WO2009119499A1 - ステント - Google Patents

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ecto
atpdase
plasmid
dna
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能彦 斎藤
田畑　泰彦
吉博 藤村
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株式会社グッドマン
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    • A61L2300/258—Genetic materials, DNA, RNA, genes, vectors, e.g. plasmids

Definitions

  • the present invention relates to a stent placed in a lumen formed by vascular tissue.
  • Patent Document 1 As a conventional stent, one described in Patent Document 1 below is known.
  • This stent is a sustained release of a gene or drug by elution (Drug Eluting Stent, DES) and is a high-container containing a gene encoding an anti-MCP-1 antibody, an MCP-1 antagonist, or an MCP-1 dominant negative. It is coated with molecular material and used for percutaneous coronary angioplasty (PTCA).
  • DES Drug Eluting Stent
  • Non-patent Document 1 there is a gene that is different from the above gene and has been discovered by the present inventor (Non-patent Document 1 below).
  • This gene has type I and type II.
  • This gene was obtained as follows. That is, first, an anti-human CD39 antibody against human CD39 protein, which is a kind of ATP-degrading enzyme (ATP diphosphohydrolase, ATPDase), is allowed to act on a protein group extracted from human placenta, and various antigen-antigen sites of anti-human CD39 antibody are contained. Acquired protein.
  • ATP diphosphohydrolase ATP diphosphohydrolase
  • a part of the amino acid sequence was determined for each of the various proteins obtained, and for a protein having a sequence different from that of the human CD39 protein, a DNA sequence was predicted from the partial amino acid sequence, and primers were prepared. Subsequently, a PCR (polymerase chain reaction) method was performed using the primers and a cDNA library derived from human placenta as a template. The PCR product was cloned to confirm type I and type II DNA.
  • This gene encodes an isoform of the human CD39 protein, and from the amino acid sequence, this isoform is an ATP-degrading enzyme and appears to direct the active site outside the cell (ecto-ATP diphosphohydrolase, ecto-ATPDase).
  • This nucleic acid-containing complex contains a nucleic acid and a positively charged water-insoluble biodegradable polymer, and releases the nucleic acid by decomposition of the biodegradable polymer.
  • Patent Document 1 can only slightly reduce the incidence of vascular restenosis as compared with a normal stent that is not simply DES, and has no use for platelet thrombus.
  • the invention described in claim 1 aims to provide a stent capable of suppressing the formation of platelet thrombus.
  • the invention according to claim 1 is a stent placed in a lumen formed by vascular tissue, and is released from the stent body after placement, and the peripheral vascular tissue. And an increasing factor that increases the concentration of ecto-ATP diphosphohydrolase.
  • the invention described in claim 2 aims to continue to increase the concentration of ecto-ATP diphosphohydrolase in the peripheral vascular tissue over a relatively long period of time by utilizing a protein synthesis system in the peripheral vascular tissue.
  • the increase factor is a vector DNA into which a DNA encoding ecto-ATP diphosphohydrolase derived from human placenta is incorporated.
  • the invention according to claim 3 increases the concentration of ecto-ATP diphosphohydrolase in the peripheral vascular tissue over a relatively long period of time by gradually releasing the increase factor related to ecto-ATP diphosphohydrolase.
  • the stent body covers the stent substrate and at least a part of the surface of the stent substrate, carries the rising factor, and gradually decomposes after placement. And a carrier that gradually releases the increase factor.
  • the invention according to claim 4 is the above invention, wherein the carrier contains a biodegradable polymer. It is characterized by this.
  • the invention according to claim 5 makes it possible to adjust the sustained release rate and maintain the ecto-ATP diphosphohydrolase concentration at an appropriate amount for a long period of time, thereby further increasing the level of platelet thrombus formation inhibition performance.
  • the biodegradable polymer is positively charged and water-soluble.
  • the invention according to claim 6 is the biodegradable polymer according to the above invention. Is characterized in that it is gelatin.
  • the present invention it has been found through trial and error that combining the ecto-ATP diphosphohydrolase with the stent related to the vascular tissue can solve the problem of the stent accurately, and the ecto-ATP diphosphohydrolase is effective for the vascular tissue. Since the adaptation to the stent was attempted in order to act effectively, there is an effect that extremely good thrombus suppression performance can be exhibited.
  • the stent of the present invention was used for PTCA placed in a coronary artery formed by vascular tissue.
  • the stent base is formed by arranging a plurality of main parts having a wave shape in a ring on the same axis and connecting them with connectors, and cutting the metal tube with this design.
  • the stent base is the same as a normal stent (a metal-only stent, bare metal stent, BMS).
  • the metal tube is a stainless steel tube here, but may be a super elastic metal tube such as nickel titanium or another metal tube.
  • the stent base is formed by cutting a metal tube with a laser here, but can also be formed by etching the metal tube or bending / knitting a wire.
  • the design of the stent substrate may consist of only a single main part, or may be a net-like tube or the like.
  • the stent substrate (stent body) can be made of a biodegradable material or can be formed by combining a plurality of materials.
  • the stent of the present invention was formed by coating the entire surface of the stent substrate with a nucleic acid-containing complex related to DNA encoding ecto-ATPDase.
  • DNA which codes ecto-ATPDase (ecto-ATPDaseI stent).
  • the DNA of SEQ ID NO: 1 is the gene sequence of type I human ecto-ATPDase discovered by the present inventor, excluding those before 186 and after 1738, and from 187 to 1737. It is equivalent to the second.
  • the ecto-ATPDase encoded from the DNA of SEQ ID NO: 1 is referred to as ecto-ATPDaseI.
  • the nucleic acid-containing complex contains the plasmid after incorporation and a positively charged water-insoluble biodegradable polymer, and releases the nucleic acid by degradation of the biodegradable polymer.
  • the biodegradable polymer is gelatin. Gelatin is positively charged by introducing a positively charged group (amino group). When gelatin is placed in the lumen, it is gradually decomposed, and accordingly, the DNA encoding the supported ecto-ATPDase is gradually released. Therefore, the stent of the present invention is coated with a nucleic acid-containing complex. It becomes DES.
  • gelatin Since gelatin is positively charged, it strongly binds (ion bond) with the negative charge of DNA, thereby stably supporting the plasmid and contributing to stable sustained release of the plasmid. Further, since it is insoluble in water, the release of nucleic acid can be controlled according to the degradability of the biodegradable polymer in the lumen, that is, the sustained release rate of the plasmid can be controlled.
  • gelatin biologicaldegradable polymer
  • the stent substrate and the carrier constitute a stent body
  • a plasmid incorporating DNA encoding ecto-ATPDase constitutes an increase factor.
  • the nucleic acid-containing complex may be applied to a part of the surface of the stent substrate.
  • collagen or the like can be used as the biodegradable polymer.
  • a biodegradable polymer that is originally positively charged may be used, or a positively charged group other than an amino group may be introduced.
  • vectors other than plasmids may be used as vector DNA, ecto-ATPDase II DNA, ecto-ATPDase II DNA, SEQ ID NO: 1 and ecto-ATPDase II DNA, A mixture of DNA according to SEQ ID NO: 1 and / or ecto-ATPDase II, or an arbitrary combination thereof may be used.
  • ecto-ATPDase II is an isoform of human CD39 protein produced from a plasmid incorporating human ecto-ATPDase II DNA (EMBL accession number: AJ133134).
  • the genomic DNA sequence of ecto-ATPDase I is shown in FIGS.
  • the cDNA sequence accession number: AJ133133, FIG. 5
  • the first (1550 bp) encoded region was used (within SEQ ID NO: 1 in the frame of FIG. 5).
  • the pCI-CMV-FLAG-ecto-ATPDase I plasmid which expresses FLAG-human ecto-ATPDase I, was obtained from co-inventor Yoshihiro Fujimura by binding the FLAG tag sequence to the gene sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the DNA fragment of FLAG-human ecto-ATPDase I when the pCI-CMV-FLAG-ecto-ATPDase I plasmid was constructed was amplified by a PCR reaction under the following conditions. That is, as a primer set for amplifying FLAG-human ecto-ATPDase I, an upstream primer (5′-GGAATTCGCCACCCATGGACTACTAAGGATGACGATGGACAGAGACGGAGCACAGGACGCTGACAAGCCACCTACCATCCATCATCCATACTCC) was used as a primer set for amplifying FLAG-human ecto-ATPDase I. It was.
  • template cDNA template human placenta cDNA library, purchased from Takara Bio Inc.
  • primer primer
  • 0.2 mM dNTPs 1 ⁇ PCR buffer (attached to Pfx DNA polymerase)
  • 1 unit Pfx DNA It was adjusted with the composition of polymerase (purchased from Invitrogen).
  • the PCR conditions for FLAG-human ecto-ATPDase I were as follows: after heat denaturation at 94 ° C for 5 minutes, the reaction was repeated 25 times at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds, and finally 72 ° C. Keep it warm for 7 minutes. This PCR fragment was inserted into a pCI CMV cloning vector (purchased from Promega) to obtain a pCI CMV FLAG ecto-ATPDaseI plasmid.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ (purchased from TOYOBO) into which the above-described pBS CAG ecto-ATPDaseI plasmid or pBS CAG ⁇ ⁇ lacZ plasmid was introduced was cultured overnight in LB medium at 37 degrees Celsius (hereinafter abbreviated as Celsius), and Quiagen Miniprep (Quiagen The plasmid used for stent production was collected according to the protocol recommended by the reagent manufacturer.
  • the nucleic acid-containing complex according to the above-described pBS CAG lacZ plasmid is first used as a stent compatible with the rabbit femoral artery.
  • Ten coatings (lacZ stents) coated on the substrate were prepared and placed in the rabbit femoral artery. Note that positively charged gelatin was used as the biodegradable polymer of the nucleic acid-containing complex.
  • FIG. 7 shows a photograph (a) of one example after 7 days and a photograph (b) of the same operation performed on BMS.
  • a cylindrical stent or artery is cut open into a plane.
  • cDNA is synthesized using mRNA extracted from each stent, and expressed by correcting the expression level of mRNA related to human ecto-ATPDaseI with the expression level of mRNA related to ⁇ -actin by the real-time PCR method described below. We grasped change of quantity.
  • RNAase out was synthesized from the extracted total RNA using Superscript II kit (purchased from Invitrogen) and RNAase out (purchased from Invitrogen) according to the protocol recommended by the reagent manufacturer.
  • the composition of the reaction solution was adjusted according to the protocol recommended by the reagent manufacturer using QuantiTsct SYBR ⁇ ⁇ Green PCR kit (purchased from Quiagen). PCR conditions were as follows: heat denaturation at 95 ° C for 15 minutes, and then the reaction of 94 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds was repeated 45 times.
  • mRNA related to the ecto-ATPDaseI plasmid is expressed in a ratio of 2.35 after 3 days of indwelling (ecto-ATPDase (3)), and even after 7 days of indwelling.
  • the mRNA according to the ecto-ATPDase I plasmid is expressed at a ratio of 1.01.
  • the human ecto-ATPDase I stent according to the present invention it can be said that the mRNA according to the ecto-ATPDase I plasmid is significantly expressed as compared with other stents.
  • the cut sample is put in a tube into which 500 ⁇ L of ice-cold homogenization buffer (100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.2% Triton X-100, 1 mM PMSF) is dispensed, Homogenization was performed while maintaining 4 degrees. The homogenized supernatant was transferred to a new tube and centrifuged at 14000 rpm for 10 minutes while maintaining 4 degrees. The supernatant was collected again and the protein concentration was measured by the BCA measurement method. For comparison, the protein was isolated from only the rabbit femoral artery (Rabbit normal artery) and used as a control for confirming the presence or absence of human ecto-ATPDaseI.
  • homogenization buffer 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.2% Triton X-100, 1 mM PMSF
  • the mixture was transferred to a secondary antibody reaction solution (peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG antibody: IBL; Cat. No. 17601) diluted 2000 times with 10% skim milk / TBST, reacted at room temperature for 45 minutes, and then ECL plus Western. Color was developed with Blotting® Detection® System (purchased from Amersham® Biosciences).
  • the present invention relates to a stent related to a plasmid (nucleic acid-containing complex) into which human ecto-ATPDase II DNA has been incorporated, and a stent related to a nucleic acid-containing complex containing this plasmid and the plasmid into which the DNA of SEQ ID NO: 1 in this example is incorporated.
  • a stent related to a nucleic acid-containing complex containing this plasmid and the plasmid into which the DNA of SEQ ID NO: 1 in this example is incorporated was confirmed in the same manner.
  • ecto-ATPDase I stents that fit the rabbit femoral artery were prepared.
  • 5 are plasmids obtained by converting the promoter of the above-described pBS CAG ecto-ATPDase I plasmid into CMV (ecto-ATPDase-1 to 5), and the other 8 are the above-described pBS CAG ecto-ATPDase I.
  • a plasmid is used (ecto-ATPDase-6 to 13).
  • lacZ-1 to 5 a stent base material suitable for a rabbit femoral artery
  • additional stents CG-1 to 8
  • BMS-1-9 additional BMSs that fit the rabbit femoral artery
  • Each of these various stents is placed in the rabbit femoral artery, and after 7 days, the blood vessel is imaged and is patent or occluded (angio: ⁇ ; patent, ⁇ ; occlusion), or a white thrombus is observed. (+++: recognized in the entire indwelling part, ++: recognized in the majority, +: recognized slightly,-: not recognized), and the like were observed. 10 and 11 are tables and graphs of the observation results.
  • BMS-3,7cm In BMS, 2 cases of BMS-3,7cm were patency, but obstruction was observed in the other 7 cases, and the patency rate was 22%. In both patent cases, some blood clots were observed. In obstructive cases, some blood clots were present in one case (BMS-6), and most cases occurred in two cases (BMS-8,9). (BMS-1,2,4,5).
  • the patency was found in 3 cases of CG-5-7cm, and no thrombus was generated, but obstruction was observed in the other 5 cases, and the patency rate was 37%.
  • the obstructed cases one case showed some blood clots (CG-3), one case showed most (CG-8), and three cases showed all (CG-1,2,4). ).
  • lacZ-2 In the stent related to lacZ, only lacZ-2 was patented and thrombus was not generated, but obstruction was observed in the other four cases, and the patency rate was 20%. Among the obstructed cases, some cases had some blood clots (lacZ-4), and 3 cases showed all cases (lacZ-1,3,5).
  • the patency is 6 cases
  • the occlusion is 16 cases
  • the patency rate is 27%. Thrombus did not occur in 4 out of 22 cases, 5 cases were slightly recognized, 3 cases were mostly recognized, and 10 cases were observed in the whole.
  • patency was established in all 13 cases, and the patency rate was 100% (ecto-ATPDase-1 to 13). In all 13 cases, no thrombus was observed.
  • the patency rate of the ecto-ATPDase I stent is 100% while the patency rate of stents other than the present invention is 27%, and the thrombus incidence rate of stents other than the present invention is 82%.
  • the thrombosis rate of the ecto-ATPDase I stent is 0%, the stent according to the present invention has a remarkable lumen patency maintenance performance (luminal stenosis suppression performance) and a thrombus formation suppression function. Can be recognized.
  • FIG. 12 shows a photograph of (a) ecto-ATPDase I stent and (b) BMS, showing the state.
  • BMS the inner wall of the blood vessel bulges in various places, and it sags red and most of the stent is completely hidden.
  • the ecto-ATPDase I stent has a light pink color similar to that of a normal lumen. The portion is not seen, and a thin skin (new thin film) that uniformly covers the stent is formed.
  • This skin is so thin that the stent can be seen through. From these observations, the remarkable lumen patency maintenance performance and the thrombus formation prevention function in the stent of the present invention can be recognized. Especially, regarding the formation of a thin skin on the inner wall surface of the lumen, BMS swells (stenosis, In the case of a general DES not related to the present invention, even a thin skin is not formed because of a relatively strong blocking action of bulging (new intimal formation). Therefore, it can be said that it is a unique action of the human ecto-ATPDase I stent, and is a factor of the remarkable effect of the human ecto-ATPDase I stent.
  • the stent of the present invention is a medical instrument that can be used for the formation of living body lumens related to vascular tissues, such as PTCA, and has a very good lumen patency rate. Since it is possible to prevent thrombus generation that was difficult to prevent at a high level, it can be used widely.
  • (A) is a photograph showing the results of X-gal staining of a rabbit femoral artery placement of a pBS CAG lacZ plasmid introduced gelatin-coated stent
  • (b) is a similar photograph relating to BMS. It is a graph which shows the expression level of the mRNA after 3 and 7 days which concerns on the placement of various stents with respect to a rabbit femoral artery. It is a figure which shows the dyeing

Abstract

【課題】血小板血栓の形成を抑制可能であるステントを提供する。 【解決手段】ＰＴＣＡで用いられるステントであって、波形状を輪にした主部位を複数同軸に並べ、それらの間をコネクタで接続してなるステント基体を有するものにあって、ステント基体の表面全体に、ecto-ATPDaseをコードするＤＮＡに係る核酸含有複合体をコーティングして形成した。核酸含有複合体は、当該ＤＮＡを組み込んだプラスミドと、正に荷電した水不溶性の生分解性高分子とを含有し、生分解性高分子の分解によってプラスミドを放出し得る。

Description

ステント
　本発明は、血管組織によって形成される管腔に留置されるステントに関する。
　従来のステントとして、下記特許文献１に記載のものが知られている。このステントは、遺伝子や薬剤を溶出により徐放するものであって（Drug Eluting Stent，ＤＥＳ）、抗ＭＣＰ－１抗体、ＭＣＰ－１アンタゴニスト、又はＭＣＰ－１ドミナントネガティブをコードする遺伝子を含有する高分子材料で被覆されており、経皮的冠状動脈血管形成術（ＰＴＣＡ）に用いられる。
　一方、前記遺伝子とは異なる遺伝子であって、本願発明者により発見されたものがある（下記非特許文献１）。この遺伝子は、Ｉ型とII型が存在する。この遺伝子は、次のようにして取得した。即ち、まず、ＡＴＰ分解酵素（ＡＴＰジホスホヒドロラーゼ，ATPDase)の一種であるヒトＣＤ３９タンパク質に対する抗ヒトＣＤ３９抗体を、ヒト胎盤から抽出したタンパク質群に作用させ、抗ヒトＣＤ３９抗体の抗原部位を有する各種のタンパク質を獲得した。次に、獲得した各種タンパク質について、アミノ酸配列の一部を決定し、ヒトＣＤ３９タンパク質の配列とは異なる配列のタンパク質について、その一部のアミノ酸配列からＤＮＡ配列を予測し、プライマーを作成した。続いて、そのプライマーを用い、ヒト胎盤由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ(polymerase chain reaction）法を行った。そして、そのＰＣＲ産物をクローニングし、Ｉ型とII型のＤＮＡを確認した。
　この遺伝子は、ヒトＣＤ３９タンパク質のアイソフォームをコードするが、このアイソフォームは、そのアミノ酸配列から、ＡＴＰ分解酵素であり、活性部位を細胞外に向けているとみられる（エクト－ＡＴＰジホスホヒドロラーゼ，ecto-ATPDase）。
　又、優れた核酸徐放性を呈する核酸含有複合体として、本願発明者により別途発明されたものがある（下記特許文献２）。この核酸含有複合体は、核酸と正に荷電した水不溶性の生分解性高分子とを含有し、当該生分解性高分子の分解によって核酸を放出する。
特開２００５－２８１２４０号公報 Yoshihiro Fujimura 他, The cDNA cloning of human placental ecto-ATP diphosphohydrolases I and II, FEBS Letters 453 (1999), 335-340p 特開２００１－１９９９０３号公報
　近時、ＰＴＣＡにおいて、ステント留置部に血小板血栓が形成され、亜急性に冠動脈を閉塞させるという重篤な合併症の発生が報告されている。しかし、特許文献１のステントは、単にＤＥＳでない通常のステントと比較して血管再狭窄の発生率を若干低減することができるに留まるもので、血小板血栓に対して全く用をなさない。
　そこで、請求項１に記載の発明は、血小板血栓の形成を抑制可能であるステントを提供することを目的としたものである。
　上記目的を達成するために、請求項１に記載の発明は、血管組織によって形成される管腔に留置されるステントであって、ステント本体と、留置後に前記ステント本体から放出され、周辺血管組織のエクト－ＡＴＰジホスホヒドロラーゼの濃度を上昇させる上昇ファクタとを有することを特徴とするものである。
　請求項２に記載の発明は、上記目的に加えて、周辺血管組織におけるタンパク質の合成系を利用することにより、比較的長期にわたり周辺血管組織のエクト－ＡＴＰジホスホヒドロラーゼの濃度を上昇させ続ける目的を達成するため、上記発明にあって、前記上昇ファクタは、ヒト胎盤由来のエクト－ＡＴＰジホスホヒドロラーゼをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターＤＮＡであることを特徴とするものである。
　請求項３に記載の発明は、上記目的に加えて、エクト－ＡＴＰジホスホヒドロラーゼに係る上昇ファクタを徐放することで、比較的長期にわたり周辺血管組織のエクト－ＡＴＰジホスホヒドロラーゼの濃度を上昇させ続ける目的を達成するため、上記発明にあって、前記ステント本体は、ステント基体と、前記ステント基体の表面の少なくとも一部を被覆し、前記上昇ファクタを担持し、留置後に徐々に分解することによって前記上昇ファクタを徐々に放出する担持体とを有することを特徴とするものである。
　請求項４に記載の発明は、上記目的に加えて、管腔等への影響を更に少なくする目的を達成するため、上記発明にあって、前記担持体は、生分解性高分子を含有することを特徴とするものである。
　請求項５に記載の発明は、上記目的に加えて、徐放速度を調整可能とし、エクト－ＡＴＰジホスホヒドロラーゼの濃度を長期にわたり適量に維持可能として、より一層高水準の血小板血栓形成抑制性能を発揮させる目的を達成するため、上記発明にあって、前記生分解性高分子は、正に荷電しており、水溶性であることを特徴とするものである。
　請求項６に記載の発明は、上記目的に加えて、管腔等への影響を更に少なくし、血栓抑制性能を発揮させる目的を達成するため、上記発明にあって、前記生分解性高分子は、ゼラチンであることを特徴とするものである。
　本発明によれば、エクト－ＡＴＰジホスホヒドロラーゼを血管組織に係るステントに組み合わせることでステントにおける課題を的確に解決し得ることを試行錯誤のうえ見出し、エクト－ＡＴＰジホスホヒドロラーゼを血管組織に効果的に作用させるためにステントへの適合化を図ったので、極めて良好な血栓抑制性能を呈することができる、という効果を奏する。
　以下、本発明に係る実施の形態の例につき、適宜図面に基づいて説明する。なお、本発明の形態は、当該例に限定されない。
［ステントの構成等］
　本願発明者等は、エクト－ＡＴＰジホスホヒドロラーゼ（ecto-ATPDase）におけるＡＤＰとＡＴＰをＡＭＰに分解する機能が、血小板の凝集防止や新生内膜増殖の抑制に役立つことを、ecto-ATPDaseやこれをコードする遺伝子の構造解析あるいは実験等の多面的検討により見出し、更に特にステントの課題解決に資する可能性に着眼し、留置時に管腔内で血管組織のecto-ATPDaseの濃度を上昇させるステント、具体的には血管内皮または内膜のecto-ATPDaseの濃度を上昇させるステントを作成した。
　即ち、本発明のステントは、血管組織によって形成される冠状動脈に留置されるＰＴＣＡに用いるものとした。又、本発明のステントでは、ステント基体につき、波形状を輪にした主部位を複数同軸に並べ、それらの間をコネクタで接続したデザインとし、このデザインで金属管を切断することで形成した。
　なお、ステント基体は、通常のステント（金属のみから成るステント、ベアメタルステント、ＢＭＳ）と同様に成る。又、金属管は、ここではステンレス管であるが、ニッケルチタン等の超弾性金属の管や、他の金属管であって良い。更に、ステント基体は、ここでは金属管をレーザーにより切断することで形成しているが、金属管のエッチングや線材の折り曲げ・編み込み等により形成することもできる。又更に、ステント基体のデザインも、単一の主部位のみからなるものとしたり、網状の管等としたりして良い。加えて、ステント基体（ステント本体）を、生分解性材料製としたり、複数の材料を組み合わせて形成したりすることができる。
　又、本発明のステントは、ステント基体の表面全体に、ecto-ATPDaseをコードするＤＮＡに係る核酸含有複合体をコーティングして形成した。
　そして、当該ステントでは、ecto-ATPDaseをコードするＤＮＡとして、配列番号１のＤＮＡが、ベクターＤＮＡであるプラスミドに組み込まれたものを用いている（ecto-ATPDaseＩステント）。ここで、配列番号１のＤＮＡは、本願発明者が発見したＩ型のヒトecto-ATPDaseの遺伝子配列のうち、１８６番目より前及び１７３８番目より後を除いたものであって、１８７番目から１７３７番目に相当するものである。なお、配列番号１のＤＮＡからコードされるecto-ATPDaseをecto-ATPDaseＩという。
　又、ecto-ATPDaseＩステントにおいて、核酸含有複合体は、当該組込後のプラスミドと、正に荷電した水不溶性の生分解性高分子とを含有し、生分解性高分子の分解によって核酸を放出し得る（特開２００１－１９９９０３号参照）。ここでは、生分解性高分子はゼラチンである。又、ゼラチンは、正荷電基（アミノ基）を導入することで、正に荷電させている。ゼラチンは、管腔内に留置されると、徐々に分解され、それに伴い、担持したecto-ATPDaseをコードするＤＮＡを徐々に放出するから、本発明のステントは、核酸含有複合体のコーティングにより、ＤＥＳとなる。ゼラチンは、正に荷電しているから、ＤＮＡの有する負の電荷と強力に結合（イオン結合）し、よってプラスミドを安定して担持して、プラスミドの安定した徐放性に寄与する。又、水不溶性であるから、生分解性高分子の管腔内での分解性に応じて核酸の放出を制御することができ、即ちプラスミドの徐放速度を制御することができる。
　なお、ここではゼラチン（生分解性高分子）が担持体を構成し、ステント基体及び担持体がステント本体を構成し、ecto-ATPDaseをコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドが上昇ファクタを構成する。又、核酸含有複合体は、ステント基体の表面の一部に塗布するようにしても良い。更に、生分解性高分子としてコラーゲン等を用いることができる。加えて、生分解性高分子の正の荷電について、本来正に荷電している生分解性高分子を用いることによって良いし、アミノ基以外の正荷電基を導入することによっても良い。
　又、ベクターＤＮＡとしてプラスミド以外のものを用いて良いし、ecto-ATPDaseをコードするＤＮＡとして、ecto-ATPDaseIIのＤＮＡを組み込んだものや、配列番号１及びecto-ATPDaseIIのＤＮＡを組み込んだものや、配列番号１及び／又はecto-ATPDaseIIに係るＤＮＡの混合物や、これらの任意に組み合わせたものを用いて良い。ここで、ecto-ATPDaseIIとは、ヒトecto-ATPDaseIIＤＮＡ（ＥＭＢＬアクセッション番号：ＡＪ１３３１３４）を組み込んだプラスミドから生成されるヒトＣＤ３９タンパク質のアイソフォームである。
［実施例］
（ｐＢＳ ＣＡＧ ecto-ATPDaseＩプラスミドの構築）
　ヒトecto-ATPDaseＩの遺伝子配列を組み込んだｐＢＳ ＣＡＧ ecto-ATPDaseＩプラスミドを以下の手順で構築した。
　ecto-ATPDaseＩのゲノムＤＮＡ配列を図１ないし図４に示す。本実施例では、ecto-ATPDaseＩを発現するため、ecto-ATPDaseＩのｃＤＮＡ配列として、ＥＭＢＬのデータベースに登録されているｃＤＮＡ配列（アクセッション番号：ＡＪ１３３１３３、図５）のうち、第１８７番目～第１７３７番目（１５５０ｂｐ）にコードされた領域を使用した（図５の枠内、配列番号１）。
　配列番号１に係る遺伝子配列にＦＬＡＧタグ配列を結合させ、ＦＬＡＧ－ヒトecto-ATPDaseＩを発現するｐＣＩ ＣＭＶ ＦＬＡＧ ecto-ATPDaseＩプラスミドを共同発明者の藤村吉博氏より入手した。
　ｐＣＩ ＣＭＶ ＦＬＡＧ ecto-ATPDaseＩプラスミドを構築した際の、ＦＬＡＧ－ヒトecto-ATPDaseＩのＤＮＡ断片は、以下の条件のＰＣＲ反応にて増幅した。即ち、ＦＬＡＧ－ヒトecto-ATPDaseＩを増幅するためのプライマーセットとして、ＦＬＡＧタグ配列を含んだ上流側プライマー（５’－ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＧＡＡＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＣＡＡＧＣＣＡ－３’）及び下流側プライマー（５’－ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＡＣＣＡＴＡＴＣＴＴＴＣＣＡＧ－３’）を用いた。
　反応液につき、鋳型ｃＤＮＡ（鋳型ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー、タカラバイオ社より購入）１００ｎｇ、０．３μｍのプライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰｓ、１ｘＰＣＲバッファー（Ｐｆｘ ＤＮＡ polymeraseに添付のもの）、１ｕｎｉｔ Ｐｆｘ ＤＮＡ polymerase（invitrogen社より購入）の組成にて調整した。又、ＦＬＡＧ－ヒトecto-ATPDaseＩのＰＣＲ条件は、９４度で５分間熱変性後、９４度で３０秒間、５５度で３０秒間、７２度で３０秒間の反応を２５回繰り返し、最後に７２度で７分間保温する、というものである。このＰＣＲ断片を、ｐＣＩ ＣＭＶ クローニングベクター(Promega社より購入）に挿入し、ｐＣＩ ＣＭＶ ＦＬＡＧ ecto-ATPDaseＩプラスミドを得た。
　次に、ｐＣＩ ＣＭＶ ＦＬＡＧ ecto-ATPDaseＩプラスミドのＥｃｏ ＲＩサイトを、Ｈｉｎｄ IIIサイトに置換した後、Ｈｉｎｄ III及びＳａｌ Ｉで切断し、Ｈｉｎｄ III－Ｓａｌ Ｉ断片（ＦＬＡＧ－ヒトecto-ATPDaseＩ配列）を切り出した。これを、望月直樹氏より入手した、ｐBluescriptII ＳＫ（＋）ベクターのプロモーターをＣＡＧプロモーターに置換したｐＢＳ ＣＡＧ ベクターのＨｉｎｄ III－Ｓａｌ Ｉ切断サイトへ挿入し、本発明のステント作製に使用するｐＢＳ ＣＡＧ ecto-ATPDaseＩプラスミドを得た（図６）。
（ｐＢＳ ＣＡＧ ｌａｃＺプラスミドの構築）
　ウサギ大腿動脈の、血管内皮と血管内膜とからなる周辺血管組織に対し、遺伝子が作用し発現することを確認するため、遺伝子発現の確認に一般的に用いられるｌａｃＺ発現ユニット（ＳＶ４０ earlyプロモーターより支配）を有するｐＢＳ ＣＡＧ ｌａｃＺプラスミドを構築した。なお、ｐＢＳ ＣＡＧ ｌａｃＺプラスミドは、前述したｐBluescriptII　ＳＫ（＋）プラスミドのプロモーターをＣＡＧプロモーターに置換したものを使用した。
　上記のｐＢＳ ＣＡＧ ecto-ATPDaseＩプラスミド、又はｐＢＳ ＣＡＧ ｌａｃＺプラスミドを導入させた大腸菌ＤＨ５α（TOYOBO社より購入）をＬＢ培地にて摂氏３７度（以下摂氏を省略）で一晩培養し、Quiagen Miniprep（Quiagen社より購入)を用い、試薬メーカーの推奨するプロトコールに従って、ステント作製に使用するプラスミドを回収した。
（血管組織におけるｐＢＳ ＣＡＧ ｌａｃＺプラスミドの発現確認）
　ウサギ大腿動脈の周辺血管組織に対し遺伝子が作用して発現することをＸ－ｇａｌ染色によって確認するため、まず、上述したｐＢＳ ＣＡＧ ｌａｃＺプラスミドに係る核酸含有複合体を、ウサギ大腿動脈に適合するステント基体に対しコーティングしたもの（ｌａｃＺステント）を１０個作成し、ウサギ大腿動脈にそれぞれ留置した。なお、核酸含有複合体の生分解性高分子として、正に帯電させたゼラチンを用いた。
　そして、うち４個のｌａｃＺステントを３日後に周辺血管組織ごと摘出してＸ－ｇａｌを添加したところ、４例で発色が認められ、ｌａｃＺの発現が確認された。又、別の６個のｌａｃＺステントについて７日後に同様の操作をしたところ、５例で発色が認められ、ｌａｃＺの発現が確認された。なお、図７に、７日後に係る１例の写真（ａ）、及びＢＭＳに対し同様の操作をしたものの写真（ｂ）を示す。図７（後記図１２も同様）では、円筒形のステントないし動脈が面状に切り開かれている。
（ｐＢＳ ＣＡＧ ecto-ATPDaseIプラスミドの発現確認）
　ウサギ大腿動脈の周辺血管組織に対し遺伝子が作用して発現し、これにより周辺血管組織においてタンパク質が合成される前段階としてｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）が発現することを確認するため、上述したｐＢＳ ＣＡＧ ecto-ATPDaseIプラスミドを使用したステント（ecto-ATPDaseＩステント）を２個作成した。又、比較のため、ウサギ大腿動脈に適合するＢＭＳを２個作成し、更に、ステント基体にゼラチンのみをコーティングしたウサギ大腿動脈に適合するステントを２個作成した。そして、それぞれのステントから抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、以下に述べるリアルタイムＰＣＲ法によってヒトecto-ATPDaseIに係るｍＲＮＡの発現量をβ-actinに係るｍＲＮＡの発現量で補正することで発現量の変化を把握した。
　前記ecto-ATPDaseＩステントをウサギ大腿動脈に留置して３日後と７日後、ステント留置部血管を摘出し、摘出した検体の一部（約２０～３０ｍｇ）から、TRIzol Reagent（Invitrogen社から購入）を用い、従来公知の方法で、全ＲＮＡを抽出した。次に、その抽出した全ＲＮＡに対し、Superscript II kit（Invitrogen社から購入）とＲＮＡａｓｅ　ｏｕｔ（Invitrogen社から購入）を用い、試薬メーカーの推奨するプロトコールにしたがってｃＤＮＡを合成した。
　各サンプルの合成ｃＤＮＡを用い、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System（Applied Bisystems社製）でリアルタイムＰＣＲを行った。ヒトecto-ATPDaseＩを検出するためのプライマーセットとして、上流側プライマー（５’－ＣＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＡＧＧＧＡＡＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＣ－３’）及び下流側プライマー（５’－ＡＧＣＡＣＡＡＴＣＣＣＡＴＡＣＴＴＡＡＣＧ－３’）を用いた。また、コントロールのβ-actinを検出するためのプライマーセットとして、上流側プライマー（５’－ＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＡＴＧＴＴＴＧ－３’）及び下流側プライマー（５’－ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＣＧＣＡＧＧＡＴＧ－３’）を用いた。
　反応液の組成については、QuantiTsct SYBR Green PCR kit（Quiagen社より購入）を用い、試薬メーカーの推奨するプロトコールにしたがって調整した。ＰＣＲ条件は、９５度で１５分間熱変性後、９４度で２０秒間、５８度で３０秒間、７２度で３０秒間の反応を４５回繰り返した。
　以上についての結果を図８に示す。３日間留置したＢＭＳ（ＢＭＳ(３)）や７日間留置したＢＭＳ（ＢＭＳ(７)）、ないし７日間留置したゼラチンコーティングステント（ＣＧ(７)）では、ecto-ATPDaseＩプラスミドに係るｍＲＮＡはほとんどみられず、３日間留置したゼラチンコーティングステント（ＣＧ(３)）は前３者と比べると当該ｍＲＮＡの発現量が多いものの、ベータアクチンに係るｍＲＮＡの量との比率で０．１２程度と、やはりecto-ATPDaseＩプラスミドに係るｍＲＮＡはほとんど発現していない。一方、本発明に係るヒトecto-ATPDaseIステントでは、３日間の留置で２．３５もの比率においてecto-ATPDaseＩプラスミドに係るｍＲＮＡが発現しており（ecto-ATPDase(３)）、７日間の留置でも１．０１の比率においてecto-ATPDaseＩプラスミドに係るｍＲＮＡが発現している。このように、本発明に係るヒトecto-ATPDaseＩステントでは、他のステントと比較して顕著にecto-ATPDaseＩプラスミドに係るｍＲＮＡが発現しているといえ、よって、本発明に係るステントの留置において、血管周辺組織にecto-ATPDaseＩをコードする遺伝子が発現してｍＲＮＡが発現するという、ecto-ATPDaseＩの発現プロセスの進行が確認できたことになる。
（ウエスタンブロッティングによるecto-ATPDaseＩ発現の検定）
　更に、ヒトecto-ATPDaseＩの生成を確認するため、上記と同様に、ＢＭＳ，ＣＧステント，ｌａｃＺステント，ecto-ATPDaseＩステントを作成し、それぞれウサギ大腿動脈に７日間留置した。ステント留置後の周辺血管組織をステントごと摘出し、ステントを除いたステント留置部血管を細かく切断した。次に、氷冷した５００μＬのホモジェナイズバッファー（１００ｍＭのTris-HCl（ｐＨ７．５）、０．２％のTriton X-100、１ｍＭのＰＭＳＦ）が分注されたチューブに切断後のサンプルを入れ、４度を維持した状態でホモジェナイズした。ホモジェナイズ後の上清を新しいチューブに移し、４度を維持したまま、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心した。再度上清を回収し、ＢＣＡ測定法にてタンパク濃度を測定した。又、比較のため、ウサギ大腿動脈のみ（Rabbit normal artery）からタンパク質を分離し、同様にヒトecto-ATPDaseIの存在の有無を確認するコントロールとして使用した。
　次いで、各サンプルの１レーンに対して１０μｇずつのタンパクをSuperSep７．５％を用いて電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（Amersham Biosciences社より購入）に転写した。転写された膜は、１０％スキムミルク／ＴＢＳＴ（２０ｍＭのTris-HCl（ｐＨ７．５））、１５０ｍＭのNaCl、０．１％のTween20)で３０分ブロッキングした後、１０％スキムミルク／ＴＢＳＴで2000倍に希釈した一次抗体反応液（抗ＦＬＡＧ　Ｍ２モノクローナル抗体：SIGMA；Cat.No.F-3165）に移し、４度で一晩反応させた。次いで、１０％スキムミルク／ＴＢＳＴで2000倍に希釈した二次抗体反応液（ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体：ＩＢＬ；Cat.No.17601）に移し、室温で４５分反応させた後、ECL plus Western Blotting Detection System（Amersham Biosciences社より購入）で発色させた。
　観察の結果、図９に示すように、ecto-ATPDaseＩステントのみ７５ｋＤａ（ヒトecto-ATPDaseＩの推定分子量）のバンドの存在が認められ、よって本発明に係るステントのみ周辺血管組織においてヒトecto-ATPDaseＩが生成されていることが確認された。又、以上を併せ、本発明に係るステントのみ、ヒトecto-ATPDaseＩをコードするプラスミドがステントから徐放されて周辺血管組織に取り込まれ、それにより血管中のecto-ATPDaseＩの濃度が上昇することが合理的に予想できる。
　なお、ヒトecto-ATPDaseIIＤＮＡを組み込んだプラスミド（核酸含有複合体）に係るステントや、このプラスミドと本実施例における配列番号１のＤＮＡを組み込んだプラスミドとを含有する核酸含有複合体に係るステントにあっても、同様にecto-ATPDaseII（及びecto-ATPDaseＩ）の発現等が確認された。
（ステントの留置）
　そこで、各種ステントの留置状態を確認すべく、前記ecto-ATPDaseＩステントであって、ウサギ大腿動脈に適合するものを１３個作成した。このうち５個は、上述したｐＢＳ ＣＡＧ ecto-ATPDaseＩプラスミドのプロモータをＣＭＶに変換したプラスミドを用いたものであり（ecto-ATPDase-1～5)、別の８個は上述したｐＢＳ ＣＡＧ ecto-ATPDaseＩプラスミドを用いたものである（ecto-ATPDase-6～13）。　
　又、前記と同様に、ｐＢＳ ＣＡＧ ｌａｃＺプラスミド含有複合体をウサギ大腿動脈に適合するステント基体に対しコーティングしたｌａｃＺステントを、別途５個作成した（lacZ-1～5)。更に、ステント基体にゼラチンのみをコーティングしたウサギ大腿動脈に適合するステントを、別途８個作成した（CG-1～8)。加えて、ウサギ大腿動脈に適合するＢＭＳを、別途９個作成した（BMS-1～9）。
　そして、これら各種のステントをそれぞれウサギ大腿動脈に留置し、７日後に当該血管を造影して、開存あるいは閉塞しているか（angio：○;開存,×;閉塞）、白色血栓が認められるか（+++：留置部全体で認められる，++：大部分で認められる，+：若干認められる，-：認められない)等、その様子を観察した。図１０，図１１は、その観察の結果の表，グラフである。
　ＢＭＳでは、ＢＭＳ-3,7 の２例が開存していたが、他の７例で閉塞が認められ、開存率は２２％であった。又、開存例の双方ともに血栓が若干認められ、閉塞例では、血栓が１例で若干存在し（BMS-6)、２例で大部分に発生し（BMS-8,9)、４例で全体に発生した（BMS-1,2,4,5)。
　ゼラチンのみコーティングしたステントでは、CG-5～7 の３例で開存し、血栓の発生もなかったが、他の５例で閉塞が認められ、開存率は３７％であった。又、閉塞例中、１例で血栓が若干認められ（CG-3）、１例で大部分に認められ（CG-8）、３例で全体に認められた（CG-1,2,4)。
　ｌａｃＺに係るステントでは、ｌａｃＺ-2のみ開存し、血栓の発生もなかったが、他の４例で閉塞が認められ、開存率は２０％であった。又、閉塞例中、１例で血栓が若干認められ（lacZ-4）、３例で全体に認められた（lacZ-1,3,5）。
　そして、以上の本発明以外のステントの結果を総合すると（ecto-ATPDase(-)total）、開存が６例、閉塞が１６例となり、開存率は２７％となる。なお、血栓が生じなかったのは２２例中４例であり、僅かに認められたのが５例、大部分に認められたのが３例、全体に認められたのが１０例である。
　一方、ecto-ATPDaseＩステントでは、１３例全てで開存し、開存率は１００％であった（ecto-ATPDase-1～13）。又、１３例全てにおいて、血栓の発生も認められなかった。
　このような血管造影結果によれば、本発明以外のステントの開存率２７％に対しecto-ATPDaseＩステントの開存率は１００％であり、更に本発明以外のステントの血栓発生率８２％に対しecto-ATPDaseＩステントの血栓発生率は０％である等といったことから、本発明に係るステントにあっては、顕著な管腔開存維持性能（管腔狭窄抑制性能）、並びに血栓形成抑制機能を認めることができる。
　又、留置時の管腔内壁等の様子を直接観察すべく、同様にＢＭＳとecto-ATPDaseＩステントとを作成して留置し、７日後に周辺血管組織ごと摘出して切り開いた。図１２に、その状態を表す（ａ）ecto-ATPDaseＩステント，（ｂ）ＢＭＳに係る写真を示す。ＢＭＳでは、血管内壁が各所で膨出し、赤くタダレてステントの大部分が完全に隠れてしまっているが、ecto-ATPDaseＩステントでは、正常な管腔と同様の薄桃色を呈しており、膨出部分は見受けられず、ステントを均一に覆う薄皮（新生薄膜）が形成されている。この薄皮は、ステントが透けて見える程の薄さである。このような観察からも、本発明のステントにおける顕著な管腔開存維持性能、並びに血栓形成防止機能を認めることができ、特に管腔内壁表面における薄皮の形成について、ＢＭＳでは膨出（狭窄，閉塞）に進行するためこのような作用を行うことはなく、本発明に係らない一般のＤＥＳでは膨出（新生内膜形成）の比較的強い阻止作用のために薄皮すら形成されないのでやはりこのような作用を行うことはなく、従ってヒトecto-ATPDaseＩステント独自の作用であるといえ、ヒトecto-ATPDaseＩステントの顕著な効果の要因となっているといえる。
　なお、ecto-ATPDaseIIのＤＮＡを組み込んだプラスミド（核酸含有複合体）に係るステントや、このプラスミドとecto-ATPDaseＩのＤＮＡを組み込んだプラスミドとを含有する核酸含有複合体に係るステントにあっても、同様に極めて良好な開存率や血栓発生防止性を呈した。
　本発明のステントは、ＰＴＣＡを始めとする、血管組織に関する生体管腔の形成術に使用可能な医療用器具であり、管腔の開存率を極めて良好なものとし、更に従来のステントでは効果的に防止し難かった血栓の発生を高水準で防止することができるため、幅広い利用が可能である。
本発明に用いるecto-ATPDaseＩのゲノムＤＮＡ配列の前部を示す図である。 図１に続く部分を示す図である。 図２に続く部分を示す図である。 図３に続く部分を示す図である。 ecto-ATPDaseＩ発現に用いたecto-ATPDaseＩのｃＤＮＡ配列に係る元のｃＤＮＡ配列を示す図である。 本発明のステント作製に使用するｐＢＳ ＣＡＧ ecto-ATPDaseＩプラスミドを示す図である。 （ａ）はｐＢＳ ＣＡＧ ｌａｃＺ plasmid 導入 ゼラチンコーティングステントのウサギ大腿動脈留置に係るＸ－ｇａｌ染色の結果を示す写真であり、（ｂ）はＢＭＳに係る同様の写真である。 ウサギ大腿動脈に対する各種ステントの留置に係る３，７日後のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 ウサギ大腿動脈に対する各種ステントの留置ないしウサギ通常動脈に係る７日後のwestern blotting法による染色結果を示す図である。 ＢＭＳ，ＣＧステント，ｌａｃＺステント及び本発明に係るステント（ecto-ATPDase plasmid 導入 ゼラチンコーティングステント）のウサギ大腿動脈留置７日後の血管造影結果を示す表である。 ＢＭＳ，ＣＧステント，ｌａｃＺステント及び本発明に係るステント（ecto-ATPDase plasmid 導入 ゼラチンコーティングステント）のウサギ大腿動脈留置７日後の血管造影結果を示すグラフである。 ウサギ大腿動脈留置の状態を表す（ａ）本発明のステント（ｐＢＳ ＣＡＧ ecto-ATPDase plasmid 導入 ゼラチンコーティングステント），（ｂ）ＢＭＳに係る写真である。

Claims (6)

  1. 　血管組織によって形成される管腔に留置されるステントであって、
    　ステント本体と、
    　留置後に前記ステント本体から放出され、周辺血管組織のエクト－ＡＴＰジホスホヒドロラーゼの濃度を上昇させる上昇ファクタと
    を有することを特徴とするステント。
  2. 　前記上昇ファクタは、ヒト胎盤由来のエクト－ＡＴＰジホスホヒドロラーゼをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターＤＮＡである
    ことを特徴とする請求項１に記載のステント。
  3. 　前記ステント本体は、
    　ステント基体と、
    　前記ステント基体の表面の少なくとも一部を被覆し、前記上昇ファクタを担持し、留置後に徐々に分解することによって前記上昇ファクタを徐々に放出する担持体と
    を有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のステント。
  4. 　前記担持体は、生分解性高分子を含有する
    ことを特徴とする請求項３に記載のステント。
  5. 　前記生分解性高分子は、正に荷電しており、水溶性である
    ことを特徴とする請求項４に記載のステント。
  6. 　前記生分解性高分子は、ゼラチンである
    ことを特徴とする請求項４又は請求項５に記載のステント。
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