MX2010014543A - Inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidermico con accion citostatica y sus usos en la terapia de tumores. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con inhibidores del receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) que se unen al receptor por los dominios I o III bloqueando la unión de los ligandos naturales pero que permiten el equilibrio fisiológico entre las conformaciones inactiva y activa del receptor de tal forma que impiden la señal mitogénica pero la fracción del dominio II de los receptores que están en conformación activa homodimerizan y autofosforilan al receptor desencadenando la cadena de eventos bioquímicos que mantienen la supervivencia de las células. Los autores de esta invención han encontrado que estos inhibidores que reconocen el EGFR por los dominios I o III tienen un efecto citostático y no citotóxico sobre tumores que expresan dicho receptor y representan una ventaja sobre el estado del arte porque los efectos adversos que provocan son menores que los reportados.

Description

INHIBIDORES DEL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO CON ACCIÓN CITOSTÁTICA Y SUS USOS EN LA TERAPIA DE TUMORES CAMPO DE LA TÉCNICA La presente invención se relaciona con el campo de la biotecnología, particularmente con la salud humana. Y más particularmente con nuevos anticuerpos que reconocen el dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento Epidérmico (EGF-R) y que bloquean la unión del ligando natural pero sin inhibir completamente la dimerización de esta molécula.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR Los avances en el conocimiento de la biología de los tumores y los mecanismos de la oncogénesis han permitido identificar diferentes blancos para la terapia del cáncer, particularmente el cáncer de pulmón, que se sabe es una de las primeras causas de muerte tanto de mujeres como de hombres. Entre estos blancos, el receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR), o HER 1 ha recibido particular atención para el tratamiento del cáncer de pulmón. El EGFR es un receptor transmembranario que se encuentra fundamentalmente en células de origen epitelial. La autofosforilación de su dominio intracelular desencadena o inicia una cascada de eventos que conducen a la proliferación celular. El EGFR es comúnmente expresado a altos niveles en una variedad de tumores sólidos y para estos, se ha evidenciado que el EGFR está involucrado en el control de la supervivencia de las células, la proliferación, metástasis y angiogénisis.

La principal estrategia en el desarrollo de armas terapéuticas basadas en la inhibición del EGFR han sido los anticuerpos monoclonales que sean antagonistas de los ligandos naturales del receptor, así como pequeñas moléculas que inhiben la actividad tirosina quinasa del dominio intracelular.

Específicamente contra el HER1 o EGFR existen actualmente varios anticuerpos cuya eficacia terapéutica está siendo evaluada en la clínica. Algunos de ellos son los anticuerpos Cetuximab, Panitumumab y Matuzumab entre otros.

Cetuximab (Erbitux), es un anticuerpo monoclonal quimérico que reconoce específicamente el dominio extracelular del EGFR y que ha sido aprobado por la FDA para cáncer colo-rectal y tumores avanzados de cabeza y cuello. Resultados experimentales han demostrado que el Cetuximab es un potente inhibidor de la proliferación de las células A431 derivadas de un carcinoma epidermoide, tanto in vitro como en tumores trasplantados en ratones atímicos. También se ha demostrado que tienen un efecto sinérgico importante cuando se combinan tanto con drogas citotóxicas como con radioterapia. Estos resultados han servido de base a la realización de ensayos clínicos Los resultados de los Ensayos Clínicos Fase II han demostrado que el Cetuximab tanto solo como combinado con irinotecan and oxaliplatin tiene un efecto como terapia de primera línea para pacientes avanzados con cáncer colo-rectal metastásico, habiéndose reportado un incremento absoluto de entre el 10 y el 20% de respuesta. Otro ensayo clínico Internacional Multicéntrico que incluyó 424 pacientes con enfermedad loco regional en estado avanzado, la combinación de Cetuximab con radioterapia prácticamente dobló el tiempo de sobrevida de los pacientes de 28 a 54 meses. A la vez esta combinación incrementó el tiempo de sobrevida de los pacientes después de dos y tres años bajo tratamiento desde 55 y 44% respectivamente para los pacientes que recibieron radioterapia solamente hasta 62 y 57% para aquellos que recibieron la combinación. En general los resultados han mostrado que el uso del Cetuximab tanto cuando se administra como mono terapia o en combinación con drogas citotóxicas o con radioterapia son altamente eficientes. Sin embargo, también se ha observado un significativo incremento de la toxicidad inducida por las terapias convencionales.

El Panitumumab que es un anticuerpo completamente humanizado que reconoce el EGFR y es otro anticuerpo monoclonal terapéutico aprobado por la FDA en 2006 como monoterapia para cáncer colo-rectal metastásico con progresión de la enfermedad después de ser sometidos a régimen de quimioterapia. Los resultados del tratamiento con Panitumumab son básicamente similares a los obtenidos con Cetuximab, al igual que las reacciones adversas.

Se ha evaluado el efecto en la clínica de muchos antagonistas del EGFR, incluyendo diversos anticuerpos monoclonales. Sin embargo la respuesta objetiva obtenida con la mayoría de estas drogas anti-EGFR ha sido de corta duración y la toxicidad común ha sido una severa erupción cutánea que en muchos casos conlleva a la interrupción del tratamiento.

Hasta el momento actual los diferentes ensayos en los que se evalúan drogas relacionadas con el EGFR han arrojado que existe una fuerte asociación entre la severidad de la erupción cutánea y la respuesta del tumor, lo cual sugiere que la aparición de la erupción sirve como un marcador predictivo de la respuesta antitumoral de los agentes que tienen como blanco el EGFR. En otras palabras, la respuesta de los tumores está asociada al efecto de la droga sobre otros tejidos sanos no relacionados con el tumor, como puede ser la piel (Peedicayil J. y col., en Correspondence 2004, doi: 10.016).

Gridelli C. y col., en Results of an Experts Panel Meeting, Crit.

Rev. Oncol/Hematol. 2007, doi: 10. 016, hace una revisión de los resultados de diversos ensayos clínicos en los que se encuentra una relación positiva entre la erupción cutánea y la respuesta al tratamiento y/o la sobrevida de los pacientes. En el artículo se concluye que cada vez con más fuerza se considera la reacción cutánea como un marcador indirecto de que realmente el EGFR está siendo bloqueado por las drogas; por lo que hay casi un consenso entre los expertos de que la erupción cutánea es un importante marcador clínico subrogado de la actividad anti tumoral o de eficacia terapéutica y se sugiere que la reacción cutánea podría servir para identificar el grupo de pacientes que más se beneficiarían con el tratamiento.

Sin embargo, resultados de ensayos clínicos utilizando el anticuerpo monoclonal anti-EGFR, hR3 (EP 0712863B1 y US 5,891 ,996), mostraron que el anticuerpo es bien tolerado por los pacientes. La erupción cutánea, que ha sido detectada en el 80% de los pacientes tratado con otras drogas bloqueadoras del EGFR (Perez-Soler y col en Oncologist 2005; 10: 345-56 y Thomas y col en Clin J. Oncol N 2005; 9: 332-8) no aparece en los pacientes sometidos a dosis repetitivas de hR3 (Crombet y col. en Cáncer Biology & Therapy 5;4, 375-379, 2006).

A pesar del consenso que existe en el estado del arte sobre la asociación directa entre la erupción cutánea y el bloqueo del EGFR, los autores de la presente invención consideran que la erupción cutánea es una desventaja asociada a la droga y no al blanco de ahí la necesidad de continuar explorando nuevos agentes anti-EGFR.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con los inhibidores del receptor de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) con actividad citostática y no citotóxica sobre células que expresan dicho receptor.

Debe entenderse por agente Citostático cualquier agente que inhibe la proliferación celular deteniendo las células en una fase del ciclo celular; mientras que agente Citotóxico: es todo agente que induce muerte celular.

Sorprendentemente, los autores de la presente invención han descubierto que entre los inhibidores del EGFR, o lo que es igual, aquellas moléculas que en su interacción con el receptor inhiben la señal mitogénica inducida por los ligandos naturales, hay un grupo que por el sitio en que reconocen al receptor, permiten un equilibrio fisiológico entre las conformaciones activa e inactiva del receptor y por tanto mantienen un nivel basal de autofosforilación del receptor. Este nivel basal de autofosforilación del receptor hace que las células que lo expresan queden arrestadas en una fase del ciclo celular. La aplicación clínica de este resultado es que permite el diseño de drogas antitumorales que mas que inducir la muerte de las células tumorales ejerzan un control biológico sobre el crecimiento del tumor. Adicionalmente, este tipo de droga antitumoral tiene la ventaja que no provoca los serios efectos adversos, como la erupción cutánea, que se ha reportado previamente para los inhibidores del EGFR que tienen efecto citotóxico sobre los tumores.

Los inhibidores del EGFR con actividad citostática descritos en la presente invención se podrían caracterizar porque reconocen al EGFR por los dominios I o III de la región extracelular, preferiblemente por dominio III, e inhiben la unión del ligando natural y por tanto la señal mitogénica; aquellas moléculas, que reconocen al receptor por estos dominios pero que al mismo tiempo dejan libre el dominio II de la región extracelular del receptor de forma tal que este forme homodímeros que activen la fosforilación de la región intracelular de dichos receptores, resultan moléculas con actividad citostática sobre células que expresan el EGFR y por tanto potenciales agentes terapéuticos para tumores que expresan este receptor de membrana.

Los autores de la presente invención también han descubierto que la terapia de tumores malignos con estas moléculas, preferiblemente anticuerpos monoclonales, que inhiben la señal mitogénica del EGF pero que no impiden un nivel basal de autofosforilacion tienen un efecto cistostático sobre el crecimiento tumoral.

Las armas terapéuticas actuales que tienen como blanco el EGFR, tanto aquellas que resultan antagonistas de los ligandos mitogénicos, como las pequeñas moléculas inhibidoras de la autofosforilacion del receptor tienen una utilidad limitada por los efectos adversos que obliga en muchos casos a suspender el tratamiento. Los autores de la presente invención han encontrado moléculas que teniendo como blanco terapéutico el EGFR pueden simultáneamente inhibir el crecimiento tumoral sin producir los severos efectos adversos descritos para los inhibidores de la autofosforilacion del EGFR existentes hasta el momento. El hallazgo de la presente invención se basa en inhibir la actividad mitogénica inducida por los ligandos naturales del EGFR sin inhibir completamente la autofosforilacion del EGFR. Ha sido descrito previamente que el EGFR se encuentra en equilibrio en la membrana entre sus formas activa e inactiva. Cuando está en forma activa, el dominio II de la región extracelular interactúa con el mismo dominio de otras moléculas formando homodímeros y activando la autofosforilación del dominio intracelular, esta fosforilación desencadena una cascada de eventos vitales para las células. Se ha calculado que en ausencia de ligandos mitogénicos, entre 5 y el 10% de los receptores se encuentran en forma activa y por tanto fosforilados, este nivel de fosforilación aunque no es mitogénico permite la supervivencia de las células. Según los autores de la presente invención, utilizar drogas que inhiban completamente la autofosforilación del receptor provocaría la muerte celular masiva, tanto las células tumorales como tejidos normales sufrirán esta deprivación y de ahí los efectos adversos severos. Sin embargo con el empleo de los inhibidores que son objeto de la presente invención, se logra inhibir la actividad mitogénica sobre el crecimiento de los tumores pero se mantiene la fosforilación basal que permite la supervivencia de las células. El primer tipo de droga provocara un efecto citotóxico con regresiones tumorales impresionantes pero se le asocian efectos adversos severos y recaídas tempranas. Las drogas objeto de la presente invención, más que una muerte celular masiva con regresiones espectaculares provocaran estabilizaciones de la enfermedad por efecto citostático sobre los tumores sin grandes efectos adversos sobre tejidos normales.

Adicionalmente, los autores de la presente invención también han encontrado que estos inhibidores de EGFR con actividad citostática mantienen las propiedades como radio y quimio sensibilizadores descritas previamente para los inhibidores del EGFR con actividad citotóxica.

Basados en los hallazgos experimentales, los autores de la presente invención reclaman moléculas que tienen como blanco el EGFR y cuya actividad es el control biológico del crecimiento de los tumores. Tanto cuando son administrados como monoterapia como cuando se usan en combinación con quimio o radio terapia.

Por tanto son objeto de la presente invención aquellos ligandos del EGFR, naturales o sintéticos, preferiblemente naturales y más preferiblemente anticuerpos monoclonales, antagonistas del EGF que inhiben la unión del EGF al dominio extracelular del receptor pero que no interfieren en la dimerización del receptor y por tanto no afectan el nivel basal de autofosforilación.

Es también objeto de la presente invención un método para el tratamiento de un paciente de cáncer, que comprende la administración de una composición farmacéutica que contiene el ligando del EGFR, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, antagonista del EGF pero que no inhibe la autofosforilación basal del receptor.

También forma parte del objeto de la presente invención un método para el diseño y la selección de los ligandos, preferiblemente los anticuerpos monoclonales con acción citostática sobre el crecimiento de los tumores malignos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1C: Vista general del modelo (representado n modelo de cintas, eEGFR en azul, VL y VH en carmelita y verde respectivamente. Figura 1A: EGFR en su conformación de inactiva (baja afinidad) y Figura 1 B: EGFR en su conformación activa (alta afinidad). Figura 1 C: acercamiento a la interfase de interacción entre el Nimotuzumab y el EGFR.

Figuras 2A y 2B: Inhibición de la unión del Cetuximab A) y EGF, B) por el Nimotuzumab. En la figura 2A: Utilizando la representación de cintas se muestra el Cetuximab y por cintas y superficie está representado el Nimotuzumab (VL y VH de carmelita y verde respectivamente) y el EGFR en su conformación inactiva en azul. En la figura 2B se muestra el EGF como representación de cintas y superficie en color rojo.

Figura 3: Modelo teórico de un fragmento Fv de anticuerpo (en verde, representado en modelo de cintas) que se une al dominio I del EGFR.

Figura 4: Cetuximab tiene una mayor capacidad citotóxica que Nimotuzumab en las células A431 y H125. Las células A431 y H125 se trataron con los anticuerpos cetuximab (7-175 nM) o Nimotuzumab (70-1750 nM) durante 96 horas y posteriormente se tiñeron con IP analizándose por FACS. Cada barra representa la media del por ciento de células muertas a partir de células totales ± D.E de 3 pozos de tratamiento. Estos experimentos se repitieron tres veces obteniéndose resultados similares.

Figuras 5A y 5B: Nimotuzumab y Cetuximab tienen un similar efecto citostático sobre las células A431 y H125 mientras Cetuximab induce una mayor respuesta apoptótica que el Nimotuzumab sobre estas células. Las células A431 (Figura 5A) y H125 (Figura 5B) se trataron con los anticuerpos cetuximab (175 nM), nimotuzumab (1750 nM) o el AG1478 (10 µ?) durante 96 horas y posteriormente se tiñeron con IP analizándose por FACS. En cada gráfico se muestran dos regiones. La de línea discontinua corresponde a las células vivas y para las mismas se muestra el porcentaje de células en cada fase del ciclo. La de línea continua corresponde a las células apoptóticas y el porcentaje de las mismas con respecto al total también se muestra. Estos experimentos se repitieron tres veces obteniéndose resultados similares.

Figura 6: Sensibilización de la línea tumoral humana U87MG xenotrasplantada por vía subcutánea en ratones NMRI atímicos por anticuerpos monoclonales anti-EGFR. Todos los tratamientos comenzaron tres días después de la inoculación de los tumores con o Nimotuzumab (h-R3), ? Cetuximab (C225), ¦ radioterapia (RT), · Nimotuzumab más radioterapia (h-R3 + RT), A Cetuximab más radioterapia (C225 + RT)? PBS como control (PBS).

Figura 7: Sensibilización de la línea tumoral humana U87MG xenotrasplantada ortotópicamente en ratones NMRI atímicos a la radioterapia por anticuerpos monoclonales anti-EGFR.

Figura 8: Análisis inmunohistoquímico de la expresión de CD31 en los tumores humanos de U87MG xenotrasplantados en ratones NMRI atímicos tratados con Nimotuzumab (h-R3), Cetuximab (C225), radioterapia (RT), Nimotuzumab más radioterapia (h-R3 + RT), C225 más radioterapia (C225 + RT), o PBS.

Figura 9: Análisis inmunohistoquímico de la expresión de CD133 en los tumores humanos de U87MG xenotrasplantados en ratones NMRI atímicos tratados con Nimotuzumab (h-R3), radioterapia (RT), Nimotuzumab más radioterapia (h-R3 + RT), o PBS.

Figura 10: Efecto antitumoral de la combinación del Anticuerpo monoclonal hR3 (Nimotuzumab) y Carboplatino a bajas dosis. Animales atímicos retados con un tumor de origen humano clasificado como NSCLC, fueron tratados con 3 dosis diarias de 50 mg/Kg del anticuerpo hR3 y una dosis semanal de Carboplatino a 50 mg/Kg durante 6 semanas. En la gráfica se representa el volumen tumoral relativo con el error estándar de la media.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El inhibidor del EGFR objeto de la presente invención comprende una molécula natural o sintética que se una al receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico por los dominio I o III de la región extracelular de dicho receptor, preferiblemente por el dominio III, y que se caracteriza porque inhibe la unión del ligando natural y además permite que el receptor adopte la configuración activa. Sorprendentemente, los inhibidores que reconocen al receptor de esta forma tienen un efecto citostático sobre el crecimiento de las células que expresan el receptor a diferencia de los inhibidores descrito hasta el momento de la invención, los cuales tienen un efecto citotóxico sobre dichas células.

El método para el diseño de los agentes terapéuticos que son objeto de la presente invención se basa en resultados encontrados por los autores de la presente invención y que soportan el modelo de interacción del EGF con su receptor, Estas drogas antagonistas del EGF tienen efecto terapéutico contra el cáncer y resultan con ventajas sobre las drogas antagonistas del EGF previamente descritas. En una representación1 preferida, estos agentes terapéuticos pueden ser anticuerpos monoclonales contra el EGFR y preferiblemente el anticuerpo monoclonal hR3. Este anticuerpo humanizado se describe con todo detalle en la solicitud de patente EP 0712863B1 y en la patente US 5,891 ,996, antes mencionadas, y también en diversas publicaciones científicas, por ejemplo en Mateo y col., Immunotechnology 3; 71-81 , 1997. En dichos documentos se describen también con todo detalle procedimientos para su obtención.

El modelo de interacción descrito por lo inventores también permite explicar los resultados de ensayos clínicos en pacientes de cáncer donde se evaluó el efecto terapéutico de los agentes objeto de la presente invención.

Es conocido que la interacción del EGF con el dominio extracelular del receptor de membrana induce una cascada de señales que son las que desencadenan la acción mitogénica de este factor de crecimiento.

La autofosforilación del dominio intracelular de EGFR es uno de los primeros eventos bioquímicos de esta cascada de señales, pero se sabe que es requisito indispensable la dimerización de los receptores.

También es conocido del estado del arte que la molécula de EGF se une simultáneamente a los Dominios I y III de la región extracelular del EGFR, haciendo que el receptor adopte una configuración activa y dejando libre para la dimerización al Dominio II. Los anticuerpos monoclonales (AcM) que reconocen el EGFR y que se han estado probando en la clínica por su efecto terapéutico en tumores son moléculas que funcionan como antagonistas del EGF y se sabe que se unen al receptor inhibiendo la dimerización y la posterior fosforilación. Otros anticuerpos descritos en el arte previo, se sabe que se unen directamente al Dominio II del receptor inhibiendo de igual manera la dimerización del receptor.

Sorprendentemente los autores de la presente invención han encontrado que es posible impedir la unión del EGF a su receptor inhibiendo así la señal mitogénica del ligando natural pero al mismo tiempo dejar libre el Dominio II, de forma que no se inhiba la dimerización del receptor, permitiendo de esta manera que ocurra un nivel basal de autofosforilación del mismo.

Es conocido del estado de arte que las moléculas de EGFR se encuentran en la membrana en un equilibrio entre las conformaciones activa e inactiva. Se dice que entre el 10% y el 5% de los receptores de membrana se encuentran en la conformación extendida que por tanto para esta fracción de los receptores es posible la dimerización con la consiguiente autofosforilación.

Si bien este nivel de fosforilación del receptor no constituye una señal para que las células entren en proliferación, al menos permite la viabilidad celular en un estado de quiescencia.

Por tanto la utilización de moléculas con las características que se describen en la presente invención seria de gran utilidad en la terapéutica de aquellos tumores que expresen este receptor. El uso terapéutico de las moléculas de la presente invención inhibiría la proliferación de los tumores inducida por el REGF pero al mismo tiempo se evitarían los efectos adversos de los antagonistas del EGF que existen actualmente en la práctica clínica.

De entre los agentes terapéuticos con las propiedades descritas anteriormente resultan preferidos al objeto de la presente invención los anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular del EGFR, siendo especialmente preferido el anticuerpo monoclonal humanizado hR3 descrito previamente en US 5,891 ,996 y EP 0712863.

Aunque en el estado de la técnica existen agentes terapéuticos que reconocen el mismo blanco, el agente terapéutico de la presente invención tiene características estructurales y funcionales que le dan ventajas desde el punto de vista terapéutico sobre los que han sido descritos previamente. Una de las particularidades del anticuerpo de la presente invención son aquellas observadas en la estructura tridimensional del sitio de reconocimiento y unión del antígeno.

Adicionalmente, el objeto de la presente invención se relaciona con un método para inhibir el crecimiento de tumores dependientes del EGF, caracterizado porque la administración en dosis terapéuticas del agente terapéutico provoca la estabilización de la enfermedad más que la regresión drástica del tamaño tumoral.

También son objeto de la presente invención composiciones terapéuticas que comprenden una disolución acuosa de al menos uno de estos inhibidores citostáticos útiles en el tratamiento de tumores u otras patologías asociadas a la desregulación del EGFR. En las composiciones farmacéuticas de la presente invención la concentración del inhibidor, particularmente el anticuerpo esta en un rango de 10-200 mg/ml y más particularmente, esta concentración estar en el rango de 50- 50 mg/ml.

Adicionalmente, la presente invención comprende el uso de estos inhibidores del EGFR, particularmente el anticuerpo monoclonal humanizado hR3 (Nimotuzumab) en combinación con radioterapia u otros agentes terapéuticos tales como agentes quimioterapéuticos o la combinación de estos para el tratamiento de tumores malignos. Según la presente invención, la administración del inhibidor objeto de la presente invención puede ser oral, parenteral (intravenoso o intramuscular), tópico, transdérmico o por inhalación.

Es otro de los objetos de la presente invención un método para la selección de inhibidores del EGFR con actividad citostática. Dicho método se basa fundamentalmente en la medición del contenido de ADN de las células por incorporación de ioduro de propidio en células permeabilizadas y fijadas, tal como se describe en el ejemplo 6 de la presente invención. .

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Estructura del Cristal del fragmento Fab del hR3 La estructura del cristal del fragmento Fab del anticuerpo hR3 se determinó a una resolución de 2.5 A y se refino para los factores R con buena estéreo química.

En general la estructura del cristal es similar a las estructuras de otros fragmentos Fab. Sin embargo sé encontró un rasgo peculiar y es que el CDR 1 de la cadena pesada no se ajusta a ninguna de las conformaciones canónicas descritas. Por el contrario, se encontró que esta región adopta una estructura de alga hélice. Esta conformación de alfa hélice no pertenece a ninguna de las conformaciones canónicas descritas para el CDR 1 de las cadenas pesadas, en las Figuras 1A-1 C se representa la estructura del cristal de fragmento Fab donde se puede apreciar la peculiaridad en la estructura del CDR1 de cadena pesada.

Por un método semi automático se comparó la estructura del cristal del fragmento Fab del anticuerpo hR3 con las estructuras de cristales de fragmentos similares contenidos en la base de datos PDB actualizada hasta Mayo de 2007. En la base de datos se encontró que solamente otro anticuerpo humanizado por el método de trasplante de los CDR tenía este rasgo peculiar en la estructura del CDR1 de la cadena pesada.

EJEMPLO 2 Estudio de la unión del fragmento al ligando.

Mediante estudios de Biacore se determinó que los fragmentos Fab del anticuerpo hR3 se unen al dominio extracelular del EGFR con una KD de 2.0x 0"8 M, en dicho estudio se usó como control el fragmento Fab del anticuerpo comercial contra el EGFR Cetuximab para el cual se encontró que se une al dominio extracelular del receptor con un KD de 1 .9x10"9M, similar al valor reportado previamente.

Como se observa el anticuerpo hR3 tiene una afinidad menor que el Cetuximab, esto es debido fundamentalmente a que tiene una mayor on- Estas diferencias en la afinidad de ambos receptores podría explicar la diferencia de su efecto biológico, particularmente efectos adversos, cuando es usado en tratamientos sistémicos en pacientes de cáncer.

TABLA 1 Fab / 0„(1/Ms) koff (Ms) Kd (M) Nimotuzumab 5.2x104 1 .1 x10"3 2.1 x10"8 Cetuximab 3.1 x106 5.8x10"3 1 .8x10"9 Adicionalmente, se comprobó que el hR3 competía por la unión al EGFR con el anticuerpo Cetuximab. Empleando técnicas de ELISA se hicieron ensayos de inhibición con el anticuerpo Cetuximab que se sabe por la literatura que se une de manera específica y exclusiva al Dominio III del EGFR. Para esto se usaron placas recubiertas con EGFR y se mantuvo constante la concentración del fragmento Fab-hR3 biotinilado. Se usaron diluciones del fragmento Fab-Cetuximab y se observó como la señal dada por el Fab-hR3 biotinilado, al ser revelado con esreptavidina conjugada a fosfatasa, disminuía.

También se realizaron ensayos de competencia utilizando el FACS sobre células A431 , que se conoce que sobre expresan el EGFR. Aquí se hicieron diluciones de hR3/Cetuximab similares a las descritas anteriormente y se confirmó que el anticuerpo hR3 compite con el Cetuximab por la unión al receptor de EGF.

Los resultados obtenidos tanto por ELISA como por FACS indican que los epitopos reconocidos por ambos anticuerpos están muy cercanos y no es posible que ambos se unan simultáneamente al receptor. Basándose en estos resultados y conociendo del arte previo que Cetuximab se une al EGFR por el dominio III de la región extracelular del receptor, es posible asumir que el hR3 se une al EGFR por el mismo Dominio que el Cetuximab.

EJEMPLO 3 Modelo del complejo anticuerpo-receptor.

El modelo del complejo entre hR3 y el EGFR se predijo mediante cálculos "in silico". Para esto se usaron, de forma secuencial, el programa RosettaDock, para la predicción del acoplamiento de ambas proteínas y Posteriormente se usó el programa NAMD para relajar la estructura del complejo dentro de una caja de agua.

El resultado de este modelo se observa en las Figuras 1A-1 C. La figura 1A muestra una vista general del modelo con el EGFR en su conformación de baja afinidad de unión al ligando (inactiva). En la figura 1 B se observa igualmente una vista general del modelo pero en este caso el EGFR está en su conformación de alta afinidad por el ligando (activa). De esta figura se observa que según nuestro modelo hR3 es capaz de unirse al EGFR sin inhibir el cambio de conformación que este necesita para la dimerización y la posterior señalización. La figura 1 C muestra un acercamiento a las interacciones moleculares entre el hR3 y el EGFR.

En la Figura 2A se muestra como, según nuestro modelo, inhibe la unión del Cetuximab. Mientras en la Figura 2B, se muestra como el anticuerpo hR3 bloquea la unión del ligando EGF a su receptor el EGFR.

EJEMPLO 4 Modelo teórico de un fragmento Fv de un anticuerpo que se une al dominio I del EGFR El modelo se obtuvo por la misma metodología que el modelo del ejemplo 3. El anticuerpo unido permite que el receptor adopte la conformación activa donde los dominios I y II están próximos uno al otro. El EGF (Figura 3, en rojo, representado en modelo de Dreiding), en cambio, no puede colocarse en su sitio de unión debido a impedimentos esféricos causados por el anticuerpo (el solapamiento de ambas estructuras es claramente visible en la Figura 3. La estructura del EGFR en complejo con el EGF fue tomada del fichero con código 1 ivo del Protein Data Bank. El fragmento Fv de anticuerpo fue construido por modelación computacional.

EJEMPLO 5 Efecto citotóxico de los anticuerpos monoclonales anti-EGFR sobre las células tumorales A431 y H125 Las células A431 y H125 (2 x 105) se sembraron en placas de 24 pozos usando medio DMEN:F12 al 0% SFT. Doce horas después las células se tratan con los anticuerpos monoclonales Cetuximab (7-175 nM) o Nimotuzumab (70-1750 nM) en medio DMEN:F12 con 1 % de SFT y EGF humano (500 pg/ml) y se incubaron 48 horas. Este tratamiento se repitió durante otras 48 horas. La muerte celular se analizó después de 96 horas de tratamiento mediante citometría de flujo utilizando un mareaje con ioduro de propidio (10 g/ml). Las células no tratadas se incluyeron como control de mínima muerte. En las dos líneas celulares analizadas, el Cetuximab induce mayor porcentaje de células muertas a todas las concentraciones ensayadas que el anticuerpo Nimotuzumab (Figura 4). Es de resaltar que este resultado se obtiene aun cuando el Nimotuzumab es usado 10X de concentración con respecto al Cetuximab, para independizar las diferencias en efecto citotóxico de las diferencias en afinidad de ambos anticuerpos.

EJEMPLO 6 Efecto citotóxico versus citostático de los anticuerpos monoclonales anti-EGFR sobre las células tumorales A431 v H125 Las células A431 y H125 (0.25 x 106) se sembraron en placas de 6 pozos usando medio DMEN:F12 al 10% SFT. Doce horas después las células se tratan con los anticuerpos monoclonales Cetuximab o Nimotuzumab (7-1750 nM) o con el AG1478 (inhibidor tirosina cinasa del EGFR) a10 µ? en medio DMEN:F12 con 1 % de SFT y EGF humano (500 pg/ml) y se incubaron 48 horas. Este tratamiento se repitió durante otras 48 horas. Para analizar el ciclo celular y la fragmentación del ADN (marcador de apoptosis tardía) en estas líneas después de las 96 horas de tratamiento, las células se fijaron con una mezcla de metanoliacetona (4:1 ) a 4°C y se marcaron incubando con ioduro de propidio (400 µg ml)y RNAsa (100 µg/ml). Ambos análisis se realizaron en un citómetro de flujo, colectando como mínimo 20 000 eventos y los datos se procesaron usando los programas WinMDI 2.8 y ModFit3.0.

Como se puede observar en las Figuras 5A y 5B, tanto en las células A431 (Figura 5A) como en las H125 (Figura 5B) ambos anticuerpos monoclonales (Cetuximab: 175 nM, Nimotuzumab: 1750 nM) inducen un similar incremento en la fracción de las células en la fase G0-G1 con la correspondiente disminución de las células en las fases G2-M y S al compararse con las células sin tratamiento. Este efecto fue comparable al obtenido con el AG1478 usado como control positivo de detención del ciclo celular. En las tablas 1 (A431) y 2 (H125) se muestran los porcentajes de células en las diferentes fases del ciclo para un amplio rango de concentraciones de Nimotuzumab y Cetuximab que se emplearon para hacer el experimento.

Sin embargo, cuando se analiza la capacidad de estos anticuerpos de inducir apoptosis sobre estas células, se observa que aun cuando ambos son capaces de tener un semejante efecto anti-proliferativo sobre las células A431 y H125, el Cetuximab induce a todas las concentraciones empleadas un mayor porcentaje de células apoptóticas que el Nimotuzumab (Figuras 5A y 5B, Tabla 2, Tabla 3).

TABLA 2 Distribución del ciclo celular y porcentaje de células apoptoticas de la línea A431 tratada con diferentes concentraciones de Cetuximab y Nimotuzumab Fases del ciclo AG1478 Nimotuzumab (nM) celular (%) 10 µ? 70 350 700 1400 1750 79.82 56.08 58.98 60.32 64.68 70.01 G2/ 3.11 8.12 7.87 7.98 6.21 5.12 S 17.06 35.08 33.17 31.7 29.11 24.87 Células 42.75 3.62 3.94 4.07 4.65 5.50 apoptót¡cas(%) TABLA 3 Distribución del ciclo celular y porcentaje de células apoptóticas de la línea H12S tratada con diferentes concentraciones de Cetuximab v Nimotuzumab EJEMPLO 7 Actividad antitumoral en ratones atímicos xenotrasplantados Los animales utilizados para la experimentación fueron ratones atímicos NMRI (8-10 semanas) los cuales se obtuvieron de Charles River (Sulzfeld, Alemania). Los animales se mantuvieron en condiciones asépticas en un animalario aprobado en el cuidado de animales de laboratorio y acorde a las regulaciones y normas vigentes, y su uso fue aprobado por las autoridades responsables locales.

Para producir los tumores, las células se tomaron de cultivos subconfluentes por tratamiento con tripsina 0.25% y EDTA 0.05%. La trypsinisación se detuvo con medio al 10% de suero fetal de ternera. Para la inoculación solo se emplearon aquellas suspensiones celulares con una viabilidad mayor del 90%. Se inocularon 8 animales por grupo con 107 células de la línea U87MG por vía subcutánea en el flanco izquierdo y con 2x104 U87MG por vía intracraneal en el hemisferio derecho del cerebro de los ratones con la ayuda de un dispositivo estereotáctico. El peso corporal de los ratones se monitoreó durante toda la experimentación. La talla de los tumores subcutáneos se midió tres veces por semana y el volumen tumoral se determinó mediante la fórmula: 0.5 x (diámetro mayor) x (diámetro menor)2. Los índices de volumen tumoral relativos (RTV) se calcularon referidos a los volúmenes medios de cada día respecto a la primera medición (ajustado a 1). Los animales se sacrificaron cuando el peso de los tumores excedió el 10% del peso total de los animales. La talla de los tumores intracraneales también se determinó. Para ese propósito se extrajeron los cerebros completos de los animales y se congelaron en 2-metíl butano. Se realizaron cortes en criostato (10pm) y se tomaron secciones consecutivas y se tiñeron con violeta cresil. Se determinaron los diámetros mayores de los tumores y los perímetros con la ayuda de un microscopio (Zeiss Axioskop), y se calcularon los volúmenes tumorales. Los tumores subcutáneos se congelaron y se almacenaron a - 80°C para otros análisis. Los diferentes tratamientos se iniciaron tres días después de inoculados los tumores. Los animales se trataron tres veces por semana con los anticuerpos monoclonales Nimotuzumab o Cetuximab con 50 mg/kg/dosis mediante administración intraperitoneal. En los grupos que recibieron irradiación, los animales se expusieron a una dosis total de 3.0 Gy de irradiación de cuerpo completo (TBI), fraccionado en 1.0 Gy semanal durante tres semanas comenzando 72 horas después de la inoculación de los tumores. Además se trataron grupos de animales con la combinación de los anticuerpos más la radioterapia. En estos grupos los anticuerpos se administraron 6 horas antes de la terapia de radiación. En el experimento se incluyó un grupo adicional de 10 animales que recibió solución salina en lugar de anticuerpos y se tomó como control. Figura 6 muestra la sensibilización de la línea tumoral humana U87MG xenotrasplantada por vía subcutánea en ratones NMRI atímicos por anticuerpos monoclonales anti-EGFR. Los anticuerpos se administraron por vía intraperitoneal a 50 mg/kg/dosis tres veces por semana durante tres semanas. Los animales tratados con radioterapia recibieron una dosis total de 3 Gy fraccionada en 1 Gy seminal durante tres semanas. En la figura se muestran las administraciones de los anticuerpos en flechas negras continuas y la radiación en flechas fraccionadas. Los volúmenes tumorales se determinaron en los tiempos indicados. La adición de los anticuerpos a la radioterapia retardó significativamente (p<0.05) el crecimiento de los tumores en los ratones respecto a los grupos de animales tratados con radioterapia o no tratados. La adición del Nimotuzumab a la radioterapia también retardó significativamente el crecimiento de los tumores respecto al grupo tratado con el anticuerpo solamente. Prueba estadística de Mann-Whitney; los símbolos indican diferencias estadísticas respecto a (*) PBS, (+) anticuerpo solo, (°) radioterapia.

Figura 7 muestra la sensibilización de la línea tumoral humana U87MG xenotrasplantada ortoépicamente en ratones NMRI atímicos a la radioterapia por anticuerpos monoclonales anti-EGFR. Todos los tratamientos comenzaron tres días después de la inoculación de los tumores con Nimotuzumab, Cetuximab, radioterapia, Nimotuzumab más radioterapia, Cetuximab más radioterapia o PBS. Los anticuerpos se administraron por vía intraperitoneal a 50 mg/kg/dosis tres veces por semana durante tres semanas. Los animales tratados con radioterapia recibieron una dosis total de 3 Gy fraccionada en 1 Gy seminal durante tres semanas. Las secciones de cerebro analizadas en los grupos que recibieron los anticuerpos más la radioterapia mostraron una reducción significativa (p<0.05) en el tamaño de los tumores. La adición del Nimotuzumab a la radioterapia disminuyó significativamente (p<0.05) el tamaño de los tumores respecto a la radioterapia sola. Prueba estadística de Mann-Whitney; los símbolos indican diferencias significativas respecto a: (*) PBS, (+) radioterapia.

Angiogénesis (CD31/PECAM-1 ) Las muestras de tumores se descongelaron a temperatura ambiente durante 10 minutos y se fijaron en para-formaldehido 3.7% durante 15 minutos. Seguidamente se bloqueó la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno 0.03% (DAKO Corporation, Carpintería, CA) durante 15 minutos y se incubaron con el anticuerpo primario anti CD31/PECAM-1 a temperatura ambiente por 2 horas a una dilución de 1 :100 en medio diluente de anticuerpo (DAKO Corporation, Carpintería, CA). Después de lavar, se incubó con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado a peroxidasa a temperatura ambiente durante 30 minutos para detectar la reacción antígeno-anticuerpo. Finalmente se visualizaron las secciones con el cromógeno DAB (DAKO Corporation, Carpintería, CA), se montaron las láminas y se analizó la tinción con CD31. Las secciones tumorales representativas se visualizaron en un microscopio de luz (Zeiss, Axíoskop) con una magnificación ocular de X40. Se estimó el área de los micro-vasos sanguíneos endoteliales presentes en los tumores de 5 campos microscópicos en cada tumor, y se promedio el valor medio en cada caso. El área total de los vasos evaluados se calculó empleando el programa Axio Vision 4.5 (Zeiss). El tratamiento con Nímotuzumab estuvo asociado a una significativa reducción (p<0.01) en el área de los vasos de los animales tratados (Figura 8).

CD133 Para la determinación de la expresión de CD133 las muestras tumorales se fijaron en acetona durante 15 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente se bloqueó la peroxidasa endógena sumergiendo las muestras en peróxido de hidrógeno 0.03% (DAKO Corporation, Carpintería CA) durante 30 minutos y se bloquearon las uniones inespecíficas con suero fetal de ternera al 20% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de esto se incubaron las muestras con el anticuerpo primario anti-CD133/1 AC133 (Miltenyi Biotec) durante 1 hora a temperatura ambiente a una dilución de trabajo de 1 :10 en diluente de anticuerpo. Posteriormente se lavaron las muestras y se incubaron con estreptavidina conjugada a peroxidasa durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente se visualizaron las secciones con el cromógeno DAB (DAKO Corporation, Carpintería, CA), se montaron las láminas y se analizó la tinción con CD133. Las secciones tumorales representativas se visualizaron en un microscopio de luz (Olympus, Japan) con una magnificación ocular de X40. El porciento de células positivas al CD 33 se determinó promediando el número de células positivas al marcador para cada grupo analizado en las secciones correspondientes a los 5 campos donde se observó la mayor tinción. Figura 9 muestra el análisis inmunohistoquímico de la expresión del CD31 en los tumores humanos de U87MG xenotrasplantados en ratones NMRI atímicos tratados. El tratamiento con Nimotuzumab estuvo asociado a una significativa reducción (p<0.05) en el porciento de células CD133 positivas respecto a los animales tratados con radioterapia. La adición del Nimotuzumab a la radioterapia disminuyó significativamente (p<0.05) el porciento de células CD133 positivas respecto a los animales tratados con radioterapia y respecto a los animales no tratados. Prueba estadística de Mann-Whitney; los símbolos indican diferencias significativas respecto a: (*) PBS, (+) radioterapia.

Análisis Estadístico Las medias, desviaciones estándar, y el error estándar de la media se calcularon utilizando el programa GraphPAD versión 4.0 (GraphPAD, San Diego, C.A.). El análisis estadístico se realizó con el mismo programa GraphPAD InStat. La significación estadística entre grupos se comparó utilizando la prueba de Mann-Whitney, y la prueba de comparación Múltiple de Dunn. Las diferencias se consideraron significativas si p<0.05.

EJEMPLO 8 Efecto antitumoral de la combinación del Anticuerpo monoclonal hR3 (Nimotuzumab) y Carboplatino a bajas dosis Los animales utilizados para la experimentación fueron ratones atímicos NMRI (8-10 semanas) retados por vía subcutánea con un tumor de origen humano clasificado como NSCLC. El día 0 del experimento los animales fueron inoculados con fragmentos del tumor. Cuando los tumores fueron palpables (entro los 10 y 12 días post-inoculación del tumor) los animales fueron tratados con 50 mg/Kg del anticuerpo monoclonal hR3 tres veces por semana y/o una dosis semanal de Carboplatino a 50 mg/Kg durante 6 semanas por vía intraperitoneal. Se usó PBS como control del experimento. El diámetro tumoral mayor y menor de los tumores fueron medidos 2 veces por semana y el volumen tumoral calculado por la siguiente fórmula: VT= (diámetro menor)2 x diámetro mayor / 0.52. El Volumen Tumoral Relativo fue calculado de la siguiente manera: VT x 1 / VTdiao. En la gráfica se representa el volumen tumoral relativo con el error estándar de la media. Figura 10.

Claims (6)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo monoclonal anti-EGFR o fragmentos del mismo que inhibe la unión del ligando natural, mientras que permite la fosforilación basal en donde el anticuerpo o fragmentos del mismo reconocen los dominios I o III del dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento epidérmico.

2.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el lazo CDRH3 tiene a lo sumo I residuos de amino ácidos.

3. - El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el CDRH1 contiene una alfa-hélice corta.

4. - El uso de un anticuerpo monoclonal como el que se reclama en la reivindicación 1 , para preparar un medicamento que tiene una actividad citostática sobre las células que expresan el EGFR.

5. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 4 en donde dicho medicamento es para la prevención del crecimiento de tumores que expresan EGFR.

6. - Un método in vitro para seleccionar anticuerpos o fragmentos de los mismos útiles para la prevención del crecimiento de tumores que expresan EGFR, en donde el método consiste en la selección de los anticuerpos o fragmentos de los mismos que reconocen el EGFR, que inhiben la unión del ligando natural y que permiten la viabilidad celular.