WO2010041742A1 - Ｄｏｔａの導入法 - Google Patents

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WO2010041742A1
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compound
peptide
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resin
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功紀 長谷川
恭良 渡辺
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独立行政法人理化学研究所
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    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for synthesizing a compound having a DOTA moiety.
  • radioactive metals are used in diagnostic methods such as nuclear magnetic resonance imaging (MRI) and nuclear medicine imaging, or in treatment methods using radiopharmaceuticals.
  • the radioactive metal is administered in vivo, and for that purpose, the high toxicity of the radioactive metal must be reduced by complex formation with an appropriate chelating agent.
  • chelating agents include 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ', N' ', N' '-tetraacetic acid. Mention may be made of (DOTA) and diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA).
  • DOTA has a characteristic of forming a thermodynamically and kinetically extremely stable complex with a metal ion such as a lanthanoid, and therefore, it can be suitably used for a diagnostic contrast agent. It is known that it is superior to DTPA in its use for radiopharmaceuticals.
  • an appropriate targeting vector that selectively interacts with a specific cell type or endocrine system in a living body is linked to DOTA.
  • Targeting vectors are typically physiologically active substances such as peptides, monoclonal antibodies, proteins, oligonucleotides, glycoproteins, etc. Of these, peptides, in particular, have good pharmacokinetics and tumor permeability. Because it has advantages, it has high potential.
  • somatostatin (DOTA-somatostatin conjugate) into which DOTA has been introduced selectively delivers a radioactive metal to tumor cells or endocrine systems expressing somatostatin receptor at high density, somatostatin receptor positive tumors Have been developed and studied to diagnose and / or treat.
  • the ligand containing the DOTA group that is subjected to the conjugation reaction with the compound should be compatible with the chemical conditions used in the solid phase synthesis method of the compound and soluble. Satisfying such requirements is the tris-tert-butyl ester of DOTA. This is currently commercially available and is most often used to introduce DOTA into peptides on a solid support. It is readily soluble in most organic solvents and is certainly useful because protection with tert-butyl ester is perfectly compatible with normal solid phase synthesis techniques, but it is very useful for removal of protecting groups.
  • Non-Patent Document 1 It has drawbacks such as time consuming (2 to 14 hours; see Non-Patent Document 1).
  • Various DOTA derivatives have been developed in order to overcome such problems, but no sufficient solution has been reached with respect to the time required for deprotection, and there are problems such as complicated synthesis and cost problems. Since it is held, it cannot be used practically (see Non-Patent Document 2).
  • DOTA which does not have a protecting group is very difficult to dissolve in an organic solvent, it has been considered impossible to use it in a solid phase synthesis method in which an aqueous solution cannot be used.
  • the present invention aims to provide such a method.
  • the present inventors mixed DOTA having no protecting group, which has been considered to be very insoluble in an organic solvent, with dimethyl sulfoxide (hereinafter also referred to as “DMSO”), and activated DOTA in the mixed solution.
  • the DOTA was successfully introduced into the peptide by contacting and reacting the activated DOTA with a resin for solid phase synthesis carrying the peptide.
  • DOTA is introduced into a peptide in such a manner, since DOTA does not have a protecting group, removal of the protecting group from the peptide and the resin for solid phase synthesis are performed in the same manner as is normally performed in the peptide solid phase synthesis method.
  • the target compound can be obtained simply by cutting out the above. Therefore, the present inventors have found that DOTA can be introduced into a compound such as a peptide very simply by such a method, and the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a method of introducing 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ′, N ′′, N ′ ′′-tetraacetic acid (DOTA) into a compound having a protecting group A method comprising: a first step of making a mixture of non-DOTA and dimethyl sulfoxide; and a second step of contacting the mixture with a compound supported on a solid support.
  • the first step includes a treatment of activating DOTA using an activating agent.
  • the compound is a peptide or a polynucleotide.
  • the method of the present invention makes it possible to easily and efficiently introduce DOTA into a compound (eg, peptide) on a solid support. Particularly, since DOTA having no protecting group is used in the method of the present invention, the time required for final deprotection is greatly reduced as compared with the conventional method using DOTA having a protecting group. Further, according to the method of the present invention, DOTA can be easily introduced into a peptide supported on a solid phase carrier synthesized by a peptide solid phase synthesis method (SPPS) which is a standard technique in peptide synthesis. The present invention can provide a very practical method of DOTA-peptide conjugate synthesis. Furthermore, DOTA that does not have a protecting group is very inexpensive (about 1/10) compared to DOTA that has a protecting group, and can greatly reduce the cost in the synthesis of DOTA-introduced compounds.
  • SPPS peptide solid phase synthesis method
  • the present invention is a method for introducing DOTA into a compound, comprising a first step of preparing a mixed solution of DOTA and dimethyl sulfoxide having no protecting group, and the mixed solution supported on a solid support. And a second step of contacting with the compound.
  • DOTA without a protecting group used in the method of the present invention refers to 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ′, N ′′, N ′ ′′-tetraacetic acid And the following formula:
  • DOTA can be synthesized according to a method described in the literature, and examples thereof include Bioconjugate Chemistry, vol. 12, p. 7-34 (2001). Alternatively, DOTA that is commercially available from Macrocyclics or the like can also be used.
  • introducing DOTA into a compound means synthesizing a substance in which DOTA and a compound are bonded by a condensation reaction of DOTA and the compound.
  • the condensation may be, for example, condensation between the carboxyl group of DOTA and the amino group of the compound, or may be condensation between the carboxyl group of DOTA and the hydroxyl group of the compound.
  • DOTA and a compound can be bonded at various positions in the compound (eg, N-terminal of peptide compound, lysine residue in compound, etc.).
  • the bonding position between DOTA and the compound is not particularly limited. As described later, the method of the present invention can be suitably applied to, for example, a peptide compound.
  • DOTA is usually introduced at the N-terminus of the peptide compound.
  • DOTA is preferably activated by using an activator or the like before contacting DOTA with the compound to be introduced. The activation of DOTA will be described later.
  • the “contact” in the second step is not particularly limited as long as it allows a chemical reaction between DOTA and the compound into which DOTA is introduced.
  • the mixed liquid obtained in the first step and the solid support carrying the compound are placed in a container and stirred, or the solid support carrying the compound is packed in a column, The process etc. which flow the liquid mixture obtained at the said 1st step can be mentioned. Further, the mixed solution may be dropped or flowed on a substrate on which a solid phase carrier layer carrying the compound is formed.
  • the compound into which DOTA is introduced may be any compound as long as it has a functional group (eg, amino group, hydroxyl group) that can be used for the condensation reaction and can be supported on a solid phase carrier. It is appropriately selected depending on. Such compounds can be, for example, peptides, polynucleotides, polysaccharides, low molecular weight organic compounds, etc., but are preferably peptides.
  • compounds that do not have a functional group (eg, amino group, hydroxyl group) that can be used in the above condensation reaction can also be obtained by introducing, for example, an amino group or a hydroxyl group in advance using a known method. The method can be used as an applicable compound.
  • the amino acid phenylalanine does not have an amino group in the side chain, but by introducing an amino group into the side chain using a coupling agent or the like to form aminophenylalanine, the method of the present invention adds the amino group to the side chain.
  • DOTA can be introduced.
  • the method for obtaining the compound as described above is not limited as long as it is supported on the solid phase carrier at the stage of introducing DOTA.
  • an organic synthetic chemical method eg, solid phase synthesis method (eg, peptide solid phase) is used.
  • a compound library prepared using combinatorial chemistry technology more specifically, a compound library on a solid phase prepared by a solid phase synthesis method (eg, peptide solid phase synthesis method) or a phage display method ( The method of the present invention can also be applied to examples, peptide libraries, antibody libraries, and the like.
  • a library may be one produced by itself or one that is generally commercially available.
  • the “compound library” means an assembly of individual compounds supported on a suitable solid phase carrier, and the solid phase carrier is a compound of the compound according to the method of the present invention.
  • the compound is not particularly limited as long as DOTA can be introduced into the group, and the compound is typically a peptide or antibody, but is not limited thereto, and the assembly is typically 1 to about It contains 100,000 compounds, preferably 2 to about 10,000 compounds, more preferably 2 to about 1000 compounds, and even more preferably 5 to about 100 compounds as constituents.
  • Methods for preparing a compound library are known in the art, and the compound library that can be used in the method of the present invention may be prepared by any method.
  • a method for preparing a compound library is described in, for example, “Combinatorial Chemistry—From Introduction to Application (Chemical Doujinshi) (1997)”.
  • peptide broadly means a substance in which two or more amino acids are linked by an amide bond, and is usually a substance called a protein in which tens to hundreds or thousands of amino acids are linked. including.
  • Examples of peptides into which DOTA is introduced by the method of the present invention include those synthesized by a known peptide solid phase synthesis method (SPPS). In this case, the number of peptides is usually from 2 to about 100.
  • SPPS peptide solid phase synthesis method
  • the amino acids constituting the peptide include natural L-amino acids, natural D-amino acids, and unnatural amino acids (not only known compounds such as phenylglycine and p-hydroxyphenylglycine but also amino acids derived from amino acids).
  • peptide any compound having a carboxyl group.
  • a substance in which a sugar and / or lipid is bound to a substance in which two or more amino acids are linked by an amide bond is also encompassed in the “peptide” as used herein.
  • Specific examples of the peptide include somatostatin, secretin, octreotide, exenatide, and QBP1 (Polyglutamine binding peptide 1).
  • Methods for synthesizing peptides by organic synthetic chemistry eg, solid phase synthesis, liquid phase synthesis, etc.
  • methods for synthesizing peptides by biotechnology eg, genetic engineering synthesis, etc.
  • peptide solid phase automatic synthesizers e.g., peptide solid phase automatic synthesizers
  • kits for performing such operations are generally commercially available.
  • the peptides used in the method of the present invention can be obtained using known methods and means such as these.
  • an antibody into which DOTA has been introduced is currently used for diagnostic and therapeutic applications, and therefore, as a suitable example of a peptide to which the method of the present invention can be applied, an antibody can be mentioned.
  • antibody means an immunoglobulin (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM and their Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment, Fc fragment), and examples include polyclonal antibodies, Monoclonal antibodies, single chain antibodies, anti-idiotype antibodies, humanized antibodies and the like can be mentioned, and monoclonal antibodies are preferred.
  • Antibody production can be performed using various methods known per se. Specific examples of antibodies into which DOTA is introduced using the method of the present invention include, but are not limited to, cetuximab and the like.
  • polynucleotide broadly means a substance in which two or more nucleotides are linked, and may be single-stranded or double-stranded, and may be polydeoxynucleotide. It may be a polyribonucleotide. Further, chimeras of DNA and RNA, peptide nucleic acids, and the like are also included in the “polynucleotide” in the present specification. Polynucleotides include those that are relatively short in length (typically 50 bases or less) and usually called oligonucleotides, and longer DNAs and RNAs.
  • the polynucleotide may contain a modified base, for example, a non-naturally occurring base such as inosine, or a tritylated base.
  • Short polynucleotides (usually 2 to about 50 bases) can be chemically synthesized by known methods such as triester method, phosphite method, phosphoamidite method, phosphonate method and the like. Such synthesis can usually be performed on a modified solid support, and automated synthesizers for that are generally commercially available.
  • the polynucleotide into which DOTA is introduced by the method of the present invention is preferably a polynucleotide synthesized on a solid phase carrier by a solid phase synthesis method having a length of 2 to about 50 bases.
  • the first step can be performed by simply mixing DOTA having no protecting group and dimethyl sulfoxide.
  • DOTA is very difficult to dissolve in DMSO, a suspension is usually obtained by the above process.
  • the said 1st step includes the process which activates DOTA using an activator.
  • treatment for activating DOTA includes, for example, reactive ester reaction by reacting DOTA with an appropriate active esterification component (eg, N-hydroxyamines such as succinimide, phenols).
  • an active esterification component means a substance capable of bringing DOTA into an activated state by forming an ester with DOTA.
  • the activated DOTA can be used to introduce DOTA into the compound by subjecting it to a condensation reaction with the compound as described above.
  • DOTA activated in a mixed solution with DMSO can be prepared as follows. That is, after adding an active esterification component (eg, N-hydroxyamines such as succinimide, phenols), an activator, and DOTA to DMSO, the mixture is left for an appropriate time (eg, 3-6 hours).
  • the activation reaction may be performed with stirring.
  • the order of addition of each compound is not particularly limited, and the reaction can be performed, for example, at room temperature.
  • the “activator” means a substance for promoting the esterification reaction between DOTA and the active esterification component. Any activator can be used as long as it can achieve the desired purpose, but an unnecessary by-product that can give a high yield when used in DMSO and inhibits the reaction.
  • water-soluble carbodiimide such as 1-ethyl-3- (dimethylaminopropyl) carbodiimide.
  • succinimide, DOTA and DMSO for example, 10 ⁇ mol of 1-ethyl-3- (dimethylaminopropyl) with respect to 1 mL of DMSO.
  • the activation reaction can be carried out by adding carbodiimide, 10 ⁇ mol succinimide and 10 ⁇ mol DOTA and stirring the mixture for 3 hours at room temperature.
  • the mixed liquid obtained in the first step is brought into contact with a solid support carrying the compound, and DOTA is introduced into the compound. Therefore, it is necessary to prepare in advance a solid phase carrier carrying the compound.
  • the compound may be obtained from nature or synthesized by an appropriate synthesis method on a solid support by any known method, or may be immobilized by a solid phase synthesis method. You may synthesize
  • the “compound supported on a solid phase carrier” is immobilized on the surface of an appropriate solid phase carrier as described later by some physical or chemical means, and It means a compound that can remain immobilized on the solid support during the DOTA introduction (conjugation) step.
  • the means may be any method known in the art, and is not limited to the following. For example, covalent bond with a compound constituting a solid phase carrier, biotin-avidin bond, biotin-streptavidin bond, etc. Is mentioned.
  • a peptide synthesized by a standard peptide solid phase synthesis method is finally cleaved from a solid phase carrier by an appropriate treatment, but the peptide before cleaving is referred to as “supported on a solid phase carrier” in the present invention.
  • a method for immobilizing an antibody on an appropriate solid phase carrier such as a bead is known in the art, and an antibody immobilized on a solid phase carrier by such a method is also referred to in the present invention.
  • a compound carried on a solid support is also referred to in the present invention.
  • solid phase carrier means an inert material capable of supporting a compound into which DOTA is introduced directly or via a binding arm.
  • the solid phase carrier can be appropriately selected from all materials usually used for binding peptides, polynucleotides, polysaccharides, organic low molecular weight compounds and the like in this technical field.
  • the solid phase carrier examples include, but are not limited to, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, and 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy
  • resins such as resins, and polymers such as polycarbonate, polyethylene, polypropylene, polystyrene, saturated cyclic polyolefin, polypentene, polyamide, and copolymers thereof.
  • the solid phase carrier may be in any form as long as it can be used in the method of the present invention, such as a flat substrate, a microwell plate, or a microbead.
  • One embodiment of the present invention includes a method of introducing DOTA into a peptide on a solid phase carrier synthesized by a known peptide solid phase synthesis method.
  • One feature of the present invention is that DOTA-peptide conjugates are important in diagnosis and treatment, that peptide solid-phase synthesis methods are already well established, and that DOTA is introduced onto a solid-phase carrier.
  • Such an embodiment is very useful from the viewpoint of being utilized. In particular, therefore, such embodiments are described in detail below. However, the present invention is not limited to such an embodiment.
  • an oligonucleotide solid phase synthesis method or a polysaccharide solid phase synthesis method known in the art may be used, or
  • a person skilled in the art can, based on the following description, obtain a desired substance into which DOTA has been introduced. It will be clear that can be obtained.
  • the method of the present invention can be applied to any peptide solid phase synthesis method commonly used in the art, but the Fmoc method and the Boc method are preferable, and the Fmoc method is more preferable.
  • the Fmoc synthesis method includes a batch method in which a resin and an amino acid are put in a container and stirred and reacted, and a continuous flow method in which a resin is packed in a column and the amino acid is allowed to flow to react.
  • a batch method can be preferably used.
  • any carrier resin for solid-phase synthesis methods commercially available in a form in which a C-terminal amino acid derivative has been introduced in advance can be preferably used.
  • carrier resin for example, Wang resin and 2-chlorotrityl resin (for batch method) as carrier resin used in Fmoc method; KA resin and PA resin (for continuous flow method); TGT resin and TGA Examples of the resin (for batch method and continuous flow method) can be given, but the present invention is not limited thereto.
  • Examples of the resin used in the Boc method include, but are not limited to, Merrifield resin and PAM resin.
  • any of the carrier resins exemplified above can be obtained from, for example, Calbiochem-Novabiochem Japan, in which various amino acid derivatives are introduced so that they can be applied to any peptide to be synthesized. It is.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin according to various known condensation methods according to the sequence of the target peptide.
  • a solid phase carrier carrying the peptide can be obtained.
  • carbodiimides are particularly preferable.
  • the carbodiimides include dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, and preferably N-ethyl-N ′-( 3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide is used.
  • a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (for example, HOBt, HOBt), or the protected amino acid is activated in advance as a symmetric anhydride, HOBt ester or HOOBt ester. It can later be added to the resin.
  • a racemization inhibitor for example, HOBt, HOBt
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin is usually DMSO.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range that is known to be usable for peptide bond formation reaction, and is usually appropriately selected from the range of about -20 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times.
  • the step of introducing DOTA into the peptide is performed using the mixed solution obtained in the first step.
  • the above-mentioned DMSO suspension with respect to a solid support carrying a compound and a reaction such as a solvent or diisopropylamine for swelling a solid support such as N-methylpyrrolidone for example, the above-mentioned DMSO suspension with respect to a solid support carrying a compound and a reaction such as a solvent or diisopropylamine for swelling a solid support such as N-methylpyrrolidone.
  • the condensation reaction may be performed by adding a promoter and stirring at an appropriate time (eg, 1 to 2 hours), for example, at room temperature.
  • an appropriate time eg, 1 to 2 hours
  • the target compound (DOTA-peptide conjugate)
  • the method for performing this step is appropriately selected from the methods performed in the usual peptide solid phase synthesis method according to the type of amino acid protecting group used in the peptide solid phase synthesis and the binding mode between the solid phase carrier and the compound. It can be carried out.
  • the desired compound can be obtained by isolating and purifying the target compound from which the protecting group has been removed in such a manner by a known purification method.
  • examples of the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and combinations thereof.
  • Example 1 Dissolve 2 mg of succinimide and 4 mg of 1-ethyl 3- (dimethylaminopropyl) carbodiimide in 2 mL of DMSO, and add 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ', N'',N''' -Tetraacetic acid (DOTA) 8 mg was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours to carry out an activation reaction. This step resulted in a suspension.
  • DOTA 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ', N'',N''' -Tetraacetic acid
  • Somatostatin was synthesized by standard Fmoc solid phase synthesis using 300 mg (0.52 mmol / g) of Fmoc-Cys (Trt)-(2-Cl) trityl resin as a starting material, and H-Ala-Gly-Cys (Trt)- Lys (Boc) -Asn (Trt) -Phe-Phe-Trp (Boc) -Lys (Boc) -Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Cys (Trt)-(2Cl) Trt A resin was obtained.
  • DOTA-somatostatin a mass spectrometer was used to confirm that the molecular weight was consistent with the calculated value.
  • DOTA functions as a chelating agent by complexing positron-releasing metal nuclide 68Ga to the obtained DOTA-somatostatin.
  • DOTA-somatostatin with 68Ga complex was injected into a mouse with a tumor that highly expresses somatostatin receptor, and positron was strongly detected from the tumor.
  • DOTA-QBP1 (polyQ-binding peptide 1) was synthesized as follows. NovaSyn® TGA resin 370 mg (0.28 mmol / g) as a starting material, Fmoc-Asp (OtBu) -OH 169 mg (0.41 mmol), 0.5M O-benzotriazolyl-N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) / DMF 0.82 mL (0.41 mmol), 0.5M 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) / DMF 0.82 mL (0.41 mmol), 4- (dimethylamino ) 0.1 mg (0.8 ⁇ mol) of pyridine was added and stirred at room temperature for 1 hour.
  • NovaSyn® TGA resin 370 mg (0.28 mmol / g) as a starting material
  • Fmoc-Asp (OtBu) -OH 169 mg (0
  • Fmoc-Asp (OtBu) -NovaSyn (registered trademark) TGA resin Fmoc-Asp (OtBu)-NovaSyn (registered trademark) TGA resin 113 mg (0.24 mmol / g) was used as a starting material by standard Fmoc method, and H-Ser (tBu) -Asn (Trt) -Trp-Lys (Boc ) -Trp-Trp-Pro-Gly-Ile-Phe-Asp (OtBu) -NovaSyn® TGA resin was obtained.
  • the crude peptide was precipitated with 5 mL of cold ether, and the precipitate was dissolved in acetonitrile aqueous solution and purified by reverse phase HPLC. It was identified as DOTA-QBP1 by mass spectrometry and amino acid analysis, and 0.3 mg of the target compound could be synthesized.
  • the method of the present invention makes it possible to easily and efficiently introduce DOTA into a compound (eg, peptide) on a solid support. Particularly, since DOTA having no protecting group is used in the method of the present invention, the time required for final deprotection is greatly reduced as compared with the conventional method using DOTA having a protecting group. Further, according to the method of the present invention, DOTA can be easily introduced into a peptide supported on a solid phase carrier synthesized by a peptide solid phase synthesis method (SPPS) which is a standard technique in peptide synthesis. The present invention can provide a very practical method of DOTA-peptide conjugate synthesis. Furthermore, DOTA that does not have a protecting group is very inexpensive (about 1/10) compared to DOTA that has a protecting group, and can greatly reduce the cost in the synthesis of DOTA-introduced compounds.
  • SPPS peptide solid phase synthesis method

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Abstract

　ペプチドなどの化合物に対して1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸（ＤＯＴＡ）を導入するための、簡便で効率的でコスト効率の良い方法を提供する。 　ＤＯＴＡを化合物に導入する方法であって、保護基を有さないＤＯＴＡとジメチルスルホキシドとの混合液を作製する第１のステップと、該混合液を、固相担体上に担持された化合物と接触させる第２のステップとを含む、方法。

Description

ＤＯＴＡの導入法
　本発明は、ＤＯＴＡ部位を有する化合物の合成法に関する。
　核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）や核医学イメージングといった診断法、あるいは放射性医薬を用いる治療法において、様々な放射性金属が利用されている。これらの目的のために放射性金属は生体内に投与されるが、そのためには、放射性金属が持つ高い毒性を、適当なキレート化剤との錯体形成によって低減させる必要がある。そのようなキレート化剤として様々な物質が開発されており、代表的なものとして1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸（ＤＯＴＡ）およびジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を挙げることができる。これらのうちで特にＤＯＴＡは、ランタノイドなどの金属イオンと熱力学的、動力学的に極めて安定な錯体を形成するという特性を持っているため、診断用造影剤のために好適に利用することができるのみならず、放射性医薬のための利用においてはＤＴＰＡよりも優れていることが知られている。
　放射性金属を体内の標的部位に送達するために、生体内の特定の細胞型や内分泌系などに対して選択的に相互作用する適当なターゲティングベクターがＤＯＴＡに連結される。ターゲティングベクターは、典型的には、ペプチド、モノクローナル抗体、タンパク質、オリゴヌクレオチド、糖タンパク質などの生理活性物質であるが、これらのうち特にペプチドは薬物動態や腫瘍に対する浸透性が良好であることなどの利点を持っているため、高い潜在的可能性を有している。例えば、ＤＯＴＡを導入したソマトスタチン（ＤＯＴＡ－ソマトスタチン・コンジュゲート）が、ソマトスタチン受容体を高密度に発現している腫瘍細胞や内分泌系に対して放射性金属を選択的に送達してソマトスタチン受容体陽性腫瘍を診断および／または治療するために開発および検討されてきた。
　化合物（例、ペプチド）にＤＯＴＡを導入（コンジュゲート）する方法についてこれまで様々な検討がなされてきたが、それらは液相で行われる方法（液相コンジュゲーション）と固相で行われる方法（固相コンジュゲーション）とに大別することができる。これらのうち液相コンジュゲーションは、反応の各段階においてそのつど、余分の反応試薬や副生成物を除去して生成物を精製しなくてはならず、最終生成物の収量の低下を招く。これに対して固相コンジュゲーションは、化合物分子をビーズなどの担体上に連結させ、反応試薬の溶液中に入れて段階的な合成反応を行うことから、過剰な試薬を取り除くためには固相樹脂を濾過するだけで足り、副産物の形成も抑制できる。また、ペプチドなどの固相合成法が確立されており、そのような方法と、ＤＯＴＡの固相コンジュゲーションとを組み合わせることにより、ＤＯＴＡが導入された化合物（例、ＤＯＴＡ－ペプチド・コンジュゲート）の合成を効率的に行うことができる。
　しかしながら、化合物の固相合成法と組み合わせて固相コンジュゲーションを効率的に行うためには、克服すべき様々な技術的課題もまた存在している。最も重要なこととして、化合物とのコンジュゲーション反応に供されるＤＯＴＡ基を含むリガンドは、化合物の固相合成法に使用される化学条件に適合し、かつ可溶であるべきである。そのような要求を満たすものとして、ＤＯＴＡのｔｒｉｓ－ｔｅｒｔ－ブチルエステルが挙げられる。これは現在市販されており、固相担体上のペプチドにＤＯＴＡを導入するために最も良く使用されている。これは、ほとんどの有機溶媒に容易に溶け、また、ｔｅｒｔ－ブチルエステルでの保護は通常の固相合成技術と完全に適合しているため確かに有用であるが、保護基の除去に非常に時間がかかる（２～１４時間；非特許文献１参照）などの欠点を抱えている。そのような問題を克服するために様々なＤＯＴＡ誘導体が開発されてきたが、脱保護に要する時間に関して十分な解決には至っておらず、また、合成が複雑であることやコスト的な問題なども抱えているため実用に耐えられるものにはなっていない（非特許文献２参照）。また、保護基を有さないＤＯＴＡは有機溶媒に非常に溶けにくいため、水溶液を用いることができない固相合成法において使用することが不可能と考えられてきた。
Tetrahedron Letter, vol. 45, p.5453-5455 (2004) Bioconjugate Chemistry, vol.19, p.391-402（2008）
　上述した当該技術分野における現状から分かるように、ペプチドなどの化合物に対してＤＯＴＡを導入するための、簡便で効率的でコスト効率の良い方法に対する需要が存在している。本発明は、そのような方法を提供することをその目的としている。
　本発明者らは、有機溶媒に非常に溶けにくいと考えられてきた保護基を有さないＤＯＴＡをジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」ともいう）と混合し、該混合液中でＤＯＴＡを活性化させ、活性化されたＤＯＴＡを、ペプチドを担持した固相合成用樹脂に接触、反応させることにより、該ペプチドにＤＯＴＡを導入することに成功した。そのようにしてペプチドにＤＯＴＡを導入した場合、ＤＯＴＡが保護基を有さないため、ペプチド固相合成法において通常行われるのと同様にしてペプチドからの保護基の除去および固相合成用樹脂からの切り出しを行うだけで目的とする化合物を得ることができる。従って、かかる方法によりペプチドなどの化合物に非常に簡便にＤＯＴＡを導入することが可能であることを本発明者らは見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸（ＤＯＴＡ）を化合物に導入する方法であって、保護基を有さないＤＯＴＡとジメチルスルホキシドとの混合液を作製する第１のステップと、該混合液を、固相担体上に担持された化合物と接触させる第２のステップとを含む、方法。
［２］第１のステップが、活性化剤を用いてＤＯＴＡを活性化する処理を含む、上記［１］記載の方法。
［３］化合物がペプチドまたはポリヌクレオチドである、上記［１］または［２］記載の方法。
［４］化合物がペプチドである、上記［３］記載の方法。
［５］ペプチドが抗体である、上記［４］記載の方法。
［６］ペプチドが、ソマトスタチン、セクレチン、オクトレオチド、エクセナチドおよびＱＢＰ１の少なくともいずれか１つである、上記［４］記載の方法。
［７］化合物が該固相担体上で合成されたものである、上記［３］記載の方法。
［８］活性化剤が１－エチル－３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである、上記［１］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
　本発明の方法により、固相担体上の化合物（例、ペプチドなど）に、簡便かつ効率的にＤＯＴＡを導入することが可能となる。特に、本発明の方法では保護基を有さないＤＯＴＡを使用するため、保護基を有するＤＯＴＡを用いる従来法の場合と比べて、最終脱保護に要する時間が大幅に低減される。また、本発明の方法によれば、ペプチド合成における標準技術であるペプチド固相合成法（ＳＰＰＳ）により合成された固相担体上に担持されたペプチドにＤＯＴＡを簡便に導入することができるため、非常に実用的なＤＯＴＡ－ペプチド・コンジュゲート合成法を本発明は与えることができる。さらには、保護基を有さないＤＯＴＡは、保護基を有するＤＯＴＡと比較して非常に安価（約１／１０）であり、ＤＯＴＡ導入化合物の合成において大幅なコストダウンが実現できる。
　本発明は、ＤＯＴＡを化合物に導入する方法であって、保護基を有さないＤＯＴＡとジメチルスルホキシドとの混合液を作製する第１のステップと、該混合液を、固相担体上に担持された化合物と接触させる第２のステップとを含む方法を提供する。
　本発明の方法で使用される、保護基を有さないＤＯＴＡとは、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸のことであり、下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
を有する化合物である。
　ＤＯＴＡは、文献に記載された方法に従って合成することができ、該文献としては、Bioconjugate Chemistry, vol.12, p.7-34 (2001)などを挙げることができる。或いは、ＤＯＴＡは、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社などから一般に市販されているものを使用することもできる。
　本明細書において「ＤＯＴＡを化合物に導入する」とは、ＤＯＴＡと化合物とを縮合反応させて、ＤＯＴＡと化合物とが結合した物質を合成することを意味する。該縮合は、例えば、ＤＯＴＡのカルボキシル基と化合物のアミノ基との間の縮合であってもよく、あるいはＤＯＴＡのカルボキシル基と化合物のヒドロキシル基との間の縮合であってもよい。また、当該技術分野において周知なように、ＤＯＴＡと化合物との結合は、化合物中の様々な位置（例、ペプチド化合物のＮ末端、化合物中のリジン残基など）で起こりうるが、本発明の方法においては、ＤＯＴＡと化合物との結合位置は特に限定されない。本発明の方法は、後述するように、例えばペプチド化合物に対して好適に適用されうるが、その場合、導入や化合物調製の容易さの観点から、通常、ＤＯＴＡはペプチド化合物のＮ末端に導入される。また、ＤＯＴＡは、ＤＯＴＡを導入される化合物と接触させる前に、活性化剤を用いるなどして活性化させておくことが好ましい。ＤＯＴＡの活性化については後述する。
　上記第２のステップにおける「接触」は、ＤＯＴＡと、ＤＯＴＡを導入される化合物との化学反応を生じさせるのを可能とするような処理であれば特に限定されない。例えば、上記第１のステップで得られた混合液と、当該化合物を担持した固相担体とを容器に入れて撹拌する処理、あるいは、当該化合物を担持した固相担体をカラムに詰め、そこに上記第１のステップで得られた混合液を流す処理などを挙げることができる。また、当該化合物を担持した固相担体層が形成された基体上に、該混合液を滴下または流動させてもよい。
　ＤＯＴＡを導入される化合物は、上記縮合反応に利用することができる官能基（例、アミノ基、ヒドロキシル基）を有しかつ固相担体上に担持されうる限り任意の化合物であってよく、用途に応じて適宜選択される。そのような化合物は、例えば、ペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、低分子有機化合物などでありうるが、好適にはペプチドである。
　また、上記縮合反応に利用することができる官能基（例、アミノ基、ヒドロキシル基）を有しない化合物についても、公知の方法を用いてあらかじめ例えばアミノ基またはヒドロキシル基を導入することによって、本発明の方法を適用可能な化合物とすることができる。例えば、アミノ酸のフェニルアラニンは、側鎖にはアミノ基を有しないが、カップリング剤などを用いて側鎖にアミノ基を導入し、アミノフェニルアラニンにすることによって、本発明の方法により当該側鎖にＤＯＴＡを導入できるようになる。
　上記のような化合物は、ＤＯＴＡを導入する段階で固相担体上に担持されている限りその取得方法は限定されず、例えば、有機合成化学的方法（例、固相合成法（例、ペプチド固相合成法）、液相合成法など）により合成された化合物、生物工学的方法（例、遺伝子工学的合成法など）により合成された化合物、公知の単離精製法により天然から得られた化合物などであってもよい。
　また、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、より詳しくは例えば、固相合成法（例、ペプチド固相合成法）やファージディスプレイ法などにより作製された固相上の化合物ライブラリー（例、ペプチドライブラリー、抗体ライブラリーなど）に対しても本発明の方法を適用することができる。そのようなライブラリーは、自身で作製したものであってもよく、あるいは一般に市販されているものであってもよい。
　本明細書において「化合物ライブラリー」とは、適当な固相担体上に担持されている個別の化合物の集合を意味しており、ここで該固相担体としては本発明の方法により該化合物の群にＤＯＴＡを導入することを可能とする限り特に限定されず、該化合物としては典型的にはペプチドまたは抗体であるがそれらに限定されず、かつ、該集合は、典型的には１から約１０００００種類の化合物、好ましくは２から約１万種類の化合物、より好ましくは２から約１０００種類の化合物、さらに好ましくは５から約１００種類の化合物をその構成要素として含む。化合物ライブラリーを作製する方法は当該技術分野で公知であり、本発明の方法で用いられうる化合物ライブラリーはいかなる方法によって作製されたものであってもよい。化合物ライブラリーを作製する方法は、例えば「コンビナトリアルケミストリー－入門から応用まで（化学同人刊）(１９９７年)」などに記載されている。
　本明細書において「ペプチド」とは、２つ以上のアミノ酸がアミド結合で連結された物質を広く意味しており、数十から数百あるいは数千のアミノ酸が連結したような通常タンパク質と呼ばれる物質を含む。本発明の方法によりＤＯＴＡを導入されるペプチドとしては、例えば、公知のペプチド固相合成法（ＳＰＰＳ）により合成されたものが挙げられるが、その場合のペプチドは、通常２から約１００個までのアミノ酸を含む。また、ペプチドを構成するアミノ酸としては、天然型Ｌ－アミノ酸、天然型Ｄ－アミノ酸、および非天然型アミノ酸（フェニルグリシンおよびｐ－ヒドロキシフェニルグリシンなどの公知化合物のみならず、アミノ酸から誘導されるアミノ基およびカルボキシル基を有する任意の化合物を含む）が挙げられる。さらに、２つ以上のアミノ酸がアミド結合で連結された物質に糖および／または脂質が結合している物質も、本明細書でいう「ペプチド」に包含される。ペプチドの具体例としては、ソマトスタチン、セクレチン、オクトレオチド、エクセナチド、ＱＢＰ１（Polyglutamine binding peptide 1）などを挙げることができる。
　有機合成化学的にペプチドを合成する方法（例、固相合成法、液相合成法など）、生物工学的にペプチドを合成する方法（例、遺伝子工学的合成法など）は当該技術分野において既に確立されており、また、ペプチドの単離精製法についても既に確立されている。さらには、そのような操作を行うための様々な機器（例、ペプチド固相自動合成機など）やキットなどが一般に市販されている。本発明の方法に利用されるペプチドは、これらのような既知の方法および手段を用いて得ることができる。
　また、ＤＯＴＡを導入した抗体（ＤＯＴＡ－抗体コンジュゲート）は診断および治療用途に現在使用されており、従って本発明の方法を適用されうるペプチドの好適な一つの例として、抗体を挙げることができる。
　本明細書において「抗体」とは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体などが挙げられ、好ましくはモノクローナル抗体である。抗体の作製は、種々の自体公知の方法を用いて行うことができる。
　本発明の方法を用いてＤＯＴＡを導入される抗体の具体例としては、セツキシマブなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、２つ以上のヌクレオチドが連結した物質を広く意味し、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、また、ポリデオキシヌクレオチドであってもポリリボヌクレオチドであってもよい。また、ＤＮＡとＲＮＡとのキメラやペプチド核酸なども本明細書における「ポリヌクレオチド」に含まれる。ポリヌクレオチドは、長さについて、比較的短い（典型的には５０塩基以下）通常オリゴヌクレオチドと呼ばれるようなものも包含し、それより長いＤＮＡやＲＮＡなどのようなものも包含している。ポリヌクレオチドは、修飾された塩基を含んでいてもよく、例えば、イノシンなどの天然には存在しない塩基、またはトリチル化された塩基などを含んでいてもよい。短いポリヌクレオチド（通常、２から約５０塩基）は、既知の方法、例えば、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホアミダイト法、ホスホネート法などの方法により化学合成することができる。そのような合成は、通常、修飾された固体支持体上で行うことができ、そのための自動合成機が一般に市販されている。本発明の方法によりＤＯＴＡを導入されるポリヌクレオチドは、好適には、２から約５０塩基までの長さを有する固相合成法により固相担体上で合成されたポリヌクレオチドである。
　上記第１のステップは、保護基を有さないＤＯＴＡとジメチルスルホキシドとを単純に混合することで行うことができる。なお、ＤＯＴＡはＤＭＳＯに非常に溶けにくいため、上記工程によって懸濁液が通常得られる。また、上述の通り、上記第１のステップは、活性化剤を用いてＤＯＴＡを活性化する処理を含むことが好ましい。本明細書において「ＤＯＴＡを活性化する処理」としては、例えば、ＤＯＴＡを適当な活性エステル化成分（例、コハク酸イミドなどのＮ－ヒドロキシアミン類、フェノール類）と反応させることにより反応性エステルを形成させる処理などが挙げられる。ここで、「活性エステル化成分」とは、ＤＯＴＡとエステルを形成することにより、ＤＯＴＡを活性化された状態にすることができる物質を意味する。活性化されたＤＯＴＡは、上述したような化合物との縮合反応に供して該化合物にＤＯＴＡを導入するために使用することができる。
　ＤＭＳＯとの混合液中で活性化されているＤＯＴＡの調製は、例えば、次のようにして行うことができる。
　すなわち、活性エステル化成分（例、コハク酸イミドなどのＮ－ヒドロキシアミン類、フェノール類）、活性化剤、およびＤＯＴＡをＤＭＳＯに加えた後、混合物を適当な時間（例、３～６時間）撹拌して活性化反応を行えばよい。ここで各化合物の添加の順序は特に限定されず、また、反応は例えば室温で行うことができる。また、「活性化剤」とは、ＤＯＴＡと上記活性エステル化成分とのエステル化反応を促進するための物質を意味する。活性化剤としては、所望の目的を達成しうる限り任意のものを使用することができるが、ＤＭＳＯ中で用いたときに高い収率を与えることができかつ反応を阻害する不要な副生成物の生成を抑えることができるという観点から、１－エチル－３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどの水溶性カルボジイミドを用いることが好ましい。１－エチル－３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、コハク酸イミド、ＤＯＴＡおよびＤＭＳＯを用いて当該工程を行う場合、例えば、１ｍＬのＤＭＳＯに対して、１０μｍｏｌの１－エチル－３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１０μｍｏｌのコハク酸イミドおよび１０μｍｏｌのＤＯＴＡを添加し、混合物を３時間室温で撹拌することによって上記活性化反応を行うことができる。
　次いで、上記第１のステップで得られた混合液を、化合物を担持した固相担体と接触させて、該化合物へのＤＯＴＡの導入を行う。そのために、該化合物を担持させた固相担体をあらかじめ作製しておく必要がある。上述したように、該化合物は、天然から得られたものまたは適当な合成法により合成されたものを任意の公知の方法により固相担体上に固定化してもよく、あるいは固相合成法により固相担体上で合成してもよい。
　なお、本明細書において、「固相担体上に担持された化合物」とは、後述するような適当な固相担体の表面に、何らかの物理的または化学的手段により固定化されており、かつ、ＤＯＴＡの導入（コンジュゲーション）工程の間、該固相担体上に固定化されたままであることができる化合物を意味する。当該手段は、当該技術分野で公知の任意の方法であってよく、以下に限定されないが例えば、固相担体を構成する化合物との共有結合、および、ビオチン－アビジン結合、ビオチン－ストレプトアビジン結合などが挙げられる。例えば、標準的なペプチド固相合成法により合成されたペプチドは最終的には適当な処理によって固相担体から切り出されるが、切り出される前のペプチドは、本発明でいう「固相担体上に担持された化合物」である。あるいは、抗体をビーズなどの適当な固相担体上に固定化する方法は当該技術分野で公知であり、そのような方法により固相担体上に固定化された抗体もまた、本発明でいう「固相担体上に担持された化合物」である。
　本明細書において「固相担体」とは、直接または結合アームを介して、ＤＯＴＡを導入される化合物を担持することができる不活性材料を意味する。固相担体としては、当該技術分野において、ペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、有機低分子化合物などを結合するために通常使用されるあらゆる材料の中から適宜選択することが可能である。固相担体としては、以下に限定されないが、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４－ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４－メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４－ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４－（２’，４’－ジメトキシフェニル－ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、および４－（２’，４’－ジメトキシフェニル－Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などの樹脂、ならびに、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体などの高分子などが挙げられる。
　また、固相担体は、平板状基板、マイクロウェルプレート、またはマイクロビーズなど、本発明の方法に使用することができる限り任意の形態であってよい。
　本発明の一つの実施形態として、公知のペプチド固相合成法により合成された固相担体上のペプチドにＤＯＴＡを導入する方法が挙げられる。ＤＯＴＡ－ペプチド・コンジュゲートが診断や治療において重要であること、ペプチド固相合成法が既に十分確立されていること、および、固相担体上でのＤＯＴＡの導入という本発明の一つの特徴が効率的に活用されていることなどの観点から、そのような実施形態は非常に有用である。それゆえ特に、そのような実施形態について以下に詳細に説明する。しかしながら、本発明はそのような実施形態に限定されるものでなく、例えば当該技術分野で公知のオリゴヌクレオチドの固相合成法や多糖の固相合成法などを使用したり、あるいは、本発明の方法によりＤＯＴＡを導入されうる上述したような化合物を固相担体上に固定化するための公知の技術を利用することにより、当業者は以下の説明に基づいて、ＤＯＴＡが導入された所望の物質を得ることができることは明らかであろう。
　固相合成法によるペプチドの合成について以下に説明する。後述する縮合や保護基の脱離は、例えば、以下の(1)～(5)： 
　(1) M.BodanszkyおよびM.A.Ondetti, ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
　(2) SchroederおよびLuebke, ザ・ペプチド (The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
　(3) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)（1975年）
　(4) 矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学IV、205（1977年)
　(5) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店（1991年）
などに記載された方法に従って行うことができる。
　なお、本発明の方法においては、固相担体上で合成されたペプチドの、保護基の脱離および該固相担体からの切り出しは、後述するＤＯＴＡの導入後に行うことに留意すべきである。
　本発明の方法には、当該技術分野において通常用いられている任意のペプチド固相合成法を適用することができるが、Ｆｍｏｃ法およびＢｏｃ法が好ましく、Ｆｍｏｃ法がより好ましい。さらにＦｍｏｃ法の合成方法としては、樹脂とアミノ酸とを容器に入れて攪拌して反応させるバッチ法と、樹脂をカラムに詰めてアミノ酸を流して反応させる連続フロー法とがあり、いずれも用いることができるが、好適にはバッチ法を用いることができる。
　これら固相合成法において用いられる担体樹脂としては、あらかじめＣ末端アミノ酸誘導体が導入された形態で市販されている固相合成法用の担体樹脂であればいずれも好ましく使用できる。そのような担体樹脂については、例えば、Ｆｍｏｃ法に用いられる担体樹脂としてＷａｎｇ樹脂および２－クロロトリチル樹脂（以上バッチ法用）；ＫＡ樹脂およびＰＡ樹脂（以上連続フロー法用）；ＴＧＴ樹脂およびＴＧＡ樹脂（以上バッチ法および連続フロー法用）を挙げることができるが、これらに限定されない。また、Ｂｏｃ法に用いられる樹脂としては、メリフィールド樹脂およびＰＡＭ樹脂などを挙げることができるが、これらに限定されない。なお、上記に例示した担体樹脂についてはいずれも、合成しようとする任意のペプチドに適用できるように、種々のアミノ酸誘導体が導入されたものが、例えばカルビオケム－ノバビオケムジャパン（株）より入手可能である。このような樹脂を用い、α－アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させることにより、目的とするペプチドが担持された固相担体を得ることができる。
　なお、上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドなどが挙げられるが、好ましくはN-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt，HOOBt）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
　また、本発明の方法においては、保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いる溶媒は、通常ＤＭＳＯである。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約-20℃～50℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常1.5～4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
　ペプチドが担持された固相担体の作製が完了したら、上記第１のステップで得られた混合液を用いて、該ペプチドへＤＯＴＡを導入する工程を行う。
　当該工程のためには、例えば、化合物が担持された固相担体に対して上記ＤＭＳＯ懸濁液および、例えば、Ｎ－メチルピロリドンなどの固相担体を膨潤させるための溶媒やジイソプロピルアミンなどの反応促進剤を加え、適当な時間（例、１～２時間）、例えば室温で攪拌することにより縮合反応を行えばよい。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
　縮合工程が完了したら、反応後の固相担体をメタノールなどにより洗浄し、減圧乾燥する。
　目的とする化合物（ＤＯＴＡ－ペプチド・コンジュゲート）を得るためには、上記のようにして減圧乾燥した固相担体に対して、化合物中の保護基の除去および固相担体からの切り出しを行う必要がある。当該工程を行う方法は、ペプチド固相合成において使用したアミノ酸保護基の種類や、固相担体と化合物との結合様式に応じて、通常のペプチド固相合成法において行われる方法から適宜選択して行うことができる。そのようにして保護基が除去され切り出された目的とする化合物を、公知の精製法により単離精製すれば所望の化合物を得ることができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
　以上、特にＤＯＴＡ－ペプチド・コンジュゲートの取得方法について詳細に記載したが、当業者であれば、上記記載を参考にして、当該技術分野で周知の技術を利用してそれ以外の化合物種（例、ポリヌクレオチド、多糖など）にＤＯＴＡが導入された化合物を得ることが可能である。
　以下、実施例によって本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
　［実施例１］
　コハク酸イミド2mgと1-エチル3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド4mgをDMSO 2mLに溶解し、そこに1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸（DOTA） 8mgを加えて3時間室温で攪拌し活性化反応を行った。この工程により、懸濁液が得られた。
　Fmoc-Cys(Trt)-(2-Cl)トリチル樹脂300mg（0.52mmol/g）を出発原料にソマトスタチンを標準的なFmoc固相合成法により合成し、H-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)－Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-(2Cl)Trt樹脂を得た。
　そこに上記で得た懸濁液2mLとN-メチルピロリドン2mL、ジイソプロピルアミンを100μL加え、1時間室温で攪拌した。この反応を5回繰り返し行い、ニンヒドリン反応にて固相樹脂上に未反応のアミノ基がほぼないことを確認した。反応後の樹脂をメタノールで洗浄し、減圧乾燥した。
　乾燥した樹脂50mgをトリイソプロピルシラン10μL、エタンジチオール25μL、水25μL、トリフルオロ酢酸940μLを含む溶液で2時間室温にて処理し、脱保護および樹脂からの切り出しを行った。反応後、冷エーテル5mLで粗ペプチドを沈殿させ、その沈殿をアセトニトリル水溶液に溶かして逆相HPLCにて精製を行った。DOTA-ソマトスタチンを0.5mg合成することができた。
　DOTA-ソマトスタチンの同定には質量分析装置を用いて分子量が計算値と一致することを確認した。また得られたDOTA-ソマトスタチンにポジトロン放出金属核種68Gaが錯形成することでDOTAがキレート化剤として機能することを確かめた。またソマトスタチン受容体を高発現する腫瘍を有するネズミに、68Gaの錯体を形成したDOTA-ソマトスタチンを注射して、腫瘍からポジトロンが強く検出できたことからソマトスタチンとしての機能を有することを確かめた。
　［実施例２］
　以下のようにして、DOTA-QBP1 (polyQ-binding peptide 1)を合成した。
　NovaSyn（登録商標） TGA 樹脂370 mg (0.28 mmol/g) を出発原料に、そこにFmoc-Asp(OtBu)-OH 169 mg (0.41 mmol)、0.5M O-ベンゾトリアゾリル-N，N，N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HBTU) /DMF 0.82 mL(0.41 mmol)、0.5M 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt) /DMF 0.82 mL(0.41 mmol)、4-(ジメチルアミノ)ピリジン0.1 mg (0.8μmol)を加え室温で1時間攪拌した。反応後、無水安息香酸でキャッピングを行いFmoc-Asp(OtBu)- NovaSyn（登録商標） TGA 樹脂380 mg (0.24 mmol/g)を得た。
　Fmoc-Asp(OtBu)- NovaSyn（登録商標） TGA 樹脂113 mg (0.24 mmol/g)を出発原料に標準的なFmoc法にてH-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Trp-Lys(Boc)-Trp-Trp-Pro-Gly-Ile-Phe-Asp(OtBu)-NovaSyn（登録商標） TGA 樹脂を得た。次にコハク酸イミド 2 mgと1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド 4mgをDMSO 2 mLに溶解し、そこに1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸 (DOTA) 8mg を加えて3時間室温で攪拌し活性化反応を行った。得られた樹脂に上記の活性化反応液2 mLとN-メチルピロリドン2mL、ジイソプロピルアミンを100 μL加え1時間室温で攪拌した。この反応を5回繰り返し行い、ニンヒドリン反応にて固相樹脂上に未反応のアミノ基がほぼないことを確認した。反応後の樹脂をメタノールで洗浄し、減圧乾燥し樹脂160 mgを得た。
　乾燥した樹脂50 mgをトリイソプロピルシラン10 μL、エタンジチオール 25 μL、水25  μL、トリフルオロ酢酸940 μLを含む溶液で2時間室温にて処理し、脱保護および樹脂からの切り出しを行った。反応後、冷エーテル5 mLで粗ペプチドを沈殿させ、その沈殿をアセトニトリル水溶液に溶かして逆相HPLCにて精製を行った。質量分析、アミノ酸分析によりDOTA-QBP1と同定し、目的物を0.3 mg合成することができた。
　本発明の方法により、固相担体上の化合物（例、ペプチドなど）に、簡便かつ効率的にＤＯＴＡを導入することが可能となる。特に、本発明の方法では保護基を有さないＤＯＴＡを使用するため、保護基を有するＤＯＴＡを用いる従来法の場合と比べて、最終脱保護に要する時間が大幅に低減される。また、本発明の方法によれば、ペプチド合成における標準技術であるペプチド固相合成法（ＳＰＰＳ）により合成された固相担体上に担持されたペプチドにＤＯＴＡを簡便に導入することができるため、非常に実用的なＤＯＴＡ－ペプチド・コンジュゲート合成法を本発明は与えることができる。さらには、保護基を有さないＤＯＴＡは、保護基を有するＤＯＴＡと比較して非常に安価（約１／１０）であり、ＤＯＴＡ導入化合物の合成において大幅なコストダウンが実現できる。
　本出願は日本で出願された特願２００８－２６４５２０（出願日：２００８年１０月１０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (8)

　1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸（ＤＯＴＡ）を化合物に導入する方法であって、保護基を有さないＤＯＴＡとジメチルスルホキシドとの混合液を作製する第１のステップと、該混合液を、固相担体上に担持された化合物と接触させる第２のステップとを含む、方法。
　第１のステップが、活性化剤を用いてＤＯＴＡを活性化する処理を含む、請求項１記載の方法。
　化合物がペプチドまたはポリヌクレオチドである、請求項１または２記載の方法。
　化合物がペプチドである、請求項３記載の方法。
　ペプチドが抗体である、請求項４記載の方法。
　ペプチドが、ソマトスタチン、セクレチン、オクトレオチド、エクセナチドおよびＱＢＰ１の少なくともいずれか１つである、請求項４記載の方法。
　化合物が該固相担体上で合成されたものである、請求項３記載の方法。
　活性化剤が１－エチル－３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
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