WO2010004525A1 - Compositions renfermant une association de propolis et d'un dérivé phénolique et leurs applications biologiques - Google Patents

Compositions renfermant une association de propolis et d'un dérivé phénolique et leurs applications biologiques Download PDF

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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals

Definitions

  • the invention relates to novel compositions containing, in combination, a phenol derivative and propolis. It also relates to the biological applications of such an association, in particular for the treatment of viral and retroviral infections.
  • patent FR 2659234 relates to compositions exerting an antiviral action against herpes viruses and comprising in combination propolis with phenolic compounds such as phenol, pyrocatechol, resorcinol, hydroquinone, benzenetriol, pyrogallol, phloroglucinol, gallic acid etc.
  • phenolic compounds such as phenol, pyrocatechol, resorcinol, hydroquinone, benzenetriol, pyrogallol, phloroglucinol, gallic acid etc.
  • the object of the invention is therefore to provide novel compositions of phenolic derivatives with propolis, and in particular new compositions in which the weight ratios between the phenolic derivative and propolis are well defined, in order to obtain a maximum synergistic effect for minimum amounts of active ingredient.
  • compositions comprising, in combination, at least one phenolic derivative and propolis, characterized in that the said phenolic derivative corresponds to the following formula (I):
  • R represents a hydrogen atom, a C 1 -C 5 alkyl radical or a group -N (R 1, R 2), with R 1 and R 2, identical or different, representing a hydrogen atom or a C 1 -C 4 alkyl radical; C5.
  • the invention also covers the pharmacologically acceptable salts of this acid.
  • compositions contain a single phenol derivative of formula (I).
  • a preferred derivative is 3,5-di-tert-butyl, 4-hydroxybenzoic acid or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • two or more phenolic derivatives are present.
  • one of the derivatives is 3,5-di-tert-butyl, 4-hydroxybenzoic acid or a salt of this pharmacologically acceptable acid.
  • the propolis used in these compositions may be in crude form or in extract form.
  • the crude propolis collected in the hives generally comprises resins and balsamic substances (about 50 to 55% by weight), beeswax (about 30 to 40% by weight), volatile or essential oils (about 5 to 10% by weight). % by weight), pollen (about 5% by weight).
  • Propolis also contains many other elements such as organic acids, flavonoids, trace elements, vitamins.
  • the propolis extract is a purified product as currently marketed, and is for example in liquid form (for example in the form of mother tincture). It is particularly a hydroalcoholic extract obtained by cold maceration of propolis.
  • the extract is produced according to the criteria of the French Pharmacopoeia with the alcohol content between 85 and 95%. Only a high alcohol content can allow maximum extraction of active ingredients (including flavonoids).
  • the weight ratio in% of phenol (s) to propolis is 0.1 to 0.006 / 0.01 to 0.006.
  • the amounts of phenol derivatives, and in particular of 3,5-di-tert-butyl, 4-hydroxybenzoic acid or a pharmacologically acceptable salt of this acid are from 0.05 to 0.005% by weight relative to the total weight of said composition.
  • the amounts of propolis are from 0.01% to 0.006% by weight relative to the total weight of said composition.
  • compositions have antiviral properties of great interest which, according to the invention, are obtained with very low doses of phenolic active ingredient.
  • the invention therefore also covers the use of the compositions defined above as medicaments.
  • compositions of the invention are characterized in that they contain a therapeutically effective amount of at least one composition as defined above.
  • compositions are advantageously in a form suitable for oral, injectable or parenteral administration.
  • the pharmaceutical compositions of the invention as defined above are used in humans or animals to prevent or treat viral infections caused by lipid capsid viruses, and in particular vis-à-vis viral viruses. herpes (HSV), or lipid capsid viruses such as HIV.
  • HSV herpes
  • HIV lipid capsid viruses
  • the subject of the invention is also the use of the compositions as defined above for the manufacture of medicinal products with virulicidal activity on the herpes virus HSV-1.
  • the invention also relates to the use of the compositions as defined above for producing virulicidal drugs on the HIV AIDS virus.
  • EXAMPLE 1 Activity against the HSV-1 virus of a composition comprising, in combination, 3,5-di-tert-butyl, 4-hydroxybenzoic acid and propolis.
  • HSV-1 refers to the herpes simplex virus type 1
  • BG4 denotes 3,5-di-tert-butyl, 4-hydroxybenzoic acid
  • Prp refers to propolis extract in liquid form.
  • compositions of BG4 comprising different concentrations of said acid are prepared and studied:
  • composition BG4 at 0.005% by weight of BG4 relative to the total weight of the composition, composition BG4 with 0.01% by weight of BG4 relative to the total weight of the BG4 composition,
  • composition BG4 at 0.025% by weight of BG4 relative to the total weight of the BG4 composition
  • composition BG4 at 0.05% by weight of BG4 relative to the total weight of the composition BG4.
  • compositions comprising in combination BG4 and Prp at different concentrations of BG4 and Prp were prepared and studied, namely: - BG4 0.01% + Prp 100 ⁇ g / ml, - BG4 0.01% + Prp 200 ⁇ g / ml
  • BG4 alone and Prp alone (expressed in weight percent) relative to the total weight of the composition are from 0.1 to 0.006 / 0.01 to 0.006.
  • the different samples are incubated in the presence of HSV-1 for 30 min or 60 min at 37 ° C. with shaking (see tests described below). After centrifugation, the infectious titres are determined according to the usual method (the so-called limiting dilutions) and are compared to HSV-1 control samples, propolis control samples and BG4 control samples incubated under the same conditions.
  • Yb Infectious titre of the control BG4 / Infectious title of the control virus HSV-1;
  • Interaction Yab Infectious Title of the Association (BG4 + Prp) (Assays) / Infectious Title of the Control HSV-1 Virus;
  • Test No. 1 Incubation for 30 min at 37 ° C of the following samples:
  • control samples BG4 BG4 at concentrations of 0.05% and 0.025%;
  • Prp Prp control samples at concentrations of 100, 150, 200 and 300 ⁇ g / ml; - "test" samples: (BG4 0.05% + Prp 100 ⁇ g / ml); (BG4 0.05% + Prp 150 ⁇ g / ml); (BG4 0.05% + Prp 200 ⁇ g / ml); (BG4 0.05% + Prp 300 ⁇ g / ml); (BG4 0.025% + Prp 100 ⁇ g / ml); (BG4 0.025% + Prp 150 ⁇ g / ml); (BG4 0.025% + Prp 200 ⁇ g / ml).
  • the infectious titre of the control virus HSV-1 is 10 4 Dl 5 o / ml.
  • Table 2 (1) The results obtained in Table 2 (1) indicate that the phenolic derivative BG4 alone shows a clear virulicidal activity: reduction of the infectious titre respectively by 2 logs for BG4 0.05% compared to the infectious titre of the virus control. HSV-1 and 1 log for BG4 0.025% compared to the infectious titre of the HSV-1 virus control.
  • Table 3 concludes on the nature of the interaction between BG4 and Prp (synergistic, subadditive or interference reaction). Table 3:
  • Prp 200 1 BG4 0, 05% 0.5 0.5 0.625 interference
  • Prp 200 1 BG4 0, 025% 0.75 0.75 0.625 synergy
  • Prp 150 1 BG4 0.025% 0.75 0.75 0, 625 synergy
  • Prp 200 1 BG4 0.025% 0.75 0.75 0, 625 synergy
  • Test No. 2 Incubation for 60 min at 37 ° C of the following samples:
  • Prp control samples at concentrations of 100, 150, 200 and 300 ⁇ g / ml;
  • the infectious titer of the HSV-1 virus control is 10 55 Dl 5 o / ml.
  • Prp 150 0, 90 BG4 0.05% 0, 45 0.40 0.45 subadditive
  • BG4 at a concentration of 0.025% drops the infectious titer of 3 logs, which is greater than or equal to the decrease of the titre found in the tests.
  • Test No. 3 Incubation for 60 min at 37 ° C of the following samples:
  • Prp control samples at concentrations of 200, 300, 400 and 600 ⁇ g / ml;
  • the infectious titer of the HSV-1 virus control is 10 4 '5 ID 50 / ml.
  • Test No. 3 confirms Test No. 2, namely that BG4 used at a concentration of 0.025% with an incubation time of 60 minutes is too active to observe a synergistic phenomenon.
  • Test No. 4 Incubation for 60 min at 37 ° C of the following samples:
  • Prp control samples at concentrations of 100, 200, 300 and 400 ⁇ g / ml;
  • the infectious titer of the HSV-1 virus control is 10 4 '5 ID 50 / ml.
  • Test No. 4 confirms that, when the product BG4 and propolis are added simultaneously to the HSV-1 virus, a synergy of their virulicidal activity is noted under the following conditions: - BG4 at 0.01% and Propolis at 400 ⁇ g / ml; - BG4 at 0.005% and Propolis at 300 ⁇ g / ml;
  • compositions comprising in combination (BG4 and propolis) for which a synergism of their virulicidal activity on the HSV-1 virus was noted are those comprising the concentrations of BG4 and propolis. following: Incubation at 37 ° C 30 minutes:
  • EXAMPLE 2 Activity against the HIV virus of a composition comprising, in combination, 3,5-di-tert-butyl, 4-hydroxybenzoic acid and propolis.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • PHA phytohemagglutinin A
  • rHulL2 recombinant human interleukin 2
  • TCID50 Viral dose infecting 50% of the wells
  • 90% 90% effective dose (which reduces viral activity by 90%);
  • 70% 70% effective dose (which decreases viral activity by 70%);
  • 50% 50% effective dose (which decreases viral activity by 50%);
  • Tox 50% Toxic dose 50% (dose that destroys 50% of the cells);
  • the antiviral compositions tested are respectively:
  • compositions of BG4 alone comprising respectively the following decreasing concentrations: 0.03, 0.015, 0.005, 0.0017 and 0.0006% of BG4 relative to the total weight of the composition;
  • compositions of BG4 and propolis respectively comprising the following decreasing concentrations of BG4: 0.03, 0.015, 0.005, 0.0017 and 0.0006% for 0.03% of propolis.
  • ⁇ l of cell suspension (10 6 cells per ml counted with Coulter) in buffered nutrient medium RPMI 1640 (DIFCO) are brought into contact with respectively 50 ⁇ l of BG4 composition alone and 50 ⁇ l of composition (BG4 / Prp) at the decreasing concentrations defined above (300, 150, 50, 17, 6 ⁇ g of BG4 / ml diluted in RPMH 640 culture medium) and 50 ⁇ l of viral inoculum (containing 1000 to 1250 TCID50 per ml, infecting 100% of cells in 1 hour).
  • the contact between the cells and the composition BG4 or (BG4 / Prp) is carried out either 24 hours (pretreatment) before viral inoculation, or 20 minutes before virus inoculation.
  • BG4 / Prp antiviral composition
  • PEG400 10 mg of antiviral composition (BG4 / Prp) are dissolved in 1 ml of PEG400 by sonication (10 minutes in a Branson ultrasonic tank) and the solution is added to 1 ml of PEG / water (50/50) mixture for injection (ppi) to give a preparation called "PO" at 5000 ⁇ g / ml of (BG4 / Prp).
  • the BG4 / Prp compositions were made by adding 200 ⁇ l of "PO", 100 ⁇ l containing 60 ⁇ g of propolis to 700 ⁇ l of the PEG / water mixture (10/90) to obtain the preparation "P'1".
  • the propolis concentration is unchanged (60 ⁇ g in 50 ⁇ l of composition BG4) at each of the different concentrations of BG4.
  • the viral inoculum used in this study is more particularly the HIV1 virus (strain LAI) prepared according to the method published by Barré-Sinoussi et al. 1983, Science, 220 (4599), 868-871.
  • the virus is produced on chronically infected CD4 T lymphoblastoid cells (CEM-HIV-LAI line). Periodically, the cells are centrifuged, resuspended in RPMM 640 culture medium containing 10% fetal calf serum and 1% glutamine. They are mixed with 14 with uninfected CEM cells at the final concentration of 5 x 10 5 cells per ml to maintain viral production. The virus present in the culture supernatant is concentrated by centrifugation at 17000 rpm for 3 hours. The pellet is resuspended in NE buffer, aliquoted and stored at -80 ° C. The concentration of the virus used was 1250 TCID 50 per ml.
  • the search in the supernatant made it possible to quantify the HIV-LAI virus by the p24 surface antigen.
  • the cells are pre-treated by placing them in contact with the BG4 compositions or
  • the cells are contacted with the BG4 or (BG4 / Prp) compositions, and then 20 minutes after the viral inoculum is applied to the cells.
  • BG4 alone is inactive and non-cytotoxic up to the concentration of 300 ⁇ g / ml.
  • Precipitates of active substance are observed as soon as they are placed in contact with the cells in RPMI 1640 enriched in fetal calf serum and glutamine.
  • BG4 associated with propolis is on the other hand active from 30 ⁇ g / ml (-2 logs) and its maximum activity -4 (-3,5 to - 4,5 logs) is observed at 90 ⁇ g / ml or with about 10 times less active substance.
  • the antiviral activity was accompanied by a moderate cytotoxic effect (calculated safety factor 1, 5). This toxicity may be due to the solvent PEG 400 (Sigma) used to solubilize respectively BG4 and (BG4 / Prp).
  • Propolis potentiates BG4 significantly, thus obtaining a maximum synergistic effect for minimal amounts of BG4 and propolis.

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Abstract

L'invention a pour objet de nouvelles compositions possédant notamment des propriétés antivirales, caractérisées en qu'elles renferment, en association, au moins un dérivé phénolique et de la propolis, ledit dérivé phénolique répondant à la formule (I) suivante : (I) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C5 ou un groupe -N(R1, R2), avec R1 et R2 identiques ou différents, représentant un atome d'hydrogène ou un radical alkyle en C1-C5.

Description

COMPOSITIONS RENFERMANT UNE ASSOCIATION DE PROPOLIS ET D'UN DERIVE PHENOLIQUE ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES.
L'invention a pour objet de nouvelles compositions renfermant, en association, un dérivé phénolique et de la propolis. Elle concerne également les applications biologiques d'une telle association, en particulier pour le traitement des infections virales et rétrovirales.
Les effets anti-infectieux de divers dérivés phénoliques d'une part et de la propolis d'autre part ont déjà été rapportés dans la littérature. L'utilisation, en association, de tels composés a également été décrite.
Ainsi, le brevet FR 2659234 concerne des compositions exerçant une action antivirale vis-à-vis des virus de l'herpès et comprenant en association de la propolis avec des composés phénoliques tels que les phénol, pyrocatéchol, résorcinol, hydroquinone, benzènetriol, pyrogallol, phloroglucinol, acide gallique etc.
Les résultats indiqués dans FR 2659234 montrent un effet synergique, conduisant à une réduction des doses en composés actifs.
Les travaux poursuivis par l'Inventeur dans ce domaine ont conduit à constater que, de manière inattendue, cet effet synergique pouvait être fortement amplifié en utilisant des dérivés phénoliques spécifiques, et qui plus est dans de faibles quantités.
L'invention a donc pour but de fournir de nouvelles compositions de dérivés phénoliques avec de la propolis, et notamment de nouvelles compositions dans lesquelles les rapports pondéraux entre le dérivé phénolique et la propolis sont bien définis, afin d'obtenir un effet synergique maximum pour des quantités minimales de principe actif.
Elle vise également la mise à profit des propriétés synergiques élevées des associations résultantes pour l'élaboration de compositions pharmaceutiques antivirales de grand intérêt. La présente invention a pour objet des compositions renfermant en association au moins un dérivé phénolique et de la propolis caractérisées en ce que ledit dérivé phénolique répond à la formule (I) suivante :
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dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1 -C5 ou un groupe -N(R1 , R2), avec R1 et R2, identiques ou différents, représentant un atome d'hydrogène ou un radical alkyle en C1 -C5.
Lorsque le dérivé phénolique est l'acide 3,5-di-tertiobutyl, 4-hydroxybenzoïque, l'invention couvre également les sels de cet acide pharmacologiquement acceptables.
Selon un mode de réalisation de l'invention, lesdites compositions renferment un seul dérivé phénolique de formule (I).
Un dérivé préféré correspond à l'acide 3,5-di-tertiobutyl, 4-hydroxybenzoïque ou à un sel pharmacologiquement acceptable de cet acide.
Dans un autre mode de réalisation, deux dérivés phénoliques, ou plus, sont présents. De manière avantageuse, l'un des dérivés est l'acide 3,5-di-tertiobutyl, 4- hydroxybenzoïque ou un sel de cet acide pharmacologiquement acceptable.
La propolis utilisée dans ces compositions peut se trouver sous forme brute ou sous forme d'extrait.
La propolis brute recueillie dans les ruches comprend généralement des résines et substances balsamiques (environ 50 à 55% en poids), de la cire d'abeille (environ 30 à 40% en poids), des huiles volatiles ou essentielles (environ 5 à 10% en poids), du pollen (environ 5% en poids). La propolis contient également beaucoup d'autres éléments comme des acides organiques, des flavonoïdes, des oligo-éléments, des vitamines.
L'extrait de propolis est un produit purifié tel que couramment commercialisé, et se trouve par exemple sous forme liquide (par exemple sous forme de teinture-mère). Il s'agit notamment d'un extrait hydroalcoolique obtenu par macération à froid de la propolis. L'extrait est produit selon les critères de la Pharmacopée française à la teneur en alcool entre 85 et 95%. Seule une teneur en alcool élevée peut permettre une extraction maximum des principes actifs (notamment des flavonoïdes).
De manière avantageuse, le rapport pondéral en % de déhvé(s) phénolique(s) à la propolis est de 0.1 à 0,006 / 0,01 à 0,006.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les quantités de dérivés phénoliques, et notamment d'acide 3,5-di-tertiobutyl, 4-hydroxybenzoïque ou d'un sel pharmacologiquement acceptable de cet acide, sont de 0,05 à 0,005 % en poids par rapport au poids total de ladite composition.
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, les quantités de propolis sont de 0,01 % à 0,006 % en poids par rapport au poids total de ladite composition.
Ces compositions sont dotées de propriétés antivirales de grand intérêt qui, conformément à l'invention, sont obtenues avec des doses très faibles de principe actif phénolique.
L'invention couvre donc également l'utilisation des compositions définies ci-dessus comme médicaments.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins une composition telle que définie ci-dessus.
Ces compositions se présentent avantageusement sous une forme appropriée pour une administration par voie orale, injectable ou parentérale. Les compositions pharmaceutiques de l'invention telles que définies ci-dessus sont utilisées chez l'homme ou l'animal pour prévenir ou traiter des infections virales provoquées par les virus à capside lipidique, et en particulier vis-à-vis des virus de l'herpès (HSV), ou les virus à capside lipidique comme HIV.
Ainsi, l'invention a encore pour objet l'utilisation des compositions telles que définies ci-dessus pour fabriquer des médicaments à activité virulicide sur le virus de l'herpès HSV-1.
L'invention concerne également l'utilisation des compositions telles que définies ci- dessus pour fabriquer des médicaments à activité virulicide sur le virus du sida VIH.
Les exemples suivants illustrent l'invention et ne la limitent en aucune façon.
EXEMPLE 1 : Activité contre le virus HSV-1 d'une composition comprenant en association de l'acide 3,5-di-tertiobutyl, 4-hvdroxybenzoïque et de la propolis.
Les essais rapportés ci-après démontrent la synergie d'une composition comprenant en association un dérivé phénolique et de la propolis, en tant que moyen antiviral vis- à-vis du virus de l'herpès HSV-1 , par rapport à une composition ne comprenant pas cette association, et ont permis de définir les meilleurs rapports pondéraux entre le dérivé phénolique et la propolis pour une synergie maximale.
Les abréviations suivantes seront utilisées dans ce qui suit :
- « HSV-1 » : désigne le virus herpès simplex de type 1 ,
- « BG4 » : désigne l'acide 3,5-di-tertiobutyl, 4-hydroxybenzoïque,
- « Prp » : désigne l'extrait de propolis sous forme liquide.
1 ) Préparation des compositions étudiées
Quatre compositions de BG4 comprenant différentes concentrations dudit acide sont préparées et étudiées :
- composition BG4 à 0,005% en poids de BG4 par rapport au poids total de la composition, - composition BG4 à 0,01 % en poids de BG4 par rapport au poids total de la composition BG4,
- composition BG4 à 0,025% en poids de BG4 par rapport au poids total de la composition BG4,
- composition BG4 à 0,05% en poids de BG4 par rapport au poids total de la composition BG4.
Six extraits liquides de propolis à différentes concentrations de propolis sont préparés et étudiés :
- Prp 100 μg de propolis/ml d'extrait liquide,
- Prp 150 μg de propolis/ml d'extrait liquide,
- Prp 200 μg de propolis/ml d'extrait liquide,
- Prp 300 μg de propolis/ml d'extrait liquide,
- Prp 400 μg de propolis/ml d'extrait liquide,
- Prp 600 μg de propolis/ml d'extrait liquide.
Ces différents extraits de Prp sont avantageusement obtenus selon les techniques habituelles , comprenant par exemple une étape de filtration des produits bruts, de dissolution dans un solvant alcoolique, d'évaporation, et d'extraction sous vide de l'alcool, suivie d'une reprise par du propylène glycol.
Les compositions suivantes comprenant en association BG4 et Prp à différentes concentrations de BG4 et de Prp ont été préparées et étudiées, à savoir : - BG4 0,01 % + Prp 100 μg/ml, - BG4 0,01 % + Prp 200 μg/ml,
- BG4 0,01 % + Prp 300 μg/ml,
- BG4 0,01 % + Prp 400 μg/ml, - BG4 0,01 % + Prp 600 μg/ml,
- BG4 0,025% + Prp 100 μg/ml,
- BG4 0,025% + Prp 150 μg/ml,
- BG4 0,025% + Prp 200 μg/ml,
- BG4 0,025% + Prp 300 μg/ml,
- BG4 0,025% + Prp 400 μg/ml,
- BG4 0,025% + Prp 600 μg/ml, BG4 0,05% + Prp 100 μg/ml, BG4 0,05% + Prp 150 μg/ml, BG4 0,05% + Prp 200 μg/ml, BG4 0,05% + Prp 300 μg/ml, BG4 0,005% + Prp 100 μg/ml, BG4 0,005% + Prp 200 μg/ml, BG4 0,005% + Prp 300 μg/ml, BG4 0,005% + Prp 400 μg/ml.
Les quantités respectives de BG4 seul et de Prp seul (exprimées en pourcentage en poids) par rapport au poids total de la composition sont de 0,1 à 0,006 / 0,01 à 0,006.
2) Protocole expérimental
A un même volume de virus stock HSV-1 , des quantités décroissantes de BG4 et de Prp sont ajoutées comme indiqué dans le tableau 1 ci-après.
Tableau 1 :
Figure imgf000007_0001
Les différents échantillons sont incubés en présence de HSV-1 pendant 30 min ou 60 min à 37°C sous agitation (voir essais décrits ci-dessous). Après centrifugation, les titres infectieux sont déterminés selon la méthode habituelle (la méthode dite des dilutions limites) et sont comparés à des échantillons témoin de virus HSV-1 , des échantillons témoins de propolis et des échantillons témoins de BG4 incubés dans les mêmes conditions.
Des essais similaires sont réalisés avec BG4 0,025 % et 0,001 %.
Pour mesurer l'effet de synergie entre BG4 et Prp, la méthode décrite par R. F. SCHINAZI et al. a été utilisée (Antimicrob. Agents Chemother., 22 (No 3), pages 499-507 (1982)), méthode reprise par J.C. POTTAGE (ibidem 30, (No 2), pages 215- 219, (1986)).
Les termes suivants sont définis :
Ya = Titre infectieux du témoin Prp / Titre infectieux du témoin virus HSV-1 ;
Yb = Titre infectieux du témoin BG4 / Titre infectieux du témoin virus HSV-1 ;
Interaction Yab = Titre infectieux de l'association (BG4 + Prp) (Essais) / Titre infectieux du témoin virus HSV-1 ;
Yc = Ya x Yb.
Si :
Yab < Yc, l'interaction entre BG4 et Prp est une synergie ;
Yab > Yc mais < au composé le plus actif seul, l'interaction est dans ce cas une réaction subadditive ;
Yab > au composé le plus actif mais < au composé le moins actif, l'interaction est alors dénommée interférence.
Pour simplifier les calculs, les titres infectieux trouvés lors des essais des associations (BG4 + Prp) et des essais témoins ont été exprimés par leur logarithme décimal (log).
2) Résultats pour l'essai n°1
Essai n°1 : Incubation pendant 30 min à 37°C des échantillons suivants :
- échantillons témoins BG4 : BG4 aux concentrations de 0,05% et 0,025% ;
- échantillons témoins Prp : Prp aux concentrations de 100, 150, 200 et 300 μg/ml ; - échantillons « essais » : (BG4 0,05% + Prp 100 μg/ml) ; (BG4 0,05% + Prp 150 μg/ml) ; (BG4 0,05% + Prp 200 μg/ml) ; (BG4 0,05% + Prp 300 μg/ml) ; (BG4 0,025% + Prp 100 μg/ml) ; (BG4 0,025% + Prp 150 μg/ml) ; (BG4 0,025% + Prp 200 μg/ml).
Le titre infectieux du témoin virus HSV-1 est de 104 Dl5o/ml.
Dans ce qui suit, les titres infectieux seront toujours exprimés dans l'unité DI50/ml Les résultats obtenus sont indiqués dans les tableaux 2(1 ) et 2(2) ci-dessous. Tableau 2(1 ) :
Figure imgf000009_0001
Les résultats obtenus dans le tableau 2(1 ) indiquent que le dérivé phénolique BG4 fait preuve à lui seul d'une activité virulicide nette : réduction du titre infectieux respectivement de 2 logs pour BG4 0,05% par rapport au titre infectieux du témoin virus HSV-1 et de 1 log pour BG4 0,025% par rapport au titre infectieux du témoin virus HSV-1. Tableau 2(2) :
Figure imgf000009_0002
A partir des valeurs indiquées dans les tableaux 2(1 ) et 2(2), les valeurs Ya, Yb, Yc et Yab sont calculées et reportées dans le tableau 3 ci-dessous.
Le tableau 3 conclue sur la nature de l'interaction entre BG4 et Prp (réaction synergique, subadditive ou interférence). Tableau 3 :
Ya Yb Yc Yab Nature de l'interaction
Prp 100 1 BG4 0 ,05% 0,5 0,5 0,875 interférence
Prp 150 1 BG4 0 ,05% 0,5 0,5 0,625 interférence
Prp 200 1 BG4 0 ,05% 0,5 0,5 0,625 interférence
Prp 300 1 BG4 0 ,05% 0,5 0,5 0,5 interférence
Prp 100 1 BG4 0 ,025% 0,75 0,75 0,625 synergie
Prp 150 1 BG4 0 ,025% 0,75 0,75 0,625 synergie
Prp 200 1 BG4 0 ,025% 0,75 0,75 0,625 synergie
3) Conclusion pour l'essai n°1
Lorsque BG4 à 0,025% est associé à des faibles doses de propolis (respectivement 100, 150 et 200 μg/ml), on observe un phénomène de synergie (l'incubation dans cet essai n°1 étant limitée à 30 min).
Prp 100 1 BG4 0,025% 0,75 0,75 0 ,625 synergie
Prp 150 1 BG4 0,025% 0,75 0,75 0 ,625 synergie
Prp 200 1 BG4 0,025% 0,75 0,75 0 ,625 synergie
4) Résultats pour l'essai n°2
Essai n°2 : Incubation pendant 60 min à 37°C des échantillons suivants :
- échantillons témoins BG4 : BG4 à la concentration de 0,025% ;
- échantillons témoins Prp : Prp aux concentrations de 100, 150, 200 et 300 μg/ml ;
- échantillons « essais » : (BG4 0,025% + Prp 100 μg/ml) ; (BG4 0,025% + Prp 150 μg/ml) ; (BG4 0,025% + Prp 200 μg/ml) ; (BG4 0,025% + Prp 300 μg/ml). Le titre infectieux du témoin virus HSV-1 est de 1055 Dl5o/ml.
Les résultats obtenus sont indiqués dans les tableaux 4(1 ) et 4(2) ci-dessous. Tableau 4(1 ) :
Figure imgf000011_0001
Les valeurs Ya, Yb, Yc et Yab et la nature de l'interaction (BG4 + Prp) sont indiquées dans le tableau 5 ci-dessous.
Tableau 5:
Ya Yb Yc Yab Nature de l'interaction
Prp 100 1 BG4 0,05% 0 ,45 0,45 0,54 subadditive
Prp 150 0 ,90 BG4 0,05% 0 ,45 0,40 0,45 subadditive
Prp 200 0 ,81 BG4 0,05% 0 ,45 0,36 0,66 subadditive
Prp 300 0 ,81 BG4 0,05% 0 ,45 0,36 0,45 subadditive 5) Conclusion pour l'essai n°2
Aux faibles concentrations utilisées, bien que le temps d'incubation ait été allongé à 60 minutes, la propolis seule diminue très peu le titre infectieux : moins 1 log à la concentration de 300 μg/ml.
BG4 à la concentration de 0,025% fait chuter le titre infectieux de 3 logs, ce qui est supérieur ou égal à la diminution du titre trouvé dans les essais.
Il n'y a donc pas ici de phénomène de synergie, la concentration en BG4 utilisée étant probablement trop élevée par rapport aux temps d'incubation.
6) Résultats pour l'essai n°3
Essai n°3 : Incubation pendant 60 min à 37°C des échantillons suivants :
- échantillons témoins BG4 : BG4 à la concentration de 0,025% et 0,01 % ;
- échantillons témoins Prp : Prp aux concentrations de 200, 300, 400 et 600 μg/ml ;
- échantillons « essais » : (BG4 0,025% + Prp 200 μg/ml) ; (BG4 0,025% + Prp 300 μg/ml) ; (BG4 0,025% + Prp 400 μg/ml) ; (BG4 0,025% + Prp 600 μg/ml) ; (BG4 0,01 % + Prp 200 μg/ml) ; (BG4 0,01 % + Prp 300 μg/ml) ; (BG4 0,01 % + Prp 400 μg/ml) ; (BG4 0,01 % + Prp 600 μg/ml).
Le titre infectieux du témoin virus HSV-1 est de 104'5 DI50/ml.
Les résultats obtenus sont indiqués dans les tableaux 6(1 ) et 6(2) ci-dessous. Tableau 6(1 ) :
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
Les valeurs Ya, Yb, Yc et Yab et la nature de l'interaction (BG4 + Prp) sont indiquées dans le tableau 7 ci-dessous. Tableau 7 :
Ya Yb Yc Yab Nature de l'interaction
Prp 200 0 ,77 BG4 0,025% 0,33 0,25 0,66 subadditive
Prp 300 0 ,66 BG4 0,025% 0,33 0,22 0,33 subadditive
Prp 400 0 ,22 BG4 0,025% 0,33 0,07 0,1 1 subadditive
Prp 600 0 BG4 0,025% 0,33 0 0 indifférence
Prp 200 0 ,77 BG4 0,01 % 0,55 0,42 0,55 subadditive
Prp 300 0 ,66 BG4 0,01 % 0,55 0,36 0,44 subadditive
Prp 400 0 ,22 BG4 0,01 % 0,55 0,12 0 synergie
Prp 600 0 BG4 0,01 % 0,55 0 0 indifférence 7) Conclusion pour l'essai n°3
L'essai n°3 confirme l'essai n°2, à savoir que BG4 utilisé à la concentration de 0,025% avec un temps d'incubation de 60 minutes est trop actif pour qu'on puise observer un phénomène de synergie.
On observe une synergie lorsque BG4 à la concentration de 0,01 % est associé à la propolis à la concentration de 400 μg/ml.
8) Résultats pour l'essai n°4
Essai n°4 : Incubation pendant 60 min à 37°C des échantillons suivants :
- échantillons témoins BG4 : BG4 à la concentration de 0,01 % et 0,005% ;
- échantillons témoins Prp : Prp aux concentrations de 100, 200, 300 et 400 μg/ml ;
- échantillons « essais » : (BG4 0,01 % + Prp 100 μg/ml) ; (BG4 0,01 % + Prp 200 μg/ml) ; (BG4 0,01 % + Prp 300 μg/ml) ; (BG4 0,01 % + Prp 400 μg/ml) ; (BG4 0,005% + Prp 100 μg/ml) ; (BG4 0,005% + Prp 200 μg/ml) ; (BG4 0,005% + Prp 300 μg/ml) ; (BG4 0,005% + Prp 400 μg/ml).
Le titre infectieux du témoin virus HSV-1 est de 104'5 DI50/ml.
Les résultats obtenus sont indiqués dans les tableaux 8(1 ) et 8(2) ci-dessous. Tableau 8(1 ) :
Figure imgf000014_0001
Tableau 8(2) :
Figure imgf000015_0001
Les valeurs Ya, Yb, Yc et Yab et la nature de l'interaction (BG4 + Prp) sont indiquées dans le tableau 9 ci-dessous. Tableau 9 :
Ya Yb Yc Yab Nature de l'interaction
Prp 100 0,66 BG4 0,01 % 0 ,66 0,43 0,66 subadditive
Prp 200 0,66 BG4 0,01 % 0 ,66 0,43 0,66 subadditive
Prp 300 0,66 BG4 0,01 % 0 ,66 0,43 0,44 subadditive
Prp 400 0,44 BG4 0,01 % 0 ,66 0,29 0,11 synergie
Prp 100 0,66 BG4 0,005% 0 ,66 0,43 0,66 subadditive
Prp 200 0,66 BG4 0,005% 0 ,66 0,43 0,55 subadditive
Prp 300 0,66 BG4 0,005% 0 ,66 0,43 0,33 synergie
Prp 400 0,44 BG4 0,005% 0 ,66 0,29 0,22 synergie
9) Conclusion pour l'essai n°4
L'essai n°4 confirme que, lorsque le produit référencé BG4 et la propolis sont ajoutés simultanément sur le virus HSV-1 , on note une synergie de leur activité virulicide dans les conditions suivantes : - BG4 à 0,01 % et Propolis à 400 μg/ml ; - BG4 à 0,005% et Propolis à 300 μg/ml ;
- BG4 à 0,005% et Propolis à 400 μg/ml.
Dans le cas présent, il y a synergie lorsque le rapport pondéral en % BG4 / Prp est de 0,01/ 0,004 ; 0,005/ 0,003; 0,005/ 0,004 en fonction des temps d'incubation respectifs.
10) Conclusion générale
En résumé, les essais 1 à 4 ont permis de démontrer que les compositions comprenant en association (BG4 et propolis) pour lesquelles une synergie de leur activité virulicide sur le virus HSV-1 a été notée sont celles comprenant les concentrations de BG4 et de propolis suivantes : Incubation à 37°C de 30 minutes :
- BG4 0,025% + Prp 100 μg/ml ;
- BG4 0,025% + Prp 150 μg/ml ;
- BG4 0,025% + Prp 200 μg/ml.
Incubation à 37°C de 60 minutes:
- BG4 0,01 % + Prp 400 μg/ml ;
- BG4 0,005% + Prp 300 μg/ml ;
- BG4 0,005% + Prp 400 μg/ml.
Ces résultats démontrent nettement une synergie dans l'activité virulicide contre HSV-1 d'une composition comprenant en association BG4 et propolis. Un avantage particulièrement intéressant de la présente invention réside dans le fait que cette synergie n'apparaît que pour des doses faibles de BG4, ce qui permet de diminuer la concentration (200 fois plus faible que dans les expérimentations initiales conduites préalablement) de BG4 dans les compositions pharmaceutiques de l'invention. Il s'agit d'un avantage considérable compte tenu de la faible solubilité du dérivé phénolique BG4.
De manière inattendue, en particulier l'association « acide 3,5-di-tertiobutyl, A- hydroxybenzoïque et propolis, conduit à une éradication complète du virus HSV-1 en seulement 30 min avec un effet synergique tel qu'il est possible de réduire la concentration en dérivé phénolique BG4 de 1 % à 0,005% pour des concentrations de propolis de 300 à 400 μg/ml.
EXEMPLE 2 : Activité contre le virus HIV d'une composition comprenant en association de l'acide 3,5-di-tertiobutyl, 4-hvdroxybenzoïque et de la propolis.
L'étude de virucidie in vitro décrite ci-après a été effectuée sur des virus VIH-LAI et sur des cultures de cellules mononucléées de sang périphérique humain (PBMC) activées par la phytohémagglutininine A (PHA) à 1 μg/ml et 5 Ul/ml d'interleukine humaine recombinante 2 (rHulL2) pendant 3 jours. Les cellules ont été isolées du sang périphérique d'un donneur sain (séronégatif vis-à-vis de HIV) par centrifugation différentielle Ficoll-hypaque.
Les abréviations utilisées dans cet exemple ont les significations suivantes :
TCID50 : Dose virale infectant 50% des puits ;
DE 90% : Dose efficace 90% (qui diminue l'activité virale de 90%) ;
DE 70% : Dose efficace 70% (qui diminue l'activité virale de 70%) ;
DE 50% : Dose efficace 50% (qui diminue l'activité virale de 50%) ;
D Tox 50% : Dose toxique 50% (dose qui détruit 50% des cellules) ;
ND : non déterminé ;
PEG : polyéthylèneglycol « PM 400 » provenant de chez Sigma ; μg/ml = microgramme(s) par millilitre.
Les compositions antivirales testées sont respectivement :
- 5 compositions de BG4 seule comprenant respectivement les 5 concentrations décroissantes suivantes : 0.03, 0.015, 0.005, 0.0017 et 0.0006 % de BG4 par rapport au poids total de la composition ;
- 5 compositions de BG4 et propolis comprenant respectivement les 5 concentrations décroissantes suivantes de BG4 : 0.03, 0.015, 0.005, 0.0017 et 0.0006 % pour 0.03 % de propolis.
100 μl de suspension cellulaire (106 cellules par ml dénombrées au Coulter) en milieu nutritif tamponné RPMI 1640 (DIFCO) sont mis en contact avec respectivement 50 μl de composition BG4 seule et 50 μl de composition (BG4 / Prp) aux 5 concentrations décroissantes définies ci-dessus (300, 150, 50, 17, 6 μg de BG4 / ml dilué dans le milieu de culture RPMH 640) et 50 μl d'inoculum viral (contenant 1000 à 1250 TCID50 par ml, infectant 100 % des cellules en 1 heure).
Le contact entre les cellules et la composition BG4 ou (BG4/Prp) est réalisé soit 24 heures (prétraitement) avant l'inoculation virale, soit 20 minutes avant l'inoculation virale.
10 mg de composition antivirale (BG4 / Prp) sont dissous dans 1 ml de PEG400 par sonication (10 minutes dans une cuve à ultrasons Branson) et la solution est ajoutée à 1 ml de mélange PEG/eau (50/50) pour préparation injectable (ppi) pour donner une préparation dénommée « PO » à 5000 μg/ml de (BG4/Prp).
On ajoute 200 μl de préparation « PO » à 800 μl d'une solution contenant 10% de
PEG et 90 % d'eau ppi pour obtenir la préparation « P1 ».
50 μl de P1 seront ajoutés à la suspension cellulaire la plus concentrée.
Les dilutions suivantes seront effectuées dans le mélange PEG/eau (10/90).
Les compositions BG4/Prp ont été réalisées en ajoutant 200 μl de « PO », 100 μl contenant 60 μg de propolis à 700 μl du mélange PEG/eau (10/90) pour obtenir la préparation « P'1 ».
La concentration de propolis est inchangée (60 μg dans 50 μl de composition BG4) à chacune des concentrations différentes de BG4.
On procède exactement de la même façon avec les compositions de BG4 seules.
L'inoculum viral utilisé dans cette étude est plus particulièrement le virus VIH1 (souche LAI) préparé suivant la méthode publiée par Barré-Sinoussi et coll. 1983, Science, 220(4599),868-871.
Le virus est produit sur cellules lymphoblastoides T CD4 chroniquement infectées (lignée CEM-HIV-LAI). Périodiquement, les cellules sont centrifugées, remises en suspension en milieu de culture RPMM 640 contenant 10 % de sérum fœtal de veau et 1 % de glutamine. Elles sont mélangées au 14 avec des cellules CEM non infectées à la concentration finale de 5 x 105 cellules par ml afin de maintenir la production virale. Le virus présent dans le surnageant de culture est concentré par centrifugation à 17000 rpm pendant 3 heures. Le culot est resuspendu dans du tampon NE, aliquoté et conservé à -800C. La concentration du virus utilisé était de 1250 TCID50 par ml.
Après inoculation, la réplication virale a lieu en 7 jours et le virus est libéré à l'extérieur de cellules par bourgeonnement.
A 7 jours, la recherche dans le surnageant a permis de quantifier le virus HIV-LAI par l'antigène de surface p24.
Parallèlement dans des plaques non infectées par le virus (50 μl de milieu RPMI 1640 ajouté, la viabilité cellulaire a été recherchée par le sel de méthyltétrazolium (test MTT, Sigma) afin de rechercher la toxicité éventuelle des compositions de l'invention sur les cellules cibles.
1 ) Pré-traitement avant lieu 24 h avant inoculation
Les cellules sont pré-traitées par mise en contact avec les compositions BG4 ou
(BG4/Prp).
Puis 24 heures après l'inoculum viral est appliqué sur les cellules pré-traitées.
Les résultas sont résumés dans les tableaux 1 à 3 ci-dessous.
Tableau 1 (DE 90% et D Tox 50% en uα/ml) :
Figure imgf000019_0001
Tableau 2 (DE 50% et DE 70% en uq/ml) :
Figure imgf000020_0001
Tableau 3 : rapports DE 90% / D Tox et DE 50 % / D Tox (indices de sécurité thérapeutique)
Figure imgf000020_0002
2) Traitement concomittant VIH et antiviral
Les cellules sont mises en contact avec les compositions BG4 ou (BG4/Prp), puis 20 minutes après l'inoculum viral est appliqué sur les cellules.
Les résultas sont résumés dans les tableaux 4 à 6 ci-dessous.
Tableau 4 (DE 90% et D Tox 50% en uq/ml) :
Figure imgf000020_0003
Tableau 5 (DE 50% et DE 70% en uq/ml) :
Figure imgf000020_0004
Tableau 6 : rapports DE 90% / D Tox et DE 50 % / D Tox (indices de sécurité thérapeutique)
Figure imgf000021_0001
3) Conclusion :
BG4 seul est inactif et non cytotoxique jusqu'à la concentration de 300 μg/ml.
Des précipités de substance active sont observés dès la mise en contact avec les cellules en RPMI 1640 enrichi en sérum de veau fœtal et glutamine.
BG4 associé à la propolis est en revanche actif dès 30 μg/ml (-2 logs) et son activité maximum -4 (-3,5 à - 4,5 logs) est observée à 90 μg/ml soit avec environ 10 fois moins de substance active.
Il n'y a pas de différence entre le traitement 15 minutes et 24 heures avant le contact avec la suspension virale.
L'activité antivirale a été accompagnée d'un effet cytotoxique modéré (coefficient de sécurité calculé 1 ,5). Cette toxicité peut être due au solvant PEG 400 (Sigma) utilisé pour solubiliser respectivement BG4 et (BG4/Prp).
La propolis potentialise BG4 de manière importante, on obtient donc un effet synergique maximum pour des quantités minimales de BG4 et propolis.

Claims

REVENDICATIONS
1. Compositions possédant notamment des propriétés antivirales, caractérisées en ce que :
- elles renferment, en association, au moins un dérivé phénolique et de la propolis, ledit dérivé phénolique répondant à la formule (I) suivante :
Figure imgf000022_0001
dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1 -C5 ou un groupe -N(R1 , R2), avec R1 et R2 identiques ou différents, représentant un atome d'hydrogène ou un radical alkyle en C1 -C5, et
- le rapport pondéral en % déhvé(s) phénolique(s) / propolis est de 0,1 à 0,006 / 0,01 à 0,006.
2. Compositions selon la revendication 1 , caractérisées en ce qu'elles renferment un seul dérivé phénolique.
3. Compositions selon la revendication 1 , caractérisées en ce que le dérivé phénolique est l'acide 3,5-di-tertiobutyl, 4-hydroxybenzoïque ou un sel pharmacologiquement acceptable de cet acide.
4. Compositions selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elles renferment deux dérivés phénoliques ou plus.
5. Compositions selon la revendication 4, caractérisées en ce que l'un des dérivés phénoliques est l'acide 3,5-di-tertiobutyl, 4-hydroxybenzoïque ou un sel pharmacologiquement acceptable de cet acide.
6. Compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce que la propolis se trouve sous forme brute ou sous forme d'extrait.
7. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 précédentes.
8. Compositions selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous une forme appropriée pour une administration par voie orale, injectable ou parentérale.
9. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 7 ou 8, pour le traitement d'infections virales.
10. Utilisation de compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour fabriquer des médicaments à activité virulicide sur le virus de l'herpès HSV-1.
11. Utilisation de compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour fabriquer des médicaments à activité virulicide sur le virus du sida VIH.
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