WO2009095518A1 - Protección heteróloga contra pasteurella multocida proporcionada por células de p. multocida fur y sus extractos proteicos de membrana externa - Google Patents

Protección heteróloga contra pasteurella multocida proporcionada por células de p. multocida fur y sus extractos proteicos de membrana externa Download PDF

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fur
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Sáiz BADIOLA
Montserrat Llagostera Casas
Ma Elena GARRIDO OCAÑA
Montserrat Bosch Gallego
Ana Ma Perez De Rozas Ruiz De Gauna
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Universitat Autonoma De Barcelona
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Definitions

  • the invention relates to Pasteurella multocida mutants capable of conferring heterologous protection against infection caused by virulent P. multocida. These mutants are defective in the genes: fur ompH and fur ompH galE.
  • the present invention relates to vaccine compositions against Pasteurella bacteria, namely Pasteurella multocida, comprising double fur ompH mutants and triple fur ompH galE mutants, obtained from P. multocida or an iron-regulated outer membrane protein extract (IROMPs). ) obtained from said mutants and a pharmaceutically acceptable carrier and / or adjuvants.
  • Pasteurella multocida mutants capable of conferring heterologous protection against infection caused by virulent P. multocida. These mutants are defective in the genes: fur ompH and fur ompH galE.
  • the present invention relates to vaccine compositions against Pasteurella bacteria, namely Pasteurella multocida, comprising double fur ompH mutants and triple fur ompH
  • Pasteurella Bacterial infections are an important cause of diseases in the world, both in animals and in man, especially in children.
  • the disease-causing bacteria is the genus Pasteurella, which currently includes 20 species, including Pasteurella multocida, which is a pathogenic bacterium that causes various infectious diseases, such as avian cholera, bovine pneumonia, septicemia. Hemorrhagic and atrophic rhinitis of the pig, in animals used for food production, so the control of the disease is of great importance for farmers dedicated to raising this cattle.
  • live attenuated vaccines in which the live pathogen to which its incapacitated virulence has been reduced or eliminated is used
  • vaccines in which purified components of the pathogen
  • dead vaccines in which the dead pathogen is used directly.
  • live attenuated vaccines are those that produce protection under conditions similar to that of natural disease.
  • vaccines of type (b) and (c) are more attractive from a safety point of view.
  • Patent application WO 98/56901 A2 whose title is “Live attenuated vaccines” describes attenuated bacteria in which the fur gene or a homologous gene is modified so that the expression of the product of the fur gene, or its counterpart , is regulated independently of the concentration of iron present in the medium in which the bacterium is found. These bacteria can be used as "live vaccines”.
  • the document generally refers to any gram-negative bacteria although it focuses in particular on Neisseria meningitidis.
  • the attenuation of the bacteria is carried out by mutation of a gene essential for the production of a metabolite or catabolite not produced by humans or animals.
  • the mutations to attenuate the bacteria are in the hoop gene or in a purine or pyrimidine pathway gene.
  • the bacterium comprises a recA mutation.
  • the invention also provides vaccines as well as the method for producing a bacterium according to the invention and comprising the modification of the native fur gene or a homologue, of an attenuated bacterium, so that the expression of the fur gene or its homologue is independently regulated. of the concentration of iron present in the environment of the bacteria.
  • a pathogenic bacterium whose genome comprises the fur gene or a homologue thereof, the bacterium being attenuated by suppression or modification of a gene essential for growth in the host in which the bacterium is pathogenic, can be modified as described. so that the bacterium produces the product of the fur gene or its counterpart independently of the iron concentration
  • Fur homologs can be identified by comparison with known sequences of other fur genes such as E. coli and N. meningitidis. Preferably, these homologs are substantially homologous to other known fur genes, with an identity of between 60-70% in a length of at least 100 amino acids. Therefore, genes identified in other bacteria that encode transcription factors and also have the property of responding to the presence of iron, can also be used.
  • the invention also proposes mutations in the recA and count genes to provide stability to the bacteria used in the vaccine. These mutations must be introduced as final genetic modifications, following the rest of the modifications described.
  • the invention proposes to formulate the vaccine for homologous serotype use, but also includes a polyvalent vaccine containing iron-regulated proteins of all pathologically important P ⁇ steurell ⁇ serotypes.
  • a polyvalent vaccine containing iron-regulated proteins of all pathologically important P ⁇ steurell ⁇ serotypes focuses on iron-regulated proteins, monoclonal or polyclonal antibodies for said proteins and vaccine formulations in which the protein material may be combined with any of the usual adjuvants in veterinary vaccines.
  • the document states that the proportions of the chelating agent to be used should be carefully controlled since a concentration that is too large would prevent the bacteria from growing.
  • This patent refers to attempts to produce vaccine compositions, which traditionally use whole cells of dead (inactivated) bacteria by providing
  • REPLACEMENT SHEET (Regia 26) only specific protection of a serotype, which is a problem for vaccination given the existence of different serotypes.
  • the inventors allude to a study in which an attenuated bacterial vaccine, which produces an inactive form of the ApxII toxin, has shown cross-protection.
  • compositions comprising mutated and attenuated gram-negative bacterial organisms and, optionally, a pharmaceutically acceptable adjuvant and / or vehicle with a view to the construction of a vaccine that prevents bacterial infection or the associated symptoms thereof are described.
  • the modified strain of the invention In order for the modified strain of the invention to be effective in a pharmaceutical formulation, the inventors point out that the attenuation must be significant enough to avoid clinical symptoms of infection, but allowing limited replication and growth of the bacteria in the host.
  • the invention provides attenuated strains of P. m ⁇ ltocida, vaccines (applicable to humans and animals), polynucleotides encoding gene products necessary for the virulence of gram-negative bacteria, host cells transformed with the polynucleotides of the infection, production methods of the polypeptides of the invention, methods of treating subjects infected by gram-negative bacteria by administering the antibacterial agents defined in the invention etc.
  • Patent application WO 99/29724 A2 whose title is "DNA encoding Pasteurella multocida outer membrane protein” claims an isolated and purified nucleic acid molecule comprising a preselected nucleic acid sequence encoding a membrane protein or OmpH polypeptide of Pasteurella multocida avian and a subunit or a biologically active variant. To do this, they sequence and clone OmpHs of 16 serotypes (which have an identity of 73%) of P. multocida.
  • This patent application shows homologous protection studies of chickens through isolated and purified external membrane X-73 polypeptides. They also indicate that the immunogenic compositions of the invention can be used in combination with bacterins. These immunogenic compositions comprise an effective amount of P. multocida outer membrane polypeptide isolated and purified in combination, subunit, peptide, variant or combination thereof, together with a pharmaceutically acceptable carrier that, upon administration to vertebrates, induces the production of specific antibodies to porinas of outer membrane of P. multocida. The invention also provides a method of detecting or determining the presence of antibodies that are specific for P. multocida avian.
  • the ompH gene which encodes the main structural membrane protein (which has high antigenicity), is negatively regulated by the Fur, iron and glucose protein.
  • P. multocida wild-type and defective fur cells have the same level of virulence.
  • the document explains the role of the fur gene in the iron-taking system of bacteria through its product, a 17KDa protein that exhibits Fe 2 + -dependent DNA binding activity.
  • the protein / wr can act as a positive or negative regulator.
  • the article describes the cloning and construction of a fur mutanie of P. multocida. To do this, inactivate the P. multocida fur gene by simple recombination of a suicide plasmid carrying an inert region of the fur gene. Mediate PCR amplification and using the Furl and Futi primers obtain a 394 base pair fragment comprising nucleotides 18-412 of the fur gene. This fragment is cloned into the plasmid pUA826 giving rise to plasmid pUA891 which is inroduced in P. multocida by "ipaiparental conjugation". Streptomycin-resistant transconjugates are selected.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) Multocida wild and in killer fur. It is observed that the expression of ompH & s greater in the mutant fur than in the wild strains which leads to confirm that the expression of ompH is negatively regulated - by fur. The work also carries out studies of virulence of the mu mutant fur, arriving at the conclusion that both the wild bacteria of P. multocida and the matantes fur present the same level of virulence.
  • the article concludes that, taking into account that the role of the OmpH protein as a protective antigen against P. multocida infection is demonstrated, to obtain "bacterins," the strain to be used should be grown in the absence of glucose due to its inhibitory effect. on the expression of the ompH gene.
  • An object of the present invention provides materials and methods for the production of vaccines comprising double fur ompH mimics and fur ompH galE multiple mutants of
  • Pasteurella multocida since an extract of outer membrane proteins prepared from mutants of Pasteurella multocida fur ompH confer heterologous to ⁇ al protection con ⁇ ra Pasteurella multocida virulent.
  • the invention also mentions that the use of thermally inactivated fur ompH and triple fur ompH galE mutants of P. multocida provides 60% cross protection against virulent P. multocida. Likewise, the invention indicates that when the cells are inactivated by sonication, a higher level of protection is obtained than when they are only treated thermally.
  • an object of the invention is to provide compositions containing said double and multiple mutanis for use as immunogenic agents for protection against P. multocida virulenia.
  • P. multocida iales such as pneumonia in pigs, cattle and small mammals, as well as avian cholera.
  • the present invention also provides a kit for administering said vaccine to animals in danger of becoming ill with P. multocida, which comprises an extract of outer membrane proteins obtained from P. multocida defective in the fur, fur ompH genes (double mutant) and / or fur ompH galE (triple mutant) and a pharmaceutically acceptable vehicle optionally with adjuvants suitable for subsequent administration.
  • FIG.l PCR analysis of the mutants./wr of Pasteurella multocida.
  • Fig. LA Construction of the mutant fur of P. multocida. Fur3 and Aad3 indicate the positions of the primers used to confirm the presence of the mutation ./wr.
  • Fig. LB Chromosomal DNA of the wild strain (PMlOl 1) (canil 2), fur (PM 1095) (lane 3) and fur ompH (PM1094) (lane 4) mutants that were subjected to PCR analysis with primers Aad3 and Fur3 (Table 2). The PCR control without DNA is shown in lane 5. Phage DNA ⁇ X174 digested with HinfL was used as a molecular weight marker (lanes 1 and 6).
  • FIG. 2 Scheme of the structure of the ompHl and ompH2 genes of P. multocida.
  • RTompHlup, RTompHlrp, RTompH2up and RTompH2rp indicate the positions of the primers used for transcriptional analysis.
  • Fig. 2A Results of the RT-PCR analysis of the transcripts of the ompHl genes.
  • Fig. 2B Results of the RT-PCR analysis of the transcripts of the ompH2 genes.
  • Fig. 2C Results of the RT-PCR analysis of the transcripts of the possible ompHl-ompH2 operon
  • Fig. 2D Results of the RT-PCR analysis of the gene transcripts in both the wild strain (PMlOIl) (canil 2) and the fur ompH mutant (PM1094) (lane 3).
  • PCRs with DNA from the wild strain (lane 4) and from a negative conirol without RNA or DNA (lane 5) are also shown.
  • Phage DNA ⁇ X174 digested with Hin ⁇ (B and C) and phage ⁇ , digested with BstEll (D) were used as molecular weight markers (lanes 1 and 6).
  • FIG. 3 PCR analysis of the construction of the P mutanie galE. multocida
  • Fig. 3A Construction of the galE mutanie of P. multocida.
  • GalEin ⁇ 2up and pKO3-R indicate the positions of the primers used to confirm the presence of the galE mutation.
  • Fig. 3B Chromosomal DNA of the wild strain (PMlOIl) (lane 2), killers fur ompH (PM 1094) (canil 3) and fur ompH galE (PMl 096) (lane 4) that were subjected to PCR analysis using the GalEin ⁇ 2up and pKO3 primers -R (Table 2). The PCR control without DNA is shown on the cannula 5. Phage DNA ⁇ digested with iJs ⁇ EII was used as a molecular weight marker (lanes 1 and 6).
  • the invention relates to mutants derived from Pastewella multocida capable of promoting heterologous protection against infection caused by P. multocida and its use in vaccines. These mutants are defective in the fur gene. This mutant has already been previously described by the same authors of the present application, and its use in vaccines has not been described. In addition to P. multocida fur, double mutants such as the mutant ⁇ w / 'ompHy are obtained, such as the mutant fur on ⁇ HgalE, which are also used to confer heterologous protection against infection caused by P. multocida through incorporation into vaccines .
  • Iron is a necessary element for almost all living cells.
  • Many gram-negative pathogenic bacteria such as Haemophilus influenzae and Neisseria meningitidis, present in their outer membrane proieins that bind to iron-binding molecules, such as ostraferrin, laciphephrine, hemoglobin, heme and ferritin, present in the mucosa of host organisms ( Ratledge, C. and LG Dover. Annu. Rev. Microbiol. 54: 881-941. 2000).
  • the expression of almost all these outer membrane proteins is under the control of the Fur protein ("fen ⁇ c uptake regulator'O regulator of iron uptake) (Stojiljkovic, L, et al. AJ. Baumler and K. Hantke. J.
  • Pasteurella multocida is a pathogenic bacterium that causes various infectious diseases, such as avian cholera, bovine pneumonia and hemorrhagic septicemia, and atrophic rhinitis of the pig, in animals used for food production.
  • vaccination against P. multocida is mainly based on the use of inactivated P. multocida cells, known as "bacterins", or on live attenuated bacteria.
  • bacterins only confer homologous protection; on the other hand, although live vaccines provide homologous and heterologous protection, they contain unknown attenuation markers
  • Cross protection is known from bacterins (Glisson, JR, MD Contreras, LH. Cheng, and C. Wang. Avian. Dis. 37: 1074-1079. 1993) as well as from extracts of outer membrane proteins (Adler B. et al J. Biotechnol., VoI. 44, pp. 139-144. 1996; Ruffolo, CG, et al BH Jose, and B. Adler. Vet. Microbiol. 59: 123-137. 1998) obtained from P Multocida grown in medium deficient in iron. This heterologous protection seems to be based on the overexpression of the outer membrane proteins regulated by P.
  • multocida iron induced by the absence of iron in the medium, and as a consequence, inside the cells.
  • This approach is limited by the fact that bacteria grow very poorly in the presence of divalent cation chelating agents, such as 2,2'-dipyridyl (DPD), which constitutes an important limitation for obtaining vaccines in large quantities.
  • DPD divalent cation chelating agents
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) Overexpression by the P. multocidafur mutant of iron-regulated outer membrane proteins resembles the growth of wild-type P. multodada cells grown in an iron-deficient medium avoiding the poor growth of cells under these conditions.
  • P. multocida mutants all defective in the fur gene, are described as a result of the invention.
  • the fur gene regulates the expression of many iron-regulated proteins in bacteria.
  • overexpression of iron-regulated outer membrane proteins in fur mutants of P. multocida resembles the overexpression that results in the growth of wild-type P. multocida cells in iron-deficient medium.
  • double fur ompH mutants are also described, which do not express the OmpH protein (highly immunogenic), and the triple / ir ompH galE mutants which, in addition to defective in fur and ompH, are also in galE.
  • Vaccines can be based on mutant bacteria (containing the mutations described above) thermally inactivated or by sonication, or based on said iron-regulated outer membrane proteins to which the P. multocida mutants give rise.
  • Mu mutated gene of P. multocida This mutation consists in the disruption of the gene by introduction into the bacterium of a plasmid that contains a 394 base pair fragment of the internal region of this gene between nucleotides 18 and 412.
  • Primers Fur 1 and Fur 2 allow PCR cloning of an internal 394 base pair fragment of the P. multocida fur gene for subsequent insertion into a plasmid.
  • the Fur 3 primer allows the verification that the wild-type gene has been interrupted by integration into P. multocida of the plasmid that integrates the 394 base pair fragment of cloned P. multocida.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) c) Plasmid pUA891, which incorporates the streptomycin resistance gene, which is obtained through the suicide plasmid pUA826, and which allows the cloning of the 394 base pair fragment of the P. multocida fur gene. This plasmid is introduced into P. multocida by triparental junction, subsequently allowing the isolation of putative mimics / Mr by selection.
  • the ompHl mutation is a pointless mutation at position 76 that results in a stop codon instead of a glutamine codon, causing a truncated protein of 24 amino acids to be expressed.
  • the ompH2 mutation involves several nucleotide changes, including a nonsense mutation at position 670, which results in a truncated protein of 223 amino acids instead of the 350 presented by the native protein.
  • the effect produced by the nonsense mutations in ompHl and ompH2 is the absence of expression of the 36 KDa OMP protein.
  • the primers OmpHl sequp and OmpH2seqdw amplify the bands containing the ompHl and ompH2 genes (Accession number of the ompHl gene: EF 102481 and the ompH2 gene: EF102482, GenBank) of P. multocida for subsequent cloning into vectors.
  • the Omp21000 and Omp22000 are used to analyze the sequence of the ompHl and ompH2 genes of P. multocida.
  • the ompHl-2up is used to analyze the ompHl sequence of P. multocida.
  • RTompHlup, RTompHlrp, RTompH2up, RTom ⁇ H2dw are used to analyze the transcription of the ompH gene (OmpHl and 0mpH2) in P. multocida.
  • the sequence of the indicated oligos can be seen in Table 2.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) h) Imitant P. multocida bacteria. These bacteria are defective in certain genes.
  • the P. multocida fur mimics are defective in the fur gene, preventing the formation of the fur-Fe (II) complex, not causing the transcription blockade of iron-regulated genes. These mimics or the iron-regulated outer membrane proteins to which they give rise can be used in the manufacture of vaccines against P. multocida, capable of proportional-heterologous protection against virulent P. multocida. Since growth in Fe-deficient medium is not necessary, a higher yield is achieved in the culture of the bacteria (whose growth is very poor in the presence of chelating agents).
  • the P. multocida fur bacteria are obtained after the isolation of the mimics obtained by the insertion of the plasmid that incorporates the 394 base pair fragment of the P. multocida fur gene.
  • Another object of the invention is the P. multocida fur ompHs mutants. These bacteria are defective in the fur and ompH genes. Thus, there is no expression of ompHl and ompH2 in them. This fact makes said mutants, when used in vaccines, confer greater protection than fur mutants (consequence not expected since ompH encodes the protein
  • the triple mutants P. multocida fur ompH galE have also been obtained.
  • the objective of the galE mutation is to optimize the exposure surface of iron-regulated outer membrane proteins of the P. multocida fur ompH mutant in order to increase protection against P. multocida.
  • the sequence of the primers used to amplify a 495 base pair fragment of galE is provided, which is subsequently cloned into plasmid pUA1089.
  • This plasmid is introduced by triparental conjugation in P. multocida fur mutants ?7? ⁇ pHPM1094, subsequently performing the selection of triple mutants.
  • the effectiveness experiments of these vaccines performed in vivo in mice show a level of protection equal to that conferred by the ompH mimics.
  • Vaccines comprising the mutant bacteria P. multocida fur, fur ompHofur ompH GalE, thermally inactivated or by sonication and / or iron-regulated outer membrane protein extracts of these mutants, comprising one or more adjuvants and / or one or plus
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) pharmaceutically acceptable vehicles.
  • the vaccine can be applied in the fight against any of the diseases caused by P. multocida, such as pneumonia in pigs and cattle; Avian cholera and pneumonia in small mammals such as rabbits and hamsters, etc.
  • the P. multocida fur, fur ompH ofur ompH galE mutants can be combined with any of the usual adjuvants in this type of veterinary vaccines, such as lipopolysaccharides, Freund's complete or incomplete adjuvant, monophospholipids such as monophospholipid A, sulfates, phosphates such as aluminum phosphate, and hydroxides such as hydrated aluminum hydroxyphosphate and aluminum hydroxide.
  • adjuvants such as lipopolysaccharides, Freund's complete or incomplete adjuvant, monophospholipids such as monophospholipid A, sulfates, phosphates such as aluminum phosphate, and hydroxides such as hydrated aluminum hydroxyphosphate and aluminum hydroxide.
  • the dose of the vaccine will vary depending on the concentration of the antigenic material; for example for a vaccine based on inactivated cells the dose will be 0.1 ml using a concentration of 10 9 cfu / ml of the fur ofur ompHofur ompH galE mutant in a 1 ml solution of physiological serum used as a vehicle, although in general the Asset concentration will be 7 x 10 8 alx 10 9 cfu / ml in a vehicle ImI solution and optionally an adjuvant such as for example 0.7% aluminum hydroxide.
  • a vaccine based on external membrane protein extracts An example would be a dose of 0.1 ml using a concentration of 400 ⁇ g of extract in a solution of 1 ml of physiological serum, although in general the concentration of active will be 100 to 400 ⁇ g in a solution of vehicle ImI and optionally a adjuvant such as 0.7% aluminum hydroxide
  • Bacterial strains and plasmids used in the present invention Bacterial strains and plasmids used in the present invention
  • d Position of the oligonucleotide end with respect to the Smal insertion site in pKO3.
  • e Position of the end of the oligonucleotide with respect to the initial transcription point of the ompHl gene of P. multocida.
  • the list of bacterial strains used is shown in Table 1. All strains of P. multocida were grown in liquid medium, in buffered peptone water (BPW) or BHI, - in SBA agar plates. When necessary, antibiotics were added at the concentrations described (Cárdenas, M. et al. AR Fernández de Henestrosa, S. Campoy, AM Pérez de Rozas, J. Barbé, I. Badiola, and M. Llagostera. Vet. Microbiol. 80: 53-61. 2001). In the growth of the wild strain, the concentration of chelating agent of divalent cations, 2-2'-dipyridyl DPD (Sigma) used was 150 ⁇ M (Table 3).
  • the P. multocida fur mutant was obtained from plasmid pUA891 ( Figure IA).
  • This plasmid is obtained as a result of the insertion of an internal fragment of the pUA826 gene (Bosch, M., R. Tarrago, ME -Garrido, S. Campoy, AR Fernández de Henestrosa, AM Pérez de Rozas, I. Badiola, and J Barbé, FEMS Microbiol, Lett. 203: 35-40, 2001) with an internal fragment of the Pasteurella multocida fur gene of 394 bp.
  • PUA826 is derived from pGY2 (26-) to which the cat gene has been extracted by restriction with SaIL.
  • Plasmid pGY2 has an origin of R6K replication (dependent on the ⁇ pir protein to replicate, therefore it is suicidal in Pasteurella multocida, it contains the region Mobilization of RP4 mob and genes that confer resistance to ampicillin (bla), streptomycin and spectinomycin (aad ⁇ ) and chloramphenicol ⁇ cat). This last gene, as already mentioned, is not in the plasmids ⁇ UA826 and pUA891.
  • the plasmid pUA1090 was used to construct the fur ompHgalE mutant ( Figure 3A). This plasmid is the result of cloning in plasmid pUA1089 (pKO3 with the mob site of pUA826) of an internal 495 bp fragment of the galE gene of Pasteurella multocida. Plasmid pUA1090 was introduced by triparental conjugation in the mutant strain fur ompH, the transconjugants being selected on selective plates.
  • the fur mutants were subcultured 20 consecutive times on SBA plates without adding antibiotics.
  • concentration of viable bacteria was determined at 5, 15 and 20 passes using appropriate dilutions of a cell suspension (10 9 cfu / ml) on SBA plates with and without streptomycin, since pUA891 encodes the resistance gene to this antibiotic.
  • the percentage of stability was calculated as the number of colonies obtained in plates supplemented with antibiotic compared to those that did not contain antibiotics.
  • Inactivated cells were prepared by sonication sonicating 7 x August 10 cfu / ml, resuspended in BPW, five times for five minutes in an ice bath at -40 0 C, in a yield of 80%. The absence of viable cells was tested on SBA plates. In all cases, the volume of extract of inactivated cells inoculated ⁇ ie of 100 ⁇ l and was administered in two doses with an interval of two weeks. Negative control and heterologous challenge were carried out as described above.
  • the internal 394-bp fragment of the P. multocida fur gene was obtained by PCR amplification using the Furl and Fur2 primers (Table 2). The fragment obtained was cloned into the suicide plasmid pUA826, resulting in the plasmid pUA891 (Fig.lA).
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) clearly the absence of the main 36-IdDa external membrane protein (OMP) in the mutant P. multocida fur ompHQs due to nonsense mutations in ompHl and ompH2.
  • Figure 2 shows the scheme of the structure of the ompHl and ompH2 genes of P. multocida. RTompHlup, RTompHlrp, RTompH2up and RTompH2rp indicate the positions of the primers used for transcriptional analysis (A).
  • Sections (B), (C) and (D) show the RT-PCR analysis of the transcripts of the ompHl, ompH2 genes and the possible ompHl-ompHl operon in both the wild strain (PMlOI l) (lane 2) and in the mutant fur ompH (PM1094) (lane 3).
  • Total RNA was used from each of the strains and primer pairs RTompHlup and RTompHlrp, RTompH2up and RTompH2rp and RTompHlup and RTompH2rp, respectively.
  • PCRs with DNA of the wild strain (lane 4) and of a negative control without RNA or DNA (lane 5) are also shown. Phage DNA ⁇ X174 digested with Hin ⁇ (B and C) and phage ⁇ digested with BstE ⁇ L (D) were used as molecular weight markers (lane 1).
  • mice were immunized with 10 and 40 ⁇ g / animal of outer membrane protein extract
  • OMP outer membrane protein extract
  • a mupopolysaccharide (LPS) mutation of the fur ompH mutant was introduced , resulting in a derived strain.
  • the galE gene product catalyzes the epimerization of UDP-galactose to UDP-glucose and is necessary for the correct synthesis of the lipopolysaccharide center.
  • a galE mutant was constructed capable of growing in the presence of glucose but unable to synthesize the surface LPS of wild-type cells.
  • Figure 3 describes the PCR analysis of the construction of the P. multocida galE mutant.
  • Section (A) shows the construction of the P. multocida galE mutant.
  • GalEint2up and pKO3-R indicate the positions of the primers used to confirm the presence of the galE mutation and
  • section (B) shows the chromosomal DNA of the wild strain (PMlOIl) (lane 2), mimics> / » ompH (PM1094) (lane 3) and fur ompH galE (PM1096) (lane 4) that were subjected to PCR analysis using primers GalEint2up and pKO3-R (Table 2).
  • the PCR control without DNA is shown in lane 5.
  • DNA of phage ⁇ digested with BstEil was used as a molecular weight marker (lanes 1 and 6).
  • mice Groups of five mice were inoculated with 7 x 10 7 cfu / animal of thermally inactivated fur ompH galE cells (45 0 C for 12 hours) and subsequently faced the heterologous challenge of PMl 002 with doses of 100 and 50OxLD 5O .
  • animals immunized with the thermally inactivated strain were protected by 60% with the lowest dose.
  • iron-regulated outer membrane proteins IROMPs
  • Pasteurella multocida exbB, exbD and tonB genes are physically linked but independently transcribed. FEMS Microbiol Lett. 210: 201-208.
  • Pasteurella multocida contains multiple immunogenic haemin- and haemoglobin-binding proteins. Vet. Microbiol 99: 103-112.
  • Fur ferric uptake regulation protein and CAP (catabolite-activator protein) modulate transcription o ⁇ fur gene in
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26 ⁇ 21. May, BJ, Q. Zhang, LL Li, ML Paustian, TS Whittam, and V. Kapur. 2001. Complete genomic sequence of Pastenrella multocida, Pm70. Proc. Nati Acad. Sci. USA. 98: 3460-3465.

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Abstract

La invención se refiere a mutantes de Pasteurella multocida capaces de conferir protección heteróloga frente a la infección producida por P. multocida virulenta. Estos mutantes son defectivos en los genes fur ompH y fur ompH galE. La presente invención se refiere a composiciones de vacuna contra la bacteria Pasteurella multocida, que comprenden dobles mutantes fur ompH y mutantes triples fur ompH galE obtenidos a partir de P. multocida, o un extracto de proteínas de membrana externa reguladas por hierro (IROMPs) obtenidas a partir de dichos mutantes, y un vehículo y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

Description

Protección heteróloga contra Pasteurella multocida proporcionada por células de P. multocida fur y sus extractos proteicos de membrana externa
Campo de la invención
La invención se refiere a mutantes de Pasteurella multocida capaces de conferir protección heteróloga frente a la infección producida por P. multocida virulenta. Estos mutantes son defectivos en los genes: fur ompH y fur ompH galE. La presente invención se refiere a composiciones de vacuna contra bacterias del género Pasteurella, concretamente Pasteurella multocida que comprenden dobles mutantes fur ompHy mutantes triples fur ompH galE, obtenidos a partir de P. multocida o un extracto de proteínas de membrana extema reguladas por hierro (IROMPs) obtenidas a partir de dichos mutantes y un vehículo y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
Estado de la técnica anterior
Las infecciones bacterianas son una causa importante de enfermedades en el mundo, tanto en animales como en el hombre, especialmente en niños. Entre las bacterias causantes de enfermedades se encuentra el género Pasteurella en el que se incluyen en la actualidad 20 especies entre las que se encuentra Pasteurella multocida que es ϋna bacteria patógena que causa diversas enfermedades infecciosas, tales como el cólera aviar, la neumonía bovina, septicemia hemorrágica y rinitis atrófica del cerdo, en animales utilizados para la producción de alimentos, por lo que el control de la enfermedad es de gran importancia para los ganaderos dedicados a la crianza de este ganado.
Por lo tanto es importante desarrollar una vacuna que evite que el ganado se infecte. El objetivo del desarrollo de cualquier vacuna es proporcionar la debida protección durante el mayor tiempo posible.
Tradicionalmente se han desarrollado fundamentalmente tres tipos de vacunas: a) "vacunas vivas atenuadas" en las que se utiliza el patógeno vivo al que se ha reducido o eliminado su virulencia incapacitado para su crecimiento, b) vacunas en las que se utilizan componentes purificados del patógeno, y c) las "vacunas muertas" en las que el patógeno muerto se utiliza directamente. Cada uno de estos tipos de vacunas tiene sus ventajas e inconvenientes; las vacunas vivas atenuadas son las que producen una protección en condiciones similares a la de la enfermedad natural. Sin embargo, las vacunas del tipo (b) y (c) son más atractivas desde el punto de vista de la seguridad.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) En medicina veterinaria, la vacunación contra P. multocida se basa principalmente en la utilización de células de P. multocida inactivadas, conocidas como "bacterinas", o en bacterias vivas atenuadas. Las bacterinas sólo confieren protección homologa; las vacunas vivas proporcionan protección homologa y heteróloga, sin embargo contienen marcadores de atenuación desconocidos y, en algunos casos, han sido asociadas incluso con brotes de epidemias.
En los documentos de patente US 3,855,408, US 4,169,886 y US 4,626,430 se describen "vacunas vivas" contra P. multocida.
La solicitud de patente WO 98/56901 A2 cuyo título es "Live attenuated vaccines" describe bacterias atenuadas en las cuales el gen fur o un gen homólogo al mismo, es modificado de manera que la expresión del producto del gen fur, o de su homólogo, es regulada independientemente de la concentración de hierro presente en el medio en que se encuentra la bacteria. Dichas bacterias pueden ser utilizadas como "vacunas vivas". El documento se refiere en general a cualquier bacteria gramnegativa aunque se centra en particular en Neisseria meningitidis.
La atenuación de la bacteria se lleva a cabo por mutación de un gen esencial para la producción de un metabolito o catabolito no producido por humanos o animales. Preferiblemente, las mutaciones para atenuar a la bacteria son en el gen aro o en un gen de la ruta de las purinas o pirimidinas. En otro aspecto de la invención, la bacteria comprende una mutación recA.
La invención también proporciona vacunas así como el método para producir una bacteria según la invención y que comprende la modificación del gen fur nativo o de un homólogo, de una bacteria atenuada, de manera que la expresión del gen fur o de su homólogo es regulada independientemente de la concentración de hierro presente en el entorno de la bacteria.
El documento señala que, en el pasado, en intentos de producción de vacunas vivas atenuadas, los organismos no producían ciertas proteínas importantes para la protección cruzada durante el cultivo en masa. Estas proteínas incluían las proteínas reguladas por hierro, cuya producción está regulada por el geiifur. Adicionalmente, una vez estas bacterias se administraban al huésped, las cepas de la vacuna no tenían tiempo o recursos metabólicos durante su limitada colonización para expresar estas proteínas.
La producción de cepas de bacterias atenuadas en las cuales la expresión de fur ha sido modificada, es una técnica aplicable de manera general. Así, una bacteria patogénica cuyo genoma comprenda el gen fur o un homólogo al mismo, siendo la bacteria atenuada por supresión o modificación de un gen esencial para el crecimiento en el huésped en el que la bacteria es patogénica, puede ser modificada según se ha descrito de manera que la bacteria produce el producto del gen fur o de su homólogo de manera independiente a la concentración de hierro
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) presente en el entorno de la bacteria. Los homólogos de fur pueden ser identificados por comparación con secuencias conocidas de otros genes fur como por ejemplo E. coli y N. meningitidis. Preferentemente, estos homólogos son substancialmente homólogos a otros genes fur conocidos, con una identidad de entre 60-70% en una longitud de al menos 100 aminoácidos. Por lo tanto, genes identificados en otras bacterias que codifican factores de la transcripción y que además presentan la propiedad de responder a la presencia de hierro, también pueden ser usados.
La invención propone también mutaciones en los genes recA y contá para proporcionar estabilidad a la bacteria que se emplea en la vacuna. Estas mutaciones deben ser introducidas como modificaciones genéticas finales, a continuación del resto de modificaciones descritas.
En la solicitud de patente ES 2059 503 T3 cuyo título es "Vacuna contra la pasteurelosis" se describen vacunas contra bacterias del género Pαsteurellα, y en concreto, en ciertos casos contra Pαsteurellα multocidα.
El documento describe que cuando los organismos de Pαsteurellα se cultivan bajo condiciones de restricción de hierro, la extracción de la membrana externa o el Usado de la célula entera originan un perfil proteico diferente del obtenido en condiciones normales in vitro, más inmunogénico que el producido por el mismo organismo cultivado bajo condiciones normales de crecimiento. Las células enteras inactivadas de Pαsteurellα cultivadas bajo condiciones de restricción de hierro que incluye la "bacterina", con el propósito de preparar una vacuna, se incluyen dentro de la invención.
La invención propone formular la vacuna para uso de serotipo homólogo, pero también incluye una vacuna polivalente que contiene proteínas reguladas por hierro de todos los serotipos de Pαsteurellα patológicamente importantes. Así, este documento de solicitud de patente se centra en proteínas reguladas por hierro, anticuerpos monoclonales o policlonales para dichas proteínas y formulaciones de vacunas en las que el material proteico puede estar combinado con cualquiera de los coadyuvantes habituales en vacunas veterinarias. El documento precisa que debe controlarse cuidadosamente las proporciones de agente quelante a utilizar ya que una concentración demasiado grande impediría el cultivo de las bacterias.
En el documento de patente US 6,790,950 B2 cuyo título es "Anti-bacterial vaccine compositions" se identifican genes virulentos de bacterias gramnegativas (centrándose en Pαsteurellα multocidα como un caso particular) que permite la identificación de nuevos agentes antibacterianos dirigidos contra esos genes virulentos y sus productos.
En esta patente se hace referencia a los intentos para producir composiciones de vacunas, que tradicionalmente utilizan células enteras de bacterias muertas (inactivadas) proporcionando
HOJA DE REEMPLAZO (Regia 26) únicamente protección específica de un serotipo, lo cual supone un problema para la vacunación dada la existencia de diferentes serotipos. Los inventores hacen alusión a un estudio en el que una vacuna de bacteria atenuada, que produce una forma inactiva de la toxina ApxII, ha mostrado protección cruzada.
Teniendo en cuenta los problemas asociados con las formulaciones de vacunas que comprenden cepas bacterianas con mutaciones indefinidas, espontáneas, los autores de dicho documento se centran en la construcción de bacterias atenuadas para su uso como vacunas que sean seguras y proporcionen protección homologa y heteróloga contra serotipos de Pasteurella, así como en la identificación de bacterias atenuadas y genes necesarios para la virulencia bacteriana, que faciliten el desarrollo de métodos de identificación de agentes antibacterianos. Así, este documento proporciona organismos bacterianos gramnegativos (Pasteurella mvltocida entre ellos), que contienen mutaciones funcionales en la secuencia de ciertos genes. Esta mutación inhibe o impide la expresión o la actividad biológica del producto codificado por el gen, siendo el efecto de esta mutación la atenuación de la virulencia de la cepa bacteriana.
Se describen composiciones que comprenden organismos bacterianos gramnegativos mutados y atenuados y, opcionalmente un adyuvante y/o un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable con vistas a la construcción de una vacuna que prevenga la infección bacteriana o los síntomas asociados a ella.
Para que la cepa modificada de la invención sea efectiva en una formulación farmacéutica, los inventores señalan que la atenuación debe ser lo suficientemente significativa para evitar síntomas clínicos de infección, pero permitiendo replicación y crecimiento limitado de la bacteria en el huésped.
La invención proporciona cepas atenuadas de P. múltocida, vacunas (aplicables a humanos y animales), polinucleótidos que codifican productos génicos necesarios para la virulencia de las bacterias gramnegativas, células huésped transformadas con los polinucleótidos de la infección, métodos de producción de los polipéptidos de la invención, métodos de tratamiento de sujetos infectados por bacterias gramnegativas mediante la administración de los agentes antibacterianos definidos en la invención etc.
Sin embargo, en este documento sólo se reivindican los polinucleótidos codificados por las secuencias que se proporcionan así como los vectores que los incluyen y las células huésped transformadas con ellos. Las bacterias mutadas Pasteurella descritas por esta invención, son utilizadas de manera atenuada.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Es de resaltar que la mutación fur objeto de la presente solicitud de invención no conlleva la disminución de la virulencia de la bacteria por lo que no estaría englobada dentro de este grupo de mutaciones. En el mencionado documento US 6,790,950 B2 refieren la dificultad de conferir protección heteróloga vía vacunación con células completas muertas, que es lo que la invención de la presente solicitud consigue.
La solicitud de patente WO 99/29724 A2 cuyo título es "DNA encoding Pasteurella multocida outer membrane protein" reivindica una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que comprende una secuencia de ácido nucleico preseleccionada que codifica una proteína de membrana o polipéptido OmpH de Pasteurella multocida aviar y una subunidad o una variante biológicamente activa. Para ello, secuencian y clonan OmpHs de 16 serotipos (que presentan una identidad del 73%) de P. multocida.
En esta solicitud de patente se muestran estudios de protección homologa de pollos a través de polipéptidos X-73 de membrana externa aislados y purificados. Asimismo, indican que las composiciones inmunogénicas de la invención pueden ser usadas en combinación con bacterinas. Estas composiciones inmunogénicas comprenden una cantidad efectiva de polipéptido de membrana externa de P. multocida aislado y purificado en combinación, subunidad, péptido, variante o combinación de ellos, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable que, tras su administración a vertebrados, induce la producción de anticuerpos específicos para porinas de membrana externa de P. multocida. La invención también proporciona un método para detectar o determinar la presencia de anticuerpos que son específicos para P. multocida aviar.
En el artículo cuyo título es "Use of a repórter gene to follow high-pressure signal transduction in the Deep-Sea Bacterium Photobacterium sp. Strain SS9" [Ellen Chi y Douglas H. Bartlett, (American Sociery for Microbiology, p. 7533-7540 (1993)] se desarrolla el primer sistema genético de una bacteria barofílica, la Photobacterium spl SS9. Se describe el uso de este sistema en la caracterización inicial de los mecanismos regulatorios que controlan la expresión del gen ompHen respuesta a cambios en la presión hidrostática.
Para estudiar dicha relación entre el gen ompH y la presión, obtienen una cepa de Photobacterium spl ompHLac. También obtienen cepas imitantes de ompH seleccionadas en condiciones de presión de 1 atm. De esta manera, consiguen cuatro imitantes, tres de los cuales no se ven afectados en su expresión por la presión del medio. Sin embargo, el cuarto mutante (EC 1002) demuestra ser sensible de forma extrema a la presión. Así, la futura caracterización de mutantes sensibles a la presión, como ECl 002, ofrecerá la oportunidad de identificar funciones necesarias para la adaptación a altas presiones.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Se observa que aunque en el trabajo descrito en este artículo se construyen mutantes ompH de una bacteria gramnegativa, estos mutantes no están dirigidos a estudios de inmunidad frente a dicha bacteria, es más, en este caso concreto, los mutantes ompH defectivos están dirigidos a la identificación de funciones importantes para el crecimiento a altas presiones.
Por último, los autores de la presente solicitud, en el artículo cuyo título es "Expresión of the Pasteυrella multocida ompH gene is negatively regulated by the Fur protein" [Montserrat Bosch, Raúl Tarrago, Ma Elena Garrido, Susana Campoy, Antonio R. Fernández de Henestrosa, Ana M. Pérez de Rozas, Ignacio Badiola y Jordi Barbé; FEMS Microbiology Letters 203, 35-40 (2001)] profundizan en los mecanismos y regulación de toma de hierro en P. multocida. Mediante la construcción de un muíante fur de P. multocida, se demuestra que el gen ompH, que codifica la principal proteína estructural de membrana (que presenta alta antigenicidad), está negativamente regulado por la proteína Fur, hierro y glucosa. Así mismo, también se demuestra que células P. multocida de tipo salvaje y fur defectivas presentan el mismo nivel de virulencia.
El documento explica el papel del gen fur en el sistema de toma de hierro de las bacterias a través de su producto, una proteína de 17KDa que presenta actividad de unión a DNA dependiente de Fe2+. La proteína/wr puede actuar como regulador positivo o negativo.
Teniendo en cuenta que es conocido que cultivos en condiciones defectivas en hierro inducen protección heteróloga contra la infección producida por cepas virulentas de P. multocida, los autores proponen obtener, aislar y caracterizar un muíante fur defectivo de este organismo. La secuencia de nucleótidos de esíe gen está registrada en GenBank con el Número de Acceso
AF027154.
El artículo describe la clonación y construcción de un mutaníe fur de P. multocida. Para ello, inacíivan el gen fur de P. multocida por recombinación simple de un plásmido suicida que porta una región iníerna del gen fur. Medianíe amplificación por PCR y usando los cebadores Furl y Futí obtienen un fragmento de 394 pares de bases que comprende los nucleótidos 18-412 del gen fur. Esíe fragmento es clonado en el plásmido suicida pUA826 dando lugar al plásmido pUA891 que es iníroducido en P. multocida por "conjugación íriparental". Los transconjugados resisíeníes a estreptomicina son seleccionados.
Tanto el modo de inactivación del gen fur como la región amplificada y los cebadores y plásmidos empleados, se utilizan como punto de partida para la obtención posterior de los mutantes doble y triple, objeto de la presente solicitud de pateníe.
Posíeriormeníe, el estudio llevado a cabo en esíe artículo continúa analizando la expresión del gen ompH (que codifica la porina de 36 KDa que hemos indicado anterionneníe) de P.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) multocida salvaje y en matantes fur. Se observa que la expresión de ompH&s mayor en el muíante fur que en las cepas salvajes lo que lleva a confirmar que Ia expresión de ompH está negativamente regulada -por fur. El trabajo también realiza estudios de virulencia del muíante fur, llegando a la conclusión de que tanto las bacterias salvajes de P. multocida como los matantes fur presentan el mismo nivel de virulencia.
El artículo concluye que, teniendo en cuenía que está demostrado el papel de la proteína OmpH como antígeno protector contra la infección por P. multocida, para obtener "bacterinas", la cepa a utilizar debería ser crecida en ausencia de glucosa debido a su efecto inhibitorio sobre la expresión del gen ompH.
Compendio de la invención
Un objeto de la preseníe invención proporciona maíeriales y métodos para la producción de vacunas que comprenden imitantes dobles fur ompH y mutantes íriples fur ompH galE de
Pasteurella multocida, ya que un extracto de proteínas de la membrana externa preparado a partir de mutantes de Pasteurella multocida fur ompH confieren protección toíal heteróloga coníra Pasteurella multocida virulenta.
La invención también menciona que el uso de mutantes fur ompH y triples mutantes fur ompH galE de P. multocida inacíivados térmicamente proporciona protección cruzada de un 60% contra P. multocida virulenta. Así mismo, la invención señala que cuando las células son inactivadas por sonicación se obtiene un mayor nivel de protección que cuando se tratan únicamente de forma térmica.
Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar composiciones que contengan dichos mutaníes dobles y tiples para ser utilizados como agentes inmunogénicos para la protección contra P. multocida virulenía.
Asimismo, íambién es un objeto de la invención proporcionar vacunas para prevenir la infección causada por P. multocida íales como neumonías en ganado porcino, ganado vacuno y en mamíferos pequeños, así como el cólera aviar.
Además, la presente invención también proporciona un kit para administrar dicha vacuna a animales en peligro de enfermar por P. multocida, que comprende un extracto de proteínas de membrana extema obtenidas a partir de P. multocida defectiva en los genes fur, fur ompH (doble muíante) y/o fur ompH galE (triple muíante) y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcionalmente con adyuvaníes adecuados para su posíerior administración.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Breve descripción de las figuras
FIG.l. Análisis mediante PCR de los mutantes./wr de Pasteurella multocida.
Fig.lA. Construcción del muíante fur de P. multocida. Fur3 y Aad3 indican las posiciones de los cebadores utilizados para confirmar la presencia de la mutación ./wr.
Fig.lB. DNA cromosómico de la cepa salvaje (PMlOl 1) (canil 2), mutantes fur (PM 1095) (carril 3) y fur ompH (PM1094) (carril 4) que fueron sujetos al análisis por PCR con los cebadores Aad3 y Fur3 (Tabla 2). El control de la PCR sin DNA se muestra en la carril 5. DNA del fago ΦX174 digerido con HinfL se utilizó como marcador de pesos moleculares (carriles 1 y 6).
FIG.2. Esquema de la estructura de los genes ompHl y ompH2 de P. multocida. RTompHlup, RTompHlrp, RTompH2up y RTompH2rp indican las posiciones de los cebadores utilizados para el análisis transcripcional.
Fig.2A. Resultados del análisis mediante RT-PCR de los transcritos de los genes ompHl.
Fig.2B. Resultados del análisis mediante RT-PCR de los transcritos de los genes ompH2. Fig.2C. Resultados del análisis mediante RT-PCR de los transcritos de los genes del posible operón ompHl-ompH2
Fig.2D. Resultados del análisis mediante RT-PCR de los transcritos de los genes tanto en la cepa salvaje (PMlOIl) (canil 2) como en la muíante fur ompH (PM1094) (carril 3). Se utilizó RNA toíal de cada una de las cepas y las parejas de cebadores RTompHlup y RTompHlrp, RTompH2up y RTompH2rp y RTompHlup y RTompH2rp, respectivameníe. Se muesíran también las PCRs con DNA de la cepa salvaje (carril 4) y de un conírol negativo sin RNA ni DNA (carril 5). DNA de los fagos ΦX174 digerido con Hinñ (B y C) y del fago λ, digerido con BstEll (D) se utilizaron como marcadores de pesos moleculares (caniles 1 y 6).
FIG.3. Análisis mediante PCR de la construcción del mutaníe galE de P . multocida.
Fig.3A. Construcción del mutaníe galE de P. multocida. GalEiní2up y pKO3-R indican las posiciones de los cebadores utilizados para confirmar la presencia de la mutación galE.
Fig.3B. DNA cromosómico de la cepa salvaje (PMlOIl) (carril 2), matantes fur ompH (PM 1094) (canil 3) y fur ompH galE (PMl 096) (carril 4) que fueron sujetos a análisis mediante PCR uíilizando los cebadores GalEiní2up y pKO3-R (Tabla 2). El control de PCR sin DNA se muestra en la canil 5. DNA del fago λ digerido con iJsíEII se utilizó como marcador de pesos moleculares (carriles 1 y 6).
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Descripción detallada de la invención
La invención se refiere a mutantes derivados de Pastewella multocida capaces de promover protección heteróloga frente a la infección producida por P. multocida y su utilización en vacunas. Estos mutantes son defectivos en el gen fur. Este muíante ya ha sido descrito previamente por los mismos autores de la presente solicitud, no habiendo sido descrita su utilización en vacunas. Además de P. multocida fur se obtienen mutantes dobles como el muíante ^w/' ompHy triples como el muíante fur onψHgalE, los cuales también se utilizan para conferir protección heteróloga frente a la infección producida por P. multocida por medio de su incorporación en vacunas.
El hierro es un elemento necesario para casi todas las células vivas. Muchas bacíerias patógenas gramnegaíivas, íales como Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis, presentan en su membrana externa proíeínas que se unen a moléculas de unión a hierro, como son íransferrina, lacíofeπϊna, hemoglobina, hemo y ferritina, presentes en la mucosa de los organismos huésped (Ratledge, C. y L. G. Dover. Annu. Rev. Microbiol. 54: 881-941. 2000). La expresión de casi todas estas proteínas de membrana extema está bajo el control de la proteína Fur ("fenϊc uptake regulator'O regulador de la captación del hierro) (Stojiljkovic, L, et al AJ. Baumler y K. Hantke. J. Mol. Biol. 236: 531-545. J. Mol. Biol. 240: 271. 1994), la cual se une al hierro presente en el citoplasma de las bacterias. En esta reacción, la proteína Fur forma un complejo con Fe(II), el cual se une posíeriormeníe a una secuencia específica de DNA, conocida como "fiir box " (caja fur) (2,12,14), en la región promotora de los genes regulados por hierro, bloqueando así su íranscripción. Muchas proíeínas de la membrana exíema reguladas por hierro (IROMP o "iron- regulaíed ouíer membrana proteins") son poderosos antígenos y factores esenciales para la virulencia duraníe el proceso de infección de algunos patógenos (Raíledge, C, y L. G. Dover. Annu. Rev. Microbiol. 54: 881-941. 2000). Por esía razón, dichas proíeínas de la membrana exíerna reguladas por hierro se han propuesto como posibles candidaías para vacunas basadas en un receptor purificado (Chibber, S., y S.B. Bhardwaj J. Med. Microbiol. 53: 705-706. 2004), o utilizando antisuero anti-IROMP (Sood, S., P. Rishi, V. Dahwan, S. Sharma, y N.K. Ganguly. Mol. CeIl. Biochem. 273:69-78. 2005).
Pasteurella multocida es una bacíeria patógena que causa diversas enfermedades infecciosas, tales como cólera aviar, neumonía bovina y septicemia hemorrágica, y rinitis atrófica del cerdo, en animales utilizados para la producción de alimentos. En medicina veterinaria, la vacunación contra P. multocida se basa principalmente en la utilización de células de P. multocida inactivadas, conocidas como "bacterinas", o en bacterias vivas atenuadas. Sin embargo, las bacterinas solo confieren protección homologa; por otro lado, aunque las vacunas vivas proporcionan protección homologa y heteróloga, contienen marcadores de atenuación desconocidos
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) y, en algunos casos, han sido incluso asociadas con brotes de epidemias. La protección homologa se ha obtenido utilizando proteínas de membrana externa de P. multocida crecidas sin privación del hierro (Basagoudanavar, S.H., D.K. Singh y B.C. Varshney. J. Vet. Med. 53: 524-530. 2006). Además, se han descrito recientemente varias cepas vivas atenuadas bien definidas que son candidatas prometedoras para vacunas (10,17).
Se conoce protección cruzada a partir de bacterinas (Glisson, J.R., M.D. Contreras, LH. Cheng, y C.Wang. Avian. Dis. 37:1074-1079. 1993) así como a partir de extractos de proteínas de membrana extema (Adler B. et al J. Biotechnol., VoI. 44, pp. 139-144. 1996; Ruffolo, C.G., et al B.H. José, y B. Adler. Vet. Microbiol. 59:123-137. 1998) obtenidas de P. multocida crecidas en medio deficiente en hierro. Esta protección heteróloga parece basarse en la sobreexpresión de las proteínas de membrana externa reguladas por hierro de P. multocida, inducida por la ausencia de hierro en el medio, y como consecuencia, en el interior de las células. Este enfoque está limitado por el hecho de que las bacterias crecen muy pobremente en presencia de agentes quelantes de cationes divalentes, tales como el 2,2'-dipiridilo (DPD), lo que constituye una limitación importante para obtener vacunas en grandes cantidades.
Inicialmente se caracterizaron dos receptores de unión a hemoglobina en P. multocida (Bosch, M., et al M.E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Pérez de Rozas. I. Badiola, y J. Barbé. Infecí. Immun. 70: 5955-5964. 2002; Cox, A. J., M.L. Hunt, J.D. Boyce, y B. Adler. Microb. Pathog. 34: 287-296, 2003), y posteriormente se demostró que esta bacteria posee un mínimo de seis proteínas de unión a hemo- y/o hemoglobina, todas ellas inmunogénicas (Bosch, et al M., M.E. Garrido, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, J. Barbé, y M. Llagostera. Vet. Microbiol. 99: 103-112. 2004 ); sin embargo, cuando son inoculadas individualmente, ninguna de ellas confiere protección contra un ataque heterólogo (Bosch, M., M.E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, y J. Barbé. Infecí. Immun. 70: 5955-5964. 2002; Bosch, M., M.E. Gañido, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, J. Barbé, y M. Llagostera. Veí. Microbiol. 99: 103-112. 2004; B. Adler, comunicación personal).
El aislamiento recieníe del gen fur de P. multocida ha permitido a los autores de la preseníe solicitad la construcción de muíanles ,/wr de esta especie de bacteria (Bosch, M., R. Tarrago, M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. Fernández de Henestrosa, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, y J. Barbé. FEMS Microbiol. Lett. 203:35-40. 2001). Dado que Fur regula muchas proteínas capíadoras de hierro bacíerianas, los autores de la presente solicitad han estudiado la protección heteróloga conferida por células de P. multocida fur.
La estrategia de usar muíaníes/wr soluciona problemas asociados con el pobre crecimiento que se observa en el cultivo de bacterias en presencia de agentes quelantes de hierro, ya que la
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) sobreexpresión por el muíante de P. multocidafur de proteínas de la membrana extema reguladas por hierro se asemeja al crecimiento de células de P. multoáda de tipo salvaje crecidas en un medio deficiente en hierro evitando el pobre crecimiento que muestran las células en esas condiciones.
Entre sus usos se destaca el desarrollo de vacunas basadas en proteínas de la membrana externa reguladas por hierro, particularmente contra patógenos que presenten varios y distintos receptores de hierro, como es el caso de P. multocida.
Se describen como resultado de la invención, mutantes de P. multocida, todos ellos defectivos en el gen fur. El gen fur regula la expresión de muchas proteínas reguladas por hierro en bacterias. Así, la sobreexpresión de proteínas de membrana externa reguladas por hierro en mutantes fur de P. multocida se asemeja a la sobreexpresión a la que da lugar el crecimiento de células de P. multocida de tipo silvestre en medio deficiente en hierro.
Además de los mutantes fur, también se describen mutantes dobles fur ompH, que no expresan la proteína OmpH (altamente inmunogénica), y los mutantes triples /ir ompH galE que, además de defectivos en fur y ompH, también lo son en galE.
Junto con los mutantes de Ia invención, también se describen los oligos empleados para dar lugar a la mutación correspondiente, los plásmidos que los incorporan, así como las vacunas a las que los mutantes dan lugar. Las vacunas pueden estar basadas en bacterias mutantes (que contengan las mutaciones anteriormente descritas) inactivadas térmicamente o por sonicación, o basadas en dichas proteínas de membrana externa reguladas por hierro a las que los mutantes de P. multocida dan lugar.
Por lo tanto en la presente solicitud se describe:
a) Gen mutado fur de P. multocida. Esta mutación consiste en la disrupción del gen por introducción en la bacteria de un plásmido que contiene un fragmento de 394 pares de pares de bases de la región interna de este gen comprendido entre los nucleótidos 18 y 412.
b) Los cebadores Fur 1, Fur 2 y Fur3. Los cebadores Fur 1 y Fur 2 permiten la clonación por PCR de un fragmento interno de 394 pares de bases del gen fur de P. multocida para su posterior inserción en un plásmido. El cebador Fur 3 permite Ia comprobación de que el gen de tipo silvestre ha sido interrumpido por integración en P. multocida del plásmido que integra el fragmento de 394 pares de bases de P. multocida clonado.
La secuencia de los oligos Furl, Fur2 y Fur3 se puede observar en la Tabla 2.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) c) Plásmido pUA891, que incorpora el gen de resistencia a la estreptomicina, que es obtenido a través del plásmido suicida pUA826, y que permite la clonación del fragmento de 394 pares de bases del gen fur de P. multocida. Este plásmido es introducido en P. multocida por unión triparental, permitiendo posteriormente el aislamiento de los imitantes putativos/Mr por selección.
d) Mutaciones sin sentido en los genes ompHl y ompH2. Teniendo en cuenta que en P. multocida existen dos copias del gen ompH separadas por 154 pares de bases, que se transcriben independientemente, se describen dos mutaciones.
La mutación en ompHl es una mutación sin sentido en posición 76 que da lugar a un codón stop en lugar de un codón glutamina, haciendo que se exprese una proteína truncada de 24 aminoácidos. La mutación en ompH2 implica varios cambios nucleotídicos, incluida una mutación sin sentido en posición 670, que da lugar a una proteína truncada de 223 aminoácidos en lugar de los 350 que presenta la proteína nativa. El efecto producido por las mutaciones sin sentido en ompHl y ompH2 es la ausencia de expresión de Ia proteína OMP de 36 KDa.
e) Cebadores OmpHl sequp, OmpH2seqdw, Omp21000, Omp22000, ompHl-2up, RTompHlup, RTompHlrp, RTompH2up y RTompffidw.
Los cebadores OmpHl sequp y OmpH2seqdw, amplifican las bandas que contienen los genes ompHl y ompH2 (Número de acceso del gen ompHl: EF 102481 y del gen ompH2: EF102482, GenBank) de P. multocida para su posterior clonación en vectores. Los Omp21000 y Omp22000, se usan para analizar la secuencia de los genes ompHl y ompH2 de P. multocida. El ompHl-2up se utiliza para analizar la secuencia de ompHl de P. multocida. Y los RTompHlup, RTompHlrp, RTompH2up, RTomρH2dw, se usan para analizar la transcripción del gen ompH (OmpHl y 0mpH2) en P. multocida. La secuencia de los oligos indicados se puede observar en la Tabla 2.
f) Vectores que incorporan el fragmento de P. multocida clonado usando los cebadores y que, por inserción en P. multocida dan lugar al imitante P. multocida fur ompH.
g) Cebadores GalEintup, GalEintrp, GalEint2up, y pKO3-R. Los cebadores GalEintup y GalEintrp son los empleados para obtener el fragmento interno de 495pb del gen galE de P. multocida. GalEint2up es un cebador directo utilizado para confirmar la disrupción del gen galE de P. multocida. pKO3-R es un cebador para confirmar la disrupción del gen galE de P. multocida por la inserción del plásmido pUA891 (plásmido en el que se ha clonado el fragmento de 495 pb.) en P. multocida fur ompH. Las secuencias de estos cebadores se pueden observar en la Tabla 2.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) h) Bacterias P. multocida imitantes. Estas bacterias son defectivas en determinados genes.
Los imitantes P. multocida fur son defectivos en el gen fur, impiden la formación del complejo fur- Fe(II), no produciéndose el bloqueo de la transcripción de los genes regulados por el hierro. Estos imitantes o las proteínas de membrana externa reguladas por hierro a las que dan lugar, pueden ser empleados en la fabricación de vacunas contra P. multocida, capaces de proporcional- protección heteróloga contra P. multocida virulenta. Al no ser necesario el crecimiento en medio deficiente en Fe, se consigue un mayor rendimiento en el cultivo de las bacterias (cuyo crecimiento es muy pobre en presencia de agentes quelantes). Las bacterias P. multocida fur son obtenidas tras el aislamiento de los imitantes obtenidos por la inserción del plásmido que incorpora el fragmento de 394 pares de bases del gen fur de P. multocida. Dichos mutantes ya han sido descritos (Bosch, M., R. Tarrago, M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. Fernández de Henestrosa, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, y J. Barbé. FEMS Microbiol. Lett. 203:35-40. 2001).
Otro objeto de invención lo constituyen los mutantes P. multocida fur ompHs. Dichas bacterias son defectivas en los genes fur y ompH. Así, en ellas no se produce expresión de ompHl y ompH2. Este hecho hace que dichos mutantes, al ser empleados en vacunas, confieran mayor protección que los mutantes fur (consecuencia no esperable ya que ompH codifica la proteína
OmpH de 36KDa, altamente inmunogénica).
Finalmente, también se han obtenido los triples mutantes P. multocida fur ompH galE. El objetivo de la mutación galE es optimizar la superficie de exposición de las proteínas de membrana externa reguladas por hierro del muíante P. multocida fur ompH con el fin de incrementar la protección frente a P. multocida. Para ello, se proporciona la secuencia de los cebadores usados para amplificar un fragmento de 495 pares de bases de galE, que posteriormente es clonado en el plásmido pUA1089. Este plásmido es introducido por conjugación triparental en mutantes P. multocida fur θ7?τpHPM1094, realizándose posteriormente la selección de los mutantes triples. No obstante, los experimentos de efectividad de estas vacunas realizados in vivo en ratones muestran un nivel de protección igual al conferido por los imitantes^ ompH.
i) Utilización de las bacterias mutantes inactivadas P. multocida fur, P. multocida fur ompH, P. multocida fur ompH galE y/o sus proteínas de membrana extema reguladas por hierro, fundamentalmente en forma de extracto, en la elaboración de una vacuna destinada a conferir pzOtección heteróloga a animales susceptibles de ser infectados por P. multocida virulenta, siendo dicha inactivación térmica o por sonicación.
j) Vacunas que comprenden las bacterias mutantes P. multocida fur, fur ompHofur ompH GalE, inactivadas térmicamente o por sonicación y/o extractos de proteínas de membrana extema reguladas por hierro de estos mutantes, que comprendan uno o más adyuvantes y/o uno o más
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) vehículos farmacéuticamente aceptables. Con esta aplicación de la invención, la obtención de vacunas, se cumple el requisito de aplicación industrial de la invención.
Los estudios de protección frente a P. muϊtocida, utilizando los imitantes dobles y triples de la presente solicitud se han llevado a cabo con ratones. Sin embargo, la vacuna se puede aplicar en la lucha contra cualquiera de las enfermedades causadas por P. multocida, tales como neumonías en ganado porcino y vacuno; cólera aviar y neumonías en mamíferos pequeños tales como conejos y hamsters, etc.
Para formular la vacuna, los mutantes P. multocida fur, fur ompH ofur ompH galE pueden combinarse con cualquiera de los coadyuvantes habituales en este tipo de vacunas veterinarias, tales como lipopolisacáridos, el adyuvante completo o incompleto de Freund, monofosfolípidos como el monofosfolípido A, sulfates, fosfatos como el fosfato de aluminio, e hidróxidos como el hidroxifosfato de aluminio hidratado y el hidróxido de aluminio.
La dosis de la vacuna variará dependiendo de la concentración del material antigénico; por ejemplo para una vacuna basada en células inactivadas la dosis será de 0,1 mi utilizando una concentración de 109 cfu/ml del muíante fur ofur ompHofur ompH galE en una solución de 1 mi de suero fisiológico utilizado como vehículo, aunque en general la concentración de activo será de 7 x l08 a l x l09 cfu/ml en una disolución de ImI de vehículo y opcionalmente un adyuvante como por ejemplo el hidróxido de aluminio al 0,7 %.. Para una vacuna basada en extractos proteicos de membrana externa un ejemplo sería una dosis de 0,1 mi utilizando una concentración de 400μg de extracto en una solución de 1 mi de suero fisiológico, aunque en general la concentración de activo será de 100 a 400 μg en una disolución de ImI de vehículo y opcionalmente un adyuvante como por ejemplo el hidróxido de aluminio al 0,7 %
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) TABLA 1
Cepas bacterianas y plásmidos utilizados en la presente invención
Organismo y plásmido Características relevantes Fuente de referencia
E. coli
DH5α TlsupE4 ÁlacU169 (0SO /αcZΔM15) Clontech hsdR17 recAl endAl gyrA96 thi-1 relAl hsdR mcrB araD139 Á(araABC-leu)7679
MClO6í(λpir) Este laboratorio
ÁlacX74 gall galKrpsL thi lisógena del bacteriófago λpir
P. niultodda
Aislada de secreción nasal de
PM25 Salvaje, serogrupo D conejo
Aislada de brote de neumonía
PM108 Salvaje, serogrupo A ovina
PMl 002 PM25 Rif* SpcR Este laboratorio PMlOI l PM108 Rif* SpcR Este laboratorio PM1094 PMlOl ifur ompH La presente invención PM1095 PM1011>r La presente invención PMl 096 PM1094 galE La presente invención
Plásmidos pGEM-T Vector de clonación de PCR Ap Promega
(13 - Ditta, G., et al T. Schmidhauser, E. Yakobson, pRK2013 rep (colEl) Mob+Tra+ Kn/ PXu, X. W. Liang, D.R.Finlay, D. Guiney, D.R. Helinsky. Plasmid. 13: 149-153. 1985) (18 -Link, AJ., et al D. Phillips, y G.M. Church. J. pKO3 M13ori repA(ts) sacB Cm Bacteriol. 179-6228-6237. 1997) pUA826 Mob+ R6K replicón ApR StrR Sp/ Este laboratorio pKO3 que contiene el lugar mob de pUA1089 La presente invención pUA826
(4 - Bosch,M., et al R. Tarrago, M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. pUA826 que contiene un fragmento Fernández de Henestrosa, A.M. pUA891 interno de 394-pb del gen fitr de P. Pérez de Rozas, I. Badiola, y J. multocida Barbé. FEMS Microbiol. Lett. 203: 35-40. 2001) pUA1089 que contiene un fragmento pUA1090 interno de 495-pb del gen galE de P. La presente invención multocida
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) TABLA 2
Características de los cebadores utilizados en la presente invención
.multocida .multocida P. multocida galE de P, multocida del plásmido pUA891 del plásmido pUA1090 de P. multocida PMlOl 1 y σ
Figure imgf000017_0001
\ ompH2 de P. multocida PMlOIl y
• PM1094 y analizar la secuencia del gen ompH2 de P. multocida PMlOl 1 y PM1094 094 PMl 094 1 y PM1094 1 y PM1094 1 y PM1094 y PM1094 y analizar la 094
Figure imgf000017_0002
a Posición del extremo del oligonucleótido i con respecto al punto inicial de transcripción del gen fur de P. multocida. b Posición del extremo del oligonucleótido < con respecto al punto inicial de transcripción del gen galE de P. multocida. c Posición del extremo 5' del oligonucleótido con respecto al punto inicial de transcripción del gen aad de pUA826. d Posición del extremo del oligonucleótido c i on respecto al lugar de inserción Smal en el pKO3. e Posición del extremo del oligonucleótido c i on respecto al punto inicial de transcripción del gen ompHl de P. multocida. Posición del extremo 5' del oligonucleótido con respecto al punto inicial de transcripción del gen ompH2 de P. multocida.
TABLA 3
Protección conferida en ratones en el enfrentamiento heterólogo con P. multocida PM1002 por inmunización con proteínas de la membrana externa de diferentes cepas de P. multocida
Cepa fuente de QMP Características relevantes Dosisb (μg/animal) Supervivencia
PM1011 Salvaje 10 0/5 40 0/5
PMl 011 Salvaje crecida en presencia de DPDa 10 0/5 40 1/5
PMl 095 fur 10 0/5 40 1/5
PMl 094 fio- ompH 10 4/5 40 5/5
Control 0/5
Suero Fisiológico0 aQuelante de cationes divalentes 2,2'-dípiridilo. bCantidad de extracto de proteína de la membrana externa inoculado en cada inmunización animal
TABLA 4
Protección conferida en ratones en el enfrentamiento heterólogo con la cepa PMl 002 de P. multocida mediante inmunización con cepas inactivadas de P. multocida
Cepa Procedimiento de Dosis de Supervivencia inactivación3 enfrentamiento (X LD50)
Salvaje H 500 0/5
H 100 0/5 fur oomph H 500 0/5
H 100 3/5 fur oomph galE H 500 0/5
H 100 3/5
Salvaje S 500 0/5 fur oomph galE S 500 3/5
Control 100 0/5
Suero fisiológico ^__ a Una suspensión de células a 7 x 10 cfu/ml se inactivo por calor mediante incubación a
450C durante 12 h (H)o por sonicación (S) y se inocularon 0,1 mi por animal.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Materiales y métodos
Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento
El listado de las cepas bacterianas utilizadas se muestra en la Tabla 1. Todas las cepas de P. multocida fueron crecidas en medio líquido, en agua de peptona tamponada (BPW) o BHI,- en placas de agar SBA. Cuando fue necesario se añadieron antibióticos en las concentraciones descritas (Cárdenas, M. et al A.R. Fernández de Henestrosa, S. Campoy, A.M Pérez de Rozas, J. Barbé, I. Badiola, y M. Llagostera. Vet. Microbiol. 80:53-61. 2001). En el crecimiento de la cepa salvaje, la concentración de agente quelante de cationes divalentes, 2-2 '-dipiridilo DPD (Sigma) utilizado fue de 150μM (Tabla 3).
Métodos genéticos
El mutante P. multocida fur se obtuvo a partir del plásmido pUA891 (Figura IA). Este plásmido se obtiene como resultado de la inserción de un fragmento interno del gen pUA826 (Bosch, M., R. Tarrago, M.E. -Garrido, S. Campoy, A.R. Fernández de Henestrosa, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, y J. Barbé. FEMS Microbiol. Lett. 203: 35-40. 2001) con un fragmento interno del gen fur de Pasteurella multocida de 394 pb. El pUA826 deriva del pGY2 (26- ) al que se ha extraído el gen cat mediante restricción con SaIL El plásmido pGY2 tiene un origen de replicación R6K (dependiente de la proteína λpir para replicarse, por tanto es suicida en Pasteurella multocida, contiene la región de movilización mob del RP4 y los genes que le confieren resistencia a ampicilina (bla), estreptomicina y espectinomicina (aadÁ) y cloramfenicol {cat). Este último gen, como ya se ha comentado, no está en los plásmidos ρUA826 y pUA891.
Para construir el mutante fur ompHgalE se utilizó el plásmido pUA1090 (Figura 3A). Este plásmido es el resultado de la clonación en el plásmido pUA1089 (pKO3 con el sitio mob del pUA826) de un fragmento interno de 495 pb del gen galE de Pasteurella multocida. El plásmido pUA1090 fue introducido por conjugación triparental en la cepa mutante fur ompH, seleccionándose los transconjugantes en placas selectivas.
Para determinar la estabilidad de Ia mutación fur, los mutantes fur se subcultivaron 20 veces consecutivas sobre placas de SBA sin añadir antibióticos. La concentración de bacterias viables se determinó a los 5, 15 y 20 pases utilizando diluciones adecuadas de una suspensión de células (109 cfu/ml) sobre placas SBA con y sin estreptomicina, ya que pUA891 codifica el gen de resistencia a este antibiótico. El porcentaje de estabilidad se calculó como el número de colonias obtenidas en placas suplementadas con antibiótico frente a aquellas que no contenían antibiótico.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Así, se observó que la mutación fia4 se mantenía con una estabilidad del 100% en células después de 20 pases en ausencia de presión selectiva.
Métodos bioquímicos, técnicas de DNA y RNA
La metodología y análisis de secuencias por ordenador fueron llevadas a cabo según se ha descrito (8- Cárdenas, M., A.R. Fernández de Henestrosa, S. Campoy, A.M. Pérez de Rozas, J. Barbó, I. Badiola, y M. Llagostera. Vet. Microbiol. 80: 53-61. 2001). Los cebadores utilizados se describen en la Tabla 2. Las secuencias de nucleótidos se determinaron por el método dideoxi en un secuenciador ALF Sequencer (Pharmacia Biotech). Los análisis de extracción de KNA y de RT- PCR se llevaron a cabo según se lia descrito (Bosch, M., E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, y J. Barbé. FEMS Microbiol Lett. 210: 201-208. 2002). Los extractos de proteína de membrana externa de P. multocida se obtuvieron y analizaron según se ha descrito (Bosch, M., E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Pérez de Rozas, I. Badiola, y J. Barbé. FEMS Microbiol Lett. 210: 201-208. 2002). Las concentraciones de proteína se midieron según se ha descrito (Lowry, O.H., NJ. Rosebrough, AX. Farr, y RJ. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275. 1951).
Estudios de protección contra P. multocida
Grupos de cinco ratones hembra Swiss de tres semanas (Harían ibérica; Barcelona, España) fueron inyectados intraperitonealmente con 10 ó 40 μg/animal de extracto de proteína de membrana extema (OMP). Los extractos se prepararon a partir de distintas cepas de P. multocida crecidas en diferentes condiciones de cultivo. En todos los casos el volumen de extracto inoculado fue de 100 μl que se administró en dos dosis con dos semanas de diferencia. Los ratones control fueron inoculados con 100 μl de suero fisiológico El desafío heterólogo se llevó a cabo tres semanas después por inoculación intraperitoneal de 0,1 mi de una cepa virulenta de P. multocida (PMl 002) que contenía 100 ó 500 veces su LD50.
La misma metodología fue usada para estudiar la protección conferida por las cepas PM1094 (deficiente en fur y ompH) y PM1096 (deficiente en fur, ompHy galE) de P. multocida inactivadas térmicamente o por sonicación. La inactivación térmica se consiguió por incubación a
450C durante toda la noche de un cultivo crecido previamente en BFn a 3O0C hasta una densidad de
7 x 108 cfu/ml. Las células inactivadas por sonicación se prepararon sonicando 7 x 108 cfu/ml, resuspendidas en BPW, cinco veces durante cinco minutos en un baño de hielo a -400C, con un rendimiento del 80%. La ausencia de células viables se probó sobre placas SBA. En todos los casos, el volumen de extracto de células inactivadas inoculado ñie de 100 μl y se administró en dos dosis con un intervalo de dos semanas. El control negativo y el desafío heterólogo se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Resultados
Construcción de un muíante P. miútocidafur
El fragmento interno de 394-pb del gen fur de P. multocidafue obtenido por amplificación por PCR utilizando los cebadores Furl y Fur2 (Tabla 2). El fragmento obtenido fue clonado en el plásmido suicida pUA826, dando como resultado el plásmido pUA891 (Fig.lA).
Tras la introducción del plásmido pUA891 en P. multocida por conjugación tripareníal, se aislaron varios imitantes putativos_/wr tas sembrado de bacterias en placas selectivas adecuadas. El análisis del DNA cromosómico por la técnica PCR confirmó que el gen/wr del tipo salvaje había sido interrumpido por integración del plásmido pUA891 (Fig. IB).
En la Fig.lB puede observarse el. DNA cromosómico de la cepa salvaje (PMlOI l) (canil
2), mutantes/iír (PM1095) (carril 3) y fur ompH (PM 1094) (carril 4) que fueron sujetos al análisis por PCR con los cebadores Aad3 y Fur3 (Tabla 2). El control de PCR sin DNA se muestra en la canil 5. DNA del fago ΦX174 digerido con Hmfl se utilizó como marcador de pesos moleculares (carriles 1 y 6).
Igualmente, los perfiles electrofbréticos de las fracciones de membrana externa de varios mutantes/wr fueron analizados para corroborar que la presencia de la mutación fur daba lugar a la inducción de proteínas de membrana externa reguladas por hierro (IROMPs) de elevado peso molecular, tal y como se ha descrito previamente (4). Se obtuvieron dos perfiles distintos de mutantes fur. Sorprendentemente, el primer muíante expresó la principal proteína de membrana externa (OMP) de 36-IcDa, OmpΗ, de P. multocida, mientras que el segundo no lo hizo.
En la secuencia completa del genoma de P. multocida Pm70 (21), se identificaron dos copias del gen ompH (separados por 154 pb), que codifican las proteínas OmpΗl y 0mpΗ2. Con objeto de determinar la mutación responsable del fenotipo observado en el muíante fur ompH (cepa PMl 094), se llevaron a cabo análisis de RT-PCR para detenninar si los genes ompH se habían transcrito. Los resultados demostraron que ompffl y ompH2 del imitante fur ompH habían sido transcritos independientemente. Sin embargo, la secuenciación del DNA de estos genes (número de acceso GenBank EF102481 y EF102482, respectivamente) reveló diferencias significativas en comparación con las secuencias correspondientes de las cepas PMlOI l y Pm70. En el gen ompHl del muíante fur ompH, se encontró una mutación sin sentido en posición 76, dando lugar a un codón stop en lugar de uno que codifica glutamina; esto da lugar a una proteína truncada muy corta de 24 aminoácidos. Igualmente, Ia secuencia de ompH2 de este muíante presentaba muchos cambios nucleotídicos, incluyendo una mutación sin sentido en posición 670 que da lugar a una proteína truncada de 223 aminoácidos en lugar de 350 aminoácidos. Estos resultados indicaron
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) claramente que la ausencia de la principal proteína de membrana extema (OMP) de 36-IdDa en el muíante P. multocida fur ompHQs debida a mutaciones sin sentido en ompHl y ompH2. La Figura 2 muestra el esquema de la estructura de los genes ompHl y ompH2 de P. multocida. RTompHlup, RTompHlrp, RTompH2up y RTompH2rp indican las posiciones de los cebadores utilizados para el análisis transcripcional (A). Los apartados (B), (C) y (D) muestran el análisis mediante RT-PCR de los transcritos de los genes ompHl, ompH2 y del posible operón ompHl-ompHl tanto en la cepa salvaje (PMlOI l) (carril 2) como en la muíante fur ompH (PM1094) (carril 3). Se utilizó RNA total de cada una de las cepas y las parejas de cebadores RTompHlup y RTompHlrp, RTompH2up y RTompH2rp y RTompHlup y RTompH2rp, respectivamente. Se muestran también las PCRs con DNA de la cepa salvaje (carril 4) y de un control negativo sin RNA ni DNA (carril 5). DNA de los fagos ΦX174 digerido con Hinñ (B y C) y del fago λ digerido con BstEΪL (D) se utilizaron como marcadores de pesos moleculares (carril 1).
Estudios de protección con imitantes P. multocida fur
Para analizar el efecto protector putativo del muíante P. multocida fur se inmunizaron grupos de cinco ratones con 10 y 40 μg/animal de extracto de proteínas de membrana extema
(OMP) preparados a partir de cepa PMlOl 1 de tipo salvaje de P. multocida, crecida en ausencia o presencia de DPD, y a partir de los muíaníes/wr y fur ompH. A continuación los ratones fueron desafiados heterólogamente con la cepa virulenía PMl 002 (LD50 = 3 cfu/animal) con una dosis de
500XLD50. Todos los ratones inmunizados con extracto de proteína de membrana externa (OMP) obtenido de células de tipo salvaje crecidas en ausencia de DPD murieron dos días después del desafío (Tabla 3). Sin embargo, los ratones inmunizados con 40 μg de extracto de proteína de membrana extema (OMP) tanto de la cepa del tipo salvaje crecida en medio deficiente en hierro como los inmunizados con el imitante fur presentaron un 20% de protección (Tabla 3).
Notablemeníe, la ausencia de la principal proteína de membrana externa (OMP) de P. multocida en el extracto dio lugar a protección total (Tabla 3).
Ya que el nivel de protección más alto se obtuvo con el extracto de proteína de membrana extema (OMP) preparado a partir del doble muíante fur ompH, los siguieníes experimentos se enfocaron hacia el análisis de la protección proporcionada por células de esta cepa inactivadas térmicamente. Ratones a los que se administró una dosis de 7 x 107 cfu/ml de células fui' ompH inactivadas térmicamente fueron posteriormente sometidos a desafío heterólogo con una dosis de lOOXLDso de la cepa PMl 002; estos ratones fueron protegidos en un 60% (Tabla 4). Estos resultados indican que la simple inactivación térmica de las células de P. multocida fur ompH pude ser usada para producir una vacuna que confiera proíección heíeróloga.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Efecto de la mutación galE en la capacidad protectora de la cepa P. muitocida
Con objeto de determinar si la optimización de la superficie de exposición de las proteínas de membrana extema reguladas por hierro (IROMPs) aumentaba la protección obtenida con células fur ompH inactivadas, se procedió a introducir una mutación en el lipopolisacárido (LPS) del muíante fur ompH, dando lugar a una cepa derivada. El producto del gen galE cataliza la epimerización de UDP-galactosa a UDP-glucosa y es necesario para la correcta síntesis del centro del lipopolisacárido. Con este fin se construyó un mutante galE capaz de crecer en presencia de glucosa pero incapaz de sintetizar el LPS de superficie de las células de tipo salvaje. Mediante amplificación por PCR con oligonucleótidos GalEintup y GalEíntrp se obtuvo un fragmento interno del gen galE de 495-pb. Este fragmento se clonó en pUA1089 y el plásmido resultante fue introducido en la cepa fur ompH (PM 1094) por conjugación triparental. Tras cultivo en placas selectivas adecuadas, se obtuvieron varios imitantes galE putativos.
En la Figura 3 se describe el análisis mediante PCR de la construcción del mutante galE de P. multocida. El apartado (A) muestra la construcción del mutante galE de P. multocida. GalEint2up y pKO3-R indican las posiciones de los cebadores utilizados para confirmar la presencia de la mutación galE y el apartado (B) muestra el DNA cromosómico de la cepa salvaje (PMlOIl) (carril 2), imitantes >/» ompH (PM1094) (carril 3) y fur ompH galE (PM1096) (canil 4) que fueron sujetos a análisis mediante PCR utilizando los cebadores GalEint2up y pKO3-R (Tabla 2). El control de PCR sin DNA se muestra en la carril 5. DNA del fago λ digerido con BstEíl se utilizó como marcador de pesos moleculares (caniles 1 y 6).
El análisis por PCR del DNA cromosómico de cuatro de los transconjugados confϊnnó que la inserción de pUA1090 intemimpía el gen galE de tipo salvaje. A continuación, se eligió uno de estos clones, el PMl 096 (Fig.3), para estudios posteriores, y el análisis de su perfil de proteínas de membrana exterior corroboró que presentaba el mismo perfil que el de la cepa progenitora.
Grupos de cinco ratones fueron inoculados con 7 x 107 cfu/ animal de células fur ompH galE inactivadas térmicamente (450C durante 12 horas) y posteriormente fueron enfrentados al desafío heterólogo de PMl 002 con dosis de 100 y 50OxLD5O. Como se observa en la Tabla 4, los animales inmunizados con la cepa inactivada térmicamente fueron protegidos en un 60% con la dosis más baja. Así, aunque las células bacterianas expresaron LPS de superficie celular más cortos, esto no resultó en un aumento de la protección mediada por proteínas de membrana externa reguladas por hierro (IROMPs), ya que los imitantes fur ompH y fur ompH galE indujeron el mismo nivel de protección en ratones inmunizados con cualquiera de las cepas de estos mutantes inactivadas térmicamente.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Por otro lado, se probó una estrategia de inactivación diferente basada en la disrapción de las células por sonicación. Los ratones inmunizados con células fur ompH galE inactivadas por sonicación fueron protegidos en un 60% frente a Ia dosis más alta (50OxLD50) de bacteria virulenta, (Tabla A), sugiriendo estos resultados que la inactivación de las células por este método proporciona una respuesta inmune más tuerte que el tratamiento térmico y que por lo tanto este método de inactivación puede ser más adecuado para el desarrollo de vacunas contra la infección de P. multocida.
En conclusión, los resultados presentados muestran por primera vez que las proteínas de membrana extema reguladas por hierro (IROMPs) de imitantes P. multocida fur ompH son inmunogénicas y confieren protección heteróloga. Por lo tanto, dichos resultados sugieren que los imitantes fur pueden ser utilizados para el desarrollo de vacunas basadas en proteínas de membrana externa reguladas por hierro (IROMPs), particularmente contra patógenos que presenten varios y distintos receptores de hierro, como es el caso de P. multocida. Además, la estrategia de utilizar imitantes fur soluciona los problemas asociados con otros métodos tales como el pobre crecimiento que experimentan las células bacterianas en presencia de agentes quelantes de cationes divalentes.
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HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)

Claims

REIVIKDICACIONES
1. Bacteria Pasteurella multocida mutada caracterizada porque es defectiva en los genes/w y ompHde forma tal que no se produce la expresión defur ni de ompHl y ompH2.
2. Bacteria Pasteurella multocida de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque además de ser defectiva en los genes fur y ompH también lo es en el gen galE de forma tal que se optimiza la superficie de exposición de las proteínas de membrana externa reguladas por hierro de las células de P. multocida fur ompH.
3. Bacteria Pasteurella multocida mutada de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, caracterizada por ser defectiva en fur por interrupción del gen salvaje por integración en el mismo del fragmento interno de 394 pb del gen fur amplificado con los cebadores Furl y
Fur2.
4. Bacteria Basteurella multocida mutada, de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, caracterizada por ser defectiva en OmpH, presentando una mutación sin sentido en ompHl en posición 76, y varios cambios nucleotídicos así como una mutación sin sentido en posición 670 en ompH2.
5. Bacteria Pasteurella multocida mutada, de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque la mutación en ompHl da lugar a un codón stop en lugar de glutamina resultando en una proteína truncada de 24 aminoácidos, y porque la mutación en ompH2 da lugar a una proteína truncada de 223 aminoácidos en lugar de 350 aminoácidos.
6. Bacteria Pasteurella multocida mutada, de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, caracterizada por la ausencia de la principal proteína de membrana externa de 36-KDa debido a las mutaciones sin sentido según reivindicaciones 4 y 5.
7. Bacteria Pasteurella multocida mutada, de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada por ser defectiva en galE por interrupción del gen salvaje por integración en el mismo del fragmento interno de galE de 495 pb. obtenido por amplificación con los cebadores
GalEintup y GalEintp.
8. Bacteria Pasteurella multocida mutada, de acuerdo con las reivindicaciones 1-7, caracterizada por haber sido inactivada.
9. Bacteria Pasteurella multocida mutada, de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque ha sido inactivada térmicamente.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
10. Bacteria Pasteurella multocida mutada de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada por haber sido inactivada por sonicación.
11. Preparación de proteínas de membrana extema de bacterias P. multocida mutadas, de acuerdo con las reivindicaciones 1-10.
12. Método para la preparación de una vacuna para la protección heteróloga de animales frente a la infección por P. multocida que se caracteriza porque comprende:
a. la obtención de mutantes de P. multocida defectivos en el gen fur, o en los genes fury ompH, o en los genes fur, ompHy galE, de acuerdo con las reivindicaciones
1-10 y/o una preparación de proteínas de membrana externa a la que dichas células de P. multocida mutadas dan lugar, de acuerdo con la reivindicación 11; y
b. la preparación adecuada al método de administración elegido de la vacuna, que comprenda un extracto de células obtenidas en (a) conteniendo una cantidad efectiva del muíante fur, fur ompH o fur ompH galE y/o de proteínas de su membrana externa y un vehículo y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
13. Método para la preparación de una vacuna para la protección heteróloga de animales frente a la infección por P. multocida, de acuerdo con la reivindicación 12, que se caracteriza porque las células del imitante fur, del muíante doble fur ompH o del muíante triple fur ompHgalE han sido inactivadas íénnicameníe.
14. Método para la preparación de una vacuna para la proíección heíeróloga de animales frente a infección por P. multocida, de acuerdo con la reivindicación 12, que se caracteriza porque las células del muíante fur, del muíante doble fur ompH o del muíante triple fur ompHgalE han sido inactivadas por sonicación.
15. Composición de vacuna para la proíección heíeróloga de animales contra la infección por Pasteurella multocida caracíerizada porque comprende una cantidad inmunogénica del muíaníe fur, del muíante doble fur ompH o del muíante triple fur ompH gal E o y/o del extracto de proteínas de su membrana extema de acuerdo con las reivindicaciones 12-14, un vehículo y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
16. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 15, para proteger de forma heteróloga a animales de enfermedades causadas por infección por P .multocida, tales como neumonías en ganado porcino y vacuno, cólera aviar y neumonías en mamíferos pequeños como conejos y hamsters.
HOJA DE REEMPUZO (Regla 26)
17. Utilización del muíante Pastewella multocida fur y/o un extracto de proteínas de su membrana extema para la preparación de una vacuna para la protección heteróloga de animales contra la infección por Pastewella multocida de acuerdo con las reivindicaciones 12-16.
18. Utilización del muíante doble Pasteurella multocida fur onψHy/o un extracto de proíeínas de su membrana exíeπia para la preparación de una vacuna para la proíección heteróloga de animales contra la infección por Pasteurella multocida de acuerdo con las reivindicaciones 12-16.
19. Utilización del muíante triple Pasteurella multocida fur ompH galE y/o un extracto de proteínas de su membrana externa para la preparación de una vacuna para la protección heteróloga dé animales contra la infección por Pasteurella multocida de acuerdo con las reivindicaciones 12-16.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
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