WO2010029232A1 - Derives de metalloporphyrines, nanoparticules les comprenant et leur utilisation pour le traitement par therapie photodynamique - Google Patents

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WO2010029232A1
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PCT/FR2009/001090
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Inventor
David Brevet
Ouahiba Hocine
Jean-Olivier Durand
Philippe Maillard
Alain Morere
Marcel Garcia
Monique SMAÏHI
Magali Gary-Bobo
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique
Institut Curie
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the subject of the invention is nanovectors for simultaneously targeting, imaging and photodynamic therapy treatment of cancer cells.
  • it is based on the use of new molecules derived from porphyrins, silicon nanoparticles comprising them and their use in photodynamic therapy.
  • Photodynamic therapy is based on the use of certain therapeutic molecules called photosensitizers, which will preferentially localize in the malignant tissues, and which, when activated with a light source of the appropriate wavelength, in the visible or near infra-red domain, they transmit their energy in excess to the molecular oxygen surrounding them. This activation results in the formation of reactive oxygen species such as free radicals and singlet oxygen. These reactive oxygen species, and more particularly singlet oxygen, are toxic to the cells that surround them and cause the destruction of malignant tissues in their immediate environment: they oxidize the cell membranes and thus cause irreversible lesions of the cells containing the photosensitizer.
  • Photodynamic therapy is based on a double selectivity: firstly the selective irradiation of the tissues concerned and secondly the relative selectivity of the photosensitizer for the target tissues.
  • the photosensitizers being little toxic to the cells, their diffusion in the body causes only few disadvantages.
  • a photosensitizer to be used in vivo must have several qualities, and in particular, it must be easily vectorized to cancerous tissues, it must be water soluble, easy to produce, non-toxic in the absence of irradiation, stable vis- circulating enzymes, with a good tropism for tumor cells and must be removed quickly from healthy tissue.
  • most of the molecules belonging to the category of photosensitizers are hydrophobic and their introduction into the body, in particular parenterally, requires the use of particular formulations, including formulations in the form of colloidal suspensions, liposomes , nanoparticles. These formulations make it possible to stabilize the photosensitizers in an aqueous medium and to promote their transport to the target tissues, in particular by using specific targeting molecules.
  • T.Y. O'hulchanskyy et al., Nanolett. 2007, 2835 discloses nanostructures of a photosensitizer for photodynamic therapy, wherein the photosensitizer is covalently bound to organic modified silica nanoparticles (ORMOSIL).
  • ORMOSIL organic modified silica nanoparticles
  • the photosensitizer retains its spectroscopic and functional properties, the nanoparticles of small size, monodisperse, have a good affinity for the cancerous cells and have a high cytotoxic efficiency.
  • the photosensitizers used are hydrophobic, which makes it necessary to synthesize in an organic medium, with solvents whose industry today seeks to avoid large-scale use.
  • US2007 / 0218049 discloses luminescent nanoparticles to which photosensitisers of the porphyrin family are attached.
  • the nanoparticles described in this document are solid and non-porous, they are based on metal molecules such as CdS, CdSe, ZnO, and the photosensitizer is grafted on the surface of these nanoparticles by a cysteine bond.
  • Such nanoparticles have been prepared by the development of new phosensitizers of formula (I) below.
  • the invention therefore firstly relates to a molecule corresponding to formula (I) below: in which: x represents an integer chosen from: 0 and 1,
  • M represents a metal atom chosen from transition metals
  • X represents a group chosen from: a halide, an anion of a pharmaceutically acceptable carboxylic acid,
  • R represents a group chosen from: a C 1 -C 15 alkyl chain, optionally interrupted by one or more groups chosen from: an ether (-O-), an amine (-NH-), a thioether (- S-) a ketone (-CO-), an ester (-CO-O-), an amide (-CO-NH-), a urea (-NH-CO-NH-), a thiourea (-NH-CS-NH -), an oxycarbonyl (-O-CO-O-), a carbamate (-NH-CO-O-),
  • R ' represents a group chosen from: a C 1 -C 6 alkyl, a phenyl, a benzyl,
  • R '' represents a group chosen from: and Z represents a pharmaceutically acceptable organic or inorganic cation
  • Y " represents a group which can be chosen from: -COO " , -SO 3 "
  • a " represents an anion which may be selected from: a halide, an anion of a pharmaceutically acceptable carboxylic acid,
  • R 1 represents a C 1 -C JO -
  • An alkyl group Ci-C] 0 is a hydrogénocarbonée chain, linear, branched or cyclic having 1 to 10 carbon atoms.
  • x represents 0, the compound of formula (I) is a porphyrin derivative and the groups (MX) are replaced by two hydrogen atoms.
  • M represents a metal atom selected from: Zn, Pt, Pd, Mn, Gd, Ni, Cr, Ru.
  • X represents a group chosen from: Cl “ , Br “ , I “ , acetate, propionate, butyrate, ascorbate, benzoate, cinnamate, citrate, fumarate, glycolate, malonate, tartrate, malate, maleate, mandelate, tosylate, and even more preferably: Cl “ , Br “ , I “ , acetate, tosylate.
  • R represents a group chosen from: a C 1 -C 10 alkyl chain, optionally interrupted by one or more groups chosen from: an ether (-O-), an amine (-NH-), a thioether (-S- ), a ketone (-CO-), an ester (-CO-O-), an amide (-CO-NH-), a urea (-NH-CO-NH-), a thiourea (-NH-
  • R may be chosen from:
  • R ' represents a group chosen from: a C 1 -C 3 alkyl, for example a methyl, an ethyl, an n-propyl, an isopropyl, and preferably a methyl or an ethyl.
  • R 1 represents a group chosen from: a C 1 -C 3 alkyl, for example a methyl, an ethyl, an n-propyl or an isopropyl, and even more advantageously a methyl.
  • Z + represents a cation which may be chosen from: K + , Li + , Na + , NH 4 + .
  • a " represents an anion which can be chosen from: Cl “ , Br “ , I “ , acetate, propionate, butyrate, ascorbate, benzoate, cinnamate, citrate, fumarate, glycolate, malonate, tartrate, malate, maleate, mandelate, tosylate, and even more preferably.
  • the preferred porphyrins (I) belong to the following list:
  • the molecules of formula (I) are water-soluble photosensitizers having a good ability to convert the surrounding molecular oxygen into reactive oxygen species. Because of their water solubility they can be easily formulated in silicon nanoparticles to which they are covalently bound. And the synthesis of these nanoparticles can be carried out in essentially aqueous medium. among:
  • R represents a group chosen from a C 1 -C 15 alkyl chain, optionally interrupted by one or more groups chosen from: an ether (-O-), an amine (-NH-), a thioether (S-), a ketone (-CO-), an ester (-CO-O-), an amide (-CO-NH-), a urea (-NH-CO-NH-), a thiourea (-NH-CS-NH- ), an oxycarbonyl (-O-CO-O-), a carbamate (-NH-CO-O-), then the molecules of formula (I) can be prepared by a process as described in scheme 1 below wherein a porphyrin carrying an amine (II) function is reacted with an isocyanatotrialcoxysilane (or isothiocyanatoalkoxysilane) compound when R is NH-CS-NHR 2 :
  • R represents a group -NH-R 2 - or -OR 2 - and R 2 represents a group chosen from a C 1 -C 5 alkyl chain, optionally interrupted by one or more groups chosen from: an ether (-O -), an amine (-NH-), a thioether (S-), a ketone (-CO-), an ester (-CO-O-), an amide (-CO-NH-), a urea (- NH-CO-NH-), a thiourea (-NH-CS-NH-), an oxycarbonyl (-O-CO-O-), a carbamate (-NH-CO-O-), one can carry out a coupling of type SN2, as illustrated respectively in Figure 4 and Figure 5.
  • R represents a group -O-CO-NH-R - and R represents a group chosen from a C 1 -C 15 alkyl chain, optionally interrupted by one or more groups chosen from: an ether (-O-), a amine (-NH-), a thioether (S-), a ketone (-CO-), an ester (-CO-O-), an amide (-CO-NH-), a urea (-NH-CO- NH-), a thiourea (-NH-CS-NH-), an oxycarbonyl (-O-CO-O-), a carbamate (-NH-CO-O-), a carbamate bond can be formed by following the method illustrated in Figure 6:
  • porphyrins of formula (I) For the preparation of porphyrins of formula (I), the following starting molecules may be employed:
  • Cationic porphyrins bearing a phenyl-CO 2 H group are described in: H. Yamaguchi et al., Chem. Eur. J., 2004, 10, 6179. Porphyrins anionic compounds bearing a -CO 2 H group are described in: US 4783529. Anionic porphyrins carrying a hydroxyphenyl group are described in: EP 891977.
  • a porphyrin-type compound is used as starting material
  • the invention also relates to nanoparticle compositions comprising at least one photosensitizer corresponding to formula (I) above. These nanoparticles are advantageously of organized porosity.
  • nanoparticle with organized porosity means nanoparticles whose pores are geometrically distributed in a regular pattern in the three dimensions of space.
  • organized porosity there may be mentioned a honeycomb structure.
  • the structured nature of the porosity can be observed in different ways:
  • the nanoparticles with an organized porosity have an X-ray diffraction spectrum.
  • the nitrogen desorption adsorption (BET) method also makes it possible to characterize a structured porosity.
  • certain molecules of formula (I) comprise a paramagnetic metal cation (M in porphyrin) which makes it possible to follow the distribution of the nanoparticles in the body by NMR and IRJV1. The fact that these labeling molecules are in an organized structure, with controlled porosity, facilitates image analysis.
  • the nanoparticles of the invention are based on silica.
  • the manufacture of these nanoparticles comprises a step of polymerizing a silicon precursor under conditions permitting the covalent grafting of the photosensitizer (I) and the formation of an organized porosity network.
  • mesoporous silica nanoparticles formed by polymerization of a silicon precursor in the presence of surfactants.
  • Mesoporous silica nanoparticles have the advantage of having a high specific surface, volume and controlled size pores.
  • the nanoparticles of the invention are advantageously monodisperse.
  • the mesoporous silica nanoparticles with controlled porosity of the invention have a particle size ranging from 80 to 400 nm in diameter, a specific surface ranging from 800 to 1000 m 2 / g and pores with a size ranging from 2 to 6 nm. These nanoparticles are advantageously of the MCM41 type.
  • the process for producing the nanoparticles of the invention is characterized in that the tetraethoxysilane is polymerized in basic aqueous solution in the presence of a surfactant such as cetyltrimethylammonium bromide and in the presence of the molecule of formula (I) .
  • a surfactant such as cetyltrimethylammonium bromide
  • it is chosen to manufacture microporous silica nanoparticles.
  • the microporous nanoparticles of the invention are of the silicalite type and are synthesized in a basic medium in the presence of the molecule of formula (I) 3 of tetraethoxysilane and of a structuring agent of quaternary ammonium type (such as, for example, tetrapropylammonium hydroxide).
  • the nanoparticles of the invention are advantageously monodisperse.
  • the nanoparticles of the invention are then microporous with a diameter of between 30 and 80 nm, a specific surface ranging from 100 to 450 m 2 / g and pore diameters ranging from 2 to 20 ⁇ .
  • the nanoparticles of the invention are grafted onto their surface by targeting molecules specific for neoplastic tissues, that is to say biomolecules whose receptors are overexpressed by the cancer cells, or on the surface of the cancerous cells.
  • targeting molecules facilitate the transfer of the nanoparticles to their biological target.
  • these targeting molecules can be chosen from: folic acid, peptides, carbohydrates. They can be grafted onto the nanoparticles of the invention via a polymeric linker as illustrated in FIG. 4.
  • the targeting molecules that can be grafted onto the nanoparticles of the invention mention may be made of:
  • Mannose which can be grafted onto silicon nanoparticles using a polyethyleneimine linker or polyethylene glycol PEG.
  • the grafting of mannose on mesoporous silica nanoparticles is described in particular in I. Young Park et al., International Journal of Pharmaceutics, 359, 2008, 280-287, and the same procedures can be employed.
  • Another way is to use phenylsquarate- ⁇ -mannose as shown in FIG.
  • peptides such as hormonal target peptides (LH-RH).
  • glycodendrimers bearing several monosaccharide or disaccharide derivatives such as mannose, mannose-6-phosphate, glucose, galactose, etc.
  • Methods for grafting silica-based microporous nanoparticles by biomolecules have been described in particular in T. Doussineau et al., Eur. J. Inorg. Chem. 2006, 2766-2772 and the same procedures can be used.
  • the invention also relates to a method of manufacturing a medicament for the treatment and / or prevention and / or detection of tumors comprising the step of manufacturing the nanoparticles described above.
  • the production of singlet oxygen and thus the destruction of the cancerous cells is induced by photon excitation: After irradiation of the nanoparticles by a light source, the singlet oxygen generated makes it possible to destroy the tumor cells.
  • the irradiation is carried out at a wavelength of between 630 nm and 680 nm at a power ranging from 2 to 10 mW / cm 2 .
  • the results obtained show that the synthesized nanoparticles are effective for generating singlet oxygen in solution with a yield ranging between 30 and 90%.
  • These nanoparticles must allow a vectorization of the active agents and their endocytosis in the tumor cells after functionalization on the surface by biomolecules.
  • retinoblastoma Y-79 cell lines
  • colon cancer HT29 cell lines
  • epidermis A 431
  • the lung A 549
  • breast MDA-MB-231, MCF-7
  • the cervix HeLa
  • solid tumors that includes, but is not limited to, cancers of the neck and head, digestive and sexual cancers, and any benign or cancerous tumor that can be illuminated.
  • the cell lines are irradiated in one of the absorption bands of the photosensitizer, and the efficiency of the nanoparticles is evaluated by MTT test.
  • the nanoparticle compositions of the invention may be administered locally or systemically. Local administration can be carried out in particular by injection of the nanoparticle composition near the tumor zone. In the case of superficial tumors, the nanoparticle compositions may be administered topically, in a suitable dosage form (solution, suspension, paste, patch). General administration may be performed intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intraperitoneally or rectally. Such formulations and their mode of implementation are well known to those skilled in the art.
  • the dosage of the active ingredient of faith-mule (I) is adapted according to the weight and the age of the patient, the nature, the location and the stage of development of the tumor, the chosen route of administration and the irradiation dose used.
  • the composition may comprise any other known active ingredient for the treatment of tumors and / or their symptoms. It comprises the conventional components of the galenic adapted to the mode of administration chosen.
  • the subject of the invention is also the nanoparticles described above for their use as medicaments, in particular for the prevention and / or treatment of tumors and cancers.
  • Figure 1 X-ray diffractogram of silicalite nanoparticles encapsulating anionic porphyrin.
  • Figure 2 TEM image of a mesoporous nanoparticle with organized porosity.
  • Figure 3 UV spectrum of nanoparticles DBO 15 (NP-PS), DBOl 6
  • NP-Mannose NP-Mannose
  • Sq-Mannose arylsquarate- ⁇ -mannose
  • FIG. 4 Nanoparticles of the Invention Grafted by Targeting Molecules
  • FIG. 5 Example of Mannose-Functionalized Nanoparticles
  • FIGS. 6 to 14 Biological Results on the Cytotoxic Efficacy of Different Nanoparticles Encapsulating Photosensitizers on Breast Cancer (MDA-MB-231) and Ovarian Cell Lines (POE14) ), prostate (LNCaP) and retinoblastoma (Y-79) after single-photon excitation.
  • Porphyrin 4 is prepared from aldehyde 3 (6.2 g, 20 mmol) and 4-pyridinecarboxaldehyde (6.4 g, 60 mmol) which are dissolved in boiling propionic acid (400 mL). Then the pyrrole (5.36 g, 80 mmol) is added dropwise. Reflux is maintained for 2 hours. The solution is evaporated under vacuum. A first purification by chromatography on silica gel eluted with a mixture CH 2 Cl 2 ZEtOH (100/5, v / v) is carried out in order to eliminate a maximum of impurities. A second, eluted with CH 2 Cl 2 then a growing amount of ethanol (0 to 10%) allows the separation of the six porphyrins.
  • the 5,10,15-tripyridyl-20-phenylporphyrin 4 is eluted (third fraction) with a CH 2 Cl 2 / EtOH mixture (94/6, v / v) and is obtained after crystallization, with a dichloromethane / methanol mixture, in the form of blue crystals (yield: 5.7%).
  • UV-vis spectrum in CH 2 Cl 2 ⁇ ma ⁇ , nm (OD): 418.5 (1), 514.5 (0.61), 549
  • Porphyrin 7 (68 mg, 0.08 mmol) and methyl iodide (1 mL) are dissolved in dimethyl formamide (20 mL) and stirred at room temperature for three hours. The solution is concentrated under vacuum and then diluted with methanol (10 mL). The IRA 400 resin (0.9 g) is added to the solution and the suspension is stirred gently for 1 hour 30 minutes. The solution is filtered and then evaporated. The pure compound is obtained in the form of a blue powder after crystallization from a methanol / diethyl ether mixture (80 mg, yield: 100%). UV-vis spectrum in MeOH: ⁇ ma ⁇ , nm ( ⁇ L.mmor'.cm "1): 427 (98.3), 518 (12), 557 (6.1) 593 (4.1), 652 (2,5).
  • DB 003 5 mg of porphyrin 9 (5.44 ⁇ 10 -3 mmol) are dissolved in 1 ml of EtOH per passage for 15 minutes under ultrasound, 5 equivalents (2.72 ⁇ 10 -2 mmol) of isocyanatopropyltriethoxysilane are added as well. 4 equivalents (2.17 10 -2 mmol) of diisopropylethylamine The solution is kept at room temperature for 12 hours.
  • CTL cetyltrimethylammonium bromide
  • the surfactant is extracted by treatment with 30 ml of 12N EtOH / HCl solution (4/1) for 2 hours at 60 ° C. After centrifugation, the operation is repeated twice, then the nanoparticles resuspended in water and centrifuged. until a neutral pH (5 times).
  • the surfactant can be removed by ammonium nitrate treatment (Chem Mater, 2004, 10, 1961): 300 mg of NH 4 NO 3 are dissolved in 150 ml of 95% EtOH. 500 mg of nanoparticles are suspended in this solution and sonicated for 15 minutes, then the solution is placed at 60 ° C for 15 min. The suspension is recovered by centrifugation, redispersed to ultrasound in EtOH, centrifuged. The extraction protocol of the surfactant is repeated once.
  • TEM Transmission electron microscopy
  • the quasi-elastic light scattering (DLS) confirms the hydrodynamic diameter of 150 nm.
  • UV V visible absorption spectroscopy analysis known as UV analysis
  • the capacity of the nanoparticles to generate singlet oxygen is evaluated by phosphorescence thereof after irradiation in one of the absorption bands of the photosensitizer and in particular at 421 nm of 3 mg of nanoparticles in 5 ml of absolute EtOH.
  • the quantum yield of singlet oxygen formation is 92%.
  • TEM Transmission electron microscopy
  • the quasi-elastic light scattering (DLS) confirms the hydrodynamic diameter of 200 nm.
  • BET indicates a surface area of 891 m 2 / g and a pore diameter of 2 nm.
  • the capacity of the nanoparticles to generate singlet oxygen is evaluated by phosphorescence thereof after irradiation in one of the absorption bands of the photosensitizer and in particular at 421 nm of 3 mg of nanoparticles in 5 ml of absolute EtOH.
  • the quantum yield of singlet oxygen formation is 32%.
  • nanoparticles are washed with EtOH (ultrasound + centrifugation) and then washed with Soxhlet EtOH for 20 h.
  • EtOH ultrasound + centrifugation
  • Soxhlet EtOH Soxhlet EtOH
  • the amino functions are characterized by a qualitative ninhydrin test.
  • UV analysis indicates that porphyrin is still present and has not been altered during the reaction.
  • the BET indicates that the specific surface area has decreased to 481 m 2 / g, due to the presence of aminopropyl groups on the surface of the nanoparticles but also in the pores.
  • the APTS assay is carried out by microanalysis and solid-state NMR. An amine charge of 2.2 mmol / g is obtained. The same procedure is used to synthesize the nanoparticles DB 019 from the nanoparticles DB 005,
  • porphyrin 9 4 mg are dissolved in 1 ml of EtOH per passage for 15 minutes with ultrasound, 5 equivalents (4.5 ⁇ l) of isocyanatopropyltriethoxysilane are added, and 4 equivalents (3, 04 ⁇ L) of diisopropylethylamine.
  • the solution is kept at ambient temperature for 12 h, then 14 ml of 1 M tetrapropylammonium hydroxide in water, 8.4 ml of TEOS and 2 ml of water are added and the reaction is kept at room temperature for 24 hours. .
  • the solution is then put in an oven at 80 ° C. without stirring for 48 hours.
  • the solution is centrifuged 3 times 20 minutes at 20000 rpm.
  • the nanoparticles are then redispersed in water and centrifuged.
  • the extraction of the structuring agent is carried out with a 12N EtOH / HCl solution (4/1) for 2 h at 60 ° C. Two cycles are carried out.
  • the nanoparticles are then washed with H 2 O 6 times (6 cycles in water dispersion with ultrasound centrifugation) until a pH of 3.5 is obtained.
  • the nanoparticles are then washed twice with EtOH.
  • the nanoparticles are analyzed by X-rays on powders and the analysis shows the presence of a structured network characteristic of zeolites (figure
  • DLS gives a hydrodynamic radius of 68 nm.
  • BET gives a specific surface area of 300 m 2 / g.
  • the capacity of the nanoparticles to generate singlet oxygen is evaluated by phosphorescence thereof after irradiation in one of the photosensitizer absorption bands and in particular at 421 nm of 3 mg of nanoparticles in 5 mL of absolute EtOH .
  • the quantum yield of singlet oxygen formation is 31%.
  • porphyrin 10 4.9 mg are dissolved in 1 mL of absolute EtOH ultrasound. 2 ⁇ l of aminopropyltriethoxysilane are added and the reaction is maintained at room temperature overnight. In a polyethylene bottle the previous reaction is dissolved with vigorous stirring with 14 ml of 1M tetrapropylammonium hydroxide in water, 8.4 ml of tetraethoxysilane and 2 ml of H 2 O. The solution is stirred for 24 hours at room temperature. room temperature and is then placed in an oven at 80 ° C. without stirring. After two days the reaction is cooled and centrifuged. The nanoparticles are redispersed in the water with ultrasound then centrifuged (3 cycles).
  • the extraction of the structuring agent is carried out with a 12N EtOH / HCl solution (4/1) for 2 h at 60 ° C. Two cycles are performed. The nanoparticles are then washed with H 2 O 6 times (6 cycles: dispersion in water with ultrasound - centrifugation) until a pH of 3.5 is obtained. The nanoparticles are then washed twice with EtOH.
  • the solution is kept stirring for 6 minutes and then rapidly neutralized to pH 7 by the addition of 0.2M HCl (approximately 25 mL).
  • the nanoparticles are recovered by centrifugation (20 minutes at 20000 rpm), resuspended in EtOH by ultrasound, centrifuged.
  • the surfactant is extracted by treatment with 15 ml of 12N EtOH / HCl solution (4/1) for 2 h at 60 ° C. After centrifugation, the operation is repeated twice, then the nanoparticles are resuspended in water and centrifuged until a pH of about 6 (6 times).
  • the TEM shows the presence of a hexagonal network of mesopores with a nanoparticle diameter of the order of 150 nm.
  • the DLS shows a hydrodynamic diameter of 311 nm.
  • UV analysis confirms the presence of the covalently encapsulated porphyrin. A charge of 4.43 ⁇ mol of porphyrin per g of nanoparticles is obtained.
  • the capacity of the nanoparticles to generate singlet oxygen is evaluated by phosphorescence thereof after irradiation in one of the absorption bands of the photosensitizer and in particular at 431 nm of 3 mg of nanoparticles in 5 mL of absolute EtOH. .
  • the quantum yield of singlet oxygen formation is 58%
  • Tetraethoxysilane (1.75 mL, 0.8 ⁇ 10 -2 mmol) is dissolved in The mixture is added dropwise as well as the previously prepared solution After 40 seconds, 128 ml of deionized water are added, the solution is kept stirring for 6 minutes and then rapidly neutralized to pH 7 by the addition of 0.2M HCl (approximately 25 mL)
  • the nanoparticles are recovered by centrifugation (20 minutes at 20000 rpm), resuspended in EtOH by ultrasound and centrifuged
  • the surfactant is extracted by treatment with 15 mL of 12N EtOH / HCl solution (4/1) for 2 hours at 60 ° C. After centrifugation, the operation is repeated twice, then the nanoparticles are resuspended in water and centrifuged until a pH of about 6 (6 times) is obtained.
  • TEM ( Figure 2) shows the presence of a hexagonal network of mesopores with a nanoparticle diameter of the order of 150 nm.
  • the DLS confirms the hydrodynamic diameter of 153 nm.
  • UV analysis confirms the presence of the covalently encapsulated porphyrin. 0.97 ⁇ mol of porphyrin per g of nanoparticles is obtained.
  • the capacity of the nanoparticles to generate singlet oxygen is evaluated by phosphorescence thereof after irradiation in one of the absorption bands of the photosensitizer and in particular at 431 nm of 3 mg of nanoparticles in 5 mL of absolute EtOH. .
  • the quantum yield of singlet oxygen formation is 60%
  • DB 015 amino nanoparticles prepared in ⁇ B above are ultrasonically dispersed for 10 minutes in 5 mL of EtOH.
  • 59 mg (0.15 mmol) of ⁇ -mannose aryl squarate are dissolved in 5 mL of EtOH-H 2 O (50-50).
  • the solution is added to the previous drop by drop.
  • 500 ⁇ l of triethylamine are added and the suspension is stirred for 18h.
  • the nanoparticles are redispersed in water and centrifuged (3 cycles). Then they are redispersed in EtOH and centrifuged (two cycles). DLS analysis indicates a hydrodynamic diameter of 173 nm.
  • HO 2 C-PEG-OH are dissolved in 10 mL of DMF. 21 ⁇ l of Et 3 N, 15 mg of NHS (N-hydroxysuccinimide) 30 mg of DCC (dicyclohexylcarbodiimide) are added. The reaction is maintained overnight at room temperature, then 200 mg of nanoparticles DB 019 are added. After 20 h, the solution is centrifuged, the nanoparticles resuspended in DMF ultrasound then the solution is centrifuged again. The DMF wash is repeated once, then the nanoparticles are washed three times with water, twice with EtOH.
  • amino-nanoparticles DB 015 are redispersed under ultrasound for 10 minutes in 5 mL of EtOH.
  • 25 mg (0.055 mmol) of ⁇ -mannose-6-carboxylate squarate are dissolved in 5 mL of EtOH-H 2 O (3/2).
  • the solution is added to the previous drop by drop.
  • 400 ⁇ l of triethylamine are added and the suspension stirred for 17 h. After centrifugation the nanoparticles are redispersed in water and centrifuged (3 cycles), then redispersed in EtOH and centrifuged (three cycles).
  • Example 1 PDT Activity of OH21 Nanoparticles on MDA-MB-231 Breast Cancer Cells (FIG. 6) Experimental Conditions: MDA-MB-Breast Cancer Cells
  • MDA-MB-231 breast cancer cells with phagocytosis capacities are incubated for 24 hours with 20 ⁇ g / ml of nanoparticles and irradiated for 40 minutes with a laser at 650 nm (power 2 to 10 mW / cm). Two days after irradiation, the living cells are quantified by the enzymatic test of MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma).
  • the efficacy of photodynamic therapy is 92% inhibition of cell growth.
  • the lack of toxicity of non-irradiated nanoparticles and irradiation in the absence of nanoparticles demonstrate the specificity of photodynamic therapy with these nanoparticles.
  • the cells are visualized by fluorescent staining of the DAPI nuclei.
  • the images obtained show the specificity of the photodynamic therapy using the nanoparticles of the invention. Cell death is evident and exclusive in the irradiated area and in the presence of nanoparticles.
  • Example 2 PDT activity of OH21 nanoparticles on ovarian cancer cells POE14 ( Figure 7).
  • the POE 14 cells are maintained in culture as described in Example 1, incubated for 24 h with a reduced nanoparticle concentration of 10 ⁇ g / ml and irradiated as described in Example 1. Two days after irradiation, addition in the medium of MTT makes it possible to quantify the number of living cells.
  • Example 3 PDT activity of cationic nanoparticles OH21, OH22 and anionic DB003, DB005 on MDA-MB-231 breast cancer cells (FIG. 8).
  • FIG. 8 shows that all of the irradiated nanoparticles tested completely inhibit the growth of MD A-MB-231 cells compared to the TO value which corresponds to the initial cell seeding before irradiation.
  • the irradiations of the OH21 and OH22 nanoparticles which contain cationic porphyrins induce a cell death of 51.3% and 57.2% respectively compared to the control (untreated cells).
  • nanoparticles DB003 and DB005 containing anionic porphyrins induce after irradiation a cell death of 37.1% and 54% respectively.
  • the (low but significant) cytotoxicity of some non-irradiated nanoparticles demonstrates the benefits of specific targeting from mannose.
  • Example 4 PDT activity of anionic nanoparticles functionalized by mannose on MDA-MB-231 breast cancer cells (FIG. 9).
  • the cells are incubated for 6 hours in medium supplemented or not with mannose (10 ⁇ 2 M), in the presence or absence of 20 ⁇ g / ml of nanoparticles (DB021 or DB005). After 6 h of incubation, the nanoparticles of the medium are removed and the cells are rinsed twice and then cultured in 100 .mu.l of fresh medium. The cells are then subjected to laser irradiation with a wavelength of 630-680 nm, with a power of 2 to 10 mW / cm 2 , for 40 min. 48 hours after irradiation, the living cells are highlighted (A) and quantified (B) by the MTT.
  • Figure 10A shows the control level of MTT accumulation in untreated cells. Incubation of the cells with nanoparticles DB021 and subjected to irradiation leads to cell death. This phenomenon is blocked by preincubation with excess mannose. The irradiated DB005 nanoparticles do not induce cell death. Quantification of living cells ( Figure 10B) confirms these observations. The cytotoxicity due to nanoparticles DB021 incubated for 6 hours is only 2 to 10% ( ⁇ mannose) while the irradiation of nanoparticles DB021 induces 70% of cell death. The addition of an excess of mannose largely stops this effect which demonstrates the specificity of internalisation. On the other hand, irradiated or non irradiated DB005 nanoparticles induce only 5 to 10% of cell death.
  • Example 6 PDT activity of silicalite nanoparticles DB008 and DB011 on MDA-MB-231 breast cancer cells (FIG. 11).
  • Example 7 PDT activity of DB054 nanoparticles on LNCaP prostate cancer cells: specificity of internalization of DB054 (FIG. 12).
  • Experimental Conditions Human prostate cancer cells (LNCaP) are incubated for 1 hour with DB054 nanoparticles in a serum-free medium at 37 ° C, in the presence or absence of an excess of M6P and then subjected to laser irradiation (660 nm, 6-7 mW / cm 2 , 40 min). The percentage of living cells is determined using the MTS (Promega) test. The graphical representations correspond to the average of 3 independent experiments.
  • results show that DB054 nanoparticles induce a 47% cell death after one hour of treatment. This effect is blocked by the addition in the medium of an excess of 10 mM M6P, which demonstrates an internalisation of the nanoparticles DB054 by the membrane receptor of M6P.
  • Example 8 PDT activity of nanoparticles DB054 on prostate cancer cells
  • LNCaP variation in the time efficiency of DB054 (FIG. 13).
  • DB054 induce respectively 47%, 96% and 100% of cytotoxicity after 1 hour, 3 hours and 24 hours of treatment. These results highlight the speed of action of nanoparticles.
  • Example 9 PDT activity of nanoparticles DB016 and DB054 on human retinoblastoma cells (FIG. 14).
  • Human retinoblastoma cells (Y-79) are incubated for 1 h with nanoparticles DB054 or BOD 16 in complete medium at 37 ° C and then subjected to laser irradiation (660 nm, 6-7 mW / cm 2 , 40 min). The percentage of living cells is determined using the MTS (Promega) test.
  • DB054 and DB016 induce respectively 33% and 38% of cellular cytotoxicity. This demonstrates that nanoparticles functionalized by mannose-6-phosphotate or mannose can be efficiently internalized via different lectins on the surface of Y-79 cells.

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Abstract

Nanovecteurs permettant simultanément de réaliser le ciblage, l'imagerie et le traitement par thérapie photodynamique de cellules cancéreuses. Nouvelles molécules (I) dérivées de porphyrines, nanoparticules siliciées les comprenant et leur utilisation en thérapie photodynamique.

Description

DERIVES DE METALLOPORPHYRINES , NANOPARTICULES LES COMPRENANT ET LEUR UTILISATION POUR LE TRAITEMENT PAR THERAPIE PHOTODYNAMIQUE
L'invention a pour objet des nanovecteurs permettant simultanément de réaliser le ciblage, l'imagerie et le traitement par thérapie photodynamique de cellules cancéreuses. En particulier elle se fonde sur l'utilisation de nouvelles molécules dérivées de porphyrines, des nanoparticules siliciées les comprenant et leur utilisation en thérapie photodynamique.
La thérapie photodynamique se fonde sur l'utilisation de certaines molécules thérapeutiques appelées photosensibilisateurs, qui vont préférentiellement se localiser dans les tissus malins, et qui, lorsqu'elles sont activées à l'aide d'une source lumineuse de longueur d'onde appropriée, dans le domaine du visible ou du proche infra-rouge, transmettent leur énergie en excès à l'oxygène moléculaire les environnant. Cette activation entraîne la formation d'espèces oxygénées réactives telles que des radicaux libres et de l'oxygène singulet. Ces espèces oxygénées réactives, et plus particulièrement l'oxygène singulet, sont toxiques pour les cellules qui les entourent et entraînent la destruction des tissus malins dans leur proche environnement : elles oxydent les membranes cellulaires et entraînent ainsi des lésions irréversibles des cellules contenant le photosensibilisateur. La thérapie photodynamique se fonde sur une double sélectivité : en premier lieu l'irradiation sélective des tissus concernés et en second lieu la sélectivité relative du photosensibiîisateur pour les tissus cibles. En l'absence d'irradiation, les photosensibilisateurs étant peu toxiques pour les cellules, leur diffusion dans l'organisme n'entraîne que peu d'inconvénients.
Un photosensibilisateur, pour pouvoir être employé in vivo doit posséder plusieurs qualités, et notamment, il doit pouvoir être facilement vectorisé vers les tissus cancéreux, il doit être hydrosoluble, facile à produire, non toxique en l'absence d'irradiation, stable vis-à-vis des enzymes circulantes, présentant un bon tropisme pour les cellules tumorales et il doit être éliminé rapidement des tissus sains. Toutefois, la plupart des molécules appartenant à la catégorie des photosensibilisateurs sont hydrophobes et leur introduction dans l'organisme, en particulier par voie parentérale, nécessite d'avoir recours à des formulations particulières, et notamment des formulations sous forme de suspensions colloïdales, de liposomes, de nanoparticules. Ces formulations permettent de stabiliser les photosensibilisateurs en milieu aqueux et de favoriser leur acheminement vers les tissus cibles, en particulier en utilisant des molécules de ciblage spécifiques. Une autre contrainte de ces formulations est de pouvoir conserver l'efficacité des photosensibilisateiirs, c'est-à-dire leur capacité à transformer l'oxygène moléculaire qui les entoure en espèces oxygénées réactives. En effet, certaines formulations interagissent avec les états excités du photosensibilisateur et réduisent son efficacité.
La formulation des photosensibilisateurs dans des nanoparticules mésoporeuses à porosité contrôlée est apparue comme une voie prometteuse pour l'application en thérapie photodynamique : de telles formulations sont décrites notamment dans WO2004/067508 ; WO2008/030624 ; I. Roy et al., J. Am. Chem. Soc.
2003, 125, 7860-7865.
Toutefois, ces formulations entraînent bien souvent le relargage prématuré du photosensibilisateur dans l'organisme avant qu'il ne soit parvenu à sa cible.
Il est donc apparu nécessaire de trouver des moyens pour éviter ce relargage prématuré et une solution proposée a été d'élaborer des nanoparticules auxquelles le photosensibilisateur est lié de façon covalente.
Le document T.Y.Ohulchanskyy et al, Nanolett. 2007, 2835 décrit des nanoformulations d'un photosensibilisateur pour la thérapie photodynamique, dans lesquelles le photosensibilisateur est lié de façon covalente à des nanoparticules de silice modifiées organiques (ORMOSIL). Le photosensibilisateur conserve ses propriétés spectroscopiques et fonctionnelles, les nanoparticules de petite taille, monodisperses, ont une bonne affinité pour les cellules cancéreuses et ont une efficacité cytotoxique élevée. Les photosensibilisateurs utilisés sont hydrophobes, ce qui contraint à faire la synthèse en milieu organique, avec des solvants dont l'industrie cherche aujourd'hui à éviter l'emploi à grande échelle.
Le document US2007/0218049 décrit des nanoparticules luminescentes auxquelles sont attachés des photosensibiîisateurs de la famille des porphyrines. Les nanoparticules décrites dans ce document sont pleines et non poreuses, elles sont à base de molécules métalliques telles que CdS, CdSe, ZnO, et le photosensibilisateur est greffé en surface de ces nanoparticules par un lien cystéine.
Il subsistait donc le besoin de nouvelles nanoparticules à porosité contrôlée auxquelles soient liés de façon covalente des photo sensibilisateurs, dans lesquelles ce dernier conserve ses propriétés spectroscopiques et fonctionnelles, ces nanoparticules pouvant être préparées par des méthodes simples et ne faisant pas appel à des composés toxiques et/ou polluants.
De telles nanoparticules ont pu être préparées grâce à la mise au point de nouveaux phosensibilisateurs répondant à la formule (I) ci-dessous. L'invention a donc pour premier objet une molécule répondant à la formule (I) ci-dessous :
Figure imgf000005_0001
dans laquelle : x représente un entier choisi parmi : 0 et 1,
M représente un atome de métal choisi parmi les métaux de transition,
X représente un groupement choisi parmi : un halogénure, un anion d'un acide carboxylique pharmaceutiquement acceptable,
R représente un groupement choisi parmi : une chaîne alkyle en C1-C15, éventuellement interrompue par un ou plusieurs groupements choisis parmi : un éther (-O-), une aminé (-NH-), un thioéther (- S-), une cétone (-CO-), un ester (-CO-O-), un amide (-C0-NH-), une urée (-NH-CO- NH-), une thiourée (-NH-CS-NH-), un oxycarbonyl (-O-CO-O-), un carbamate (-NH- CO-O-),
R' représente un groupement choisi parmi : un alkyle en C]-C6, un phényle, un benzyle,
R' ' représente un groupement choisi parmi :
Figure imgf000005_0002
et Z représente un cation organique ou minéral pharmaceutiquement acceptable,
Y" représente un groupement qui peut être choisi parmi : -COO", -SO3 "
A" représente un anion qui peut être choisi parmi : un halogénure, un anion d'un acide carboxylique pharmaceutiquement acceptable,
R1 représente un alkyle en C1 à CJ O-
Un groupement alkyle en Ci-C]0 est une chaîne hydrogénocarbonée, linéaire, ramifiée ou cyclique comportant de 1 à 10 atomes de carbone. Lorsque x représente 0, le composé de formule (I) est un dérivé de porphyrine et les groupements (M-X) sont remplacés par deux atomes d'hydrogène.
Lorsque x représente 1, le composé de formule (I) est un dérivé de métalloporphyrine. Dans la formule (I), les variables définies ci-dessus sont avantageusement choisies, de façon indépendante, suivant les règles suivantes :
De préférence, M représente un atome de métal choisi parmi : Zn, Pt, Pd, Mn, Gd, Ni, Cr, Ru.
De préférence, X représente un groupement choisi parmi : Cl", Br", I", acétate, propionate, butyrate, ascorbate, benzoate, cinnamate, citrate, fumarate, glycolate, malonate, tartrate, malate, maléate, mandélate, tosylate, et encore plus préférentiellement : Cl", Br", I", acétate, tosylate.
Avantageusement, R représente un groupement choisi parmi : une chaîne alkyle en Cj-C1O, éventuellement interrompue par un ou plusieurs groupements choisis parmi : un éther (-O-), une aminé (-NH-), un thioéther (-S-), une cétone (-CO-), un ester (-CO-O-), un amide (-C0-NH-), une urée (-NH-CO-NH-), une thiourée (-NH-
CS-NH-), un oxycarbonyl (-O-CO-O-), un carbamate (-NH-CO-O-), et par exemple R peut être choisi parmi :
Figure imgf000006_0001
Avantageusement, R' représente un groupement choisi parmi : un alkyle en Ci-C3, comme par exemple un méthyle, un éthyle, un n-propyle, un isopropyle, et de préférence un méthyle ou un éthyle.
Avantageusement R1 représente un groupement choisi parmi : un alkyle en Cj-C3, comme par exemple un méthyle, un éthyle, un n-propyle, un isopropyle, et encore plus avantageusement un méthyle.
De préférence, Z+ représente un cation qui peut être choisi parmi : K+, Li+, Na+, NH4 +.
De préférence A" représente un anion qui peut être choisi parmi : Cl", Br", I", acétate, propionate, butyrate, ascorbate, benzoate, cinnamate, citrate, fumarate, glycolate, malonate, tartrate, malate, maléate, mandélate, tosylate, et encore plus préférentiellement. Cl", Br", F, acétate, tosylate.
Les porphyrines (I) préférées appartiennent à la liste suivante :
Figure imgf000008_0001
Les molécules répondant à la formule (I) sont des photosensibilisateurs hydrosolubles dotés d'une bonne capacité à transformer l'oxygène moléculaire qui les entoure en espèces oxygénées réactives. En raison de leur hydrosolubilité ils peuvent être facilement formulés dans des nanoparticules siliciées auxquelles ils sont liés de façon covalente. Et la synthèse de ces nanoparticules peut être réalisée en milieu essentiellement aqueux. parmi :
Figure imgf000009_0001
et R représente un groupement choisi parmi une chaîne alkyle en C1- C15, éventuellement interrompue par un ou plusieurs groupements choisis parmi : un éther (-O-), une aminé (-NH-), un thioéther (S-), une cétone (-CO-), un ester (-CO-O-), un amide (-CO-NH-), une urée (-NH-C0-NH-), une thiourée (-NH-CS-NH-), un oxycarbonyl (-O-CO-O-), un carbamate (-NH-C0-0-), alors les molécules de formule (I) peuvent être préparées par un procédé tel que décrit dans le schéma 1 ci-dessous dans lequel on fait réagir une porphyrine porteuse d'une fonction aminé (II) avec un composé isocyanatotrialcoxysilane (ou isothiocyanatoalcoxysilane lorsque R représente NH-CS- NHR2) :
Figure imgf000009_0002
(I) Schéma 1
On peut également employer un procédé selon le schéma 2 dans lequel on fait réagir une porphyrine porteuse d'une fonction isocyanate (IV) (ou isothiocyanate lorsque R représente NH-CS-NHR2) avec un composé aminoalkyl trialcoxysilane (V) :
Figure imgf000010_0001
Schéma 2
Lorsque R représente un groupement -CO-NH-R2- et R2 représente un groupement choisi parmi une chaîne alkyle en C1-C15, éventuellement interrompue par un ou plusieurs groupements choisis parmi : un éther (=-0-), une aminé (-NH-), un thioéther (S-), une cétone (-CO-), un ester (-CO-O-), un amide (-C0-NH-), une urée (-NH-C0-NH-), une thiourée (-NH-CS-NH-), un oxycarbonyl (-O-CO-O-), un carbamate (-NH-CO-O-),
On peut alors réaliser un couplage à partir d'une porphyrine porteuse d'un groupement acide carboxylique suivant schéma 3 ci-dessous :
Schéma 3
Lorsque R représente un groupement -NH-R2- ou -O-R2- et R2 représente un groupement choisi parmi une chaîne alkyle en C1-C]5, éventuellement interrompue par un ou plusieurs groupements choisis parmi : un éther (-O-), une aminé (-NH-), un thioéther (S-), une cétone (-CO-), un ester (-CO-O-), un amide (-C0-NH-), une urée (-NH-C0-NH-), une thiourée (-NH-CS-NH-), un oxycarbonyl (-O-CO-O-), un carbamate (-NH-CO-O-), on peut réaliser un couplage de type SN2, comme illustré respectivement sur le Schéma 4 et le Schéma 5.
Figure imgf000011_0001
Schéma 4
Figure imgf000011_0002
Schéma 5
Lorsque R représente un groupement -O-CO-NH-R - et R représente un groupement choisi parmi une chaîne alkyle en C1-C15, éventuellement interrompue par un ou plusieurs groupements choisis parmi : un éther (-O-), une aminé (-NH-), un thioéther (S-), une cétone (-CO-), un ester (-CO-O-), un amide (-CO-NH-), une urée (-NH-CO-NH-), une thiourée (-NH-CS-NH-), un oxycarbonyl (-O-CO-O-), un carbamate (-NH-CO-O-), on peut former un lien carbamate en suivant la méthode illustrée sur le schéma 6 :
Figure imgf000011_0003
Schéma 6
Pour la préparation des porphyrines de formule (I), les molécules de départ suivantes peuvent être employées :
Des porphyrines cationiques porteuses d'un groupement phényl-CO2H sont décrites dans : H. Yamaguchi et al, Chem. Eur. J., 2004, 10, 6179. Des porphyrines anioniques porteuses d'un groupement -CO2H sont décrites dans : US 4783529. Des porphyrines anioniques porteuses d'un groupement hydroxyphényl sont décrites dans : EP 891977.
La synthèse de porphyrines porteuses de groupements pyridine est décrite notamment dans EP-345171. De telles molécules peuvent être utilisées pour préparer des molécules de formule (I) comme illustré sur le schéma 7 ci-dessous :
On utilise comme produit de départ un composé de type porphyrine
(VI) porteur de trois groupements pyridine et d'une fonction Q appropriée, précurseur d'un linker -R-CH2-. Puis les groupements pyridine sont quaternisés pour donner (VII) et le groupement Q est transformé et greffé par un groupement trialcoxysilane pour donner (I).
Figure imgf000013_0001
L'invention a encore pour objet les compositions de nanoparticules comportant au moins un photosensibilisateur répondant à la formule (I) ci-dessus. Ces nanoparticules sont avantageusement à porosité organisée.
Par nanoparticule à porosité organisée, ou à porosité structurée, on entend des nanoparticules dont les pores sont répartis de façon géométrique suivant un schéma régulier dans les trois dimensions de l'espace. Comme exemple de porosité organisée on peut citer une structure en nid d'abeille. Le caractère structuré de la porosité peut être observé de différentes façons :
Les nanoparticules à porosité organisée ont un spectre de diffraction aux rayons X. La méthode d'adsorption désorption d'azote (BET) permet également de caractériser une porosité structurée.
Le fait d'avoir une structure à porosité organisée facilite le transfert d'énergie des photosensibilisateurs vers l'oxygène et la libération des espèces réactives de l'oxygène, dont l'oxygène singulet, dans les cellules. En outre, les porphyrines (I) sont fluorescentes si les cations métalliques M sont diamagnétiques ou si x = 0, aussi les nanoparticules de l'invention permettent de procéder au marquage par fluorescence des zones où sont localisés les tissus cancéreux. Et certaines molécules de formule (I) comprennent un cation métallique paramagnétique (M dans la porphyrine) qui permet de suivre la répartition des nanoparticules dans l'organisme par RMN et IRJVl. Le fait que ces molécules de marquage soient dans une structure organisée, à porosité contrôlée, facilite l'analyse d'image.
De façon avantageuse, les nanoparticules de l'invention sont à base de silice. La fabrication de ces nanoparticules comporte une étape de polymérisation d'un précurseur silicié dans des conditions permettant le greffage covalent du photosensibilisateur (I) et la formation d'un réseau à porosité organisée.
Selon une première variante on choisit de fabriquer des nanoparticules de silice mésoporeuse, formées par polymérisation d'un précurseur silicié en présence de tensio actifs. Les nanoparticules de silice mésoporeuse ont l'avantage d'avoir une surface spécifique élevée, un volume et des pores de taille contrôlée. Les nanoparticules de l'invention sont avantageusement monodisperses. Les nanoparticules de silice mésoporeuse à porosité contrôlée de l'invention ont une taille de particules allant de 80 à 400 nm de diamètre, une surface spécifique allant de 800 à 1000 m2/g et des pores de taille allant de 2 à 6 nm. Ces nanoparticules sont avantageusement de type MCM41.
Des nanoparticules mésoporeuses à base de silice ainsi que leur procédé de synthèse ont été décrits notamment dans C.E.Fowler et al., Adv. Mater. 2001, 13, N°9, 649-652. Ce sont les mêmes modes opératoires qui sont employés dans la présente invention.
Le procédé de fabrication des nanoparticules de l'invention se caractérise par le fait que l'on fait polymériser le tétraéthoxysilane en solution aqueuse basique en présence d'un tensioactif tel que du bromure de cétyltriméthylammonium et en présence de la molécule de formule (I). Selon une seconde variante on choisit de fabriquer des nanoparticules de silice microporeuses. Les nanoparticules microporeuses de l'invention sont de type silicalite et sont synthétisées en milieu basique en présence de la molécule de formule (I)3 du tétraéthoxysilane et d'un agent structurant de type ammonium quaternaire (comme par exemple de l'hydroxyde de tétrapropylammonium). Les nanoparticules de l'invention sont avantageusement monodisperses. Les nanoparticules de l'invention sont alors microporeuses avec un diamètre compris entre 30 et 80 nm, une surface spécifique allant de 100 à 450 m2/g et des diamètres de pores allant de 2 à 20 Â.
Des nanoparticules microporeuses à base de silice ainsi que leur procédé de synthèse ont été décrites notamment dans T. Doussineau et al., Eur. J. Inorg. Chem. 2006, 2766-2772. Ce sont les mêmes modes opératoires qui sont employés dans la présente invention.
Les procédés de production de ces nanoparticules conduisent à la formation d'une liaison covalente entre les molécules de formule (I) et les nanoparticules, ce qui évite le relargage des molécules de formule (I) dans l'organisme et favorise leur acheminement de façon spécifique vers leur cible biologique.
De préférence les nanoparticules de l'invention sont greffées sur leur surface par des molécules de ciblage spécifiques des tissus néoplasiques, c'est-à-dire des biomolécules dont les récepteurs sont surexprimés par les cellules cancéreuses, ou à la surface des cellules cancéreuses. Ces molécules de ciblage facilitent le transfert des nanoparticules vers leur cible biologique. D'une façon générale, ces molécules de ciblage peuvent être choisies parmi : l'acide folique, les peptides, les hydrates de carbone. Elles peuvent être greffées sur les nanoparticules de l'invention par l'intermédiaire d'un linker polymérique comme illustré sur la figure 4. Parmi les molécules de ciblage qui peuvent être greffées sur les nanoparticules de l'invention on peut mentionner :
- des dérivés de sucre comme le mannose, qui peut être greffé sur des nanoparticules siliciées à l'aide d'un linker polyéthylèneimine ou polyéthylène glycol PEG. Le greffage du mannose sur des nanoparticules de silice mésoporeuse est décrit notamment dans I. Young Park et al., International Journal of Pharmaceutics, 359, 2008, 280-287, et l'on peut employer les mêmes modes opératoires. Une autre voie consiste à utiliser le phénylsquarate-α-mannose comme illustré sur la figure 5.
- des peptides tels que des peptides à cible hormonale (LH-RH).
- des glycodendrimères portant plusieurs dérivés monosaccharides ou disaccharides tels que mannose, mannose-6-phosphate, glucose, galactose,... Des méthodes de greffage des nanoparticules microporeuses à base de silice par des biomolécules ont été décrites notamment dans T. Doussineau et al., Eur. J. Inorg. Chem. 2006, 2766-2772 et l'on peut employer les mêmes modes opératoires.
L'invention a encore pour objet un procédé de fabrication d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention et/ou à la détection des tumeurs comprenant l'étape de fabrication des nanoparticules décrites ci-dessus.
La production d'oxygène singulet et donc la destruction des cellules cancéreuses est induite par excitation photonique : Après irradiation des nanoparticules par une source lumineuse, l'oxygène singulet généré permet de détruire les cellules tumorales. L'irradiation est faite à une longueur d'onde comprise entre 630 nm et 680 nm à une puissance allant de 2 à 10 mW/cm2. Les résultats obtenus montrent que les nanoparticules synthétisées sont efficaces pour générer de l'oxygène singulet en solution avec un rendement quanti que compris entre 30 et 90%. Ces nanoparticules doivent permettre une vectorisation des actifs et leur endocytose dans les cellules tumorales après fonctionnalisation en surface par des biomolécules.
Parmi les différents cancers que l'on peut envisager de traiter avec les nanoparticules de l'invention, on peut citer : le rétinoblastome (lignées cellulaires Y- 79), le cancer du colon (lignées cellulaires HT29), de l'épiderme (A 431), du poumon (A 549), du sein (MDA-MB-231, MCF-7), du col de l'utérus (HeLa) de l'ovaire (PEO 14) ainsi que l'ensemble des tumeurs solides qui inclut, mais n'est pas limité aux cancers du cou et de la tête, aux cancers digestifs et des organes sexuels, et toute tumeur bénigne ou cancéreuse qui peut être illuminée.
Après endocytose les lignées cellulaires sont irradiées dans une des bandes d'absorption du photosensibilisateur, et l'efficacité des nanoparticules est évaluée par test MTT.
Les compositions de nanoparticules de l'invention peuvent être administrées localement ou par voie systémique. L'administration locale peut être effectuée notamment par injection de la composition de nanoparticule à proximité de la zone tumorale. Dans le cas des tumeurs superficielles, les compositions de nanoparticules peuvent être administrées par voie topique, sous une forme galénique appropriée (solution, suspension, pâte, patch). L'administration par voie générale peut être mise en œuvre par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intrapéritonéale ou rectale. De telles formulations et leur mode de mise en œuvre sont bien connus de l'homme du métier. Le dosage de la composition en actif de foi-mule (I) est adapté en fonction du poids et de l'âge du patient, de la nature, de la localisation et du stade de développement de la tumeur, de la voie d'administration choisie et de la dose d'irradiation utilisée.
La composition peut comprendre tout autre actif connu pour le traitement des tumeurs et/ou de leurs symptômes. Elle comprend les composants classiques de la galénique adaptés au mode d'administration choisi.
L'invention a encore pour objet les nanoparticules décrites ci-dessus, pour leur utilisation comme médicament, en particulier pour la prévention et/ou le traitement de tumeurs et cancers.
PARTIE EXPERIMENTALE Figures :
Figure 1 : Diffractogramme aux rayons X des nanoparticules de silicalite encapsulant une porphyrine anionique.
Figure 2 : Cliché TEM d'une nanoparticule mésoporeuse à porosité organisée. Figure 3 : Spectre UV des nanoparticules DBO 15 (NP-PS), DBOl 6
(NP-Mannose) et de l'arylsquarate-α-mannose (Sq-Mannose).
Figure 4 : nanoparticules de l'invention greffées par des molécules de ciblage
Figure 5 : exemple de nanoparticules fonctionalisées par le mannose Figures 6 à 14: Résultats biologiques sur l'efficacité cytotoxique de différentes nanoparticules encapsulant des photosensibilisateurs sur des lignées cellulaires de cancer du sein (MDA-MB-231), de l'ovaire (POE14), de la prostate (LNCaP) et de rétinoblastome (Y-79) après excitation monophotonique.
I- Synthèse des molécules de formule (I) : A- Synthèse de la porphyrine cationique hydrosoluble 8
- Schéma de synthèse :
Le composé 3 (1 équivalent) obtenu par la méthode décrite par Diane L. Dick et al, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 2664-2669, est condensé selon la procédure standard de Adler, avec le pyridinaldéhyde (3 équivalents) et le pyrrole (4 équivalents) pour donner, après chromatographie, la porphyrine 4 avec un rendement de 5,7 %, comme décrit par Martine Perrée-Fauvet et al pour le composé analogue meta Tetrahedron. 1996, 52, 13569-13588. Le dérivé 5 est obtenu quantitativement à partir du composé 4 par traitement avec de l'hydrazine dans l'eau à reflux. La réaction de la porphyrine 5 et de l'acide 6 peptidique dans le dichlorométhane, en présence de 1- hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt), l-(3-diméthy]aminopropyl)-3-éthylcarbodiimide chlorhydrate (EDC) et de triéthylamine comme agents de couplage, conduit au composé 7 (rend : 40 %) (Daniel H. Rich, et al., J. Med. Chem. 1975, 18, 1004-1010). Ce dernier composé est traité par un large excès d'iodure de méthyle pour donner quantitativement la porphyrine hydrosoluble 8.
Figure imgf000018_0001
- Modes opératoires:
5-[^-(3-isoindoline-r,3'-dione-propoxy)-phényle]-10,15,20-tri-/7- pyridyl-porphyrine 4
La porphyrine 4 est préparée à partir de l'aldéhyde 3 (6,2 g, 20 mmol) et la 4-pyridinecarboxaldéhyde (6,4 g, 60 mmol) qui sont dissous dans l'acide propionique bouillant (400 mL). Puis le pyrrole (5,36 g, 80 mmol) est ajouté goutte-à- goutte. Le reflux est maintenu 2 h. La solution est évaporée sous vide. Une première purification par chromatographie sur gel de silice élue par un mélange CH2Cl2ZEtOH (100/5, v/v) est effectuée afin d'éliminer un maximum d'impuretés. Une seconde, éluée avec du CH2Cl2 puis une quantité croissante d'éthanol (0 à 10%) permet la séparation des six porphyrines. La 5,10,15-tripyridyl-20-phénylporphyrine 4 est éluée (troisième fraction) avec un mélange CH2Cl2/EtOH (94/6, v/v) et est obtenue après cristallisation, par un mélange dichlorométhane/méthanol, sous forme de cristaux bleus (rendement : 5,7%). Spectre UV-vis dans le CH2Cl2 : λmaχ, nm (DO) : 418,5 (1), 514,5 (0,61), 549
(0,31), 589 (0,25), 646 (0,16). RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,05 (m, 6 H, méta- pyridine), 8,95 (d, J = 4,7 Hz, 2 H, pyrrole), 8,85 (s, 4 H, pyrrole), 8,81 (d, J = 5 Hz, 2 H5 pyrrole), 8,16 (d, J = 5,8 Hz, 6 H, ort/zo-pyridine), 8,07 (d, J = 8,4 Hz, 2 H, méta- phényle), 7,93 (dd, J = 3,1, 5,4 Hz. 2 H, phthalimide), 7,76 (dd, J = 3,0, 5,4 Hz, 2 H, phthalimide), 7,12 (d, J = 8 Hz, 2 H, or^o-phényle), 4.35 (t, 8 Hz, 2 H, 0-CH2), 4.09 (t, 8 Hz, 2 H, N-CH2), 2.40 (m, 2 H, CH2), -2.87 (s, 2 H, NH).
5-(/7-(3-aminopropoxy)-phényle]-10,15,20-tri-p-pyridyl- porphyrine 5
Un mélange de porphyrine 4 (0,930 g, 1,13 mmol) et de monohydrate d'hydrazine (0,71 mL, 23 mmol) est porté à reflux pendant 16 h, puis agité, à température ambiante, 24 h. La phthalhydrazide est précipitée par addition de HCl (solution 10%) et filtrée. La solution est neutralisée par addition de NaOH (solution 10%). La porphyrine est extraite de la phase aqueuse avec un mélange CH2Cl2/Et0H (95/5, v/v). Après séchage sur sulfate de sodium, fîltration et évaporation à sec, la porphyrine 5 (0,760 g) est obtenue pure sous la forme d'une poudre bleue (rendement : 97 %). Spectre UV-vis dans le CH2Cl2 : λmaχ, nm (ε L.mmolΛcm"1) : 418 (224,9), 515
(13,1), 550 (6,5), 590 (5,4), 647 (4,1). RMN 1K (300 MHz, CDCI3) δ 9,05 (m, 6 H, méta-pyvidinë), 8,95 (d, J = 4,7 Hz, 2 H, pyrrole), 8,85 (s, 4 H, pyrrole), 8,81 (d, J = 5 Hz, 2 H, pyrrole), 8,16 (d, J = 5,8 Hz, 6 H, orfλo-pyridine), 8,10 (d, J = 8,4 Hz, 2 H, méto-phényle), 7,31 (d, J = 8 Hz, 2 H, ortfzo-phényle), 4,38 (t, J = 8 Hz, 2 H, 0-CH2), 3,09 (t, J = 8 Hz, 2 H, N-CH2), 2,14 (m, 2 H, CH2), -2.87 (s, 2 H, NH).
5-{p-[3-(2',5t-dioxo-2',5'-dihydro-lH-pyrrol-r-yl)-/V-3- phénoxypropyl)propanamide]-phényle}-10,15,20-tri-p-pyridyl-porphyrine 7
Le composé 5 (160 mg, 0,23 mmol) est dissout dans CH2Cl2 (40 mL). Le HOBt (48 mg, 0,35 mmol), le EDC (67 mg 0,35 mmol), la triéthylamine (48 mL, 0,35 mmol) et l'acide 5-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-pyrrol-l-yl)-propionique (80mg, 0,46 mmoles) sont ajoutés. Le mélange est agité sous argon, pendant trois heures, à température ambiante. La fin de la réaction est contrôlée par chromatographie analytique sur couche mince de gel de silice éluée par un mélange CH2Cl2/éthanol (90/10, v/v). La solution est diluée par un mélange de CH2Cl2-éthanol (95/5, v-v) et lavée avec de l'eau (x 3), séchée sur sulfate de sodium, filtrée puis concentrée sous vide. Le produit est purifié par chromato graphie sur couche mince (Al2O3) élue avec un mélange de CH2Cl2/méthanol (9/1, v/v). Le composé 7 est obtenu sous la forme d'une poudre bleue après cristallisation dans un mélange CH2Cl2/éthanol/heptane (110 mg, rendement : 57 %). Spectre UV -vis dans le CH2Cl2 : λmaχ, nm (ε L.mmol"1.cm"1) : 418
(190,6), 516 (13,7), 550 (8,3), 591 (7,1), 652 (6,7). Spectre de masse Electro spray : cal. pour C5JH39N9O4 841.9 trouvé 842,66 M + 1. RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,04 (d, J = 5,6 Hz, 6 H, /wéto-pyridine), 8,92 (d, J = 5 Hz, 2 H, pyrrole), 8,83 (s, 4 H, pyrrole), 8,80 (d, J = 4,7 Hz, 2 H, pyrrole), 8,13 (d, J = 5,7 Hz, 6 H, ortfw-pyridine), 8,10 (d, J = 8,5 Hz, 2 H, méta-φényle), 7,30 (d, J = 8,6 Hz, 2 H, orfAo-phényle), 4,32 (t, 8 Hz, 2 H3 O- CH2), 3,92 (t, J = 7,4 Hz, 2 H, CH2-N), 3,63 (t, J = 7,8 Hz, 2 H, CH2-NH-CO), 2,62 (t, J = 7 Hz, 2 H, CH2-CO-NH), 2,19 (t, 2 H, CH2), -2,87 (s, 2 H, NH). 13C NMR (300 MHz, CDCl3) δ 170,6 (CON), 169,7 (CO-NH), 158,8 (pαra-phényle), 150 (pyridine), 148,4 (méta-pyήdiné), 135,7 (ortho-phénylé), 134,3 (éthylène), 134 (phényle), 131 (pyrrole), 129,4 (ort/zo-pyridine), 121,6 (méso-C), 117,4 (méso-C), 116,7 (méso-C), 112,8 (méta- phényle), 66,6 (C-O-), 37,5 (C-NHCO), 34,9 (C-N), 34,3 (C-CONH), 29,2 (C-C-O). 5-{p-[3-(2',5'-dioxo-2',5'-dihydro-lH-pyrroI-l'-yI)-N-3- phénoxypropyl)propanamide]-phényle}-10,15,20-tri-/?-pyridynium-porphyrin tri chlorure 8
La porphyrine 7 (68 mg, 0,08 mmol) et l'iodure de méthyle (1 mL) sont dissous dans le diméthyl formamide (20 mL) et agités à température ambiante pendant trois heures. La solution est concentrée sous vide puis diluée par du méthanol (10 mL). La résine IRA 400 (0.9 g) est ajoutée à la solution puis la suspension est agitée doucement pendant 1 heure 30. La solution est filtrée puis évaporée. Le composé pur est obtenu sous forme d'une poudre bleue après cristallisation dans un mélange méthanol/diéthyl éther (80 mg, rendement : 100 %). Spectre UV -vis dans le MeOH : λmaχ, nm (μL.mmor'.cm"1) : 427 (98,3), 518 (12), 557 (6,1), 593 (4,1), 652 (2,5).
Spectre de masse MALDI-TOF : cale pour C54H48N9O4Cl3 993,38 trouvé 886,44, M -
3Cl', 887,44, M + H - 3Cl".
B- Synthèse de la porphyrine anionique hydrosoluble 9 Ce composé est préparé par la méthode décrite par Kruper et al., J. Org. Chem. 1989, 54, 2753-2756 à partir de la 5,10,15,20-tétraphényl porphyrine avec un rendement global de 43 %.
Figure imgf000021_0001
II- Synthèse des nanoparticules :
A- Synthèse de nanoparticules mésoporeuses encapsulant une porphyrine anionique - Nanoparticules DB 003, DB 005 :
Figure imgf000021_0002
DB 003 : 5 mg de la porphyrine 9 (5,44.10"3 mmol) sont dissous dans 1 mL d'EtOH par passage pendant 15 min aux ultrasons. 5 équivalents (2,72 10"2 mmol) d'isocyanatopropyltriéthoxysilane sont ajoutés ainsi que 4 équivalents (2,17 10"2 mmol) de diisopropyléthylamine. La solution est maintenue à température ambiante pendant 12 heures.
686 mg (1,8 10"3 mol) de bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) sont dissous dans 40 mL de soude 0,2M à 25°C. La solution précédemment préparée est ajoutée puis le tétraéthoxysilane (3,5 mL, 1.57 10"2 mmol) est ajouté goutte à goutte. Après 40 secondes, 260 mL d'eau déionisée sont ajoutés. La solution est maintenue 6 minutes sous agitation puis rapidement neutralisée à pH 7 par l'addition de HCl 0,2 M (environ 50 mL). Les nanoparticules sont récupérées par centrifugation (20 minutes 20000 tours-minute), remises en suspension dans EtOH aux ultrasons, centrifugées. Le tensioactif est extrait par traitement avec 30 mL de solution EtOH/HCl 12N (4/1) durant 2h à 600C. Après centrifugation, l'opération est répétée deux fois, puis les nanoparticules remises en suspension dans l'eau et centrifugées jusqu'à obtenir un pH neutre (5 fois).
Alternativement le tensioactif peut être éliminé par traitement au nitrate d'ammonium (Chem Mater, 2004, 10, 1961) : 300 mg de NH4NO3 sont dissous dans 150 mL d'EtOH 95%. 500 mg de nanoparticules sont mis en suspension dans cette solution et traités aux ultrasons pendant 15 minutes, puis la solution est placée à 60°C pendant 15 min. La suspension est récupérée par centrifugation, redispersée aux ultrasons dans EtOH, centrifugée. Le protocole d'extraction du tensioactif est répété une fois.
La microscopie électronique à transmission (TEM) montre la présence d'un réseau hexagonal de mésopores avec un diamètre des nanoparticules de l'ordre de 100 nm.
La diffusion quasi-élastique de la lumière (DLS) confirme le diamètre hydrodynamique de 150 nm.
La BET indique une surface spécifique de 862 m2/g et un diamètre de pores de 2 nm. L'analyse par spectroscopie d'absorption U V- visible dite analyse UV
(EtOH) confirme la présence de la porphyrine encapsulée de manière covalente, on obtient une charge de 3,3 μmol de porphyrine par g de nanoparticules.
La capacité des nanoparticules à générer de l'oxygène singulet est évaluée par phosphorescence de celui-ci après irradiation dans une des bandes d'absorption du photosensibilisateur et en particulier à 421 nm de 3 mg de nanoparticules dans 5 mL d'EtOH absolu. Le rendement quantique de formation de l'oxygène singulet est de 92%.
Le même mode opératoire est utilisé pour synthétiser les nanoparticules DB 005 mais on utilise 10 mg (10,88 10"3 mmol) de la porphyrine 9, 13,4 μl d'isocyanatopropyltriethoxysilane, 7,4 μl de diisopropyléthylamine.
La microscopie électronique à transmission (TEM) montre la présence d'un réseau hexagonal de mésopores avec un diamètre des nanoparticules de l'ordre de 100 nm.
La diffusion quasi-élastique de la lumière (DLS) confirme le diamètre hydrodynamique de 200 nm.
La BET indique une surface spécifique de 891 m2/g et un diamètre de pores de 2 nm.
L'analyse par spectroscopie d'absorption U V- visible dite analyse UV (EtOH) confirme la présence de la porphyrine encapsulée de manière covalente, on obtient une charge de 6,94 μmol de porphyrine par g de nanoparticules.
La capacité des nanoparticules à générer de l'oxygène singulet est évaluée par phosphorescence de celui-ci après irradiation dans une des bandes d'absorption du photosensibilisateur et en particulier à 421 nm de 3 mg de nanoparticules dans 5 mL d'EtOH absolu. Le rendement quantique de formation de l'oxygène singulet est de 32%. B- Greffage de rammopropyltriéthoxysilane (APTS) en surface des nanoparticules - Nanoparticules DB 015, DB 019 :
Figure imgf000023_0001
DB 015 : 250 mg des nanoparticules DB 003 sont mises en suspension dans 6 mL d'HbO déionisée aux ultrasons pendant 30 min. Puis une solution de 2,5 mL d'EtOH et 391 μl d'APTS est ajoutée au goutte à goutte. On ajoute HCl 052M jusqu'à pH = 6. La réaction est agitée pendant 2Oh, centrifugée pendant 15 min. à 20000 tours.
Les nanoparticules sont lavées par EtOH (ultrasons + centrifugation) puis lavées par EtOH au Soxhlet durant 2Oh. On obtient m = 206 mg de nanoparticules.
Les fonctions aminés sont caractérisées par un test qualitatif à la ninhydrine.
L'analyse UV (EtOH) indique que la porphyrine est toujours présente et n'a pas été altérée durant la réaction. La BET indique que la surface spécifique a diminué à 481 m2/g, du fait de la présence des groupements aminopropyle à la surface des nanoparticules mais aussi dans les pores.
Le dosage de l'APTS est effectué par microanalyse et RMN Si du solide. On obtient une charge aminée de 2,2 mmol/g. Le même mode opératoire est utilisé pour synthétiser les nanoparticules DB 019 à partir des nanoparticules DB 005,
La BET indique que la surface spécifique a diminué à 545 m2/g, du fait de la présence des groupements aminopropyle à la surface des nanoparticules mais aussi dans les pores. C- Synthèse des nanoparticules de silicalite encapsulant une porphyrine anionique - Nanoparticules DB 008 :
Figure imgf000023_0002
4 mg de la porphyrine 9 (4,35.10"3 mmol) sont dissous dans 1 mL d'EtOH par passage pendant 15 min aux ultrasons. 5 équivalents (4,5 μL) d'isocyanatopropyltriéthoxysilane sont ajoutés ainsi que 4 équivalents (3,04 μL) de diisopropyléthylamine. La solution est maintenue à température ambiante pendant 12 h, puis 14 mL d'hydroxyde de tétrapropylammonium IM dans l'eau, 8,4 mL de TEOS et 2 mL d'eau sont ajoutés et la réaction est maintenue à température ambiante durant 24 h. La solution est ensuite mise à l'étuve à 80°C sans agitation pendant 48 h. Après refroidissement la solution est centrifugée 3 fois 20 minutes à 20000 tours-minute. Les nanoparticules sont ensuite redispersées dans l'eau et centrifugées. L'extraction de l'agent structurant est effectuée par une solution EtOH/HCl 12N (4/1) durant 2h à 6O0C. Deux cycles sont effectués. Les nanoparticules sont ensuite lavées par H2O 6 fois (6 cycles dispersion dans l'eau aux ultrasons centrifugation) jusqu'à obtenir un pH de 3,5. Les nanoparticules sont ensuite lavées deux fois par EtOH.
Les nanoparticules sont analysées par rayons X sur poudres et l'analyse montre la présence d'un réseau structuré caractéristique des zéolithes (figure
I)-
La DLS donne un rayon hydrodynamique de 68 nm. La BET donne une surface spécifique de 300 m2/g.
La capacité des nanoparticules à générer de l'oxygène singulet est évaluée par phosphorescence de celui-ci après irradiation dans l'une des bandes d'absorption du photosensibilisateur et en particulier à 421 nm de 3 mg de nanoparticules dans 5 mL d'EtOH absolu. Le rendement quantique de formation de l'oxygène singulet est de 31%.
D- Synthèse des nanoparticules de silicalite encapsulant une porphyrine cationique - Nanoparticules DB 011 :
Nanoparticules Silicalites
Figure imgf000024_0001
4,9 mg de la porphyrine 10 sont dissous dans 1 mL de EtOH absolu aux ultrasons. 2 μL d'aminopropyltriéthoxysilane sont ajoutés et la réaction est maintenue à température ambiante pendant une nuit. Dans un flacon en polyéthylène on dissout sous forte agitation la réaction précédente avec 14 mL d'hydroxyde de tétrapropylammonium IM dans l'eau, 8,4 mL de tétraéthoxysilane et 2 mL d'H2O. La solution est agitée pendant 24h à température ambiante puis est mise à l'étuve à 80°C sans agitation. Après deux jours la réaction est refroidie puis centrifugée. Les nanoparticules sont redispersées dans l'eau aux ultrasons puis centrifugées (3 cycles). L'extraction de l'agent structurant est effectuée par une solution EtOH/HCl 12N (4/1) durant 2h à 60°C. Deux cycles sont effectués. Les nanoparticules sont ensuite lavées par H2O 6 fois (6 cycles : dispersion dans l'eau aux ultrasons - centrifugation) jusqu'à obtenir un pH de 3,5. Les nanoparticules sont ensuite lavées deux fois par EtOH.
Diffraction rayons X : réseau structuré
DLS : 92 nm
BET : 100 m2/g
E- Synthèse de nanoparticules mésoporeuses encapsulant une porphyrine cationique - Nanoparticules OH21 :
Figure imgf000025_0001
8 mg de la porphyrine 8 (6,3 10 v"3 mmol) sont dissous dans 1 mL de MeOH. 4,2 mg de mercaptopropyltriméthoxysilane (21,78 10"3 mmoles) sont additionnés et la réaction est maintenue à température ambiante pendant une nuit. 343 mg (0,9 10" mol) de bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) sont dissous dans 20 mL de soude 0,2M à 25°C. La solution précédemment préparée est ajoutée ainsi que le tétraéthoxysilane (1,75 mL, 0.8 10"2 mmol). Après 40 secondes 128 mL d'eau déionisée sont ajoutés. La solution est maintenue pendant 6 minutes sous agitation puis rapidement neutralisée à pH 7 par l'addition de HCl 0,2 M (environ 25 mL). Les nanoparticules sont récupérées par centrifugation (20 minutes à 20000 tours-minute), remises en suspension dans EtOH aux ultrasons, centrifugées. Le tensioactif est extrait par traitement avec 15 mL de solution EtOH/HCl 12N (4/1) durant 2h à 60°C. Après centrifugation, l'opération est répétée deux fois, puis les nanoparticules sont remises en suspension dans l'eau et centrifugées jusqu'à obtenir un pH de l'ordre de 6 (6 fois).
L'analyse IR confirme l'élimination du tensioactif
La TEM montre la présence d'un réseau hexagonal de mésopores avec un diamètre des nanoparticules de l'ordre de 150 nm.
La DLS montre un diamètre hydrodynamique de 311 nm. L'analyse UV (EtOH) confirme la présence de la porphyrine encapsulée de manière covalente. On obtient une charge 4,43 μmol de porphyrine par g de nanoparticules.
La capacité des nanoparticules à générer de l'oxygène singulet est évaluée par phosphorescence de celui-ci après irradiation dans l'une des bandes d'absorption du photosensibilisateur et en particulier à 431 nm de 3 mg de nanoparticules dans 5 mL d'EtOH absolu. Le rendement quantique de formation de l'oxygène singulet est de 58%
F- Synthèse de nanoparticules mésoporeuses encapsulant une porphyrine cationique - Particules OH 22 :
Nanoparticules mésoporeuses
Figure imgf000026_0001
12 mg de la porphyrine 10 (1,1 10 v"2 mmol) sont dissous dans 1 mL de MeOH. 4,88 mg d'aminopropyltriméthoxysilane (2,72 10"2 mmoles) sont additionnés et la solution est maintenue à température ambiante pendant une nuit. 343 mg (0,9 10"3 mol) de bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) sont dissous dans 20 mL de soude 0,2M à 25°C. Le tétraéthoxysilane (1,75 mL, 0,8 10'2 mmol) est ajouté goutte à goutte ainsi que la solution précédemment préparée. Après 40 secondes 128 mL d'eau déionisée sont ajoutés. La solution est maintenue pendant 6 minutes sous agitation puis rapidement neutralisée à pH 7 par l'addition de HCl 0,2 M (environ 25 mL). Les nanoparticules sont récupérées par centrifugation (20 minutes à 20000 tours-minute), remises en suspension dans EtOH aux ultrasons et centrifugées. Le tensioactif est extrait par traitement avec 15 mL de solution EtOH/HCl 12N (4/1) durant 2h à 60°C. Après centrifugation, l'opération est répétée deux fois, puis les nanoparticules sont remises en suspension dans l'eau et centrifugées jusqu'à obtenir un pH de l'ordre de 6 (6 fois).
L'analyse IR confirme l'élimination du tensioactif.
La TEM (Figure 2) montre la présence d'un réseau hexagonal de mésopores avec un diamètre des nanoparticules de l'ordre de 150 nm.
La DLS confirme le diamètre hydrodynamique de 153 nm. L'analyse UV (EtOH) confirme la présence de la porphyrine encapsulée de manière covalente. On obtient une charge 0,97 μmol de porphyrine par g de nanoparticules.
La capacité des nanoparticules à générer de l'oxygène singulet est évaluée par phosphorescence de celui-ci après irradiation dans l'une des bandes d'absorption du photosensibilisateur et en particulier à 431 nm de 3 mg de nanoparticules dans 5 mL d'EtOH absolu. Le rendement quantique de formation de l'oxygène singulet est de 60%
G- Greffage de Pα-mannose en surface des nanoparticules : - Particules DBOl 6 :
Figure imgf000027_0001
100 mg de nanoparticules DB 015 aminées préparées au § B ci-dessus sont dispersées aux ultrasons pendant 10 minutes dans 5 mL d'EtOH. 59 mg (0,15 mmol) d'aryl squarate d'α-mannose sont dissous dans 5 mL d'un mélange EtOH-H2O (50-50). La solution est ajoutée à la précédente goutte à goutte. 500 μL de triéthylamine sont ajoutés et la suspension est agitée pendant 18h. Après centrifugation les nanoparticules sont redispersées dans l'eau et centrifugées (3 cycles). Puis elles sont redispersées dans EtOH et centrifugées (deux cycles). L'analyse DLS indique un diamètre hydrodynamique de 173 nm.
L'analyse UV confirme la présence de la porphyrine et du noyau aromatique-squarate (Figure 3).
- Nanoparticules DB 021 :
Figure imgf000027_0002
250 mg (7,35 10"5 mol) de H2N-PEG-CO2H (masse molaire 3400) sont dissous dans 1,25 mL d'eau distillée. 2 équivalents (0,0148 mol) de triéthylamine sont ajoutés. 81 mg (2,5 équivalents) de squarate phényl mannose sont dissous dans 1 mL d'eau. Cette solution est ajoutée goutte à goutte à la précédente. La réaction est maintenue à température ambiante durant 15h. Le DMF est évaporé puis le PEG est cristallisé dans l'éther qui est évaporé. 66 mg (2.10"5 mol) de produit précédent, 256 mg (9.10"5 mol) de
HO2C-PEG-OH, sont dissous dans 10 mL de DMF. 21 μl d'Et3N, 15 mg de NHS (N- hydroxysuccinimide) 30 mg de DCC (dicyclohexylcarbodiimide) sont ajoutés. La réaction est maintenue une nuit à température ambiante, puis 200 mg de nanoparticules DB 019 sont ajoutées. Après 2Oh, la solution est centrifugée, les nanoparticules remises en suspension dans le DMF aux ultrasons puis la solution est centrifugée à nouveau. Le lavage au DMF est répété une fois, puis les nanoparticules sont lavées trois fois à l'eau, deux fois à EtOH.
On obtient 178 mg de nanoparticules DB 021.
H- Greffage de l'α-mannose-6-carboxylate en surface des nanoparticules (Particules DB 054) :
NEt3
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000028_0002
56 mg de nanoparticules aminées DB 015 sont redispersées aux ultrasons pendant 10 minutes dans 5 mL d'EtOH. 25 mg (0,055 mmol) de squarate α- mannose-6carboxylate sont dissous dans 5 mL d'un mélange EtOH-H2O (3/2). La solution est ajoutée à la précédente goutte à goutte. 400 μL de triéthylamine sont ajoutés et la suspension agitée pendant 17h. Après centrifugation les nanoparticules sont redispersées dans l'eau et centrifugées (3 cycles), puis redispersées dans EtOH et centrifugées (trois cycles).
On obtient 33 mg de nanoparticules DB 054.
IH- Activité biologique :
Les activités en thérapie photodynamique (PDT) des différentes nanoparticules non fonctionnalisées ou fonctionnalisées par une biomolécule sont évaluées dans différentes lignées cellulaires. L'efficacité cytotoxique des nanoparticules internalisées dans des cellules cancéreuses est testée après excitation monophotonique des porphyrines encapsulées. L'efficacité de la PDT est montrée par la relative innocuité des particules non irradiées. La spécificité du ciblage et de l'endocytose des nanoparticules est montrée par co-incubation de la nanoparticule fonctionnalisée et de la biomolécule correspondante.
Exemple 1 : Activité PDT des nanoparticules OH21 sur les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 (Figure 6) Conditions expérimentales : les cellules de cancer du sein MDA-MB-
231, maintenues en culture dans du milieu Dulbecco's modifîed Eagle's médium additionné de 10% de FCS, dans une atmosphère humide à 370C et 5% de CO2, sont ensemencées dans des plaques 96 puits à une densité de 30 000 cellules par puits, dans 100 μl de milieu. Les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 ayant des capacités de phagocytose, sont incubées pendant 24 h avec 20 μg/ml de nanoparticules et irradiées pendant 40 min par un laser à 650 nm (puissance 2 à 10 mW/cm ). Deux jours après l'irradiation, les cellules vivantes sont quantifiées par le test enzymatique du MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium, Sigma).
Résultats : l'efficacité de la thérapie photodynamique se traduit par une inhibition de la croissance cellulaire de 92 %. Les absences de toxicité des nanoparticules non irradiées et de l'irradiation en absence de nanoparticules démontrent la spécificité de la thérapie photodynamique avec ces nanoparticules . Les cellules sont visualisées par un marquage fluorescent des noyaux au DAPI. Les clichés obtenus montrent la spécificité de la thérapie photodynamique à l'aide des nanoparticules de l'invention. La mort cellulaire est évidente et de façon exclusive dans Ia zone irradiée et en présence de nanoparticules.
Exemple 2 : Activité PDT des nanoparticules OH21 sur les cellules de cancer de l'ovaire POE14 (Figure 7).
Conditions expérimentales : les cellules POE 14 sont maintenues en culture comme décrit dans l'Exemple 1, incubées pendant 24 h avec une concentration de nanoparticules réduite à 10 μg/ml et irradiées comme décrit dans l'Exemple 1. Deux jours après irradiation, l'ajout dans le milieu de MTT permet de quantifier le nombre de cellules vivantes.
Résultats : l'irradiation des nanoparticules incubées avec les cellules POEl 4 induit une mort cellulaire de 82 % par rapport aux cellules témoins ou seulement irradiées. Dans ce type cellulaire, les nanoparticules non irradiées induisent une diminution du nombre de cellules vivantes d'environ 30 %. Cette toxicité démontre la nécessité d'un ciblage spécifique.
Exemple 3 : Activité PDT des nanoparticules cationiques OH21, OH22 et anioniques DB003, DB005 sur les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 (Figure 8).
Conditions expérimentales : identiques à l'Exemple 1. Résultats : Les résultats obtenus permettent de comparer l'efficacité des nanoparticules contenant soit des porphyrines anioniques, soit des porphyrines cationiques. La figure 8 montre que l'ensemble des nanoparticules irradiées testées inhibe totalement la croissance des cellules MD A-MB-231 comparée à la valeur TO qui correspond à l'ensemencement cellulaire initial avant irradiation. De plus, les irradiations des nanoparticules OH21 et OH22 qui contiennent des porphyrines cationiques induisent une mort cellulaire de 51,3 % et 57,2 % respectivement par rapport au témoin (cellules non traitées). Les nanoparticules DB003 et DB005 contenant des porphyrines anioniques induisent après irradiation une mort cellulaire de 37,1 % et 54 % respectivement. La cytotoxicité (faible mais significative) de certaines nanoparticules non irradiées démontre les avantages d'un ciblage spécifique provenant du mannose.
Exemple 4 : Activité PDT des nanoparticules anioniques fonctionnalisées par du mannose sur les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 (Figure 9).
Conditions expérimentales : identiques à l'Exemple 1. Résultats : Les résultats obtenus permettent de comparer l'efficacité des nanoparticules contenant des porphyrines anioniques, recouvertes ou non de mannose. Les nanoparticules DBO 16 et DB021 à la surface desquelles ont été greffés des résidus mannose, induisent une mort cellulaire de 100 % et 99 %, respectivement. Ces résultats mettent en évidence l'augmentation de l'efficacité cyto toxique des nanoparticules par le ciblage provenant du mannose.
Exemple 5 : Comparaison des activités PDT des nanoparticules anioniques fonctionnalisées par du mannose ou non fonctionnalisées sur les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 en présence ou non d'un excès de mannose (Figure 10).
Conditions expérimentales : Les cellules sont incubées pendant 6 heures dans du milieu supplémenté ou non de mannose (10~2 M), en présence ou en absence 20 μg/ml de nanoparticules (DB021 ou DB005). Après 6 h d'incubation, les nanoparticules du milieu sont éliminées et les cellules sont rincées 2 fois puis mises en culture dans 100 μl de milieu frais. Les cellules sont alors soumises à une irradiation au laser de longueur d'onde de 630-680 nm, avec une puissance de 2 à 10 mW/cm2, pendant 40 min. 48 h après irradiation, les cellules vivantes sont mises en évidence (A) et quantifiées (B) par le MTT. Résultats : la figure 10A montre le niveau témoin de l'accumulation du MTT dans les cellules non traitées. L'incubation des cellules avec les nanoparticules DB021 et soumises à l'irradiation conduit à une mort cellulaire. Ce phénomène est bloqué par la préincubation avec un excès de mannose. Les nanoparticules DB005 irradiées n'induisent pas de mort cellulaire. La quantification des cellules vivantes (Figure 10B) confirme ces observations. La cytotoxicité due aux nanoparticules DB021 incubées pendant 6 h n'est que de 2 à 10 % (± mannose) alors que l'irradiation des nanoparticules DB021 induit 70 % de mort cellulaire. L'ajout d'un excès de mannose stoppe en grande partie cet effet ce qui démontre la spécificité de l'internalisation. D'autre part, les nanoparticules DB005 irradiées ou non n'induisent que 5 à 10 % de mort cellulaire.
Exemple 6 : Activité PDT des nanoparticules de silicalite DB008 et DB011 sur les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 (Figure 11).
Conditions expérimentales : identiques à l'Exemple 1. Résultats : Les résultats obtenus montrent que les nanoparticules de silicalites DB008 et DB011 présentent une faible cytotoxicité de 8,3% et 5,3% lorsqu'elles ne sont pas irradiées. L'irradiation des cellules incubées avec ces nanoparticules (pendant 24 h) induit une inhibition totale de la croissance et une mort cellulaire d'environ 60 %.
Exemple 7 : Activité PDT des nanoparticules DB054 sur les cellules de cancer de la prostate LNCaP : spécificité de l'internalisation de DB054 (Figure 12). Conditions expérimentales : Des cellules humaines de cancer de la prostate (LNCaP) sont incubées pendant 1 h avec les nanoparticules DB054 dans un milieu sans sérum à 37°C, en présence ou en absence d'un excès de M6P puis soumises à une irradiation laser (660 nm, 6-7 mW/cm2, 40 min). Le pourcentage de cellules vivantes est déterminé à l'aide du test MTS (Promega). Les représentations graphiques correspondent à la moyenne de 3 expériences indépendantes.
Résultats : Les résultats obtenus montrent que les nanoparticules DB054 induisent une mort cellulaire de 47% après une heure de traitement. Cet effet est bloqué par l'ajout dans le milieu d'un excès de 10 mM M6P, ce qui démontre une internalisation des nanoparticules DB054 par le récepteur membranaire du M6P. Exemple 8 : Activité PDT des nanoparticules DB054 sur les cellules de cancer de la prostate LNCaP : variation de l'efficacité dans le temps de DB054 (Figure 13).
Conditions expérimentales : Des cellules humaines de cancer de la prostate (LNCaP) sont incubées pendant des durées différentes (1 h, 3 h, 24 h) avec les nanoparticules DB054 puis soumises à une irradiation laser (660 nm, 6-7 mW/cm2, 40 min). Le pourcentage de cellules vivantes est déterminé à l'aide du test MTS (Promega). Les représentations graphiques correspondent à la moyenne de 3 expériences indépendantes.
Résultats : Les résultats obtenus montrent que les nanoparticules
DB054 induisent respectivement 47%, 96% et 100% de cytotoxicité après 1 h, 3 h et 24 h de traitement. Ces résultats mettent en évidence la rapidité d'action des nanoparticules.
Exemple 9 : Activité PDT des nanoparticules DB016 et DB054 sur les cellules humaines de rétinoblastome (Figure 14).
Conditions expérimentales : Des cellules humaines de rétinoblastome (Y-79) sont incubées pendant 1 h avec les nanoparticules DB054 ou DBO 16 dans un milieu complet à 37°C puis soumises à une irradiation laser (660 nm, 6-7 mW/cm2, 40 min). Le pourcentage de cellules vivantes est déterminé à l'aide du test MTS (Promega).
Les représentations graphiques correspondent à la moyenne de 3 expériences indépendantes. Résultats : Les résultats obtenus montrent que les nanoparticules
DB054 et DB016 induisent respectivement 33% et 38% de cytotoxicité cellulaire. Ceci démontre que les nanoparticules fonctionnalisées par le mannose-6-phosphotate ou par le mannose peuvent être internalisées de façon efficace via différentes lectines présentes à la surface des cellules Y-79.

Claims

REVENDICATIONS
1. Molécule répondant à la formule (I) ci-dessous :
Figure imgf000033_0001
dans laquelle : x représente un entier choisi parmi : 0 et 1 ,
M représente un atome de métal choisi parmi les métaux de transition, lorsque x représente O5 (M-X) est remplacé par deux atomes d'hydrogène, X représente un groupement choisi parmi : un halogénure, un anion d'un acide carboxylique pharmaceutiquement acceptable,
R représente un groupement choisi parmi : une chaîne alkyle en Ci-C]5, éventuellement interrompue par un ou plusieurs groupements choisis parmi : un éther (-O-), une aminé (-NH-), un thioéther (- S-), une cétone (-CO-), un ester (-CO-O-), un amide (-C0-NH-), une urée (-NH-CO-
NH-), une thiourée (-NH-CS-NH-), un oxycarbonyl (-O-CO-O-), un carbamate (-NH-
CO-O-),
R' représente un groupement choisi parmi : un alkyle en Ci-C6, un phényle, un benzyle, R' ' représente un groupement choisi parmi :
Figure imgf000033_0002
et Z+ représente un cation organique ou minéral pharmaceutiquement acceptable,
Y" représente un groupement qui peut être choisi parmi : -COO", -SO3 ",
A- représente un anion qui peut être choisi parmi : un halogénure, un anion d'un acide carboxylique pharmaceutiquement acceptable,
R1 représente un alkyle en C1 à C]0.
2. Molécule selon la revendication 1, dans laquelle
M représente un atome de métal choisi parmi : parmi : Zn, Pt, Pd, Mn, Gd, Ni5 Cr, Ru.
X représente un groupement choisi parmi : Cl", Br', I", acétate, propionate, butyrate, ascorbate, benzoate, cinnamate, citrate, fumarate, glycolate, malonate, tartrate, malate, maléate, mandélate, tosylate,
R représente un groupement choisi parmi : une chaîne alkyle en C1-C10, éventuellement interrompue par un ou plusieurs groupements choisis parmi : un éther (-O-), une aminé (-NH-), un thioéther (-
S-), une cétone (-CO-), un ester (-CO-O-), un amide (-C0-NH-), une urée (-NH-CO- NH-), une thiourée (-NH-CS-NH-), un oxycarbonyl (-O-CO-O-), un carbamate (-NH-
CO-O-),
R' représente un groupement choisi parmi : un alkyle en C1-C3,
R1 représente un groupement choisi parmi : un alkyle en C]-C3,
Z+ représente un cation qui peut être choisi parmi : K+, Li+, Na+, NH4 +,
A' représente un anion qui peut être choisi parmi : Cl", Br', I", acétate, propionate, butyrate, ascorbate, benzoate, cinnamate, citrate, fumarate, glycolate, malonate, tartrate, malate, maléate, mandélate, tosylate.
3. Molécule selon la revendication 2, dans laquelle X représente un groupement choisi parmi : Cl", Br", I", acétate, tosylate,
R est choisi parmi
Figure imgf000034_0001
R' représente un groupement choisi parmi : un méthyle, un éthyle, RJ représente un méthyle, A' représente un anion qui peut être choisi parmi : Cl", Br", I", acétate, tosylate.
4. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, qui est choisie parmi :
Figure imgf000035_0001
5. Composition de nanoparticules à base de silice comportant au moins un photosensibilisateur répondant à la formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
6. Composition selon la revendication 5 dans laquelle les nanoparticules sont à porosité organisée.
7. Composition selon la revendication 6, dans laquelle les nanoparticules de silice sont mésoporeuses.
8. Composition selon la revendication 7 dans laquelle les nanoparticules de silice mésoporeuse ont une taille de particules allant de 80 à 400 nm de diamètre, une surface spécifique allant de 800 à 1000 m2/g et des pores de taille allant de 2 à 6 nm.
9. Composition selon la revendication 6, dans laquelle les nanoparticules de silice sont microporeuses.
10. Composition selon la revendication 9, dans laquelle les nanoparticules ont un diamètre compris entre 40 et 80 nm, une surface spécifique allant de 100 à 450 m2/g et des diamètres de pores allant de 2 à 20 Â.
11. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, qui comporte un greffage sur la surface des nanoparticules par des molécules de ciblage spécifiques des tissus néoplasiques.
12. Composition selon la revendication 11, dans laquelle la molécule de ciblage est choisie parmi les dérivés de sucre, en particulier le mannose.
13. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 12, pour son utilisation comme médicament.
14. Composition selon la revendication 13, pour son utilisation pour le traitement et/ou la prévention et/ou la détection d'un cancer.
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