WO2010046517A1 - Compuestos potenciadores de la actividad de glicosidasas mutantes - Google Patents

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WO2010046517A1
WO2010046517A1 PCT/ES2009/070449 ES2009070449W WO2010046517A1 WO 2010046517 A1 WO2010046517 A1 WO 2010046517A1 ES 2009070449 W ES2009070449 W ES 2009070449W WO 2010046517 A1 WO2010046517 A1 WO 2010046517A1
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tetrahydroxy
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unsubstituted
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thianedolizidine
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PCT/ES2009/070449
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José Manuel GARCÍA FERNÁNDEZ
Carmen Ortiz Mellet
M. Isabel GARCÍA MONCAYO
Yoshiyuki Suzuki
Kousaku Ohno
Matilde Aguilar Moreno
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Universidad De Sevilla
International University Of Health And Welfare
Tottori University
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Definitions

  • the present invention relates to compounds with inhibitory activity of glycosidases enzymes and a method for the activation of mutant ⁇ -glucosidase ( ⁇ -glucocerebrosidase) and mutant ⁇ -galactosidase in patients suffering from lysosomal storage environments by administering said inhibitory compounds.
  • enzymes characterized by a very specific binding specificity and a favorable relationship between its concentration for pharmacological chaperone activity and its concentration for inhibitory activity.
  • the invention also relates to these compounds, their method of production and therapeutic compositions containing said compounds.
  • Lysosomal storage disorders are a group of diseases resulting from the abnormal metabolism of several substrates that do not degrade and accumulate in lysosomes, leading to a series of phenotypes that include megalovisceralia, neurological pathologies, skeletal injuries and premature death (AH Futerman, G. van Meer, N ature Rev. Mol. CeII Biol. 2004, 554-565). These diseases are the result of mutations in the genes that encode enzymes involved in the degradation process.
  • Current therapeutic strategies include the inhibition of substrate production using inhibitors of the enzymes involved in its biosynthesis (US2005 / 0075305). The increase of the defective enzyme could be achieved clinically by enzymatic replacement (R. J. Desnick, E. H. Schuchman, Nature Rev. Genet.
  • Gaucher disease is the most predominant lysosomal storage disorder, with an estimated incidence of approximately 1: 60,000 in the general population and 1: 100 in the population of Ashkenazi Jews (TD Butters, Curr. Opin. Chem. Biol. 2007 , 11, 412-418). It is the result of mutations in ⁇ -glucosidase acid ( ⁇ -glucocerebrosidase), a lysosomal membrane-associated glycoprotein of 497 residues that have as a consequence the accumulation of the corresponding substrate (glucosylceramide). More than 200 different point mutations have been identified in the gene encoding ⁇ -gluocerebrosidase (E. Sidransky, Mol. Genet. Metab. 2004, 83, 6-15). The mutations lead to significant defects in the folding of the protein during translation in the endoplasmic reticulum, resulting in a reduction of the transport of the enzyme to the lysosome.
  • ⁇ -galactosidosis Another pathology, the hereditary deficiency of lysosomal acid ⁇ -galactosidase ( ⁇ -galactosidosis), causes two clinically distinct diseases in humans, G MI gangliosidosis and Morquio B disease (Y. Suzuki, J ⁇ Inherit. Metab. Dis. 2006, 29, 471-476). Both are the result of mutations in the GLB1 gene that lead to an erroneous protein folding (S. Zhang, R. Bagshow, W. Hilson, Y. Oho, A. Hinek, JTR Clarke, A. Hinek, JW Callahan, Biochem. J. 2000, 348, 621-632). The mode of inheritance is autosomal recessive.
  • G M i gangliosidosis is a generalized neurosomatic disease that appears mainly in early childhood, and rarely in childhood or in young adults.
  • Disease Morquio B is a rare bone disease without involvement of the central nervous system.
  • glucoconjugates accumulate with terminal ⁇ -galactose residues in tissues and urine.
  • the ganglioside G M i and its Asian derivative G A i accumulate in the brain in the case of G MI gangliosidosis -
  • high amounts of oligosaccharides derived from keratane sulfate or glycoproteins in visceral organs and urine In both patients with G MI gangliosidosis and in patients suffering from Morquio B disease high amounts of oligosaccharides derived from keratane sulfate or glycoproteins in visceral organs and urine.
  • Morquio B disease high amounts of oligosaccharides derived from keratane sulfate or glycoprotein
  • these compounds used at subinhibitory concentrations have been shown to act as mutant ⁇ -glucocerebrosidase and mutant ⁇ -galactosidase chaperones (US 2006/0100241; WO2004 / 037373).
  • these types of compounds generally behave as broad-type glucosidase inhibitors, simultaneously inhibiting several glycosidases, which represented a serious inconvenience for clinical applications.
  • Simultaneous inhibition of ⁇ and ⁇ -glucosidases is particularly problematic. Therefore, there is a need to develop sugar-related molecules with a high ratio of chaperone to inhibitor activity that, at the same time, exhibit high anomeric selectivity for the corresponding ⁇ -glycosidases enzymes.
  • the present invention provides bicyclic compounds structurally related to sugars that incorporate at least one endocyclic nitrogen atom with a substantially sp 2 character (as of now, azaz ⁇ car sp 2 ) and behave as highly selective competitive inhibitors of the lysosomal ⁇ -glucocerebrosidase and ⁇ -galactosidase acid associated with Gaucher's disease and ⁇ -galactosidosis, respectively.
  • These compounds enhance the activity of said enzymes when they are administered at concentrations lower than those necessary to inhibit the intracellular enzymatic activity, acting as well as pharmacological chaperones. The effect is particularly significant in certain mutant enzymes, but it also appears in cells that contain the normal enzyme.
  • the present invention also provides a method for activating ⁇ -glucosidase or ⁇ -galactosidase and a method for treating patients suffering from Gaucher disease or ⁇ -galactosidosis, by using the compounds of the invention.
  • This method of the invention in addition to being useful in mammalian cells, is also useful in cells of another origin, such as, for example, insect cells and cultured CHO cells, used in the production of recombinant enzymes for enzyme replacement therapy.
  • cells of another origin such as, for example, insect cells and cultured CHO cells, used in the production of recombinant enzymes for enzyme replacement therapy.
  • a first aspect of the present invention refers to a compound of general formula (I) or any of its salts:
  • R is a substituent, the same or different in each case, and is selected from an H atom, a hydroxyl group (-OH) or an OR 2 group; wherein R 2 is selected from an acyl group, substituted or unsubstituted, a (C1-C18) alkyl group, substituted or unsubstituted, an aryl group, substituted or unsubstituted, an aralkyl group, substituted or unsubstituted, a group amino (NH 2 ), an acetamide group (NHAc), or an NHR 3 group, where R 3 is selected from an acyl group, substituted or unsubstituted, an alkyl group (CrCi 8 ), substituted or unsubstituted, an aryl group, substituted or unsubstituted, or an aralkyl group, substituted or unsubstituted.
  • R is the same in all cases and is OH
  • X is the group -NR 1 ; wherein R 1 is selected from an H atom, an alkyl group (CrCi 8 ), substituted or unsubstituted, an aryl group, substituted or unsubstituted or an aralkyl group, substituted or unsubstituted.
  • alkyl refers, in the present invention, to aliphatic, linear or branched chains, having 1 to 18 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, / -propyl, n-butyl, tere-butyl, sec-butyl, n-pentyl, n-hexyl, etc.
  • the alkyl group has between 3 and 9 carbon atoms. More preferably n-butyl, n-pentyl, n-hexyl, n-heptyl or n-octyl.
  • the alkyl groups may be optionally substituted by one or more substituents such as halogen, hydroxyl, azide, carboxylic acid or a substituted or unsubstituted group selected from amino, amido, carboxylic ester, ether, thiol, acylamino or carboxamido.
  • substituents such as halogen, hydroxyl, azide, carboxylic acid or a substituted or unsubstituted group selected from amino, amido, carboxylic ester, ether, thiol, acylamino or carboxamido.
  • the alkyl group is substituted, it is preferably one or more amine, amide or ether groups, which in turn may or may not be substituted by alkyl, amide, cycloalkyl or ethers groups and these, in turn, may also be substituted or no.
  • Cycloalkyl refers to a stable monocyclic or bicyclic radical of 3 to 10 members, which is saturated or partially saturated, and which only consists of carbon and hydrogen atoms, such as cyclohexyl or adamantyl.
  • aryl refers, in the present invention, to single or multiple aromatic rings, which have between 5 and 18 links in which a proton has been removed from the ring.
  • the aryl group has 5 to 7 carbon atoms.
  • the aryl groups are for example, but not limited to phenyl, naphthyl, diphenyl, indenyl, phenanthryl or anthracil.
  • the aryl radicals may be optionally substituted by one or more substituents.
  • aralkyl refers, in the present invention, to an aliphatic chain in which at least one of the hydrogens has been substituted by an aryl group, with the above meanings. As for example, but not limited to, a benzyl or phenethyl group.
  • acyl refers, in the present invention, to a carboxylic acid derivative by elimination of a hydroxyl group.
  • the carboxylic acid derivatives have as general formula R 4 -CO-, where R 4 is an alkyl group with the above meanings and preferably refers to (C 3 -Ci 4 ) alkyl groups, linear or branched.
  • R 4 is an alkyl group with the above meanings and preferably refers to (C 3 -Ci 4 ) alkyl groups, linear or branched.
  • propionyl butanoyl, hexanoyl, pivaloyl, octanoyl or myristoyl.
  • the sugar mimetic compounds of the invention include condensed bicycles of six members / five members that have a bridgehead nitrogen atom that is part of a cyclic amide or pseudoamide functionality.
  • Preferred heteroatoms are nitrogen (N), oxygen (O) or sulfur (S).
  • Non-limiting examples of pseudoamide groups, according to the present invention are urea, thiourea, isourea, isothiourea, guanidine or amidine.
  • the term azaaz ⁇ cares sp 2 will be used to refer to the compounds of the invention.
  • the carbon atoms of the bicyclic nucleus of the azaaz ⁇ car sp 2 may be substituted with hydroxyls to closely mimic a sugar structure or they may be devoid of hydroxyls.
  • Preferred hydroxylation profiles are those that coincide with those of D-glucose and D-galactose in positions equivalent to C-2, C-3 and C-4 in the monosaccharide after superimposition of the six-membered ring of the bicycles with the ring of pyranose of the monosaccharide, with the bridgehead nitrogen atom in the position of the sugar oxygen atom (hereinafter, glucomimetics and galactomimetics, respectively).
  • the compounds of the invention can carry a hydroxyl group in the position equivalent to the anomeric position.
  • the presence of the neighboring nitrogen atom of the pseudoamide type with substantially sp 2 character favors the axial orientation of this hydroxyl and provides high stability to the reducing sugar mimetic. Consequently, the preferred pharmacological chaperones according to this invention respond to formulas Ia and Ib.
  • R, X and Y are defined above.
  • the invention provides a process for the chemical synthesis of the bicyclic core of the aforementioned compounds from readily available commercial carbohydrates and is particularly well adapted to generate molecular diversity, allowing to synthesize compounds with substitution patterns of structural complementarity with D-glucose and D-galactose
  • a battery of substituents can be introduced in different positions along the synthetic route, which is of great importance to optimize the activity Biological and pharmacodynamic properties.
  • Another aspect of the present invention relates to the process for obtaining the compounds of general formula (I) comprising: (i) the introduction of an amino group in C-5 position of the corresponding sugar in the form of furanose; (ii) the closure of a 5-member ring between positions C-5 and C-6 by a segment of the pseudoamide type; Y
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the compounds of general formula (I) for the preparation of a pharmaceutical composition.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the compound of general formula (I) for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of a disease related to human mutated ⁇ -glucosidase and / or ⁇ -galactosidase.
  • the diseases are Gaucher's disease, G M gangliosidosis, or Morquio B disease.
  • Another aspect of the present invention relates to a method of enhancing the bioavailability of chemical chaperones using therapeutic compositions containing a pharmacologically acceptable vehicle, preferably a commercial cyclodextrin such as ⁇ -, ⁇ - or y-cyclodextrin ( ⁇ CD, ⁇ CD or yCD ), a methylated ⁇ -cyclodextrin (TRIMEB, DIMEB or RAMEB), a hydroxypropylated ⁇ -cyclodextrin (HP- ⁇ CD) or a sulfobutylated ⁇ CD (Captisol®), or a chemically modified cyclodextrin such as a biorecognizable cyclodextrin derivative that carries oligosaccharides.
  • a commercial cyclodextrin such as ⁇ -, ⁇ - or y-cyclodextrin ( ⁇ CD, ⁇ CD or yCD ), a methylated ⁇ -cyclodextrin (
  • the present invention involves the use of bicyclic compounds that mimic D-glucose (glucomimetics) of the azaz ⁇ car sp 2 type, which carry hydrophobic substituents, such as chemical chaperones to enhance the residual activity in a fibroblast culture medium for several mutations that cause Gaucher disease.
  • This therapeutic strategy could be applied to G MI gangliosidosis using compounds that mimic D-galactose (galactomimetics) of the azaz ⁇ car sp 2 type that carry hydrophobic substituents.
  • a method of this invention can be used to treat a patient who has Gaucher disease or a patient suffering from ⁇ -galactosidosis.
  • an effective activating amount of ⁇ -glucocerebrosidase or ⁇ -galactosidase of a suitable sp 2 azaz ⁇ car or of a therapeutic composition of a suitable sp 2 azaz ⁇ car is administered to the patient.
  • the present invention implies that the compound that mimics the azaz ⁇ car sp 2 sugar mentioned above has, in addition to a high ratio of chaperone activity to inhibitory activity, a very high selectivity towards the target enzyme.
  • This represents a significant improvement compared, for example, with the use of conventional type azaz ⁇ cares in which a nitrogen atom with sp 3 hybridization replaces the endocyclic oxygen of a sugar, such as for example 1-deoxinojirimycin, which behave in general as broad spectrum glycosidase inhibitors.
  • the glycemic compounds of the azaz ⁇ car sp 2 type of the invention exhibit a very high ⁇ -anomeric selectivity when compared with the inhibitory activity towards ⁇ - and ⁇ -glucosidases or ⁇ - and ⁇ -galactosidases human.
  • compositions comprise a therapeutically effective amount of azaz ⁇ car sp 2 glycemic compound and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • vehicle designates a diluent, adjuvant, excipient or carrier with which the therapeutic agent is administered.
  • Various administration systems are known and can be used to administer a compound of the invention, for example, liposomes, microparticles or microcapsules.
  • the administration system is a cycloomaltooligosaccharide (cyclodextrin, CD).
  • the inventors discovered that the use of native CDs or chemically modified CDs allows the hydrophobic moiety of the inhibitor to be masked, thereby increasing its solubility in aqueous media.
  • the resulting inclusion complexes maintain or even enhance the inhibitory and chaperone activities of the active agent.
  • another aspect of the present invention refers to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one of the compounds of general formula (I) and a pharmaceutically acceptable carrier, as defined above.
  • Another aspect of the present invention relates to an in vitro process to enhance the activity of a glycosidase enzyme, which comprises contacting the protein with an effective amount of a compound of general formula (I).
  • the azaz ⁇ car sp 2- type glycemimetic compounds of the invention include six-member / five-member condensed bicycles having a bridgehead nitrogen atom that is part of a cyclic amide or pseudoamide functionality.
  • Preferred pharmacological chaperones in the context of this invention respond to formulas Ia (glucomimetics) and Ib (galactomimetics).
  • urea type intermediates of general formula (IV) was found advantageous.
  • the ureas can be prepared, for example, by reaction of 5-amino-5- deoxy-1, 2-O-isopropylidene- ⁇ -D-gluco-furanose (III), which can be obtained by reducing the IL as described (VM D ⁇ az Pérez et al., J. Org. Chem. 2000, 65, 136-143), by coupling reaction with the appropriate isocyanate of general formula R 1 NCO.
  • the ureas IV can be transformed into the corresponding cyclic isoureas V by treatment with a sulfonic acid anhydride or a sulfonyl chloride such as trifluoromethanesulfonic anhydride, methanesulfonic anhydride or p-toluenesulfonyl chloride.
  • a sulfonic acid anhydride or a sulfonyl chloride such as trifluoromethanesulfonic anhydride, methanesulfonic anhydride or p-toluenesulfonyl chloride.
  • Acid catalyzed hydrolysis of the acetal protecting group in compounds V provides compounds Vl (scheme 1).
  • the reaction sequence represented in scheme 3 can be followed.
  • the cyclic thiourea precursor X can be obtained from the azide derivative Il following the methodology outlined above (VM D ⁇ az Pérez et al., J. Orq. Chem. 2000, 65, 136-143).
  • the reaction of X with an alkylating reagent, such as methyl iodide, provides the corresponding S-alkylisothiouronium salt Xl.
  • the nucleophilic displacement of the alkylthio group by an amine of the general formula R 1 NH 2 provides cyclic guanidines of the general formula XII.
  • the bicyclic sp 2 azaz ⁇ car glucomimetic XIII can be obtained by acid catalyzed hydrolysis of the acetal protecting group followed by treatment with a base such as, for example, sodium hydroxide.
  • a base such as, for example, sodium hydroxide.
  • the compounds of general formula XIII can be stored and used in the context of the present invention as a free base or in the form of a guanidinium salt such as, for example, the corresponding guanidinium chloride.
  • the starting monosaccharide is D-galactose or a commercially available D-galactose derivative.
  • the final compound responds to the general formula Ib.
  • inhibitors of the glucomimetic (Ia) (compounds 1-14) and galactomimetic (Ib) (compounds 15-23) families chemically synthesized and used in this invention are shown below:
  • the preparation of said inclusion complexes involves the preparation of a solution in water of both the cyclodextrin and the inhibitor, in a relative proportion that can vary from 1: 9 to 9: 1, followed by lyophilization.
  • the cyclodextrin vehicle the native ⁇ , ⁇ or yCD, the commercially available methylated, hydroxypropylated or sulfobutylated derivatives (DIMEB, TRIMEB, RAMEB, HPBCD, Captisol®) or other chemically modified CDs such as those described in patent applications WO 9733919 can be used and WO2004087768.
  • the preferred cyclodextrin carrier according to this invention is ⁇ CD.
  • Dermal fibroblasts derived from a healthy person and from Gaucher disease patients (N370S / N370S, F213I / F213I, N188S / G193W and F213I / L444P mutations) at 37 0 C in 5% CO 2 atmosphere using Dulbecco-modified Eagle medium supplemented with antibiotics (streptomycin and penicillin) and 10% fetal bovine serum.
  • antibiotics streptomycin and penicillin
  • 10% fetal bovine serum 10% fetal bovine serum.
  • Insoluble materials were removed by centrifugation at 12,000 g for 10 min at 4 0 C. Protein concentrations were determined in those used with a BCA microprotein assay kit (Pierce).
  • ⁇ -Glucocerebrosidase activities in cell phones were determined using ⁇ -D-glucopyranoside conjugated with 4-methylumbelliferone as substrate (AM Vaccaro, M. Muschilli, M. Tatti, R. Salvioli, E. Gallozzi, K. Suzuki. Clin. Biochem. 20: 429-43, 1987). Briefly, 4 ul of cell lysates were incubated at 37 0 C with 8 .mu.l of substrate solution in 0.1 M citrate buffer, pH 5.2, supplemented with sodium taurocholate (0.8% w / v). The reaction was terminated by adding 1.0 ml of 0.2 M sodium glycine-hydroxide buffer (pH 10.7). One unit of enzymatic activity was defined as nmoles of A-methylumbelliferone released per hour.
  • mutant ⁇ -glucocerebrosidase healthy control cells and patients with Gaucher disease were cultured for 4 days in the absence or presence of increasing concentrations of compounds. After exposure, they were scratched in ice cold H 2 O (10 6 / ml) and used by sonication. Insoluble materials were removed by centrifugation at 12,000 g for 10 min at 4 0 C. The ⁇ -glucocerebrosidase activities in cellular used were measured.
  • ⁇ -galactosidase assay Intracellular ⁇ -galactosidase assay. Fibroblasts were cultured in Dulbecco-modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum and antibiotics, and collected by scratching. They were combined by centrifugation, washed once with phosphate buffered saline and suspended in water. The cell suspension was sonicated and used for enzymatic assay (enzymatic solution). The ⁇ -galactosidase assay was performed in 96-well plates.
  • the enzyme test mixture consisted of 10 ⁇ l of enzymatic solution, with or without active ingredient of the invention at a final concentration of up to 5 ⁇ M, and 10 ⁇ l of substrate solution containing 1 mM 4-methylumbelliferyl- ⁇ -galactoside (Sigma , St Louis, MO) in 0.1 M (pH 4.5) and 0.1M NaCI
  • the enzymatic reaction was terminated by adding buffer 0.2 M glycine-NaOH (pH 10.7) and the 4-methylumbelliferone released by fluorometry (355 nm excitation; 460 nm emission) was measured as described above (Sakuraba, Aoyagi T, Suzuki Y. Clin. Chim. Acta 1982; 125: 275-282).
  • the protein was determined with the BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL).
  • IC 50 values selected for the inhibition of human ⁇ -glucosidase and ⁇ -galactosidase is shown in Table 1.
  • the sp 2 azaz ⁇ cares of the invention that have a hydroxylation profile of structural complementarity with D- Glucose are very potent inhibitors of human ⁇ -glucosidase.
  • Those who have a hydroxylation profile of structural complementarity with D-galactose are potent inhibitors of both ⁇ -glucosidase and ⁇ -galactosidase.
  • sp 2 azaz ⁇ cares of the invention did not significantly inhibit either ⁇ -glucosidase or ⁇ -galactosidase.
  • the inhibition of ⁇ -glucosidases was at least 1,000 times more effective, in terms of Cl 50 values, compared to the inhibition of ⁇ -glucosidases.
  • sp 2 azaz ⁇ cares of the invention as pharmacological chaperones for the treatment of diseases related to the malfunction of human ⁇ -glucosidase and / or ⁇ -galactosidase, such as Gaucher's disease or G MI gangliosidosis , avoid or minimize the side effects associated with interference in the functioning of ⁇ -glucosidase and / or ⁇ -galactosidase.
  • the ⁇ -glucosidase activity in used obtained from Gaucher fibroblasts with different mutations was increased by increasing the concentration of inhibitor in a certain range.
  • the summary of the data selected for some of the inhibitors is shown in Table 2.
  • Both the glucomimetics and the galactomimetics of the invention are active as pharmacological chaperones against mutants N370S / N370S, F213I / F213I and N188S / G193W in this test, with relative activity enhancements that go up to 3.4 times in the most favorable case.
  • the previous results support the therapeutic concept of the applicants that potent azaz ⁇ car sp 2 inhibitors can serve as effective pharmacological chaperones to enhance the mutant enzymatic activity of patients with Gaucher disease.
  • Residual activity refers to wild control cells.
  • the intracellular potentiation activity of the azaz ⁇ car sp 2 inhibitors of the invention with fibroblasts from patients with Gaucher with phenotypes N370S / N370S, F213I / F213I, N188S / G193W, N370S / 84GG, L444P / RecNcil and F213I was investigated ex vivo / L444P.
  • the data selected for some glucomimetics are collected in Table 3, which were found to be much more active than the galactomimetics in this assay.
  • the azaz ⁇ car sp 2 glucomimetics of the invention demonstrated a significant impact on the potentiation of intracellular enzymatic activity in Gaucher fibroblasts.
  • the residual enzyme activity in the mutants increased up to 3.5 times in the most favorable case.
  • the magnitude of the potentiation depended on the phenotype and the structure of the compound.
  • Compound 6 which has a cyclic isourea in the structure, was particularly effective against mutations N370S / N370S, F213I / F213I and L444P / RecNcil, with elevations of residual activity of 2.7, 3.5 and 1, 3 times , respectively, at a concentration of 30 ⁇ M.
  • the azaz ⁇ cares sp 2 inhibitors of the invention that have a hydroxylation profile of structural complementarity with D-galactose (galactomimetics; for example, compounds 15-23) enhance the ⁇ -galactosidase activity in control cell fibroblasts as well as in fibroblasts of patients with G M i gangliosidosis -
  • Table 4 collects the corresponding data of compound 17, which has a cyclic isourea functionality in its structure.
  • the intracellular ⁇ -galactosidase activity in the control was raised by 46% using a 50 ⁇ M concentration of 17.
  • the azaz ⁇ cares sp 2 inhibitors of the invention easily formed inclusion complexes with ⁇ CD in water at different relative proportions, as observed from the NMR experiments.
  • the resulting complexes allowed increasing the solubility of the inhibitor in water without observing harmful effects on the inhibitory activity against human glucosidases.
  • the enzymatic activity was elevated in Gaucher fibroblasts, both used as in intact cells, increasing the concentration of inclusion complexes azaz ⁇ cares sp 2: ⁇ CD. Selected data of some complexes are collected in Table 5. Applicants found this formulation particularly suitable for compounds that have low aqueous solubility, as is the case of compound 6. By using relative ratios 1: 1 of 6 and ⁇ CD at a concentration of 30 ⁇ M, increases of up to 3 times were achieved. of the residual activity of the mutant ⁇ -glucosidase for the N370S / N370S phenotype.

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Abstract

Compuestos potenciadores de la actividad de glicosidasas mutantes, con actividad inhibidoras de enzimas glicosidasas y también se refiere a un procedimiento para la activación de β-glucosidasa mutante (β- glucocerebrosidasa) y β-galactosidasa mutante en pacientes que padecen trastornos de almacenamiento lisosómico mediante la administración de dichos compuestos inhibidores competitivos de las enzimas, caracterizados por una especificidad de unión muy alta y una relación favorable entre su concentración para actividad de chaperona farmacológica y su concentración para actividad inhibidora.

Description

COMPUESTOS POTENCIADORES DE LA ACTIVIDAD DE GLICOSIDASAS MUTANTES
La presente invención se refiere a unos compuestos con actividad inhibidoras de enzimas glicosidasas y a un procedimiento para Ia activación de β-glucosidasa muíante (β-glucocerebrosidasa) y β-galactosidasa muíante en pacientes que padecen írasíornos de almacenamienío lisosómico medianíe Ia adminisíración de dichos compuesíos inhibidores compeíiíivos de las enzimas, caracíerizados por una especificidad de unión muy alia y una relación favorable entre su concentración para actividad de chaperona farmacológica y su concentración para actividad inhibidora. La invención también se refiere a estos compuestos, a su procedimiento de obtención y a composiciones terapéuticas que contienen dichos compuestos.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Los trastornos de almacenamiento lisosómico son un grupo de enfermedades resultantes del metabolismo anormal de varios sustratos que no se degradan y se acumulan en los lisosomas, conduciendo a una serie de fenotipos que incluyen megalovisceralia, patologías neurológicas, lesiones esqueléticas y muerte prematura (A. H. Futerman, G. van Meer, N ature Rev. Mol. CeII Biol. 2004, 554-565). Estas enfermedades son el resultado de mutaciones en los genes que codifican enzimas implicadas en el proceso de degradación. Las estrategias terapéuticas actuales incluyen Ia inhibición de Ia producción de sustrato usando inhibidores de las enzimas implicadas en su biosíntesis (US2005/0075305). El aumento de Ia enzima defectiva podría conseguirse clínicamente mediante reemplazamiento enzimático (R. J. Desnick, E. H. Schuchman, Nature Rev. Genet. 2002, 954-966). Para el trastorno de almacenamiento lisosómico más predominante, Ia enfermedad de Gaucher, esta terapia cuesta entre 100.000 y 750.000 dólares al año, y no es muy eficaz para los casos que muestran implicación del sistema nervioso central. El transplante de médula ósea puede revertir también Ia enfermedad, pero hasta ahora las estrategias de terapia génica no han tenido éxito.
Algunas de estas mutaciones perniciosas se manifiestan mediante proteínas mutantes que retienen actividad catalítica pero que presentan defectos de plegamiento y experimentan degradación mediada por Ia maquinaria celular de control de calidad. El uso de compuestos funcionales que pueden servir de molde para un plegado apropiado de proteínas con tendencia a un plegado erróneo está bien documentado. Así, se sabe que algunos inhibidores enzimáticos son capaces de unirse al sitio activo y estabilizar el plegamiento apropiado de Ia forma catalítica de Ia enzima. Dichos compuestos pueden actuar como "chaperonas farmacológicas" para estabilizar Ia proteína muíante en una conformación apropiada para su transporte a los lisosomas, donde permanece estable debido a Ia alta concentración de sustrato y al entorno de bajo pH.
La enfermedad de Gaucher es el trastorno de almacenamiento lisosómico más predominante, con una incidencia estimada de aproximadamente 1 :60.000 en Ia población general y de 1 :100 en Ia población de judíos asquenazíes (T. D. Butters, Curr. Opin. Chem. Biol. 2007, 11 , 412-418). Es el resultado de mutaciones en Ia β-glucosidasa acida (β- glucocerebrosidasa), una glucoproteína lisosómica asociada a membrana de 497 restos que tienen como consecuencia Ia acumulación del correspondiente sustrato (glucosilceramida). Se han identificado más de 200 mutaciones puntuales diferentes en el gen que codifica Ia β- gluocerebrosidasa (E. Sidransky, Mol. Genet. Metab. 2004, 83, 6-15). Las mutaciones conducen a defectos significativos en el plegamiento de Ia proteína durante Ia traducción en el retículo endoplasmático, dando como resultado una reducción del transporte de Ia enzima al lisosoma.
Otra patología, Ia deficiencia hereditaria de β-galactosidasa acida lisosómica (β-galactosidosis), causa dos enfermedades clínicamente distintas en seres humanos, Ia gangliosidosis GMI y Ia enfermedad de Morquio B (Y. Suzuki, J¿ Inherit. Metab. Dis. 2006, 29, 471-476). Ambas son el resultado de mutaciones en el gen GLB1 que conducen a un plegamiento proteico erróneo (S. Zhang, R. Bagshow, W. Hilson, Y. Oho, A. Hinek, J. T. R. Clarke, A. Hinek, J. W. Callahan, Biochem. J. 2000, 348, 621-632). El modo de herencia es recesivo autosómico. La gangliosidosis GMi es una enfermedad neurosomática generalizada que aparece principalmente en Ia primera infancia, y raramente en Ia niñez o en adultos jóvenes. La enfermedad de Morquio B es una rara enfermedad ósea sin implicación del sistema nervioso central. En pacientes con estos fenotipos clínicos se acumulan glucoconjugados con restos de β-galactosa terminales en los tejidos y orina. El gangliósido GMi y su derivado asiálico GAi se acumulan en el cerebro en el caso de Ia gangliosidosis GMI - Tanto en pacientes con gangliosidosis GMI como en pacientes que padecen Ia enfermedad de Morquio B se detectan altas cantidades de oligosacáridos derivados de sulfato de queratano o glucoproteínas en órganos viscerales y orina. Actualmente, sólo está disponible Ia terapia sintomática para pacientes con β-galactosidosis.
Por otro lado, algunos alcaloides polihidroxilados naturales y sintéticos estructuralmente relacionados con los azúcares (glicomiméticos) que incorporan un nitrógeno endocíclico de tipo amina (hibridación sp3) exhiben una actividad inhibidora significativa frente a glicosidasas. Análogamente, se ha demostrado que los carbociclos estructuralmente relacionados con los azúcares que portan sustituyentes de tipo amina se comportan como inhibidores de glicosidasas (S. Ogawa, M. Kanto, Y. Suzuki, Mini-Rev. Med. Chem. 2007, 7, 679-691 ). En algunos casos, se ha demostrado que estos compuestos usados a concentraciones subinhibidoras actúan como chaperonas de β-glucocerebrosidasa muíante y β-galactosidasa muíante (US 2006/0100241 ; WO2004/037373). Sin embargo, estos íipos de compuesíos se comportan en general como inhibidores de glucosidasa de amplio especíro, inhibiendo simulíáneameníe varias glicosidasas, Io que represenía un inconvenieníe serio para aplicaciones clínicas. La inhibición simulíánea de β y α-glucosidasas es paríicularmeníe problemáíica. Por Io íanío, exisíe Ia necesidad de desarrollar moléculas esírucíuralmeníe relacionadas con los azúcares con una alia relación de actividad chaperona a inhibidora que, al mismo tiempo, exhiban una alta selectividad anomérica por las correspondientes enzimas β-glicosidasas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona compuestos bicíclicos estructuralmente relacionados con los azúcares que incorporan al menos un átomo de nitrógeno endocíclico con un carácter sustancialmente sp2 (a partir de ahora, azazúcar sp2) y se comportan como inhibidores competitivos muy selectivos de las β-glucocerebrosidasa y β-galactosidasa acida lisosómicas asociadas a Ia enfermedad de Gaucher y Ia β-galactosidosis, respectivamente. Estos compuestos potencian Ia actividad de dichas enzimas cuando se administran a concentraciones menores de las necesarias para inhibir Ia actividad enzimática intracelular, actuando por Io tanto como chaperonas farmacológicas. El efecto es particularmente significativo en ciertas enzimas mutantes, pero aparece también en células que contienen Ia enzima normal.
En consecuencia, Ia presente invención también proporciona un procedimiento para activar β-glucosidasa o β-galactosidasa y un procedimiento para tratar pacientes que padecen enfermedad de Gaucher o β-galactosidosis, mediante Ia utilización de los compuestos de Ia invención.
Este procedimiento de Ia invención además de ser útil en células de mamífero, es también útil en células de otra procedencia, tales como, por ejemplo, células de insecto y células CHO cultivadas, usadas en Ia producción de enzimas recombinantes para terapia de reemplazamiento enzimático.
De acuerdo con Io anterior, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I) o cualquiera de sus sales:
Figure imgf000005_0001
donde: R es un sustituyente, igual o diferente en cada uno de los casos, y que se selecciona de entre un átomo de H, un grupo hidroxilo (-OH) ó un grupo OR2; donde R2 se selecciona de entre un grupo acilo, sustituido o no sustituido, un grupo alquilo (C1-C18), sustituido o no sustituido, un grupo arilo, sustituido o no sustituido, un grupo aralquilo, sustituido o no sustituido, un grupo amino (NH2), un grupo acetamido (NHAc), o un grupo NHR3, donde R3 se selecciona de entre un grupo acilo, sustituido o no sustituido, un grupo alquilo (CrCi8), sustituido o no sustituido, un grupo arilo, sustituido o no sustituido, o un grupo aralquilo, sustituido o no sustituido.
Preferiblemente R es igual en todos los casos y es OH;
Y se selecciona de entre un átomo de O, un grupo NH ó un átomo de S; y
X es el grupo -NR1; donde R1 se selecciona de entre un átomo de H, un grupo alquilo (CrCi8), sustituido o no sustituido, un grupo arilo, sustituido o no sustituido o un grupo aralquilo, sustituido o no sustituido.
El término "alquilo" se refiere, en Ia presente invención, a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 18 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, /-propilo, n-butilo, tere-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n- hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 3 y 9 átomos de carbono. Más preferiblemente n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo o n- octilo. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, azida, ácido carboxílico o un grupo sustituido o no sustituido seleccionado de entre amino, amido, áster carboxílico, éter, tiol, acilamino o carboxamido. Cuando el grupo alquilo está sustituido, Io está preferentemente por un o varios grupos amina, amida o éter, que a su vez pueden estar o no sustituidos por grupos alquilo, amida, cicloalquilo o éteres y estos a su vez, pueden estar igualmente sustituidos o no.
"Cicloalquilo" se refiere a un radical estable monocíclico o bicíclico de 3 a 10 miembros, que está saturado o parcialmente saturado, y que sólo consiste en átomos de carbono e hidrógeno, tal como ciclohexilo o adamantilo.
El término "arilo" se refiere, en Ia presente invención, a anillos aromáticos sencillos o múltiples, que tienen de entre 5 a 18 eslabones en los que se ha eliminado un protón del anillo. Preferentemente el grupo arilo tiene de 5 a 7 átomos de carbono. Los grupos arilo son por ejemplo, pero sin limitarse a fenilo, naftilo, difenilo, indenilo, fenantrilo o antracilo. Los radicales arilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes. El término "aralquilo" se refiere, en Ia presente invención, a una cadena alifática en el que al menos uno de los hidrógenos se ha sustituido por un grupo arilo, con las acepciones anteriores. Como por ejemplo, pero sin limitarse, un grupo bencilo o fenetilo.
El término "acilo" se refiere, en Ia presente invención, a un derivado de ácido carboxílico por eliminación de un grupo hidroxilo. Los derivados de ácido carboxílico tienen como fórmula general R4-CO-, donde R4 es un grupo alquilo con las acepciones anteriores y preferiblemente se refiere a grupos alquilo (C3-Ci4), lineal o ramificado. Como por ejemplo, pero sin limitarse a propionilo, butanoilo, hexanoilo, pivaloilo, octanoilo o miristoilo.
Los compuestos miméticos de azúcar de Ia invención, según se representa en Ia fórmula general (I), incluyen biciclos condensados de seis miembros/cinco miembros que tienen un átomo de nitrógeno cabeza de puente que es parte de una funcionalidad amida cíclica o pseudoamida. Por "funcionalidad pseudoamida", se define un grupo de fórmula general N- C(=X)Y, en Ia que X representa un heteroátomo que porta, dado el caso, sustituyentes de naturaleza variada, Y es un heteroátomo, que porta dado el caso sustituyentes de naturaleza variada. Son heteroátomos preferidos el nitrógeno (N), oxígeno (O) ó azufre (S). Ejemplos no limitantes de grupos pseudoamida, según Ia presente invención son urea, tiourea, isourea, isotiourea, guanidina o amidina. En adelante, se utilizará el término azaazúcares sp2 para refererirse a los compuestos de Ia invención.
Los átomos de carbono del núcleo bicíclico del azaazúcar sp2 pueden estar sustituidos con hidroxilos para imitar estrechamente una estructura de azúcar o pueden estar desprovistos de hidroxilos. Son perfiles de hidroxilación preferidos aquellos que coinciden con los de D-glucosa y D- galactosa en las posiciones equivalentes a C-2, C-3 y C-4 en el monosacárido tras superimposición del anillo de seis miembros del biciclo con el anillo de piranosa del monosacárido, con el átomo de nitrógeno cabeza de puente en Ia posición del átomo de oxígeno del azúcar (de aquí en adelante, glucomiméticos y galactomiméticos, respectivamente).
De forma interesante, los compuestos de Ia invención pueden portar un grupo hidroxilo en Ia posición equivalente a Ia posición anomérica. La presencia del átomo de nitrógeno vecino de tipo pseudoamida con carácter sustancialmente sp2 favorece Ia orientación axial de este hidroxilo y proporciona una alta estabilidad al mimético de azúcar reductor. En consecuencia, las chaperonas farmacológicas preferidas según esta invención responden a las fórmulas Ia y Ib.
Figure imgf000008_0001
Ia Ib
Donde Y y X están definidos anteriormente.
Otros compuestos adicionales a las fórmulas (Ia) y (Ib) incluyen aquellos en los que uno o más de los grupos hidroxilo están adiados, alquilados o reemplazados por un átomo de H o por otros grupos funcionales, preferiblemente por funcionalidades de nitrógeno, tal y como se recoge en Ia descripción de Ia fórmula general (I). Por tanto, otra realización preferida comprende los compuestos de fórmula general (Ia') y (Ib'):
Figure imgf000008_0002
'a' Ib1
Donde: R, X e Y están definidos anteriormente.
Cuando Y es oxígeno el compuesto de Ia invención es de fórmula general (Ic):
Figure imgf000009_0001
Cuando Y es un átomo de nitrógeno, el compuesto de Ia invención es de fórmula general (Id):
Figure imgf000009_0002
(Id)
Cuando Y es un átomo de azufre, el compuesto de Ia invención es de fórmula general (Ie):
Figure imgf000009_0003
(Ie)
Adicionalmente Ia invención proporciona un procedimiento para Ia síntesis química del núcleo bicíclico de los compuestos anteriormente mencionados a partir de carbohidratos comerciales fácilmente disponibles y está particularmente bien adaptada para generar diversidad molecular, permitiendo sintetizar compuestos con patrones de sustitución de complementariedad estructural con D-glucosa y D-galactosa. Además, puede introducirse una batería de sustituyentes en diferentes posiciones a Io largo de Ia ruta sintética, que es de gran importancia para optimizar Ia actividad biológica y las propiedades farmacodinámicas.
Así, otro aspecto de Ia presente invención se refiere al procedimiento de obtención de los compuestos de fórmula general (I) que comprende: (i) Ia introducción de un grupo amino en posición C-5 del azúcar correspondiente en forma de furanosa; (ii) el cierre de un anillo de 5 miembros entre las posiciones C-5 y C-6 mediante un segmento de tipo pseudoamida; y
(iii) Ia transposición del anillo de furanosa a un ciclo de piperidina fusionado con el anillo de pseudoamida cíclico de cinco miembros anteriormente construido.
Las características del procedimiento de preparación de Ia invención quedarán más claramente reflejadas en los ejemplos que se proporcionan más adelante.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula general (I) para Ia elaboración de una composición farmacéutica.
Otro aspecto más de Ia presente invención se refiere al uso del compuesto de fórmula general (I) para Ia elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad relacionada con β-glucosidasa y/o β- galactosidasa mutadas humanas. Preferiblemente las enfermedades son Ia enfermedad de Gaucher, Ia gangliosidosis GMi o Ia enfermedad de Morquio B.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un procedimiento de potenciación de Ia biodisponibilidad de chaperonas químicas usando composiciones terapéuticas que contienen un vehículo farmacológicamente aceptable, preferiblemente una ciclodextrina comercial tal como α-, β- o y- ciclodextrina (αCD, βCD o yCD), una β-ciclodextrina metilada (TRIMEB, DIMEB o RAMEB), una β-ciclodextrina hidroxipropilada (HP-βCD) o una βCD sulfobutilada (Captisol®), o una ciclodextrina modificada químicamente tal como un derivado de ciclodextrina que porta oligosacáridos biorreconocibles.
La presente invención implica el uso de los compuestos bicíclicos que imitan D-glucosa (glucomiméticos) de tipo azazúcar sp2, que portan sustituyentes hidrófobos, como chaperonas químicas para potenciar Ia actividad residual en un medio de cultivo de fibroblastos para varias mutaciones que causan enfermedad de Gaucher. Esta estrategia terapéutica pudo aplicarse a Ia gangliosidosis GMI usando compuestos que imitan D-galactosa (galactomiméticos) de tipo azazúcar sp2 que portan sustituyentes hidrófobos.
Por tanto, puede usarse un procedimiento de esta invención para tratar un paciente que tiene enfermedad de Gaucher o un paciente que padece β- galactosidosis. Según los procedimientos de Ia invención, se administra al paciente una cantidad activante eficaz de β-glucocerebrosidasa o β- galactosidasa de un azazúcar sp2 adecuado o de una composición terapéutica de un azazúcar sp2 adecuada.
En particular, Ia presente invención implica que el compuesto que imita el azúcar de tipo azazúcar sp2 mencionado tiene, además de una alta relación de actividad chaperona frente a actividad inhibidora, una muy alta selectividad hacia Ia enzima diana. Esto representa una mejora significativa en comparación, por ejemplo, con el uso de azazúcares de tipo convencional en los que un átomo de nitrógeno con hibridación sp3 reemplaza al oxígeno endocíclico de un azúcar, como por ejemplo Ia 1-desoxinojirimicina, que se comportan en general como inhibidores de glicosidasas de amplio espectro. Significativamente, los compuestos glicomiméticos de tipo azazúcar sp2 de Ia invención exhiben una selectividad β-anomérica muy alta cuando se comparan con Ia actividad inhibidora hacia α- y β-glucosidasas o α- y β- galactosidasas lisosómicas humanas.
La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de compuesto glicomimético de tipo azazúcar sp2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "vehículo" designa un diluyente, coadyuvante, excipiente o portador con el que se administra el agente terapéutico. Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar un compuesto de Ia invención, por ejemplo, liposomas, micropartículas o microcápsulas. En una realización específica, el sistema de administración es un ciclomaltooligosacárido (ciclodextrina, CD). Los inventores descubrieron que el uso de CD nativas o CD modificadas químicamente permite enmascarar el resto hidrófobo del inhibidor, aumentando así su solubilidad en medios acuosos. Los complejos de inclusión resultantes mantienen o incluso potencian las actividades inhibidoras y chaperona del agente activo.
Por tanto, otro aspecto de Ia presente invención ser refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los compuestos de fórmula general (I) y un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal y como se ha definido anteriormente.
Además, otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para potenciar Ia actividad de una enzima glicosidasa, que comprende poner en contacto Ia proteína con una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula general (I).
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
EJEMPLOS
Los inventores ensayaron una serie de inhibidores de tipo azazúcar sp2 novedosos sintetizados químicamente frente a un panel de glicosidasas comercialmente disponibles de origen vegetal, de microorganismos y animal. Se evaluaron algunos compuestos de Ia invención en Ia inhibición in vitro de β-glucocerebrosidasa y β-galactosidasa humanas y Ia potenciación intracelular ex vivo de enzimas mutantes con fibroblastos de Gaucher y de gangliosidosis GMi -
EJEMPL0 1 1.1. Materiales y procedimientos
Los compuestos glicomiméticos de tipo azazúcar sp2 de Ia invención, de fórmula general (I), incluyen biciclos condensados de seis miembros/cinco miembros que tienen un átomo de nitrógeno cabeza de puente que es parte de una funcionalidad amida cíclica o pseudoamida.
Figure imgf000013_0001
Las chaperonas farmacológicas preferidas en el contexto de esta invención responden a las fórmulas Ia (glucomiméticos) e Ib (galactomiméticos).
Figure imgf000013_0002
Para Ia obtención de los compuestos que tienen Ia fórmula Ia, cuando Y es oxígeno y X es NR1 (véase Ia fórmula Vl) se siguió Ia siguiente síntesis: el monosacárido de partida es D-glucosa o un derivado de D-glucosa comercialmente disponible. La introducción de un grupo nitrogenado en posición C-5 puede conseguirse entonces vía Ia correspondiente 5-azida-5- desoxi-1 ,2-O-isopropiliden-α-D-glucofuranosa (II). Para Ia preparación de este intermedio sintético puede usarse el procedimiento reseñado por K. Dax y col. (J. Carbohvdr. Chem. 1990, 9, 479-499), partiendo de D- glucufuranurono-6,3-lactona comercial. Se encontró ventajosa una estrategia sintética que implica intermedios de tipo urea de formula general (IV). Las ureas pueden prepararse, por ejemplo, mediante reacción de 5-amino-5- desoxi-1 ,2-O-isopropiliden-α-D-glucofuranosa (III), que puede obtenerse mediante Ia reducción de Il como se ha reseñado (V. M. Díaz Pérez y col., J. Org. Chem. 2000, 65, 136-143), por reacción de acoplamiento con el isocianato apropiado de formula general R1NCO. Las ureas IV pueden transformarse en las isoureas cíclicas V correspondientes mediante tratamiento con un anhídrido de ácido sulfónico o un cloruro de sulfonilo tales como anhídrido trifluorometanosulfónico, anhídrido metanosulfónico o cloruro de p-toluenosulfonilo. La hidrólisis catalizada por ácido del grupo protector acetal en los compuestos V proporciona los compuestos Vl (esquema 1 ).
Figure imgf000014_0001
Esquema 1
Para Ia preparación de compuestos que tienen Ia formula Ia en Ia que Y es un átomo de S y X representa NR1 (véase Ia fórmula IX), puede seguirse Ia secuencia de reacción representada en el Esquema 2. La reacción de Ia amina III con isotiocianatos R1NCS proporciona aducios de tiourea VII. El tratamiento de VII con un derivado reactivo sulfonante, como se describe anteriormente para Ia preparación de isoureas cíclicas V, proporciona los precusores de isotiourea cíclicos VIII correspondientes, que después de desacetilación catalizada por ácido proporcionan los glucomiméticos bicíclicos IX.
Figure imgf000015_0001
Esquema 2
Para Ia preparación de los compuestos que tienen Ia formula Ia, en Ia que Y representa NH y X representa NR1 (véase Ia fórmula XIII), puede seguirse Ia secuencia de reacción representada en el esquema 3. El precursor de tiourea cíclica X puede obtenerse a partir del derivado de azida Il siguiendo Ia metodología reseñada anteriormente (V. M. Díaz Pérez y col., J. Orq. Chem. 2000, 65, 136-143). La reacción de X con un reactivo alquilante, tal como yoduro de metilo, proporciona Ia correspondiente sal de S- alquilisotiouronio Xl. El desplazamiento nucleófilo del grupo alquiltio por una amina de formula general R1NH2 proporciona guanidinas cíclicas de fórmula general XII. El glucomimético de azazúcar sp2 bicíclico XIII puede obtenerse mediante hidrólisis catalizada por ácido del grupo protector acetal seguido de tratamiento con una base tal como, por ejemplo, hidróxido de sodio. Los compuestos de fórmula general XIII pueden almacenarse y usarse en el contexto de Ia presente invención como base libre o en forma de una sal de guanidinio tal como, por ejemplo, el cloruro de guanidinio correspondiente.
Figure imgf000015_0002
Esquema 3
En otra realización preferida adicional, el monosacárido de partida es D- galactosa o un derivado de D-galactosa comercialmente disponible. En este caso, el compuesto final responde a Ia fórmula general Ib.
Para Ia preparación de galactomiméticos Ib en los que Y representa O ó S y X representa NR1 (véanse las fórmulas XV y XVI, respectivamente), puede seguirse una estrategia sintética idéntica a Ia descrita anteriormente para Ia preparación de los glucomiméticos Vl y IX análogos, usando 5-amino-5- desoxi-1 ,2-O-isopropiliden-α-D-galactofuranosa XIV como aminoazúcar precursor (esquema 4). El compuesto XIV puede obtenerse a partir de D- galactosa comercial mediante metodologías conocidas tales como, por ejemplo, las reseñadas por P. Díaz Pérez y col. en Eur. J. Org. Chem. 2005, 2903-2913.
Figure imgf000016_0001
Esquema 4
Para Ia preparación del galactomimético Ib en el que Y representa NH y X representa NR1 (véase Ia formula XVIII), puede seguirse una estrategia sintética idéntica a Ia descrita anteriormente para Ia preparación del glucomimético XII análogo, partiendo de Ia tiourea cíclica XVII (esquema 5). El compuesto XVII puede obtenerse a partir de D-galactosa comercial vía el derivado conocido 3-O-benzoil-1 ,2-O-isopropiliden-α-D-galactofuranosa (H. Wang y J. Ning, J. Ora. Chem.. 2003, 68, 2521-2524) mediante una secuencia de reacción que implica: (i) trifenilmetilación en el grupo hidroxilo primario, (ii) introducción de un grupo azida en C-5 mediante doble inversión de Ia configuración en este centro, (iii) retirada catalizada por ácido del grupo trifenilmetilo, (iv) introducción de un segundo grupo azida en C-6, (v) retirada catalizada por base del grupo benzoílo seguido de reducción simultánea de los dos grupos azida, dando 5,6-diamino-5,6-didesoxi-1 ,2-O-isopropiliden-α- D-galactofuranosa, y (vi) tiocarbonilación de Ia diamina a Ia tiourea cíclica diana XVII. Todas las transformaciones mencionadas son estándar. Como ejemplo, pueden aplicarse los procedimientos reseñados en P. Díaz Pérez y col. en Eur. J. Orq. Chem. 2005, 2903-2913 y V. M. Díaz Pérez y col., J. Orq.
Chem. 2000, 65, 136-143.
Figure imgf000017_0001
XVII XVIII
Esquema 5
En los esquemas 1-5, el sustituyente R1 en las fórmulas tiene el significado indicado anteriormente para Ia e Ib.
Algunos ejemplos de inhibidores de las familias glucomimética (Ia) (compuestos 1-14) y galactomimética (Ib) (compuestos 15-23) sintetizados químicamente y usados en esta invención se muestran a continuación:
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
1.2. Caracterización estructural de algunos de los compuestos.
Se realizó Ia caracterización estructural de los compuestos preparados y usados en esta invención mediante espectrometría de masas, rotación óptica, espectroscopia RMN de 1H y 13C y análisis elemental. Se presentan a continuación algunos de los resultados.
(5/?,6/?,7S,8/?,8a/?)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-fenilimino-2-oxaindolizidina (1). [α]D -26,7 (c 0,75, piridina). RMN-1H (500 MHz, D2O) δ 7,44-7,27 (m, 5H, Ph), 5,73 (s a, 1 H, H-5), 4,96 (t, 1 H, J1a>1b = J8aM = 8,8 Hz, H-1a), 4,69 (t, 1 H, Jβa.ib = 8,8 Hz, H-1b), 4,28 (t d, 1 H, J8,8a = 9,4 Hz, H-8a), 3,81 (t, 1 H, J67 = J7,8 = 9,4 Hz, H-7), 3,73 (dd, 1 H, J5,6 = 3,7 Hz, H-6), 3,66 (t, 1 H, H-8); RMN- 13C (75,5 MHz, D2O) δ 157,4 (CN), 129,7-123,9 (Ph), 75,3 (C-5), 74,1 (C-6), 73,0 (C-8), 71 ,9 (C-7), 70,9 (C-1 ), 56,1 (C-8a). Anal. cale, para Ci3Hi6N2O5: C, 55,71 ; H, 5,75; N, 9,99. Encontrado: C, 55,70; H, 5,81 ; N, 9,97.
(5/?,6/?,7S,8/?,8a/?)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-butilimino-2-oxaindolizidina
(2). [α]D +5,9 (c 1 ,0, H2O). RMN-1H (300 MHz, D2O) δ 5,53 (d, 1 H, J5,6 = 3,9 Hz, H-5), 5,01 (t, 1 H, J1a>1b = J8a,ia = 8,8 Hz, H-1a), 4,67 (t, 1 H, J8a,ib = 8,8 Hz, H-1 b), 4,24 (t d, 1 H, J8,8a = 9,4 Hz, H-8a), 3,74 (t, 1 H, J6,7 = J7,8 = 9,4 Hz, H-7), 3,62 (dd, 1 H, H-6), 3,61 (t, 1 H, H-8), 3,36 (d t, 2H, 2JH,H = 7,1 Hz, 3JH,H = 2,1 Hz, CH2N), 1 ,55 (c, 2 H, CH2CH2N), 1 ,30 (m, 2H, CH2CH3), 0,87 (t, 3H, CH3); RMN-13C (75,5 MHz, D2O) δ 158,7 (CN), 74,9 (C-5), 73,9 (C-6), 73,0 (C-8), 71 ,9 (C-7), 70,9 (C-1 ), 56,2 (C-8a), 42,9 (CH2N), 30,4 (CH2CH2N), 19,2 (CH2CH3), 12,9 (CH3). Anal. cale, para Ci3H22N2Oi0: C, 42,62; H, 6,05; N, 7,65. Encontrado: C, 42,75; H, 6,13; N, 7,69.
(5/?,6S,7/?,8/?,8a/?)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-2-oxa-3-octilimino-indolizidina (3): [α]D +5,9 (c 1 ,0, H2O). RMN-1H (500 MHz, D2O) δ 5,74 (d, 1 H, J5,6 = 3,8 Hz, H-5), 5,22 (t, 1 H, J1a,1b = J8a,ia = 8,9 Hz, H-1a), 4,90 (t, 1 H, J8a,ib = 8,9 Hz, H-1 b), 4,45 (t d, 1 H, J8,8a = 9,5 Hz, H-8a), 3,95 (t, 1 H, J6,7 = J7,8 = 9,5 Hz, H-7), 3,83 (dd, 1 H, H-6), 3,80 (t, 1 H, H-8), 3,57 (d t, 2H, 2JH,H = 7,1 Hz, 3JH,H = 4,2 Hz, CH2N), 1 ,53 (m, 2H, CH2CH2N), 1 ,24 (m, 1OH, 5 CH2), 0,87 (t, 3H, CH3); RMN-13C (75,5 MHz, D2O) δ 158,7 (CN), 74,9 (C-5), 73,9 (C-6), 73,0 (C-8), 71 ,9 (C-7), 70,9 (C-1 ), 56,2 (C-8a), 43,2 (CH2N), 31 ,2, 28,4, 28,2, 25,8, (5 CH2), 28,3 (CH2CH2N), 22,1 (CH2CH3), 13,5 (CH3). Anal. cale, para Ci3H22N2Oi0: C, 42,62; H, 6,05; N, 7.65. Encontrado: C, 42,75; H, 6,13; N, 7,69.
(5/?,6/?,7S,8/?,8a/?)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-fenilimino-2-tiaindolizidina (4). [α]D -38,0 (c 0,5, H2O). RMN-1H (500 MHz, CD3OD) δ 7,22 (t, 2H, Ph), 7,00 (t, 1 H, Ph), 6,88 (d, 2H, Ph), 5,72 (d, 1 H, J5,6 = 3,7 Hz, H-5), 3,82 (td, 1 H, Ja,aa = Jβa.ib = 9,5 Hz, J8a,ia = 6,5 Hz, H-8a), 3,71 (t, 1 H, J6,7 = J7,8 = 9,5 Hz, H-7), 3,45 (dd, 1 H, H-6), 3,35 (dd, 1 H, J1a>1b = 10,9 Hz, H-1a), 3,29 (t, 1 H, H- 8), 3,00 (dd, 1 H, H-1 b). RMN-13C (125,7 MHz, CD3OD) δ 162,3 (CN), 152,6- 123,0 (Ph), 77,8 (C-5), 76,3 (C-8), 74,8 (C-7), 73,4 (C-6), 61 ,1 (C-8a), 31 ,8 (C-1 ). FABMS: m/z 319 (75, [M + Na]+). Anal. cale, para Ci3Hi6N2O4S: C, 52,69; H, 5,44; N, 9,45. Encontrado: C, 52,50; H, 5,13; N, 9,29.
(5R,6R,7S,8R,8aR)-3-Butilimino-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-tiaindolizidina (5). [α]D -22,9 (c 0,7, H2O). RMN-1H (500 MHz, D2O) δ 5,52 (d, 1 H, J5,6 = 3,7 Hz, H-5), 3,75 (d t, 1 H, J8,8a = J8a,ib = 9,5 Hz, J8a,ia = 6,4 Hz, H-8a), 3,71 (t, 1 H, Jβj = Jτ,8 = 9,5 Hz, H-7), 3,55 (dd, 1 H, H-6), 3,45 (dd, 1 H, J1a,1b = 10,5 Hz, H- 1a), 3,40 (t, 1 H, H-8), 3,18 (m, 2H, CH2N), 3,07 (dd, 1 H, H-1 b), 1 ,52 (m, 2H, CH2CH2N), 1 ,30 (m, 2H, CH2CH3), 0,87 (t, 3H, 3JH,H = 7,4 Hz, CH3). RMN-13C (125,7 MHz, D2O) δ 162,9 (CN), 76,0 (C-5), 74,3 (C-8), 72,8 (C-7), 71 ,4 (C- 6), 59,8 (C-8a), 53,9 (CH2N), 32,0 (C-1 ), 30,4 (CH2CH2N), 19,8 (CH2CH3), 13,2 (CH3). FABMS: m/z 299 (40, [M + Na]+), 277 (100, [M + H]+). Anal. cale, para CnH20N2O4S: C, 47,81 ; H, 7,29; N, 10,14. Encontrado: C, 47,65; H, 7,14; N, 9,99.
(5R,6R,7S,8R,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-octilimino-2-tiaindolizidina (6).
[α]D -24,5 (c 0,5, MeOH). RMN-1H (300 MHz, D2O) δ 5,50 (d, 1 H, J5,6 = 3,7 Hz, H-5), 4,20 (m, 1 H, H-8a), 3,66 (m, 2H, H-7, H-1a), 3,52 (dd, 1 H, J67 = 10,0, H-6), 3,45 (t, 1 H, J7,8 = J8,8a = 9,5 Hz, H-8), 3,32 (m, 3H, H-1 b, CH2N), 1 ,56 (m, 2H, CH2CH2N), 1 ,18 (m, 1OH, CH2), 0,74 (t, 3H, 3JH,H = 6,9 Hz, CH3). RMN-13C (75,5 MHz, D2O) δ 162,5 (CN), 76,6 (C-5), 73,5 (C-8), 72,0 (C-7), 70,9 (C-6), 63,6 (C-8a), 49,4 (CH2N), 31 ,5 (C-1 ), 31 ,3, 28,6, 28,5, 28,3, 26,0 (CH2), 22,3 (CH2CH3), 13,7 (CH3). FABMS: m/z 355 (30, [M + Na]+), 333 (100, [M + H]+). Anal. cale, para Ci5H28N2O4S: C, 54,19; H, 8,49; N, 8,43. Encontrado: C, 53,94; H, 8,42; N, 8,29.
(5/?,6/?,7S,8/?,8a/?)-3-[2'-(Λ/,Λ/-Bis-(2-hexanamidoetil)aminoetil)-imino]- 5,6,7,8-tetrahidroxi-2-tiaindolizidina (7). [α]D -5,0 (c 1 ,0, H2O). FR 0,41 (CH2CI2-MeOH-H2O 40:10:1 ). RMN-1H (500 MHz, D2O) δ 5,62 (d, 1 H, J5,6 = 3,8 Hz, H-5), 3,85 (m, 1 H, H-8a), 3,74 (t, 1 H, J6,7 = J7,β = 9,5 Hz, H-7), 3,57 (dd, 1 H, H-6), 3,56 (dd, 1 H, J1a,1 b = 10,5 Hz, J8a,1a = 6,5 Hz, H-1a), 3,45 (m, 6H, CH2NCS, CH2NHCO), 3,44 (t, 1 H, J88a = 9,5 Hz, H-8), 3,25 (m, 2H, CH2NCS), 3,18 (m, 4H, CH2CH2NHCO), 3,17 (t, 1 H, J8a 1 b = 10,5 Hz, H-1 b), 2,16 (t, 4H, 3JH,H = 7,5 Hz, CH2CONH), 1 ,47 (m, 4H, CH2CH2CONH), 1 ,18 (m, 8H, CH2), 0,76 (t, 6H, 3JH,H = 7,0 Hz, CH3). RMN-13C (125,7 MHz, D2O) δ 178,3 (CO), 162,9 (CN), 75,9 (C-5), 74,3 (C-8), 72,6 (C-7), 71 ,3 (C-6), 60,5 (C-8a), 54,4 (CH2CH2NCS), 54,0 (CH2CH2NHCO), 48,0 (CH2NCS), 35,7 (CH2NHCO), 35,6 (CH2CONH), 31 ,1 (C-1 ), 30,6 (CH2), 25,0 (CH2CH2CONH), 21 ,7 (CH2CH3), 13,2 (CH3). FABMS: m/z 568 (30, [M + Na]+), 546 (40, [M + H]+). Anal. cale, para C25H47N5O6S: C, 55,02; H, 8,68; N, 12,83. Encontrado: C, 55,09; H, 8,66; N, 12,86.
Clorhidrato de (5R,6R,7S,8R,8aR)-3-(8-aminooctil)imino-5,6,7,8- tetrahidroxi-2-tiaindolizidina (8). [α]D -7,0 (c 1 ,0, H2O). RMN-1H (500 MHz,
D2O, 313 K) δ 5,76 (d, 1 H, J56 = 4,0 Hz, H-5), 4,46 (m, 1 H, H-8a), 3,92 (m, 2H, H-7, H-1a), 3,78 (dd, 1 H, J6,7 = 9,5 Hz, H-6), 3,71 (t, 1 H, J7,8 = J8,8a = 9,5 Hz, H-8), 3,61 (t, 1 H, J1a,1b = J8a,1 b = 10,0 Hz, H-1b), 3,57 (t, 2H, 3JH,H = 7,0 Hz, CH2N), 3,12 (t, 2H, 3JH,H = 7,5 Hz, CH2NH2), 1 ,79 (m, 4H, CH2), 1 ,48 (m, 8H, CH2). RMN-13C (125,7 MHz, D2O, 313 K) δ 173,0 (CN), 76,6 (C-5), 73,3 (C-8), 71 ,9 (C-7), 70,8 (C-6), 63,6 (C-8a), 49,2 (CH2N), 39,8 (CH2NH2), 31 ,4 (C-1 ), 28,2, 28,1 , 28,0, 26,9, 27,8, 25,7 (CH2). FABMS: m/z 348 (30, [M + H]+). HRFABMS: m/z 348,194640; cale, para Ci5H30N3O4S: 348,195704. Anal. cale, para Ci5H30CIN3O4S: C, 46,92; H, 7,88; N, 10,94; S, 8,35. Encontrado: C, 46,57; H, 7,69; N, 10,61 ; S, 8,04.
(5R,6R,7S,8R,8aR)-3-(4-Adamantano-1-ilcarboxamidobutil)imino-5,6,7,8- tetrahidroxi-2-tiaindolizidina (9). [α]D -7,1 (c 1 ,0, H2O). FR 0,28 (CH2CI2- H2O-MeOH 40:10:1 ). RMN-1H (500 MHz, D2O, 313 K) δ 5,73 (d, 1 H, J56 = 3,7 Hz, H-5), 4,38 (m, 1 H, H-8a), 3,91 (t, 1 H, J6,7 = J7,β = 9,5 Hz, H-7), 3,87 (dd, 1 H, Jia,ib = 11 ,3 Hz, J8a,ia = 7,5 Hz, H-1a), 3,74 (dd, 1 H, J6,7 = 9,5 Hz, H- 6), 3,67 (t, 1 H, J8,8a = 9,5 Hz, H-8), 3,53 (m, 3H, H-1 b, CH2N), 3,33 (t, 2H, 3JH,H = 6,7 Hz, CH2NHCO), 2,14 (s a, 3H, CH), 1 ,92 (m, 6H, CCH2), 1 ,83 (m, 6H, CHCH2), 1 ,67 (m, 2H, CH2). RMN-13C (125,7 MHz, D2O, 313 K) δ 182,0 (CO), 173,0 (CN), 76,6 (C-5), 73,5 (C-8), 72,0 (C-7), 70,9 (C-6), 63,1 (C-8a), 49,3 (CH2N), 40,8 (CCONH), 38,8 (CH), 38,6 (CH2NHCO), 36,1 (CCH2), 31 ,4 (C-1 ), 28,0 (CHCH2), 25,9, 25,6 (CH2). FABMS: m/z 476 (20, [M + Na]+), 454 (10, [M + H]+). Anal. cale, para C22H35CIN3O5S: C, 58,25; H, 7,78; N, 9,26; S, 7,07.
(5R,6R,7S,8R,8aR)-3-(11 -Azida-3,6,9-trioxaundecil)imino-5,6,7,8- tetrahidroxi-2-tiaindolizidina (10). [α]D -13,0 (c 1 ,0, H2O). RMN-1H (500 MHz, D2O) δ 5,55 (d, 1 H, J5 6 = 3,7 Hz, H-5), 3,73 (m, 14H, H-7, H-8a, OCH2), 3,54 (dd, 1 H, J6 7 = 9,8 Hz, H-6), 3,45 (m, 2H, CH2N), 3,45 (dd, 1 H, Jia.ib = 10,7 Hz, J8a,ia = 6,3 Hz, H-1a), 3,39 (t, 1 H, J8,8a = 9,7 Hz, H-8), 3,35 (m, 2H, CH2N3), 3,05 (t, 1 H, J8a,ib = 10,7 Hz, H-1b). RMN-13C (125,7 MHz, D2O) δ 166,1 (CN), 78,3 (C-5), 77,0 (C-8), 75,3 (C-7), 73,9 (C-6), 73,4, 73,1 , 72,1 , 72,0, 71 ,8 (OCH2), 62,1 (C-8a), 56,0 (CH2N3), 52,7 (CH2N), 45,7 (CH2CH2N3), 33,1 (C-1 ). FABMS: m/z 444 (15, [M + Na]+). HRFABMS: m/z 444,154344; cale, para Ci5H27N5O7NaS: 444,152890. Anal. cale, para Ci5H27N5O7S: C, 42,75; H, 6,46; N, 16,62; S, 7,61. Encontrado: C, 42,51 ; H, 6,55; N, 16,46; S, 7,39. (5R,6R,7S,8R,8aR)-3-(A 1 -Adamantano-1 -ilcarboxamido-3,6,9- trioxaundecil)imino-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-tiaindolizidina (11). [α]D -6,2 (c 1 ,0, H2O). FR 0,51 (CH2CI2-H2O-MeOH 40:10:1 ). RMN-1H (500 MHz, D2O, 313 K) δ 5,76 (d, 1 H, J5,6 = 3,7 Hz, H-5), 4,21 (m, 1 H, H-8a), 3,90 (t, 1 H, J67 = J7,8 = 9,5 Hz, H-7), 3,84 (m, 12H, OCH2), 3,79 (dd, 1 H, J1a,1b = 11 ,2 Hz, J8a,1a = 7,1 Hz, H-1a), 3,73 (dd, 1 H, H-6), 3,67 (m, 2H, CH2N), 3,63 (t, 1 H, J8,8a = 9,5 Hz, H-8), 3,52 (t, 2H, 3JH,H = 5,5 Hz, CH2NHCO), 3,42 (t, 1 H, J8a,1 b = 11 ,2 Hz, H-1 b), 2,15 (s a, 3H, CH), 1 ,94 (m, 6H, CCH2) 1 ,85 (m, 6H, CH2). RMN-13C (125,7 MHz, D2O, 313 K) δ 182,0 (CO), 163,0 (CN), 76,4 (C-5), 74,0 (C-8), 72,5 (C-7), 71 ,2 (C-6), 69,9, 69,8, 69,7, 69,3, 69,2 (OCH2), 61 ,9 (C-8a), 51 ,1 (CH2N), 40,8 (CCONH), 39,1 (CH2NHCO), 38,7 (CH), 36,1 (CCH2), 31 ,2 (C-1 ), 27,9 (CH2). FABMS: m/z 580 (100, [M + Na]+), 558 (5, [M + H]+). Anal. cale, para C26H43N3O8S: C, 55,99; H, 7,77; N, 7,53; S, 5,75. Encontrado: C, 55,68; H, 7,58; N, 7,32; S, 5,39.
Clorhidrato de (5R,6R,7S,8R,8aR)-2-aza-3-bencilimino-5,6,7,8- tetrahidroxindolizidina (12). [α]D +4,0 (c 1 ,0, H2O). RMN-1H (400 MHz, D2O) δ 7,34 (m, 5H, Ph), 5,40 (d, 1 H, J5,6 = 3,8 Hz, H-5), 4,40 (s, 2H, CH2Ph), 3,93 (m, 1 H, H-8a), 3,76 (t, 1 H, J1a,1b = J8a,1a = 9,5 Hz, H-1a), 3,66 (t, 1 H, J6j = J7,8 = 9,5 Hz, H-7), 3,57 (dd, 1 H, H-6), 3,46 (t, 1 H, J8,8a = 9,5 Hz, H- 8), 3,42 (dd, 1 H, J8a,1 b = 9,5 Hz, H-1 b). RMN-13C (75,5 MHz, D2O) δ 156,5 (CN), 136,3-127,0 (Ph), 74,4 (C-5), 73,3 (C-8), 72,4 (C-7), 71 ,4 (C-6), 56,2 (C-8a), 46,1 (C-1 , CH2Ph). FABMS: m/z 294 (60, [M - Cl]+). Anal. cale, para Ci4H22CIN3O5: C, 48,35; H, 6,38; N, 12,08. Encontrado: C, 48,19; H, 6,20; N, 11 ,92.
Clorhidrato de (5R,6R,7S,8R,8aR)-2-aza-3-butilimino-5,6,7,8- tetrahidroxindolizidina (13). [α]D +7,7 (c 0,8, H2O). FR 0,53 (CH3CN-H2O- AcOH6:3:1 ). RMN-1H (300 MHz, D2O) δ 5,42 (d, 1 H, J5,6 = 3,7 Hz, H-5), 3,95 (m, 1 H, H-8a), 3,86 (t, 1 H, J1a,1b = J8a,1a = 9,5 Hz, H-1a), 3,72 (t, 1 H, J6,7 = J7,8 = 9,5 Hz, H-7), 3,60 (dd, 1 H, H-6), 3,52 (t, 1 H, J88a = 9,5 Hz, H-8), 3,50 (t, 1 H, J8a,1 b = 9,5 Hz, H-1 b), 3,23 (t, 2H, 3JH,H = 7,1 Hz, CH2N), 1 ,57 (m, 2H, CH2CH2N), 1 ,35 (m, 2H, CH2CH3), 0,92 (t, 3H, 3JH,H = 7,3 Hz, CH3). RMN-13C (75,5 MHz, D2O) δ 156,6 (CN), 74,6 (C-5), 73,5 (C-8), 72,6 (C-7), 71 ,7 (C-6), 56,3 (C-8a), 46,3 (C-1 ), 42,8 (CH2N), 30,3 (CH2CH2N), 19,3 (CH2CH3), 12,9 (CH3). FABMS: m/z 260 (100, [M - Cl]+). Anal. cale, para CnH24CIN3O5: C, 42,11 ; H, 7,71 ; N, 13,39. Encontrado: C, 42,21 ; H, 7,81 ; N, 13,31. Clorhidrato de (5R,6R,7S,8R,8aR)-2-aza-5,6,7,8-tetrahidroxi-3- octiliminoindolizidina (14). [α]D +6,6 (c 0,97, H2O). RMN-1H (300 MHz, D2O) δ 5,31 (d, 1 H, J5,6 = 3,8 Hz, H-5), 3,85 (m, 1 H, H-8a), 3,75 (t, 1 H, J1a,1b = J8a,ia = 9,7 Hz, H-1a), 3,64 (t, 1 H, J6,7 = J7,8 = 9,7 Hz, H-7), 3,49 (dd, 1 H, H- 6), 3,42 (t, 1 H, J8,8a = 9,7 Hz, H-8), 3,39 (t, 1 H, J8a,1b = 9,7 Hz, H-1 b), 3,21 (t, 2H, 3JH,H = 7,1 Hz, CH2N), 1 ,50 (m, 2H, CH2CH2N), 1 ,23 (m, 1OH, CH2), 0,79 (t, 3H, 3JH,H = 6,9 Hz, CH3). RMN-13C (75,5 MHz, D2O) δ 156,6 (CN), 74,7 (C- 5), 73,5 (C-8), 72,6 (C-7), 71 ,8 (C-6), 56,3 (C-8a), 46,3 (C-1 ), 43,0 (CH2N), 31 ,0, 28,3, 28,2, 25,8 (CH2), 22,0 (CH2CH3), 13,4 (CH3). FABMS: m/z 316 (100, [M - Cl]+). Anal. cale, para Ci5H32CIN3O5: C, 48,71 ; H, 8,72; N, 11 ,36. Encontrado: C, 48,58; H, 8,61 ; N, 11 ,23.
(5/?,6/?,7S,8S,8a/?)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-fenilimino-2-oxaindolizidina (15). [α]D -5,2 (c 0,58, H2O ). RMN-1H (500 MHz, D2O) δ 7,23-6,91 (m, 5H, Ph), 5,44 (d, 1 H, J5i6 = 4,0 Hz, H-5), 4,36 (t, 1 H, J8a,1a = J1a,1b = 8,3 Hz, H-1a), 4,20 (t, 1 H, J8a 1 b = 7,8 Hz, H-1 b), 4,11 (m, 1 H, H-8a), 3,93 (m, 1 H, H-8), 3,82 (dd, 1 H, J6,7 = 10,2 Hz, J7,8 = 2,6 Hz, H-7), 3,77 (dd, 1 H, H-6). RMN-13C (125,7 MHz, D2O) δ 153,5 (CN), 146,1-123,4 (Ph), 78,3 (C-5), 69,5 (C-7), 68,2 (C-8), 67,7 (C-6), 66,4 (C-1 ), 53,6 (C-8a). FABMS: m/z 303 (60, [M + Na]+), 281 (30, [M + H]+). Anal. cale, para Ci3H16N2O5: C, 55,71 ; H, 5,75; N, 9,99. Encontrado: C, 55,74; H, 5,64; N, 9,87.
(5R,6R,7S,8S,8aR)-3-Butilimino-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-oxaindolizidina (16). [α]D -4,1 (c 1 ,0, H2O). RMN-1H (500 MHz, D2O) δ 5,52 (d, 1 H, J5 6 = 4,0 Hz, H-5), 4,82 (t, 1 H, J8a,1a = J1a,1b = 9,0 Hz, H-1a), 4,69 (dd, 1 H, J8a,1b = 7,0 Hz, H-1 b), 4,49 (ddd, 1 H, J88a = 2,5 Hz, H-8a), 4,02 (t, 1 H, J78 = 2,5 Hz, H- 8), 3,87 (dd, 1 H, J67 = 10,5, H-7), 3,77 (dd, 1 H, H-6), 3,30 (t, 2H, 3JH,H = 7,0 Hz, CH2N), 1 ,48 (m, 2H, CH2CH2N), 1 ,25 (m, 2H, CH2CH3), 0,81 (t, 3H, 3JH,H = 7,0 Hz, CH3). RMN-13C (125,7 MHz, D2O) δ 158,5 (CN), 74,9 (C-5), 70,6 (C-1 ), 68,8 (C-7), 68,0 (C-8), 67,3 (C-6), 56,2 (C-8a), 42,3 (CH2N), 30,3 (CH2CH2N), 19,1 (CH2CH3), 12,8 (CH3). FABMS: m/z 283 (20, [M + Na]+), 261 (100, [M + H]+). Anal. cale, para CnH20N2O5: C, 50,78; H, 7,75; N, 10,77. Encontrado: C, 50,66; H, 8,04; N, 10,71.
(5/?,6/?,7S,8S,8a/?)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-octilimino-2-oxaindolizidina (17). [α]D .9,8 (c 0,5, H2O ). RMN-1H (500 MHz, D2O) δ 5,52 (d, 1 H, J5,6 = 4,0 Hz, H-5), 4,83 (t, 1 H, J8a,1a = J1a,1b = 8,5 Hz, H-1a), 4,71 (dd, 1 H, J8a,1b = 8,5 Hz, H-1 b), 4,50 (t, 1 H, H-8a), 4,02 (m, 1 H, H-8), 3,87 (dd, 1 H, J67 = 10,0 Hz, J7,8 = 2,5 Hz, H-7), 3,78 (dd, 1 H, H-6), 3,30 (t, 2H, 3JH,H = 6,5 Hz, CH2N), 1 ,52 (m, 2H, CH2CH2N), 1 ,21 (m, 1OH, CH2), 0,78 (t, 3H, 3JH,H = 6,5 Hz, CH3). RMN-13C (125,7 MHz, D2O) δ 158,5 (CN), 74,9 (C-5), 70,6 (C-1 ), 68,8 (C-7), 68,1 (C-8), 67,4 (C-6), 56,2 (C-8a), 43,0 (CH2N), 31 ,1 , 28,5, 28,3, 28,2, 25,7 (CH2), 22,0 (CH2CH3), 13,4 (CH3). FABMS: m/z 317 (100, [M + H]+). Anal. cale, para Ci5H28N2O5: C, 56,94; H, 8,92; N, 8,85. Encontrado: C, 56,78; H, 8,56; N, 8,76.
(5/?,6/?,7S,8S,8a/?)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-fenilimino-2-tiaindolizidina (18). [α]D -25,5 (c 0,5, H2O). RMN-1H (500 MHz, D2O) δ 7,38-7,01 (m, 5H, Ph), 5,74 (s a, 1 H, H-5), 4,23 (t a, 1 H, J8a,1a = J8a,1 b = 9,0 Hz, 6,5 Hz, H-8a), 4,04 (s a, 1 H, H-8), 3,95 (d a, 1 H, J6,7 = 9,3 Hz, H-7), 3,88 (d a, 1 H, H-6), 3,30 (t a, 1 H, J1a,1b = 9,0 Hz, H-1a), 3,20 (t a, 1 H, H-1b). RMN-13C (125,7 MHz, D2O) δ 173,9 (CN), 149,0-122,5 (Ph), 75,8 (C-5), 69,7 (C-7), 68,8 (C- 8), 67,9 (C-6), 59,2 (C-8a), 26,7 (C-1 ). FABMS: m/z 322 (100, [M + Na + 3H]+), 297 (10, [M + H]+). Anal. cale, para Ci3H16N2O4S: C, 52,69; H, 5,44; N, 9,45. Encontrado: C, 52,69; H, 5,38; N, 9,38.
(5/?,6/?,7S,8S,8a/?)-3-Butilimino-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-tiaindolizidina (19).
[α]D -5,5 (c 0,6, H2O). [α]546 -7,3 (c 0,6, H2O). RMN-1H (500 MHz, D2O) δ 5,61 (d, 1 H, J5,6 = 3,2 Hz, H-5), 4,51 (t, 1 H, J8^ = 9,0 Hz, H-8a), 4,05 (s a, 1 H, H- 8), 3,93 (dd, 1 H, J6,7 = 10,2 Hz, J78 = 1 ,8 Hz, H-7), 3,83 (dd, 1 H, H-6), 3,49 (d, 2H, H-1a, H-1 b), 3,34 (t, 2H, 3JH,H = 6,8 Hz, CH2N), 1 ,61 (m, 2H, CH2CH2N), 1 ,33 (m, 2H, CH2CH3), 0,89 (t, 3H, 3JH,H = 7,3 Hz, CH3). RMN-13C (125,7 MHz, D2O) δ 170,4 (CN), 76,0 (C-5), 69,1 (C-7), 68,9 (C-8), 67,4 (C- 6), 61 ,8 (C-8a), 50,0 (CH2N), 30,6 (CH2CH2N), 27,4 (C-1 ), 19,3 (CH2CH3), 12,9 (CH3). FABMS: m/z 299 (55, [M + Na]+), 277 (100, [M + H]+). Anal. cale, para CnH20N2O4S: C, 47,81 ; H, 7,29; N, 10,14. Encontrado: C, 47,69; H, 7,17; N, 9,94 .
(5/?,6/?,7S,8S,8a/?)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-octilimino-2-tiaindolizidina (20). [α]D -14,3 (c 0,6, MeOH). RMN-1H (300 MHz, DMSO) δ 5,44 (d, 1 H, J5 6 = 3,4 Hz, H-5), 4,67 (t a, J8a,1a = J8a,1 b = 8,5 Hz, 1 H, H-8a), 4,03 (t a, 1 H, J1a,1 b = 8,5 Hz, H-1a), 3,69 (s a, 1 H, H-8), 3,64 (d a, 1 H, J67 = 9,6, H-7), 3,52 (dd, 1 H, H-6), 3,25 (m, 1 H, H-1 b), 3,09 (m, 2H, CH2N), 1 ,49 (m, 2H, CH2CH2N), 1 ,24 (m, 1OH, CH2), 0,84 (t, 3H, 3JH,H = 6,9 Hz, CH3). RMN-13C (75,5 MHz, DMSO) δ 170,9 (CN), 76,7 (C-5), 70,0 (C-7), 69,4 (C-8), 68,3 (C-6), 60,2 (C- 8a), 52,6 (CH2N), 31 ,7, 30,5, 29,2, 29,1 (CH2), 27,4 (C-1 ), 22,5 (CH2CH3), 14,4 (CH3). FABMS: m/z 355 (65, [M + Na]+), 333 (100, [M + H]+). Anal. cale, para Ci5H28N2O4S: C, 54,19; H, 8,49; N, 8,43. Encontrado: C, 53,83; H, 8,39; N, 8,30.
Clorhidrato de (5R,6R,7S,8S,8aR)-2-aza-3-bencilimino-5,6,7,8- tetrahidroxindolizidina (21). [α]D +7,0 (c 0,8, H2O). FR 0,32 (CH3CN-H2O- AcOH 20:2:1 ). RMN-1H (300 MHz, D2O) δ 7,39-7,27 (m, 5H, Ph), 5,45 (d, 1 H, J5,6 = 3,8 Hz, H-5), 4,41 (s, 2H, CH2Ph), 4,28 (td, 1 H, J8a,1a = J8a,1b = 9,8 Hz, J8,8a = 1 ,4 Hz, H-8a), 3,99 (dd, 1 H, J7,8 = 2,7 Hz, H-8), 3,84 (dd, 1 H, J6,7 = 10,2 Hz, H-7), 3,77 (dd, 1 H, H-6), 3,68 (t, 1 H, J1a 1b = 9,8 Hz, H-1a), 3,55 (t, 1 H, H-1 b). RMN-13C (75,5 MHz, D2O) δ 156,7 (CN), 136,1-127,6 (Ph), 74,8 (C-5), 69,7 (C-7), 68,7 (C-8), 68,4 (C-6), 56,4 (C-8a), 46,4 (CH2Ph), 42,5 (C- 1 ). FABMS: m/z 294 (100, [M - Cl]+). HRFABMS: m/z 294,144663; cale, para Ci4H20N3O4: 294,145381.
Clorhidrato de (5R,6R,7S,8S,8aR)-2-aza-3-butilimino-5,6,7,8- tetrahidroxindolizidina (22). [α]D +8,0 (c 1 ,0, H2O). RMN-1H (500 MHz, D2O) δ 5,40 (d, 1 H, J5,6 = 4,0 Hz, H-5), 4,25 (t, 1 H, J8a,ia = J8a,ib = 9,7 Hz, H- 8a), 3,98 (m, 1 H, H-8), 3,82 (dd, 1 H, J6,7 = 9,8 Hz, J78 = 2,5 Hz, H-7), 3,74 (dd, 1 H, H-6), 3,69 (t, 1 H, J1a>1 b = 9,7 Hz, H-1a), 3,56 (t, 1 H, H-1 b), 3,15 (t, 2H, 3JH,H = 7,0 Hz, CH2N), 1 ,48 (m, 2H, CH2CH2N), 1 ,26 (m, 2H, CH2CH3), 0,81 (t, 3H, 3JH,H = 7,3 Hz, CH3). RMN-13C (125,7 MHz, D2O) δ 155,9 (CN), 74,0 (C-5), 69,2 (C-7), 68,1 (C-8), 67,8 (C-6), 55,7 (C-8a), 42,7 (CH2N), 41 ,7 (C-1 ), 30,1 (CH2CH2N), 19,2 (CH2CH3), 12,9 (CH3). FABMS: m/z 260 (100, [M - Cl]+). HRFABMS: m/z 260.160864; cale, for CnH22N3O4: 260.161031. Anal. cale, para CnH22CIN3O4: C, 44,67; H, 7,50; N, 14,21. Encontrado: C, 44,29; H, 7,35; N, 13,93.
Clorhidrato de (5R,6R,7S,8S,8aR)-2-aza-5,6,7,8-tetrahidroxi-3- octiliminoindolizidina (23). [α]D -1 ,9 (c 1 ,0, H2O), [α]578 -3,9 (c 1 ,0, H2O).
RMN-1H (500 MHz, D2O) δ 5,42 (d, 1 H, J5,6 = 4,0 Hz, H-5), 4,28 (t, 1 H, J8a,ia = J8a,1b = 9,8 Hz, H-8a), 4,01 (s a, 1 H, H-8), 3,85 (dd, 1 H, J6,7 = 10,3 Hz, J7,8 = 2,8 Hz, H-7), 3,77 (dd, 1 H, H-6), 3,72 (t, 1 H, J1a,1b = 9,8 Hz, H-1a), 3,59 (t, 1 H, H-1 b), 3,18 (t, 2H, 3JH,H = 7,0 Hz, CH2N), 1 ,53 (m, 2H, CH2CH2N), 1 ,23 (m, 10H, CH2), 0,80 (t, 3H, 3JH,H = 7,0 Hz, CH3). RMN-13C (125,7 MHz, D2O) δ 155,9 (CN), 74,1 (C-5), 69,2 (C-7), 68,1 (C-8), 67,8 (C-6), 55,7 (C-8a), 42,9 (CH2N), 41 ,7 (C-1 ), 31 ,0, 28,3, 28,2, 28,0, 25,7 (CH2), 22,0 (CH2CH3), 13,4 (CH3). FABMS: m/z 316 (100, [M + H - Cl]+). Anal. cale, para Ci5H30CIN3O4 H2O: C, 48,71 ; H, 8,72; N, 11 ,36. Encontrado: C, 48,84; H, 8,72; N, 11 ,25.
EJEMPLO 2
2.1. Preparación de complejos de inclusión entre azazúcares sp2 y ciclodextrinas. La presencia de un resto hidrófobo en los inhibidores de tipo azazúcar sp2 de Ia invención da como resultado, en algunos casos, solubilidades limitadas en medios acuosos. Para superar dicha limitación, los solicitantes encontraron particularmente útil Ia preparación de complejos de inclusión con ciclodextrinas o ciclodextrinas modificadas químicamente. Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos que conforman una cavidad que puede aceptar moléculas huésped complementarias de tamaño apropiado. La preparación de dichos complejos de inclusión implica Ia preparación de una disolución en agua tanto de Ia ciclodextrina como del inhibidor, en una proporción relativa que puede variar de 1 :9 a 9:1 , seguido de liofilización. Como vehículo ciclodextrina pueden usarse las α, β o yCD nativas, los derivados metilados, hidroxipropilados o sulfobutilados comercialmente disponibles (DIMEB, TRIMEB, RAMEB, HPBCD, Captisol®) u otras CD modificadas químicamente tales como las reseñadas en las solicitudes de patente WO 9733919 y WO2004087768. El vehículo ciclodextrina preferido según esta invención es βCD. Tras Ia formación de los complejos de inclusión correspondientes, aumentó significativamente Ia solubilidad acuosa de los inhibidores de Ia invención, con potenciaciones de Ia solubilidad de hasta 100 veces.
2.2. Cultivo celular.
Se cultivaron fibroblastos cutáneos derivados de una persona sana y de pacientes con enfermedad de Gaucher (mutaciones N370S/N370S, F213I/F213I, N188S/G193W y F213I/L444P) a 370C en atmósfera de CO2 al 5% usando medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con antibióticos (estreptomicina y penicilina) y suero bovino fetal al 10%. Cuando las células se volvieron confluentes al 80%, se rascaron en H2O enfriada con hielo (106/ml) y se usaron mediante sonicación. Se retiraron los materiales insolubles mediante centrifugación a 12.000 g durante 10 min a 40C. Se determinaron las concentraciones de proteína en los usados con un kit de ensayo de microproteína BCA (Pierce).
2.3. Ensayo enzimático en usados.
Se determinaron las actividades de β-glucocerebrosidasa en usados celulares usando β-D-glucopiranósido conjugado con 4-metilumbeliferona como sustrato (A.M. Vaccaro, M. Muschilli, M. Tatti, R. Salvioli, E. Gallozzi, K. Suzuki. Clin. Biochem. 20: 429-43, 1987). Brevemente, se incubaron 4 μl de usados celulares a 370C con 8 μl de disolución sustrato en tampón citrato 0,1 M, pH 5,2, suplementada con taurocolato de sodio (0,8% p/v). Se terminó Ia reacción añadiendo 1 ,0 mi de tampon de glicina-hidróxido de sodio 0,2 M (pH 10,7). Se definió una unidad de actividad enzimática como nmoles de A- metilumbeliferona liberados por hora.
2.4. Ensayo enzimático en usados para Ia determinación de las actividades inhibidoras frente a β-glucocerebrosidasa humana.
Para explorar los efectos de los compuestos sobre β-glucocerebrosidasa muíante, se cultivaron células de controles sanos y pacientes con enfermedad de Gaucher durante 4 días en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de compuestos. Después de Ia exposición, se rascaron en H2O enfriada con hielo (106/ml) y se usaron mediante sonicación. Se retiraron los materiales insolubles mediante centrifugación a 12.000 g durante 10 min a 40C. Se midieron las actividades β- glucocerebrosidasa en usados celulares.
2.5. Ensayo de β-glucocerebrosidasa intacta para Ia determinación de actividades inhibidoras frente a β-glucocerebrosidasa humana. El ensayo enzimático ex vivo no indicaba si Ia actividad de enzima lisosómica estaba potenciada por estos compuestos. Para compensar esto, se empleó un "ensayo de enzima intacta" descrito por Sawkar y col. (A. R. Sawkar, W.C. Cheng, E. Beutler, CH. Wong, W.E. Balch, J.W. Kelly. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99: 15428-15433, 2002) en el que se estimó Ia actividad enzimática celular mediante Ia aplicación del sustrato (β-D- glucopiranósido conjugado con 4-metilumbeliferona) a células intactas seguido de cuantificación de Ia 4-metilumbeliferona liberada. En este ensayo se pretrataron las células con o sin una alta concentración (0,5 mM) de conduritol-B-epóxido (CBE), un inhibidor irreversible de Ia β-glucosidasa lisosómica, antes de exposición al sustrato.
Brevemente, se trataron placas de 24 pocilios con ingredientes activos de Ia presente invención durante 4 días. Después de lavar con disolución salina tamponada con fosfato (PBS), se incubaron las células en 80 μl de PBS y 80 μl de tampón acetato 0,2 M (pH 4,0). Se inició Ia reacción mediante Ia adición de 100 μl de β-D-glucopiranósido conjugado con 4-metilumbeliferona (5 mM), seguido de incubación a 370C durante 1 h. Se detuvo Ia reacción usando las células mediante Ia adición de 2 mi de tampón de glicina 0,2 M (pH 10,7) y se cuantificó Ia liberación de 4-metilumbeliferona. Se realizó cada experimento en paralelo con células preincubadas con o sin CBE 0,5 mM durante 1 h. Se asignó el componente sensible a CBE a Ia β- glucosidasa lisosómica, mientras que se asignó el componente insensible a CBE a Ia β-glucosidasa no lisosómica.
2.6 Ensayo de β-galactosidasa intracelular. Se cultivaron fibroblastos en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10% y antibióticos, y se recogieron por rascado. Se reunieron mediante centrifugación, se lavaron una vez con disolución salina tamponada con fosfato y se suspendieron en agua. Se sometió a sonicación Ia suspensión celular y se usó para ensayo enzimático (disolución enzimática). Se realizó el ensayo de β-galactosidasa en placas de 96 pocilios. La mezcla de ensayo enzimático consistía en 10 μl de disolución enzimática, con o sin ingrediente activo de Ia invención a una concentración final de hasta 5 μM, y 10 μl de disolución de sustrato que contenía 4-metilumbeliferil-β-galactósido 1 mM (Sigma, St Louis, MO) en tampón citrato 0,1 M (pH 4,5) y NaCI 0,1 M. Después de Ia incubación durante 1 h a 370C, se terminó Ia reacción enzimática añadiendo tampón glicina-NaOH 0,2 M (pH 10,7) y se midió Ia 4-metilumbeliferona liberada mediante fluorometría (excitación 355 nm; emisión 460 nm) como se describe anteriormente (Sakuraba, Aoyagi T, Suzuki Y. Clin. Chim. Acta 1982; 125: 275-282). Se determinó Ia proteína con el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL).
EJEMPLO 3
Inhibición in vitro de β-glucosidasa y β-galactosidasa humanas por azazúcares sp2.
Se recoge el resumen de los valores de CI50 seleccionados para Ia inhibición de β-glucosidasa y β-galactosidasa humanas en Ia Tabla 1. En general, los azazúcares sp2 de Ia invención que tienen un perfil de hidroxilación de complementariedad estructural con D-glucosa (glucomiméticos; por ejemplo, 3, 6 y 14) son inhibidores muy potentes de Ia β-glucosidasa humana. Aquellos que tienen un perfil de hidroxilación de complementariedad estructural con D-galactosa (galactomiméticos; por ejemplo 17, 20 y 23) son potentes inhibidores tanto de β-glucosidasa como de β-galactosidasa. Es destacable que los azazúcares sp2 de Ia invención no inhibían significativamente ni α-glucosidasa ni α-galactosidasa. La inhibición de las β- glucosidasas era al menos 1.000 veces más eficaz, en términos de valores de Cl50, en comparación con Ia inhibición de α-glucosidasas. Los resultados sugieren a los solicitantes que el uso de azazúcares sp2 de Ia invención como chaperonas farmacológicas para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el mal funcionamiento de β-glucosidasa y/o β- galactosidasa humanas, tales como enfermedad de Gaucher o gangliosidosis GMI , evitará o reducirá al mínimo los efectos secundarios asociados a interferencias en el funcionamiento de α-glucosidasa y/o α- galactosidasa.
Tabla 1. Actividad inhibidora de algunos de los inhibidores sobre β- glucosidasa y β-galactosidasa humanas en fibroblastos
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
aLos datos representan valores medios a partir de tres líneas celulares de control independientes
EJEMPLO 4
Potenciación in vitro de Ia actividad de β-glucosidasa mutante por azazúcares sp2.
La actividad β-glucosidasa en usados obtenidos a partir de fibroblastos de Gaucher con diferentes mutaciones se incrementó al aumentar Ia concentración de inhibidor en un cierto intervalo. Se recoge el resumen de los datos seleccionados para algunos de los inhibidores en Ia Tabla 2. Tanto los glucomiméticos como los galactomiméticos de Ia invención son activos como chaperonas farmacológicas frente a mutantes N370S/N370S, F213I/F213I y N188S/G193W en este ensayo, con potenciaciones de actividad relativa que van hasta 3,4 veces en el caso más favorable. Los resultados anteriores apoyan el concepto terapéutico de los solicitantes de que los inhibidores de tipo azazúcar sp2 potentes pueden servir como chaperonas farmacológicas eficaces para potenciar Ia actividad enzimática mutante de pacientes con enfermedad de Gaucher.
Tabla 2. Potenciaciones de actividad sobre Ia actividad β-glucosidasa en fibroblastos de Gaucher (usados) inducidos en presencia de algunas chaperonas farmacológicas de Ia invención 3 μM (arriba) y 30 μM (abajo) para diferentes mutaciones. SP indica sin potenciación
Figure imgf000031_0002
Figure imgf000032_0001
3La actividad residual se refiere a las células control silvestres.
EJEMPLO 5
Potenciación intracelular de Ia actividad de β-qlucosidasa en fibroblastos de pacientes con Gaucher por azazúcares sp2.
Se investigó ex vivo Ia actividad de potenciación intracelular de los inhibidores de tipo azazúcar sp2 de Ia invención con fibroblastos procedentes de pacientes con Gaucher con fenotipos N370S/N370S, F213I/F213I, N188S/G193W, N370S/84GG, L444P/RecNcil y F213I/L444P. Se recogen en Ia Tabla 3 los datos seleccionados para algunos glucomiméticos (compuestos 3, 6 y 14), que se encontró que eran mucho más activos que los galactomiméticos en este ensayo.
Los compuestos 3 y 6 a baja concentración (3 μM) potenciaban Ia actividad de fibroblastos de tipo silvestre (control) en un 23,6 y un 6,5%, respectivamente. Concentraciones mayores de 30 μM anulaban el efecto de potenciación en el control. En contraposición, aumentar Ia concentración de 3 a 30 mM causaba generalmente una mayor potenciación de Ia actividad en el caso de β-glucosidasas mutantes, apoyando una alta relación de actividad chaperona frente a inhibidora para esta familia de derivados.
Los glucomiméticos de azazúcar sp2 de Ia invención demostraron un impacto significativo sobre Ia potenciación de Ia actividad enzimática intracelular en fibroblastos de Gaucher. La actividad enzimática residual en los mutantes aumentaba hasta 3,5 veces en el caso más favorable. La magnitud de Ia potenciación dependía del fenotipo y de Ia estructura del compuesto. El compuesto 3, que tiene una isourea cíclica en Ia estructura, era particularmente eficaz frente a mutaciones N370S/N370S y F213I/F213I, con elevaciones de actividad residual de 2,7 y 3,5 veces, respectivamente, a una concentración 30 μM. El compuesto 6, que tiene una isourea cíclica en Ia estructura, era particularmente eficaz frente a las mutaciones N370S/N370S, F213I/F213I y L444P/RecNcil, con elevaciones de actividad residual de 2,7, 3,5 y 1 ,3 veces, respectivamente, a una concentración 30 μM. El compuesto 6, que tiene una isotiourea cíclica en Ia estructura, era el más eficaz de Ia serie frente a Ia mutación N370S/84GG (potenciación de actividad residual elevada en 1 ,8 veces a una concentración 30 μM), mientras que el compuesto 14, que tiene una guanidina cíclica en Ia estructura, era el más eficaz frente a las mutaciones N188S/G193W y F213I/L444P (potenciaciones de Ia actividad residual elevada en 2,2 veces a una concentración 30 μM en ambos casos). Se cree que Ia biodisponibilidad de estos compuestos mejora significativamente por Ia naturaleza anfifílica de las moléculas, Io que posiblemente facilita su paso a través de las membranas celular y del RE, aumentando así Ia concentración intracelular de estos compuestos.
Tabla 3. Potenciaciones de Ia actividad sobre Ia actividad de β-glucosidasa en fibroblastos de Gaucher intactos inducidas en presencia de ciertas chaperonas farmacológicas de Ia invención a 3 μM (arriba) y 30 μM (abajo) para diferentes mutaciones. SP indica sin potenciación.
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
EJEMPLO 6
Potenciación intracelular de Ia actividad de β-galactosidasa en fibroblastos de pacientes con ganqliosidosis GM1 por azazúcares sp2
Los azazúcares sp2 inhibidores de Ia invención que tienen un perfil de hidroxilación de complementariedad estructural con D-galactosa (galactomiméticos; por ejemplo, los compuestos 15-23) potencian Ia actividad β-galactosidasa en fibroblastos de células de control así como en fibroblastos de pacientes con gangliosidosis GMi - Como ejemplo, Ia Tabla 4 recoge los datos correspondientes del compuesto 17, que tiene una funcionalidad isourea cíclica en su estructura. La actividad intracelular β- galactosidasa en el control se elevó un 46% usando una concentración 50 μM de 17. La actividad β-galactosidasa intracelular en fibroblastos de gangliosidosis GMi se elevó un 17% usando una concentración 50 μM de 17. Tabla 4. Potenciaciones de Ia actividad sobre Ia actividad β-galactosidasa en fibroblastos silvestres (control) y de gangliosidosis GMi intactos inducidas por Ia presencia del compuesto 17 a diferentes concentraciones.
Figure imgf000035_0001
EJEMPLO 7
Potenciación in vitro y ex vivo de Ia actividad de β-qlucosidasa mutante por complejos de inclusión de azazúcares sp2:βCD.
Los inhibidores azazúcares sp2 de Ia invención formaban fácilmente complejos de inclusión con βCD en agua a diferentes proporciones relativas, como se observa a partir de los experimentos de RMN. Los complejos resultantes permitieron aumentar Ia solubilidad del inhibidor en agua sin observar efectos perjudiciales sobre Ia actividad inhibidora frente a las glucosidasas humanas.
Se elevó Ia actividad enzimática en fibroblastos de Gaucher, tanto en usados como en células intactas, aumentando Ia concentración de complejos de inclusión de azazúcares sp2:βCD. Se recogen en Ia Tabla 5 datos seleccionados de algunos complejos. Los solicitantes encontraron esta formulación particularmente apropiada para compuestos que tienen una baja solubilidad acuosa, tal como es el caso del compuesto 6. Al usar proporciones relativas 1 :1 de 6 y βCD a una concentración de 30 μM, se consiguieron aumentos de hasta 3 veces de Ia actividad residual de Ia β- glucosidasa mutante para el fenotipo N370S/N370S.
Tabla 5. Potenciaciones de Ia actividad β-glucosidasa en fibroblastos de Gaucher (usados) o células intactas inducidas en presencia de algunos complejos de sp2-azazúcares:βCD para diferentes mutaciones. SP indica sin potenciación.
Figure imgf000036_0001
aLas concentraciones se refieren al componente azazúcar sp activo. En usados. cEn células intactas

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de fórmula general (I), o cualquiera de sus sales,
Figure imgf000037_0001
donde: R es un sustituyente, igual o diferente, y que se selecciona de entre un átomo de H, un grupo hidroxilo (-OH) o un grupo OR2; donde
R2 es un grupo seleccionado de entre acilo, sustituido o no sustituido, alquilo (C1-C18), sustituido o no sustituido, arilo, sustituido o no sustituido, aralquilo, sustituido o no sustituido, amino (NH2), acetamido (NHAc), o un NHR3; donde R3 es un grupo seleccionado de entre acilo, sustituido o no sustituido, alquilo (C1-C18), sustituido o no sustituido, arilo, sustituido o no sustituido o aralquilo, sustituido o no sustituido.
Y se selecciona de entre un O, NH ó S; y
X es el grupo -NR1. Donde R1 se selecciona del entre un grupo alquilo (C1-C18), sustituido o no sustituido, un grupo arilo (C5-C18), sustituido o no sustituido, o un grupo aralquilo, sustituido o no sustituido.
2. Compuesto según Ia reivindicación 1 , donde Y es un átomo de oxígeno.
3. Compuesto según Ia reivindicación 1 donde Y es NH.
4. Compuesto según Ia reivindicación 1 , donde Y es un átomo de azufre.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, de fórmula general (Ia'):
Figure imgf000038_0001
6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, de fórmula general (Ib'):
Figure imgf000038_0002
Ib1
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde R es OH.
8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde R1 es un grupo alquilo (C3-C9).
9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde R1 es un grupo arilo (C5-C7).
10. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho compuesto es una sal de un clorhidrato.
11. Compuesto según Ia reivindicación 1 , de fórmula: a. (5R,6R,7S,8R,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-fenilimino-2-oxaindolizidina b. (5R,6R,7S,8R,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-butilimino-2-oxaindolizidina c. (5R,6S,7R,8R,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-2-oxa-3-octilimino- indolizidina. d. (5R,6R,7S,8R,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-fenilimino-2-tiaindolizidina. e. (5R,6R,7S,8R,8aR)-3-Butilimino-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-tiaindolizidina f. (5R,6R,7S,8R,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-octilimino-2-tiaindolizidina g. (5R,6R,7S,8R,8aR)-3-[2'-(Λ/,Λ/-Bis-(2-hexanamidoetil)aminoetil)- imino]-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-tiaindolizidina h. Clorhidrato de (5R,6R,7S,8R,8aR)-3-(8-aminooctil)imino-5,6,7,8- tetrahidroxi-2-tiaindolizidina i. (5R,6R,7S,8R,8aR)-3-(4-Adamantano-1-ilcarboxamidobutil)imino-
5,6,7,8-tetrahidroxi-2-tiaindolizidina. j. (5R,6R,7S,8R,8aR)-3-(11 -Azida-3,6,9-trioxaundecil)imino-5,6,7,8- tetrahidroxi-2-tiaindolizidina k. (5R,6R,7S,8R,8aR)-3-(11-Adamantano-1-ilcarboxamido-3,6,9- trioxaundecil)imino-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-tiaindolizidina. I. Clorhidrato de (5R,6R,7S,8R,8aR)-2-aza-3-bencilimino-5,6,7,8- tetrahidroxindolizidina. m. Clorhidrato de (5R,6R,7S,8R,8aR)-2-aza-3-butilimino-5,6,7,8- tetrahidroxindolizidina. n. Clorhidrato de (5R,6R,7S,8R,8aR)-2-aza-5,6,7,8-tetrahidroxi-3- octiliminoindolizidina. o. (5R,6R,7S,8S,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-fenilimino-2-oxaindolizidina. p. (5R,6R,7S,8S,8aR)-3-Butilimino-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-oxaindolizidina. q. (5R,6R,7S,8S,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-octilimino-2-oxaindolizidina. r. (5R,6R,7S,8S,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-fenilimino-2-tiaindolizidina. s. (5R,6R,7S,8S,8aR)-3-Butilimino-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-tiaindolizidina. t. (5R,6R,7S,8S,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-octilimino-2-tiaindolizidina. u. Clorhidrato de (5R,6R,7S,8S,8aR)-2-aza-3-bencilimino-5,6,7,8- tetrahidroxindolizidina. v. Clorhidrato de (5R,6R,7S,8S,8aR)-2-aza-3-butilimino-5,6,7,8- tetrahidroxindolizidina; o w. Clorhidrato de (5R,6R,7S,8S,8aR)-2-aza-5,6,7,8-tetrahidroxi-3- octiliminoindolizidina.
12. Procedimiento de obtención de los compuestos de fórmula general (I) que comprende: a. introducir un grupo amino en Ia posición C-5 del correspondiente azúcar en forma de furanosa; b. cerrar un anillo de cinco miembros entre las posiciones C-5 y C-6 mediante un segmento de tipo pseudoamida del compuesto obtenido en el paso (a); y c. transposición del anillo de furano a un ciclo de piperidina fusionado con el anillo de pseudoamida cíclico de cinco miembros obtenido en el paso (b).
13. Uso del compuesto de fórmula general (I) para Ia elaboración de una composición farmacéutica.
14. Uso del compuesto de fórmula general (I) para Ia elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad relacionada con β-glucosidasa y/o β-galactosidasa mutadas humanas.
15. Uso del compuesto según Ia reivindicación 14, donde las enfermedades son enfermedad de Gaucher, gangliosidosis GM1 o enfermedad de Morquio B.
16. Composición farmacéutica que comprende al menos uno de los compuestos de fórmula general (I).
17. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 16, que además comprende otro componente activo y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 17, donde el vehículo es una ciclodextrina o cualquiera de sus derivados.
19. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 18, donde el vehículo es β-ciclodextrina.
20. Procedimiento in vitro para potenciar Ia actividad de una enzima glicosidasa, que comprende poner en contacto Ia proteína con una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula general (I).
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