WO2009103494A2 - Sgk1 als therapeutisches und diagnostisches target für karzinomatöse erkrankungen - Google Patents

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    • G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases

Definitions

  • the present invention relates to substances for the therapeutic treatment and diagnosis of carcinomas, a diagnostic method and a related diagnostic kit.
  • Serum and glucocorticoid-dependent kinase-1 (sgk1, serum and glucocorticoid dependent kinase) is a protein found to be ubiquitous in eukaryotic cells. Sgk1 is under the control of cellular stress, such as cell shrinkage, and hormones, such as gluco- and mineralocorticoids. Sgk1 is activated by insulin and growth factors via phosphatidylinositol 3-kinase and PDK1 (3-phosphoinositide dependent kinase-1).
  • Sgk1 was originally cloned from rat breast carcinoma cells (Webster MK, Goya L, Firestone GL, J. Biol. Chem. 268 (16): 11482-11485, 1993; Webster MK, Goya L, Ge Y, Maiyar AC, Firestone GL, Mol. Cell Biol. 13 (4): 2031-2040, 1993).
  • the human kinase hsgk was cloned as a cell volume-regulated gene from liver cells (Waldegger S, Barth P, Raber G, Lang F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4440-4445, 1997).
  • the hsgk is also expressed in the brain (Waldegger S 1 Barth P 1 Raber G, Lang F. Proc Natl Acad., USA 94: 4440-4445, 1997), where it regulates the voltage-dependent K + channels Kv1.3 , It has been shown that these Kv1.3-type K + channels are involved in the regulation of neuronal excitability (Pongs O. Physiol., Rev.
  • Kv1.3 is also important in the regulation of lymphocyte proliferation and function (Cahalan MD and Chandy KG, Cur Opin Biotech 8 (6): 749-756, 1997).
  • Two further members of the sgk family were cloned, the sgk2 and sgk3 (Kobayashi T, Deak M, Morrice N 1 Cohen P. Biochem., J. 344: 189-197, 1999).
  • the sgk form a serine-threonine protein kinase family that can be transcriptionally and post-transcriptionally regulated.
  • the sgk2 and sgk3 are replaced by z.
  • insulin and IGF1 are activated via the PI3 kinase pathway.
  • complete characterization of the sgk protein family has not yet taken place.
  • sgk1 has also been recognized as a valuable target for therapeutic and diagnostic applications.
  • DE 197 08 173 has shown that the hsgki can be pathophysiologically influenced in many diseases which are influenced by cell volume change, such as hypernatremia, hyponatremia, diabetes mellitus, renal insufficiency, hypercatabolism, hepatic encephalopathy and microbial or viral infections. has considerable diagnostic potential.
  • DE 199 17 990 describes kinase inhibitors, such as, for example, staurosporine, chelerythrine or transdominant inhibitory kinase, which can be used in the therapy of cell-volume-dependent diseases.
  • WO 2004/079003 A1 discloses the use of sgk1 as a diagnostic and therapeutic target for coagulopathies, angiopathies, pulmonary hypertension and arteriosclerosis.
  • the invention therefore has as its object to provide therapeutic and diagnostic applications for carcinomatous diseases using sgk1 as the target molecule (target).
  • sgk1 is suitable as a therapeutic and diagnostic target molecule for the prophylaxis and treatment of carcinomatous disorders.
  • a substance for the prophylaxis and / or treatment of carcinomas, wherein the substance influences the expression and / or activity of sgk1.
  • said substance can stimulate the expression or activity of sgk1.
  • said substance inhibits or inhibits the expression and / or activity of sgk1.
  • activity is to be understood as meaning above all the enzyme activity of sgk1.
  • the substance is an anti-sgk1 substance.
  • said substance is an anti-sgk1 antibody.
  • anti-sgk1 antibodies which may be monoclonal or polyclonal antibodies, is well known to those skilled in the art.
  • Corresponding antibodies can be produced, for example, by administering to animals, for example pigs or horses, protein fragments of sgk1 for immunization purposes. After administration of the sgk1 fragments, these animals produce specific anti-sgk1 antibodies, which can be isolated and purified by standard procedures.
  • the substance is directed against activators, inhibitors, regulators, biological precursors, variants, in particular isoforms of sgk1.
  • the compounds listed above may be, for example, up- and / or downstream members of the sgk1 signal transduction cascade, transcription factors responsible for the expression level of sgk1, and / or proteases useful for the proteolytic degradation of activators, inhibitors, regulators, biological precursors or variants of sgk1 are responsible.
  • Suitable activators are, for example, the phosphatidylinositol 3-kinase mentioned at the beginning and PDK1.
  • As an inhibitor for example, the ubiquitin ligase Nedd4-2 into consideration.
  • the transcription factors may, for example, be at least one factor from the group Forkhead transcription factor FKHRLI, ⁇ -catenin and NFKB (nuclear-factor-kappa-B).
  • the substance may be a polynucleotide which codes for a peptide, preferably a polypeptide, which influences, in particular inhibits, the expression and / or activity of sgk1.
  • the substance is a "small molecular compound", preferably a "small molecular compound” having a molecular weight (MW) ⁇ 1000.
  • the substance is a Kinase inhibitor is.
  • the substance is preferably selected from the group consisting of staurosporine, chelerythrine, SB 203580 (MW 377.4), SB 202190 (MW 331, 3) and derivatives derived therefrom.
  • the kinase inhibitors SB 203580 and SB 202190 are imidazole derivatives which are described, for example, by CaI Biochem. be sold commercially.
  • the substance is a mandelic acid hydrazide derivative.
  • the substance is preferably a compound of the formula I.
  • R 1 , R 2 are each independently H, CHO or acetyl
  • R 8 , R 9 , R 10 , R 11 are each independently
  • R 3 and R 4 , R 7 and R 8 or R 8 and R 9 together also alkylene with 3, 4 or 5 C
  • A is unbranched or branched alkyl having 1-6 C atoms, in which 1-7 H atoms may be replaced by F, or cyclic alkyl having 3-7 C atoms,
  • Ar is unsubstituted or mono-, di- or trisubstituted by Hal, A, OR 12 , N (R 12 ) 2 , NO 21 CN, phenyl, CON (R 12 ) 2 , NR 12 COA, NR 12 CON (R 12 ) 2 , NR 12 SO 2 A, COR 12 , SO 2 N (R 12 ) 2 , S (O) 111 A, - [C (R 12 ) 2 ] n -COOR 12 and / or -O [C (R 12 ) 2 ] O- COOR 12 substituted phenyl, naphthyl or biphenyl,
  • HaI F, Cl, Br or I m is 0, 1 or 2
  • n is 0, 1, 2 or 3
  • o is 1, 2 or 3
  • the substance may in particular be selected from the group of 2,4-dihydroxy-6-methylbenzoic acid N '- [2' (3,4-difluoro-phenyl) -2-hydroxy-acetyl] -hydrazide, 2,4-dihydroxy- 6-methylbenzoic acid N '- [2-hydroxy-2- (3-phenoxyphenyl) acetyl] hydrazide, 2,4-dihydroxy-6-methylbenzoic acid N' - (2-hydroxy-2 -phenyl-acetyl) hydrazide, 2,4-dihydroxy-6-methylbenzoic acid N '- [2-hydroxy-2- (3-chloro-phenyl) -acetyl] -hydrazide, 2,4-
  • the invention further relates to a substance for the diagnosis of carcinomas, wherein the substance is used to detect the expression, activity and / or a gene modification of sgk1 in eukaryotic cells.
  • the substance may be an anti-sgk1 substance, preferably an anti-sgk1 antibody.
  • an antibody can be used in the context of detection methods known to the person skilled in the art, for example ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay).
  • sgk1 enzyme-linked immunosorbant assay
  • a carrier material for example cellulose or polystyrene.
  • immune complexes Upon incubation with a sample containing the antigen (sgk1), immune complexes form on the support material. In a subsequent step, these immune complexes a labeled antibody, which is also directed against the antigen (sgk1) but expediently binds at a different site than the antibody bound on the carrier material.
  • This labeled antibody is usually an antibody-enzyme conjugate, which enzyme is usually alkaline phosphatase or horseradish peroxidase.
  • the addition of the labeled antibody ultimately produces ternary complexes of the antigen (sgk1) and the two antibodies directed against the antigen (sgk1). These ternary complexes can be visualized by the addition of chromogenic substrates, such as para-nitrophenol.
  • the antigen concentration (concentration of sgk1) in the sample can be determined by a photometric determination of the immunocomplex-bound marker enzymes by comparison with standards of known enzyme activity. It is also possible to use antibodies directed against sgk1 in the context of ELIS-POT methods. These methods are sufficiently familiar to the person skilled in the art, so that further explanations on this are dispensed with. As a gene modification of sgk1, nucleotide polymorphisms and / or insertion mutations may be considered.
  • the samples are usually body samples from a patient containing eukaryotic cells. In particular, tissue samples but also samples of body fluids, such as blood, come into question as samples.
  • the substance may be an oligonucleotide, which is suitable, for example with the aid of the so-called polymerase chain reaction (PCR), to selectively amplify certain DNA segments of sgk1 and in this way to provide a preferably quantitative detection of sgk1.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the substance may be an oligo- or polynucleotide which hybridizes with sgk1 under stringent conditions.
  • oligo- or polynucleotides for example, Southern or Northern blots be performed to detect the DNA or RNA content of sgk1 in this way.
  • Corresponding methods are also sufficiently familiar to the person skilled in the art. For example, the transcription rate of sgk1 can also be examined in this way.
  • carcinomas of the present invention are preferably selected from the group of colon carcinoma, breast carcinoma, gastric carcinoma and lung carcinoma.
  • the present invention further relates to a diagnostic kit for the diagnosis of carcinomas.
  • This comprises at least one substance which is suitable for detecting the expression, activity and / or a gene modification of sgk1.
  • the invention comprises an in vitro method for the diagnosis of carcinomas, wherein the expression, activity and / or a gene modification of sgk1 by a preferably quantitative detection in a body sample of a patient with antibodies directed against sgk1, with oligonucleotides, with which, for example, in a Polymerase chain reaction (PCR), amplify certain DN A sections of sgk1, and / or with polynucleotides that hybridize with DNA or mRNA of sgk1 under stringent conditions.
  • tissue samples and / or blood samples may be considered as body samples.
  • it is provided in particular to detect by means of the abovementioned substances also certain mutations, for example insertion mutations, or polymorphisms in sgk1.
  • the present invention also relates to a method for the prophylaxis and / or treatment of carcinomas, in particular in im- ineficient patients, comprising the administration of a therapeutically effective amount of a substance which influences the expression and / or activity of sgk1, preferably inhibited.
  • a substance which influences the expression and / or activity of sgk1, preferably inhibited preferably inhibited.
  • the immunodeficient patients may be, in particular, patients who are under cytostatic or immunosuppressant therapy or who have already had carcinoma.
  • the patients may also be patients who have a genetic predisposition to carcinoma disorders.
  • the invention also relates to the use of a substance for the production of a medicament for the prophylaxis and / or treatment of carcinomas, wherein the substance influences, preferably inhibits, the expression and / or activity of sgk1. Furthermore, the invention also relates to the use of a substance for the production of a diagnostic agent for the diagnosis of carcinomas, wherein the substance is used to detect the expression, activity and / or a gene modification of sgk1. With regard to the substances in question, reference is made to the previous description.
  • FIG. 1 the development of colon carcinomas in sgk1 knockout mice compared to sgk1 wild type mice
  • FIG. 2 the inhibition of colon carcinomas by a sgk1 inhibitor.
  • Figure 1 shows the development of colon carcinomas in sgk1 knockout mice (sgkr 'mice) compared to sgk1 wild type mice (sgk + / + mice).
  • colonic tumors were chemically induced in the experimental animals (Wang JG, Wang DF, Lv BJ, Si JM: A novel mouse model for colitis-associated colon carcinogenesis induced by 1, 2-dimethylhydrazine and dextran sulfate sodium.) World J Gastroenterol 2004; 10: 2958-2962).
  • Part of the experimental animals were exposed to three cycles of chemical tumorigenesis at 8 weeks of age.
  • DSH 1, 2-dimethylhydrazine
  • Figure 2 shows graphically the effect of a sgk1 inhibitor of the type described in the present specification compounds according to formula I on the development of colon carcinomas.
  • a chemically induced tumorigenesis as described in the figure description of FIG. 1 was performed.
  • One week after treatment either a placebo or the sgk1 inhibitor was administered for 20 days.
  • the sgk1 inhibitor was added to the feed at a mixing ratio of 4.46 mg / g diet. This corresponds to an approximate dose of 600 mg / kg body weight.
  • the graph shown in Figure 2 illustrates that in the case of the animals treated with the sgk1 inhibitor, the growth of
  • Colontumoren (right closed bar) compared to the untreated experimental animals (left open bar) is significantly inhibited.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Substanzen für die Therapie und Diagnose von Karzinomen unter Verwendung von sgk1 (serum and glucocorticoid dependent kinase 1) als therapeutisches bzw. diagnostisches Target.

Description

Beschreibung
Sgk1 als therapeutisches und diagnostisches Target für karzinomatöse
Erkrankungen
Die vorliegende Erfindung betrifft Substanzen zur therapeutischen Behandlung und zur Diagnose von Karzinomen, ein Diagnoseverfahren sowie ein diesbezügliches Diagnosekit.
Die Serum- und Glucocorticoid-abhängige Kinase-1 (sgk1 , serum and glucocorticoid dependent kinasel ) ist ein in eukaryotischen Zellen ubi- quitär vorkommendes Protein. Sgk1 steht dabei unter der Kontrolle von zellulärem Stress, wie beispielsweise Zellschrumpfung, und Hormonen, wie beispielsweise Gluco- und Mineralcorticoiden. Sgk1 wird durch Insulin und Wachstumsfaktoren über die Phosphatidylinositol-3-Kinase und PDK1 (3-Phosphoinositide dependent kinase-1 ) aktiviert.
Sgk1 wurde ursprünglich aus Rattenmammakarzinomazellen kloniert (Webster MK, Goya L, Firestone GL. J. Biol. Chem. 268 (16): 11482- 11485, 1993; Webster MK, Goya L, Ge Y, Maiyar AC, Firestone GL. Mol. Cell. Biol. 13 (4): 2031-2040, 1993). Die humane Kinase hsgk wurde als zellvolumenreguliertes Gen aus Leberzellen kloniert (Waldegger S, Barth P, Raber G, Lang F. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 4440-4445, 1997). Es zeigte sich, daß die Rattenkinase (Chen SY, Bhargava A, Mastroberardino L, Meijer OC, Wang J1 Buse P, Firestone GL, Verrey F, Pearce D. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96: 2514-2519, 1999; Naray- Fejes-Toth A, Canessa C, Cleaveland ES, Aldrich G, Fejes-Toth G. J. Biol. Chem. 274: 16973-16978, 1999) den epithelialen Na+-Kanal (ENaC) stimuliert. Weiter wurde gezeigt, daß eine gesteigerte Aktivität des ENaC mit Hypertonie einhergeht (Warnock DG. Kidney Ind. 53 (1 ): 1824, 1998). Die hsgk wird auch im Gehirn exprimiert (Waldegger S1 Barth P1 Raber G, Lang F. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 4440-4445, 1997), wo sie die spannungsabhängigen K+-Kanäle Kv1.3 reguliert. Es wurde gezeigt, daß diese K+-Kanäle des Kv1.3-Typs involviert sind in der Regulation der neuronalen Erregbarkeit (Pongs O. Physiol. Rev. 72: 69-88, 1992), der Regulation von Zeilproliferation (Cahalan MD und Chandy KG. Cur. Opin. Biotech. 8 (6): 749-756, 1997) sowie der Regulation von apoptioti- schem Zelltod (Szabo I1 Gulbins E, Apfel H, Zhan X, Barth P, Busch AE, Schlottmann K, Pongs O, Lang F. J. Biol. Chem. 271 : 20465-20469, 1999; Lang F, Szabo I1 Lepple-Wienhues A, Siemen D, Gulbins E. News Physiol. Sei. 14: 194-200, 1999). Kv1.3 ist ferner wichtig bei der Regulation der Lymphozytenproliferation und -funktion (Cahalan MD und Chandy KG, Cur. Opin. Biotech. 8 (6): 749-756, 1997). Es wurden zwei weitere Mitglieder der sgk-Familie kloniert, die sgk2 und sgk3 (Kobayashi T, Deak M, Morrice N1 Cohen P. Biochem. J. 344: 189-197, 1999). Ferner zeigte sich, dass die sgk eine Serin-Threonin-Proteinkinase-Familie bilden, die transkriptioneil und posttranskriptionell reguliert werden können. Wie die sgk1 , werden auch die sgk2 und sgk3 durch z. B. Insulin und IGF1 über den PI3-Kinase-Weg aktiviert. Eine vollständige Charakterisierung der sgk Proteinfamilie hat aber bis jetzt nicht stattgefunden.
In der Zwischenzeit ist sgk1 auch als wertvolles Target für therapeutische und diagnostische Anwendungen erkannt worden.
In der DE 197 08 173 konnte beispielsweise gezeigt werden, daß die hsgki bei vielen Erkrankungen, die durch Zellvolumenänderung pa- thophysiologisch beeinflußt werden, wie beispielsweise Hypernatriämie, Hyponatriämie, Diabetes mellitus, Niereninsuffizienz, Hyperkatabolis- mus, hepatische Encephalopathie und mikrobielle oder virale Infektionen, ein beträchtliches diagnostisches Potential besitzt. In der DE 199 17 990 sind Kinase-Hemmstoffe, wie beispielsweise Stau- rosporin, Chelerythrin oder transdominant inhibitorische Kinase beschrieben worden, die bei der Therapie zellvolumenabhängiger Erkrankungen eingesetzt werden können.
Darüber hinaus ist aus der WO 2004/079003 A1 die Verwendung von sgk1 als diagnostisches und therapeutisches Target für Koagulopathien, Angiopathien, pulmonale Hypertonie und Arteriosklerose bekannt.
Die Rolle von sgk1 bei der Entstehung von Tumoren wird in der Fachliteratur dagegen sehr kontrovers und widersprüchlich diskutiert.
Die Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, therapeutische und diagnostische Anwendungen für karzinomatöse Erkrankungen unter Verwendung von sgk1 als Zielmolekül (Target) bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche 1 , 9 und 12 bis 15. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen genannt. Der Inhalt aller dieser Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Überraschenderweise konnte anhand von Tierversuchen festgestellt werden, dass sgk1 als therapeutisches und diagnostisches Zielmolekül zur Prophylaxe und Behandlung von karzinomatösen Erkrankungen geeignet ist.
Erfindungsgemäß wird daher eine Substanz zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Karzinomen bereitgestellt, wobei die Substanz die Expression und/oder Aktivität von sgk1 beeinflusst. Grundsätzlich kann besagte Substanz die Expression bzw. Aktivität von sgk1 stimulieren. Vor- zugsweise inhibiert bzw. hemmt die besagte Substanz die Expression und/oder Aktivität von sgk1.
Unter Aktivität im Sinne der vorliegenden Erfindung soll vor allem die Enzymaktivität von sgk1 verstanden werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um eine gegen sgk1 gerichtete Substanz. Vorzugsweise ist die besagte Substanz ein gegen sgk1 gerichteter Antikörper. Die Herstellung von gegen sgk1 gerichteten Antikörpern, bei welchen es sich um mono- oder polyklonale Antikörper handeln kann, ist dem Fachmann hinreichend bekannt. Entsprechende Antikörper können beispielsweise dadurch hergestellt werden, dass Tieren, beispielsweise Schweinen oder Pferden, Proteinfragmente von sgk1 zu Immunisierungszwecken verabreicht werden. Nach Verabreichung der sgk1 -Fragmente produzieren diese Tiere spezifisch gegen sgk1 gerichtete Antikörper, welche mit Hilfe von Standardverfahren isoliert und aufgereinigt werden können.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Substanz gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren, biologische Vorläufer, Varianten, insbesondere Isoformen von sgk1 gerichtet. Die vorstehend aufgelisteten Verbindungen können beispielsweise up- und/oder downstream liegende Mitglieder der sgk1-Signaltransduktionskaskade, Transkriptionsfaktoren, welche für das Expressionsniveau von sgk1 verantwortlich sind, und/oder Proteasen sein, welche für den proteolytischen Abbau von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren, biologischen Vorläufern bzw. Varianten von sgk1 verantwortlich sind. Geeignete Aktivatoren sind beispielsweise die eingangs erwähnten Phosphatidylinositol-3-Kinase und PDK1. Als Inhibitor kommt beispielsweise die Ubiquitin-Ligase Nedd4-2 in Betracht. Bei den Transkriptionsfaktoren kann es sich beispielsweise um mindestens einen Faktor aus der Gruppe Forkhead-transcription-factor-FKHRLI , ß- Catenin und NFKB (nuclear-factor-kappa-B) handeln. Weiterhin kann es sich bei der Substanz um ein Polynukleotid handeln, welches für ein Peptid, vorzugsweise Polypeptid, codiert, das die Expression und/oder Aktivität von sgk1 beeinflusst, insbesondere inhibiert.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um ein „small molecular Compound", vorzugsweise ein „small molecular Compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 1000. Erfindungsgemäß kann es dabei insbesondere vorgesehen sein, dass es sich bei der Substanz um einen Kinase-Inhibitor handelt. Bevorzugt ist die Substanz aus der Gruppe Staurosporin, Chelerythrin, SB 203580 (MG 377,4), SB 202190 (MG 331 ,3) und davon abgeleiteten Derivaten ausgewählt. Bei den Kinaseinhibitoren SB 203580 und SB 202190 handelt es sich um Imidazol-Derivate, die beispielsweise von CaI Biochem. kommerziell vertrieben werden.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um ein Mandelsäurehydrazidderivat. Vorzugsweise handelt es sich bei der Substanz um eine Verbindung der Formel I
Figure imgf000006_0001
worin
R1, R2 jeweils unabhängig voneinander H, CHO oder Acetyl,
Figure imgf000007_0001
R8, R9, R10, R11 jeweils unabhängig voneinander
H, A, OSO2A, HaI, NO2, OR12, N(R12)2, CN, O-COA, -[C(R12)2]nCOOR12, O-[C(R12)2]0COOR12, SO3H, -[C(R12)2]nAr, -CO-Ar, O-[C(R12)2]nAr, -[C(R12)2]nHet, -[C(R12)2]nC≡CH, O-[C(R12)2]nC≡CH, -[C(R12)2]nCON(R12)2, -[C(R12)2]nCONR12N(R12)2, O-[C(R12)2]nCON(R12)2, O-[C(R12)2]0CONR12N(R12)2, NR12COA, NR12CON(R12)2, NR12SO2A, N(SO2A)2, COR12, S(O)01Ar, SO2NR12 oder S(O)111A,
R3 und R4 zusammen auch CH=CH-CH=CH,
R3 und R4, R7 und R8 oder R8 und R9 zusammen auch Alkylen mit 3, 4 oder 5 C-
Atomen, worin eine oder zwei CH2-Gruppen durch Sauerstoff ersetzt sein können,
A unverzweigtes oder verzweigtes Alkyl mit 1-6 C-Atomen, worin 1-7 H-Atome durch F ersetzt sein können, oder cylisches Alkyl mit 3-7 C-Atomen,
Ar unsubstituiertes oder ein-, zwei- oder dreifach durch HaI, A, OR12, N(R12)2, NO21CN, Phenyl, CON(R12)2, NR12COA, NR12CON(R12)2, NR12SO2A, COR12, SO2N(R12)2, S(O)111A, -[C(R12)2]n-COOR12 und/oder -O[C(R12)2]O-COOR12 substituiertes Phenyl, Naphthyl oder Biphenyl,
Het einen ein- oder zweikernigen gestättigten, ungesättigten oder aromatischen Heterocyclus mit 1 bis 4 N-, O- und/oder S-Atomen, der ein-, zwei- oder dreifach durch HaI, A, OR12, N(R12)2, NO2, CN, COOR12, CON(R12)2, NR12COA, NR12SO2A, COR12, SO2NR12, S(O)111A, =S, =NR12 und/oder =O (Carbonylsauerstoff) substituiert sein kann,
R12 H oder A,
HaI F, Cl, Br oder I, m 0, 1 oder 2, n 0, 1 , 2 oder 3, o 1 , 2 oder 3 bedeuten, sowie ihre pharmazeutisch verwendbaren Derivate, Salze, Solvate und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen.
Die Substanz kann insbesondere aus der Gruppe 2,4-Dihydroxy-6- methyl-benzoesäure-N'-[2'(3,4-difluor-phenyl)-2-hydroxy-acetyl]- hydrazid, 2,4-Dihydroxy-6-methyl-benzoesäure-N'-[2-hydroxy-2-(3- phenoxy-phenyl)-acetyl]-hydrazid, 2,4-Dihydroxy-6-methyl-benzoesäure- N'-(2-hydroxy-2-phenyl-acetyl)-hydrazid, 2,4-Dihydroxy-6-methyl- benzoesäure-N'-[2-hydroxy-2-(3-chlor-phenyl)-acetyl]-hydrazid, 2,4-
Dihydroxy-6-methyl-benzoesäure-N'-[2-hydroxy-2-(3-triflourmethyl- phenyl)-acetyl]-hydrazid, 2,4-Dihydroxy-6-methyl-benzoesäure-N'-[2- acetoxy-2-(3-chlor-phenyl)-acetyl]-hydrazid, 2,4-Dihydroxy-6-methyl- benzoesäure-N'-[2-hydroxy-2-(3-fluor-phenyl)-acetyl]-hydrazid, 2,4-
Dihydroxy-6-methyl-benzoesäure-N'-[2-hydroxy-2-(3,5-difluor-phenyl)- acetyl]-hydrazid, 2,4-Dihydroxy-6-methyl-benzoesäure-N'-(2-hydroxy-2- (2,3,4,5,6-pentafluor-phenyl)-acetyl]-hydrazid, 2,4-Dihydroxy-6-methyl- benzoesäure-N'-(2-benzo[1 ,3]dioxol-5-yl-2-hydroxy-acetyl)-hydrazid, 2,4-Dihydroxy-6-methyl-benzoesäure-N'-[2-hydroxy-2-(3-hydroxy-4- methoxy-phenyl)-acetyl]-hydrazid, 2,4-Dihydroxy-5-chlor-benzoesäure- N'-[2-hydroxy-2-(3-chlor-phenyl)-acetyl]-hydrazid, 3-Chlor-2-ethyl-4- hydroxy-benzoesäure-N'-[2-hydroxy-2-(3-chlor-phenyl)-acetyl]-hydrazid, 2,4-Dihydroxy-6-methyl-benzoesäure-N'-[(R)-2-(3-chlor-phenyl)-2- hydroxy-acetyl]-hydrazid, 2-Chlor-4,6-dihydroxy-benzoesäure-N'-[2- hydroxy-2-(3-hydroxy-phenyl)-acetyl]-hydrazid, 2-Methyl-4,6-dihydroxy- benzoesäure-N'-[2-hydroxy-2-(3-hydroxy-phenyl)-acetyl]-hydrazid, 2- Ethyl-4,6-dihydroxy-benzoesäure-N'-[2-hydroxy-2-(3-hydroxy-phenyl)- acetyl]-hydrazid, 2-Methyl-4,6-dihydroxy-benzoesäure-N'-(2-hydroxy-2- phenyl-acetyl)-hydrazid, 2,4-Dihydroxy-6-methyl-benzoesäure-N'-[2- hydroxy-2-(3-methyl-phenyl)-acetyl]-hydrazid, 2,4-Dihydroxy-5-methyl- benzoesäure-N'-[2-hydroxy-2-(3,4-difluor-phenyl)-acetyl]-hydrazid, 2,4- Dihydroxy-6-methyl-benzoesäure-N'-[2-formyloxy-2-(3,4-difluor-phenyl)- acetyl]-hydrazid, 2,4-Dihydroxy-6-ethyl-benzoesäure-N'-[2-hydroxy-2- (3,4-difluor-phenyl)-acetyl]-hydrazid und 4-Hydroxy-2-ethyl-3-methyl- benzoesäure-N'-[2-hydroxy-2-(3,4-difluor-phenyl)-acetyl]-hydrazid ausgewählt sein.
Die im vorherigen Abschnitt genannten Substanzen sind in der WO 2007/093264 A1 als Verbindungen „A1" bis „A23" aufgeführt. Bezüglich weiterer Merkmale und Einzelheiten sowie der Herstellung dieser Verbindungen wird daher auf die WO 2007/093264 A1 verwiesen, deren Offenbarungsgehalt durch ausdrückliche Bezugnahme zum Inhalt der vorliegenden Beschreibung gemacht wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Substanz zur Diagnose von Karzinomen, wobei die Substanz zum Nachweis der Expression, Aktivität und/oder einer Genmodifikation von sgk1 in eukaryotischen Zellen verwendet wird. Bei der Substanz kann es sich um eine gegen sgk1 gerichtete Substanz, vorzugsweise um einen gegen sgk1 gerichteten Antikörper, handeln. Ein derartiger Antikörper kann im Rahmen von dem Fachmann bekannten Nachweisverfahren, beispielsweise ELISA (enzy- me-linked immunosorbant assay), eingesetzt werden. Bei diesem Im- munoassay wird der gegen das zu bestimmende Antigen (sgk1 ) gerichtete spezifische Antikörper (bzw. bei Antikörperbestimmungen homologe Testantigene) an ein Trägermaterial, beispielsweise Cellulose oder Polystyrol, gebunden. Auf dem Trägermaterial bilden sich nach der Inkubation mit einer Probe, welche das Antigen (sgk1) enthält, Immunkomplexe. In einem nachfolgenden Schritt wird diesen Immunkomplexen ein markierter Antikörper, welcher ebenfalls gegen das Antigen (sgk1 ) gerichtet ist aber zweckmäßigerweise an einer anderen Stelle bindet als der auf dem Trägermaterial gebundene Antikörper, hinzugegeben. Bei diesem markierten Antikörper handelt es sich gewöhnlich um ein Anti- körper-Enzym-Konjugat, wobei es sich bei dem Enzym in der Regel um alkalische Phosphatase oder Meerretichperoxidase handelt. Durch die Zugabe des markierten Antikörpers entstehen letztendlich ternäre Komplexe aus dem Antigen (sgk1) und den beiden jeweils gegen das Antigen (sgk1 ) gerichteten Antikörpern. Diese ternären Komplexe lassen sich durch Zugabe von chromogenen Substraten, beispielsweise Para- Nitrophenol, sichtbar machen. Hieraus kann die Antigenkonzentration (Konzentration von sgk1 ) in der Probe über eine photometrische Bestimmung der immunkomplex-gebundenen Markerenzyme durch Vergleich mit Standards bekannter Enzymaktivität ermittelt werden. Ebenso ist es möglich, gegen sgk1 gerichtete Antikörper im Rahmen von ELIS- POT-Verfahren einzusetzen. Diese Verfahren sind dem Fachmann hinreichend vertraut, so dass auf weitere Ausführungen hierzu verzichtet wird. Als Genmodifikation von sgk1 kommen vor allem Nukleotidpolymorphismen und/oder Insertionsmutationen in Betracht. Bei den Proben handelt es sich gewöhnlich um Körperproben eines Patienten, welche eukaryotische Zellen enthalten. Als Proben kommen insbesondere Gewebeproben aber auch Proben von Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blut, in Frage.
Weiterhin kann es sich bei der Substanz um ein Oligonukleotid handeln, welches beispielsweise mit Hilfe der sogenannten Polymerase- Kettenreaktion (PCR) dazu geeignet ist, selektiv bestimmte DNA- Abschnitte von sgk1 zu amplifizieren und auf diese Weise einen vorzugsweise quantitativen Nachweis von sgk1 zu erbringen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann es sich bei der Substanz um ein Oligo- oder Polynukleotid handeln, welches mit sgk1 unter strin- genten Bedingungen hybridisiert. Mit Hilfe von derartigen Oligo- bzw. Polynukleotiden können beispielsweise Southern oder Northern Blots durchgeführt werden, um auf diese Weise den DNA- oder RNA-Gehalt an sgk1 nachzuweisen. Entsprechende Methoden sind dem Fachmann ebenfalls hinreichend geläufig. Beispielsweise kann auf diese Weise auch die Transkriptionsrate von sgk1 untersucht werden.
Die Karzinome der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt aus der Gruppe Colonkarzinom, Mammakarzinom, Magenkarzinom und Lungenkarzinom ausgewählt.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren auch ein Diagnosekit zur Diagnose von Karzinomen. Dieser umfasst zumindest eine Substanz, die zum Nachweis der Expression, Aktivität und/oder einer Genmodifikation von sgk1 geeignet ist. Bezüglich weiterer Merkmale und Eigenschaften des Diagnosekits wird auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen.
Weiterhin umfasst die Erfindung ein in vitro- Verfahren zur Diagnose von Karzinomen, wobei die Expression, Aktivität und/oder eine Genmodifikation von sgk1 durch einen vorzugsweise quantitativen Nachweis in einer Körperprobe eines Patienten mit gegen sgk1 gerichteten Antikörpern, mit Oligonukleotiden, mit welchen beispielsweise in einer Polymerase- Kettenreaktion (PCR) bestimmte D N A- Abschnitte von sgk1 amplifiziert werden, und/oder mit Polynukleotiden, die mit DNA oder mRNA von sgk1 unter stringenten Bedingungen hybridisieren, detektiert wird. Wie bereits erwähnt, kommen als Körperproben vor allem Gewebe-und/oder Blutproben in Betracht. Bei diesem Verfahren ist es insbesondere vorgesehen, mittels der vorstehend genannten Substanzen auch bestimmte Mutationen, beispielsweise Insertionsmutationen, oder Polymorphismen in sgk1 zu detektieren.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Karzinomen, insbesondere bei im- mundefizienten Patienten, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Substanz, welche die Expression und/oder Aktivität von sgk1 beeinflusst, vorzugsweise inhibiert. Bezüglich der in Frage kommenden Substanzen wird auf die bisherige Beschreibung verwiesen. Bei den immundefizienten Patienten kann es sich insbesondere um Patienten handeln, die unter zytostatischer oder immunsupres- siver Therapie stehen oder bereits an einem Karzinom erkrankt waren. Des Weiteren kann es sich bei den Patienten auch um Patienten handeln, die eine genetische Prädisposition für Karzinomerkrankungen aufweisen.
Schließlich betrifft die Erfindung auch die Verwendung einer Substanz zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Karzinomen, wobei die Substanz die Expression und/oder Aktivität von sgk1 beeinflusst, vorzugsweise inhibiert. Weiterhin betrifft die Erfindung auch die Verwendung einer Substanz zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von Karzinomen, wobei die Substanz zum Nachweis der Expression, Aktivität und/oder einer Genmodifikation von sgk1 verwendet wird. Bezüglich der in Frage kommenden Substanzen wird auf die bisherige Beschreibung verwiesen.
Die bestehenden und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen und den Figuren. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Abbildungen zeigen:
Figur 1 : die Entwicklung von Colonkarzinomen bei sgk1 -Knockout Mäusen im Vergleich zu sgk1 -Wildtyp-Mäusen, Figur 2: die Hemmung von Colonkarzinomen durch einen sgk1- Inhibitor.
Figur 1 zeigt die Entwicklung von Colonkarzinomen bei sgk1 -Knockout Mäusen (sgkr' -Mäusen) im Vergleich zu sgk1 -Wildtyp-Mäusen (sgk+/+- Mäusen). Hierzu wurden in den Versuchstieren Colontumore chemisch induziert (Wang JG, Wang DF, Lv BJ, Si JM: A novel mouse model for colitis-associated colon carcinogenesis induced by 1 ,2- dimethylhydrazine and dextran sulfate sodium. World J Gastroenterol 2004; 10:2958-2962). Ein Teil der Versuchstiere wurde in einem Alter von 8 Wochen drei Zyklen einer chemischen Tumorgenese ausgesetzt. Dazu wurden die Tiere intraperitoneal mit 20 mg/kg 1 ,2- Dimethylhydrazin (DMH; Sigma-Aldrich Corporation. St. Louis. MO. USA) behandelt. Beginnend eine Woche später wurde den Tieren drei Mal für 7 Tage destilliertes Wasser mit 30 g/l synthetischem Dextransul- fatnatrium (DSS; Molmasse 5000; Wako Pure Chemical Industries Ltd. Japan) und für weitere 14 Tage destilliertes Wasser verabreicht (Dauer insgesamt 3 x (1 + 2 Wochen) = 9 Wochen insgesamt). Der andere Teil der Versuchstiere (Kontrolltiere) wurde stattdessen intraperitoneal per Injektion mit 20 mg/kg einer 0,9 %igen Natriumchlorid-Lösung versorgt. Alle Mäuse wurden im Alter von 22 Wochen mit Äther anästhesiert und anschließend getötet.
Das in Figur 1 graphisch dargestellte Ergebnis der chemisch induzierten Tumorgenese zeigt deutlich, dass die Empfindlichkeit von sgk1- Knockout-Mäusen (wiedergegeben durch den rechten geschlossenen Balken) im Gegensatz zu sgk1 -Wildtyp-Mäusen (wiedergegeben durch den linken offenen Balken) gegen chemisch induzierte Colontumore signifikant herabgesetzt ist. Dieses Ergebnis ist um so überraschender, als die Fachliteratur bezüglich verschiedener Karzinomtypen von einer Herabregulierung von sgk1 in karzinomatösem Gewebe berichtet (Rauhala HE, Porkka KP, Tolonen TT, Martikainen PM, Tammela TL, Visakorpi T: Dualspecificity Phosphatase 1 and serum/glucocorticoid-regulated kina- se are downregulated in prostate Cancer. Int J Cancer 2005; Chu S, Rushdi S, Zumpe ET, Mamers P, Healy DL, Jobling T, Burger HG, Füller PJ: FSH-regulated gene expression profiles in ovarian tumours and normal ovaries. Mol Hum Reprod 2002; 8:426-433; Chung EJ, Sung YK, Farooq M1 Kim Y, Im S, Tak WY, Hwang YJ1 Kim Yl, Han HS, Kim JC, Kim MK: Gene expression profile analysis in human hepatocellular Carcinoma by cDNA microarray. Mol CeIIs 2002; 14:382-387), weswegen eigentlich zu erwarten gewesen wäre, dass eine Hemmung von sgk1 das Tumorwachstum fördert.
Figur 2 zeigt graphisch die Wirkung eines sgk1-lnhibitors vom Typ der in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Verbindungen gemäß Formel I auf die Entstehung von Colonkarzinomen. Zunächst wurde eine wie in der Figurenbeschreibung zu Figur 1 beschriebene chemisch induzierte Tumorgenese durchgeführt. Eine Woche nach der Behandlung wurde für 20 Tage entweder ein Placebo oder der sgk1-lnhibitor verabreicht. Der sgk1-lnhibitor war dem Futter in einem Mischungsverhältnis von 4.46 mg/g Futter beigemischt worden. Dies entspricht einer ungefähren Dosis von 600 mg/kg Körpergewicht. Die in Figur 2 dargestellte Graphik verdeutlicht, dass im Falle der mit dem sgk1-lnhibitor behandelten Versuchstiere das Wachstum von
Colontumoren (rechter geschlossener Balken) im Vergleich zu den unbehandelten Versuchstieren (linker offener Balken) signifikant gehemmt wird.

Claims

Patentansprüche
1. Substanz zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Karzinomen, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz die Expression und/oder Aktivität von sgk1 beeinflusst, insbesondere hemmt.
2. Substanz nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Substanz um eine gegen sgk1 gerichtete Substanz, vorzugsweise um einen gegen sgk1 gerichteten Antikörper, handelt.
3. Substanz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren, biologische Vorläufer, Varianten, insbesondere Isoformen, von sgk1 gerichtet ist.
4. Substanz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein Polynukleotid ist, welches ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid, codiert, wobei dieses Peptid die Expression und/oder Aktivität von sgk1 beeinflusst, insbesondere inhibiert.
5. Substanz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Substanz um ein „small mo- lecular Compound", vorzugsweise ein „small molecular Compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 1000, handelt.
6. Substanz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein Kinaseinhibitor ist.
7. Substanz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz aus der Gruppe Staurosporin, Chelerythrin, SB 203580, SB 202190 und davon abgeleiteten Derivaten ausgewählt ist.
8. Substanz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Substanz um eine Verbindung der Formel I handelt:
Figure imgf000016_0001
worin
R1, R2 jeweils unabhängig voneinander H, CHO oder Acetyl,
R 3 n4 n5 [36 n7
R8, R9, R10, R11 jeweils unabhängig voneinander
H, A, OSO2A, HaI, NO2, OR12, N(R12)2, CN, O-COA, -[C(R12)2]nCOOR12, O-[C(R12)2]0COOR12, SO3H, -[C(R12)2]nAr, -CO-Ar1 O-[C(R12)2]nAr, -[C(R12)2]nHet, -[C(R12)2]nC≡CH, O-[C(R12)2]nC≡CH, -[C(R12)2]nCON(R12)2, -[C(R12)2]nCONR12N(R12)2, O-[C(R12)2]nCON(R12)2, O-[C(R12)2]oCONR12N(R12)2l NR12COA1 NR12CON(R12)2, NR12SO2A, N(SO2A)2, COR12, S(O)mAr, SO2NR12 oder S(OWV
R3 und R4 zusammen auch CH=CH-CH=CH,
R3 und R4, R7 und R8 oder R8 und R9 zusammen auch Alkylen mit 3, 4 oder 5 C-
Atomen, worin eine oder zwei CH2-Gruppen durch Sauerstoff ersetzt sein können,
A unverzweigtes oder verzweigtes Alkyl mit 1-6 C-Atomen, worin 1-7 H-Atome durch F ersetzt sein können, oder cylisches Alkyl mit 3-7 C-Atomen,
Ar unsubstituiertes oder ein-, zwei- oder dreifach durch HaI1 A, OR12, N(R12)2, NO2, CN, Phenyl, CON(R12)2, NR12COA, NR12CON(R12)2, NR12SO2A, COR12, SO2N(R12)2, S(OJmA, -[C(R12)2]n-COOR12 und/oder -O[C(R12)2]0-COOR12 substituiertes Phenyl, Naphthyl oder Biphenyl,
Het einen ein- oder zweikernigen gestättigten, ungesättigten oder aromatischen Heterocyclus mit 1 bis 4 N-, O- und/oder S-Atomen, der ein-, zwei- oder dreifach durch HaI, A, OR12, N(R12)2, NO2, CN, COOR12, CON(R12)2, NR12COA, NR12SO2A, COR12, SO2NR12, S(O)nA =St =NR12 und/oder =O (Carbonylsauerstoff) substituiert sein kann,
R12 H oder A,
HaI F, Cl, Br oder I, m O, 1 oder 2, n O, 1 , 2 oder 3, o 1 , 2 oder 3 bedeuten, sowie ihre pharmazeutisch verwendbaren Derivate, Salze, Solvate und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen.
9. Substanz zur Diagnose von Karzinomen, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz zum Nachweis der Expression, Aktivität und/oder einer Genmodifikation von sgk1 verwendet wird.
10. Substanz nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Substanz um eine gegen sgk1 gerichtete Substanz, insbesondere um einen gegen sgk1 gerichteten Antikörper, handelt.
11. Substanz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Karzinome aus der Gruppe Colonkarzi- nom, Mammakarzinom, Magenkarzinom und Lungenkarzinom ausgewählt sind.
12. Diagnosekit, umfassend zumindest eine Substanz zum Nachweis der Expression, Aktivität und/oder einer Genmodifikation von sgk1 , zur Diagnose von Karzinomen.
13. Verfahren zur Diagnose von Karzinomen, wobei die Expression, Aktivität und/oder eine Genmodifikation von sgk1 durch Nachweis in einer Körperprobe eines Patienten mit Antikörpern gegen sgk1 , mit Oligonukleotiden, mit welchen in einer Polymerasekettenreati- on (PCR) bestimmte D N A- Abschnitte von sgk1 amplifiziert werden, und/oder mit Polynukleotiden, die mit DNA oder mRNA von sgk1 unter stringenten Bedingungen hybridisieren, detektiert wird.
14. Verwendung einer Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 11 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Karzinomen.
15. Verwendung einer Substanz nach einem der Ansprüche 9 bis 11 zur Herstellung eines Diagnosemittels zur Diagnose von Karzinomen.
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