WO2009152783A1 - Inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (egfr) con acción citostática y sus usos en la terapia de tumores - Google Patents

Inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (egfr) con acción citostática y sus usos en la terapia de tumores Download PDF

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WO2009152783A1
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egfr
receptor
antibody
inhibitor
growth factor
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Rolando Pérez Rodríguez
Greta Garrido Hidalgo
Ernesto MORENO FRÍAS
José Enrique MONTERO CASIMIRO
Ariel TALAVERA PÉREZ
Arlhee DÍAZ MIQUELI
Yildian Díaz Rodríguez
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Centro De Inmunologia Molecular
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Definitions

  • EGFR Epidermal Growth Factor
  • the present invention relates to the field of biotechnology, particularly to human health. And more particularly with new antibodies that recognize the extracellular domain of the Epidermal growth factor receptor (EGF-R) and that block the binding of the natural ligand but without completely inhibiting the dimerization of this molecule.
  • EGF-R Epidermal growth factor receptor
  • EGFR Epidermal Growth Factor
  • HER 1 the Epidermal Growth Factor (EGFR) receptor
  • EGFR is a transmembrane receptor that is found primarily in cells of epithelial origin. Autophosphorylation of its intracellular domain triggers or initiates a cascade of events that lead to cell proliferation.
  • EGFR is commonly expressed at high levels in a variety of solid tumors and for these, it has been shown that EGFR is involved in the control of cell survival, proliferation, metastasis and angiogenesis.
  • the main strategy in the development of therapeutic weapons based on the inhibition of EGFR has been monoclonal antibodies that are antagonists of the natural ligands of the receptor, as well as small molecules that inhibit the tyrosine kinase activity of the intracellular domain.
  • HER ⁇ or EGFR there are currently several antibodies whose therapeutic efficacy is being evaluated in the clinic. Some of them are the antibodies Cetuximab, Panitumumab and Matuzumab among others.
  • Cetuximab (Erbitux) is a chimeric monoclonal antibody that specifically recognizes the extracellular domain of EGFR and has been approved by the FDA for colo-rectal cancer and advanced head and neck tumors.
  • Cetuximab is a potent inhibitor of the proliferation of A431 cells derived from squamous cell carcinoma, both in vitro and in transplanted tumors in athymic mice. They have also been shown to have an important synergistic effect when combined with both cytotoxic drugs and radiotherapy. These results have served as the basis for conducting tests.
  • the results of the Phase II Clinical Trials have shown that Cetuximab both alone and in combination with irinotecan and oxaliplatin has an effect as first-line therapy for advanced patients with metastatic colo-rectal cancer, an absolute increase of between 10 and 10 being reported. 20% response.
  • Panitumumab is a fully humanized antibody that recognizes EGFR and is another therapeutic monoclonal antibody approved by the FDA in 2006 as monotherapy for metastatic colo-rectal cancer with progression of the disease after being subjected to chemotherapy.
  • the results of treatment with Panitumumab are basically similar to those obtained with Cetuximab, as are the adverse reactions.
  • the clinical effect of many EGFR antagonists has been evaluated, including various monoclonal antibodies.
  • the objective response obtained with the majority of these anti-EGFR drugs has been of short duration and the common toxicity has been a severe skin rash that in many cases leads to the interruption of treatment.
  • rash which has been detected in 80% of patients treated with other EGFR blocking drugs (Pérez-Soler et al in Oncologist 2005; 10: 345-56 and Thomas et al in Clin J. Oncol N 2005; 9 : 332-8) does not appear in patients undergoing repetitive doses of hR3 (Crombet et al. In Cancer Biology & Therapy 5; 4, 375-379, 2006).
  • the present invention relates to Epidermal Growth Factor (EGFR) receptor inhibitors with cytostatic and non-cytotoxic activity on cells expressing said receptor.
  • EGFR Epidermal Growth Factor
  • Cytostatic agent should be understood as any agent that inhibits cell proliferation by stopping cells in a phase of the cell cycle; while Cytotoxic agent: is any agent that induces cell death.
  • Cytotoxic agent is any agent that induces cell death.
  • this result allows the design of antitumor drugs that, rather than induce the death of tumor cells, exert a biological control over tumor growth. Additionally, this type of antitumor drug has the advantage that it does not cause serious adverse effects, such as skin rash, which has been previously reported for EGFR inhibitors that have a cytotoxic effect on tumors.
  • the EGFR inhibitors with cytostatic activity described in the present invention could be characterized in that they recognize EGFR by domains I or III of the extracellular region, preferably by domain III, and inhibit the binding of the natural ligand and therefore the mitogenic signal; those molecules that recognize the receptor by these domains but at the same time leave the domain Il free of the extracellular region of the receptor in such a way that it forms homodimers that activate the phosphorylation of the intracellular region of said receptors, molecules with cytostatic activity on cells that express EGFR and therefore potential therapeutic agents for tumors that express this membrane receptor.
  • the authors of the present invention have also discovered that the therapy of malignant tumors with these molecules, preferably monoclonal antibodies, that inhibit the EGF mitogenic signal but that do not prevent a basal level of autophosphorylation have a cystatic effect on tumor growth.
  • the current therapeutic weapons that target EGFR, both those that are antagonistic of the mitogenic ligands, and the small molecules that inhibit the autophosphorylation of the receptor have a limited utility due to the adverse effects that in many cases oblige to suspend treatment.
  • the authors of the present invention have found molecules whose therapeutic target is EGFR can simultaneously inhibit tumor growth without producing the severe adverse effects described for the EGFR autophosphorylation inhibitors existing so far.
  • the finding of the present invention is based on inhibiting the mitogenic activity induced by natural EGFR ligands without completely inhibiting the autophosphorylation of EGFR. It has been previously described that EGFR is in equilibrium in the membrane between its active and inactive forms. When it is in active form, the Il domain of the extracellular region interacts with the same domain of other molecules forming homodimers and activating the autophosphorylation of the intracellular domain, this phosphorylation triggers a cascade of vital events for the cells. It has been calculated that in the absence of mitogenic ligands, between 5 and 10% of the receptors are active and therefore phosphorylated, this level of phosphorylation although not mitogenic allows the survival of the cells.
  • the authors of the present invention claim molecules that target EGFR and whose activity is the biological control of tumor growth. Both when administered as monotherapy and when used in combination with chemo or radio therapy.
  • those EGFR ligands natural or synthetic, preferably natural and more preferably monoclonal antibodies, antagonists of EGF that inhibit the binding of EGF to the extracellular domain of the receptor but that do not interfere in the dimerization of the receptor and by both do not affect the basal level of autophosphorylation.
  • the object of the present invention is also a method for the treatment of a cancer patient, which comprises the administration of a pharmaceutical composition that contains the EGFR ligand, preferably a monoclonal antibody, antagonist of the EGF but that does not inhibit the basal autophosphorylation of the recipient .
  • a pharmaceutical composition that contains the EGFR ligand, preferably a monoclonal antibody, antagonist of the EGF but that does not inhibit the basal autophosphorylation of the recipient .
  • Also part of the object of the present invention is a method for the design and selection of ligands, preferably monoclonal antibodies with cytostatic action on the growth of malignant tumors.
  • the EGFR inhibitor object of the present invention comprises a natural or synthetic molecule that binds to the Growth Factor receptor Epidermal by domain I or III of the extracellular region of said receptor, preferably by domain III, and characterized in that it inhibits the binding of the natural ligand and also allows the receptor to adopt the active configuration.
  • the inhibitors that recognize the receptor in this way have a cytostatic effect on the growth of the cells that express the receptor unlike the inhibitors described so far of the invention, which have a cytotoxic effect on said cells.
  • these therapeutic agents may be monoclonal antibodies against EGFR and preferably the hR3 monoclonal antibody.
  • This humanized antibody is described in detail in the patent application EP 0712863B1 and in the US patent 5,891, 996, mentioned above, and also in various scientific publications, for example in Mateo et al., Immunotechnology 3; 71-81, 1997. These documents also describe in detail the procedures for obtaining them.
  • the interaction model described by the inventors also allows explaining the results of clinical trials in cancer patients where the therapeutic effect of the agents object of the present invention was evaluated. It is known that the interaction of EGF with the extracellular domain of the membrane receptor induces a cascade of signals that are what trigger the mitogenic action of this growth factor. Autophosphorylation of the intracellular domain of EGFR is one of the first biochemical events of this signal cascade, but it is known that the dimerization of the receptors is essential. It is also known from the state of the art that the EGF molecule binds simultaneously to Domains I and III of the extracellular region of EGFR, causing the receiver to adopt an active configuration and leaving Domain II dimerization free.
  • AcM Monoclonal antibodies that recognize EGFR and that have been tested in the clinic for their therapeutic effect on tumors are molecules that function as antagonists of EGF and it is known that they bind to the receptor inhibiting dimerization and subsequent phosphorylation. Other antibodies described in the prior art are known to bind. directly to the Domain I of the receptor inhibiting likewise the dimerization of the receptor.
  • this level of phosphorylation of the receptor does not constitute a signal for the cells to enter proliferation, at least it allows the cell viability in a quiescence state. Therefore, the use of molecules with the characteristics described in the present invention would be very useful in the therapeutic of those tumors that express this receptor.
  • the therapeutic use of the molecules of the present invention would inhibit the proliferation of tumors induced by REGF but at the same time the adverse effects of EGF antagonists that currently exist in clinical practice would be avoided.
  • monoclonal antibodies against the extracellular domain of EGFR are preferred for the purpose of the present invention, the humanized monoclonal antibody hR3 previously described in US 5,891, 996 and EP 0712863 being especially preferred.
  • the therapeutic agent of the present invention has structural and functional characteristics that give advantages from the therapeutic point of view over those previously described.
  • One of the particularities of the antibody of the present invention are those observed in the three-dimensional structure of the antigen recognition and binding site.
  • the object of the present invention is related to a method for inhibiting the growth of EGF-dependent tumors, characterized in that the administration in therapeutic doses of the therapeutic agent causes the stabilization of the disease more than the drastic regression of the tumor size.
  • the subject of the present invention are also therapeutic compositions comprising an aqueous solution of at least one of these cytostatic inhibitors useful in the treatment of tumors or other pathologies associated with the deregulation of EGFR.
  • the concentration of the inhibitor, particularly the antibody is in the range of 10-200 mg / ml and more particularly, this concentration is in the range of 50-150 mg / ml.
  • the present invention comprises the use of these EGFR inhibitors, particularly the humanized monoclonal antibody hR3 (Nimotuzumab) in combination with radiotherapy or other therapeutic agents such as chemotherapeutic agents or the combination thereof for the treatment of malignant tumors.
  • the administration of the inhibitor object of the present invention can be oral, parenteral (intravenous or intramuscular), topical, transdermal or by inhalation.
  • Another of the objects of the present invention is a method for the selection of EGFR inhibitors with cytostatic activity. Said method is fundamentally based on the measurement of the DNA content of the cells by incorporation of propidium iodide in permeabilized and fixed cells, as described in example 6 of the present invention. .
  • Example 1 Crystal Structure of the Fab fragment of hR3.
  • the crystal structure of the Fab fragment of the hR3 antibody was determined at a resolution of 2.5 A and refined for R factors with good chemical stereo. In general, the structure of the crystal is similar to the structures of other Fab fragments. However, a peculiar feature was found and that the CDR 1 of the heavy chain does not conform to any of the canonical conformations described. On the contrary, it was found that this region adopts a helical seaweed structure. This alpha helix conformation does not belong to any of the canonical conformations described for the CDR 1 of the heavy chains, in Figure 1 the structure of the Fab fragment crystal is shown where the peculiarity in the structure of the heavy chain CDRl can be seen .
  • Example 2 Study of the binding of the fragment to the ligand.
  • hR3 competed for binding to EGFR with the Cetuximab antibody.
  • inhibition assays were made with the Cetuximab antibody that is known from the literature that specifically and exclusively binds to Domain III of EGFR.
  • EGFR coated plates were used and the concentration of the biotinylated Fab-hR3 fragment was kept constant. Dilutions of the Fab-Cetuximab fragment were used and it was observed that the signal given by the biotinylated Fab-hR3, when revealed with phosphatase-conjugated esreptavidin, decreased.
  • Competition tests were also performed using the FACS on A431 cells, which are known to express EGFR.
  • Example 3 Model of the antibody-receptor complex.
  • Figure 2A it is shown how, according to our model, it inhibits the binding of Cetuximab. While in Figure 2B, it is shown how the hR3 antibody blocks the binding of the EGF ligand to its EGFR receptor.
  • Example 4 Theoretical model of an Fv fragment of an antibody that binds to domain I of EGFR.
  • the model was obtained by the same methodology as the model in Example 3.
  • the bound antibody allows the receptor to adopt the active conformation where domains I and Il are close to each other.
  • the EGF Figure 3, in red, represented in Dreiding's model
  • the EGF cannot be placed in its binding site due to spherical impediments caused by the antibody (the overlap of both structures is clearly visible in Figure 3.
  • the structure of the EGFR in complex with the EGF was taken from the file with live code of the Protein Data Bank.
  • the antibody Fv fragment was constructed by computational modeling.
  • Example 5 Cytotoxic effect of anti-EGFR monoclonal antibodies on tumor cells A431 and Hl 25.
  • A431 and Hl 25 cells (2 x 10 5 ) were seeded in 24-well plates using 10% DMENrFl 2 SFT medium. Twelve hours later the cells are treated with the monoclonal antibodies Cetuximab (7-175 nM) or Nimotuzumab (70-1750 nM) in DMEN medium: F12 with 1% SFT and human EGF (500 pg / ml) and incubated 48 hours. This treatment was repeated for another 48 hours. Cell death was analyzed after 96 hours of treatment by flow cytometry using a propidium iodide (10 ⁇ g / ml).
  • Example 6 Cytotoxic versus cytostatic effect of anti-EGFR monoclonal antibodies on tumor cells A431 and H125.
  • A431 and Hl 25 cells (0.25 x 10 6 ) were seeded in 6-well plates using DMEN medium: 10% SFT F12. Twelve hours later the cells are treated with the monoclonal antibodies Cetuximab or Nimotuzumab (7-1750 nM) or with the AG 1478 (EGFR tyrosine kinase inhibitor) at 0 ⁇ M in DMEN medium: F12 with 1% SFT and human EGF (500 pg / ml) and incubated 48 hours. This treatment was repeated for another 48 hours.
  • both A431 (A) and H 125 (B) cells both monoclonal antibodies (Cetuximab: 175 nM, Nimotuzumab: 1750 nM) induce a similar increase in the fraction of the cells in The G0-G1 phase with the corresponding decrease of the cells in the G2-M and S phases when compared to the cells without treatment. This effect was comparable to that obtained with AG 1478 used as a positive control of cell cycle arrest.
  • Tables 1 (A431) and 2 (Hl 25) show the percentages of cells in the different phases of the cycle for a wide range of concentrations of Nimotuzumab and Cetuximab that were used to do the experiment.
  • Table 2 Distribution of the cell cycle and percentage of apoptotic cells of the A431 line treated with different concentrations of Cetuximab and Nimotuzumab.
  • Table 3 Distribution of the cell cycle and percentage of apoptotic cells of the H 125 line treated with different concentrations of Cetuximab and Nimotuzumab.
  • Example 7 Antitumor activity in xenotransplanted atonic mice.
  • the animals used for the experimentation were NMRI athymic mice (8-10 weeks) which were obtained from Charles River (Sulzfeld, Germany). The animals were kept in aseptic conditions in an approved animal farm in the care of laboratory animals and in accordance with current regulations and standards, and their use was approved by the local responsible authorities.
  • the cells were taken from subconfluent cultures by treatment with 0.25% trypsin and 0.05% EDTA. The trypsinization was stopped with 10% medium of fetal calf serum. For inoculation only those cell suspensions with a viability greater than 90% were used.
  • mice Eight animals were inoculated per group with 10 7 cells of the U87MG line subcutaneously in the left flank and with 2x10 4 U87MG intracranially in the right hemisphere of the mice's brain with the help of a stereotactic device. The body weight of the mice was monitored throughout the experiment. The size of the subcutaneous tumors was measured three times per week and the tumor volume was determined by means of the formula: 0.5 x (larger diameter) x (smaller diameter) 2 . The relative tumor volume indices (RTV) were calculated referring to the average volumes of each day with respect to the first measurement (adjusted to). The animals were sacrificed when the weight of the tumors exceeded 10% of the total weight of the animals. The size of intracranial tumors was also determined.
  • RTV relative tumor volume indices
  • the whole brains of the animals were extracted and frozen in 2-methyl butane. Cryostat cuts (l O ⁇ m) were made and consecutive sections were taken and stained with cresil violet. The major diameters of the tumors and the perimeters were determined with the help of a microscope (Zeiss Axioskop), and the tumor volumes were calculated. Subcutaneous tumors were frozen and stored at -80 ° C for further analysis. The different treatments began three days after the tumors were inoculated. The animals were treated three times a week with the Nimotuzumab or Cetuximab monoclonal antibodies with 50 mg / kg / dose by intraperitoneal administration.
  • the antibodies were administered via intr ⁇ peritone ⁇ l ⁇ 50 mg / kg / two ⁇ s three times a week for three weeks. Animals treated with radiotherapy received a total dose of 3 Gy divided into 1 seminal Gy for three weeks. The figure shows the administrations of the antibodies in continuous black arrows and the radiation in fractional arrows. Tumor volumes were determined at the indicated times.
  • the addition of the antibodies to radiotherapy significantly retarded (p ⁇ 0.05) the growth of tumors in mice with respect to the groups of animals treated with radiotherapy or untreated.
  • the addition of Nimotuzumab to radiotherapy also significantly retarded the growth of tumors with respect to the group treated with the antibody only.
  • Figure 7 shows the sensitization of the human tumor line U87MG xenotransplanted orthotopically in NMRI mice athymic to radiotherapy by anti-EGFR monoclonal antibodies. All treatments began three days after the inoculation of the tumors with Nimotuzumab, Cetuximab, radiotherapy, Nimotuzumab plus radiotherapy, Cetuximab plus radiotherapy or PBS. The antibodies were administered intraperitoneally at 50 mg / kg / dose three times a week for three weeks. Animals treated with radiotherapy received a total dose of 3 Gy divided into 1 seminal Gy for three weeks.
  • the brain sections analyzed in the groups that received the antibodies plus the radiotherapy showed a significant reduction (p ⁇ 0.05) in the size of the tumors.
  • the addition of Nimotuzumab to radiotherapy significantly reduced (p ⁇ 0.05) the size of tumors with respect to radiotherapy alone. Mann-Whitney statistical test; the symbols indicate significant differences with respect to: (*) PBS, (+) radiotherapy.
  • Angiogenesis (CD31 / PECAM-I). Tumor samples were thawed at room temperature for 10 minutes and fixed in para-formaldehyde 3.7% for 15 minutes. The endogenous peroxidase was then blocked with 0.03% hydrogen peroxide (DAKO Corporation, Carpentry, CA) for 15 minutes and incubated with the primary anti-CD31 / PECAM-I antibody at room temperature for 2 hours at a dilution of 1: 100 in antibody diluent medium (DAKO Corporation, Carpinter ⁇ a, CA). After washing, it was incubated with the corresponding secondary antibody conjugated to peroxidase at room temperature for 30 minutes to detect the antigen-antibody reaction.
  • DAKO Corporation antibody diluent medium
  • the sections were visualized with the DAB chromogen (DAKO Corporation, Carpinter ⁇ a, CA).
  • the sheets were mounted and the staining was analyzed with CD31.
  • Representative tumor sections were visualized in a light microscope (Zeiss, Axioskop) with an ocular magnification of X40.
  • the area of the endothelial blood micro-vessels present in the tumors of 5 microscopic fields in each tumor was estimated, and the average value in each case was averaged.
  • the total area of the vessels evaluated was calculated using the Axio Vision 4.5 (Zeiss) program.
  • Nimotuzumab treatment was associated with a significant reduction (p ⁇ .01) in the area of the vessels of the treated animals ( Figure 8).
  • CDI 33 CDI 33.
  • the tumor samples were fixed in acetone for 15 minutes at room temperature.
  • the endogenous peroxidase was then blocked by immersing the samples in 0.03% hydrogen peroxide (DAKO Corporation, Carpentry CA) for 30 minutes and the nonspecific junctions were blocked with 20% fetal calf serum for 20 minutes at room temperature.
  • the samples were incubated with the primary anti-CD 133/1 AC 133 antibody (Miltenyi Biotec) for 1 hour at room temperature at a working dilution of 1: 10 in antibody diluent.
  • the samples were subsequently washed and incubated with peroxidase-conjugated streptavidin for 1 hour at room temperature.
  • FIG. 9 shows the immunohistochemical analysis of the expression of CD31 in human tumors of U87MG xenotransplanted in treated NMRI mice treated.
  • Nimotuzumab treatment was associated with a significant reduction (p ⁇ 0.05) in the percentage of CDL 33 positive cells compared to animals treated with radiotherapy.
  • the addition of Nimotuzumab to radiotherapy significantly decreased (p ⁇ 0.05) the percentage of CDL 33 positive cells with respect to animals treated with radiotherapy and with respect to untreated animals.
  • Mann-Whitney statistical test ; the symbols indicate significant differences with respect to: (*) PBS, (+) radiotherapy.
  • Statistic analysis The means, standard deviations, and the standard error of the mean were calculated using the GraphPAD program version 4.0 (GraphPAD, San Diego, CA.). Statistical analysis was performed with the same GraphPAD InStat program. Statistical significance between groups was compared. using the Mann-Whitney test, and the Dunn Multiple comparison test. The differences were considered significant if p ⁇ 0.05.
  • Example 8 Antitumor effect of the combination of monoclonal Antibody hR3 (Nimotuzumab) and Carboplatin at low doses.
  • the animals used for the experimentation were NMRI athymic mice (8-10 weeks) challenged subcutaneously with a tumor of human origin classified as NSCLC. On day 0 of the experiment the animals were inoculated with tumor fragments. When the tumors were palpable (within 10 and 12 days post tumor inoculation) the animals were treated with 50 mg / kg of the hR3 monoclonal antibody three times per week and / or a weekly dose of 50 mg / kg Carboplatin for 6 weeks per intraperitoneal route. PBS was used as control of the experiment.
  • VT (smaller diameter) 2 x larger diameter / 0.52.
  • the Relative Tumor Volume was calculated as follows: VT x 1 / VTd ⁇ ao.
  • the graph shows the relative tumor volume with the standard error of the mean.
  • Figure 1 General view of the model (represented n tape model, eEGFR in blue, VL and VH in carmelite and green respectively. A) EGFR in its conformation of inactive (low affinity) and B) EGFR in its active conformation
  • Nimotuzumab and the EGFR Nimotuzumab and the EGFR.
  • Figure 3 Theoretical model of an Fv fragment of antibody (in green, represented in tape model) that binds to domain I of EGFR.
  • Cetuximab has a greater cytotoxic capacity than Nimotuzumab in A431 and H125 cells.
  • A431 and H125 cells were treated with cetuximab (7-175 nM) or Nimotuzumab (70-1750 nM) antibodies for 96 hours and subsequently stained with IP analyzed by FACS. Each bar represents the average of the percentage of dead cells from total cells ⁇ D. E of 3 treatment wells. These experiments were repeated three times, obtaining similar results.
  • Nimotuzumab and Cetuximab have a similar cytostatic effect on A431 and HI 25 cells while Cetuximab induces a greater apoptotic response than Nimotuzumab on these cells.
  • A431 (A) and H 125 (B) cells were treated with cetuximab (175 nM), nimotuzumab (1750 nM) or AG 1478 (10 ⁇ M) for 96 hours and subsequently stained with IP analyzed by FACS. In each graph two regions are shown. The dashed line corresponds to living cells and for them the percentage of cells in each phase of the cycle is shown. The continuous line corresponds to apoptotic cells and the percentage of them with respect to the total is also shown. These experiments were repeated three times, obtaining similar results.
  • FIG. 6 Sensitization of the human tumor line U87MG xenotransplanted subcutaneously in athymic NMRI mice by anti-EGFR monoclonal antibodies. All treatments began three days after the inoculation of the tumors with or Nimotuzumab (h-R3), ⁇ Cetuximab (C225), m radiotherapy (RT), • Nimotuzumab plus radiotherapy (h-R3 + RT), A Cetuximab plus radiotherapy (C225 + RT) ⁇ PBS as control (PBS).
  • Figure 7 Sensitization of the human tumor line U87MG xenotransplanted orthotopically in NMRI mice athymic to radiotherapy by anti-EGFR monoclonal antibodies.
  • Figure 8 Immunohistochemical analysis of the expression of CD31 in human tumors of U87MG xenotransplanted in athymic NMRI mice treated with Nimotuzumab (h-R3), Cetuximab (C225), radiotherapy (RT), Nimotuzumab plus radiotherapy (h-R3 + RT) , C225 plus radiation therapy (C225 + RT), or PBS.
  • Figure 9 Immunohistochemical analysis of the expression of CD 133 in human tumors of U87MG xenotransplanted in athymic NMRI mice treated with Nimotuzumab (h-R3), radiotherapy (RT), Nimotuzumab plus radiotherapy (h-R3 + RT), or PBS.
  • Figure 10 Antitumor effect of the combination of monoclonal Antibody hR3 (Nimotuzumab) and Carboplatin at low doses. Atymic animals challenged with a tumor of human origin classified as NSCLC, were treated with 3 daily doses of 50 mg / kg of the hR3 antibody and a weekly dose of Carboplatin at 50 mg / kg for 6 weeks. The graph shows the relative tumor volume with the standard error of the mean.

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Abstract

La presente invención se relaciona con inhibidores del receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) que se unen al receptor por los dominios I o III bloqueando la unión de los ligandos naturales pero que permiten el equilibrio fisiológico entre las conformaciones inactiva y activa del receptor de tal forma que impiden la señal mitogénica pero la fracción del dominio II de los receptores que están en conformación activa homodimerizan y autofosforilan al receptor desencadenando la cadena de eventos bioquímicos que mantienen la supervivencia de las células. Los autores de esta invención han encontrado que estos inhibidores que reconocen el EGFR por los dominios I o III tienen un efecto citostático y no citotóxico sobre tumores que expresan dicho receptor y representan una ventaja sobre el estado del arte porque los efectos adversos que provocan son menores que los reportados.

Description

Inhibidores del receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) con acción citostática y sus usos en Ia terapia de tumores. Campo de Ia técnica:
La presente invención se relaciona con el campo de Ia biotecnología, particularmente con Ia salud humana. Y más particularmente con nuevos anticuerpos que reconocen el dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento Epidérmico (EGF-R) y que bloquean Ia unión del ligando natural pero sin inhibir completamente Ia dimerización de esta molécula.
Estado de Ia técnica anterior: Los avances en el conocimiento de Ia biología de los tumores y los mecanismos de Ia oncogénesis han permitido identificar diferentes blancos para Ia terapia del cáncer, particularmente el cáncer de pulmón, que se sabe es una de las primeras causas de muerte tanto de mujeres como de hombres. Entre estos blancos, el receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR), o HER 1 ha recibido particular atención para el tratamiento del cáncer de pulmón. El EGFR es un receptor transmembranario que se encuentra fundamentalmente en células de origen epitelial. La autofosforilación de su dominio intracelular desencadena o inicia una cascada de eventos que conducen a Ia proliferación celular. El EGFR es comúnmente expresado a altos niveles en una variedad de tumores sólidos y para estos, se ha evidenciado que el EGFR está involucrado en el control de Ia supervivencia de las células, Ia proliferación, metástasis y angiogénisis.
La principal estrategia en el desarrollo de armas terapéuticas basadas en Ia inhibición del EGFR han sido los anticuerpos monoclonales que sean antagonistas de los ligandos naturales del receptor, así como pequeñas moléculas que inhiben Ia actividad tirosina quinasa del dominio ¡ntracelular. Específicamente contra el HERÍ o EGFR existen actualmente varios anticuerpos cuya eficacia terapéutica está siendo evaluada en Ia clínica. Algunos de ellos son los anticuerpos Cetuximab, Panitumumab y Matuzumab entre otros. Cetuximab ( Erbitux), es un anticuerpo monoclonal quimérico que reconoce específicamente el dominio extracelular del EGFR y que ha sido aprobado por Ia FDA para cáncer colo-rectal y tumores avanzados de cabeza y cuello. Resultados experimentales han demostrado que el Cetuximab es un potente inhibidor de Ia proliferación de las células A431 derivadas de un carcinoma epidermoide, tanto /n vitro como en tumores trasplantados en ratones atímicos. También se ha demostrado que tienen un efecto sinérgico importante cuando se combinan tanto con drogas citotóxicas como con radioterapia. Estos resultados han servido de base a Ia realización de ensayos clínicos Los resultados de los Ensayos Clínicos Fase Il han demostrado que el Cetuximab tanto solo como combinado con irinotecan and oxaliplatin tiene un efecto como terapia de primera línea para pacientes avanzados con cáncer colo-rectal metastásico, habiéndose reportado un incremento absoluto de entre el 10 y el 20% de respuesta. Otro ensayo clínico Internacional Multicéntrico que incluyó 424 pacientes con enfermedad loco regional en estado avanzado, Ia combinación de Cetuximab con radioterapia prácticamente dobló el tiempo de sobrevida de los pacientes de 28 a 54 meses. A Ia vez esta combinación incrementó el tiempo de sobrevida de los pacientes después de dos y tres años bajo tratamiento desde 55 y 44% respectivamente para los pacientes que recibieron radioterapia solamente hasta 62 y 57% para aquellos que recibieron Ia combinación. En general los resultados han mostrado que el uso del Cetuximab tanto cuando se administra como mono terapia o en combinación con drogas citotóxicas o con radioterapia son altamente eficientes. Sin embargo, también se ha observado un significativo incremento de Ia toxicidad inducida por las terapias convencionales.
El Panitumumab que es un anticuerpo completamente humanizado que reconoce el EGFR y es otro anticuerpo monoclonal terapéutico aprobado por Ia FDA en 2006 como monoterapia para cáncer colo-rectal metastásico con progresión de Ia enfermedad después de ser sometidos a régimen de quimioterapia. Los resultados del tratamiento con Panitumumab son básicamente similares a los obtenidos con Cetuximab, al igual que las reacciones adversas. Se ha evaluado el efecto en Ia clínica de muchos antagonistas del EGFR, incluyendo diversos anticuerpos monoclonales. Sin embargo Ia respuesta objetiva obtenida con Ia mayoría de estas drogas anti-EGFR ha sido de corta duración y Ia toxicidad común ha sido una severa erupción cutánea que en muchos casos conlleva a Ia interrupción del tratamiento. Hasta el momento actual los diferentes ensayos en los que se evalúan drogas relacionadas con el EGFR han arrojado que existe una fuerte asociación entre Ia severidad de Ia erupción cutánea y Ia respuesta del tumor, Io cual sugiere que Ia aparición de Ia erupción sirve como un marcador predictivo de Ia respuesta antitumoral de los agentes que tienen como blanco el EGFR. En otras palabras, Ia respuesta de los tumores está asociada al efecto de Ia droga sobre otros tejidos sanos no relacionados con el tumor, como puede ser Ia piel (Peedicayil J. y col., en Correspondence 2004, doi: 10.016). Gridelli C. y col., en Results of an Experts Panel Meeting, Crit. Rev. Oncol/Hematol. 2007, doi: 10.1016, hace una revisión de los resultados de diversos ensayos clínicos en los que se encuentra una relación positiva entre Ia erupción cutánea y Ia respuesta al tratamiento y/o Ia sobrevida de los pacientes. En el artículo se concluye que cada vez con más fuerza se considera Ia reacción cutánea como un marcador indirecto de que realmente el EGFR está siendo bloqueado por las drogas; por Io que hay casi un consenso entre los expertos de que Ia erupción cutánea es un importante marcador clínico subrogado de Ia actividad anti tumoral o de eficacia terapéutica y se sugiere que Ia reacción cutánea podría servir para identificar el grupo de pacientes que más se beneficiarían con el tratamiento. Sin embargo, resultados de ensayos clínicos utilizando el anticuerpo monoclonal anti-EGFR, hR3 (EP 0712863B1 y US 5,891 ,996), mostraron que el anticuerpo es bien tolerado por los pacientes. La erupción cutánea, que ha sido detectada en el 80% de los pacientes tratado con otras drogas bloqueadoras del EGFR (Pérez-Soler y col en Oncologist 2005; 10: 345-56 y Thomas y col en Clin J. Oncol N 2005; 9: 332-8) no aparece en los pacientes sometidos a dosis repetitivas de hR3 (Crombet y col. en Cáncer Biology & Therapy 5;4, 375-379, 2006).
A pesar del consenso que existe en el estado del arte sobre Ia asociación directa entre Ia erupción cutánea y el bloqueo del EGFR, los autores de Ia presente invención consideran que Ia erupción cutánea es una desventaja asociada a Ia droga y no al blanco de ahí Ia necesidad de continuar explorando nuevos agentes anti-EGFR.
Memoria descriptiva:
La presente invención se relaciona con los inhibidores del receptor de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) con actividad citostática y no citotóxica sobre células que expresan dicho receptor.
Debe entenderse por agente Citostático cualquier agente que inhibe Ia proliferación celular deteniendo las células en una fase del ciclo celular; mientras que agente Citotóxico: es todo agente que induce muerte celular. Sorprendentemente, los autores de Ia presente invención han descubierto que entre los inhibidores del EGFR, o Io que es igual, aquellas moléculas que en su interacción con el receptor inhiben Ia señal mitogénica inducida por los ligandos naturales, hay un grupo que por el sitio en que reconocen al receptor, permiten un equilibrio fisiológico entre las conformaciones activa e inactiva del receptor y por tanto mantienen un nivel basal de autofosforilación del receptor. Este nivel basal de autofosforilación del receptor hace que las células que Io expresan queden arrestadas en una fase del ciclo celular. La aplicación clínica de este resultado es que permite el diseño de drogas antitumorales que mas que inducir la muerte de las células tumorales ejerzan un control biológico sobre el crecimiento del tumor. Adicionαlmente, este tipo de droga antitumoral tiene Ia ventaja que no provoca los serios efectos adversos, como Ia erupción cutánea, que se ha reportado previamente para los inhibidores del EGFR que tienen efecto citotóxico sobre los tumores. Los inhibidores del EGFR con actividad citostática descritos en Ia presente invención se podrían caracterizar porque reconocen al EGFR por los dominios I o III de Ia región extracelular, preferiblemente por dominio III, e inhiben Ia unión del ligando natural y por tanto Ia señal mitogénica; aquellas moléculas que reconocen al receptor por estos dominios pero que al mismo tiempo dejan libre el dominio Il de Ia región extracelular del receptor de forma tal que este forme homodímeros que activen Ia fosforilación de Ia región intracelular de dichos receptores, resultan moléculas con actividad citostática sobre células que expresan el EGFR y por tanto potenciales agentes terapéuticos para tumores que expresan este receptor de membrana. Los autores de Ia presente invención también han descubierto que Ia terapia de tumores malignos con estas moléculas, preferiblemente anticuerpos monoclonales, que inhiben Ia señal mitogénica del EGF pero que no impiden un nivel basal de autofosforilacion tienen un efecto cistostático sobre el crecimiento tumoral. Las armas terapéuticas actuales que tienen como blanco el EGFR, tanto aquellas que resultan antagonistas de los ligandos mitogénicos, como las pequeñas moléculas inhibidoras de Ia autofosforilacion del receptor tienen una utilidad limitada por los efectos adversos que obliga en muchos casos a suspender el tratamiento. Los autores de Ia presente invención han encontrado moléculas que teniendo como blanco terapéutico el EGFR pueden simultáneamente inhibir el crecimiento tumoral sin producir los severos efectos adversos descritos para los inhibidores de Ia autofosforilacion del EGFR existentes hasta el momento. El hallazgo de Ia presente invención se basa en inhibir Ia actividad mitogénica inducida por los ligandos naturales del EGFR sin inhibir completamente Ia autofosforilacion del EGFR. Ha sido descrito previamente que el EGFR se encuentra en equilibrio en Ia membrana entre sus formas activa e inactiva. Cuando está en forma activa, el dominio Il de Ia región extracelular interactúa con el mismo dominio de otras moléculas formando homodímeros y activando Ia autofosforilacion del dominio intracelular, esta fosforilación desencadena una cascada de eventos vitales para las células. Se ha calculado que en ausencia de ligandos mitogénicos, entre 5 y el 10% de los receptores se encuentran en forma activa y por tanto fosforilados, este nivel de fosforilación aunque no es mitogénico permite Ia supervivencia de las células. Según los autores de Ia presente invención, utilizar drogas que inhiban completamente Ia autofosforilación del receptor provocaría Ia muerte celular masiva, tanto las células tumorales como tejidos normales sufrirán esta deprivación y de ahí los efectos adversos severos. Sin embargo con el empleo de los inhibidores que son objeto de Ia presente invención, se logra inhibir Ia actividad mitogénica sobre el crecimiento de los tumores pero se mantiene Ia fosforilación basal que permite Ia supervivencia de las células. El primer tipo de droga provocara un efecto citotóxico con regresiones tumorales impresionantes pero se Ie asocian efectos adversos severos y recaídas tempranas. Las drogas objeto de Ia presente invención, más que una muerte celular masiva con regresiones espectaculares provocaran estabilizaciones de Ia enfermedad por efecto citostático sobre los tumores sin grandes efectos adversos sobre tejidos normales.
Adicionalmente, los autores de Ia presente invención también han encontrado que estos inhibidores de EGFR con actividad citostática mantienen las propiedades como radio y quimio sensibilizadores descritas previamente para los inhibidores del EGFR con actividad citotóxica.
Basados en los hallazgos experimentales, los autores de Ia presente invención reclaman moléculas que tienen como blanco el EGFR y cuya actividad es el control biológico del crecimiento de los tumores. Tanto cuando son administrados como monoterapia como cuando se usan en combinación con quimio o radio terapia.
Por tanto son objeto de Ia presente invención aquellos ligandos del EGFR, naturales o sintéticos, preferiblemente naturales y más preferiblemente anticuerpos monoclonales, antagonistas del EGF que inhiben Ia unión del EGF al dominio extracelular del receptor pero que no interfieren en Ia dimerización del receptor y por tanto no afectan el nivel basal de autofosforilación.
Es también objeto de Ia presente invención un método para el tratamiento de un paciente de cáncer, que comprende Ia administración de una composición farmacéutica que contiene el ligando del EGFR, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, antagonista del EGF pero que no inhibe Ia autofosforilación basal del receptor.
También forma parte del objeto de Ia presente invención un método para el diseño y Ia selección de los ligandos, preferiblemente los anticuerpos monoclonales con acción citostática sobre el crecimiento de los tumores malignos.
Descripción detallada de Ia invención:
El inhibidor del EGFR objeto de Ia presente invención comprende una molécula natural o sintética que se una al receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico por los dominio I o III de Ia región extracelular de dicho receptor, preferiblemente por el dominio III, y que se caracteriza porque inhibe Ia unión del ligando natural y además permite que el receptor adopte Ia configuración activa. Sorprendentemente, los inhibidores que reconocen al receptor de esta forma tienen un efecto citostático sobre el crecimiento de las células que expresan el receptor a diferencia de los inhibidores descrito hasta el momento de Ia invención, los cuales tienen un efecto citotóxico sobre dichas células.
E I método para el diseño de los agentes terapéuticos que son objeto de Ia presente invención se basa en resultados encontrados por los autores de Ia presente invención y que soportan el modelo de interacción del EGF con su receptor, Estas drogas antagonistas del EGF tienen efecto terapéutico contra el cáncer y resultan con ventajas sobre las drogas antagonistas del EGF previamente descritas. En una representación preferida, estos agentes terapéuticos pueden ser anticuerpos monoclonales contra el EGFR y preferiblemente el anticuerpo monoclonal hR3. Este anticuerpo humanizado se describe con todo detalle en Ia solicitud de patente EP 0712863B1 y en Ia patente US 5,891 ,996, antes mencionadas, y también en diversas publicaciones científicas, por ejemplo en Mateo y col., Immunotechnology 3; 71-81 , 1997. En dichos documentos se describen también con todo detalle procedimientos para su obtención.
El modelo de interacción descrito por Io inventores también permite explicar los resultados de ensayos clínicos en pacientes de cáncer donde se evaluó el efecto terapéutico de los agentes objeto de Ia presente invención. Es conocido que Ia interacción del EGF con el dominio extracelular del receptor de membrana induce una cascada de señales que son las que desencadenan Ia acción mitogénica de este factor de crecimiento. La autofosforilación del dominio intracelular de EGFR es uno de los primeros eventos bioquímicos de esta cascada de señales, pero se sabe que es requisito indispensable Ia dimerización de los receptores. También es conocido del estado del arte que Ia molécula de EGF se une simultáneamente a los Dominios I y III de Ia región extracelular del EGFR, haciendo que el receptor adopte una configuración activa y dejando libre para Ia dimerización al Dominio II. Los anticuerpos monoclonales (AcM) que reconocen el EGFR y que se han estado probando en Ia clínica por su efecto terapéutico en tumores son moléculas que funcionan como antagonistas del EGF y se sabe que se unen al receptor inhibiendo Ia dimerización y Ia posterior fosforilación. Otros anticuerpos descritos en el arte previo, se sabe que se unen directamente al Dominio Il del receptor inhibiendo de igual manera Ia dimerización del receptor.
Sorprendentemente los autores de Ia presente invención han encontrado que es posible impedir Ia unión del EGF a su receptor inhibiendo así Ia señal mitogénica del ligando natural pero al mismo tiempo dejar libre el Dominio II, de forma que no se inhiba Ia dimerización del receptor, permitiendo de esta manera que ocurra un nivel basal de autofosforilación del mismo. Es conocido del estado de arte que las moléculas de EGFR se encuentran en Ia membrana en un equilibrio entre las conformaciones activa e inactiva. Se dice que entre el 10% y el 5% de los receptores de membrana se encuentran en Ia conformación extendida que por tanto para esta fracción de los receptores es posible Ia dimerización con Ia consiguiente autofosforilación. Si bien este nivel de fosforilación del receptor no constituye una señal para que las células entren en proliferación, al menos permite Ia viabilidad celular en un estado de quiescencia. Por tanto Ia utilización de moléculas con las características que se describen en Ia presente invención seria de gran utilidad en Ia terapéutica de aquellos tumores que expresen este receptor. El uso terapéutico de las moléculas de Ia presente invención inhibiría Ia proliferación de los tumores inducida por el REGF pero al mismo tiempo se evitarían los efectos adversos de los antagonistas del EGF que existen actualmente en Ia práctica clínica.
De entre los agentes terapéuticos con las propiedades descritas anteriormente resultan preferidos al objeto de Ia presente invención los anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular del EGFR, siendo especialmente preferido el anticuerpo monoclonal humanizado hR3 descrito previamente en US 5,891 ,996 y EP 0712863.
Aunque en el estado de Ia técnica existen agentes terapéuticos que reconocen el mismo blanco, el agente terapéutico de Ia presente invención tiene características estructurales y funcionales que Ie dan ventajas desde el punto de vista terapéutico sobre los que han sido descritos previamente. Una de las particularidades del anticuerpo de Ia presente invención son aquellas observadas en Ia estructura tridimensional del sitio de reconocimiento y unión del antígeno.
Adicionalmente, el objeto de Ia presente invención se relaciona con un método para inhibir el crecimiento de tumores dependientes del EGF, caracterizado porque Ia administración en dosis terapéuticas del agente terapéutico provoca Ia estabilización de Ia enfermedad más que Ia regresión drástica del tamaño tumoral. También son objeto de Ia presente invención composiciones terapéuticas que comprenden una disolución acuosa de al menos uno de estos inhibidores citostáticos útiles en el tratamiento de tumores u otras patologías asociadas a Ia desregulación del EGFR. En las composiciones farmacéuticas de Ia presente invención Ia concentración del inhibidor, particularmente el anticuerpo esta en un rango de 10-200 mg/ml y más particularmente, esta concentración estar en el rango de 50-150 mg/ml.
Adicionalmente, Ia presente invención comprende el uso de estos inhibidores del EGFR, particularmente el anticuerpo monoclonal humanizado hR3 (Nimotuzumab) en combinación con radioterapia u otros agentes terapéuticos tales como agentes quimioterapéuticos o Ia combinación de estos para el tratamiento de tumores malignos. Según Ia presente invención, Ia administración del inhibidor objeto de Ia presente invención puede ser oral, parenteral (intravenoso o intramuscular), tópico, transdérmico o por inhalación. Es otro de los objetos de Ia presente invención un método para Ia selección de inhibidores del EGFR con actividad citostática. Dicho método se basa fundamentalmente en Ia medición del contenido de ADN de las células por incorporación de ioduro de propidio en células permeabilizadas y fijadas, tal como se describe en el ejemplo 6 de Ia presente invención. .
EJEMPLOS;
Ejemplo 1: Estructura del Cristal del fragmento Fab del hR3.
La estructura del cristal del fragmento Fab del anticuerpo hR3 se determinó a una resolución de 2.5 A y se refino para los factores R con buena estéreo química. En general Ia estructura del cristal es similar a las estructuras de otros fragmentos Fab. Sin embargo se encontró un rasgo peculiar y es que el CDR 1 de Ia cadena pesada no se ajusta a ninguna de las conformaciones canónicas descritas. Por el contrario, se encontró que esta región adopta una estructura de alga hélice. Esta conformación de alfa hélice no pertenece a ninguna de las conformaciones canónicas descritas para el CDR 1 de las cadenas pesadas, en Ia Figura 1 se representa Ia estructura del cristal de fragmento Fab donde se puede apreciar Ia peculiaridad en Ia estructura del CDRl de cadena pesada. Por un método semi automático se comparó Ia estructura del cristal del fragmento Fab del anticuerpo hR3 con las estructuras de cristales de fragmentos similares contenidos en Ia base de datos PDB actualizada hasta Mayo de 2007. En Ia base de datos se encontró que solamente otro anticuerpo humanizado por el método de trasplante de los CDR tenía este rasgo peculiar en Ia estructura del CDRl de Ia cadena pesada.
Ejemplo 2: Estudio de Ia unión del fragmento al ligando.
Mediante estudios de Biacore se determinó que los fragmentos Fab del anticuerpo hR3 se unen al dominio extracelular del EGFR con una KD de 2.OxIO-8 M, en dicho estudio se usó como control el fragmento Fab del anticuerpo comercial contra el EGFR Cetuximab para el cual se encontró que se une al dominio extracelular del receptor con un KD de 1.9x10-9M, similar al valor reportado previamente. Como se observa el anticuerpo hR3 tiene una afinidad menor que el Cetuximab, esto es debido fundamentalmente a que tiene una mayor Kon. Estas diferencias en Ia afinidad de ambos receptores podría explicar Ia diferencia de su efecto biológico, particularmente efectos adversos, cuando es usado en tratamientos sistémicos en pacientes de cáncer.
Fab kon ( 1 /Ms) koff (1 /s) Kd (M)
Nimotuzumab 5.2xlO4 l .lxlO"3 2.IxIO'8
Cetuximab 3.IxIO6 5.8xlO"3 1.8xlO-9
TABLA l:
Adicionalmente, se comprobó que el hR3 competía por Ia unión al EGFR con el anticuerpo Cetuximab. Empleando técnicas de ELISA se hicieron ensayos de inhibición con el anticuerpo Cetuximab que se sabe por Ia literatura que se une de manera específica y exclusiva al Dominio III del EGFR. Para esto se usaron placas recubiertas con EGFR y se mantuvo constante Ia concentración del fragmento Fab-hR3 biotinilado. Se usaron diluciones del fragmento Fab- Cetuximab y se observó como Ia señal dada por el Fab-hR3 biotinilado, al ser revelado con esreptavidina conjugada a fosfatasa, disminuía. También se realizaron ensayos de competencia utilizando el FACS sobre células A431 , que se conoce que sobre expresan el EGFR. Aquí se hicieron diluciones de hR3/Cetux¡mab similares a las descritas anteriormente y se confirmó que el anticuerpo hR3 compite con el Cetuximab por Ia unión al receptor de EGF. Los resultados obtenidos tanto por ELISA como por FACS indican que los epitopos reconocidos por ambos anticuerpos están muy cercanos y no es posible que ambos se unan simultáneamente al receptor. Basándose en estos resultados y conociendo del arte previo que Cetuximab se une al EGFR por el dominio III de Ia región extracelular del receptor, es posible asumir que el hR3 se une al EGFR por el mismo Dominio que el Cetuximab.
Ejemplo 3: Modelo del complejo anticuerpo-receptor.
El modelo del complejo entre hR3 y el EGFR se predijo mediante cálculos "/n silíco". Para esto se usaron, de forma secuencial, el programa RosettaDock, para Ia predicción del acoplamiento de ambas proteínas y Posteriormente se usó el programa NAMD para relajar Ia estructura del complejo dentro de una caja de agua. El resultado de este modelo se observa en Ia Figura 1. El panel A) muestra una vista general del modelo con el EGFR en su conformación de baja afinidad de unión al ligando (inactiva). En el panel B) se observa igualmente una vista general del modelo pero en este caso el EGFR está en su conformación de alta afinidad por el ligando (activa). De esta figura se observa que según nuestro modelo hR3 es capaz de unirse al EGFR sin inhibir el cambio de conformación que este necesita para Ia dimerización y Ia posterior señalización. El panel C) muestra un acercamiento a las interacciones moleculares entre el hR3 y el EGFR.
En Ia Figura 2A se muestra como, según nuestro modelo, inhibe Ia unión del Cetuximab. Mientras en Ia Figura 2B, se muestra como el anticuerpo hR3 bloquea Ia unión del ligando EGF a su receptor el EGFR.
Ejemplo 4: Modelo teórico de un fragmento Fv de un anticuerpo que se une al dominio I del EGFR. El modelo se obtuvo por Ia misma metodología que el modelo del ejemplo 3. El anticuerpo unido permite que el receptor adopte Ia conformación activa donde los dominios I y Il están próximos uno al otro. El EGF (Figura 3, en rojo, representado en modelo de Dreiding), en cambio, no puede colocarse en su sitio de unión debido a impedimentos esféricos causados por el anticuerpo (el solapamiento de ambas estructuras es claramente visible en Ia Figura 3. La estructura del EGFR en complejo con el EGF fue tomada del fichero con código livo del Protein Data Bank. El fragmento Fv de anticuerpo fue construido por modelación computacional.
Ejemplo 5: Efecto citotóxico de los anticuerpos monoclonales anti-EGFR sobre las células tumorales A431 y Hl 25. Las células A431 y Hl 25 (2 x 105) se sembraron en placas de 24 pozos usando medio DMENrFl 2 al 10% SFT. Doce horas después las células se tratan con los anticuerpos monoclonales Cetuximab (7-175 nM) o Nimotuzumab (70-1750 nM) en medio DMEN:F12 con 1% de SFT y EGF humano (500 pg/ml) y se incubaron 48 horas. Este tratamiento se repitió durante otras 48 horas. La muerte celular se analizó después de 96 horas de tratamiento mediante citometría de flujo utilizando un mareaje con ioduro de propidio (10 μg/ml). Las células no tratadas se incluyeron como control de mínima muerte. En las dos líneas celulares analizadas, el Cetuximab induce mayor porcentaje de células muertas a todas las concentraciones ensayadas que el anticuerpo Nimotυzumab (Figura 4). Es de resaltar que este resultado se obtiene aun cuando el Nimotuzumab es usado 1OX de concentración con respecto al Cetuximab, para independizar las diferencias en efecto citotóxico de las diferencias en afinidad de ambos anticuerpos.
Ejemplo 6: Efecto citotóxfco versus citostátíco de los anticuerpos monoclonales anti-EGFR sobre las células tumorales A431 y H125.
Las células A431 y Hl 25 (0.25 x 106) se sembraron en placas de 6 pozos usando medio DMEN:F12 al 10% SFT. Doce horas después las células se tratan con los anticuerpos monoclonales Cetuximab o Nimotuzumab (7-1750 nM) o con el AG 1478 (inhibidor tirosina cinasa del EGFR) alO μM en medio DMEN:F12 con 1% de SFT y EGF humano (500 pg/ml) y se incubaron 48 horas. Este tratamiento se repitió durante otras 48 horas. Para analizar el ciclo celular y Ia fragmentación del ADN (marcador de apoptosis tardía) en estas líneas después de las 96 horas de tratamiento, las células se fijaron con una mezcla de metanol:acetona (4:1 ) a 4°C y se marcaron incubando con ioduro de propidio (400 μg/ml)y RNAsa (100 μg/ml). Ambos análisis se realizaron en un citómetro de flujo, colectando como mínimo 20 000 eventos y los datos se procesaron usando los programas WinMDI 2.8 y ModFit3.0. Como se puede observar en las Figura 5, tanto en las células A431 (A) como en las H 125 (B) ambos anticuerpos monoclonales (Cetuximab: 175 nM, Nimotuzumab: 1750 nM) inducen un similar incremento en Ia fracción de las células en Ia fase G0-G1 con Ia correspondiente disminución de las células en las fases G2-M y S al compararse con las células sin tratamiento. Este efecto fue comparable al obtenido con el AG 1478 usado como control positivo de detención del ciclo celular. En las tablas 1 (A431 ) y 2 (Hl 25) se muestran los porcentajes de células en las diferentes fases del ciclo para un amplio rango de concentraciones de Nimotuzumab y Cetuximab que se emplearon para hacer el experimento. Sin embargo, cuando se analiza Ia capacidad de estos anticuerpos de inducir apoptosis sobre estas células, se observa que aun cuando ambos son capaces de tener un semejante efecto anti-proliferativo sobre las células A431 y Hl 25, el Cetuximab induce a todas las concentraciones empleadas un mayor porcentaje de células apoptóticas que el Nimotuzumab (Figura 5, Tabla 2, Tabla 3).
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Tabla 2. Distribución del ciclo celular y porcentaje de células apoptóticas de Ia línea A431 tratada con diferentes concentraciones de Cetuximab y Nimotuzumab.
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Tabla 3. Distribución del ciclo celular y porcentaje de células apoptóticas de Ia línea H 125 tratada con diferentes concentraciones de Cetuximab y Nimotuzumab.
Ejemplo 7: Actividad antitumoral en ratones atónicos xenotrasplantados.
Los animales utilizados para Ia experimentación fueron ratones atímicos NMRI (8-10 semanas) los cuales se obtuvieron de Charles River (Sulzfeld, Alemania). Los animales se mantuvieron en condiciones asépticas en un animalario aprobado en el cuidado de animales de laboratorio y acorde a las regulaciones y normas vigentes, y su uso fue aprobado por las autoridades responsables locales. Para producir los tumores, las células se tomaron de cultivos subconfluentes por tratamiento con tripsina 0.25% y EDTA 0.05%. La trypsinisación se detuvo con medio al 10% de suero fetal de ternera. Para Ia inoculación solo se emplearon aquellas suspensiones celulares con una viabilidad mayor del 90%. Se inocularon 8 animales por grupo con 107 células de Ia línea U87MG por vía subcutánea en el flanco izquierdo y con 2x104 U87MG por vía intracraneal en el hemisferio derecho del cerebro de los ratones con Ia ayuda de un dispositivo estereotáctico. El peso corporal de los ratones se monitoreó durante toda Ia experimentación. La talla de los tumores subcutáneos se midió tres veces por semana y el volumen tumoral se determinó mediante Ia fórmula: 0.5 x (diámetro mayor) x (diámetro menor)2. Los índices de volumen tumoral relativos (RTV) se calcularon referidos a los volúmenes medios de cada día respecto a Ia primera medición (ajustado a l ). Los animales se sacrificaron cuando el peso de los tumores excedió el 10% del peso total de los animales. La talla de los tumores intracraneales también se determinó. Para ese propósito se extrajeron los cerebros completos de los animales y se congelaron en 2-metil butano. Se realizaron cortes en criostato (l Oμm) y se tomaron secciones consecutivas y se tiñeron con violeta cresil. Se determinaron los diámetros mayores de los tumores y los perímetros con Ia ayuda de un microscopio (Zeiss Axioskop), y se calcularon los volúmenes tumorales. Los tumores subcutáneos se congelaron y se almacenaron a -80°C para otros análisis. Los diferentes tratamientos se iniciaron tres días después de inoculados los tumores. Los animales se trataron tres veces por semana con los anticuerpos monoclonales Nimotuzumab o Cetuximab con 50 mg/kg/dosis mediante administración intraperitoneal. En los grupos que recibieron irradiación, los animales se expusieron a una dosis total de 3.0 Gy de irradiación de cuerpo completo (TBI), fraccionado en 1.0 Gy semanal durante tres semanas comenzando 72 horas después de Ia inoculación de los tumores. Además se trataron grupos de animales con Ia combinación de los anticuerpos más Ia radioterapia. En estos grupos los anticuerpos se administraron 6 horas antes de Ia terapia de radiación. En el experimento se incluyó un grupo adicional de 10 animales que recibió solución salina en lugar de anticuerpos y se tomó como control. Figura 6 muestra Ia sensibilización de Ia línea tumoral humana U87MG xenotrasplantada por vía subcutánea en ratones NMRI atímicos por anticuerpos monoclonales anti-EGFR. Los anticuerpos se administraron por vía intrαperitoneαl α 50 mg/kg/dos¡s tres veces por semana durante tres semanas. Los animales tratados con radioterapia recibieron una dosis total de 3 Gy fraccionada en 1 Gy seminal durante tres semanas. En Ia figura se muestran las administraciones de los anticuerpos en flechas negras continuas y Ia radiación en flechas fraccionadas. Los volúmenes tumorales se determinaron en los tiempos indicados. La adición de los anticuerpos a Ia radioterapia retardó significativamente (p<0.05) el crecimiento de los tumores en los ratones respecto a los grupos de animales tratados con radioterapia o no tratados. La adición del Nimotuzumab a Ia radioterapia también retardó significativamente el crecimiento de los tumores respecto al grupo tratado con el anticuerpo solamente. Prueba estadística de Mann-Whitney; los símbolos indican diferencias estadísticas respecto a (*) PBS, (+) anticuerpo solo, (°) radioterapia. Figura 7 muestra Ia sensibilización de Ia línea tumoral humana U87MG xenotrasplantada ortotópicamente en ratones NMRI atímicos a Ia radioterapia por anticuerpos monoclonales anti-EGFR. Todos los tratamientos comenzaron tres días después de Ia inoculación de los tumores con Nimotuzumab, Cetuximab, radioterapia, Nimotuzumab más radioterapia, Cetuximab más radioterapia o PBS. Los anticuerpos se administraron por vía intraperitoneal a 50 mg/kg/dosis tres veces por semana durante tres semanas. Los animales tratados con radioterapia recibieron una dosis total de 3 Gy fraccionada en 1 Gy seminal durante tres semanas. Las secciones de cerebro analizadas en los grupos que recibieron los anticuerpos más Ia radioterapia mostraron una reducción significativa (p<0.05) en el tamaño de los tumores. La adición del Nimotuzumab a Ia radioterapia disminuyó significativamente (p<0.05) el tamaño de los tumores respecto a Ia radioterapia sola. Prueba estadística de Mann-Whitney; los símbolos indican diferencias significativas respecto a: (*) PBS, (+) radioterapia.
Angiogenesis (CD31 /PECAM-I). Las muestras de tumores se descongelaron a temperatura ambiente durante 10 minutos y se fijaron en para-formaldehido 3.7% durante 15 minutos. Seguidamente se bloqueó Ia peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno 0.03% (DAKO Corporation, Carpintería, CA) durante 15 minutos y se incubaron con el anticuerpo primario anti CD31 /PECAM-I a temperatura ambiente por 2 horas a una dilución de 1 :100 en medio diluente de anticuerpo (DAKO Corporation, Carpintería, CA). Después de lavar, se incubó con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado a peroxidasa a temperatura ambiente durante 30 minutos para detectar Ia reacción antígeno-anticuerpo. Finalmente se visualizaron las secciones con el cromógeno DAB (DAKO Corporation, Carpintería, CA), se montaron las láminas y se analizó Ia tinción con CD31. Las secciones tumorales representativas se visualizaron en un microscopio de luz (Zeiss, Axioskop) con una magnificación ocular de X40. Se estimó el área de los micro-vasos sanguíneos endoteliales presentes en los tumores de 5 campos microscópicos en cada tumor, y se promedio el valor medio en cada caso. El área total de los vasos evaluados se calculó empleando el programa Axio Vision 4.5 (Zeiss). El tratamiento con Nimotuzumab estuvo asociado a una significativa reducción (pθ.01 ) en el área de los vasos de los animales tratados (Figura 8). CDI 33. Para Ia determinación de Ia expresión de CD 133 las muestras tumorales se fijaron en acetona durante 15 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente se bloqueó Ia peroxidasa endógena sumergiendo las muestras en peróxido de hidrógeno 0.03% (DAKO Corporation, Carpintería CA) durante 30 minutos y se bloquearon las uniones inespecíficas con suero fetal de ternera al 20% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de esto se incubaron las muestras con el anticuerpo primario anti-CD 133/1 AC 133 (Miltenyi Biotec) durante 1 hora a temperatura ambiente a una dilución de trabajo de 1 :10 en diluente de anticuerpo. Posteriormente se lavaron las muestras y se incubaron con estreptavidina conjugada a peroxidasa durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente se visualizaron las secciones con el cromógeno DAB (DAKO Corporation, Carpintería, CA), se montaron las láminas y se analizó Ia tinción con CDl 33. Las secciones tumorales representativas se visualizaron en un microscopio de luz (Olympus, Japan) con una magnificación ocular de X40. El porciento de células positivas al CDl 33 se determinó promediando el número de células positivas al marcador para cada grupo analizado en las secciones correspondientes a los 5 campos donde se observó Ia mayor tinción. Figura 9 muestra el análisis inmunohistoquímico de Ia expresión del CD31 en los tumores humanos de U87MG xenotrasplantados en ratones NMRI atímicos tratados. El tratamiento con Nimotuzumab estuvo asociado a una significativa reducción (p<0.05) en el porciento de células CDl 33 positivas respecto a los animales tratados con radioterapia. La adición del Nimotuzumab a Ia radioterapia disminuyó significativamente (p<0.05) el porciento de células CDl 33 positivas respecto a los animales tratados con radioterapia y respecto a los animales no tratados. Prueba estadística de Mann-Whitney; los símbolos indican diferencias significativas respecto a: (*) PBS, (+) radioterapia. Análisis Estadístico. Las medias, desviaciones estándar, y el error estándar de la media se calcularon utilizando el programa GraphPAD versión 4.0 (GraphPAD, San Diego, CA.) . El análisis estadístico se realizó con el mismo programa GraphPAD InStat. La significación estadística entre grupos se comparó utilizando Ia prueba de Mann-Whitney, y Ia prueba de comparación Múltiple de Dunn. Las diferencias se consideraron significativas si p<0.05.
Ejemplo 8: Efecto antitumoral de Ia combinación del Anticuerpo monoclonal hR3 (Nimotuzumab) y Carboplatino a bajas dosis. Los animales utilizados para Ia experimentación fueron ratones atímicos NMRI (8-10 semanas) retados por vía subcutánea con un tumor de origen humano clasificado como NSCLC. El día 0 del experimento los animales fueron inoculados con fragmentos del tumor. Cuando los tumores fueron palpables (entro los 10 y 12 días postinoculación del tumor) ios animales fueron tratados con 50 mg/Kg del anticuerpo monoclonal hR3 tres veces por semana y/o una dosis semanal de Carboplatino a 50 mg/Kg durante 6 semanas por vía intraperitoneal. Se usó PBS como control del experimento. El diámetro tumoral mayor y menor de los tumores fueron medidos 2 veces por semana y el volumen tumoral calculado por Ia siguiente fórmula: VT= (diámetro menor)2 x diámetro mayor / 0.52. El Volumen Tumoral Relativo fue calculado de Ia siguiente manera: VT x 1 / VTdíao. En Ia gráfica se representa el volumen tumoral relativo con el error estándar de Ia media. Figura 10.
Breve descripción de las figuras: Figura 1: Vista general del modelo (representado n modelo de cintas, eEGFR en azul, VL y VH en carmelita y verde respectivamente. A) EGFR en su conformación de inactiva (baja afinidad) y B) EGFR en su conformación activa
(alta afinidad). C) acercamiento a Ia inferíase de interacción entre el
Nimotuzumab y el EGFR.
Figura 2: Inhibición de Ia unión del Cetuximab A) y EGF, B) por el
Nimotuzumab.
En A) Utilizando Ia representación de cintas se muestra el Cetuximab y por cintas y superficie está representado el Nimotuzumab (VL y VH de carmelita y verde respectivamente) y el EGFR en su conformación inactiva en azul. En B) se muestra el EGF como representación de cintas y superficie en color rojo.
Figura 3: Modelo teórico de un fragmento Fv de anticuerpo (en verde, representado en modelo de cintas) que se une al dominio I del EGFR.
Figure 4. Cetuximab tiene una mayor capacidad citotóxica que Nimotuzumab en las células A431 y H125. Las células A431 y H125 se trataron con los anticuerpos cetuximab (7-175 nM) o Nimotuzumab (70-1750 nM) durante 96 horas y posteriormente se tiñeron con IP analizándose por FACS. Cada barra representa Ia media del porciento de células muertas a partir de células totales ± D. E de 3 pozos de tratamiento. Estos experimentos se repitieron tres veces obteniéndose resultados similares.
Figure 5. Nimotuzumab y Cetuximab tienen un similar efecto citostático sobre las células A431 y HI 25 mientras Cetuximab induce una mayor respuesta apoptótica que el Nimotuzumab sobre estas células. Las células A431 (A) y H 125 (B) se trataron con los anticuerpos cetuximab (175 nM), nimotuzumab (1750 nM) o el AG 1478 (10 μM) durante 96 horas y posteriormente se tiñeron con IP analizándose por FACS. En cada gráfico se muestran dos regiones. La de línea discontinua corresponde a las células vivas y para las mismas se muestra el porcentaje de células en cada fase del ciclo. La de línea continua corresponde a las células apoptóticas y el porcentaje de las mismas con respecto al total también se muestra. Estos experimentos se repitieron tres veces obteniéndose resultados similares.
Figura 6: Sensibilización de Ia línea tumoral humana U87MG xenotrasplantada por vía subcutánea en ratones NMRI atímicos por anticuerpos monoclonales anti-EGFR. Todos los tratamientos comenzaron tres días después de Ia inoculación de los tumores con o Nimotuzumab (h-R3), Δ Cetuximab (C225), m radioterapia (RT), • Nimotuzumab más radioterapia (h-R3 + RT), A Cetuximab más radioterapia (C225 + RT) π PBS como control (PBS).
Figura 7: Sensibilización de Ia línea tumoral humana U87MG xenotrasplantada ortotópicamente en ratones NMRI atímicos a Ia radioterapia por anticuerpos monoclonales anti-EGFR.
Figura 8: Análisis inmunohistoquímico de Ia expresión de CD31 en los tumores humanos de U87MG xenotrasplantados en ratones NMRI atímicos tratados con Nimotuzumab (h-R3), Cetuximab (C225), radioterapia (RT), Nimotuzumab más radioterapia (h-R3 + RT), C225 más radioterapia (C225 + RT), o PBS.
Figura 9: Análisis inmunohistoquímico de Ia expresión de CD 133 en los tumores humanos de U87MG xenotrasplantados en ratones NMRI atímicos tratados con Nimotuzumab (h-R3), radioterapia (RT), Nimotuzumab más radioterapia (h-R3 + RT), o PBS. Figura 10: Efecto antitumoral de Ia combinación del Anticuerpo monoclonal hR3 (Nimotuzumab) y Carboplatino a bajas dosis. Animales atímicos retados con un tumor de origen humano clasificado como NSCLC, fueron tratados con 3 dosis diarias de 50 mg/Kg del anticuerpo hR3 y una dosis semanal de Carboplatino a 50 mg/Kg durante 6 semanas. En Ia gráfica se representa el volumen tumoral relativo con el error estándar de Ia media.

Claims

5 Reivindicaciones
1. Un inhibidor del receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) caracterizado porque dicho inhibidor reconoce al EGFR por los dominios I o III de Ia región extracelular inhibiendo Ia unión de los ligandos mitogénicos, adicionalmente permite que el dominio Il de Ia región 0 extracelular del receptor forme homodímeros que activen Ia autofosforilación de modo tal que dicho inhibidor tiene una actividad citostática sobre células que expresan el receptor.
2. El inhibidor del receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) 5 según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque reconoce al EGFR por el domino I de Ia región extracelular.
3. El inhibidor del receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque reconoce al EGFR por 0 el domino III de Ia región extracelular.
4. El inhibidor del receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) según Ia reivindicación 1 caracterizado porque dicho inhibidor es un anticuerpo monoclonal o sus fragmentos contra el receptor del EGFR.
15
5. El inhibidor del receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) según Ia reivindicación 4 caracterizado porque dicho inhibidor es un anticuerpo monoclonal humanizado o sus fragmentos contra el receptor del EGFR.
30
6. El inhibidor del receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) según Ia reivindicación 5, caracterizado porque dicho inhibidor es al anticuerpo humanizado hR3 producido por el hibridoma secretor con numero de Deposito ECACC 951 1 10101 , o sus fragmentos con Ia misma
)5 actividad biológica que el anticuerpo original.
7. La línea celular secretora del anticuerpo de Ia reivindicación 4.
8. La línea celular secretora del anticuerpo de Ia reivindicación 6 con numero de Deposito ECACC 951 1 10101.
0 9. Una composición farmacéutica útil para el tratamiento de los tumores malignos que expresan EGFR caracterizada porque comprende al menos uno de los inhibidores de las reivindicaciones 1 a 3, y que adicionalmente puede contener excipientes y/o adyuvantes y/o otros ingredientes farmacéuticamente activos.
5 10. Una composición farmacéutica útil para el tratamiento de los tumores malignos que expresan EGFR caracterizada porque comprende al menos uno de los anticuerpos o fragmentos del anticuerpo de las reivindicaciones 4 a 6, y que adicionalmente puede contener excipientes y/o adyuvantes y/o otros ingredientes farmacéuticamente activos.
1 1 . La composición farmacéutica de Ia reivindicación 10, caracterizada porque comprende el anticuerpo humanizado o los fragmentos del anticuerpo producido por el hibridoma secretor con numero de Deposito ECACC 951 1 10101 , o alguna de sus variantes o fragmentos con la misma actividad biológica que el anticuerpo original.
12. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el anticuerpo humanizado o los fragmentos del anticuerpo de Ia reivindicación 6.
13. Uso del inhibidor de Ia reivindicación 1 para Ia terapia de tumores malignos.
14. Uso del inhibidor de Ia reivindicación 1 en combinación con radioterapia para el tratamiento de tumores malignos.
15. Uso del inhibidor de Ia reivindicación 1 en combinación con quimioterapia para el tratamiento de tumores malignos.
16. Uso del anticuerpo de Ia reivindicación 6 para Ia terapia de tumores malignos.
17. Uso del anticuerpo de Ia reivindicación 6 en combinación con radioterapia para el tratamiento de tumores malignos.
18. Uso del inhibidor de Ia reivindicación 6 en combinación con quimioterapia para el tratamiento de tumores malignos.
19. Un método para Ia selección de los inhibidores de Ia reivindicación 1 .
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