage and which provides the improved fermentation performance when inoculated in the fermentation reactor loaded with the known traditional SM medium, in the state of the art concerning the synthesis of xanthan gum. Therefore it was pre-fixed to the desired concentration to be produced by the system of this invention and experimentally, it proved suitable for the respective operation. Thereafter it was adopted throughout the working sequence of this defined concentration dispersion production process of Xanthomonas campestris cells.
  • the valve (6) connecting the diluent storage tank (D) and the reactor (C) is thus driven as a function of the concentration of cells measured in that reactor. If the value of this concentration indicated by the analyzer (R) in line is higher than the desired value, the valve (6) is opened so that the diluent can be added to the reactor (C) sufficiently so that the concentration is adjusted to the value established. Such a procedure does not allow the dispersion viscosity to exceed the smooth operation of the pump system that confers the dynamics to the process.
  • Millipore type filter which removes particles larger than 3 microns in diameter, containing the cells, which normally characterize the debris and residues produced by the microorganisms, so that the solution is recirculated.
  • This filter has a self-cleaning system which allows frequent cleaning of the filter allowing its integrated operation throughout the process.
  • the concentration in the reactor (C) is always maintained at a defined value.
  • the content of an Ependorf is transferred with the aid of a syringe to the reactor (A) equipped with septum and injector of a liquid chromatography apparatus, avoiding contaminations and corresponding to a defined volume transfer and safe form for the reactor (A) starting growth.
  • the syringe system is carefully washed and sterilized and only installed at the time of inoculation of the contents of the next Ependorf.
  • Pasteurization of the diluent solution feeding the continuous cell dispersion preparation system of determined concentration of Xanthomonas campestris is always carried out suitably at 121 ° C by heating the carbohydrate which is the glucose in the case of the diluent is the YM medium, separately from the remainder of the composition.
  • glucose is pasteurized separately and added to the other constituents of the diluent solution at the time of preparation of the diluent solution and this solution being kept in a larger reservoir, also kept inside the environment and feeding the storage tank of diluent (D) so that the dispersant is always available for the operation of the system itself.
  • the carbohydrate is pasteurized in isolation and is added to the aqueous medium of the other components.
  • the diluent means mentioned in the examples constitute only those used or possible to be used in the continuous dispersion preparation system of Xanthomonas campestris cells of determined concentration.
  • the system also allows you to set control values at different reference points. For example, a cell dispersion with twice the concentration of cells throughout the study and accurately defining the flow time conditions to obtain it.
  • the results obtained are of cell concentration as a function of the measurements of the in-line analyzers at each growth time, according to table 1. This curve of response represents the way the absorbance of the solution varies with the concentration of the cells.
  • This response curve like all others, has a linearity range where there is a direct correlation between the data and a range in which the correlation loses linearity (usually at higher values).
  • the linearity range of the curve is set from 0.50 to 3.00 g / kg of solution.
  • the absorbance curve x concentration in grams / kg is reliable and provides the linear coefficient and angular coefficient that were introduced into the in-line apparatus.
  • the curve has a correlation coefficient of 0.9999.
  • the desired point of concentration falls in the perfectly linear range and that lower concentrations than this also make the process work.
  • the value set as the desired concentration is 2.50 g / kg of solution which corresponds to a measured absorbance of 0.700. This was also the value set to the "automatic control point of the whole system.
  • the value of 2.50 g / kg is the value that defines the end of the log phase of bacterial growth and the beginning of the lag phase crecimento the same as data already known in the state of the art.
  • This concentration value is also the value of the optimal concentration of the cell dispersion in the system.
  • the diluent compositions in the following examples are always for the diluent added to Reactors (B) and (C).
  • the composition of the diluent in Reactor (A) is always that of the YM culture medium, ie 0.15% yeast extract, 0.15% malt extract, 0.25% peptone and 0.98% of glucose. (3 g of yeast extract, 3 g of malt extract, 5 g of peptone, 20 g of anhydrous glucose, QSP for 1 liter with water).
  • the reactor (A) has The reactor (B) and the reactor (C) are 4 liters and the storage tank (D) is 15 liters.
  • the other accessories are compatible with these dimensions.
  • the reactor (A) received 50 ml of the YM diluent.
  • the contents of an Ependorf were transferred to the reactor (A) with the aid of a syringe and the stirring of said reactor was started.
  • the diluent was continuously introduced at a flow rate of 1 ml / min and the reactor (B) was kept stirred for 24 hours when the valve (4) to the reactor (C) was opened.
  • the reactor (C) 2 liters of the diluent were added to the volume transferred from the reactor (B).
  • the spectrophotometric (R) analyzer indicated absorbance values close to 0.66, with 0.70 being the optimum concentration of cells. At 42 hours, the total volume of the system was equivalent to the two filled reactors and in this condition the absorbance indicated exactly the value 0.70.
  • the diluent was initially prepared and fed to the storage tank (D) maintaining the tank always at a suitable level.
  • the diluent YM has the known composition of 0.15% yeast extract, 0.15% malt extract, 0.25% peptone and 0.98% glucose.
  • Example 1 All conditions were maintained the same as in Example 1 by changing only one component of the diluent which in this case was YM medium, where sucrose glucose was replaced by the same content. With a substantially equivalent growth time, control value was obtained with the analyzer at the same result as in Example 1.
  • Example 3 All conditions were maintained the same as in Example 1.
  • the diluent used was YM.
  • the medium recommended by ⁇ admus called YM-T.
  • the YM-T diluent consists of 1.2% glucose, 0.15% yeast, 0.15% malt extract, 0.25% peptone, 0.15% diammonium phosphate and 0.15% dipotassium phosphate and 0.005% v anhydrous magnesium sulfate.
  • Example 1 At a lower growth time than Example 1, (85% of the time of Example 1) the control value of the analyzer (R), i.e. the absorbance of 0.70, was obtained.
  • the diluent used was YM.
  • the diluent used was the SM medium.
  • the diluent SM consists of 1.2% glucose, 0.15% yeast, 0.15% malt extract, 0.25% peptone, 0.15% diammonium phosphate, 0.15% dipotassium phosphate and 0.005% of anhydrous magnesium sulfate.
  • Example 1 At a slower growth time than that of Example 1 (80% of the time of Example 1) the control value of the analyzer (R), i.e. the absorbance of 0.70, was obtained.
  • the diluent used was YM.
  • the modified SM medium consists of 1.2% sucrose, 0.15% yeast, 0.15% malt extract, 0.25% peptone, 0.15% diammonium phosphate, 0.15% dipotassium phosphate, 0.005% anhydrous magnesium sulfate, and 0.1% , 05% citric acid.
  • Example 1 At a lower growth time than that of Example 1 (80% of the time of Example 1) the control value of the analyzer (R), i.e. the absorbance of 0.70, was obtained.
  • Example 1 All conditions were maintained the same as in Example 1. The only difference is that in this case 1 used a turbidimetric analyzer instead of the spectrophotometric analyzer for the measurement and control of cell contents.
  • the turbidimetric analyzer was calibrated to the same values as the spectrophotometric analyzer used previously. This calibration also ensured that the system was also compatible and all controlled by this alternative type of analyzer. However, it was found that the spectrophotometric analyzer provides data with a faster response rate.
  • the set point of the analyzer was set at the absorbance value of 0.700.
  • the zero time value was measured after the transfer of the contents of the reactor (A) where the first Ependorf was inoculated to the reactor (B).
  • the absorbance in the analyzer (R) was increasing with the cell growth itself, after feeding the system.
  • the absorbance value reached the control point.
  • the diluent was added continuously in small volumes maintaining the absorbance at the set value.
  • the cell dispersion was transferred / dispensed to the transfer vial (G) and a cell-free volume and equivalent to that withdrawn from the system, ie 4 liters, was introduced from the storage tank (D) to the reactor (B) and then started circulation throughout the system.
  • the production is 160 ml / hour or 4 liters every 25 hours on average.
  • the system is powered by new Ependorfs in regular 24-hour periods. With this, there is a tendency of the system that the growing time will become shorter as the system works. Provided that the cleaning of the filter is done properly. In this case, the cleaning was carried out with 130 hours of system operation.
  • the production is 200 ml / hour or 4 liters every 20 hours on average.
  • Example 4 The same considerations as in Examples 1, 2 and 3 are valid for Example 4.
  • the production is over 200 ml / hour or 4 liters every 20 hours on average.
  • Example 5 The same considerations as in Examples 1, 2, 3 and 4 are valid for Example 5. The results obtained were also very similar to those of Example 4. Between the first 10 to 45-47 hours which characterize the start of the system and correspond to the production of the first 4 liters, we have a productivity value of 88.8-85 ml / hour which is equivalent to 4000 ml every 45 hours.
  • the production is over 200 ml / hour or 4 liters every 20 hours on average.
  • the viscosity of the dispersion is greater than that observed in Examples 1 to 3.
  • the viscosity increase of the dispersion causes the need for more frequent filter cleanings (F) and a small loss of system load on the filter itself which necessitates a greater pressure of the pump system. Even so, the entire assembly can run for at least 250 hours without a major maintenance shutdown.

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Abstract

A presente invenção refere-se a um processo industrial contínuo para a produção de uma dispersão de concentração constante e definida de células de Xanthomonas campestris sendo essa dispersão utilizável como inóculo em um processo fermentativo para a produção de Goma Xantana em condições controladas. A invenção descreve um processo de crescimento celular controlado em três reatores interligados sendo que um deles é alimentado periodicamente com o conteúdo de um Ependorf de volume conhecido de células de microorganismos de interesse e onde o diluente de todo o processo é qualquer um dos meios de cultura que permitam o crescimento celular e que possam ser utilizados isoladamente ou em conjunto com o sistema YM de crescimento celular habitual para Xanthomonas campestris ou outras espécies de Xanthomonas. Este sistema é controlado automaticamente pela medida do teor de células formadas podendo-se pré-definir esse teor de células e levando o processo a fornecer um volume adequado de uma dispersão com uma concentração celular perfeitamente definida para a inoculação no reator de fermentação.

Description

PROCESSO INDUSTRIAL CONTÍNUO PARA PRODUÇÃO DE CÉLULAS REATIVADAS DE Xanthomonas campestris Campo da invenção
A presente invenção refere-se a um sistema industrial continuo para a produção de uma dispersão de concentração constante e definida de células de Xanthomonas campestris sendo essa dispersão utilizável como inoculo em um processo fermentativo para a produção de Goma Xantana em condições controladas.
A Goma Xantana é um biopolimero com utilidades em inúmeros ramos da indústria quais sejam alimentícia, cosmética, farmacêutica, têxtil, de explosivos e de petróleo. Além disso, tal goma exibe excelentes características como viscosificante e apresenta efeito significativo como estabilizante em emulsões bem como uma excelente resistência salina e grande resistência a alterações de pH, assim como estabilidade à ação enzimática o que torna crescente o uso da goma xantana como um aditivo importante em uma pluralidade considerável de processos e produtos químicos.
Estado da técnica
A Goma xantana é produzida por ação de bactérias da espécie Xanthomonas campestris ou outras espécies de Xanthomonas em processo de fermentação aeróbica a partir de um meio onde haja uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogénio e alguns nutrientes minerais que contenham potássio, magnésio, fosfato e enxofre à sua estrutura.
Esse biopolimero tem massa molecular na faixa de 0,5 a 12 milhões de daltons e consiste molecularmente de uma cadeia de carboidratos em que glicose, manose e ácido glicurônico na proporção de 2,8:2,8:2 estão arranjados em uma cadeia principal de D-glucopiranose Glucan (ligação 1,4 de glucopiranoses ) . Existe a cada duas glucoses uma ramificação constituída por uma D-manose acetilada que está ligada a essa glucose. À esta D-manose acetilada está ligado um ácido d-glucuronico e este ligado a uma segunda D-manose piruvatizada, conforme figura abaixo:
Figure imgf000004_0001
D MANOSE PIRUVATIZADA
ESTRUTURA DA GOMA XANTANA
0 polímero é aniônico sendo que o cátion sódio acompanha a molécula orgânica na maioria dos produtos goma xantana. Além disso, teores de nitrogénio da ordem de 1% também podem estar presentes na goma xantana, via de regra como material protéico associado à cadeia principal.
Existem, no estado da técnica, numerosas publicações referentes à produção de polissacarideos base água, do tipo goma xantana, podendo ser citadas as Patentes US 3.020.206, US 3.251.749, US 3.391.060, US 3.271.267, US 3.427.226, US 3.433.708, US 3.455.786, US 3.594.280, US 4.154.654 e US 4.282.321.
O procedimento usual para a produção de goma xantana envolve a realização de uma fermentação em duas etapas diferenciadas. Primeiramente, o microorganismo a ser utilizado é submetido a um cultivo adequadoj|en pequena escala de forma a se obter uma concentração de bactérias relativamente elevada. Nessa fase, a bactéria não produz o exopolimero ou o produz em uma concentração muito baixa. A população dos microorganismos cresce significativamente nessa fase. Por isso ela é denominada de fase de germinação ou de crescimento.
A partir dai, o material resultante dessa primeira etapa, tendo uma concentração relativamente elevada de bactérias, é inoculado no reator maior contendo um meio de cultura apropriado e sob aeração controlada e condições reacionais perfeitamente ajustadas para que ai se desenvolva a etapa de fermentação propriamente dita. Essa é a etapa de produção ou de fermentação como é também denominada.
Dezenas de menções de patentes e artigos de importância na literatura química relacionada a esse assunto mostram que o crescimento celular passa por duas fases sendo a primeira a fase log que dura, desde a inoculação até 15 a 34 horas e a segunda, a fase lag em que o crescimento ainda é existente, mas muito menos intenso.
O artigo de Papagianni e col., Process Biochem, 37, 73-80(2001), apresenta um tempo de 42 a 44 horas para que se atinja essa fase lag de crescimento.
O artigo de Pons, Dussap e Gros, Biotec and Bioengineering, 33, 1989 apresenta com clareza a relação do crescimento bacteriano, quer seja do teor de biomassa em função dos parâmetros do próprio processo. Os autores destacam a importância e total dependência em relação ao teor de nitrogénio consumido pelas bactérias para definir o rendimento de biomassa formado. Um valor para- rendimento de biomassa expresso em gramas
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totais de microorganismo formadas/gramas de nitrogénio consumido, da ordem de 8,48 é encontrado pelos autores e valores semelhantes também são destacados por outros grupos de pesquisa .
Os autores também determinam a máxima velocidade de crescimento especifico de células como sendo μ= 0,5 h"1 (constante de velocidade de primeira ordem) o que corresponde a uma concentração de células na fase estacionária após a fase log do processo de crescimento da ordem de 1,8 g células por litro de solução, no meio de crescimento por eles utilizado.
Diversos meios de crescimento são apresentados em toda a literatura, prevalecendo o meio YM ou MY como inicialmente denominado.
Piches e Pallent, Biotec and Bioeng. , 28,1484, (1986), mencionando o trabalho de iensroek e Klein. (Patente US No. 4,374,929) e utilizando o meio de crescimento constituído por KH2P04 0,88, K2S0 0,54, MgSO4.7H20, CaCl2.2H20 0,056, acido cítrico 0,167, FeCl3 0,01, glicose 22,5 e elementos em traços mg/kg (ZnS04 1 como Zn , CuS04 0,6 como Cu, nS04, H3B03 0, 1 como B, NaMo04 0,2 (como Mo) e Kl 0,1 como I destacam um tempo de log até lag 28-32 horas.
Weiss e Ollis, Biotec and Bioeng., 22,859, (1980), apresentam a seguinte equação:
X(t) = X0 e μί /[1.0 - (X0 /X»ax)(l.Q - e tfl) ]
Onde X0 é a concentração inicial de biomassa na inoculação;
X(t) é a concentração de células no momento t do crescimento celular;
Xmax é a máxima concentração de células que se desenvolvem em uma determinada condição de meio de crescimento .
No trabalho de Moraine e Rogovin, um gráfico é apresentado mostrando que o crescimento celular que parte de zero de forma crescente (fase log de crescimento) atinge um máximo de 2,45 g/kg em aproximadamente 40-45 horas de crescimento e permanece nesse patamar até 85 horas (fase lag de crescimento) quando começa a cair e atinge 1,6 em aproximadamente 100 horas. Para esses autores, e considerando os dados de Moraine e Rogovin Biotec and Bioeng., 13, 381, (1971), a máxima concentração de células, Xmax é da ordem de 2,45 g de células por quilo de caldo de crescimento (0,25%).
Thompson e Ollis, Biotec and Bioeng ., 22 , 875 , (1980), utilizam como meio de crescimento, uma solução aquosa de 2% de dextrose, 0,8% de extrato de distillers dried solubles, 0,5% de KaHP04 e 0,01% de MgS04,
Cadmus e col . , Biotec and Bioeng., 20, 103-1014, ( 1978), usam o meio de crescimento YM em duas fases desde um liofilizado de células de Xanthomonas campestris e duas etapas iniciais da fase de crescimento e na terceira etapa desta fase, utilizam o meio YM-T que consiste de 1,2% de glicose, 0,15% de levedura, 0,15% de extrato de malte, 0,25% de peptona , 0,15% de fosfato diamônico e 0,15% de fosfato dipotássico e 0,005% de sulfato de magnésio anidro.
Moraine e Rogovin col., Biotec and Bioeng.,15, 225, (1973), apresentam dados de crescimento celular e indicam que a concentração máxima de células é obtida aijum. tempo de crescimento da ordem de
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a velocidade especifica de formação de células está relacionada diretamente com o teor de nitrogénio da fonte de nitrogénio orgânico utilizado no caso o DDS com uma velocidade inicial máxima de crescimento igual a 0,25/hora e uma saturação máxima equivalente de 0,008% do nitrogénio presente no DDS. Os autores afirmam que quase a metade do nitrogénio disponível no meio resta inalterado quando cessa o crescimento celular.
A patente de Honnma, Higehiro e Kanji, US 5,580,763 é uma excelente indicação sobre uma variedade grande de meios de crescimento e de produção para goma xantana. Os autores preconizam o uso de nitrogénio amoniacal e uma substância oleosa do tipo leite de soja.
0 meio de crescimento MY é utilizado pelos autores e constitui-se de 0,3% de malte, 0,3% de levedura, 1% de dextrose e 0,5% de peptona.
Apresentação da solução do problema em linhas gerais
Apesar de todo esse "background" de informação sobre o processo de crescimento celular no caso da Xanthomonas campestris , é verificado que em todas as menções de trabalhos e patentes efetivas, a etapa de crescimento celular não tem um controle efetivo durante sua realização. Além disso, a concentração real de células do microorganismo ao fim da etapa de crescimento e que é, efetivamente, inoculada no reator de produção do biopolimero nunca é mencionada ou mesmo não é conhecida. Dessa forma, ela é baseada em conhecimentos empiricos ou na aplicação de equações cinéticas dentro de modelos reacionais complicados, como indicado acima nos¾ documentos citados no estado da técnica e sem que se leve em consideração o verdadeiro teor de células que alimentam o reator de fermentação.
No estado da técnica relacionado à síntese de Goma Xantana, utiliza-se o conhecimento empírico nas fases do próprio crescimento celular que ocorrem desde a placa de Petri até a própria inoculação e, dessa forma, no volume de inoculo adicionado ao reator de fermentação que permite o controle do processo de fabricação.
Isto implica em não se dispor do valor da concentração inicial de células que é alimentada para a fase de fermentação. Cabe ressaltar que o acompanhamento do processo se dá em função do tempo de crescimento onde se define o tempo que a massa celular deve ser . deixada crescendo antes de ser transferida para o fermentador. Logo, se pode ter concentrações de células muito variáveis ao se considerar findada a etapa de crescimento celular.
O fato de se ter uma concentração de células que não é conhecida ao final da etapa de crescimento, podendo variar significativamente de lote a lote, faz com que o controle de todo o processo que implica diretamente sobre a etapa de produção seja sempre realizado empiricamente. Logo, obtêm-se resultados com diferenças significativas não só nas propriedades micro e macroscópicas do biopolimero obtido como também refletindo em diferenças significativas de qualidade e de produtividade da goma xantana obtida ao final do processo.
Com a finalidade de resolver este problema, a referida invenção propõe um sistema continuo de produção de uma dispersão de células de Xanthomonas campestris ou outras espécies de Xanthomonas e microorganismos bacterianos, correlatos, em solução aquosa com uma concentração de células perfeitamente definida, adequada e constante a inoculação direta no reator de fermentação para a produção do biopolimero de Goma Xantana.
Desta forma, permite-se introduzir sempre o mesmo teor de células (concentração) no reator de fermentação conduzindo a um significativo ganho em controle de processo e em qualidade de produto comparado com o resultado das produções segundo as metodologias do estado da arte de síntese de goma xantana. Sendo assim, a invenção estabelece um controle de forma que a concentração celular seja quantificada e conhecida na solução que é inoculada ao fermentador .
Breve descrição dos desenhos
A Figura 1 representa o fluxograma do processo para a preparação de uma dispersão de células de Xanthomonas campestris de concentração determinada da presente invenção.
Descrição detalhada da invenção
O sistema contínuo de preparação de dispersão de concentração determinada de células de Xanthomonas campestris é composto por três reatores (A), (B) e (C), um reservatório de armazenamento de diluente (D), um analisador (R) continuo de células de microorganismo, um filtro (F) e um medidor de nível (U), além das tubulações, bombas e válvulas que permitem sua operação em continuo.
0 reator (A) é o reator de inoculação de células e alimentação ao sistema contínuo de crescimento dessas células .
Os reatores (B) e (C) sao os efetxvos reatores que permitem o processo contínuo de crescimento celular. Os reatores (B) e (C) têm ambos capacidade de V (litros). 0 volume V é da ordem de 2 a 10 litros, melhor de 3 a 7 litros e ainda melhor de 4 a 6 litros.
O volume do reator (A) é da ordem de 1/20 a 1/10 do volume do reator (B) e (C).
O volume V é geralmente igual a 1/10 do volume do reator de fermentação (E) correspondente quando este tem uma capacidade de 30 a 80 litros.
Entretanto, a invenção não se restringe somente a esses valores, podendo ser utilizados volumes maiores quando quantidades maiores de inóculos forem utilizadas nos reatores de fermentação da unidade industrial de produção de goma xantana.
Os reatores acima mencionados (A, B e C) e também o tanque de armazenamento de diluente (D) são constituídos em vidro ou aço inox, geralmente 316, encamisados e com controle de temperatura que permita trabalhar a temperaturas definidas e constantes na faixa de 26 a 30 °C.
Tais reatores não têm cantos retos que causem incrustações ou qualquer processo análogo que possa provocar contaminações do meio neles contido.
Tanto os reatores quanto o tanque de armazenamento de diluente (D) são dotados de respiros para a atmosfera equilibrando desta forma as pressões, sendo que o ar que adentra o sistema é filtrado e esterilizado protegendo o sistema contra naturais contaminações.
Os reatores possuem agitadores . magnéticos perfeitamente definidos em termos de forma e ^velocidade , conferindo assim uma velocidade de agitação¾adéquada e automaticamente controlada ao meio.
0 tanque de armazenamento de diluente (D) tem condições de alimentar cada um dos reatores (A, B e C) de forma a manter a dinâmica do processo.
A alimentação do reator (A) que é proveniente do tanque de armazenamento de diluente (D) é controlada pela válvula (1) e é realizada por fase quando o conteúdo do reator (A) é transferido integralmente para o reator (B).
A alimentação do reator (B) que é proveniente do tanque de armazenamento de diluente (D) é controlado pela válvula (2) e por um sistema regulador de vazão de liquido de forma que um fluxo definido é continuamente alimentado ao reator (B). Esse fluxo é estabelecido sendo da ordem de 0,5 a 2,0 ml/min dependendo do volume dos próprios reatores (A) e (B).
Uma segunda tubulação permite também que o tanque de armazenamento de diluente (D) alimente o reator (B) introduzindo, de forma rápida, o diluente para o referido reator. 0 fluxo de diluente é controlado pela válvula (3). A válvula (3) quando aberta faz com que seja introduzido, em tempo praticamente instantâneo, um volume de diluente equivalente à capacidade do reator (B) que é regulado pelo medidor de nível (U). Essa válvula (3) é aberta toda vez que o conteúdo do reator (C) é transferido para o frasco de transferência (G) e daí ao reator de fermentação (E). Tais transferências são realizadas de forma sincronizada e com a transferência do conteúdo do reator (B) para o reator (C).
A alimentação do reator (C) que é proveniente do tanque de armazenamento de diluente (D) é controlada por um sistema regulador de vazão de líquido acoplado ao analisador (R) que monitora de forma contínua o teor de células presente no reator (C).
O analisador em linha (R) é do tipo espectrofotométrico sendo operável em um comprimento de onda definido e fixado em 630 nm. Este valor é o valor de comprimento de onda sensível a teores de partículas de pequeno diâmetro em dispersão aquosa. Ele aponta então, de forma contínua, o teor de células no reator (C). O valor apontado pelo analisador (R) atua sobre a válvula de entrada de diluente (6) nesse próprio reator (C). Toda vez que a concentração de células se torna maior que o valor definido, o que é função do próprio crescimento celular, a válvula (6) que dá acesso ao reator é aberta e o diluente é introduzido fazendo com que a concentração de células baixe até o valor fixado.
0 filtro (F) que se situa entre os reatores (B) e (C) opera no sentido de (C) para (B). O referido filtro é um filtro tipo Millipore de 3 micra. Sua função é reter os resíduos celulares e débris que tenham sido produzidos pelo processo de crescimento celular de forma que o fluido que vai para o reator (B) seja límpido e sem esses resíduos, sendo reciclado ao reator (C) suficientemente limpo e livre de tais subprodutos macroscópicos do processo de desenvolvimento bacteriano.
Quando o teor de células no reator (B) é o adequado, o conteúdo integral do reator (C) é transferido para a sequência do processo.
O teor de células no reator (B) é considerado adequado quando for equivalente ao teor de células pré-
' . ·¾ fixado e correspondente a um tempo de residência das células no sistema de crescimento celular (reatores B e C) de 28 a 42 horas, conforme o diluente e demais condições.
De maneira geral, o volume do reator (C) é integralmente transferido após a válvula (4) que une os reatores (B) e (C) ser fechada. Essa transferência é efetuada rapidamente e encerra o ciclo de crescimento celular iniciado desde a inoculação do conteúdo do Ependorf ao reator (A) .
Uma vez realizada a transferência, o diluente é imediatamente introduzido ao reator (B). A válvula (4) que une os reatores (B) e (C) é novamente aberta de forma que o ciclo de crescimento já desenvolvido no reator (A) e transferido para o reator (B) prossiga ininterruptamente. Desta forma, o sistema de produção de dispersão de células opera de forma contínua.
Possíveis diluentes a serem utilizados no processo
0 diluente mencionado no processo de preparação da dispersão pode, a princípio, ser qualquer composição que cumpra o objetivo de permitir o crescimento adequado dos microorganismos em consideração. Sendo assim, o diluente pode ser o meio de crescimento clássico denominado YM bem como outras composições desde que permita o crescimento das células de forma controlada. Tal dispersão obtida apresenta uma concentração constante e predeterminada das células de xanthomonas campestris.
A composição do meio YM é a seguinte:
Na presente invenção, o meio YM é especialmente mencionado como diluente. Entretanto, em função,. de aspectos
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de custo-benefício, qualquer meio aquoso, a principio, pode ser utilizado desde que contenha uma fonte de 'carbono, uma fonte de nitrogénio, alguns nutrientes minerais que contenham potássio, magnésio, fosfato e enxofre em sua estrutura e uma linhagem de bactérias do género e família xanthomonas . A fonte de carbono deve apresentar um baixo teor de carboidrato, sendo de preferência um açúcar redutor como glicose, mas podendo ser também um dissacarídeo como sacarose, dextrose ou um outro qualquer. A fonte de nitrogénio mineral ou orgânica pode a princípio provir de uma grande variedade de substâncias nitrogenadas possíveis, podendo conter também os habituais malte e levedura usados para o crescimento celular em inúmeras patentes e trabalhos da literatura desde a descoberta da goma xantana já conhecidos no estado da técnica. Na presente invenção a fonte de nitrogénio utilizada no meio YM foi a peptona.
A composição clássica de malte e levedura esta indicada a seguir.
Meios de diluição mistos também podem ser utilizados. Como exemplo, podemos citar o uso do meio de diluição YM no reator (A) e a introdução de um segundo meio de cultura apresentando um menor teor de levedura e malte. Ou então, esse segundo meio de cultura pode apresentar teores nulos desses dois componentes, ou esses dois componentes podem ser substituídos por eventualmente uma outra ou outras substâncias que possam permitir o crescimento celular sem bloquear a subsequente produção da goma xantana a ocorrer no reator de fermentação (E) para o qual o conteúdo completo de reator (C) é transferido.
Exemplos de operação apresentados a seguir indicam alguns dos dispersantes utilizáveis, não restringindo essa invenção apenas aos dispersantes aqui indicados^ ^
Detalhamento de operação do processo contínuo de preparação de dispersão de concentração determinada de células de Xanthomonas campestris
Mais particularmente, de acordo com esta invenção, uma dispersão contendo uma concentração definida de células de Xanthomonas campestris é preparada, em contínuo, de forma controlada e disponível para ser inoculada no reator de produção de biopolímero goma xantana.
Neste pedido de patente, fazemos referência a dados experimentais correspondentes à produção de Goma Xantana e, portanto, relativos ao microorganismo Xanthomonas campestris e a outros microorganismos de espécies correlatas de Xanthomonas. No entanto, a invenção se refere também a todos os demais sistemas de produção de biopolímeros aquosolúveis quanto às suas etapas de crescimento de microorganismos que, com sua fermentação, resultam em tais exo-polímeros de origem biológica.
Segundo o procedimento descrito nessa invenção, todas as operações são realizadas em condições de sala limpa e todo o material é esterilizado a 121-126 °C por duas horas antes de ser utilizado.
O sistema é constituído por três reatores (A), (B) e (C) e anexos construídos em material adequado, vidro ou aço inox 316 e confinado em ambiente limpo, preferencialmente dentro de um sistema com fluxo laminar. Os reatores são encamisados e o fluido externo mantém a temperatura com precisão na faixa de 27 a 28 °C.
0 primeiro reator (A) de vidro de capacidade V/10 ml
(onde V é o volume dos reatores B e C), contém um volume
SS A
. í definido da solução esterilizada do meio YM e" nele e adicionado o conteúdo de 3 ml de um Ependorf mantido em vaso criogênico até o momento dessa transferência.
O primeiro reator (A) é mantido em agitação, sendo o agitador magnético especialmente definido para a rotação desejada .
0 segundo reator (B), dotado de sistema análogo de agitação magnética, de capacidade de V litros, também encamisado e mantido a 27°C é ligado ao reator (C) por tubulações adequadas sendo o fluxo impulsionado por bombas adaptadas às vazões desejadas e que podem ser do tipo mecânica de pistão, peristálticas ou de outras concepções adequadas para baixos fluxos da ordem de 0,1 até 1 ml/min.
Preparação do inoculo inicial conservado em frascos Ependorf
Realizado em fluxo laminar em sala totalmente esterilizada. A partir de uma cepa definida da bactéria Xant omonas campestris, NRRL B1459, faz-se o crescimento celular em placa de Petri selecionando-se as colónias de tamanho adequado e após isso, transferindo uma quantidade adequada dessas células para Erlenmeyer de tamanho conveniente de preferência de 125 ml e mantida em Shaker por 24 horas em meio de crescimento YM.
Em seguida, o conteúdo desse Erlenmeyer é transferido a um Erlenmeyer de 1000 ml e inoculado a 500 ml de solução YM e colocado em Shaker por mais 24 horas.
Em seguida, volumes de 3 ml dessa solução são transferidos para frascos Ependorf sendo esses fechados e conservados em vaso criogênico pelo tempo necessário e só retirados no momento da inoculação no sistema reacional apresentado no presente pedido.
Dessa forma, o estoque de algumas dezenas, centenas ou mesmo milhares de frascos Ependorf contendo solução congelada das células de Xanthomonas ca pestris é mantido no vaso criogênico e pode ser continuamente enviado, no momento em que for necessário, ao respectivo processo. Após o sistema continuo de produção de dispersão de células, com uma concentração conhecida, estar em pleno funcionamento, um volume de 1 a 2 litros do produto desse sistema é transferido para frascos Ependorf e estes são conservados em vaso criogênico.
Início da operação do processo
No exemplo desenvolvido, o volume V escolhido para os reatores (B) e (C) foi de 5 litros. (V = 5 litros). A descrição é apresentada para um volume V qualquer na faixa de 2 até 10 litros, preferencialmente 3 a 5 litros.
0 conteúdo de um Ependorf é alimentado sob condições absolutamente limpas ao reator (A) de V/10 litros, sendo o frasco lavado com o diluente. Adiciona-se V/15 ml do diluente e deixa-se o sistema em agitação por 24 horas.
Em seguida, o conteúdo deste reator é integralmente transferido ao reator (B) abrindo-se a válvula (5). O reator (B) contém V/2 litros do diluente na partida do sistema e recebe continuamente, controlado pela válvula (2), após a transferência do conteúdo de (A) para (B), uma vazão de 0,5 a 1,5 ml/min de diluente e este é mantido em agitação por mais 24 horas mantendo fechada a válvula (4) que une os reatores (B) e (C). 0 medidor de nível (U) no reator (B) define o momento de abertura da válvula (4) fazendo o líquido adentrar no reator (C) pass'àndo este a ser preenchido. Os níveis de fluido nos reatores (B) e (C) se igualam e à medida que a alimentação em (B) prossegue, o nível vai subindo até alcançar a tubulação (t) que une (C) e (B) pela parte superior e onde um filtro (F) está intercalado. Antes do filtro (F) há uma bomba que força o líquido a passar pelo filtro (F) sem perder velocidade de deslocamento.
O fluido filtrado adentra o reator (B) fechando o ciclo.
Enquanto isso, no reator (A) após a transferência de seu conteúdo para o reator (B), uma segunda carga de diluente é alimentada pela tubulação e com a abertura da respectiva válvula (1) o crescimento celular é iniciado repetindo-se o ciclo de transferência do seu volume para o reator (B) após 24 horas como já descrito.
Funcionamento em contínuo
0 reator (B) é alimentado continuamente com a solução diluente a uma vazão aproximada de 0,5 a 1,0 ml por minuto, sendo preferencialmente 0,7 a 0,9 ml por minuto para o volume de V = 5 litros controlada por um sistema de injeção do tipo utilizado em aparelhos cromatográficos de cromatografia liquida de alta performance ou aparelho de flow injection analysis (FIA).
A cada período de 24 horas, o conteúdo do reator (A) é transferido para o reator (B). 0 fluído vai ciciando pelos reatores (B) e (C) sendo filtrado pelo filtro (F).
O analisador (R) contínuo controla o teor de células existente no reator (C) e a válvula (4) é mantida aberta fazendo o fluido circular no sentido adequado e sendo filtrado no correspondente filtro (F) elimihando-se os resíduos celulares de sua constituição.
O sistema de bombas e válvulas é todo controlado automaticamente embora permita a atuação manual.
Se o teor de células ultrapassa o valor adequado, um volume de diluente é adicionado no reator (C) através da tubulação e da válvula (6) a ponto de diluir a solução até que a concentração seja adequada.
O fluido vai circulando e o crescimento celular vai se estabelecendo e quando o teor de células indicado pelo analisador (R) em linha está no valor adequado, o volume V do reator (C) é transferido diretamente ao frasco de transferência (G). O frasco de transferência (G) pode ser conservado saindo da sala limpa e pode ser levado para inoculação direta no reator de fermentação (E).
Sempre a transferência para o frasco de transferência (G) se faz com a dispersão na concentração adequada.
Para a transferência desse volume, as válvulas (6) e (4) são fechadas e a válvula (7) é aberta até se esgotar o conteúdo do reator (C). Após isso, a válvula (4) é novamente aberta e o líquido do reator (B) passa ao reator (C) fazendo novamente com que o ciclo recomece com a adição do volume suplementar do diluente de forma suficiente para que o fluído recomece a circular através do filtro (F) na tubulação ( t ) .
Dessa forma, alimentando o reator (A) com o conteúdo do frasco Ependorf em tempos adequados , em média a cada vinte e quatro horas, e ajustando adequadamente o volume de diluente e as vazões de cada fluxo, o sistema vai sempre liberar um volume fixo V de dispersão aquosa de, Xanthomonas campestris com uma concentração determinada e . adequada a fermentação .
Funcionamento e ajuste do analisador em linha, do filtro do processo e do sistema de injeção do conteúdo de Ependorfs, no sistema
0 reator (C) é controlado por um analisador (R) automático espectrofotométrico, operando na faixa do visível a 630 nm. Por esse analisador (R), a concentração de células dessa dispersão aquosa é medida continuamente e regulada a um valor fixado expresso em mg de célula por volume de dispersão aquosa em diluente cujo teor conduz à melhor performance do processo de produção da goma xantana. Esse valor é escolhido de forma experimental e definido em função do diluente utilizado.
Um valor de orientação de 2,45 g de células por quilo de caldo de crescimento (0,25%) já mencionado no estado da técnica no trabalho de Moraine e Rogovin, serve como base para a padronização do sistema analisador e para a definição do valor a ser alcançado e fixado para que o sistema dessa invenção possa produzir. Este valor foi adotado em todo o procedimento, entretanto, nada impede que outros valores, nessa faixa de 2-3 g células por quilo de caldo de crescimento, sejam adotados e fixados para a operação do sistema proposto nesta invenção.
Esse valor de 2,45 g de células por quilo de caldo de crescimento (0,25%) foi experimentalmente determinado por Moraine e Rogovin e corresponde ao teor ótimo de células presentes em caldos de fermentação Y após a etapa de crescimento e que fornece a melhor performance de fermentação quando inoculado no reator de fermentação carregado com o meio SM tradicional conhecido, n estado da técnica referente à síntese de goma xantana. Por isso foi pré-fixado para a concentração desejada a ser produzida pelo sistema desta invenção e experimentalmente, se mostrou adequado para a respectiva operação. A partir daí foi adotado em toda a sequência de funcionamento desse processo de produção de dispersão de concentração definida de células de Xanthomonas campestris.
Na sequência experimental de padronização do analisador (R), uma curva de absorbância a 630 nm em função da massa de células é estabelecida. Um analisador turbidimétrico também pode ser utilizado para esse acompanhamento reacional .
A válvula (6) que une o tanque de armazenamento de diluente (D) e o reator (C) é assim acionada em função da concentração de células medida nesse reator. Se o valor dessa concentração, indicado pelo analisador (R) em linha for superior ao valor pretendido, a válvula (6) é aberta para que o diluente possa ser adicionado ao reator (C) de forma suficiente para que a concentração se ajuste ao valor estabelecido. Tal procedimento não permite que a viscosidade da dispersão ultrapasse o valor adequado para o bom funcionamento do sistema de bomba que confere a dinâmica ao processo.
Entre os reatores , está situado um filtro (F) do tipo Millipore que elimina as partículas de diâmetro superior a 3 micra, contendo as células, que normalmente caracterizam os débris e resíduos produzidos pelos microorganismos, de forma que a solução se recircule. Outros meios filtrantes que
sist
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Esse f ltro tem um s stema autol mpante ' que perm te a limpeza frequente do filtro permitindo seu funcionamento integrado a todo o processo.
Dessa forma, a concentração no reator (C) é sempre mantida em um valor definido.
A cada intervalo de 36 a 46 horas aproximadamente, temos um volume de dispersão de células do microorganismo na concentração adequada e que podem ser transferidos integralmente a um dos reatores de fermentação (E). Este intervalo de tempo pode ser maior ou menor em função do próprio desenvolvimento celular e dos próprios parâmetros do processo.
0 excesso de dispersão de células é conservado em um reservatório a parte, a temperatura de 15°C também monitorado periodicamente pelo analisador (R) espectroscópico .
0 conteúdo de um Ependorf é transferido com auxílio de uma seringa para o reator (A) dotado de septo e injetor de um aparelho de cromatografia líquida, evitando contaminações e correspondendo a uma transferência de volume definido e forma segura para o reator (A) iniciando o crescimento. Após a injeção, o sistema incluindo a seringa é lavado e esterilizado cuidadosamente e só instalado no momento da inoculação do conteúdo do próximo Ependorf .
Pasteurização da solução diluente
A pasteurização da solução diluente que alimenta o sistema continuo de preparação de dispersão de células de concentração determinada de Xanthomonas campestris é sempre realizada adequadamente a 121°C, aquecendo-se o carboidrato, que e a glicose no caso do diluente sèr o meio YM, separadamente do restante da composição.
Assim, nesse caso, glicose é pasteurizada a parte e agregada aos demais constituintes da solução diluente no momento da preparação da solução diluente e sendo esta solução conservada em reservatório maior, também mantido dentro do ambiente e alimentando a cada 24 horas o tanque de armazenamento de diluente (D) de forma que o dispersante esteja sempre disponível para o funcionamento do próprio sistema .
Em todos os demais meios diluentes, o carboidrato é pasteurizado de forma isolada e reunido ao meio aquoso dos demais componentes .
Os meios diluentes mencionados nos exemplos constituem apenas alguns dos utilizados ou possíveis de serem utilizados no sistema contínuo de preparação de dispersão de células de Xanthomonas campestris de concentração determinada.
Cada um desses diluentes pode ter procedimentos ligeiramente diferentes no processo de pasteurização o que é perfeitamente compreensível por um técnico no assunto já acostumado a processos dessa natureza.
Preparação da dispersão de células de Xanthomonas campestris de concentração determinada no processp contínuo da presente invenção
Com o processo operando em condições adequadas, é produzida uma dispersão de células de concentração perfeitamente ajustada. A concentração é dada em massa de células por volume de solução, sendo definida segundo a própria cinética de crescimento celular.. e sendo perfeitamente controlada. Essa concentração pérféitamente ajustada é a concentração ótima a ser inoculada diretamente no reator de fermentação (E) . Com isso uma produção de goma Xantana é obtida em maior quantidade e a etapa de fermentação é melhor controlada impactando nos resultados de todo o processo.
Assim, está garantida a maior reprodutibilidade da etapa de fermentação uma vez que ela se inicia sempre com a mesma concentração inicial de células, tornando a etapa de fermentação muito mais controlável quando comparada com as sínteses de goma xantana realizadas no estado da técnica.
0 sistema também permite fixar os valores de controle à diferentes pontos de referência. Por exemplo, uma dispersão de células com o dobro da concentração de células de todo o estudo e definindo exatamente as condições de tempo de vazões para obtê-la.
Curva de resposta; Concentração de células x Absorbância
Os resultados obtidos são de concentração de células em função das medidas dos analisadores em linha a cada tempo de crescimento, conforme tabela 1. Esta curva de resposta representa a maneira como a absorbância da solução varia com a concentração das células.
Tabela 1
Figure imgf000026_0001
Essa curva de resposta, assim como todas as outras, apresenta uma faixa de linearidade onde existe uma correlação direta entre os dados e uma faixa em que a respectiva correlação perde a linearidade (geralmente a valores mais altos). A faixa de linearidade da curva se estabelece de 0,50 a 3,00 g/kg de solução.
Na faixa de linearidade, a curva de absorbância x concentração em gramas /kg é confiável e fornece o coeficiente linear e o coeficiente angular que foram introduzidos no aparelho em linha. A curva tem um coeficiente de correlação de 0,9999. Nesta faixa de linearidade, percebe-se que o ponto de concentração desejado cai na faixa perfeitamente linear e que concentrações mais baixas do que esta também fazem com que o processo funcione.
O Valor definido como concentração desejada é 2,50 g/kg de solução o que corresponde a uma absorbânciái medida de 0,700. Este foi também o valor estabelecido párá o "ponto de controle automático de todo sistema. O valor de 2,50 g/kg é o valor que define o fim da fase log de crescimento bacteriano e o inicio da fase lag do mesmo crecimento, conforme dados já conhecidos no estado da técnica.
Esse valor de concentração é também o valor da concentração ótima da dispersão celular no sistema.
Com essa curva de resposta e calibrada com frequência de dois dias no máximo, se estabelece o acompanhamento do crescimento celular e das medidas de absorbância de soluções no analisador (R) que acompanha o reator (C).
As composições de diluentes nos exemplos a seguir são sempre quanto ao diluente adicionado aos Reatores (B) e (C). A composição do diluente no Reator (A) é sempre a do meio de cultura YM, ou seja, 0,15% de extrato de levedura, 0,15% de extrato de malte, 0,25% de peptona e 0,98% de glicose. (3 g de extrato de levedura, 3 g de extrato de malte, 5 g de peptona, 20 g de glicose anidra, QSP para 1 litro com água).
Exemplo 1
Em um sistema segundo a figura 1, o reator (A) tem capacidade de 100 ml, o reator (B) e o reator (C) são de 4 litros e o tanque de armazenamento (D) é de 15 litros. Os demais acessórios são compatíveis com essas dimensões.
Inicialmente, foram preparados 15 litros da solução diluente YM. Entretanto, a cada dia, cinco litros dessa solução são preparados, esterilizados e colocados no tanque de armazenamento (D).
O reator (A) recebeu 50 ml do diluente YM. Além disso, o conteúdo de um Ependorf foi transferido ao reator (A) com auxílio de uma seringa e a agitação do referido reator foi iniciada.
Após 24 horas, o conteúdo do reator (A) foi totalmente transferido ao reator (B) que já continha 3 litros do meio YM e estava fechado em sua válvula (4) de contato com o reator (C).
Iniciou-se a introdução do diluente continuamente a vazão de 1 ml/min e o reator (B) foi mantido agitado por 24 horas quando a válvula (4) para o reator (C) foi aberta . No reator (C) foram introduzidos 2 litros do diluente juntando-se ao volume transferido do reator (B).
Nesse momento, o conteúdo de um segundo Ependorf foi também adicionado ao reator (A) , iniciando o crescimento celular nesse reator da mesma forma que com o Ependorf anterior .
O líquido subiu nos dois reatores (B) e (C) e com 36 horas, atingiu a tubulação (t) que contém o filtro (F) sendo o líquido bombeado através do filtro (F) novamente para o reator (B).
Nesse meio tempo, o conteúdo do reator (A) foi transferido para o reator (B) e prosseguiu crescendo em (B) e em todo o sistema.
0 analisador (R) espectrofotométrico apontava de absorbância valores próximos de 0,66 sendo 0,70 o valor definido como a concentração ótima de células. Ao atingir 42 horas, o volume total do sistema era equivalente aos dois reatores preenchidos e nesta condição a absorbância indicou exatamente o valor 0,70.
Nesse momento, as válvulas foram acionadas e o conteúdo integral do reator (C), foram
Figure imgf000029_0001
transferidos para o frasco de transferência '(G) e dai destinados ao reator de fermentação (E).
4 litros de diluente YM foram introduzidos no mesmo instante no reator (B) e o sistema prosseguiu dessa forma produzindo. A cada momento em que a absorbância atingia o valor 0,70 um ciclo se repetia e um Ependorf era adicionado ao sistema.
0 diluente foi preparado inicialmente e era alimentado ao tanque de armazenagem (D) mantendo o tanque sempre em um nível adequado.
0 diluente YM tem a conhecida composição de 0,15% de extrato de levedura, 0,15% de extrato de malte, 0,25% de peptona e 0,98% de glicose.
Exemplo 2
Todas as condições foram mantidas iguais as do Exemplo 1 mudando somente um componente do diluente que nesse caso foi o meio YM, onde se substituiu glicose por sacarose no mesmo teor. Com um tempo praticamente equivalente de crescimento, obteve-se valor de controle com o analisador ao mesmo resultado do Exemplo 1.
Exemplo 3 Todas as condições foram mantidas iguais as do Exemplo 1. No reator (A), o diluente utilizado foi o YM. Já na sequência do processo, ou seja nos reatores (B) e (C) e em todo o sistema dinâmico, o diluente utilizado foi o meio recomendado por Çadmus denominado YM-T. 0 diluente YM-T consiste em 1,2% de glucose, 0,15% de levedura, 0,15% de extrato de malte, 0,25% de peptona, 0,15% de fosfato diamônico e 0,15% de fosfato dipotássico ev 0,005% de sulfato de magnésio anidro.
Com tempo de crescimento menor do que o do- Exemplo 1, (85% do tempo do Exemplo 1) obteve-se o valor de controle do analisador (R), isto é a absorbância de 0,70.
Exemplo 4
Todas as condições foram mantidas iguais as do Exemplo 1. No reator (A) o diluente utilizado foi o YM. Já na sequência do processo, ou seja nos reatores (B) e (C) e em todo o sistema dinâmico, o diluente utilizado foi o meio SM. O diluente SM consiste em 1,2% de glicose, 0,15% de levedura, 0,15% de extrato de malte, 0,25% de peptona, 0,15% de fosfato diamônico, 0,15% de fosfato dipotássico e 0,005% de sulfato de magnésio anidro.
Com tempo de crescimento menor do que o do Exemplo 1 (80% do tempo do Exemplo 1) obteve-se o valor de controle do analisador (R), isto é a absorbância de 0,70.
Exemplo 5
Todas as condições foram mantidas iguais as do Exemplo 1. No reator (A) o diluente utilizado foi o YM. Já na sequência do processo, ou seja nos reatores (B) e (C) e em todo o sistema dinâmico, o diluente utilizado foi o meio SM modificado. 0 diluente SM modificado consiste em 1,2% de sacarose, 0,15% de levedura, 0,15% de extrato de malte, 0,25% de peptona, 0,15% de fosfato diamônico, 0,15% de fosfato dipotássico, 0,005% de sulfato de magnésio anidro e 0,05% de ácido cítrico.
Com tempo de crescimento menor do que o do Exemplo 1 (80% do tempo do Exemplo 1) obteve-se o valor de controle do analisador (R), isto é a absorbancia de 0,70.
Exemplo 6
Todas as condições foram mantidas iguais as do Exemplo 1. A única diferença é que, neste caso- se1 usou um analisador turbidimétrico em substituição ao analisador espectrofotométrico para a medida e controle do teor de células. 0 analisador turbidimétrico foi calibrado para os mesmos valores do analisador espectrofotométrico utilizado anteriormente. Esta calibração também garantiu que o sistema fosse também compatível e todo controlado por esse tipo alternativo de analisador. Entretanto, foi verificado que o analisador espectrofotométrico fornece dados com maior rapidez de resposta.
Resultados obtidos
EXEMPLO 1 (CONDIÇÃO 1 - meio de crescimento Y )
Curva de absorbancia e concentração
Tempo ( h ) A Cone. (g/kg)
10 0,020 0,05
20 0,280 0,09
25 0,275 1,20
30 0,350 1,50
35 0,400 1,75
40 0,530 2,00
45 0,600 2,25 50 0,700 2,50
55 0,240 1,10
60 0,350 1,50
65 0,400 1,75
70 0,580 2,20
75 0,700 2,50
80 0,290 1,25
85 0,350 1,50
90 0,410 1,80 ¾
95 0,608 2,28
100 0,700 2,50
105 0,270 1,35
110 0,407 1,78
115 0,582 2,18
120 0,700 2,50
Esses dados descrevem a operação em contínuo, embora destacando tempos regulares de cinco em cinco horas e que ilustram o funcionamento do sistema em consideração, com o meio de cultura YM.
Tanto neste ensaio quanto nos demais, em qualquer meio de cultura, o ponto de ajuste do analisador foi estabelecido ao valor de absorbância de 0,700.
0 valor de tempo zero foi medido após a transferência do conteúdo do reator (A) onde foi inoculado o primeiro Ependorf, ao reator (B). Assim, a absorbância no analisador (R) foi crescendo com o próprio crescimento celular, após alimentação do sistema. Em 50 horas, o valor da absorbância atingiu o ponto de controle. A partir daí, o diluente foi adicionado continuamente em pequenos volumes mantendo a absorbância ao valor definido. Neste momento de 50 horas, a dispersão de células foi transferida/dispensada ao frasco de transferência (G) e um volume isento de células e equivalente ao retirado do sistema, ou seja, 4 litros, foi introduzido do tanque de armazenamento (D) ao reator (B) e dai iniciou-se a circulação por todo o sistema.
Foi observado que ao se realizar essa operação, a concentração remanescente de células cai, devido ao efeito de diluição, a um valor próximo ao da metade e , * partir dai torna a subir e por volta de 20 a 25 horas, torna á atingir o valor 2,50 g/kg.
Entre as primeiras 10 até 50 horas as quais caracterizam a partida do sistema e correspondem à produção dos primeiros 4 litros, temos um valor de produtividade de 80 ml/hora que equivale a 4000 ml a cada 50 horas.
A partir da segunda transferência subsequente e todas as demais (de 4 litros), a produção é de 160 ml/hora ou seja, 4 litros a cada 25 horas em média.
O sistema é alimentado com novos Ependorfs em períodos regulares de 24 horas. Com isso, há uma tendência do sistema de que o tempo de crescimento vá se tornando mais curto à medida que o sistema vai funcionando. Isso desde que a limpeza do filtro seja feita adequadamente. Neste caso, a limpeza foi realizada com 130 horas de funcionamento do sistema.
EXEMPLO 2 - CONDIÇÃO 2 (meio de crescimento YM modificado
Curva de absorbancia e concentração
Tempo ( h ) A Cone. (g/kg)
10 0,020 0,06
Figure imgf000034_0001
Esses dados descrevem a operação em contínuo, embora destacando tempos regulares de cinco em cinco horas e que ilustram o funcionamento do sistema em consideração, com o meio de cultura YM modificado.
Entre as primeiras 10 até 50 horas as quais caracterizam a partida do sistema e correspondem à produção dos primeiros 4 litros, temos um valor de produtividade de 80 ml/hora que equivale a 4000 ml a cada 50 horas. A partir da segunda transferência subsequente e todas as demais (de 4 litros), a produção é de 160 ml/hora ou seja, 4 litros a cada 25 horas em média.
EXEMPLO 3 - CONDIÇÃO 3 (meio de crescimento YM-T)
Curva de absorbancia e concentração
Figure imgf000035_0001
As mesmas considerações dos exemplos 1 e 2 valem para o exemplo 3.
Entre as primeiras 10 até 45 horas as quais caracterizam a partida do sistema e correspondem à produção dos primeiros 4 litros, temos um valor de produtividade de 88,8 ml/hora que equivale a 4000 ml a cada 45 horas.
A partir da segunda transferência subsequente e todas as demais (de 4 litros), a produção é de 200 ml/hora ou seja, 4 litros a cada 20 horas em média.
EXEMPLO 4 - CONDIÇÃO 4 (meio de crescimento SM)
Curva de absorbância e concentração
Tempo ( h ) A Cone. (g/kg)
10 0,022 0,06
20 0,034 0,13
25 0,315 1,36
30 0,380 1,79
35 0,410 1,99
40 0,590 2,19
45-47 0,700 2,50
50 0,315 1,36
55 0,401 1,91
60 0,600 2,24
65 0,700 2,50
70 0,310 1,34
75 0,376 1,78
80 0,405 1,96
85 0,593 2,22
90 0,700 2,50
95 0,308 1,32
100 0,408 1,97 105 0,591 2,21
110 0,700 2,50
115 0,285 1,24
120 0,381 1,66
As mesmas considerações dos exemplos 1, 2 e 3 valem para o exemplo 4.
Entre as primeiras 10 até 45-47 horas as quais caracterizam a partida do sistema e correspondem à produção dos primeiros 4 litros, temos um valor de produtividade de
•i f
88,8-85 ml/hora que equivale a 4000 ml a cada 45 horas.
A partir da segunda transferência subsequente e todas as demais (de 4 litros), a produção é superior a 200 ml/hora ou seja, 4 litros a cada 20 horas em média.
Nestas condições obtém-se uma produtividade de no mínimo 80% em relação à produtividade do exemplo 1.
Uma formação insipiente de goma xantana é notada nessa situação já que o meio de crescimento utilizado nesse exemplo é o próprio meio de fermentação que receberá o concentrado de células no reator de fermentação. Assim, a viscosidade da dispersão é maior do que a observada nos exemplos de 1 a 3. Não há quantificação do teor de goma xantana presente quando o volume de 4 litros é dispensado para o frasco de transferência (G) . Também nenhum inconveniente é notado nessa condição experimental quanto a esse aspecto. 0 aumento de viscosidade da dispersão provoca a necessidade de limpezas mais frequentes do filtro (F) e uma pequena perda de carga do sistema no próprio filtro o que exige uma pressão maior do sistema de bombas. Mesmo assim, o conjunto todo consegue funcionar ao menos 250 horas sem uma parada maior de manutenção. EXEMPLO 5 - CONDIÇÃO 5 (meio de crescimento SM modificado)
Figure imgf000038_0001
As mesmas considerações dos exemplos 1, 2, 3 e 4 valem para o exemplo 5. Os resultados obtidos também foram muito semelhantes aos do exemplo 4. Entre as primeiras 10 até 45-47 horas as quais caracterizam a partida do sistema e correspondem à produção dos primeiros 4 litros, temos um valor de produtividade de 88,8-85 ml/hora que equivale a 4000 ml a cada 45 horas.
A partir da segunda transferência subsequente e todas as demais (de 4 litros), a produção é superior a 200 ml/hora ou seja, 4 litros a cada 20 horas em média.
Figure imgf000039_0001
situação já que o meio de crescimento utilizado nesse exemplo é o próprio meio de fermentação que receberá o concentrado de células no reator de fermentação. Assim, a viscosidade da dispersão é maior do que a observada nos exemplos de 1 a 3. Não há quantificação do teor de goma xantana presente quando o volume de 4 litros é dispensado para o frasco de transferência (G). Também nenhum inconveniente é notado nessa condição experimental quanto a esse aspecto. 0 aumento de viscosidade da dispersão provoca a necessidade de limpezas mais frequentes do filtro (F) e uma pequena perda de carga do sistema no próprio filtro o que exige uma pressão maior do sistema de bombas. Mesmo assim, o conjunto todo consegue funcionar ao menos 250 horas sem uma parada maior de manutenção.
Ficará claro aos versados na técnica que variações no meio de cultivo podem ser feitas, sem com isso fugir do conceito inventivo e escopo da invenção. Assim, pretende-se que a presente invenção cubra tais modificações e variações, contanto que elas se encontrem no escopo das reivindicações apensas e seus equivalentes.

Claims

1/5 REIVINDICAÇÕES
1. Processo industrial para produção de células reativadas de Xanthomonas campestris caracterizado por compreender três reatores (A), (B) e (C), um tanque de armazenamento de diluente (D), um analisador (R), um filtro
(F) , um medidor de nível (U), um frasco de transferência
(G) e um reator de fermentação (E), além das tubulações, bombas e válvulas .
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do reator (A) ser reator de inoculação de células e alimentação do sistema.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato dos reatores (B) e (C) serem os reatores que permitem o processo contínuo de crescimento celular .
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato do volume do reator (A) ser de 1/20 a 1/10 do volume dos reatores (B) e (C).
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 3 , caracterizado pelo fato do volume dos reatores (B) e (C) serem de 2 a 10 litros, melhor de 3 a 7 litros e ainda melhor de 4 a 6 litros.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do volume do reator de fermentação (E) ser 30 a 80 litros.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do tanque de armazenamento de diluente (D) alimentar cada um dos reatores (A), (B) e (C) de forma a manter a dinâmica do processo.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, 2 /5 caracterizado pelo fato da alimentação do reator (A) proveniente do tanque de armazenamento de diluente (D) ser controlada pela válvula ( 1 ) sendo realizada por fase quando o conteúdo do reator (A) é transferido integralmente para o reator ( B) .
9 . Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato da alimentação do reator (B) proveniente do tanque de armazenamento de diluente (D) ser controlado pela válvula ( 2 ) e por um sistema regulador de vazão de liquido de forma que um fluxo é continuamente alimentado ao reator (B).
10 . Processo, de acordo com a reivindicação 9 , caracterizado pelo fato do fluxo estabelecido variar de 0 , 5 a 2 , 0 ml/min dependendo do volume dos reatores (A) e (B) .
1 1 . Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato do tanque de armazenamento de diluente (D) alimentar também o reator (B) através de uma segunda tubulação onde a válvula ( 3 ) controla o fluxo de diluente que entra no reator (B).
12 . Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato da alimentação do reator (C) proveniente do tanque de armazenamento de diluente (D) ser controlado pela válvula ( 6 ) e por um sistema regulador de vazão de liquido acoplado ao analisador (R) que monitora de forma continua o teor de células presente no reator (C).
13 . Processo, de acordo com a reivindicação 12 , caracterizado pelo fato do analisador em linha (R) ser do tipo espectrofotométrico calibrado para operar em um comprimento de onda de 700 nm.
14 . Processo, de acordo com a reivindicação 12 , 3/5 caracterizado pelo fato do analisador em linha (R) poder ser também um analisador turbidimétrico .
15. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracter!zado pelo fato do filtro (F) ser um filtro tipo Millipore de 3 micra.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do diluente do tanque de armazenamento (D) ser qualquer composição que permita o crescimento adequado dos microorganismos utilizados no processo. ^
17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato dos diluentes utilizados no processo serem os meios de cultura YM, Y modificado, YM-T, SM ou SM modificado.
18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato dos meios de cultura SM e SM modificado conduzirem aos melhores resultados quanto à velocidade de produção da dispersão de concentração definidas de células.
19. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do reator (A) conter um volume da solução esterilizada do meio YM e receber o conteúdo de um
Ependorf.
20. Processo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato do conteúdo de um Ependorf ser de 3 ml .
21. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato das bombas e válvulas serem controladas automaticamente podendo ser controladas manualmente também. 4/5
22. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12, 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que quando o analisador (R) indica o teor de células adequado, o conteúdo do reator (C) é transferido diretamente ao frasco de transferência (G) .
23. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12, 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que quando o analisador (R) indica um teor de células superior ao valor pretendido, a válvula (6 o diluente do tanque de diluente (D)
Figure imgf000043_0001
ao reator (C) de forma que a concentração de células diminua e se ajuste ao valor estabelecido.
24. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizado pelo fato do processo ser um processo continuo de geração de células.
25. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, caracterizado por produzir uma dispersão de células de concentração perfeitamente definida.
26. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato da dispersão de células obtida possuir uma concentração ótima constante de 2,50 g de células por kg de solução.
27. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26, caracterizado por obter uma produção da dispersão de 5/5 células de pelo menos 160 ml/hora.
28. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27, caracterizado pelo fato da concentração ótima constante ser inoculada diretamente no reator de fermentação (E).
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