WO2009130330A1 - Marker zur bestimmung der biologischen alterung - Google Patents

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WO2009130330A1
WO2009130330A1 PCT/EP2009/055059 EP2009055059W WO2009130330A1 WO 2009130330 A1 WO2009130330 A1 WO 2009130330A1 EP 2009055059 W EP2009055059 W EP 2009055059W WO 2009130330 A1 WO2009130330 A1 WO 2009130330A1
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aging
age
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Lenhard Rudolph
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Lenhard Rudolph
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to markers which can be used for the determination of biological aging, regenerative capacity and prognosis in age-associated and chronic diseases, in particular markers which can be determined from blood or serum.
  • telomere shortening occurs in human cells with each cell division (3). This limits the proliferation capacity of human cells to 50-70 divisions (3). In humans, telomere shortening occurs as part of aging in almost all tissues (4). Shortening of telomeres correlates with the survival of 60-75 year olds (5). Accelerated shortening of telomeres has been associated with age-associated diseases such as Alzheimer's disease (6), diabetes mellitus (7), cardiovascular disease (8), and tumor development (9). In addition, shortening of telomeres correlates with disease progression and organ failure in chronic diseases such as hepatitis (10) and myelodysplastic syndromes (11).
  • telomere length has not been successful in the clinic so far, since technically complex methods such as Southern blot, quantitative fluorescence in situ hybridization or quantitative PCR must be used for this purpose. In addition, sample collection is often difficult. Telomere shortening in liver tissue correlates with the progression of chronic liver disease to liver cirrhosis (10). It would therefore be necessary to carry out liver biopsies in order to be able to estimate the prognosis and disease progression.
  • telomere length per se has only limited power over cell function and regenerative capacity.
  • Animal experiments have shown that it is not the average telomere length that is decisive, but the number of critically short, dysfunctional telomeres (12). So it comes in the mouse model to a premature Aging and a reduction in organ preservation when the number of dysfunctional telomeres is increased, although the median telomere length may still be relatively long (12).
  • These results are also important for the proliferation capacity of human cells. This leads to the induction of senescence and thus to the irreversible proliferation loss of the cells when the number of dysfunctional telomeres per cell exceeds a certain level (13).
  • telomere dysfunction appears to be an indication of aging, age-associated diseases, as well as chronic diseases.
  • the determination of telomere dysfunction as a clinical marker was not successful because telomere dysfunction is difficult to determine methodologically and biopsies from the affected organs are often not available.
  • telomere dysfunction A group of four proteins secreted by cells in response to telomere dysfunction or DNA damage has been identified (Jiang, Rudolph, Schiffer, Mischak et al., 2008 and unpublished data). These proteins have been identified in the culture supernatant of bone marrow cells from telomerase knockout (Terc " ⁇ ) mice with dysfunctional telomeres, and it has been shown in advance that Terc " ⁇ mice develop telomere dysfunction in bone marrow cells and thereby the function of hematopoietic cells Strain and progenitor cells is restricted. To identify marker proteins of telomere dysfunction, bone marrow cells from these mice were cultured (4 hrs). Proteome analysis of the secreted proteins in the cell culture supernatant was then performed by CE-TOF-MS. In this method, four proteins were identified that are specifically associated with the aging of telomere dysfunctional mice.
  • Elongation Factor 1 alpha (EF-lalpha): This protein controls transcriptional protein synthesis and is up-regulated in human cells in response to proliferation loss (senescence) (18,19).
  • Chitinase 3 like protein 3 (Chi3L3): This protein belongs to the family of chitinases, which are also activated in response to activation of the innate immune system (15, 16). Upregulation of a member of the chitinase family has been associated with the aging of human cartilage cells (17). Subsequent studies have shown that the determination of the enzyme activity of chitobiosidases, chitinases, chitibiases and / or N-acetyl-glucosaminidases can be used to determine the age and risk of developing age-associated diseases and cancer in humans. All or individual activities of chitobiosidases, chitinases, chitibiases and N-acetyl-glucosaminidases are measured.
  • CRAMP Catelcidino-Related Anti-Microbial Protein
  • Stathmin This protein controls microtubule stability, cell motility and mitosis (20).
  • the determination preferably takes place from blood or serum samples. It turns out that these four protein markers are upregulated in different organs of telomere dysfunctional mice (kidney, liver, lung, brain, spleen and heart). In addition, protein expression of these marker proteins in the blood serum of aging mice with dysfunctional telomeres is increased. These markers appear to be specific for aging in telomere dysfunction because upregulation of these marker proteins does not occur in wild-type mice with long telomeres. The work also shows that the same marker proteins in aging human cells (fibroblasts) are upregulated as part of aging and in response to radiation-induced DNA damage in young human cells.
  • Orthologous proteins of the marker proteins identified in the mouse system are known in humans for three of the four proteins: EF-lalpha, stathmin, CRAMP.
  • An orthologue for Chi3L3 is currently unknown in humans.
  • telomere dysfunction An essential feature of aging is the accumulation of DNA damage.
  • telomere dysfunction is also to be understood, since in response to telomere dysfunction, activation of DNA damage signaling pathways occurs in cells (21).
  • a number of premature aging syndromes in humans are associated with the mutation of genes necessary for the maintenance of DNA stability.
  • Our own investigations show that the identified marker proteins are also up-regulated in human cells in response to irradiation-induced DNA damage.
  • the marker proteins at the RNA and protein level there is a significant upregulation of the marker proteins at the RNA and protein level.
  • an upregulation of the marker proteins in the cell culture medium of irradiated human cells is detectable in comparison with unirradiated human cells.
  • Further methods for detecting the marker proteins are quantitative PCRs for the marker proteins.
  • antibodies were additionally defined which can be used for immunohistochemical detection of the marker proteins in human tissue samples.
  • the identified proteins are biomarkers of DNA damage, telomere dysfunction and can be used to determine the biological age, regenerative capacity, risk of cancer, the risk of developing age-associated diseases and the prognosis of chronic human and animal diseases.
  • the methods relate to ex vivo examinations of body fluids or biopsies.
  • the method is applicable to mammals and especially humans.
  • the determination ex-vivo is preferred.
  • DNA damage and telomere dysfunction are fundamental mechanisms that can prevent the development of age-associated diseases, aging, regeneration capacity, and cancer formation are underlying.
  • the detection of DNA damage and telomere dysfunction is difficult.
  • serum markers that can be determined in the blood or body fluids that indicate the presence of DNA breaks or telomere dysfunction.
  • the defined markers can be used for this application.
  • the studies show for the first time that the identified markers increase in response to telomere dysfunction or DNA damage in the blood serum. Due to the increasing recognition that DNA damage and telomere dysfunction are fundamentally underlying the development of age-associated diseases and cancer, the invention represents a significant advance in medicine and can be used as a novel biomarker.
  • the biological age of an individual may differ from the chronological age. It is well known that genetic factors, living conditions, lifestyle habits, eating habits, external factors and many other factors have an influence on the aging of the organism. The biological age determines the life expectancy and fitness of the aging individual in some cases more than the chronological age. Slow-aged, 60-year-old people can be fitter and have a longer life expectancy than aged 50 years old.
  • Measurement of the expression of the biomarkers defined herein can determine the presence and extent of DNA damage and telomere dysfunction. There is increasing evidence that these two parameters correlate with the biological age of an individual and their expected life expectancy.
  • the measurement can be carried out in body fluids (eg serum, blood, urine, saliva, cerebrospinal fluid) or in tissue and organ biopsies and samples.
  • the markers can also be determined with modern imaging techniques (molecular imaging). These methods are suitable for determining the state of aging of organs or for identifying aged cell clones with increased risk of degeneration.
  • a) Personal life planning For individual life planning, it is important to be able to estimate how long you are expected to be fit and able to work and what your own, probable life expectancy is. The determination of the biomarkers defined here can be used to determine the biological age and life expectancy of the individual. This can help the individual with their personal life planning.
  • Forensic / criminalistics The determination of markers defined here can be used to determine the biological age of victims of violent crimes and accidents.
  • the trade in livestock, domestic animals and animals used in sport is often accompanied by medical reports on the fitness and the expected useful life of the animals.
  • the measurement of the markers defined here can be used determine the biological age and the expected fitness span and life expectancy of animals.
  • Occupational / Environmental Medicine The determination of the markers defined here can be used to determine the influence of certain activities and the influence of environmental factors on the biological aging and fitness of individuals.
  • the biomarkers defined here can therefore be used to determine the regeneration capacity of tissues and organs.
  • the measurement may be in body fluids (e.g., serum, blood, urine, saliva, cerebrospinal fluid) or in tissue and organ biopsies / samples.
  • body fluids e.g., serum, blood, urine, saliva, cerebrospinal fluid
  • tissue and organ biopsies / samples e.g., in tissue and organ biopsies / samples.
  • a) Determination of prognosis and treatment planning in chronic diseases A number of chronic diseases lead to failure of the affected organs in the final stage. Interindividual profiles can be very different. The prediction of individual history is clinically meaningful to better plan the timing of invasive therapies (eg, organ transplants). The determination of the markers defined here can be used to predict the individual case of chronic Diseases (eg: hepatitis, pulmonary fibrosis, anemia, chronic inflammatory diseases) to determine.
  • chronic Diseases eg: hepatitis, pulmonary fibrosis, anemia, chronic inflammatory diseases
  • a number of acute illnesses and injuries can lead to failure of the affected organs and death of the patient. Interindividual profiles can be very different. The prediction of individual history is clinically meaningful to estimate the timing and benefits of invasive therapies (eg: surgery, intensive care). The determination of the markers defined here can be used to determine the individual prognosis for acute illnesses and injuries.
  • the determination of the markers defined here can therefore be used to determine the risk of the occurrence and prognosis of age-associated diseases.
  • the measurement may be in body fluids (e.g., serum, blood, urine, saliva, cerebrospinal fluid) or in tissue and organ biopsies / samples.
  • the determination of the risk of occurrence and prognosis of age-associated diseases using the markers defined here is suitable for the following areas:
  • a) Determination of the risk of the occurrence of age-associated diseases A variety of diseases are associated with aging (vascular disease, diabetes mellitus, dementia, strokes, etc.). It would be of clinical importance to be able to estimate the risk of the occurrence of such diseases in order, if necessary, to start early with preventive or therapeutic measures. see countermeasures begin. The determination of the markers defined here can be used to determine the individual risk of developing diseases associated with aging.
  • b) Determination of the prognosis of age-associated diseases A variety of diseases are associated with aging (vascular disease, diabetes mellitus, dementia, strokes, etc.). It would be of clinical importance to be able to estimate the prognosis of such diseases in order to take therapy measures adapted to the individual course. The determination of the markers defined here can be used to determine the individual course and prognosis in age-associated diseases.
  • the determination of the markers defined here can therefore be used to determine the risk of cancer in chronic diseases and in the context of aging.
  • the measurement may be in body fluids (e.g., serum, blood, urine, saliva, cerebrospinal fluid) or in tissue and organ biopsies / samples.
  • Many chronic diseases eg hepatitis, inflammatory bowel disease
  • the defined markers show the individual Ie cancer risk in chronic diseases.
  • a cancer risk assessment can be used to tailor cancer screening to individual cancer risk.
  • the timing of preventative measures can be improved.
  • Many genetic diseases for example, LiFraumatici syndrome, Adenomatosis poplyposis coli
  • the determination of the markers defined here may indicate the individual cancer risk of genetic predisposition and thus be used to improve cancer screening and improve the timing of preventative measures in these diseases.
  • General Cancer Screening The "General Cancer Screening" is recommended for many cancers (e.g., colon carcinoma, prostate carcinoma, breast carcinoma) as part of aging, following general medical guidelines at the time and frequency of screening. The individual risk of developing cancer is not included in these measures. The determination of the markers defined here can indicate the individual cancer risk and can be used for an improved "general cancer screening" adapted to the individual risk.
  • cancers e.g., colon carcinoma, prostate carcinoma, breast carcinoma
  • Figure 1 The markers of telomere dysfunction and DNA damage are detectable in the blood and indicate the risk of tumors in the context of aging and chronic liver disease.
  • A) Serum levels of EFlalpha are significantly elevated in the blood of hepatitis C virus infected patients who developed liver cancer during the course of the disease (group 1) compared to patients who did not develop liver cancer in the same observation period (group 2, p 0.02).
  • Figure 2 The markers of telomere dysfunction and DNA damage are detectable in the blood and are influenced by the lifestyle (smoking, exercise, obesity).
  • EF-lalpha The up-regulation of this protein has been linked to the proliferation loss (senescence) of human cells in culture (18,19). A link with human aging and age-associated diseases has not been described. Furthermore, it has not been shown that eflalpha is up-regulated by DNA damage and telomere dysfunction. Furthermore, it has not been shown that eflalpha is up-regulated by DNA damage and telomere dysfunction.
  • the marker also showed increased end-stage expression of chronic diseases (e.g., cirrhosis and myelodysplastic syndromes) in both the blood serum and the affected tissues.
  • the studies show for the first time that the serum protein levels of the marker indicate the risk of cancer in old age and in chronic diseases (FIG. 1A).
  • serum EF-lalpha levels were significantly higher in liver cirrhotic patients who developed liver cancer during the disease than in cirrhotic patients who did not develop liver cancer (Figure IB).
  • CRAMP also referred to as LL-37 in humans
  • the studies show for the first time that this protein in blood serum response to telomere dysfunction increases (22).
  • our studies show for the first time that this protein increases in human blood in the context of human aging and in the context of age-associated diseases (22).
  • the marker also shows increased end-stage expression of chronic diseases (e.g., cirrhosis and myelodysplastic syndromes) in both the blood serum and the affected tissues.
  • chronic diseases e.g., cirrhosis and myelodysplastic syndromes
  • Stathmin The studies show for the first time that this protein in blood serum increases in response to telomere dysfunction (22). In addition, the studies show for the first time that this protein increases in human blood in the context of human aging and in age-associated diseases (22).
  • the marker also showed increased end-stage expression of chronic diseases (e.g., liver cirrhosis and myelodysplastic syndromes) in both the blood serum and the affected tissues.
  • the marker indicates the risk of cancer in old age and chronic diseases.
  • Stathmin serum levels are significantly higher in cirrhotic liver cancer patients than in liver cirrhotic patients without liver cancer.
  • Enzyme activity of chitinases, chitibiases and N-acetylglucosaminidases An increase in the secretion of chitinase-like protein is described in the cell culture of aged human cartilage cells and in arthritis patients been (17). An increase in the enzyme activity of chitinases, chitibiases and N-acetylglucosaminidases in human blood or in human tissues / organs as a result of DNA damage, telomere dysfunction, aging or diseases has not previously been described.
  • the investigations show for the first time that the enzyme activity of chitobiosidases, chitinases, chitibiases and N-acetylglucosaminidases increases in the blood serum in response to telomere dysfunction (22).
  • the studies show for the first time that these enzyme activities in human blood increase in the context of human aging and in age-associated diseases (22).
  • chitinases e.g., chitibiases and N-acetylglucosaminidases
  • chronic diseases e.g., liver cirrhosis and myelodysplastic syndromes
  • the investigations show for the first time that the enzyme activity of chitobiosidases, chitinases, chitibiases and N-acetylglucosaminidases measured in the blood serum indicates the risk of cancer in chronic diseases.
  • the enzyme activity of chitobiosidases, chitinases, chitibiases and N-acetylglucosaminidases is significantly higher in liver cirrhosis patients with liver cancer than in cirrhotic patients, who developed liver cancer in the course of disease significantly higher than in cirrhotic patients who did not develop liver cancer in the same follow-up period (Figure ID).
  • the studies show for the first time that chitinase enzyme activity is significantly influenced by lifestyle habits (sport and smoking, Figure 2C, D).
  • telomere length is critical for cell viability and chromosomal stability. Cell. 2001 Oct 5; 107 (1): 67-77.

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Abstract

Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens und des Ausmaß von DNA-Schädigung und Telomerdysfunktion in Mensch oder Tier umfassend folgende Schritte: Bestimmung der Menge oder der Aktivität mindestens eines Proteinmarkers in einer Blut- oder Serumprobe, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EF1α, Chitobiosidasen, Stathmin und CRAMP.

Description

MARKER ZUR BESTIMMUNIG. DER BIOLOGISCHEN ALTERUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Marker, die zur Bestimmung von biologischer Alterung, regenerativer Kapazität und Prognose bei alternsassoziierten und chronischen Erkrankungen genutzt werden können, insbesondere Marker, die aus Blut oder Serum bestimmt werden können.
Die Anzahl an alten und chronisch kranken Menschen steigt in den meisten Ländern der Welt (1). Die Bestimmung der biologischen Alterung, der regenerativen Kapazität oder der Prognose bei chronischen und alternsassoziierten Erkrankungen stellt ein grundlegendes medizinisches Problem dar. Biomarker, die für solche Fragestellungen genutzt werden können, sind derzeit nicht verfügbar. Die Identifizierung leicht bestimmbarer Biomarker, welche die biologische Alterung, die Regenerationskapazität und das Krankheitsrisiko im Alter anzeigen, könnte zur Verbesserung und Individualisierung von Therapien (Therapiebeginn, Therapieauswahl, etc.) im Alter und bei chronischen Erkrankungen genutzt werden. Darüber hinaus können solche Marker genutzt werden, um Medikamente, Substanzen, Nahrungsprodukte/Zusätze und Verhaltensmaßnahmen zu entwickeln, welche die biologische Alterung aufhalten können.
Bei vielen alternsassoziierten und chronischen Erkrankungen ist eine Früherkennung von klinischer Bedeutung. Frühe Erkennung und Prognoseabschätzung ist klinisch notwendig, um eine Therapie einzuleiten, die genau an die spezielle Erkrankung und den individuellen Verlauf angepasst ist. Hierdurch kann das Risiko verringert werden, dass die Patienten weitere Folgeerkrankungen oder Komplikationen entwickeln. Darüber hinaus stellen invasive Therapien beim alten Menschen häufig auch ein Risiko dar. Die Abschätzung des Risikos therapeutischer Nebenwirkungen oder Komplikationen könnte zu einer besseren Therapieauswahl führen. Dies erscheint insbesondere bei Therapien indiziert, die eine regenerative Reserve des Patienten erfordern, wie zum Beispiel Operationen, Chemotherapie oder Radiotherapie.
Einer der wenigen biologischen Marker, der mit Alterung, alternsassoziierten Erkrankungen und chronischen Erkrankungen assoziiert ist, ist die Verkürzung der Telomere. Die Telomere bilden die Endstücke der Chromosomen (2). Eine Verkürzung der Telomere tritt in menschlichen Zellen mit jeder Zellteilung auf (3). Hierdurch wird die Proliferationskapazität menschlicher Zellen auf 50-70 Teilungen begrenzt (3). Im Menschen tritt eine Verkürzung der Telomere im Rahmen der Alterung in fast allen Geweben auf (4). Die Verkürzung der Telomere korreliert mit dem Überleben von 60-75 jährigen Menschen (5). Eine akzellerierte Verkürzung der Telomere wurde mit alternsassoziierten Erkrankungen wie Alzheimer (6), Diabetes Mellitus (7), kardiovaskulären Erkrankungen (8) und Tumorentwicklung (9) assoziiert. Darüber hinaus korreliert die Verkürzung der Telomere mit Krankheits-Progression und Organversagen bei chronischen Erkrankungen wie Hepatitis (10) und myelodysplastischen Syndromen (11).
Die Bestimmung der Telomerlänge hat sich in der Klinik bislang nicht durchsetzen können, da hierfür technisch aufwendige Verfahren wie Southern Blot, quantitative Fluoreszenz in situ Hybridisierung oder quantitative PCR eingesetzt werden müssen. Darüber hinaus ist die Probengewinnung oft schwierig. So korreliert die Telomerverkürzung im Lebergewebe mit dem Voranschreiten von chronischen Lebererkrankungen zur Leberzirrhose (10). Es müssten deswegen Leberbiopsien durchgeführt werden, um die Prognose und den Krankheitsverlauf abschätzen zu können.
Ein weiteres Problem der Telomerlängenbestimmung ist, dass die Telomerlänge per se nur eine begrenzte Aussagekraft über die Zellfunktion und die regenerative Kapazität hat. Tierversuche haben gezeigt, dass nicht die mittlere Telomerlänge entscheidend ist, sondern die Anzahl der kritisch kurzen, dys- funktionellen Telomere (12). So kommt es im Mausmodell zu einer vorzeitigen Alterung und einer Verminderung des Organerhalts, wenn dien Zahl der dys- funktionellen Telomere erhöht ist, obwohl eventuell die mittlere Telomerlänge noch relativ lang ist (12). Diese Ergebnisse sind auch für die Proliferationsfä- higkeit menschlicher Zellen von Bedeutung. So kommt es zur Induktion von Seneszenz und damit zum irreversiblen Proliferationsverlust der Zellen, wenn die Anzahl von dysfunktionellen Telomeren pro Zelle ein gewisses Maß überschreitet (13).
Zusammenfassend erscheint Telomerdysfunktion ein Hinweis auf Alterung, alternsassoziierte Erkrankungen, sowie für chronische Erkrankungen darzustellen. Allerdings konnte sich die Bestimmung der Telomerdysfunktion als klinischer Marker nicht durchsetzen, da die Telomerdysfunktion methodisch schwer zu bestimmen ist und Biopsien aus den betroffenen Organen häufig nicht verfügbar sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es ein Verfahren bereit zu stellen, mit dem in einfacher Weise eine Bestimmung biologischer Alterung, regenerativer Kapazität und Prognose bei alternsassoziierten und chronischen Erkrankungen erfolgen kann.
Gelöst wird dieses Problem nun mit der Identifizierung von Markerproteinen, die in Antwort auf Telomerdysfunktion (oder andere Formen von DNA- Schädigung) von Zellen sezerniert werden und mit einfachen Verfahren im Blutserum bestimmt werden können.
Es wurde eine Gruppe von vier Proteinen identifiziert, die von Zellen in Antwort auf Telomerdysfunktion oder DNA Schädigung sezerniert werden (Jiang, Rudolph, Schiffer, Mischak et al. 2008 und unpublizierte Daten). Diese Proteine wurden im Kulturüberstand von Knochenmarkzellen aus Telomerase Knockout (Terc"Λ) Mäusen mit dysfunktionellen Telomeren identifiziert. Es wurde in Vorarbeiten gezeigt, dass Terc"Λ Mäuse Telomerdysfunktion in Knochenmarkzellen entwickeln und hierdurch die Funktion von hämatopoetischen Stamm- und Progenitorzellen eingeschränkt wird. Zur Identifizierung von Markerproteinen der Telomerdysfunktion wurden Knochenmarkzellen aus diesen Mäusen in Kurzkultur (4 Std.) genommen. Es wurde dann eine Proteomanalyse der sezernierten Proteine im Zellkulturüberstand mittels CE-TOF-MS durchgeführt. In diesem Verfahren wurden vier Proteine identifiziert, die spezifisch mit der Alterung von telomerdysfunktionellen Mäusen assoziiert sind.
Es handelt sich bei diesen Proteinen um:
1. Elongation Factor 1 alpha: (EF-lalpha): Dieses Protein kontrolliert die trans- lationelle Proteinsynthese und ist in menschlichen Zellen in Antwort auf Pro- liferationsverlust (Seneszenz) hochreguliert (18,19).
2. Chitinase 3 like protein 3 (Chi3L3) : Dieses Protein gehört zu der Familie der Chitinasen, die ebenfalls in Antwort auf eine Aktivierung des innaten Immunsystems aktiviert werden (15, 16). Die Hochregulation eines Mitglieds der Chitinase Familie wurde mit der Alterung von menschlichen Knorpelzellen assoziiert (17). Folgeuntersuchungen zeigten, dass die Bestimmung der Enzymaktivität von Chitobiosidasen, Chitinasen, Chitibiasen und/oder N- Acetyl-Glucosaminidasen zur Bestimmung des Alter und des Risikos der Entwicklung von alternsassoziierten Erkrankungen und Krebs im Menschen genutzt werden können. Dabei werden alle oder einzelne Aktivitäten von Chitobiosidasen, Chitinasen, Chitibiasen und N-Acetyl-Glucosaminidasen gemessen.
3. Catelcidine-Related Anti-Microbial Protein (CRAMP, im Menschen auch als LL-37 bezeichnet) : Dieses Protein wird in Antwort auf eine Aktivierung des innaten Immunsystems aktiviert und scheint eine Funktion bei der Protektion gegen bakterielle Infektionen zu haben (14).
4. Stathmin (OP18) : Dieses Protein kontrolliert die Stabilität der Mikrotubuli, Zellmotilität und Mitose (20).
Die Bestimmung erfolgt bevorzugt aus Blut- oder Serumproben. Es zeigt sich, dass diese vier Protein marker in verschiedenen Organen von telomerdysfunktionellen Mäusen hochreguliert werden (Niere, Leber, Lunge, Gehirn, Milz und Herz). Zusätzlich ist die Proteinexpression dieser Markerproteine im Blutserum von alternden Mäusen mit dysfunktionellen Telomeren erhöht. Diese Marker erscheinen spezifisch zu sein für die Alterung im Rahmen von Telomerdysfunktion, da eine Hochregulation dieser Markerproteine nicht in Wildtyp-Mäusen mit langen Telomeren auftritt. Die Arbeiten zeigen ebenfalls, dass die gleichen Markerproteine in alternden menschlichen Zellen (Fibroblasten) im Rahmen der Alterung hochreguliert werden sowie in Antwort auf Strahlungs-induzierte DNA-Schädigung in jungen menschlichen Zellen.
Orthologe Proteine der im Maussystem identifizierten Markerproteine sind im Menschen für drei der vier Proteine bekannt: EF-lalpha, Stathmin, CRAMP. Ein Ortholog für Chi3L3 ist im Menschen derzeit nicht bekannt. Allerdings ist es möglich, die Enzymaktivität von Chitobiosidasen, Chitinasen, Chitibiasen und N-Acetyl- Glucosaminidasen in menschlichen Proben zu bestimmen. Die Untersuchungen zeigen erstmals, dass diese Enzymaktivitäten zur Bestimmung des Alter und des Risikos der Entwicklung von alternsassoziierten Erkrankungen und Krebs genutzt werden können. Die Bestimmung von Chitobiosidasen ist besonders bevorzugt.
Ein wesentliches Merkmal der Alterung ist die Akkumulation von DNA- Schädigung. In diesem Sinne ist auch die Akkumulation von Telomerdysfunktion zu verstehen, da es in Antwort auf Telomerdysfunktion zu Aktivierung von DNA-Schädigungssignalwegen in Zellen kommt (21). Eine Reihe von frühzeitigen Alterungssyndromen im Menschen ist mit der Mutation von Genen verbunden, die für die Aufrechterhaltung von DNA-Stabilität notwendig sind. Eigene Untersuchungen zeigen, dass die identifizierten Markerproteine auch in menschlichen Zellen in Antwort auf Bestrahlungs-induzierte DNA-Schädigung hochreguliert werden. So kommt es in Antwort auf Bestrahlung zu einer signifikanten Hochregulation der Markerproteine auf RNA und Proteinebene. Zu- sätzlich ist eine Hochregulation der Markerproteine im Zellkulturmedium von bestrahlten menschlichen Zellen im Vergleich mit unbestrahlten menschlichen Zellen nachweisbar.
Weiterhin wurden Methoden etabliert, die 3 orthologen Markerproteine im Blutserum vom Menschen mittels Elisa nachzuweisen. Darüber hinaus wurde ein kommerziell verfügbarer Kit zur Bestimmung der Enzymaktivität von Chi- tinasen, Chitibiasen und N-Acetyl -Glucosaminidasen in menschlichen Proben zu bestimmen.
Weitere Verfahren zur Detektion der Markerproteine sind quantitative PCRs für die Markerproteine. Weiterhin wurden zusätzlich Antikörper definiert, die zur immunhistochemischen Detektion der Markerproteine in menschlichen Gewebeproben nutzbar sind.
Die identifizierten Proteine sind Biomarker für DNA-Schädigung, Telomerdys- funktion und können zur Bestimmung des biologischen Alters, regenerativer Kapazität, des Krebsrisikos, des Risikos der Entwicklung von alternsassoziier- ten Erkrankungen und der Prognose bei chronischen Erkrankungen in Mensch und Tier genutzt werden. Die Verfahren beziehen sich auf ex vivo Untersuchungen von Körperflüssigkeiten oder Biopsien.
Das Verfahren ist auf Säugetiere und insbesondere Menschen anwendbar. Die Bestimmung ex-vivo ist bevorzugt.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können folgende Ziele erreicht werden :
1. Bestimmung des Vorliegens von DNA Schädigung und dyfunktionellen TeIo- meren
DNA Schädigung und Telomerdysfunktion sind grundlegende Mechanismen, die der Entstehung von alternsassoziierten Erkrankungen, Alterung, nachlas- sender Regenerationsfähigkeit, und Krebsentstehung zu Grunde liegen. Der Nachweis von DNA-Schädigung und Telomerdysfunktion ist schwierig. Es gibt derzeit keine einfach bestimmbaren Serummarker, die im Blut oder Körperflüssigkeiten bestimmt werden können und auf das Vorhandensein von DANN Brüchen oder Telomerdysfunktion hindeuten. Die definierten Marker können für diese Applikation genutzt werden. Die Untersuchungen zeigen erstmals, dass die identifizierten Marker in Antwort auf Telomerdysfunktion oder DNA- Schädigung im Blutserum ansteigen. Aufgrund der zunehmenden Erkenntnis, dass DNA Schädigung und Telomerdysfunktion grundlegend der Entwicklung von alterns-assoziierten Erkrankungen und Krebs zu Grunde liegen, stellt die Erfindung einen wesentlichen fortschritt in der Medizin dar und kann als neuer Biomarker genutzt werden.
2. Bestimmung des biologischen Alters und der voraussichtlichen Lebenserwartung:
Das biologische Alter eines Individuums kann von dem chronologischen Alter abweichen. Es ist bekannt, dass genetische Faktoren, Lebensumstände, Lebensgewohnheiten, Ernährungsgewohnheiten, äußere Faktoren und viele andere Faktoren einen Einfluss auf die Alterung des Organismus haben. Das biologische Alter bestimmt die Lebenserwartung und Fitness des alternden Individuums teilweise stärker als das chronologische Alter. Langsam gealterte, 60-jährige Menschen können zum Teil fitter sein und eine längere Lebenserwartung haben als vorgealterte 50 Jährige.
Die Messung der Expression der hier definierten Biomarker kann das Vorliegen und das Ausmaß von DNA-Schädigung und Telomerdysfunktion bestimmen. Es gibt zunehmend Hinweise dass diese beiden Parameter mit dem biologischen Alter eines Individuums und dessen voraussichtlicher Lebenserwartung korrelieren. Die Messung kann in Körperflüssigkeiten (z.B. : Serum, Blut, Urin, Speichel, Liquor) oder in Gewebe- und Organ-Biopsien und Proben erfolgen. Neben der Messung mittels Färbungen, PCR und Genarray können die Marker auch mit modernen Bildgebungsverfahren bestimmt werden (molekulare Bildge- bung). Diese Verfahren sind geeignet, den Alterungszustand von Organen zu bestimmen oder gealterte Zellklone mit erhöhtem Entartungsrisiko zu identifizieren.
Die Bestimmung des biologischen Alters und der voraussichtlichen Lebenserwartung mithilfe dieser Marker ist für folgende Bereiche geeignet:
a) Persönliche Lebensplanung : Für die individuelle Lebensplanung ist es von Bedeutung, abschätzen zu können, wie lange man voraussichtlich fit und arbeitsfähig ist und was die eigene, voraussichtliche Lebenserwartung ist. Die Bestimmung der hier definierten Biomarker kann dazu genutzt werden, das biologische Alter und die Lebenserwartung des Individuums zu bestimmen. Dies kann dem Individuum bei der persönlichen Lebensplanung helfen.
b) Medizinischer Bereich : Im medizinischen Bereich ist es bei der Therapieplanung von Bedeutung, das biologische Alter und die Lebenserwartung eines Patienten bestimmen zu können. Dies ist insbesondere bei invasiven Therapien (Operationen, Intensivmedizin, Organtransplantation, etc. von Bedeutung). Die Bestimmung der hier definierten Biomarker kann dazu genutzt werden, das biologische Alter und die Lebenserwartung des Individuums zu bestimmen. Dies kann Medizinern dabei helfen, individuelle Therapieindikationen besser zu stellen.
c) Lifestyle und Wellness Industrie: Es gibt Hinweise, dass Sport und Wellness- Anwendungen einen günstigen Einfluss auf die Alterung haben können. Welche Programme/Anwendungen für wen am besten geeignet sind, die Alterung aufzuhalten, ist nicht bekannt. Darüber hinaus ist es nicht möglich, den Erfolg solcher Verfahren objektiv zu bestimmen. Die Bestimmung der hier definierten Biomarker kann dazu genutzt werden, den Einsatz solcher Verfahren zu optimieren und den Erfolg der Maßnahmen im Verlauf zu beurteilen.
d) Gesunde Nahrungsmittel/Nahrungsmittelzusätze: Es gibt Hinweise, dass die Ernährung einen günstigen Einfluss auf die Alterung nehmen kann. Welche Nahrungsmittel/Nahrungsmittelzusätze für wen am besten geeignet sind, die Alterung aufzuhalten, ist nicht bekannt. Darüber hinaus ist es schwierig, den Erfolg solcher Maßnahmen zu bestimmen. Die Bestimmung der hier definierten Biomarker kann dazu genutzt werden, den Einsatz solcher Verfahren zu optimieren und den Erfolg der Maßnahmen im Verlauf zu beurteilen.
e) Medikamente/Substanzen zur Verbesserung von Fitness, Organfunktion und Lebenserwartung : Es gibt eine stetig wachsende Anzahl von Medikamenten und Substanzen, die einen günstigen Einfluss auf Alterung und Fitness im Alter haben können. Welche Medikamente/Substanzen für wen am besten geeignet sind die Alterung aufzuhalten, ist nicht bekannt. Darüber hinaus ist es schwierig, den Erfolg solcher Medikamente/Substanzen zu bestimmen. Die Bestimmung der hier definierten Biomarker kann dazu genutzt werden, den Einsatz solcher Medikamente/Substanzen zu optimieren und den Erfolg der Maßnahmen im Verlauf zu beurteilen.
f) Forensischer Bereich/Kriminalistik: Die Bestimmung der hier definierten Marker kann genutzt werden das biologische Alter von Opfern von Gewaltverbrächen und Unfällen zu bestimmen.
g) Bestimmung des biologischen Alters und der Lebenserwartung von Nutztieren, Haustieren, Sporttieren :
Der Handel mit Nutztieren, Haustieren und im Sport eingesetzten Tieren (z.B. : Rennpferde, Springpferde, Kamele, Hunde, etc.) ist häufig von medizinischen Gutachten über die Fitness und die voraussichtliche Nutzdauer der Tiere begleitet. Die Messung der hier definierten Marker kann genutzt wer- den das biologische Alter und die voraussichtliche Fitnessspanne und die Lebenserwartung von Tieren zu bestimmen.
h) Sportmedizin/Profisport: Die Bestimmung der hier genannten Marker kann dazu genutzt werden, das biologische Alter und die Fitness von Sportlern zu bestimmen.
i) Versicherungen : Die Bestimmung der hier genannten Marker kann dazu genutzt werden, das biologische Alter und die Fitness von Versicherungsnehmern zu bestimmen.
j) Arbeits-/Umweltmedizin : Die Bestimmung der hier definierten Marker kann dazu genutzt werden, den Einfluss bestimmter Tätigkeiten und den Einfluss von Umweltfaktoren auf die biologische Alterung und die Fitness von Individuen zu bestimmen.
3. Es gibt experimentell Hinweise, dass die Akkumulation von DNA-Schädigung und Telomerdysfunktion die Regenerationsfähigkeit von Geweben und Organen limitiert. Die hier definierten Biomarker können deswegen zur Bestimmung der Regenerationsfähigkeit von Geweben und Organen genutzt werden. Die Messung kann in Körperflüssigkeiten (z.B. : Serum, Blut, Urin, Speichel, Liquor) oder in Gewebe- und Organ-Biopsien/Proben erfolgen. Die Bestimmung der Regenerationsfähigkeit von Organen- und Geweben mithilfe dieser Marker ist für folgende Bereiche geeignet:
a) Bestimmung der Prognose und Therapieplanung bei chronischen Erkrankungen : Eine Reihe chronischer Erkrankungen führt im Endstadium zum Versagen der betroffenen Organe. Interindividuelle Verläufe können sehr unterschiedlich sein. Die Vorhersage des individuellen Verlaufs ist klinisch bedeutsam, um das Timing von invasiven Therapien (z.B. : Organtransplantationen) besser planen zu können. Die Bestimmung der hier definierten Marker kann dazu genutzt werden, die individuelle Prognose bei chronischen Erkrankungen (z.B. : Hepatitiden, Lungenfibrose, Anämien, chronisch entzündliche Erkrankungen) zu bestimmen.
b) Bestimmung der Prognose und Therapieplanung bei akuten Erkrankungen und Verletzungen.
Eine Reihe akuter Erkrankungen und Verletzungen kann zum Versagen der betroffenen Organe und zum Versterben der Patienten führen. Interindividuelle Verläufe können sehr unterschiedlich sein. Die Vorhersage des individuellen Verlaufs ist klinisch bedeutsam, um das Timing und den Nutzen von invasiven Therapien (z. B. : Operationen, Intensivmedizinische Maßnahmen) abzuschätzen. Die Bestimmung der hier definierten Marker kann dazu genutzt werden, die individuelle Prognose bei akuten Erkrankungen und Verletzungen zu bestimmen.
4. Es gibt zunehmend Hinweise, dass die Akkumulation von DNA Schädigung und Telomerdysfunktion das Risiko des Auftretens und die Prognose von al- ternsassoziierten Erkrankungen bestimmt. Die Bestimmung der hier definierten Marker kann deswegen zur Bestimmung des Risikos des Auftretens und der Prognose von alternsassoziierten Erkrankungen genutzt werden. Die Messung kann in Körperflüssigkeiten (z.B. : Serum, Blut, Urin, Speichel, Liquor) oder in Gewebe- und Organ-Biopsien/Proben erfolgen.
Die Bestimmung des Risikos des Auftretens und der Prognose von alternsassoziierten Erkrankungen mithilfe der hier definierten Marker ist für folgende Bereiche geeignet:
a) Bestimmung des Risikos des Auftretens von alternsassoziierten Erkrankungen : Eine Vielzahl von Erkrankungen ist mit der Alterung assoziiert (Gefäßkrankheiten, Diabetes Mellitus, Demenz, Schlaganfälle, etc.). Es wäre von klinischer Bedeutung, dass Risiko des Auftretens solcher Erkrankungen abschätzen zu können, um ggf. frühzeitig mit präventiven oder therapeuti- sehen Gegenmaßnahmen zu beginnen. Die Bestimmung der hier definierten Marker kann dazu genutzt werden, das individuelle Risiko, an alternsassozi- ierten Erkrankungen zu erkranken, bestimmen.
b) Bestimmung der Prognose von alternsassoziierten Erkrankungen : Eine Vielzahl von Erkrankungen ist mit der Alterung assoziiert (Gefäßkrankheiten, Diabetes Mellitus, Demenz, Schlaganfälle, etc.). Es wäre von klinischer Bedeutung, die Prognose solcher Erkrankungen abschätzen zu können, um dem individuellen Verlauf angepasste Therapiemaßnahmen zu ergreifen. Die Bestimmung der hier definierten Marker kann dazu genutzt werden, den individuellen Verlauf und die Prognose bei alternsassoziierten Erkrankungen zu bestimmen.
5. Es gibt zunehmend Hinweise, dass DNA Schädigung und Telomerdysfunkti- on zur Krebsentstehung führt. Die Bestimmung der hier definierten Marker kann deswegen zur Bestimmung des Krebsrisikos bei chronischen Erkrankungen und im Rahmen der Alterung genutzt werden. Die Messung kann in Körperflüssigkeiten (z.B. : Serum, Blut, Urin, Speichel, Liquor) oder in Gewebe- und Organ-Biopsien/Proben erfolgen.
Die Bestimmung des Krebsrisikos mithilfe der hier definierten Marker ist für folgende Bereiche geeignet:
a) Bestimmung des Krebsrisikos im Rahmen der Alterung. Im Alter steigt das Krebsrisiko an. Die hier definierten Marker zeigen das Krebsrisiko im Rahmen der Alterung an. Eine Bestimmung des Krebsrisikos kann dazu genutzt werden Krebsvorsorgeuntersuchungen dem individuellen Krebsrisiko anzupassen.
b) Bestimmung des Krebsrisikos bei chronischen Erkrankungen. Bei vielen chronischen Erkrankungen (z.B. : Hepatitiden, entzündliche Darmerkrankungen) steigt das Krebsrisiko an. Die definierten Marker zeigen das individuel- Ie Krebsrisiko bei chronischen Erkrankungen an. Eine Bestimmung des Krebsrisikos kann dazu genutzt werden Krebsvorsorgeuntersuchungen dem individuellen Krebsrisiko anzupassen. Darüber hinaus kann das Timing von Präventivmaßnahmen (Operation/Transplantation) verbessert werden.
c) Bestimmung des Krebsrisikos bei genetischer Prädisposition und bei genetischen Erkrankungen. Viele genetische Erkrankungen (z.B. LiFraumeni- Syndrom, Adenomatosis Poplyposis Coli) gehen mit einem erhöhten Krebsrisiko einher. Die Bestimmung der hier definierten Marker kann das individuelle Krebsrisiko bei genetischer Prädisposition anzeigen und so zur Verbesserung von Krebsvorsorge und einem verbesserten Timing von Präventivmaßnahmen bei diesen Erkrankungen genutzt werden.
d) Allgemeine Krebsvorsorgeuntersuchung : Die "allgemeine Krebsvorsorgeuntersuchung" ist für viele Krebsarten (z.B. Kolonkarzinom, Prostatakarzinom, Mamma-Karzinom) im Rahmen der Alterung empfohlen und folgt dabei allgemeinen, medizinischen Richtlinien zum Zeitpunkt und zur Häufigkeit der Vorsorgeuntersuchung. Das individuelle Risiko an Krebs zu erkranken ist bei diesen Maßnahmen nicht berücksichtigt. Die Bestimmung der hier definierten Marker kann das individuelle Krebsrisiko anzeigen und kann zu einer verbesserten, dem individuellen Risiko angepassten „allgemeinen Krebsvorsorge" genutzt werden.
Fiqurenbeschreibunq :
Figur 1 : Die Marker von Telomerdysfunktion und DNA-Schädigung sind im Blut nachweisbar und zeigen das Tumorrisiko im Rahmen der Alterung und bei chronischer Lebererkrankung an.
A) Der Serumspiegel von EFlalpha ist signifikant erhöht im Blut von Hepatitis C Virus infizierten Patienten, die im Verlauf der Erkrankung Leberkrebs entwickelten (Gruppe 1) gegenüber Patienten die im gleichen Beobachtungszeitraum keinen Leberkrebs entwickelten (Gruppe 2, p=0,02). B) 85 jährige Probanden mit erhöhtem EFlalpha Serumspiegel (50% der Probanden oberhalb des mittleren Serumspiegels = blaue Linie) zeigten ein signifikant höheres Risiko im verlauf von 4 Jahren an Krebs zu erkranken im vergleich zu 85 jährigen Probenden mit niedrigerem Eflalpha Serumspiegel (50% der Probanden unterhalb des mittleren Serumspiegels = rote Linie, p=0.002).
C) die Chitinase-Enzymaktivität ist signifikant erhöht im Blut von Hepatitis C Virus infizierten Patienten, die im Verlauf der Erkrankung Leberkrebs entwickelten (Gruppe 1) gegenüber Patienten die im gleichen Beobachtungszeitraum keinen Leberkrebs entwickelten (Gruppe 2, p=0,02).
D) 85 jährige Probanden mit erhöhtem CRAMP Serumspiegel (50% der Probanden oberhalb des mittleren Serumspiegels = blaue Linie) zeigten ein signifikant höheres Risiko im Verlauf von 4 Jahren an Krebs zu erkranken im vergleich zu 85 jährigen Probenden mit niedrigerem CRAMP Serumspiegel (50% der Probanden unterhalb des mittleren Serumspiegels = rote Linie, p=0.002).
Figur 2: Die Marker von Telomerdysfunktion und DNA-Schädigung sind im Blut nachweisbar und sind durch den Lebenswandel (Rauchen, Sport, Fettleibigkeit) beeinflusst.
A-C) Der Proteinspiegel von EFlalpha und Stathmin und die Chitinase Enzymaktivität im menschlichen Blut-Serum korrelieren signifikant negativ mit der sportlichen Aktivität. Diese Daten indizieren, dass mehr sportliche Aktivität mit einer verminderten DNA Schädigung assoziiert ist.
D) Der Proteinspiegel von Stathmin und die Chitinase Enzymaktivität im menschlichen Blut-Serum korrelieren signifikant positiv mit Zigarettenrauchen (gemessen in pack years = Lebensjahre in denen eine Schachtel Zigaretten pro tag geraucht wurde). Diese Daten indizieren, dass Rauchen mit einer verstärkten DNA Schädigung assoziiert ist.
E-G) Der Proteinspiegel von EFlalpha, Stathmin und CRAMP im menschlichen Blut-Serum korrelieren signifikant positiv mit Fettleibigkeit (gemessen als Body Mass Index). Diese Daten indizieren, dass Fettleibigkeit mit einer verstärkten DNA Schädigung assoziiert ist.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
EF-lalpha: Die Hochregulation dieses Protein ist mit dem Proliferationsverlust (Seneszenz) von menschlichen Zellen in Kultur in Verbindung gebracht worden (18,19). Eine Verbindung mit menschlicher Alterung und alternsassoziierten Erkrankungen ist nicht beschrieben worden. Ferner ist bislang nicht gezeigt worden, dass Eflalpha durch DNA-Schädigung und Telomerdysfunktion hochreguliert wird. Ferner ist bislang nicht gezeigt worden, dass Eflalpha durch DNA-Schädigung und Telomerdysfunktion hochreguliert wird.
Die Untersuchungen zeigen erstmals, dass dieses Protein im Blutserum in Antwort auf Telomerdysfunktion und DNA-Schädigung ansteigt (Jiang et al. 2009). Darüber hinaus zeigen die Arbeiten erstmals, dass EF-lalpha Protein im menschlichen Blut nachweisbar ist und im Rahmen der Alterung und bei alternsassoziierter Erkrankungen und chronischen Erkrankungen ansteigt (Jiang et al. 2009). So ist der Blutserum Spiegel von EF-lalpha bei alten Menschen im Altersheim (n = 20, mittleres Alter 85 Jahre, EF-lalpha= 1,5 Einheiten) signifikant höher als bei jungen Menschen (n = 31, mittleres Alter 35 Jahre, EF-lalpha= 1 Einheit, p=0.0004). Ein weiterer Anstieg ist bei geriatrischen Patienten zu verzeichnen (n = 72, mittleres Alter 73 Jahre, EF-lalpha= 1,7 Einheiten, p=0.0115). Der Marker zeigte darüber hinaus eine erhöhte Expression im Endstadium chronischer Erkrankungen (z.B. Leberzirrhose und myelo- dysplastische Syndrome), sowohl im Blutserum als auch in den betroffenen Geweben.
Zusätzlich zeigen die Untersuchungen erstmals, dass die Serumproteinspiegel des Markers das Krebsrisiko im Alter und bei chronischen Erkrankungen anzeigen (Figur IA). Bei >85 jährigen Probanden war das Risiko innerhalb der nächsten 4 Jahre an Krebs zu erkranken bei erhöhtem EF-lalpha- Serumspiegel (>Median) signifikant höher (46/243 Probanden entwickelten Tumore) als bei den Probanden mit niedrigeren EF-lalpha- Serumspiegel (<Median, 22/243 Probanden entwickelten Tumore, p=0,001). Zusätzlich war der EF- lalpha- Serumspiegel bei Leberzirrhosepatienten, die im Krankheitsverlauf Leberkrebs entwickelten deutlich höher als bei Leberzirrhosepatienten, die keinen Leberkrebs entwickelten (Figur IB).
Zusätzlich zeigen unsere Untersuchungen erstmals, dass die Serumproteinspiegel des Markers signifikant von Lebensgewohnheiten (Sport und Fettleibigkeit, Figur 2A, E) beeinflusst werden.
Beispiel 2
CRAMP (im Menschen auch als LL-37 bezeichnet) : Die Untersuchungen zeigen erstmals, dass dieses Protein im Blutserum Antwort auf Telomerdysfunktion ansteigt (22). Darüber hinaus belegen unsere Untersuchungen erstmals, dass dieses Protein im menschlichen Blut im Rahmen der menschlichen Alterung und im Rahmen alternsassoziierter Erkrankungen ansteigt (22). So ist der Blutserum Spiegel von CRAMP bei alten Menschen im Altersheim (n = 20, mittleres Alter 85 Jahre, CRAMP= 18ng) signifikant höher als bei jungen Menschen (n = 31, mittleres Alter 35 Jahre, CRAMP= 8ng, p<0,0001). Ein weiterer Anstieg ist bei geriatrischen Patienten zu verzeichnen (n=72, mittleres Alter 73 Jahre, CRAMP= 22ng, p=0,0007). Der Marker zeigt darüber hinaus eine erhöhte Expression im Endstadium chronischer Erkrankungen (z.B. Leberzirrhose und Myelodysplastische Syndrome), sowohl im Blutserum als auch in den betroffenen Geweben. Zusätzlich zeigt der Marker das Krebsrisiko im Alter und bei chronischen Erkrankungen an.
Diese Untersuchungen zeigen erstmals, dass der Serumspiegel von CRAMP (LL-37) im menschlichen Blut bei 85 jährigen Probanden das Risiko innerhalb der nächsten 4 Jahre an Krebs zu erkranken anzeigt (Figur IC). Probanden mit erhöhtem CRAMP- Serumspiegel (>Median) zeigten signifikant höhere Raten der Entwicklung maligner Tumore (44/243 Probanden entwickelten Tumore) als die Probanden mit niedrigeren CRAMP- Serumspiegel (<Median, 24/243 Probanden entwickelten Tumore, p=0,006). Zusätzlich war der CRAMP- Serumspiegel bei Leberzirrhosepatienten mit Leberkrebs deutlich höher als bei Leberzirrhosepatienten ohne Leberkrebs.
Zusätzlich zeigen die Untersuchungen erstmals, dass der Serumspiegel von CRAMP signifikant von Fettleibigkeit beeinflusst wird (Figur 2G).
Beispiel 3
Stathmin : Die Untersuchungen zeigen erstmals, dass dieses Protein im Blutserum in Antwort auf Telomerdysfunktion ansteigt (22). Darüber hinaus belegen die Untersuchungen erstmals, dass dieses Protein im menschlichen Blut im Rahmen der menschlichen Alterung und bei alternsassoziierter Erkrankungen ansteigt (22). So ist der Blutserum Spiegel von Stathmin bei alten Menschen im Altersheim (n = 20, mittleres Alter 85 Jahre, STATHMIN= 1,3 Einheiten) signifikant höher als bei jungen Menschen (n = 31, mittleres Alter 35 Jahre, STATHMIN= 1 Einheit, p=0.0001). Der Marker zeigte darüber hinaus eine erhöhte Expression im Endstadium chronischer Erkrankungen (z.B. Leberzirrhose und Myelodysplastische Syndrome), sowohl im Blutserum als auch in den betroffenen Geweben.
Zusätzlich zeigt der Marker das Krebsrisiko im Alter und bei chronischen Erkrankungen an. Der Stathmin-Serumspiegel ist bei Leberzirrhosepatienten mit Leberkrebs deutlich höher als bei Leberzirrhosepatienten ohne Leberkrebs.
Zusätzlich zeigen die Untersuchungen erstmals, dass die Serumproteinspiegel des Markers signifikant von Lebensgewohnheiten (Sport, Rauchen und Fettleibigkeit, Figur 2A, D, F) beeinflusst werden.
Beispiel 4
Enzymaktivität von Chitinasen, Chitibiasen und N-Acetyl- Glucosaminidasen : Eine Erhöhung der Sekretion von Chitinase-like-Protein ist in der Zellkultur von Knorpelzellen von gealterten Menschen und bei Arthritis Patienten beschrieben worden (17). Eine Erhöhung der Enzym Aktivität von Chitinasen, Chitibiasen und N-Acetyl- Glucosaminidasen im menschlichen Blut oder in menschlichen Geweben/Organen als Folge von DNA-Schädigung, Telomerdysfunktion, Alterung oder Erkrankungen ist bislang nicht beschrieben worden.
Die Untersuchungen zeigen erstmals, dass die Enzym Aktivität von Chitobiosi- dasen, Chitinasen, Chitibiasen und N-Acetyl- Glucosaminidasen im Blutserum in Antwort auf Telomerdysfunktion ansteigt (22). Darüber hinaus belegen die Untersuchungen erstmals, dass diese Enzymaktivitäten im menschlichen Blut im Rahmen der menschlichen Alterung und bei alternsassoziierter Erkrankungen ansteigen (22). So ist die Enzymaktivität von Chitinasen, Chitibiasen und N-Acetyl- Glucosaminidasen im Blutserum von alten Menschen im Altersheim (n = 20, mittleres Alter 85 Jahre, Chitinase-Enzym-Aktivität = 52 Units) signifikant höher als bei jungen Menschen (n = 31, mittleres Alter 35 Jahre, Enzym- Aktivität = 24 Units, p=0, 0004). Ein weiterer Anstieg ist bei geriatrischen Patienten zu verzeichnen (n = 72, mittleres Alter 73 Jahre, Enzym-Aktivität: 56 Units, p=0, 0216). Die Enzymaktivität von Chitinasen, Chitibiasen und N- Acetyl- Glucosaminidasen ist darüber hinaus im Endstadium chronischer Erkrankungen (z.B. Leberzirrhose und Myelodysplastische Syndrome) im Blutserum erhöht.
Die Untersuchungen zeigen darüber hinaus erstmals, dass die im Blutserum gemessene Enzymaktivität von Chitobiosidasen, Chitinasen, Chitibiasen und N- Acetyl- Glucosaminidasen das Krebsrisiko bei chronischen Erkrankungen anzeigen. Die Enzymaktivität von Chitobiosidasen, Chitinasen, Chitibiasen und N- Acetyl- Glucosaminidasen ist bei Leberzirrhosepatienten mit Leberkrebs deutlich höher als bei Leberzirrhosepatienten, die im Krankheitsverlauf Leberkrebs entwickelten deutlich höher als bei Leberzirrhosepatienten, die im gleichen Nachbeobachtungs-Zeitraum keinen Leberkrebs entwickelten (Figur ID). Zusätzlich zeigen die Untersuchungen erstmals, dass Chitinase-Enzymaktivität signifikant von Lebensgewohnheiten (Sport und Rauchen, Figur 2C, D) beein- flusst werden.
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens und des Ausmaß von DNA- Schädigung und Telomerdysfunktion in Mensch oder Tier umfassend folgende Schritte:
Bestimmung der Menge oder der Aktivität mindestens eines Proteinmar- kers in einer Blut- oder Serumprobe, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EFlα, Chitobiosidasen, Stathmin und CRAMP.
2. Verfahren zur Bestimmung des Alterungszustandes eines Organismus umfassend folgende Schritte:
Bestimmung der Menge oder der Aktivität mindestens eines Proteinmar- kers in einer Probe, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (i) EFlα, (ii) CRAMP, (iii) Stathmin und (iv) Chitinase Genfamilie.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Aktivität der Chitinase Genfamilie die Enzymaktivität von Chitobiosidasen Chitin- asen, Chitibiasen und/oder N-Acetyl-Glucosaminidasen gemessen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung der Expression erfolgt durch Messung :
- des Proteins,
- Messung von Bruchstücken des Proteins,
- Messung von mRNA, die für das Protein kodiert,
- Messung von mRNA-Fragmenten, die für das Protein kodieren,
- Messung der biologischen Aktivität der Proteins.
- Bildliche Darstellung der Proteine oder der Aktivität der Proteine (molekulares Imaging)
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung in Körperflüssigkeiten oder in Gewebe- und Organbiopsien oder - proben erfolgt.
6. Verfahren nach mindestens Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeiten ausgewählt werden aus Blut, Urin, Speichel und Liquori, insbesondere aus Serum.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zur Bestimmung des biologischen Alters, der voraussichtlichen Lebenserwartung, der Regenerationsfähigkeit von Geweben und Organen, des Risikos des Auftretens und der Prognose von alternsassoziierten Erkrankungen, der Bestimmung des Krebsrisikos bei chronischen Erkrankungen, der Bestimmung des Krebsrisikos im Rahmen der Alterung, Bestimmung des Krebsrisikos im Rahmen chronischer Erkrankungen dient.
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 75, dadurch gekennzeichnet, dass 2, 3 oder 4 Proteinmarker aus der Gruppe (i) CRAMP, (ii) EFlα, (iii) Stathmin und (iv) Chitinase Genfamilie bestimmt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität der Chitinasen Genfamilie als Enzymaktivität von Chitobiosidasen, Chitin- asen, Chitibiasen und N-Acetyl-Glucosaminidasen bestimmt wird.
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das die Marker bzw. die Markeraktivität durch Bildge- bung (molekulares Imaging) dargestellt werden.
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