WO2009143816A1 - Verfahren zur isolierung von zellen und krankheitserregern aus körperflüssigkeiten - Google Patents

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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system

Definitions

  • the invention relates to the production of separation systems for cells and / or pathogens based on subunits from circulating immune complexes (CIC).
  • CIC circulating immune complexes
  • CIC The functional basis for the immune response is based on the finely tuned interaction of local and systemically effective cellular and humoral components of innate and acquired immunity.
  • CIC are the product of actions taken and reactions between these components, e.g. Antibodies and antigens, receptors and associated ligands, complement factors, albumin and other plasma constituents.
  • Antibodies and antigens, receptors and associated ligands, complement factors, albumin and other plasma constituents e.g. Antibodies and antigens, receptors and associated ligands, complement factors, albumin and other plasma constituents.
  • particulate agglomerates form, which are taken up and degraded by phagocytes.
  • immunopathological events they are jointly responsible for the emergence and maintenance of a variety of acute and chronic inflammatory diseases.
  • CICs are the final morphological product and thus a mirror image of ongoing or expired processes of immune regulation. This applies to the physiological, life-sustaining immune response as well as immunopathological processes that can lead to disease and death. In every individual, CICs can be detected in the blood. Excessive values are e.g. associated with rheumatoid arthritis.
  • the subunits can be recovered gently. They retain their function of binding the respective reaction partner.
  • the subunits can be up be coupled to a fixed matrix. This process is described in DE 19538641. It allows the removal of CIC and its subunits from the blood from the individuals from whom the CIC were obtained in the sense of affinity chromatography. In animal experiments with rats of the inbred strain BB / OK, an influence on immunoregulation by plasmapheresis could be demonstrated. BB / OK rats develop auto-aggressive ß-cell destruction similar to that of human juvenile diabetes (type 1 diabetes). CIC derived from plasmas were dissociated and covalently coupled to Sepharose.
  • Antibodies Both the efficient defense of infectious agents and toxic substances and the homeostasis of healthy endogenous cells involve a number of immunocompetent cells and signaling systems. Antibodies, receptors and soluble mediators play an essential role in this complicated process. Antibodies are specifically directed against foreign and self-antigens and contribute to their elimination via various mechanisms (e.g., complement activation). The balance and proper function of the immune system depends on a number of factors.
  • Autoimmunity is characterized by the loss of tolerance to the body's own tissue. Multiple endogenous and exogenous factors are involved in the dysregulation of the immune system. Many mechanisms involved in the pathogenesis of autoimmune diseases are discussed. Cross-reacting antibodies or an antigen-driven specific immune response are two of the many possibilities. The inadequate control of the potentially autoreactive cells and the presentation of autoantigens eventually lead to the formation of autoreactive cells and the production of pathogenic antibodies, resulting in considerable damage and often life-threatening consequences. Autoantibody-mediated disorders form a broad spectrum ranging from the functional impairment of a receptor to destructive systemic disease.
  • the result of the dysregulation is also a significant increase in IgG anti-IgE autoantibodies correlated with the serum IgE level, which can be detected in circulating immune complexes (thus, up to 32% of total serum IgE in patients with atopic dermatitis in the form of IgG anti-IgE immune complexes).
  • IgG anti-IgE immune complexes there is no correlation between the concentration of IgG anti-IgE immune complexes and the severity of the disease, due to the known heterogeneity of the autoantibodies in their ability to induce histamine release from basophils.
  • IgG anti-IgE might be due to the high affinity of C1q IgGI and the Fc gamma receptor have an IgE-allergen complex eliminating function.
  • the extracorporeal removal could be a further, at least in certain patients promising method of therapy.
  • Specific antibodies are formed against the tumor proteins called neoantigens.
  • neoantigens There are specific binding ligands.
  • Antibodies such as ligands lead to the complexation of neoantigens.
  • the immunological reaction is suppressed inter alia by the following mechanisms:
  • immunosuppressive factors such as soluble tumor necrosis factor
  • sTNFRs 5 receptor
  • CEA neoantigens
  • Neoplasms the blood concentration of neoantigen immunocomplex has prognostic significance.
  • the condensation products of tumor action and body counteraction circulate as CIC's in the blood.
  • virus immune complexes are taken up by phagocytes and reduced.
  • viruses such as Dengue virus
  • Neutralized herpesvirus IgG immune complexes induce the same IL6 release in macrophages as free viral DNA.
  • a correlation was detected between the cerebellar immune complexes and the rheumatoid Artrithis (MAY et al., Rheumatology. 1994; 33: 27-31).
  • Virus immune complexes play a pathogenic role in virus-induced immune complex diseases (eg, glomerulonephritis, Appel, GB, et al., NEJM, Feb. 18, 1993). Almost all patients suffering from chronic hepatitis C infection carry immune complex-bound HCV (MORITA T. et al., Hepato-gastroenterology, 1996, 43, 582-585), which can lead to permanent reinfection. A therapeutic influence of, usually chronic, viral infections with extracorporeal blood treatment procedures must therefore always remove the virus bound in the immune complex.
  • the object of the invention is to provide a method, an arrangement and its use, on the basis of which, with different separation methods, cells, including pathogens, can be isolated or examined from body fluids. It is necessary in the first step to recognize the target cells.
  • CIC CIC
  • They are not just the final product intended for degradation in the biological reaction chain.
  • CICs are also key to isolating cells from the blood of individuals related to the current status of cellular immune regulation.
  • CIC subunits have been shown to bind to the surface of cells.
  • the CIC are prepared by known methods, e.g. Precipitation method or obtained by means of protein A - Adsorbem from the plasma of individuals. After such isolation, the CICs are broken down into their biologically active constituents. This is preferably done by lowering the pH to ⁇ 3.0.
  • the subunits can be prepared by known methods, e.g. Gel chromatography, separately and individually and mixed as a mixture of corresponding support materials, preferably microparticles, are suitable as solid support all available solid materials, in particular polystyrene or more preferably sepharose. With the aid of these "scavenger particles", cells can be separated from blood and other body fluids using different separation techniques In a second step, the cells can be characterized, cultured in vitro, subpopulated, manipulated, and used for further diagnostic or therapeutic purposes.
  • Cell depletion by means of a continuous or discontinuous extracorporeal method for therapeutic use can also be carried out using the method according to the invention.
  • Such systems are also reactivated by known methods and possible for multiple use.
  • Figure 1 Total fraction of dissociated CIC coupled to particles and incubated with Mono Nuclear Cells (MNC) from donor JM to Ficoll gradient.
  • MNC Mono Nuclear Cells
  • Figure 2 Total fraction of dissociated CIC coupled to particles and incubated with whole blood from donor JM.
  • FIG. 3 30-100kDa fraction of dissociated CIC coupled to particles and incubated with Mono Nuclear CeIIs (MNC) from donor JM to Ficoll gradient
  • Figure 4 30-100kDa fraction of dissociated CIC coupled to particles and incubated with whole blood from donor JM.

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Abstract

Die Erfindung hat die Aufgabe, ein Verfahren, eine Anordnung und ihre Verwendung bereitzustellen, auf deren Grundlage mit unterschiedlichen Trennverfahren Zellen, einschließlich Krankheitserreger aus Körperflüssigkeiten isoliert oder untersucht werden können. Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Isolierung von somatischen Zellen, Mikroorganismen und/oder Viren aus Körperflüssigkeiten von Individuen, umfassend die Schritte: (f) Isolierung von Immunkomplexen aus der Körperflüssigkeit eines Individuums, (g) Aufspaltung der isolierten Immunkomplexe in ihre Untereinheiten, (h) Anbindung der dissoziierten Untereinheiten an einen festen Träger, (i) Inkubation des modifizierten Trägers aus (c) mit Zellen oder Körperflüssigkeit des Individuums aus (a), (j) Isolierung des inkubierten Trägers aus (d) mit den an die Untereinheiten angebundenen Zellen, Mikroorganismen und/oder Viren sowie eine insbesondere für die patientenspezifische Diagnostik und Therapie geeignete Anordnung umfassend - einen Träger, vorzugsweise Mikropartikel, - an den Träger angebundene Untereinheiten aus Immunkomplexen, vorzugsweise aus CIC, eines Individuums, - an die Untereinheiten angebundene Zellen, Mikroorganismen und/oder Viren, vorzugsweise MNCs, aus demselben Individuum, und deren Verwendung gelöst.

Description

Verfahren zur Isolierung von Zellen und Krankheitserregern aus Körperflüssigkeiten
Die Erfindung betrifft die Herstellung von Separationssystemen für Zellen und/oder Krankheitserregern auf der Grundlage von Untereinheiten aus zirkulierenden Immunkomplexen (CIC).
Wissensstand
Die funktionelle Grundlage für die Immunreaktion beruht auf dem fein abgestimmten Zusammenwirken von lokalen und systemisch wirksamen zellulären und humoralen Komponenten der angeborenen und erworbenen Immunität. CIC sind das Produkt stattgefundener Aktionen und Reaktionen zwischen diesen Komponenten, wie z.B. Antikörpern und Antigenen, Rezeptoren und dazugehörigen Liganden, Komplementfaktoren, Albumin und anderen Plasmabestandteilen. Im Ergebnis formen sich partikuläre Agglomerate, die von Phagozyten aufgenommen und abgebaut werden. Im immunpathologischen Geschehen sind sie mitverantwortlich für das Entstehen und die Aufrechterhaltung einer Vielzahl von akuten und chronischen, mit Entzündung einhergehenden Erkrankungen.
CIC sind das morphologische Endprodukt und damit Spiegelbild stattfindender oder abgelaufener Prozesse der Immunregulation. Das trifft für die physiologische, lebenserhaltende Immunantwort ebenso zu, wie für immunpathologische Vorgänge, die zu Krankheit und Tod führen können. In jedem Individuum können CIC im Blut nachgewiesen werden. Überhöhte Werte werden z.B. in Zusammenhang gebracht mit Rheumatoider Arthritis.
Die Analytik der Zusammensetzung der CIC durch Aufspaltung und Bestimmung derer Untereinheiten wäre eine Momentaufnahme der immunregulatorischen Vorgänge in einem Individuum.
Die Untereinheiten können schonend gewonnen werden. Sie bewahren dabei ihre Funktion, den jeweiligen Reaktionspartner zu binden. Die Untereinheiten können auf eine feste Matrix gekoppelt werden. Dieses Verfahren ist in DE 19538641 beschrieben. Es ermöglicht im Sinne einer Affinitätschromatographie die Entfernung von CIC und deren Untereinheiten aus dem Blut von den Individuen, von dem die CIC gewonnen wurden. Im Tierexperiment mit Ratten des Inzuchtstammes BB/OK konnte eine Beeinflussung der Immunregulation durch Plasmapherese nachgewiesen werden. BB/OK-Ratten entwickeln einen auto-agressive ß-Zellzerstörung ähnlich der des humanen juvenilen Diabetes (Diabetes Typ 1). Die aus Sammelplasmen gewonnene CIC wurden dissoziiert und kovalent an Sepharose gekoppelt. Es gelang durch eine extra-korporale und temporäre Behandlung von Ratten im prädiabetischen Zustand mit nachweisbarer Insulitis (Voraussetzung für eine Diagnostik im humanen System) der Prozess der ß-Zellzerstörung aufzuhalten (Berg, S. et al. Diab. Stoffwechsel 11 (2002) Suppl. 1. S. 55).
Pathogenetische Grundlagen, Autoimmunität, Allergien und Tumore
Sowohl an der effizienten Abwehr infektiöser Agenzien und toxischer Substanzen als auch an der Homeostase der gesunden körpereigenen Zellen sind eine Reihe von immunkompetenten Zellen und Signalsystemen beteiligt. Antikörper, Rezeptoren und lösliche Mediatoren spielen in diesem komplizierten Prozess eine wesentliche Rolle. Antikörper sind spezifisch gegen Fremd- und Selbstantigene gerichtet und tragen über verschiedene Mechanismen (z.B. Komplementaktivierung) zu deren Eliminierung bei. Die Balance und korrekte Funktion des Immunsystems hängt dabei von einer Reihe von Faktoren ab.
Autoimmunität ist durch den Verlust der Toleranz gegen körpereigenes Gewebe charakterisiert. Multiple endogene und exogene Faktoren sind an der Dysregulation des Immunsystems beteiligt. Viele Mechanismen, die in die Pathogenese der Autoimmunkrankheiten involviert sind, werden diskutiert. Kreuzreagierende Antikörper oder eine antigengetriebene spezifische Immunantwort sind zwei der vielen Möglichkeiten. Die inadäquate Kontrolle der potenziell autoreaktiven Zellen und die Präsentation von Autoantigenen führen schließlich zur Formation autoreaktiver Zellen und zur Produktion pathogener Antikörper mit der Folge einer erheblichen Schädigung und nicht selten lebensbedrohenden Konsequenzen. Autoantikörper vermittelte Störungen bilden ein breites Spektrum, das von der funktionellen Beeinträchtigung eines Rezeptors bis zur destruktiven systemischen Erkrankung reicht.
Das klinische Bild hängt von der Spezifität der Autoimmunreaktion ab. Organspezifische Erkrankungen wie Morbus Basedow bilden die eine Seite des Spektrums. Auf der anderen Seite findet man die systemischen Autoimmunerkrankungen, denen auch die rheumatischen Erkrankungen (z. B. Rheumatoide Arthritis) zugeordnet werden. Hierbei sind sowohl Läsionen als auch Antikörper nicht auf nur ein Organ beschränkt. Des weiteren werden Misch- und Übergangsformen beschrieben, wie z.B. Myasthenia gravis.
In der Konsequenz ist die Entfernung der pathogenetisch bedeutsamen Autoantikörper bzw. der CIC, die Autoantikörper enthalten, notwendig, um die pathologischen Prozesse günstig zu beeinflussen und die assoziierten Symptome zu kontrollieren.
Allergien entstehen ebenfalls auf der Basis einer Fehlsteuerung des Immunsystems.
Der Erstkontakt mit bestimmten Antigenen (Allergenen) induziert bei genetisch prädisponierten Personen eine Fehlsteuerung im Gleichgewicht zwischen Ig-
Subklassen, IgE-Rezeptorverteilung, TH1 :TH2-Verhältnis (und damit Cytokinsynthese) und IgE-Synthese. Ergebnis dieser Fehlsteuerung sind die bekannten akuten bzw. chronischen Symptome nach wiederholtem Allergenkontakt.
Das Ergebnis der Dysregulation ist neben der erhöhten IgE- und IgE-Rezeptorsynthese ebenfalls eine signifikante, mit dem Serum-lgE-Spiegel korrelierende Erhöhung von IgG- anti-lgE-Autoantikörpern, die sich in zirkulierenden Immunkomplexen nachweisen lassen (so konnten bis zu 32% des Gesamt-Serum-lgE bei Patienten mit atopischer Dermatitis in Form von IgG-anti-lgE-lmmunkomplexen nachgewiesen werden). Es besteht jedoch keine Korrelation zwischen der Konzentration von IgG-anti-lgE- Immunkomplexen und der Schwere der Erkrankung, begründet in der bekannten Heterogenität der Autoantikörper in ihrer Fähigkeit, die Histaminfreisetzung aus Basophilen zu induzieren.
Autoantikörper spielen zweifellos eine immunmodulatorische Rolle, die nicht näher bekannt ist. Darüber hinaus könnten IgG-anti-lgE durch die hohe Affinität von C1q zu IgGI und dem Fc gamma-Rezeptor eine IgE-Allergen-Komplex eliminierende Funktion haben.
Bisherige Ansatzpunkte einer (mehr oder minder) kausalen Therapie bestehen in der Inaktivierung von freien IgE, mit Ausnahme des Einsatzes von Nedocromil, das wahrscheinlich während der B-Zellreifung den Subklassen-Switch zum IgE unterbindet. Neben der Applikation hoher Dosen von Spender-IgG, was in Einzelfällen überzeugende Resultate erbringt, hat die Anwendung eines rekombinanten humanisierten monoklonalen Antikörpers (rhuMAb-E25, eine gemeinsame Entwicklung der Firmen Genentech, Novatis Pharma und Tanox Biosystems) den weitesten Weg bis zur Zulassung zurückgelegt. Dieser Antikörper bindet an der Fc-Rezeptorbindungs- Region des freien IgE und verhindert deren Andocken an die unterschiedlichen IgE- Rezeptoren. Das ermöglicht es, erfolgreich die Konzentration freien IgE um mehr als 95 % zu senken. Die Eliminierung des Mab-lgE-Komplexes geschieht über den oben beschriebenen Weg des IgG-FcR-Bindung.
Ein Nachteil der Anwendung dieses Antikörpers wird das Kostenproblem sein, was insbesondere bei Patienten zu Buche schlägt, deren IgE-Spiegel stark erhöht ist.
Neben der Inaktivierung freien IgE's durch Antikörper könnte die extrakorporale Entfernung eine weitere, zumindest bei bestimmten Patienten erfolgversprechende Therapiemethode sein.
Versuche dazu wurden in der ehemaligen Sowjetunion und Japan mit Immunadsorbern durchgeführt, die als Liganden spezifische anti-lgE-Antikörper kovalent gebunden hatten. Es wurden keine Nebenwirkungen beobachtet. Die Konzentration freien IgE wurde um 83-98 % gesenkt und über einen Beobachtungszeitraum von 6 Monaten konnte ein therapeutischer Effekt nachgewiesen werden. Differenzierte Behandlungsprotokolle sind leider nicht zugänglich.
Tumore entgehen der immunologischen Abwehr durch das Freisetzen verschiedener Faktoren, die eine Immuntoleranz induzieren, in deren Folge der unbegrenzt wachsende Tumor von der Körperabwehr wie ein „Embryo" betrachtet wird. Gegen die als Neoantigene bezeichneten Tumorproteine werden spezifische Antikörper gebildet bzw. sind spezifisch bindende Liganden vorhanden. Antikörper wie Liganden führen zur Komplexierung der Neoantigene. Die immunologische Reaktion wird u. a. unterdrückt durch folgende Mechanismen:
• Freisetzung immunsuppressiver Faktoren (wie löslicher Tumornekrosefaktor-
5 Rezeptor (sTNFRs) und Neoantigene wie CEA, MUC1 , CA15-3 u.a.). Bei einigen
Neubildungen hat die Blutkonzentration von Neoantigen-lmmunkomplexen prognostische Bedeutung.
• Beeinflussung regulativer T-Zellen (TGFß- Anstieg führt zur Abfall zytotoxischer T-Zellen)
I O • Erhöhung der ILT3- und ILT4- Expression auf dentritischen Zellen induziert
Immuntoleranz
• Antigenmodulation
• Cytophile Antikörper maskieren Tumor-Antigene
] 5 Der Verlust der Gewebeintegration im Ergebnis einer erhöhten Expression von NFATtumorceiis (nuclear factor of activated T cells) und α-6-ß-4-lntegrin; die Unterdrückung der Apoptose (TOR - Sir3 - hsp; Reaper - DIAP; Dbc2 Protein - apoptosis; - ) und/oder erhöhte Zellteilung (HER-network - EGFR; ras - IL24/IL24Receptor) und Vaskularisierunq solider Tumore (CUGBP2 - COX2 -
20 Prostaglandine) generieren dem wachsenden Tumor zusätzliche Vermehrungsvorteile.
Die Kondensationsprodukte von Tumor-Aktion und Körper-Gegenaktion zirkulieren als CIC im Blut.
Seit mehr als 20 Jahren werden Plasmaaustausch und Protein-A-Immunadsorption als therapeutische Maßnahme in der Tumorbehandlung erprobt. Ein temporärer, positiver 5 Effekt war in bestimmten Fällen nachweisbar.
Virusinfektionen
Die Interaktion von Virus und Antikörper führt normalerweise zur Neutralisierung des Virus. Diese Virusimmunkomplexe werden von Phagozyten aufgenommen und abgebaut. Von einigen Viren, wie z.B. Dengue Virus, ist jedoch bekannt, dass in Immunkomplex gebundenes Virus sogar eine höhere Infektiosität habe kann als das freie. Neutralisierte Herpesvirus-lgG-lmmunkomlexe induzieren die gleiche IL6- Freisetzung in Makrophagen, wie freie Virus-DNA. In Hunden wurde eine Korrelation nachgewiesen zwischen Staupevirus-Immunkomplexen und rheumatoider Artrithis (MAY et al. Rheumatology.1994; 33: 27-31). Virus-Immunkomplexe spielen eine pathogetische Rolle für die virusinduzierten Immunkomplex-Krankheiten (z.B. Glomerulonephritis, Appel, G. B.etz al. NEJM, 18 Feb, 1993). Fast alle Patienten, die an einer chronischen Hepatitis C Infektion leiden, tragen Immunkomplex gebundenes HCV (MORITA T. et al., Hepato-gastroenterology, 1996, 43, 582-585), was zur ständigen Reinfektion führen kann. Eine therapeutische Beeinflussung von, meist chronischen Virusinfektionen mit extra-korporalen Blutbehandlungsverfahren muss also auch immer das im Immunkomplex gebundene Virus entfernen.
Aufgabenstellung
Während die Analytik einzelner Faktoren und deren Rolle in der physiologischen und pathologischen Immunreaktion Dank molekularbiologische Untersuchungsmethoden einen raschen Erkenntnisgewinn generieren, ist die Untersuchung regulatorischer Zusammenhänge auf zellulärer Ebene noch immer methodisch anspruchsvoll.
Die Erfindung hat das Ziel ein Verfahren, eine Anordnung und ihre Verwendung bereitzustellen, auf deren Grundlage mit unterschiedlichen Trennverfahren Zellen, einschließlich Krankheitserreger aus Körperflüssigkeiten isoliert oder untersucht werden können. Dabei ist es im ersten Schritt notwendig die Zielzellen zu erkennen.
Grundlage der Erfindung sind CIC. Sie sind nicht nur das zum Abbau vorgesehene Endprodukt in der biologischen Reaktionskette. CIC sind auch Schlüssel für die Isolierung von Zellen aus dem Blut von Individuen, die in Beziehung stehen zum aktuellen Status zellulärer Immunregulation. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass Untereinheiten aus CIC auf der Oberfläche von Zellen binden.
Die Aufgabenstellung wird gemäß der Ansprüche 1 -20 gelöst. Beschreibung der Erfindung
Die CIC werden mit bekannten Verfahren, z.B. Fällungsverfahren oder mittels Protein A - Adsorbem aus dem Plasma von Individuen gewonnen. Nach solcher Isolierung werden die CIC in ihre biologisch aktiven Bestandteile zerlegt. Das geschieht vorzugsweise durch Absenken des pH auf <3,0. Jetzt können die Untereinheiten durch bekannte Verfahren, z.B. Gel-Chromatographie, getrennt und einzeln und einzeln oder als Gemisch an entsprechende Trägermaterialien, vorzugsweise Mikropartikel, gekoppelt werden, wobei als feste Träger alle verfügbaren festen Materialen geeignet sind, insbesondere Polystyrol oder besonders bevorzugt Sepharose. Mit Hilfe dieser „Fängerpartikel" können aus Blut und anderen Körperflüssigkeiten unter Verwendung unterschiedlicher Trennverfahren Zellen separiert werden. In einem zweiten Schritt können die Zellen charakterisiert, in vitro kultiviert, in Subpopulationen aufgetrennt, manipuliert, und für weitere diagnostische oder therapeutische Zwecke angewendet werden.
Auch eine Zellabreicherung mittels eines kontinuierlichen oder diskontinuierlichen extrakorporalen Verfahren zur therapeutischen Anwendung kann mit der erfindungsgemäßen Methode durchgeführt werden. Solche Systeme sind durch bekannte Verfahren auch reaktivierbar und zum vielfachen Gebrauch möglich.
Die Erfindung wird mit folgenden Beispielen näher beschrieben:
Beispiel 1 :
Gewinnung von antikoagulierten Blut von Spender JM mittels üblichen Entnahmesystems. 4 ml Vollblut zentrifugieren (10 min 600xg), 2 ml Plasma abnehmen und mit 2 ml 0,1 M Borat-Puffer versetzen. 4 ml 7% PEG in Borat-Puffer zugeben und für 30 sec vortexen. Fällungsreaktion über Nacht im Kühlschrank.
Fällung 30 min 4°C 1600xg zentrifugieren, Überstand abnehmen und verwerfen und das Sediment mit 10 ml 3,5 % PEG in Borat-Puffer waschen. 2x 1 min vortexen und 30 min 4°C 1600xg zentrifugieren. Überstand abnehmen und verwerfen, Sediment in 1 ml PBS pH 7.4 aufnehmen und Lösung homogenisieren.
pH des CIC-Gemisch mit HCl auf pH 3,0 absenken.
5 Proteinkopplung:
Polystyrolpartikel mit NHS und EDC in MES Puffer aktivieren, aktivierte Partikel mit MES pH 3,0 waschen und in MES-Puffer pH 3,0 aufnehmen, Proteinlösung dazugeben, Lösung bewegen, dabei binden die Proteine an die PS-Partikel. Abstoppen freier Bindungsstellen durch Glycin oder Ethanolamine. Waschen der PS-Partikel mit PBS und I O Aufnehmen in PBS.
Inkubation der Partikel mit Zellen:
a) Mono Nuclear CeIIs (MNC) von Spender JM nach Ficollgradient
3 Mio. MNC in 300 μl PBS/BSA Puffer pH 7,4 aufnehmen und mit 20.000 mit CIC 5 gekoppelte Partikel in ein Reaktionsröhrchen geben. Auf einem Kipprollmischer für 45 min bei Raumtemperatur inkubieren. Danach Lösung im Reaktionsröhrchen mit 3 ml PBS-BSA Puffer auffüllen. Partikel über Sieb isolieren und mit 5 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 waschen und mit 1 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 Partikel in eine Multiwellplatte zurückspülen 0 b) Vollblut:
2 ml Vollblut 350xg 10 min zentrifugieren und Plasma abnehmen und verwerfen. Blutpellet mit 1 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 mischen und 350xg 10 min zentrifugieren. Schritte 2-3 4 mal wiederholen, Überstand abnehmen und aufkonzentriertes Vollblut aufwirbeln. 1 ml gewaschenes Vollblut und 20.000 mit CIC gekoppelte Partikel in das 5 Probenröhrchen geben und auf Kipprollmischer 45 min bei RT inkubieren. Lösung im Mischcontainer mit 3 ml PBS7BSA Puffer auffüllen und Partikel über Sieb isolieren und mit 10 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 waschen. Mit 1 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 Partikel in eine Multiwellplatte zurückspülen
Calcein AM und Propidiumjodid zugeben und am Fluoreszenzmikroskope auswerten.
Beispiel 2:
4 ml Vollblut zentrifugieren (10 min 600xg), 2 ml Plasma abnehmen und mit 2 ml 0,1 M Borat-Puffer versetzen. 4 ml 7% PEG in Borat-Puffer zugeben und für 30 sec vortexen. Fällungsreaktion über Nacht im Kühlschrank.
Fällung 30 min 40C 1600xg zentrifugieren, Überstand abnehmen und verwerfen und das Sediment mit 10 ml 3,5 % PEG in Borat-Puffer waschen. 2x 1 min vortexen und 30 min 4°C 1600xg zentrifugieren.
Überstand abnehmen und verwerfen, Sediment in 1 ml PBS pH 7.4 aufnehmen und Lösung homogenisieren.
pH des CIC-Gemisch mit HCl auf pH 3,0 absenken.
Abtrennung einer 3OkDa - 100kDa-Fraktion:
Zur Proteinlösung in Amicon Ultra 100K mit 4 ml PBS pH 2,7 geben, 20 min 4000xg 4°C zentrifugiert. Durchfluss wird in ein Amicon Ultra 3OK Röhrchen überführt zentrifugiert 30 min bei 4000xg 40C. Schritt 17 und 18 wiederholen und Proteinlösung in Amicon Ultra 3OK 2x waschen mit 4 ml PBS pH 3,0. Fraktionen 3OkDa-IOOkDa vereinen und Proteingehalt bestimmen. Proteinkopplung:
Polystyrolpartikel mit NHS und EDC in MES Puffer aktivieren, aktivierte Partikel mit MES pH 3,0 waschen und in MES-Puffer pH 3,0 aufnehmen, Proteinlösung dazugeben, Lösung bewegen, dabei binden die Proteine an die PS-Partikel. Abstoppen freier Bindungsstellen durch Glycin oder Ethanolamine. Waschen der PS-Partikel mit PBS und Aufnehmen in PBS.
Inkubation der Partikel mit Zellen:
a) Mono Nuclear CeIIs (MNC) von Spender HW nach Ficollgradient
3 Mio. MNC in 300 μl PBS/BSA Puffer pH 7,4 aufnehmen und mit 20.000 mit CIC gekoppelte Partikel in ein Reaktionsröhrchen geben. Auf einem Kipprollmischer für 45 min bei Raumtemperatur inkubieren. Danach Lösung im Reaktionsröhrchen mit 3 ml PBS-BSA Puffer auffüllen. Partikel über Sieb isolieren und mit 5 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 waschen und mit 1 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 Partikel in eine Multiwellplatte zurückspülen
b) Vollblut:
2 ml Vollblut 350xg 10 min zentrifugieren und Plasma abnehmen und verwerfen. Blutpellet mit 1 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 mischen und 350xg 10 min zentrifugieren. Schritte 2-3 4 mal wiederholen, Überstand abnehmen und aufkonzentriertes Vollblut aufwirbeln. 1 ml gewaschenes Vollblut und 20.000 mit CIC gekoppelte Partikel in das Probenröhrchen geben und auf Kipprollmischer 45 min bei RT inkubieren. Lösung im Mischcontainer mit 3 ml PBS7BSA Puffer auffüllen und Partikel über Sieb isolieren und mit 10 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 waschen. Mit 1 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 Partikel in eine Multiwellplatte zurückspülen
Calcein AM und Propidiumjodid zugeben und am Fluoreszenzmikroskope auswerten. In den Abbildungen 1-4 ist ersichtlich, das sowohl mit der gesamt CIC-Proteinfarktion, wie auch mit der 30-100kDa-Fraktion, MNC des gleichen Spenders isoliert werden können. Zumindest ein Teil dieser spezifischen Zellen werden nicht durch Antikörper gebunden, sondern von Proteinen mit einer relativen Molmasse zwischen 30 und 10OkDa.
Legende zu den Abbildungen
Abbildung 1.: Gesamtfraktion dissoziierter CIC gekoppelt an Partikel und inkubiert mit Mono Nuclear CeIIs (MNC) von Spender JM nach Ficollgradient.
Abbildung 2.: Gesamtfraktion dissoziierter CIC gekoppelt an Partikel und inkubiert mit Vollblut von Spender JM .
Abbildung 3.: 30-100kDa-Fraktion dissoziierter CIC gekoppelt an Partikel und inkubiert mit Mono Nuclear CeIIs (MNC) von Spender JM nach Ficollgradient
Abbildung 4.: 30-100kDa-Fraktion dissoziierter CIC gekoppelt an Partikel und inkubiert mit Vollblut von Spender JM.
Alle in der vorangehenden Beschreibung, den nachfolgenden Ansprüchen und den Abbildungen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Isolierung von somatischen Zellen, Mikroorganismen und/oder Viren aus Körperflüssigkeiten von Individuen, umfassend die Schritte
(a) Isolierung von Immunkomplexen aus der Körperflüssigkeit eines Individuums
(b) Aufspaltung der isolierten Immunkomplexe in ihre Untereinheiten
(c) Anbindung der dissoziierten Untereinheiten an einen festen Träger
(d) Inkubation des modifizierten Trägers aus (c) mit Zellen oder Körperflüssigkeit des Individuums aus (a) (e) Isolierung des inkubierten Trägers aus (d) mit den an die Untereinheiten angebundenen Zellen, Mikroorganismen und/oder Viren.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei in einem weiteren Schritt
(f) die Zellen aus (e) charakterisiert, in vitro kultiviert, in Subpopulationen aufgetrennt, manipuliert, und/oder für weitere diagnostische oder therapeutische
Zwecke verwendet werden.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass die mit bekannten Verfahren, vorzugsweise durch Fällung oder aus Körperflüssigkeiten isolierten Immunkomplexe in ihre Untereinheiten aufgespalten und im dissoziierten Zustand mit bekannten Methoden an feste Träger gebunden werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeit Blut, vorzugsweise antikoaguliertes Blut oder Vollblut, ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunkomplexe durch eine pH-Absenkung, vorzugsweise auf einen pH < 3,0 , in ihre Untereinheiten zerlegt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Untereinheiten ohne weitere Aufarbeitung oder nach Fraktionierung nach Molekulargewicht oder Affinität adsorptiv oder kovalent an feste Träger gebunden werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die festen Träger, die vorzugsweise aus Polystyrol, Polyvinylacrylat,
Polymethylmethacrylat, Polymethylacrylat, Polylactide, oder besonders bevorzugt Sepharose gebildet sind, alle Formen haben können, vorzugsweise aber Partikel verwendet werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass sämtliche Materialen geeignet sind, die durch den Zweck einer diagnostischen oder therapeutischen Anwendung vorbestimmt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass übliche Hilfsmittel für die Separierung der festen Träger und Isolierung der an den festen
Trägern gebundenen Zellen, Mikroorganismen und/oder Viren verwendet werden, wie Sedimentation, magnetische Anreicherung oder Separierung durch Größenunterschied und Ablösung der Zellen durch pH-Absenkung oder Enzymreaktionen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, wobei die Schritte (a)-(c) dadurch gekennzeichnet sind, dass
(a) zirkulierende Immunkomplexe (CIC) mit bekannten Verfahren, vorzugsweise Fällungsverfahren oder mittels Protein A - Adsorbern, aus dem Plasma eines Individuums gewonnen werden
(b) nach solcher Isolierung die CIC in ihre biologisch aktiven Bestandteile zerlegt werden, insbesondere durch Absenken des pH auf < 3,0, und vorzugsweise die Untereinheiten durch bekannte Verfahren, insbesondere Gel- Chromatographie, getrennt werden (c) die Untereinheiten einzeln oder als Gemisch an entsprechende
Trägermaterialien, vorzugsweise Mikropartikel, gekoppelt werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, wobei die Schritte (a)-(c) dadurch gekennzeichnet sind, dass
(a) antikoaguliertes Blut mittels eines üblichen Entnahmesystems gewonnen wird, dieses Vollblut zentrifugiert wird, der Plasmaüberstand abgenommen wird, eine PEG-Fällungsreaktion im Plasma durchgeführt wird, die gefällte
Fraktion abzentrifugiert wird und das die CIC enthaltende Sediment als Gemisch in Flüssigkeit aufgenommen wird
(b) der pH-Wert des CIC-Gemischs aus (a) auf pH 3,0 abgesenkt wird
(c) mit NHS und EDC aktivierte Polystyrolpartikel mit den dissoziierten Untereinheiten aus (b) inkubiert werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10-11 , wobei der Schritt (b) ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass nach der Dissoziation der CIC in ihre Untereinheiten vorzugsweise durch Zentrifugation eine 3OkDa - 100kDa-Fraktion daraus gewonnen wird, die dann für die nachfolgenden Schritte verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10-12, wobei die Schritte (d)-(e) dadurch gekennzeichnet sind, dass
(d) die modifizierten Partikel aus (c) mit Mono Nuclear CeIIs (MNC) des Individuums aus (a) inkubiert werden
(e) die Partikel aus (d) mit den angebundenen MNC über ein Sieb isoliert werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10-12, wobei die Schritte (d)-(e) dadurch gekennzeichnet sind, dass
(d) die modifizierten Partikel aus (c) mit Vollblut des Individuums aus (a), welches vorzugsweise durch Zentrifugation und Abnahme des Plasmas aufkonzentriert worden ist, inkubiert werden
(e) die Partikel aus (d) mit den angebundenen Zellen, Mikroorganismen und/oder Viren über ein Sieb isoliert werden.
15. Anordnung, insbesondere geeignet für eine Verwendung gemäß einem der Ansprüche 16-20, die vorzugsweise mit einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-12 hergestellt ist, umfassend
- einen Träger, vorzugsweise Mikropartikel - an den Träger angebundene Untereinheiten aus Immunkomplexen, vorzugsweise aus CIC, eines Individuums
- an die Untereinheiten angebundene Zellen, Mikroorganismen und/oder Viren, vorzugsweise MNCs, aus demselben Individuum.
16. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1-14 oder der
Anordnung gemäß Anspruch 15 für die patientenspezifische Diagnostik und Therapie, vorzugsweise für das Erkennen oder Behandeln krankhafter Zustände von den Individuen, von denen die Immunkomplexe gewonnen worden.
17. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1-14 oder der
Anordnung gemäß Anspruch 15 als wirksamer Bestandteil von Produkten und Verfahren, die geeignet sind in einem extra-korporalen Kreislauf zur Anwendung zu kommen.
18. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1-14 oder der
Anordnung gemäß Anspruch 15 für die extra-korporale Gewinnung oder Abreicherung von somatischen Zellen, Mikroorganismen und/oder Viren die durch Immunkomplexbestandteile erkannt werden.
19. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1-14 oder der
Anordnung gemäß Anspruch 15 für die Behandlung von Krankheiten, die durch Fehlregulation des Immunsystems ausgelöst oder aufrechterhalten werden, einschließlich bestimmter, chronisch verlaufender Viruskrankheiten.
20. Verwendung des Verfahrens gemäß Anspruch 19 in Kombination mit der extra- korporalen Entfernung von Immunkomplexen und/oder deren Untereinheiten und/oder pro-inflammatorischen Mediatoren.
1.Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1-14 oder der Anordnung gemäß Anspruch 15 für die Behandlung von Virushepatitiden, vorzugsweise Hepatitis C.
l ό
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