WO2010010208A1 - Sirna y shrna para la elaboración de medicamentos frente a la presión intraocular elevada - Google Patents

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sirna
shrna
nucleotides
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Jesús Jerónimo PINTOR JUST
Álvarez Crooke
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Universidad Complutense de Madrid
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Universidad Complutense de Madrid
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]

Definitions

  • siRNA and shRNA for the preparation of medications against high intraocular pressure.
  • the present invention deals with the preparation of pharmaceutical compositions for the treatment of ocular hypertension. More specifically, it refers to the use of siRNA technology to selectively silence the P2Y 2 purinergic receptor gene.
  • dsRNA double stranded RNA
  • dsRNA messenger RNA
  • siRNA small interference RNA
  • iRNA interfering RNA
  • siRNA of length greater than 30 nucleotides produce nonspecific response to interferon due to
  • dsRN ⁇ chains between 18 and 30 base pairs of dsRN ⁇ can enter cells and tissues and, if their sequence is well chosen, they can selectively destroy an mRNA without firing the interferon response.
  • dsRNA molecules with a specific sequence to in turn destroy a particular mRNA have been called siRNA, as described above.
  • siRNA comes from the processing of the dsRNA through the enzyme DICER, a protein that belongs to the family of RNase III, which cleaves the dsRNA into small fragments.
  • a protein complex called RISC RNA induced silencing compl ⁇ x collects these siRNAs and then searches for and destroys any RNA present in the cell with a complementary sequence, such as the target mRNA for which the dsRNA was designed.
  • RISC RNA induced silencing compl ⁇ x
  • the dsRNA Binding Protein RDE-4 Interacts with RDE-1, DCR-1 and a DexH-box Hel ⁇ case to Direct RNAi in C. elegans, CeI1 109 (7): 861-71; Mart ⁇ nez et al., (2002) Single-Stranded Antisense siRNAs Guide Target RNA Cleavage in RNAi, CelI. 110 (5): 563-574; Hutvagner & Zamore (2002) A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex, Science 297: 2056; (For the review, see Bosher & Labouesse (2000) RNA inter ⁇ erence: genetic wand and genetic watchdog. Nat. CeII. Biol. 2 (2): E31-E36).
  • RNA interference or silencing is completed by the following steps: (i) First, recognition of the dsRNA and binding to DICER occurs; (ii) then, the RNase III activity of DICER produces the cleavage of the dsRNA resulting in the production of siRNA; (iii) be
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) it produces the association of the siRNAs to the RISC protein complex that (iv) • recognizes the target complementary mRNA and (v) induces the breakdown of the target mRNA in the center of the region complementary to the siRNA; (vi) the last step consists in the degradation of the target mRNA and the recycling of the RISC complex.
  • siRNA is specifically designed so that the expression of a gene can be inhibited without affecting any other (Kisielow, M. et al. (2002) Is ⁇ form-specific knockdown and expression of adapter protein ShcA using smal! interfering RNA, J. Biochem. 363: 1-5). This not only allows selective applications for very complex pathologies but, in addition, siRNAs can be used to check the participation of a certain gene (and therefore its protein) in the biochemical and physiological processes of a cell.
  • iRNAs are an excellent tool to quickly assess the function of the gene and to reveal null phenotypes.
  • RNAs could be used to treat diseases.
  • Glaucoma is a neurodegenerative disease that occurs in many cases as a result of the increase in intraocular pressure (PlO) that strangles the ciliary artery depriving the retina of blood flow and inducing
  • PlO intraocular pressure
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The death of retinal cells with the consequent loss of vision. If the IOP is very high, the optic nerve can even be strangled so that the process is, if possible, more serious.
  • the most common case of glaucoma is the one just mentioned, which is called open angle, and its prevalence is notable in people over 40, among those who have one. incidence of a case every 200 people.
  • the myocilin gene has more than 30 mutations and has been shown to be responsible for 5% of cases of open-angle glaucoma (see reviews in Wirtz & Samples (2003) The genetic loci of open angle glaucoma Ophtalmopl: Clin. Nor ⁇ h Am. 16: 505-514, and Khaw et al., (2004) Glaucoma -1: diagnosis. BMJ 1 328: 97-99).
  • the therapies that are currently being developed against glaucoma go through surgery and pharmacology, in order to drop the abnormally high intraocular pressure in these patients.
  • pharmacology is carried out through 5 types of drug families:
  • Beta-blocking agents Beta-blocking agents; Alpha-adrenergic agonist agents; Parasympathomimetics;
  • the present invention relates to a siRNA for the preparation of medicaments against elevated intraocular pressure in animals and humans.
  • the siRNA of the invention is specific for the silencing of the gene encoding the purinergic receptor P2Y 2 , which is one of the purinergic receptors P2Y with influence on the behavior of aqueous humor.
  • the silencing and non-expression of this gene are due to use of a double stranded RNA that directly interferes with the P2Y 2 receptor mRNA.
  • P2Y 2 purinergic receptor gene is also called the target gene since it is its expression that specifically and selectively silences itself.
  • siRNA design is established around general criteria such as a length between 21 and 26 base pairs, the selection of the homologous region of, within the gene, distance of the initiation codon, G / C content and
  • sequences AA (NI 9), CA (NI 9) are searched, that is, sequences of 19 base pairs preceded either by AA or by CA.
  • a search for sequence homology is performed in specialized databases (that is, a BLAST through NCBI ESTs databases) with the sequences that best fit the requirements set forth here, to ensure that only the gene that interests us will be silenced.
  • the oligonucleotide sequence for which the siRNAs of the invention have been designed includes 19 nucleotides of the P2Y 2 purinergic receptor gene and is the following (SEQ ID NO 1):
  • This sequence is the target sequence and corresponds to that of the P2Y 2 purinergic receptor mRNA fragment against which the siRNAs have been designed.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
  • the invention also relates to siRNA of between 19 and 26 nucleotides whose sequences contain the 19 nucleotides designed against the target sequence defined above.
  • the two strands of the siRNAs of the invention can have one or more nucleotides at the 3 'end, preferably two, which are not complemented by the complementary strand.
  • These free nucleotides can be both ribonucleotides and deoxyribonucleotides.
  • the two strands of. the siRNA of the invention can comprise two deoxythymines (TT) or two free uridines (uu) at both 3 'ends.
  • the invention includes siRNA whose sequences differ from that of the siRNAs against SEQ ID NO 1 in one or more nucleotides, but which fulfill the requirement to mediate the degradation of the mRNA of the target gene by the action of the RNA interference phenomenon.
  • the nucleotides in which the sequences of these siRNA differ may have been modified by chemical or enzymatic procedures.
  • shRNA In addition to siRNA silencing, another possibility is shRNA or RNA mediated silencing in. fork.
  • the shRNA is an RNA molecule containing a nucleotide sequence "sense" (5' - 3 '), an antisense nucleotide sequence (3'-5'), and a short sequence between Ia
  • RNA molecules tend to form a double stranded RNA with a loop (the loop is the short sequence).
  • the shRNA is reproduced from a vector, under the expression of a promoter of Ia
  • RNA polymerase III The expressed shRNA is exported to the cytoplasm where it is processed by the DICER in the same way as the dsRNA and, thus, is incorporated into the siRN ⁇ silencing path. This way of silencing is used when you want to achieve a lasting, "stable" silencing.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
  • One of the aspects of this invention relates to a shRNA whose antisense chain contains the sequence complementary to SEQ ID NO 1 and which is capable of silencing the expression of the P2Y 2 purinergic receptor gene.
  • Both chains can contain 19 to 29 nucleotides distributed interchangeably between both sequences.
  • the invention also includes shRNA whose sequences differ from that of shRNAs against SEQ ID NO 1 in one or more nucleotides, but which fulfill the requirement to mediate the degradation of the mRNA of the target gene by the action of the RNA interference phenomenon.
  • the nucleotides in which the sequences of these shRNA differ may have been modified by chemical or enzymatic methods.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical compound that includes any of the versions of siRNA or shRNA against SEQ ID NO 1 that have been detailed in this description as well as its use in the preparation of a medicament to reduce abnormally high IOP due to diseases such as glaucoma, uveitis, diabetic retinopathy or Ia certain infectious or systemic diseases' s.
  • Preparations containing the siRNA or shRNA can have various formulations, so that the siRNA or shRNA can be prepared in a suitable vehicle to allow a more effective penetration of the active ingredient (such as liposomes).
  • suitable vehicles must have acceptable properties for ocular administration and may comprise, in addition to the aforementioned liposomes, biodegradable polymers, hydrogels, cyclodextrins, nanocapsules, microspheres, dendrimers or
  • siRNA or shRNA may be formulated with polyethyleneimine or derivatives such as polyetinleneimine
  • siRNA and shRNA can also be prepared with agents that allow permeabilization through membranes, such as lipid preparations.
  • siRNA and shRNA can be carried out in aqueous and non-aqueous solutions, aqueous and non-aqueous gels, creams, emulsions, microemulsions, liposomes, oils, lotions or aerosols.
  • the siRNA is applied topically as a simpler way, although other protocols and compositions can also be used.
  • the prepared siRNAs can be applied systemically or locally, orally, transdermally or in injections. In the latter case, intratramericular, subconjunctival and intravitreal injections are especially interesting.
  • the pharmaceutically effective dose will be the one that prevents, inhibits the appearance or treats the pathological state in question. This varies. depending on the pathology that produces the ocular hypertension, the composition, the route of administration, the type of animal to be treated and other aspects that depend on the medical analysis by the specialist (such as other simultaneous treatments). In general, an amount ranging from 0.1 mg / kg to 100 mg / kg of body weight per day is administered.
  • Example 1 5 For the design of the specific siRNA of the rabbit P2Y 2 receptor it was necessary to clone said receptor. Cloning was performed from total RNA of rabbit corneal epithelium using degenerate oligonucleotides and the RT-PCR and RACE (Rapid Amplification of cDNA ends) techniques known to any person skilled in the art. To obtain the target sequences with the highest probability of success of siRNA silencing, the Applied Biosystems search system was used with which, using a series of empirical criteria, 9 sequences were selected. The siRNAs that recognize these target sequences were provided by Applied Biosystems in the ringed form, purified and lyophilized. To measure the efficacy of said siRNAs in vitro, they were resuspended in RNase-free water and for application in vivo were resuspended in 0.9% NaCl.
  • siRNA was tested in the animal model of the New Zealand rabbit. For this, siRNA was used whose sequence is complementary to the sequence described above (SEQ ID NO 1) and whose obtaining is exemplified in the
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Example 1 of this report.
  • the rabbit sequence is homologous to the human receptor so that the designed siRNA can be used in humans.
  • siRNAs designed by silencing, in primary cell cultures of epithelium, the levels of the mRNA corresponding to the P2Y 2 receptor.
  • the analysis of the efficacy of said siRNAs was determined by immunocytochemistry, from rabbit corneal epithelium cells transfected with 30OnM of said siRNAs. This analysis revealed the silencing efficiency of the siRNA whose target sequence was the sequence characterized by SEQ ID NO 1.
  • the intraocular pressure studies were performed in rabbits of the New Zealand breed by measuring the intraocular pressure.
  • the eye of the rabbit is especially interesting because it is large and in this way it is possible to perform intraocular pressure measurements in a precise way.
  • the intraocular pressure of these animals, around 20mm Hg, can decrease up to 40% with the use of commercial treatments for ocular hypertension.
  • Rabbits were kept in individual cages with free access to food and drink. They were subjected to 12-hour light / dark cycles to avoid oscillations due to circadian cycles. To carry out the experimentation, the European directive 86/609 / EEC was followed for the use and handling of experimental animals.
  • the siRNAs were applied by topically instilling a volume of 40 ⁇ l on the surface of the cornea.
  • the contralateral eye received an equivalent volume of the vehicle used, that is, saline solution, and was used as a control eye.
  • the measurements of the intraocular pressure were carried out by means of a rebound tonometer TonoVet. This tonometer is minimally invasive, so it does not require the use of anesthesia. The measurements were made by measuring the baseline level of the intraocular pressure and the experiment was repeated a total of 8 times. To avoid problems, the experiments were always carried out at the same time of day, which allowed to obtain a more objective assessment of the results.
  • the protocol for the application of the siRNA was the following: the doses of the siRNA prepared in saline solution (NaCl 0.9% w / v) in a final volume of 40 ⁇ l were applied in each eye for four consecutive days at the same time. The eye. contralateral received 40 ⁇ l of saline solution, during the same number of days and at the same time. Intraocular pressure was measured before each application and every 2, 4 and 6 hours for the next 7 days. The maximum responses in the lowering of the intraocular pressure were obtained 24 hours after starting the treatment and lasted until the fifth day.
  • Figure 1 shows the results obtained.
  • the black squares indicate the data obtained from the eye in which only saline was applied; the white circles reflect the results obtained in the eye that was treated with the siRNA of the invention.
  • the axis of the X expresses the time in hours and that of the Y indicates the value of the IOP and how it varies with respect to the control (to which a value of 100% is given)
  • the result of treatment with the siRNA showed a decrease in infraocular pressure which, in addition, was statistically significant, a fundamental objective of all therapies for diseases that occur with ocular hypertension such as glaucoma.
  • siRNA was not only notable in its hypotensive capacity of intraocular pressure but also its effect was very long since it lasted four days, in clear comparison with commercial drugs whose duration is a few hours.

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Abstract

siRNA y shRNA para la elaboración, de medicamentos frente a la presión intraocular elevada. La presente invención proporciona moléculas de siRNA y de shRNA para silenciar de manera selectiva el gen del receptor purinérgico P2Y2. Estas moléculas son útiles para la elaboración de composiciones farmacéuticas con capacidad de disminuir la presión intraocular por lo que su aplicación es de utilidad en aquellas enfermedades que cursan con presión intraocular elevada como son el glaucoma, la uveítis, la retinopatía diabética así como determinadas enfermedades infecciosas o sistémicas.

Description

TITULO
siRNA y shRNA para Ia elaboración de medicamentos frente a Ia presión intraocular elevada.
CAMPÓ DE LA INVENCIÓN
La presente invención trata de Ia elaboración de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de Ia hipertensión ocular. Más concretamente se refiere al empleo de Ia tecnología de los siRNA para silenciar de manera selectiva el gen del receptor purinérgico P2Y2.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Desde hace relativamente poco tiempo los investigadores han observado que el RNA de doble hebra (dsRNA, del inglés doble strand RNA) tiene propiedades interesantes al ser capaz de inhibir Ia expresión de genes. Esta capacidad de silenciar un gen tiene un amplio potencial para el tratamiento de algunas enfermedades humanas motivo por el cual tanto empresas. como laboratorios de las universidades están poniendo un gran esfuerzo en el desarrollo de nuevas terapias basadas en esta tecnología.
Se considera que el mecanismo principal que tiene el dsRNA para inducir el silenciamiento de genes en mamíferos es Ia degradación del RNA mensajero (mRNA). En este caso, al dsRNA que degrada el mRNA se Ie llama siRNA (del inglés small interference RNA) o iRNA (interferente RNA).
Los primeros abordajes para el uso de dsRNA con el fin de silenciar un gen en particular tuvieron como resultado Ia síntesis de cadenas demasiado grandes que condujeron a fenómenos no deseados. De hecho, se ha comprobado que existe una limitación en mamíferos: siRNA de longitud superior a 30 nucleótidos producen respuesta inespecífica a interferón debido
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) a que activan un mecanismo celular de defensa ante infecciones víricas. Esta observación puso de manifiesto Ia necesidad de buscar cadenas de dsRNA que no fuesen demasiado grandes.
Recientemente, se ha podido comprobar que cadenas entre 18 y 30 pares de bases de dsRNÁ pueden entrar en células y tejidos y, si su secuencia está bien escogida, pueden destruir selectivamente un mRNA sin disparar Ia respuesta del interferón. A estas moléculas de dsRNA con una secuencia específica para destruir a su vez a un mRNA en particular se les ha denominado siRNA, como se ha descrito anteriormente.
La estructura de los denominados siRNA proviene del procesamiento de los dsRNA por mediación del enzima DICER, una proteína que pertenece a Ia familia de Ia RNasa III, que escinde el dsRNA en fragmentos pequeños. Un complejo de proteínas denominado RISC (del inglés RNA induced silencing complθx) recoge estos siRNA y a continuación busca y destruye cualquier RNA presente en Ia célula con una secuencia complementaria, como es el mRNA diana para el que se diseñó el dsRNA. El mecanismo de acción de los siRNA así como algunos de sus usos se pueden ver en las siguientes referencias: Provost et al. (2002) Ribonuclease Activity and RNA Binding of
Recomhinant Human Dícer, EMBO J. 21(21): 5864-5874; Tabara et al. (2002)
The dsRNA Binding Protein RDE-4 Interacts with RDE-1, DCR-1 and a DexH- box Helícase to Direct RNAi in C. elegans, CeI1 109(7):861-71; Martínez et al., (2002) Single-Stranded Antisensé siRNAs Guide Target RNA Cleavage in RNAi, CelI. 110(5):563-574; Hutvagner & Zamore (2002) A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex, Science 297:2056; (para Ia revisión vea Bosher & Labouesse (2000) RNA interíerence: genetic wand and genetic watchdog. Nat. CeII. Biol. 2 (2): E31-E36). De modo resumido, el fenómeno de Ia interferencia o silenciamiento del RNA se completa mediante los siguientes pasos: (i) en primer lugar se produce el reconocimiento del dsRNA y Ia unión a DICER; (ii) a continuación, Ia actividad RNasa III de DICER produce Ia escisión del dsRNA dando lugar a Ia producción de siRNA; (iii) se
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) produce Ia asociación de los siRNA al complejo proteico RISC que (iv) • reconoce el mRNA complementario diana y (v) induce Ia ruptura del mRNA diana en el centro de Ia región complementaria al siRNA; (vi) el último paso consiste en Ia degradación del mRNA diana y el reciclaje del complejo RISC.
Las dos principales ventajas de esta tecnología consisten en que el efecto es bastante más duradero que el de un fármaco. normal y que Ia interferencia se mantiene, in vitro, después de numerosas divisiones celulares. Otra característica fundamental es que el siRNA se diseña de manera específica por Io que se puede inhibir Ia expresión de un gen sin afectar a ningún otro (Kisielow, M. et al. (2002) Isόform-specific knockdown and expression of adaptor protein ShcA using smal! interfering RNA, J. Biochem. 363:1-5). Esto no solo permite aplicaciones selectivas para patologías muy complejas sino que, además, los siRNA pueden emplearse para comprobar Ia participación de un determinado gen (y por ende su proteína) en los procesos bioquímicos y fisiológicos de una célula.
Se han utilizado diversos sistemas en los que, con el empleo de siRNA, se ha logrado Ia supresión específica de Ia biosíntesis de proteínas en diferentes líneas celulares mamíferas, de modo que este método' ha permitido asignar una función a los genes. Por ejemplo, se ha podido demostrar Ia inhibición de Ia expresión génica a nivel postranscripcional en células eucarióticas. En este contexto, los iRNA son una herramienta excelente para evaluar rápidamente Ia función del gen y para revelar fenotipos nulos.
Más allá de los posibles papeles de este tipo de RNA como herramienta para comprender el significado de los genes está el empleo con fines terapéuticos. De este modo se podría emplear los iRNA para tratar enfermedades.
El glaucoma es una enfermedad neurodegenerativa que ocurre en muchos casos como consecuencia del incremento en Ia presión intraocular (PlO) que estrangula Ia arteria ciliar privando de flujo sanguíneo a Ia retina e induciendo
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Ia muerte de las células retinianas con Ia consiguiente pérdida de visión. Si Ia PIO es muy elevada el nervio óptico puede ser incluso estrangulado con Io que el proceso es, si cabe, más grave. El caso más habitual de glaucoma es el que se acaba de comentar, que se denomina de ángulo abierto, y su prevalencia es notable en mayores de 40 años, entre quienes tiene una. incidencia de un caso cada 200 personas.
No se conocen bien los motivos que pueden desencadenar el glaucoma, pero parece que podría tener un componente genético. Por ejemplo, el gen de Ia miocilina, presenta más de 30 mutaciones y se ha comprobado que es responsable del 5% de los casos de glaucoma de ángulo abierto (véase las revisiones en Wirtz & Samples (2003) The genetic loci of open angle glaucoma. Ophtalmopl: Clin. Noríh Am. 16: 505-514, y Khaw et al., (2004) Glaucoma -1: diagnosis. BMJ1 328: 97-99).
Las terapias que actualmente se están desarrollando frente al glaucoma pasan por Ia cirugía y Ia farmacología, con el fin de hacer caer Ia presión intraocular anormalmente elevada en estos pacientes. Al margen de Ia cirugía, Ia farmacología sé lleva a cabo por medio de 5 tipos de familias de fármacos:
Inhibidores de las anhidrasas carbónicas; Agentes betabloqueantes; Agentes agonistas alfaadrenérgicos; Parasimpáticomiméticos;
Análogos de las protaglandinás.
Todas y cada una de estas aproximaciones presentan ventajas e inconvenientes y son precisamente los inconvenientes los que demandan Ia generación de nuevas estrategias para el tratamiento de esta patología.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Recientemente en Ia patente WO2006021817 se describe el diseño y empleo de iRNA para el tratamiento de las patologías oculares y en particular en el tratamiento del glaucoma. Sin embargo, las dianas seleccionadas por los inventores nada tienen que ver, ni ponen en compromiso alguno, con la invención que aquí se describe. La mencionada patente reivindica 1829 secuencias oligonucleotídicas para las anhidrásas carbónicas II, IV y XII, para los receptores adrenérgicos betai y beta2, alíala, para Ia acetilcolinesterasa, ciclooxigenasas 1 y 2, ATPasas, ELAM, el sistema renina angiotensina y Ia coclina: En ningún momento se reivindica el uso de un iRNA para silenciar el gen de Ia proteína que se reivindica en este documento.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un siRNA para Ia elaboración de medicamentos frente a Ia presión intraocular elevada en animales y humanos.
Patologías como el glaucoma, Ia uveitis y los procesos inflamatorios suelen ocurrir con incrementos notables de Ia presión intraocular. El siRNA de Ia invención es específico para el silenciamiento del gen que codifica el receptor purinérgico P2Y2, que es uno de los receptores purinérgicos P2Y con influencia en el comportamiento del humor acuoso.. El silenciamiento y la no expresión de este gen se deben al empleo de un RNA de doble hebra que directamente interfiere con el mRNA del receptor P2Y2.
En Ia presente invención el. gen del receptor purinérgico P2Y2 se denomina también gen diana puesto que es su expresión Ia que específica y selectivamente se silencia.
El diseño del siRNA se establece entorno a unos criterios generales como son una longitud entre 21 y 26 pares de bases, la selección de Ia región homologa de,ntro del gen, distancia del codón de iniciación, contenido G/C y
Ia localización de dímeros de adenosina. Dado que esto no es un proceso
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) exacto es necesario diseñar varias secuencias y ensayarlas para así seleccionar aquella más adecuada.
De una manera más detallada, para una buena selección de Ia secuencia de un siRNA se deben seguir los siguientes pasos:
1.- .En Ia secuencia del mRNA, buscar una región localizada de 50 a 100 nucleótidos en sentido 3' desde el codón AUG de iniciación.
2.- En esta región se buscan las secuencias AA(NI 9), CA(NI 9), es decir, secuencias de 19 pares de bases precedidas bien por AA o bien por CA.
3.- El porcentaje ideal de G/C debe ser superior al 30% pero no sobrepasar el 70% (50% sería ideal).
4.- Se evitan secuencias con las siguientes repeticiones: AAA, CCC, GGG, TTT, AAAA, CCCC1 GGGG, TTTT. 5.- Se realiza una predicción de Ia estructura secundaria del mRNA.
6.- Se realiza una búsqueda por homología de secuencias en bases de datos especializadas (es decir, un BLAST a través de las bases de datos tipo NCBI ESTs) con las secuencias que se ajustan mejor a los requisitos aquí expuestos, para garantizar que solo se va a silenciar el gen que nos interesa.
La secuencia oligonucleotídica para Ia que se han diseñado los siRNA de Ia invención incluye 19 nucleótidos del gen del receptor purinérgico P2Y2 y es Ia siguiente (SEQ ID NO 1):
CCTGTACTGCAGCATCCTC
Esta secuencia es Ia secuencia diana y se corresponde con Ia del fragmento de mRNA del receptor purinérgico P2Y2 contra Ia que se ha diseñado los siRNA.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) La invención también se refiere a siRNA de entre 19 y 26 nucleótidos cuyas secuencias contienen los 19 nucleótidos diseñados frente a Ia secuencia diana definida más arriba.
Por otro lado, las dos hebras de los siRNA de Ia invención pueden tener uno o más nucleótidos en el extremo 3', preferentemente dos, que no se complementan con Ia hebra complementaria. Estos nucleótidos libres pueden ser tanto ribonucleótidos como deoxyribonucleótidos. Por ejemplo, las dos hebras de. los siRNA de Ia invención pueden comprender dos desoxitiminas (TT) o dos uridinas (uu) libres en ambos extremos 3'.
Además, Ia invención incluye siRNA cuyas secuencias difieren de Ia de los siRNA frente a SEQ ID NO 1 en uno o más nucleótidos, pero que cumplen el requisito de mediar Ia degradación del mRNA del gen diana por Ia acción del fenómeno de interferencia de RNA. Los nucleótidos en que difieren las secuencias de estos siRNA pueden haber sido modificados mediante procedimientos químicos o enzimáticos.
Además del silenciamiento mediante siRNA, otra posibilidad es el silenciamiento mediado por shRNA o RNA en . horquilla. El shRNA es una molécula de RNA que contiene una secuencia nucleotídica "sentido" (5'-3'), una secuencia nucleotídica antisentido(3'-5'), y una secuencia corta entre Ia
"secuencia sentido" y Ia "antisentido". Debido a Ia complementariedad de las secuencias sentido y antisentido, tales moléculas de RNA tienden a formar un RNA de doble cadena con un bucle (el bucle es Ia secuencia corta). El shRNA se reproduce a partir de un vector, bajo Ia expresión de un promotor de Ia
RNA polimerasa III. El shRNA expresado se exporta al citoplasma donde es procesado por el DICER de igual forma que el dsRNA y, de esta manera, se incorpora a Ia ruta de silenciamiento del siRNÁ. Esta forma de silenciar se utiliza cuando se quiere conseguir un silenciamiento duradero, "estable".
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Uno de los aspectos de esta invención se refiere a un shRNA cuya cadena antisentido contiene la, secuencia complementaria a SEQ ID NO 1 y que es capaz de silenciar la expresión del gen del receptor purinérgico P2Y2. Ambas cadenas (sentido y antisentido) pueden contener de 19 a 29 nucleótidos distribuidos indistintamente entre ambas secuencias.
La invención también incluye shRNA cuyas secuencias difieren de Ia de los shRNA frente a SEQ ID NO 1 en uno o más nucleótidos, pero que cumplen el requisito de mediar Ia degradación del mRNA del gen diana por Ia acción del fenómeno dé interferencia de RNA. Los nucleótidos en que difieren las secuencias de estos shRNA pueden haber sido modificados mediante procedimientos químicos o enzimáticos.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a un compuesto farmacéutico que incluye cualquiera de las versiones de siRNA o shRNA frente a SEQ ID NO 1 que se han detallado en esta descripción así como su uso en Ia elaboración de un medicamento para disminuir la PIO anormalmente elevada debido a enfermedades como el glaucoma, la uveítis, Ia retinopatía diabética o determinadas enfermedades infecciosas o sistémica's.
También se refiere a un método para, tratar Ia PlO mediante el uso de siRNA. o shRNA frente a Ia secuencia diana del gen del receptor purinérgico P2Y2 en pacientes con PIO elevada debido a cualquiera de las enfermedades mencionadas. •
Las preparaciones que contienen los siRNA o shRNA pueden tener diversas formulaciones, de modo que los siRNA o shRNA puedan estar preparados en un vehículo adecuado para permitir una penetración más eficaz del principio activo (como por ejemplo liposomas). Dichos vehículos deben poseer propiedades aceptables para la administración ocular y pueden comprender, además de los mencionados liposomas, polímeros bíodegradables, hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas, microesferas, dendrímeros o
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) vectores para proteínas. En otros casos el siRNA o el shRNA podrá estar formulado con poíietileneimina o derivados como polietinleneimina
, polietiíénglicol-N-acetilgalactosamina . o - polietiíenglicol-triN- acetilgalactosamina. Los siRNA y shRNA también pueden prepararse con agentes que permiten Ia permeabilización a través de membranas, como pueden ser preparados lipidíeos.
La administración de los siRNA y shRNA puede realizarse en soluciones acuosas y no acuosas, geles acuosos y no acuosos, cremas, emulsiones, microemulsíones, liposomas, aceites, lociones o aerosoles.
El siRNA se aplica de manera tópica como manera más sencilla, aunque también se pueden emplear otros protocolos y composiciones. Los siRNA preparados pueden aplicarse de manera sistémica o local, por vía oral, transdérrηica o en inyecciones. En este último caso, son especialmente interesantes las inyecciones ¡ntracamerular, subconjuntival e intravítrea.
La dosis farmacéuticamente efectiva será aquella que prevenga, inhiba Ia aparición o trate el estado patológico en cuestión. Esto varía. dependiendo de Ia patología que produzca Ia hipertensión ocular, la composición, Ia vía de administración, el tipo de animal a tratar y otros aspectos que dependen del análisis médico por parte del especialista (como otros tratamientos simultáneos). De manera general se administra una cantidad que oscila entre 0.1 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal al día.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para facilitar Ia comprensión de las principales características de Ia invención y formando parte integrante de esta memoria descriptiva, se acompaña una figura. Con carácter ilustrativo y no limitativo se ha representado Io siguiente:
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Figura 1 : Efecto del siRNA frente ai gen del receptor P2Y2 donde se puede ver ía bajada de ía presión \ntraocu\ar (PIO) en los animales tratados cuando se compara con los ojos contralaterales tratados solamente con solución salina.
•5
WIODO DE REALIZACIÓN
Habiendo descrito Ia presente invención, se ilustra adicionalmente mediante0 los siguientes ejemplos, que no son limitativos d.e su alcance; dicho alcance viene definido exclusivamente. por Ia nota reivindicatoria adjunta.
Ejemplo 1 5 Para el diseño del siRNA específico del receptor P2Y2 de conejo fue necesario clonar dicho receptor. El clonaje se realizó a partir de RNA total de epitelio corneal de conejo utilizando oligonucleótidos degenerados y las técnicas RT-PCR y RACE (Rapid Amplification of cDNA ends) que cualquier experto en al materia conoce. Para obtener las secuencias diana con mayor0 probabilidad de éxito de silenciamiento por siRNA, se utilizó el sistema de búsqueda de Applied Biosystems con el que, mediante una serie de criterios empíricos, se seleccionaron 9 secuencias. Los siRNA que reconocen esas secuencias dianas fueron proporcionados por Applied Biosystems en Ia forma anillada, purificados y liofilizados. Para medir la eficacia de dichos siRNA in5 vitro, se resuspendieron en agua libre de RNasas y para su aplicación in vivo fueron resuspendidos en NaCI 0.9%.
Ejemplo 2 0 El siRNA fue ensayado en el modelo animal del conejo de Nueva Zelanda. Para ello se usó siRNA cuya secuencia es complementaria a Ia secuencia anteriormente descrita (SEQ ID NO 1) y cuya obtención se ejemplifica en el
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) ejemplo 1 de esta memoria. La secuencia de conejo es Ia homologa para el receptor humano por io que el siRNA diseñado puede utilizarse en el ser humano.
Los estudios para valorar Ia especificidad de los siRNA se realizaron tanto in vitro como in vivo. Se realizaron estudios in vitro que demostraron Ia eficiencia y especificidad de los siRNA diseñados al silenciar, en cultivos celulares primarios de epitelio, los niveles del mRNA correspondiente al receptor P2Y2. El análisis de Ia eficacia de dichos siRNA se determino mediante inmunocitoquímica, a partir de células de epitelio corneal de conejo transfectadas con 30OnM de dichos siRNAs. Este análisis reveló Ia eficiencia de silenciamiento del siRNA que tenía como secuencia diana Ia secuencia caracterizada por SEQ ID NO 1.
Posteriormente se realizaron estudios in vivo. Por un lado se estudió el silenciamiento in vivo del receptor por técnicas inmunohistoquímicas. Para ello se trató al animal con el siRNA y en el momento de máxima disminución de Ia presión intraocular se sacrificó para realizar técnicas inmunohistoquímicas de los procesos ciliares con el anticuerpo para el receptor P2Y2, empleando el anticuerpo comercial de Ia casa Santa Cruz (SC-1520), y realizando Ia inmunohistoquímica siguiendo las especificaciones del fabricante. Estos resultados demostraron Ia desaparición de Ia proteína, y permitieron realizar a continuación estudios del efecto de los siRNA sobre Ia presión ¡ntraocular.
Los estudios de Ia presión intraocular se realizaron en conejos de Ia raza Nueva Zelanda midiéndoles Ia presión intraocular. El ojo del conejo es especialmente interesante al ser grande y de ese modo poderse realizar medidas de presión ¡ntraocular de una manera precisa. La presión intraocular de estos animales, entorno a 20mm Hg, puede disminuir hasta el 40% con el uso de tratamientos comerciales para Ia hipertensión ocular.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Los animales empleados fueron normotensos ya que de ese modo Ia reproducibilidad de las medidas de presión intraocular y Ia facilidad de las mismas estaban garantizadas.
Los conejos se mantuvieron en jaulas individuales con libre acceso a comida y bebida. Estaban sometidos a ciclos de luz/ oscuridad de 12 horas para evitar las oscilaciones debidas a los ciclos circadianos. Para Ia realización de Ia experimentación se siguió Ia directiva europea 86/609/EEC para el uso y manejo de los animales de experimentación.
Los siRNA se aplicaron instilando tópicamente un volumen de 40μl en Ia superficie de Ia córnea. El ojo contralateral recibió un volumen equivalente del vehículo utilizado, es decir, solución salina, y se utilizó como ojo control.
Las medidas de Ia presión intraocular se realizaron por medio de un tonómetro de rebote TonoVet. Este tonómetro es mínimamente invasivo, por Io que no requiere el uso de anestesia. Las medidas se realizaron midiendo el nivel basal de Ia presión intraocular y el experimento se repitió un total de 8 veces. Para evitar problemas, los experimentos se realizaron siempre a Ia misma hora del día, Io que permitió obtener una valoración más objetiva de los resultados.
El protocolo de aplicación del siRNA fue el siguiente: las dosis del siRNA preparadas en solución salina (NaCI 0.9% p/v) en un volumen final de 40μl se aplicaron en cada ojo durante cuatro días consecutivos a Ia misma hora. El ojo. contralateral recibió 40μl de solución salina, durante el mismo número de días y a Ia misma hora. La presión intraocular fue medida antes de cada aplicación y cada 2, 4 y 6 horas durante los siguientes 7 días. Las máximas respuestas en Ia bajada de Ia presión intraocular se obtuvieron a las 24 horas de comenzar el tratamiento y duraron hasta el quinto día.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) La figura 1 muestra los resultados obtenidos. Los cuadrados negros indican los datos obtenidos a partir del ojo en el que se aplicó únicamente solución salina; los círculos blancos reflejan los resultados obtenidos en el ojo que se trató con el siRNA de Ia invención. El eje de las X expresa el tiempo en horas y el de las Y indica el valor de Ia PIO y cómo varía respecto al control (al que se Ie da un valor del 100 %) Como se aprecia en Ia figura 1 , el resultado del tratamiento con el siRNA mostró una disminución de Ia presión infraocular qué, además, resultó estadísticamente significativa, objetivo fundamental de todas las terapias para patologías que cursan con hipertensiones oculares como el glaucoma. Comparativamente con el ojo contralateral tratado con solución salina, que apenas fluctuó, los ojos tratados con el siRNA de Ia invención disminuyeron Ia presión intraocular por debajo de Ia línea base hasta un 50% (figura 1). Dichos valores fueron normalizados sobre los valores de Ia línea base y los puntos en Ia figura representan Ia media y el error estándar de Ia media:
El efecto del siRNA no solamente fue notable en su capacidad hipotensora de Ia presión intraocular sino que además su efecto fue muy duradero ya que llegó a durar cuatro días, en clara comparación con los fármacos comerciales cuya duración es de unas pocas horas.
Adicionalmente, no se observaron efectos secundarios ni durante ni después del tratamiento con el síRNA. Los posibles efectos secundarios que se estudiaron fueron irritación corneo conjuntiva!, edema corneal, tindall en cámara anterior y formación de cataratas.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Claims

REIVINDICACIONES
1. Molécula aislada de siRNA que comprende una secuencia de 19 nucleótidos complementaria a Ia secuencia diana SEQ ID NO 1 del gen del receptor purinérgico P2Y2.
2. Molécula aislada de siRNA, según Ia reivindicación 1, cuya secuencia contiene hasta 7 nucleótidos más que SEQ ID NO 1 distribuidos indistintamente en ambos extremos.
3. Molécula aislada de siRNA, según Ia reivindicación 1 , cuya secuencia contiene dos nucleótidos más que SEQ ID NO 1 en el extremo 3' de cada una de las hebras siendo esos dos nucleótidos o bien dos desoxitiminas (TT) o bien dos uridinas (uu).
4. Molécula aislada de siRNA, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que contiene nucleótidos modificados química o enzimáticamente.
5. Molécula, aislada de shRNA cuya cadena antisentido es complementaria a Ia secuencia diana caracterizada por SEQ ID NO 1 del gen del receptor purinérgico P2Y2.
6. Molécula aislada de shRNA, según Ia reivindicación 5, cuyas secuencias (sentido y antisentidó) contienen de 19 a 29 nucleótidos distribuidos indistintamente entre ambas secuencias.
7. Molécula aislada de shRNA, según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, que contiene nucleótidos modificados química o enzimáticamente.
8. Composición farmacéutica que comprende Ia molécula de cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
9. Uso de la molécula de RNA de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para elaborar un medicamento para el tratamiento de Ia presión intraocular elevada.
5 10. Uso, según Ia reivindicación 9, donde Ia presión intraocular elevada está causada por glaucoma.
11. Uso, según Ia reivindicación 9, donde Ia presión intraocular elevada está causada por retinopatía diabética.
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12. Uso, según la reivindicación 9, donde Ia presión intraocular elevada- está causada por una uveítis.
13. Uso, según Ia reivindicación 9, donde Ia presión intraocular elevada está 15 causada por una enfermedad sistémica.
14. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde el medicamento se administra tópicamente en el ojo del paciente.
20 15. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde el medicamento se administra en el ojo del paciente a través de una inyección intracamerular.
16. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde el 25 medicamento se administra en el ojo del paciente a través de una inyección subconjuntival.
17. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde el medicamento se administra en el ojo del paciente a través de una inyección
30 intravitrea.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
18. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde el medicamento se administra en Ia córnea del paciente.
19. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 10-18, donde el paciente es un ser humano.
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