WO2009078693A1 - Proceso mejorado para obtener bioetanol a partir de grano de sorgo (sorghum bicolor l. moench) que integra las etapas de decorticación e hidrólisis con proteasas - Google Patents

Proceso mejorado para obtener bioetanol a partir de grano de sorgo (sorghum bicolor l. moench) que integra las etapas de decorticación e hidrólisis con proteasas Download PDF

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WO2009078693A1
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sorghum
grain
bioethanol
protease
hydrolysis
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Sergio Román Othón SERNA SALDIVAR
Esther Perez Carrillo
Mario Moisés ALVAREZ
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Instituto Tecnologico Y De Estudios Superiores De Monterrey
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the object of this invention relates to an improved process that allows to obtain a higher bioethanol yield from sorghum grain (Sorghum bicolor L. Moench), and commercially improved by-products such as decortication fiber and spent grains of Distillery obtained from sorghum grain.
  • sorghum grain Sorghum bicolor L. Moench
  • by-products such as decortication fiber and spent grains of Distillery obtained from sorghum grain.
  • Bioethanol is an alternative fuel to gasoline in the internal combustion process.
  • the resurgence of the use of bioethanol as fuel is due to two main reasons: to reduce a country's dependence on oil supplies or deposits and a greater ecological awareness that has led to the search for a lower impact on the environment.
  • technological alternatives are reduced if we take into account that (Sanderson, 2007):
  • bioethanol has been greatly promoted as a solution for a group of complex problems related to energy and the environment.
  • bioethanol has the great advantages of being renewable, promoting clean combustion and producing less greenhouse gases (Altinta? Et al. 2002).
  • Bioethanol can contribute to a cleaner environment, and with the implementation of environmental protection laws in different parts of the world, governments have established strategies to boost their production and use as fuel (Ccopa-Rivera et al. 2006).
  • sugarcane ⁇ accharum officinarum
  • starchy cornos substrate substrate for alcoholic fermentation with yeast is a well established, well-known and mature technology (Pimientel and Patzek, 2005).
  • Starch the main storage polysaccharide, which accounts for 70% by weight of corn, is presented as a source of high-performance glucose (Bello-Pérez et al. 2002; Nigam and Singh, 1995).
  • cereals have the advantage of being able to be stored for long periods and have low transport costs and previous treatments (Abouizied and Reddy, 1986).
  • starch To produce bioethanol from cereals, starch must be hydrolyzed to fermentable sugars, mainly glucose (Thomas and Ingledew, 1990).
  • the stages that are traditionally performed are: gelatinization of starch granules, liquefaction with generally heat-resistant alpha amylase and saccharification with amyloglucosidase.
  • alpha amylase and amyloglucosidase convert practically all the starch present in the grain into fermentable sugars, mainly glucose.
  • fermentable sugars are converted to bioethanol. Due to the strong demand for bioethanol in the world, the demand for enzymes and yeasts has increased significantly.
  • biocatalysis technology for ethanol production can be classified into two areas, alcoholic beverages and fuel ethanol.
  • the technology in general is the same, however, some of the conditions and substrates are different (Sears, 1995).
  • bioethanol we seek to reduce energy requirements to make it more competitive with fossil fuels (Wang et al. 2007a).
  • Yield is the most important consideration for the production of bioethanol from corn, and there is a renewed emphasis on the design of cooking processes that allow greater yield (Maisch, 2003).
  • the objective of the saccharification process is the production of a syrup with the maximum amount of glucose possible. The reason why high glucose levels (> 94%) are not reached is generally attributed to the reversal reactions catalyzed by amyloglucosidase.
  • maltulose (4- ⁇ -D-glucopyranosyl-D-fructose). Once the maltulose is formed, the final glucose yield is reduced because the amyloglucosidase does not act between glucose and fructose (Guzmán-Maldonado and Paredes-López, 1995).
  • a source of nitrogen is required. Even if a cereal is rich in protein, yeast cannot use this complex material unless it is first hydrolyzed to amino acids, dipeptides or at least to tripeptides (Thomas and Ingledew, 1990). You can also use other sources of non-protein nitrogen such as They are ammonia and urea. These sources are added to support yeast growth and avoid defective fermentation. The amount and type of nitrogen source not only affects growth but also has an effect on ethanol yield and the type of associated by-products (Wu et al. 2006b). One of the main cost items in the bioethanol production process is the raw material (Brandberg et al. 2007).
  • the non-fermentable materials of corn are recovered at the end of the process as spent distillery grains or GGD.
  • GGD spent distillery grains
  • the net cost of corn is high in the dry milling process due to the low value of GGD (Singh et al. 2005).
  • Thomas et al. (2001) studied the effect of lactibacils on the growth of yeast in semi-continuous fermentation using corn as raw material.
  • Pimientel and Patzek (2005) conducted a comparative study taking into account the investment in the field and during the process for the production of ethanol from corn, being the main investments in machinery, irrigation and herbicides. Singh et al.
  • sorghum has long been used as a crop for livestock feed, but the large quantities of it processed during World War II by the industrial distillation and milling industry showed the potential of this grain as a raw material for processes fermentation especially in areas where corn cultivation is difficult, such as arid or semi-arid areas (Hubbard et al. 1950; Lázaro and Favier, 2000).
  • Mexico is the fourth largest producer of sorghum, being used mostly as food for birds and livestock.
  • the chemical composition of sorghum is practically identical to that of corn. It usually contains a little more protein but a lower concentration of oil.
  • sorghum grain contains approximately the same amount of starch compared to corn grain which makes it attractive as a raw material for bioethanol production.
  • sorghum as a raw material for industrial processes, the following has been observed:
  • starch yields can be substantially increased by subjecting broken corn kernels to enzymatic attack in the soaking stage.
  • wet milling process has been practically perfected without the addition of enzymes and that the starch granules are not very crosslinked with the protein matrix, these catalysts are not widely used in practice.
  • the use of enzymes in wet milling or sorghum starch refining is more effective because it has a more crosslinked and difficult to hydrolyze protein matrix.
  • the proposed technology has the disadvantage of not allowing the release of dextrins trapped by proteins in addition to the fact that the proteolytic enzyme can significantly lower the activity of glucoamylase or amyloglucosidase.
  • reason for this invention it refers to an improved process for the production of bioethanol using the sorghum grain (Sorghum bicolor I. Moench) as raw material; and the products obtained are bioethanol, decortication fiber and GDD obtained from sorghum grain.
  • FIGURES Figure 1 Flowchart of the improved process for obtaining bioethanol from sorghum grains.
  • Figure 2. Graph of the percentage of fiber removed expressed based on the initial weight of white sorghum decorticated with respect to decortication time.
  • Figure 3. Graph of the concentration profile of reducing sugars in the suspension of hydrolyzed flours with thermostable ⁇ -amylase in the conventional process.
  • Figure 4 Graph of the concentration profile of reducing sugars in the suspension of flours hydrolysed with thermostable ⁇ -amylase in the process proposed here that includes protease hydrolysis.
  • Figure 5. Graph of the concentration profile of ⁇ -ANL during the saccharification stage with thermostable ⁇ -amylase in the conventional process
  • Figure 6 Graph of the concentration profile of ⁇ -ANL during the saccharification stage with thermostable ⁇ -amylase in the process proposed here that includes protease hydrolysis.
  • Figure 7. Graph of the glucose concentration profile in the dextrin suspension in the conventional process.
  • Figure 11 Graph of the concentration profile of ⁇ -ANL in the sweet must during the fermentation stage with the conventional process.
  • Figure 12 Graph of the concentration profile of ⁇ -ANL in the sweet must during the fermentation stage with the process proposed here that includes protease hydrolysis.
  • the present invention is directed to an improved process for the production of bioethanol using sorghum grain (Sorghum bicolor I. Moench) as raw material.
  • the general process is represented in FIGURE 1 and includes the steps of:
  • This stage is done to remove the outer layers of the sorghum grain, to expose the endosperm that contains the starch, and make it susceptible in the later stages and promote its conversion to bioethanol.
  • Decortication is optimally carried out until 7-10% of the weight of the whole grain is removed by mechanical means, such as for example in equipment equipped with carborundum discs, (Mutana Machine, Saskatoon). Additionally, more than 60% are removed at this stage. of phenolic compounds from the whole sorghum grain, and the removal of these phenolic compounds, is concentrated in the decortication fiber that in a conventional process for the production of bioethanol, is not obtained.
  • the products resulting from the decortication stage are: decorticated sorghum grains and decortication fiber (comprising: pericarp or bran and part of the germ).
  • the sorghum grains are decortified from 5 minutes to 30 minutes to remove 7 to 10% of the original grain weight, which during the stages of the process that is the subject of this invention, translates mainly into energy savings and high efficiency; because the amount of fermentable matter contained in the grains of decorticated sorghum that enters the process, has greater bioavailability and greater proportion; and the concentration of non-fermentable matter (the decortication fiber) that enters the process and that implies greater energy consumption is reduced; and that being separated this decortication fiber can be used commercially.
  • the decortication fiber obtained has a moisture content of 9 to 15%, and can be used mainly for feeding cattle or as a raw material in the preparation of food for human consumption, because it is characterized by being rich in protein, extract ethereal or oil, low humidity and phenolic compounds; what gives it: storage stability at room temperature, and its consequent decrease in transportation cost; extend shelf life, as phenolic compounds act as protective agents against diseases caused by insects and phytopathogens and as antioxidants that prevent oil rancidity that obviously lowers the palatability of livestock feed.
  • Decorticated sorghum grains are milled or ground using preferably a hammer mill Arthur Thomas Co. Philadelphia, PA, provided with a mesh with 2 mm holes and the product obtained is sorghum flour; the resulting sorghum flour contained a particle size distribution or granulometric profile with
  • thermo-resistant alpha amylase added 0.2 mL of a thermo-resistant alpha amylase to the flour suspension: hydrolyzed water.
  • the activity declared by the supplier for this enzyme is 240 KNUs / g. It works optimally at 90 0 C and a pH of 7.”
  • thermostable alpha amylase enzyme can be substituted by a commercial enzyme with similar characteristics.
  • the starch of the flour suspension hydrolyzed water
  • gelatinization a phenomenon that can be affected by the characteristics of the starch granule.
  • Gelatinization is necessary to increase the efficiency of the thermo-resistant alpha amylase enzyme since starch granules are broken by exposing the amylose and amylopectin molecules that are more susceptible to heat-resistant alpha amylase e) Remove the dextrin suspension (5)
  • Converting the dextrin suspension obtained in the liquefaction stage into a suspension of concentrated sweet must, to carry out the conversion is added to the dextrin suspension obtained in the previous stage (liquefaction), the enzyme amyloglucosidase in an enzyme ratio: 1: 100 substrate (w / w), incubate the dextrin suspension at a temperature range of 55 to 60 ° C and pH 5.5 with stirring between 60 to 120 rpm, between 14 to 16 hours, to obtain a sweet must concentrated with matter insoluble
  • the enzyme amyloglucosidase works optimally at a range of pH 4.5 to 5.5 and an optimum temperature of 55 ° C - 60 ° C and consists of an enzyme complex mainly of amyloglucosidase or glucoamylase and starch chain branching enzymes that They are called pululanases.
  • the concentrated sweet musts are cooled between 20-25 ° C and adjust to a certain concentration of sugars.
  • the concentration of soluble solids must be measured as ° Plate using a refractometer. If the concentration of soluble solids in concentrated sweet musts corresponds to a value greater than 11-15 ° Plate, water should preferably be added to dilute and obtain a reading in the refractometer of l-15 ° Plate and when diluting the sweet must Concentrate is hereinafter referred to as standardized sweet must.
  • yeasts can be Pichia pastoris sp or Saccharomyces cereviseae preferably in this process Saccharomyces cereviseae ATCC 24858 is used in a 1: 100 ratio, that is, add 1 mL of inoculum per 100 mL of sweet must to start fermentation with a concentration of 15x10 6 cells / 900 mL of standardized sweet must. Incubate the sweet musts inoculated preferably at 30 ° C with 125 rpm stirring for 72 hours.
  • the yeast uses oxygen contained in the must and present in the head space of the fermenter to reproduce asexually by budding. This stage lasts approximately 12 hrs, and once the oxygen is depleted the conditions become anaerobic and this is where the yeast begins to produce ethanol. Fermentation conditions affect the conversion rate of fermentable sugars to bioethanol. Fermentations are generally carried out with an initial pH of 4.5 at a temperature of 32 to 36 ° C. The pH gradually decreases during the fermentation stage due to the production of organic acids and the temperature tends to increase because the active yeast generates heat that has to be dissipated by a heat exchanger that is generally part of the reactors of fermentation.
  • the main product of this process which is mixed with: water and spent distillery grains, is subjected to a typical distillation process where the mixture is heat treated in a distillation column. In these columns the ethanol is evaporated at temperatures above 70 0 C and recondenses; Generally, in the first part of the distillation stage, ethanol is recovered with water (90% ethanol and 10% water). This product is subjected to a second distillation stage where the ethanol content is rectified to concentrate it at 95%. Finally, to obtain fuel grade ethanol with a purity greater than 98%, the mixture is subjected to azeotroping or dehydration using a molecular sieve that binds the water in the mixture. The main product at this stage is ethanol and the remaining product of these operations is a mixture of spent distillery grains: water. i) Dehydrate bioethanol in molecular sieves (9)
  • the biothenol obtained in the distillation stage is dehydrated, preferably for this dehydration a plurality of molecular sieves packed with zeolite or some similar material are used.
  • the molecular sieve adsorbs and retains the water present in the bioethanol and anhydrous or dehydrated bioethanol is obtained, ready for use as fuel.
  • This stage applies to the processes identified as "C” and “F” and consists of taking 3 lots of sorghum of 4 kg each, and decorticar them mechanically, using a pilot plant equipment equipped with 5 carborundum discs (60 grits) 30 centimeters (Nutana Machine, Saskatoon). These 5 discs are positioned on a shaft that rotates at high revolutions. The sorghum grains when rubbing against the abrasive surface of the discs gradually lose their outer layers. Every 5 minutes, the grain and fiber removed were removed through a sieve to estimate the degree of decortication and the yield of the byproduct or decorted material.
  • the sorghum grain was decorated for 30 minutes in order to remove 10% of the original grain weight. It is worth mentioning that there are other commercial equipment for decortication that can carry out this work in 5-7 minutes because they operate at higher revolutions per minute, although decortication is preferably carried out until 10% of the original grain weight is removed.
  • FIGURE 2 The equation that relates the percentage of material removed (Y) or decorated in relation to the decortication time (X) is registered.
  • the dry grinding stage is applied separately to all the processes identified in Table 2, such as: A, B, C, D, E, and F; preferably using a hammer mill (Arthur Thomas Co. Philadelphia, PA) provided with a mesh with 2 mm holes.
  • the resulting sorghum flours contained a particle size distribution or granulometric profile with 68% of the particles with a size of 420 ⁇ m, 11.5% between 250-420 ⁇ m, 7.7% between 149 to 250 ⁇ m and 11.1 less than 149 ⁇ m.
  • Cornmeal contained a finer particle size distribution or granulometric profile compared to the two sorghum flours.
  • the reported values correspond to the average of three repetitions and are reported as a percentage on a dry basis, except for total phenolics.
  • the 10% decorticated sorghum grain (of the processes identified as: C and F) had lower amounts of ash, ethereal extract and crude fiber and additionally involved removing 68.7% of the total phenolic compounds compared to processes B and E which employ the unsorted sorghum grain, and in comparison to processes A and D, which use the uncropped corn kernel.
  • This change in composition resulted in an increase in the content of the decortified sorghum grain in the content of starch and / or nitrogen free extract with respect to the undecortified sorghum grain.
  • removing the phenolic compounds makes the decorticated sorghum grain a better substrate for the amylolytic enzymes used in the liquefaction and saccharification stages and of the yeasts during fermentation.
  • protease hydrolysis stage is applied separately to the processes identified in Table 2, such as: D, E, and F; and it consists in preparing a 30:70 suspension of flour: water, (flour obtained in the dry grinding stage), so for each process, 50 g of dry flour are taken and 350 mL of water are added.
  • a proteolytic enzyme which may optionally be Neutrase 0.5L®
  • This enzyme has an activity declared by the supplier of 0.5 units Anson / gr and works optimally at a temperature of 45 to 55 0 C and a pH of 5.5 to 7.5
  • any other protease or set of proteases can be added according to the specification of the suppliers This protease should preferably be used at the temperature and pH recommended by the supplier.
  • Heat in a water bath for heating with stirring Hot Shaker, BeIlCo Glass, Inc. Vineland, NJ. USA
  • the flour water suspension, ensuring that after 15 minutes it reaches a temperature of 60 ° C.
  • the stage of liquefying the flour suspension is applied separately to all the processes identified in Table 2, such as: A, B, C, D, E, and F; and consists in preparing • Add 0.2 mL of a heat-resistant alpha amylase, which can optionally be Termamyl L®, Novo Nordisk to each of the flour suspensions: hydrolyzed water.
  • a heat-resistant alpha amylase which can optionally be Termamyl L®, Novo Nordisk
  • the product obtained at this stage is called a suspension of dextrins generated by the hydrolysis of the amylose and amylopectin chains.
  • a suspension of dextrins generated by the hydrolysis of the amylose and amylopectin chains is reported.
  • FIGURE 5 shows the values obtained of ⁇ -ANL in cornmeal, whole sorghum and decortified sorghum treated with the conventional process, corn had the highest values of ⁇ -ANL followed by decortified sorghum and finally the whole sorghum
  • the difference of ⁇ -ANL between decortified and whole sorghum is increased in the decorticated sorghum and is attributed to the decortication stage that removes the pericarp, rich in cellulose, hemicellulose, lignin and other fibers that act as physical barriers that delay the Enzymatic hydrolysis and that additionally also decreased the concentration of phenolic compounds that inhibit enzymes such as ⁇ -amylase and trypsin, resulting in less inhibition of said enzymes.
  • FIGURE 6 shows the values obtained of ⁇ -ANL in the corn, whole sorghum and decortified sorghum grains treated with the motive process of this invention, showing that by including the protease hydrolysis stage, the concentration of ⁇ - increased. ANL in all types of hydrolysates. This because the Protease partially hydrolyzed proteins producing higher amounts of amino acids and low molecular weight peptides that are a source of nitrogen available for yeast.
  • the whole sorghum and decortified sorghum hydrolysates that included the protease hydrolysis step had approximately 40 mg / L more of ⁇ -ANL compared to the whole sorghum and decortified sorghum hydrolysates obtained by the conventional process.
  • the step of saccharifying the dextrin suspension obtained in the previous stage of liquefying, to obtain a concentrated sweet must is applied separately to the processes identified in Table 2, such as: D, E, and F; and consists of:
  • amyloglucosidase preferably Dextrozyme® (Novo Nordisk, Princeton, NJ) in an enzyme: substrate 1: 100 (w / w) ratio.
  • This enzymatic complex consists mainly of amyloglucosidase or glucoamylase and starch chain branching enzymes called pululanases. These enzymes hydrolyze dextrins resulting from glucose liquefaction. In the research described here once the enzyme complex added was maintained at 55 0 C for 16 hrs with shaking at 120 rpm. It is worth mentioning that this saccharification stage is generally integrated with the fermentation stage to have significant energy and time savings.
  • FIGURE 7 is a graph showing the glucose concentration obtained in the saccharification stage of the conventional process for each of the three different treatments, it can be seen that the glucose concentration obtained from the treatments with whole sorghum and decortified sorghum, is it remains practically the same during the first six hours, later presenting difference in concentration favoring this treatment with decorticated sorghum; However, the corn treatment reached the highest glucose concentration in the third hour, and there was an insignificant difference between the concentration observed between the fourteenth and sixteenth hour. However, the final glucose concentration of the three treatments ranged between 140 - 180 mg glucose / mL, with the highest concentration being the treatment that used cornmeal as the raw material.
  • FIGURE 8 it can be seen that the glucose concentration is not affected by including in the process the decortication and hydrolysis stages with protease, since the glucose concentration range is between 140-180 mg / mL, as in equivalent treatments in the conventional process; but the inclusion of these stages in the process proposed here had an effect on the conversion rate of dextrins to glucose, since during the first two hours the difference between the glucose profiles observed for treatments with whole sorghum decorticated sorghum was minimal ; however, at the end of 3 hours the treatment with corn generated 30% more glucose than that generated by any of the treatments with whole sorghum and decorticated sorghum; and the value reached by the treatment with corn in the first three hours, was reached by the decorticated sorghum until the eight hours of reaction.
  • the stage of adjusting the concentrated sweet must to separate degrees is applied separately to the processes identified in Table 2, such as: A, B, C, D, E, and F and comprises:
  • the stage of fermenting the concentrated sweet must is applied separately to the processes identified in Table 2, such as: A, B, C, D, E, and F and comprises: • Adjust the pH of the sweet musts preferentially to 4.5.
  • Inoculate sweet musts optionally with Saccharomyces cereviseae ATCC 24858 in a 1: 100 ratio; that is, 1 mL of inoculum was added per 100 mL of suspension to start fermentation with a concentration of 15x10 6 cells / 900 mL of standardized sweet must.
  • Erlenmeyer flasks with IL capacity were used as bioreactors.
  • the incubated mixture was removed and centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes to collect the precipitate that was stored at -80 ° C (REVCO Model Ultima II, Asheville, NC) in 5 mL cryopreservation vials, adding 1 mL of glycerol for every 4 mL of precipitate.
  • REVCO Model Ultima II Asheville, NC
  • the glucose consumption profile can be observed throughout the fermentation stage with Saccharomyces cereviseae ATCC 24858 for each of the six different treatments.
  • ⁇ -ANL concentration is plotted in FIGURE 11. The maximum value of ⁇ -ANL was reached at 7 hours and after 14 hours of fermentation there were no significant differences for the three types of musts.
  • the maximum concentration of corn is approximately 220 mg / L, the decorticated sorghum approximately 150 mg / L and the whole sorghum less than 50 mg / L in a time of approximately 7 hours. It can also be observed that in all cases, as time went by the values were decreasing so that by 8 hours there was no significant difference in the concentration of ⁇ -ANL in corn and decortified sorghum.
  • FIGURES 13 and 14 present the profiles for obtaining bioethanol during the fermentation of the musts of the different treatments subjected to the conventional process and the reason process of this invention.
  • FIGURE 13 and 14 it can be seen that the maximum final concentration of bioethanol was obtained for the treatment with corn subjected to both processes (conventional and the one proposed here).
  • the concentration of bioethanol generated in the musts of the treatment with decortized sorghum subjected to the process reason for this invention was 1.8 greater than that observed in the must of the treatment with decortized sorghum subjected to the conventional process (not includes the hydrolysis stage with protease).
  • the final concentration of bioethanol was 2.6% more for decortified sorghum subjected to the new process that includes protease hydrolysis than for decortified sorghum subjected to the conventional process that does not include the protease hydrolysis stage.
  • the whole sorghum processed under the conventional scheme produced the highest percentage of GGD. This is because it was not decorticized, because its protein was more difficult to hydrolyze and, in addition, it was possible that the fiber and protein trapped some starch granules that did not gelatinize or hydrolyze with ⁇ -amylase
  • spent grains of decortified sorghum had a lower fiber content and ethereal extract since during the decortication the pericarp was selectively removed and germ.
  • the high protein content observed in all spent grains indicates that these by-products can be valuable in animal feed, mainly from ruminants. Possibly spent grains obtained from decortified sorghum have use in monogastric feeding due to their lower fiber content.
  • the protein concentration was higher in the GGD of the whole sorghum both with and without protease and the lowest values were observed in the corn without and with protease and sorghum decoded with protease.
  • the concentration of ethereal extract was higher in the case of GGD of corn without protease and the lowest was for whole sorghum without protease and decorticated without and with protease.
  • the highest values were observed in whole sorghum without protease and the lowest values for decortified sorghum without and with protease.
  • Each value is the average of three repetitions.
  • the yields of bioethanol obtained especially with the decorticated sorghum and treated with protease gives the guideline to present a process that allows obtaining yields equal to those obtained with corn and higher by 40% in the case of whole sorghum without protease treatment.
  • the flow chart for this process is set out in FIGURE 1. In general, the process is divided into 9 stages, and the stages that are added to the conventional process are: mechanical decortication before dry milling and hydrolysis with prior protease and during the first part of liquefaction.
  • Some aspects to take into consideration is to take care during the decortication of the fiber separation system to avoid starch losses due to broken grain, the particle size obtained during milling, temperature and pH control during the liquefaction, saccharification and fermentation stages , in the latter a special care to avoid contamination by microorganisms that can consume the substrates by decreasing the concentration of ethanol in the final product.
  • One of the advantages of this process is the obtaining of a decortication fiber stable in storage and suitable for ruminant feeding, the entry of more starch per kilogram of flour to the process and the clear and important reduction of liquefaction, saccharification and fermentation times. These time savings can surely translate into savings in energy, labor and more effective use of ethanol biorefinery. Worn grains from decortified sorghum can possibly be channeled to monogastric feed due to their high protein content and lower fiber content.
  • the step of distilling the fermented mixture obtained in the previous step is applied separately to the processes identified in Table 2 as A, B, C, D, E, and F and is preferably heated to 80 0 C, the mixture that contains alcohol, water and spent distillery grains. Bioethanol reaches its boiling point at approximately
  • the step of dehydrating the bioethanol is applied separately to the processes identified in Table 2, such as: A, B, C, D, E, and F and consists of dehydrating the bioethanol obtained in the distillation using molecular sieves packed with zeolite or some similar material, to obtain bioethanol ready for use as fuel.

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Abstract

Proceso mejorado para obtener bioetanol a partir de grano de sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) que integra las etapas de decorticación e hidrólisis con proteasas antes de Ia licuafacción. La decorticación se hace mecánicamente y permite obtener un subproducto rico en pericarpio o salvado y germen de sorgo estable. El grano decorticado produce mayores cantidades de biotenol en comparación con el grano entero. La hidrólisis con proteasa antes y durante Ia primera parte de Ia etapa de licuafacción permite hidrolizar Ia matriz proteica que recubre a los gránulos de almidón de sorgo y propiciar una mayor tasa de hidrólisis de almidón a dextrinas y glucosa después de las etapas de licuefacción y sacarificación, respectivamente. Las dos nuevas etapas del proceso acortan de manera significativa los tiempos de biocatálisis y fermentación de tal manera que se puede producir etanol en menor tiempo y con Ia utilización de menos recursos.

Description

Proceso mejorado para obtener bioetanol a partir de grano de sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) que integra las etapas de decorticación e hidrólisis con proteasas
DESCRIPCIÓN
OBJETO DE LA INVENCIÓN El objeto de esta invención se refiere a un proceso mejorado que permite obtener un mayor rendimiento bioetanol a partir de grano de sorgo (Sorghum bicolor L. Moench), y subproductos comercialmente mejorados como la fibra de decorticación y los granos gastados de destilería obtenidos del grano de sorgo.
ANTECEDENTES
El bioetanol es un combustible alterno a la gasolina en el proceso de combustión interna. El resurgimiento de la utilización de bioetanol como combustible se debe a dos razones principales: reducir la dependencia de un país al suministro o yacimientos de petróleo y una mayor conciencia ecológica que ha llevado a la búsqueda de un menor impacto en el medio ambiente. Existen muchas fuentes de energía y tecnologías que pueden ser consideradas para reducir o remplazar la dependencia al petróleo y sus derivados. Sin embargo, las alternativas tecnológicas se reducen si se toman en cuenta que (Sanderson, 2007):
• Debe contar con líneas de abastecimiento poco susceptibles a la interrupción y a efectos económicos negativos debido a problemas internacionales, como es la inestabilidad del precio del petróleo y desastres naturales.
• Debe estimular la economía rural tanto como sea posible, al aumentar las oportunidades del campo y de comercialización.
• Debe promover la protección del ambiente, a través de la reducción de emisiones contaminantes y disminución de destrucción de habitat y recursos naturales.
Tomando en cuenta lo anterior, se ha promovido en gran manera el bioetanol como una solución para un grupo de problemas complejos relacionados con la energía y el medio ambiente. Al ser comparado con los combustibles fósiles, el bioetanol tiene las grandes ventajas de ser renovable, propiciar una combustión limpia y producir menor cantidad de gases de efecto invernadero (Altinta? et al. 2002). Basados en la premisa de que el bioetanol pede contribuir a un ambiente mas limpio, y con la implementación de leyes de protección del ambiente en diferentes partes del mundo, los gobiernos han establecido estrategias para impulsar su producción y utilización como combustible (Ccopa-Rivera et al. 2006). Para Brasil, la mayor fuente para producción de bioetanol ha sido y es: la caña de azúcar (βaccharum officinarum). Este país fue de los primeros en impulsar la producción y uso de bioetanol durante las décadas de 1970 y 1980 (Ccopa-Rivera et al. 2006). En el caso de Estados Unidos, la producción de etanol a nivel comercial como biocombustible ha presentado un crecimiento sin precedentes y aún se espera un incremento en la producción de etanol como combustible (Srinivasan et al. 2006; Sanderson, 2007). Aproximadamente el 95% de esta producción es a partir de maíz {Zea mays L), principalmente procesado por molienda seca y el resto de diversos cereales entre los que se encuentra el sorgo (Wu et al. 2007). Uno de los principales argumentos contra la utilización de bioetanol es su competitividad económica contra los combustibles fósiles. Sin embargo, a través de la experiencia en Brasil se ha demostrado que la escala de producción los avances tecnológicos puede propiciar la competitividad de la producción de bioetanol reduciendo la brecha con los combustibles fósiles convencionales (Goldemberg et al. 2004). Como consecuencia, hay un marcado interés en el estudio de todas las etapas involucradas en la producción de bioetanol, esto con el fin de reducir los costos de producción (Ccopa-Rivera et al. 2006). Se han consideradodiferentes materias primas (Jones et al. 1994), variaciones en las condiciones de la molienda, mejoras en el proceso de producción de azúcares fermentables, fermentación a altas concentraciones de azúcares y nitrógeno (Jones et al. 1994), cultivo continuo con recirculación de levaduras (Brandberg et al. 2007) y utilización de microorganismos recombinantes (Altinta§ et al. 2002), entre muchas otras alternativas.
La utilización de cereales almidonosos cornos sustrato para la fermentación alcohólica con levadura (Saccharomyces cerevisiaé) es una tecnología bien establecida, conocida y madura (Pimientel y Patzek, 2005). El almidón, principal polisacárido de almacenamiento, que llega a representar el 70% en peso del maíz, se presenta como una fuente de glucosa de alto rendimiento (Bello-Pérez et al. 2002; Nigam y Singh, 1995). En comparación con otras fuentes de azúcares fermentables los cereales presentan la ventaja de poder ser almacenados durante tiempos prolongados y tener bajos costos de transporte y tratamientos previos (Abouizied y Reddy, 1986).
Para producir bioetanol a partir de cereales, el almidón debe ser hidrolizado a azúcares fermentables, principalmente glucosa (Thomas y Ingledew, 1990). Las etapas que tradicionalmente se realizan son: gelatinización de los granulos de almidón, liquefacción con alfa amilasa generalmente termoresistente y sacarificación con amiloglucosidasa. Estas dos enzimas (alfa amilasa y amiloglucosidasa) convierten prácticamente todo el almidón presente en el grano en azúcares fermentables, principalmente glucosa. Posteriormente mediante fermentación los azúcares fermentables se convierten a bioetanol. , Debido a la fuerte demanda de bioetanol en el mundo se ha incrementado significativamente la demanda de enzimas y levaduras. La aplicación de la tecnología de biocatálisis para la producción de etanol se puede clasificar en dos áreas, bebidas alcohólicas y etanol combustible. La tecnología en general es la misma, sin embargo, algunas de las condiciones y sustratos son diferentes (Sears, 1995). En el caso de bioetanol se busca disminuir los requerimientos energéticos para hacerlo mas competitivo con carburantes de origen fósil (Wang et al. 2007a). El rendimiento es la consideración mas imp'ortante para la producción de bioetanol a partir de maíz, y hay un énfasis renovado en el diseño de procesos de cocción que permitan un mayor rendimiento (Maisch, 2003). El objetivo del proceso de sacarificación es la producción de un jarabe con la máxima cantidad de glucosa posible. La razón por la que no se alcanzan altos niveles de glucosa (>94%) generalmente se atribuye a las reacción de reversión catalizadas por la amiloglucosidasa. También se ha reconocido que un factor adicional para no obtener altos rendimientos es la formación de maltulosa (4-α-D-glucopiranosil-D-fructosa). Una vez que la maltulosa se forma, el rendimiento final de glucosa es reducido debido a que la amiloglucosidasa no actúa entre la glucosa y la fructosa (Guzmán-Maldonado y Paredes-López, 1995).
Además de la presencia de azúcares fermentables, que son la fuente de carbono para la levadura, se requiere de una fuente de nitrógeno. Aún cuando un cereal sea rico en proteínas, la levadura no puede utilizar este material complejo a menos que primero sea hidrolizado a amino ácidos, dipéptidos o por lo menos a tripéptidos (Thomas y Ingledew, 1990). También se puede utilizar otras fuentes de nitrógeno no proteico como son la amonia y la urea. Estas fuentes son adicionadas para dar soporte al crecimiento de la levadura y evitar fermentaciones defectuosas. La cantidad y tipo de fuente de nitrógeno no solo afecta el crecimiento sino también tiene efecto sobre el rendimiento de etanol y el tipo de subproductos asociados (Wu et al. 2006b). Una de las principales partidas de costo en el proceso de producción de bioetanol es la materia prima (Brandberg et al. 2007). En la selección de la materia prima se debe de considerar principalmente el costo en el mercado y en el caso de cereales que tan biodisponible es el almidón. Esto debido a que diferentes tipos de cereales afectan de manera importante la velocidad de conversión y el rendimiento final de etanol (Wu et al. 2006a). En términos generales los costos de la materia prima afectan un 70% del costo de producción del etanol producido a partir de cereales almidonosos. Las biorefϊnerías procesadoras de cereales generalmente cuentan con un diseño de planta basada en molienda seca en lugar de molienda húmeda (almidón refinado) debido a que se requiere una menor inversión inicial y en equipo (Srinivasan et al. 2006). En el caso del maíz, el grano es molido y mezclado con agua para formar una suspensión que es calentada, dextrinizada, sacarificada y fermentada para producir bioetanol. Los materiales no fermentables del maíz (germen, fibra y proteína) son recuperados al final del proceso como granos gastados de destilería o GGD. El costo neto del maíz es alto en el proceso de molienda seca debido al bajo valor de los GGD (Singh et al. 2005). Con el propósito de hacer más redituable este proceso se han desarrollado trabajos para incrementar el rendimiento de etanol y la eficiencia de conversión: Thomas et al. (2001) estudió el efecto de los lactibacilos sobre el crecimiento de levadura en fermentación semicontinua utilizando como materia prima maíz. Pimientel y Patzek (2005) realizaron un estudio comparativo tomando en cuenta la inversión en campo y durante el proceso para la producción de etanol a partir de maíz, siendo las principales inversiones en maquinaria, irrigación y herbicidas. Singh et al. (2005) propone la tecnología de molienda fraccionada seca enzimática con el fin de mejorar la calidad de los granos gastados de destilería, aumentando su valor en el mercado y al mismo tiempo aumentando el rendimiento de etanol. En este proceso, el maíz se remoja en agua por un período corto seguido por una molienda gruesa con agua (además del agua de remojo) para remover selectivamente al pericarpio y germen libres de almidón. El endospermo resultante es finamente molido y la suspensión remanente dextrinizada, sacarificada y fermentada para producir bioetanol. El contenido de proteína de los GGD del proceso de molienda seca enzimática fue de 58% y la fibra detergente acida fue de 2%, en comparación con 28% de proteína y 11% de fibra detergente acida en el GGD convencional. Wang et al. (2005), concluyeron que al utilizar un proceso de molienda seca y enzimas proteolíticas en maíz, se aumentó la concentración de sustratos fermentables que redundó en un menor gasto en la etapa de purificación. Cabe mencionar que estos autores agregaron a las enzimas en la etapa de sacarificación/fermentación. Singh et al. (2006) realizó trabajos en relación a las α-amilasas endógenas en maíz para disminuir los gastos involucrados en licuefacción.
Para el caso de México, la información mas reciente en cuanto a consumo de energía total en el país corresponde al año 2005 y según el Reporte Nacional de Energía 2005 (SENER, 2007) el 42.5% fue por transporte. A su vez el 90% de la demanda del transporte esgasolina, lo que significa que el 38.58% del consumo de energía total en México en el año 2005 fue por utilización de autotransporte con motores de gasolina. Esto representa la demanda mas importante de energía. El esenario luce poco alentador en el futuro corto debido a dos principales hechos: que a partir del año 2006 se ha presentado una reducción gradual en la producción de petróleo en Canterell, fuente que provee el 61% de la producción nacional (PEMEX, 2007) y a que la problemática se acentúa debido a que cada día crece más el parque vehicular y por consiguiente la demanda de carburantes. Siendo concientes de esto, el 26 de abril de 2007, el Senado de la República aprobó la "Ley de Desarrollo de Bioenergéticos".
Es importante señalar, que la selección de la materia prima para la producción de bioetanol debe tomar en cuenta disponibilidad de la misma y que sea de bajo costo Para México la caña de azúcar, es "políticamente imposible" debido a la "Ley Cañera" y el alto precio de la caña de azúcar en el mercado (tonelada a 40 dólares), además de que se espera un aumento en la demanda y por lo mismo en el precio del azúcar de caña ya que en Estados Unidos se verá disminuida la producción de Jarabes de Alta Fructosa al canalizar la mayor producción de maíz a la producción de bioetanol (Quadri, 2007). En lo que respecta al maíz, en México no se debe considerar como una alternativa para la producción de bioetanol combustible, ya que forma parte fundamental de la alimentación de la población mas necesitada. Por otra parte, el sorgo {Sorghum bicolor) es un cereal que se caracteriza por una composición química muy similar a la de maíz, pero con menores requerimientos en campo y de irrigación para su cultivo (Hubbard et al. 1950).
En el mundo occidental, durante mucho tiempo se ha utilizado el sorgo como cultivo para alimentación de ganado, pero las grandes cantidades del mismo procesadas durante la Segunda Guerra Mundial por la industrial de destilación y molienda mostraron el potencial de este grano como materia prima para procesos de fermentación especialmente en zonas donde el cultivo del maíz se dificulta, como son las zonas áridas o semiáridas (Hubbard et al. 1950; Lázaro y Favier, 2000). México es el cuarto productor mundial de sorgo siendo utilizado en su gran mayoría como alimento para aves y ganado. La composición química del sorgo es prácticamente idéntica a la del maíz. Contiene por lo general un poco más de proteína pero una menor concentración de aceite. Interesantemente el grano de sorgo contiene aproximadamente la misma cantidad de almidón comparado con el grano de maíz lo cual lo hace atractivo como materia prima para producción de bioetanol. En relación al uso de sorgo como materia prima para procesos industriales se ha observado lo siguiente:
En un proceso convencional para la obtención de etanol, donde se sustituya el grano de maíz por grano de sorgo, la recuperación de almidón a partir del grano de sorgo no es tan completa como cuando se utiliza grano de maíz. Algunos de los factores responsables de esta situación son: (a) que este almidón se pierde en la fracción de germen y fibra debido a que se puede encontrar almidón en el pericarpio del grano y algunas de estas células periféricas no se rompen durante la molienda, y (b) además el almidón se encuentra recubierto con proteínas altamente entrecruzadas (Yang y Seib, 1996). Algunas células del endospermo periférico no se abren durante el proceso de molienda húmeda y el alto grado de entrelazamiento de las kafirinas o prolaminas asociadas con los granulos de almidón hacen mas difícil el fraccionamiento del sorgo (Higiro et al. 2003). Las técnicas de decorticación abrasivas han sido tradicionalmente utilizadas para obtener harinas y grits refinados de sorgo en África y Asia y los subproductos ricos en fibra, aceite, proteína y energía derivados de la decorticación pueden ser utilizados y canalizados a la alimentación de ganado, principalmente rumiantes (Rooney et al. 1972).
También los grits refinados con mayor contenido de almidón, han sido utilizados como adjuntos en la industria cervecera dado a que las enzimas de la malta los transforman en dextrinas y carbohidratos fermentables (Higiro et al. 2003).
Se ha observado que ciertos métodos de procesamiento de sorgo incrementan la digestibilidad de sus proteínas. Hamaker et al. (1987), observó que la digestibilidad "in vitro" de las proteínas de sorgo es afectada de manera negativa por el proceso de cocción, en tanto que el uso de agentes reductores (mercaptoetanol) mejora la digestibilidad de las mismas. Estos autores concluyeron que tanto la extrusión termoplástica como la fermentación incrementan la digestibilidad de sorgo cuando se utiliza en alimentación infantil.
Una de las etapas más importantes en la molienda húmeda para la obtención de almidón, es la etapa de remojo en una solución débil de dióxido de azufre. Esto debido al tiempo que implica (48 horas) y a que es un proceso realizado en lotes. Se han publicado varios trabajos cuyo objetivo es mejorar la hidrólisis de las proteínas del grano de sorgo para que liberen más rápidamente y efectivamente al almidón: Yang y Seib (1996), trataron de optimizar el proceso de remojo aumentando la temperatura para reducir el tiempo de remojo, pero no obtuvieron resultados favorables, llegando a la conclusión de que la mitad del almidón se encuentra asociado con proteínas entrecruzadas.
Los resultados obtenidos por estos autores indican que el cuello de botella inicial para el aislamiento de almidón a partir de granos de sorgo es la difusión de líquido de remojo dentro del grano. La segunda barrera probablemente sea el alto grado de entrecruzamiento de las proteínas de sorgo. Por otra parte, Johnston y Singh (2001), observaron que el uso de proteasas reduce el tiempo de remojo y los requerimientos de SO2 en el caso de maíz, pero no observaron ventaja alguna en cuanto al uso de enzimas de pared celular ya sea solas o combinadas con proteasas: Moheno-Pérez et al. (1997), Wang et al. (2000) y Serna-Saldívar y Mezo-Villanueva (2003), han realizado trabajos también centrados en la etapa de remojo, pero en función del uso de enzimas de pared celular con resultados favorables en cuanto a rendimiento de almidón. Mezo-Villanueva y Sema Saldívar (2004), realizaron un trabajo en relación al uso de proteasas durante la etapa de remojo en dióxido de azufre obteniendo resultados favorables en cuanto a rendimiento de almidón.
Moheno-Pérez (1994) observó que cuando se adicionan las enzimas degradadoras de pared celular junto con la solución de remojo (una sola etapa) no mejoran el rendimiento para la obtención de almidón a partir de grano de sorgo entero. En un estudio posterior, Serna-Saldívar y Mezo-Villanueva (2003), observaron que el uso de enzimas degradadoras de la pared celular incrementaban de manera significativa el rendimiento y recuperación de almidón, cuando se adicionan en etapa posterior al remojo del grano previamente molido en una concentración de 120 FBG/100 mL de grano.
Pérez-Carrillo y Serna-Saldívar (2006) observaron que la utilización de proteasa en grano quebrado después del remojo, ya sea solo o en combinación con enzimas degradadoras de pared celular da como resultado un mayor rendimiento de almidón a través de molienda húmeda lo que lleva a la conclusión de que el mayor efecto sobre la disponibilidad de almidón se debe a la presencia de proteínas en interacción con los granulos de almidón.
También se ha demostrado que los rendimientos de almidón pueden incrementarse sustancialmente sometiendo granos quebrados de maíz al ataque enzimático en la etapa de remojo. Sin embargo, debido a que prácticamente se ha perfeccionado el proceso de molienda húmeda sin la adición de enzimas y que los granulos de almidón no se encuentran muy entrecruzados con la matriz proteica, estos catalizadores no son muy utilizados en la práctica. En cambio, el uso de enzimas en la molienda húmeda o refinación de almidón del sorgo es más efectiva debido a que tiene una matriz proteica más entrecruzada y difícil de hidrolizar.
En el caso de cervecería, se sabe que el sorgo sin maltear prácticamente no contiene enzimas endógenas dando como resultado mostos de baja concentración de azúcares fermentables. Esto hace necesario la utilización de enzimas exógenas y tomar en cuenta diferentes aspectos tecnológicos durante la maceración como son: la capacidad del cocedor, el gasto energético, la utilización de enzimas endógenas y los parámetros óptimos de las mismas. Una etapa de maceración inadecuada da lugar a una protéolisis insúflente, gelatinización incompleta del almidón, resultando en una bajo grado de sacarificación y mostos con problemas de filtración (Goode et al 2003). Interesantemente, los mismos autores observaron que el uso de proteasa en la producción de mostos a partir de sorgo sin maltear aumentaba los niveles de hidrólisis de proteínas o solubilización de nitrógeno. La tecnología convencional de procesamiento del sorgo esta muy lejos de ser la óptima en comparación con otros cereales de igual relevancia como son el maíz, trigo {Triticum sp) y arroz (Orγza sativa) (Lázaro y Favier, 2000). Uno de los problemas involucrados en la correcta utilización del sorgo es la decorticación poco efectiva (Suroso et al. 2000). Las cantidades de ciertos anti-nutrientes pueden ser reducidos por decorticación ya que se puede remover selectivamente el pericarpio y la testa (Lestienne et al. 2006). Yetneberk et al. (2005) observaron que al decorticar sorgo se mejora la calidad de un producto alimenticio fermentado. Corredor et al. (2006) estudiaron el efecto de solo decorticar 10 y 20% sorgo sobre la producción de bioetanol y la composición de los granos de destilería, concluyendo que la decorticación a un 10% tuvo un efecto positivo mayor que cuando se decortica al 20% en cuanto al rendimiento del biocombustible. Este último trabajo muestra el posible uso de la decorticación, no solo la producción de alimentos, sino como una etapa previa en el proceso de producción de alcohol grado combustible. Lantero et al. (1993) presentaron una patente en la cual proponen la utilización de una proteasa en la etapa de sacarificación-fermentación simultánea. La utilización de la enzima proteolítica tuvo un efecto positivo en la producción de etanol y nitrógeno o amino ácidos disponibles para la levadura. Sin embargo la tecnología propuesta tiene la desventaja de no permitir la liberación de dextrinas atrapadas por las proteínas además de que la enzima proteolítica puede bajar significativamente la actividad de la glucoamilasa o amiloglucosidasa. En la solicitud de patente, motivo de esta invención, se refiere a un proceso mejorado para la producción de bioetanol utilizando como materia prima el grano de sorgo (Sorghum bicolor I. Moench); y los productos obtenidos son el bioetanol, fibra de decorticación y GDD obtenidos a partir de grano de sorgo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Diagrama de flujo del proceso mejorado para la obtención de bioetanol a partir de granos de sorgo.
Figura 2. Gráfica del porcentaje de fibra retirada expresada en base al peso inicial de sorgo blanco decorticado respecto al tiempo de decorticación. Figura 3. Gráfica del perfil de concentración de azúcares reductores en la suspensión de harinas hidrolizadas con α-amilasa termoestable en el proceso convencional.
Figura 4. Gráfica del perfil de concentración de azúcares reductores en la suspensión de harinas hidrolizadas con α-amilasa termoestable en el proceso aquí propuesto que incluye hidrólisis con proteasa. Figura 5. Gráfica del perfil de concentración de α-ANL durante la etapa de sacarificación con α-amilasa termoestable en el proceso convencional
Figura 6. Gráfica del perfil de concentración de α-ANL durante la etapa de sacarificación con α-amilasa termoestable en el proceso aquí propuesto que incluye hidrólisis con proteasa. Figura 7. Gráfica del perfil de concentración de glucosa en la suspensión de dextrinas en el proceso convencional.
Figura 8. Gráfica del perfil de concentración de glucosa en la suspensión de dextrinas en el proceso aquí propuesto que incluye hidrólisis con proteasa.
Figura 9. Gráfica del perfil de concentración de glucosa en el mosto dulce durante el la etapa de fermentación en el proceso convencional.
Figura 10. Gráfica del perfil de concentración de glucosa en el mosto dulce durante el la etapa de fermentación en el proceso aquí propuesto que incluye hidrólisis con proteasa.
Figura 11. Gráfica del perfil de concentración de α-ANL en el mosto dulce durante la etapa de fermentación con el proceso convencional. Figura 12. Gráfica del perfil de concentración de α-ANL en el mosto dulce durante la etapa de fermentación con el proceso aquí propuesto que incluye hidrólisis con proteasa.
Figura 13. Gráfica del perfil de generación de etanol durante la etapa de fermentación de mostos dulces con el tratamiento convencional.
Figura 14. Gráfica del perfil de generación de etanol durante la etapa de fermentación de mostos dulces con el proceso aquí propuesto que incluye hidrólisis con proteasa.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a un proceso mejorado para la producción de bioetanol utilizando como materia prima el grano de sorgo (Sorghum bicolor I. Moench). El proceso general esta representado en la FIGURA 1 y comprende las etapas de:
a) Decorticar los granos de sorgo (1)
Esta etapa se realiza para eliminar las capas externas del grano de sorgo, para exponer el endospermo que contiene el almidón, y hacerlo susceptible en las etapas posteriores y propiciar su conversión a bioetanol. La decorticación se realiza óptimamente hasta remover del 7 - 10% del peso del grano entero por medios mecánicos, como por ejemplo en un equipo provisto con discos de carborundum, (Mutana Machine, Saskatoon), Adicionalmente en esta etapa se remueven más del 60% de compuestos fenólicos del grano de sorgo entero, y la remoción de estos compuestos fenólicos, se concentra en la fibra de decorticación que en un proceso convencional para la producción de bioetanol, no se obtiene. Los productos resultantes de la etapa de decorticación son: granos de sorgo decorticados y fibra de decorticación (que comprende: pericarpio o salvado y parte del germen). Preferentemente los granos de sorgo se decortican desde 5 minutos hasta de 30 minutos hasta remover entre un 7 a 10% del peso original del grano, que durante las etapas del proceso motivo de esta invención, se traduce principalmente en ahorros energéticos y alta eficiencia; porque la cantidad de materia fermentable contenida en los granos de sorgo decorticado que entra al proceso, tiene mayor biodisponibilidad y mayor proporción; y se reduce la concentración de materia no fermentable (la fibra de decorticación) que entra al proceso y que implica mayor consumo energético; y que al ser separada esta fibra de decorticación puede ser aprovechada comercialmente. Durante esta etapa, algunos granos de sorgo, se quiebran, y para reducir la pérdida de granos quebrados, a los productos resultantes de la decorticación se les trata con un medio capaz de remover únicamente la fibra de decorticación (por ejemplo un aspirador de aire o tarara) y separarla selectivamente del grano decorticado. El grano decorticado producto principal de esta etapa, al removerle la fibra de decorticación, disminuye su concentración de compuestos fenólicos, y se convierte en un sustrato con mayor biodisponibilidad para: las enzimas amilolíticas utilizadas en las etapas posteriores de liquefacción y sacarificación y para las levaduras en la etapa de fermentación.
La fibra de decorticación obtenida tiene un contenido de humedad de 9 a 15% , y puede ser utilizada principalmente para alimentación de ganado o como materia prima en la elaboración de alimentos de consumo humano, debido a que se caracteriza por ser rica en proteínas, extracto etéreo o aceite, baja humedad y compuestos fenólicos; lo que le confiere: estabilidad de almacenamiento a temperatura ambiente, y su consiguiente disminución de costo en la transportación; extender la vida de anaquel, ya que los compuestos fenólicos actúan como agentes protectores contra enfermedades causadas por insectos y fitopatógenos y como antioxidantes que previenen la rancidez del aceite que obviamente baja la palatabilidad del alimento de ganado.
b) Moler en seco los granos de sorgo decorticados (2)
Los granos de sorgo decorticados se molturan o muelen utilizando preferentemente un molino de martillos Arthur Thomas Co. Philadelphia, PA, provisto con una malla con orificios de 2 mm y el producto obtenido es harina de sorgo; la harina de sorgo resultante contuvo un distribución de tamaño de partícula o perfil granulométrico con
68% de las partículas con un tamaño de 420 μm, 11.5% entre 250-420 μm, 7.7% entre
149 a 250 μm y 11.1 menor a 149 μm. La harina de sorgo y la fibra de decorticación, se caracterizaron químicamente, y los resultados obtenidos se presentan en la tabla 1, de estos resultados podemos resaltar que la mayor concentración de almidón esta en la harina de sorgo y que además tiene menor concentración de compuestos fenólicos.
TABLA 1. Caracterización química y perfil de fenólicos totales de Ia harina de Sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) decorticado y harina de Ia fibra de decorticación de sorgo1.
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'Los valores reportados corresponden al promedio de tres repeticiones y se encuentran reportados como porcentaje en base seca, exceptuando fenólicos totales. ELN = extracto libre de nitrógeno que da una indicación de la cantidad de almidón y otros azúcares.
c) Hidrolizar con proteasa (3)
A partir de la harina de sorgo obtenida por molienda seca, se diluyo en agua, para obtener una suspensión harina:agua, que se somete a una rampa de temperatura como a continuación se indica: " Preparar una suspensión 30:70 de harina:agua.
" Agregar de 0.2 a 0.4% de Ca(OH)2 en relación al contenido de harina de sorgo para asegurar una buena actividad de las enzimas calcio dependientes. " Ajustar la suspensión de harina:agua, a un pH de 6.5 utilizando HCl 0.1N.
Opcionalmente se puede trabajar desde un pH de 4.5 hasta 7. " Adicionar 0.5 mL de al menos una enzima proteolítica.
• Calentar en un baño María con agitación la suspensión de harina: agua, procurando que después de 15 minutos alcance una temperatura de 60° C. Es importante considerar que la condición de temperatura no es la recomendada como óptima por el proveedor de la enzima, sin embargo es el rango de temperatura óptimo para esta etapa, que en un proceso convencional el incremento de temperatura no se aprovecha como en el proceso aquí propuesto, que se aprovecha para incluir la hidrólisis con al menos una proteasa.
De acuerdo con el fabricante, las condiciones óptimas de la mezcla de metaloproteasas usadas son:
Temperatura en el rango de 45 a 55° C y se desnaturaliza o inactiva a temperaturas superiores de 70° C. pH en el rango de 5.5 a 7.5, puede usarse una o combinación de enzimas proteoliticas con características similares a esta.
d) Licuifícar la suspensión harina:agua hidrolizada (4) De la suspensión de harina:agua hidrolizada obtenida en la etapa anterior se obtiene una suspensión de dextrinas, con el protocolo que a continuación se indica:
" Adicionar 0.2 mL de una alfa amilasa termoresistente a la suspensión de harina:agua hidrolizada. La actividad declarada por el proveedor para esta enzima es de 240 KNUs/g. Trabaja óptimamente a 900C y un pH de 7. " Incrementar gradualmente la temperatura por 55 minutos hasta alcanzar la temperatura máxima de 83 a 95° C. (Es importante considerar que esta temperatura no es la óptima para la actividad de la enzima recomendada por el proveedor, pero si la recomendada para llevar a cabo esta etapa.) " Dejar reaccionar por 2 horas a 83°C - 900C con agitación de 50-150 rpm para propiciar el contacto entre la enzima y sustrato.
• Disminuir la temperatura hasta alcanzar un rango entre 55 - 6O0C en el menor tiempo posible. " Ajustar la suspensión de dextrinas a un pH preferentemente de 5.5 utilizando
HCl O. IN. De acuerdo con el fabricante, las condiciones óptimas de la alfa amilasa termoresistente son:
Temperatura en el rango de 85° C - 95° C, y pH en el rango de 5.5 - 7.5. Sin embargo, esta enzima alfa amilasa termoestable, puede ser sustituida por alguna enzima comercial con características similares.
En esta etapa de licuefacción, el almidón de la suspensión de harina: agua hidrolizada, primero presenta gelatinización, fenómeno que se puede ver afectado por las características del granulo de almidón. La gelatinización es necesaria para hacer incrementar la eficiencia de la enzima alfa amilasa termoresistente puesto que los granulos de almidón se rompen exponiendo a las moléculas de amilosa y amilopectina que son mas susceptibles a la alfa amilasa termoresistente e) Sacarificar la suspensión de dextrinas (5)
Convertir la suspensión de dextrinas obtenida en la etapa de licuefacción en una suspensión de mosto dulce concentrado, para llevar a cabo la conversión se agrega a la suspensión de dextrinas obtenida en la etapa anterior (de licuefacción), la enzima amiloglucosidasa en una relación enzima: sustrato 1:100 (p/p), incubar la suspensión de dextrinas un rango de temperatura de 55 a 60° C y pH 5.5 con agitación entre 60 a 120 rpm, entre 14 a 16 horas, para obtener un mosto dulce concentrado con materia , insoluble.
De acuerdo con el proveedor la enzima amiloglucosidasa trabaja óptimamente a un rango de pH 4.5 a 5.5 y una temperatura óptima de 55° C - 60° C y consiste en un complejo enzimático principalmente de amiloglucosidasa o glucoamilasa y enzimas desramificadoras de las cadenas de almidón que se denominan pululanasas.
f) Ajustar a grados plato el mosto dulce concentrado (6) Una vez que se concluye la etapa de sacarificación, los mostos dulces concentrados resultantes, se enfrian entre 20 - 25°C y ajustan a una cierta concentración de azúcares. Para el ajuste se debe medir la concentración de los sólidos solubles como °Plato utilizando un refractómetro. Si la concentración de sólidos solubles en los mostos dulces concentrados corresponde a un valor superior a 11-15 °Plato, preferentemente se debe agregar agua para diluir y obtener una lectura en el refractómetro de l l-15°Plato y al diluir el mosto dulce concentrado se le denomina en adelante como mosto dulce estandarizado.
g) Fermentar el mosto dulce estandarizado (7) En esta etapa los mostos dulces estandarizados son inoculados preferentemente con una levadura para obtener bioetanol, que es el producto de interés en el proceso aquí propuesto, para esto es necesario:
" Ajustar a los mostos dulces estandarizados preferentemente a un pH de 4.5 a
5.5 y una temperatura óptima de 32 a 36°C " Inocular los mostos dulces estandarizados con una levadura, organismos genéticamente modificados osmotolerantes, u otros microorganismos capaces de convertir la glucosa en etanol, como ejemplos de levaduras pueden ser Pichia pastoris sp o Saccharomyces cereviseae preferentemente en este proceso se usa Saccharomyces cereviseae ATCC 24858 en relación 1:100, es decir agregar 1 mL de inoculo por cada 100 mL de mosto dulce para iniciar la fermentación con una concentración de 15x106 células/900 mL de mosto dulce estandarizdo. Incubar los mostos dulces inoculados preferentemente a 30° C con 125 rpm de agitación durante 72 horas.
Durante la fermentación alcohólica se reconocen dos grandes vias secuenciales, la vía aeróbica y la vía anaeróbica. En la primera, la levadura utiliza al oxígeno contenido en el mosto y presente en el espacio de cabeza del fermentador para reproducirse asexualmente por gemación. Esta etapa dura aproximadamente 12 hrs, y una vez que se agotó el oxígeno las condiciones se tornan anaeróbicas y aquí es donde la levadura empieza a producir etanol. Las condiciones de fermentación afectan la tasa de conversión de azúcares fermentables a bioetanol. Generalmente se realizan las fermentaciones con un pH inicial de 4.5 a una temperatura de 32 a 36°C. El pH gradualmente se disminuye durante la etapa de fermentación debido a la producción de ácidos orgánicos y la temperatura tiende a incrementarse debido a que la levadura activa, genera calor que tiene que ser disipado por un intercambiador de calor que generalmente forma parte de los reactores de fermentación.
h) Destilar mezcla fermentada (8)
Para una recuperación primaria del bioetanol producto principal de este proceso, que esta mezclado con: agua y granos gastados de destilería, se somete a un proceso típico de destilación en donde la mezcla se trata térmicamente en a una columna de destilación. En estas columnas el etanol se evapora a temperaturas superiores a los 700C y se recondensa; generalmente en la primera parte de la etapa de destilación se recupera etanol con agua (90% etanol y 10% agua). A este producto se le somete a una segunda etapa de destilación donde se rectifica el contenido de etanol para concentrarlo a un 95%. Finalmente para obtener etanol grado combustible con una pureza superior al 98% la mezcla se somete a una destilación azeótropica o a la deshidratación usando un tamiz molecular que liga al agua de la mezcla. El producto principal en esta etapa es el etanol y el producto remanente de estas operaciones es una mezcla de granos gastados de destilería: agua. i) Deshidratar bioetanol en tamices moleculares (9)
El biotenol obtenido en la etapa de destilación, se deshidrata, preferentemente para esta deshidratación se usan una pluralidad de tamices moleculares empacados con zeolite o algún material semejante. El tamiz molecular adsorbe y retiene al agua presente en el bioetanol y se obtiene bioetanol anhidro o deshidratado, listo para su utilización como combustible.
j) Centrifugar granos gastados de destilería (10) La mezcla de granos gastados de destilería: agua, obtenida en la etapa de destilación, se centrifuga para separar a los granos gastados de destilería y retirar el agua, que puede aun contener mínimas cantidades de bioetanol que pudo quedar atrapado y reintegrarlo al flujo que entra a las etapas de destilación. El producto obtenido en esta etapa son los granos gastados de destilería, que posteriormente pueden ser deshidratados o secados para ser canalizados a alimentación de animales domésticos.
Con la finalidad resaltar la eficiencia del proceso motivo de esta invención, respecto al proceso convencional; y el proceso convencional que incorpore únicamente una de las dos nuevas etapas (decorticación o hidrólisis con proteasa), se llevaron a cabo de manera independiente 6 procesos, que identificaremos como se indica en la siguiente lista y en la Tabla No. 2
(A) Proceso convencional, para maíz (no incluye las etapas de decorticación e hidrólisis con proteasa incluidas en el proceso aquí propuesto). (B) Proceso convencional, para sorgo (no incluye las etapas de decorticación e hidrólisis con proteasa incluidas en el proceso aquí propuesto).
(C) Proceso convencional con la incorporación de la etapa de decorticación, para el sorgo.
(D) Proceso convencional con la incorporación de la etapa de hidrólisis con proteasa, para maíz.
(E) Proceso convencional con la incorporación de la etapa de hidrólisis con proteasa, para sorgo. (F) Proceso aquí propuesto para sorgo, que incluye las etapas de decorticación e hidrólisis con proteasa.
TABLA 2. Diferencias entre el proceso convencional, y el proceso motivo de esta invención, que incluye decorticación e hidrólisis con proteasa.
Figure imgf000020_0001
a) Decorticar los granos de sorgo
Esta etapa se aplica a los procesos identificados como "C" y "F" y consiste en tomar 3 lotes de sorgo de 4 kg cada uno, y decorticarlos mecánicamente, utilizando un equipo de planta piloto equipado con 5 discos de carborundum (60 grits) de 30 centímetros (Nutana Machine, Saskatoon). Estos 5 discos se encuentran posicionados en un eje que gira a altas revoluciones. Los granos de sorgo al friccionarse con la superficie abrasiva de los discos van perdiendo gradualmente sus capas externas. Cada 5 minutos se retiró el grano y la fibra removida a través de un tamiz para estimar el grado de decorticación y el rendimiento del subproducto o material decorticado.
El grano de sorgo se decorticó por 30 minutos con el objetivo de remover el 10% del peso original del grano. Cabe mencionar que existen otros equipos comerciales para decorticación que pueden realizar esta labor en 5-7 minutos debido a que operan a mayores revoluciones por minuto, si embargo la decorticación se realiza preferentemente hasta remover el 10% del peso original del grano. En la FIGURA 2 se encuentra registrada la ecuación que relaciona el porcentaje de material removido (Y) o decorticado en relación con el tiempo de decorticación (X).
b) Moler en seco los granos La etapa de molienda en seco, se aplica por separado a todos los procesos identificados en la tabla 2, como: A, B, C, D, E, y F; utilizando preferentemente un molino de martillos (Arthur Thomas Co. Philadelphia, PA) provisto con una malla con orificios de 2 mm. Las harinas de sorgo resultantes contuvieron un distribución de tamaño de partícula o perfil granulométrico con 68% de las partículas con un tamaño de 420 μm, 11.5% entre 250-420 μm, 7.7% entre 149 a 250 μm y 11.1 menor a 149 μm. La harina de maíz contuvo una distribución de tamaño de partícula o perfil granulométrico mas fino en comparación con las dos harinas de sorgo. Aproximadmente el 50% de las partículas con un tamaño de 420 μm, 12% entre 250-420 μm, 12% entre 149 a 250 μm y 25 menor a 149 μm. Posteriormente las harinas obtenidas para cada uno de los 6 procesos independientes, se caracterizaron químicamente y los resultados se presentan en la tabla 3.
TABLA 3. Caracterización química y perfil de fenólicos totales de materia prima para la producción de harinas de licuefacción y de fibra obtenida por decorticación de sorgo1.
Sorgo Blanco Fibra de
Parámetro Maíz Amarillo Decorticación de
Entero Decorticado sorgo
Humedad 12.03±0.11 12.53±0.19 11.15±0.05 8.88±0.04
Cenizas 1.42±0.20 1.42±0.08 1.36±0.03 3.96±0.05
Proteína 9.26±0.56 12.41±0.51 10.90±0.62 18.07±0.20
Extracto Etéreo 4.00±0.42 1.09±0.27 0.66±0.05 10.43±0.44
Fibra Cruda 3.03±0.18 3.65±0.37 1.78±0.14 1 1.08dk0.24
ELN 82.28±1.80 82.5Ü1.90 83.80±0.84 76.26±0.76
Almidón 76.74±0.18 73.24±0.24 75.80±0.22 19.80±0.41
Fenólicos Totales
(equivalentes de ácido 0.42±0.01 1.44±0.09 0.45±0.01 10.92±0.72 gálico mg/g)
Tos valores reportados corresponden al promedio de tres repeticiones y se encuentran reportados como porcentaje en base seca, exceptuando fenólicos totales. El grano de sorgo decorticado al 10% (de los procesos identificados como: C y F) tuvieron menores cantidades de cenizas, extracto etéreo y fibra cruda y adicionalmente implicó retirar el 68.7% del total de compuestos fenólicos en comparación con los procesos B y E que emplean el grano de sorgo sin decorticar, y en comparación con los procesos A y D, que empelan el grano de maíz sin decorticar. Este cambio en la composición, dio lugar a un aumento del contenido de el grano de sorgo decorticado en el contenido de almidón y/o extracto libre de nitrógeno respecto con el grano de sorgo sin decorticar. Adicionalmente el retirar los compuestos fenólicos hace que el grano de sorgo decorticado sea un mejor sustrato para las enzimas amilolíticas utilizadas en las etapas de liquefacción y sacarificación y de las levaduras durante la fermentación.
c) Hidrolizar con proteasa La etapa de hidrólisis con proteasa, se aplica por separado a los procesos identificados en la tabla 2, como: D, E, y F; y consiste en preparar una suspensión 30:70 de harina: agua, (harina obtenida en el a etapa de molienda seca), así que por cada proceso, se tienenl50 g de harina seca y se adicionan 350 mL de agua.
A cada una de las seis supensiones de harina: agua, se le trata por separado como a continuación se describe:
" Agregar 0.2% de Ca(OH)2 en relación al contenido de harina. " Ajustar el pH a 6.5 utilizando HCl 0.1N.
" Adicionar 0.5 mL de una enzima proteolítica, que opcionalmente puede ser Neutrase 0.5L®) de Novo Nordisk. Esta enzima tiene una actividad declarada por el proveedor de 0.5 unidades Anson/gr y trabaja óptimamente a una temperatura de 45 a 550C y un pH de 5.5 a 7.5. Opcionalmente se puede adicionar cualquier otra proteasa o conjunto de proteasas de acuerdo a la especificación de los proveedores. Esta proteasa debe ser preferentemente utilizada a la temperatura y pH que recomiende el proveedor. " Calentar en un baño de agua para calentamiento con agitación (Hot Shaker, BeIlCo Glass, Inc. Vineland, NJ. USA) la suspensión harina:agua, procurando que después de 15 minutos alcance una temperatura de 60° C.
En la etapa de hidrólisis de almidón primero se presenta una gelatinización, fenómeno que se puede ver afectado por las características del granulo de almidón.
Al concluir esta etapa y determinar la concentración de azucares reductores final obtenida en cada tipo de suspensión (suspensión de harina de maíz, suspensión de harina de sorgo entero, suspensión de de harina de sorgo decorticado), se tiene que: En la FIGURA 3 se puede apreciar que en el proceso convencional (que no incluye la etapa de hidrólisis con proteasa) no existen diferencias significativas en el perfil de azúcares reductores para los tres tipos de granos utilizados, y que los hidrolizados obtenidos comprenden entre 17-20% de azúcares reductores después de 3 horas de hidrólisis. En la FIGURA 4 se puede observar que al incluir la hidrólisis con proteasa antes de la licuefacción aumentó muy significativamente la concentración de azúcares reductores especialmente en los hidrolizados de sorgos. Comparativamente es interesante recalcar que la máxima cantidad de azúcares en el proceso convencional fueron de 15g de azucares reductores /10Og, mientras que en los sorgos tratados con proteasa sobrepaso los 30g/100g. Esto indica importantes diferencias en la tasa de hidrólisis y hace evidente la necesidad de incluir la etapa de hidrólisis con proteasa antes de la etapa de licuefacción. Sin embargo, para sorpresa los hidrolizados de harina de maíz que incluían la etapa de hidrólisis con proteasa fueron los que terminaron la licuefacción con las menores cantidades de azúcares reductores. Con los datos obtenidos se puede concluir que incluir la etapa de hidrólisis con proteasa antes de la licuefacción produce mayor concentración de azucares reductores, a partir de los cuales se va obtener bioetanol.
d) Licuificar la suspensión harina:agua hidrolizada
La etapa de licuificar la suspensión de harina: agua hidrolizada obtenida en la etapa de hirolisis con proteasa, se aplica por separado a todos los procesos identificados en la tabla 2, como: A, B, C, D, E, y F; y consiste en preparar • Adicionar 0.2 mL de una alfa amilasa termoresistente, que opcionalmente puede ser Termamyl L®, Novo Nordisk a cada una de las suspensiones harina:agua hidrolizada.
" Incrementar gradualmente la temperatura por 55 minutos hasta alcanzar la temperatura máxima de 83° C.
" Dejar reaccionar por 2 horas a la temperatura de 830C en un baño con agitación a 150 rpm. La agitación mejora la hidrólisis ya que promueve el contacto entre la enzima alfa amilasa y el sustrato.
• Disminuir la temperatura hasta alcanzar preferentmente 600C en el menor tiempo posible.
" Ajustar la suspensión de dextrinas a un pH preferentemente de 5.5 utilizando HCl
0.1N.
Al producto obtenido en esta etapa se le llama suspensión de dextrinas generadas por la hidrólisis de las cadenas de amilosa y amilopectina. - En la FIGURA 5 y 6 esta reportado el perfil de alfa amino nitrógeno libre o α-ANL generados durante la etapa de liquefacción para el proceso convencional (FIGURA 5) y el proceso aquí propuesto que incluye hidrólisis con proteasa (FIGURA 6). En la FIGURA 5 se observa los valores obtenidos de α-ANL en las harinas de maíz, sorgo entero y sorgo decorticado tratados con el proceso convencional, el maíz tuvo los valores más altos de α-ANL seguido por el sorgo decorticado y por último el sorgo entero. La diferencia de α-ANL entre sorgo decorticado y entero, se ve incrementada en el sorgo decorticado y se atribuye a la etapa de decorticación que remueve el pericarpio, rico en celulosa, hemicelulosa, lignina y otras fibras que actúan como barreras físicas que retrasan la hidrólisis enzimática y que adicionalmente también disminuyó la concentración de compuestos fenólicos que inhiben enzimas como α-amilasa y tripsina, trayendo como consecuencia menor inhibición de dichas enzimas. Los hidrolizados de maíz y sorgo decorticado tuvieron aproximadamente 60 y 30% más α-ANL respectivamente en comparación con los hidrolizados de sorgo entero. En la FIGURA 6 se observan los valores obtenidos de α-ANL en los granos maíz, sorgo entero y sorgo decorticado tratados con el proceso motivo de esta invención, poniendo en evidencia que al incluir la etapa de hidrólisis con proteasa aumentó la concentración de α-ANL en todos los tipos de hidrolizados. Esto debido a que la proteasa hidrolizó parcialmente a las proteínas produciendo mayores cantidades de aminoácidos y péptidos de bajo peso molecular que son fuente de nitrógeno disponible para la levadura.
Los hidrolizados de sorgo entero y sorgo decorticado que incluyeron la etapa de hidrólisis con proteasa tuvieron aproximadamente 40 mg/L más de α-ANL comparado con los hidrolizados de sorgo entero y sorgo decorticado obtenidos por el proceso convencional.
Por lo cual se concluye que la integración de las etapas de decorticación mecánica del sorgo e hidrólisis con proteasa antes y durante la liquefacción es muy recomendable ya que se incrementan de manera significativa el grado de hidrólisis del almidón y proteínas durante la licuefacción, traduciéndose en un sustrato mas adecuado para la amiloglucosidasa que se incorpora en la etapa posterior de sacarificación. Adicionalmente se obtiene, una mayor concentración de nitrógeno que eventualmente estará disponible para la levadura utilizada en la etapa subsecuente de fermentación.
e) Sacarificar la suspensión de dextrinas
La etapa de sacarificar la suspensión de dextrinas obtenidas en la etapa anterior de licuificar, para obtener un mosto dulce concentrado, se aplica por separado a los procesos identificados en la tabla 2, como: D, E, y F; y consiste en:
Agregar una amiloglucosidasa preferentemente Dextrozyme® (Novo Nordisk, Princeton, NJ) en una relación enzima:sustrato 1 :100 (p/p). Este complejo enzimático consiste principalmente de amiloglucosidasa o glucoamilasa y enzimas desramificadoras de las cadenas de almidón que se denominan pululanasas. Estas enzimas hidrolizan a las dextrinas resultantes de la licuefacción en glucosa. En la investigación aquí descrita una vez que se añadió el complejo enzimático se mantuvo a 550C durante 16 hrs con agitación a 120 rpm. Cabe mencionar que esta etapa de sacarificación generalmente se integra a la de fermentación para tener importantes ahorros de energía y tiempo. Cuando se integra la etapa desacarificación con la de fermentación la temperatura y pH se regulan a 36-37°C y 5.2 a 5.4 respectivamente. En las FIGURAS 7 y 8 esta reportada la concentración de glucosa (mg/mL) obtenida durante la etapa de sacarificación, para el proceso convencional (FIGURA 7) y el proceso aquí propuesto que incluyó la etapa de hidrólisis con proteasa (FIGURA 8). La FIGURA 7 es una gráfica que muestra la concentración de glucosa obtenida en la etapa de sacarificación del proceso convencional para cada uno de los tres diferentes tratamientos, se puede observar que la concentración de glucosa obtenida de los tratamientos con sorgo entero y sorgo decorticado, se mantiene prácticamente igual durante las seis primeras horas, presentándose posteriormente diferencia en la concentración favoreciendo esta al tratamiento con sorgo decorticado; si embargo el tratamiento con maíz, a la tercera hora alcanzó la mayor concentración de glucosa, y existió una diferencia poco significativa entre la concentración observada entre la hora catorce y dieciséis. Sin embargo, la concentración final de glucosa de los tres tratamientos osciló entre 140 - 180 mg glucosa/mL, teniendo la concentración mas alta el tratamiento que utilizó harina de maíz como materia prima.
En la FIGURA 8 se puede apreciar que la concentración de glucosa no se ve afectada por incluir en el proceso las etapas de decorticación e hidrólisis con proteasa, pues el rango de concentración de glucosa es entre 140 - 180 mg/mL, al igual que en los tratamientos equivalentes en el proceso convencional; pero el incluir dichas etapas en el proceso aquí propuesto si tuvo un efecto sobre la tasa de conversión de dextrinas a glucosa, ya que durante las dos primeras horas la diferencia entre los perfiles de glucosa observados para los tratamientos con con sorgo entero sorgo decorticado fue mínima; sin embargo, al término de 3 horas el tratamiento con maíz generó 30% más de glucosa que la generada por cualquiera de los tratamientos con sorgo entero y sorgo decorticado; y el valor que alcanzó el tratamiento con maíz a las tres primeras horas, fue alcanzado por el sorgo decorticado hasta las ocho horas de reacción.
Haciendo un análisis de los resultados obtenidos para los tratamientos que siguieron el proceso motivo de esta invención, se puede observar que como era de suponerse, el sorgo entero presentó la menor tasa de hidrólisis y menor concentración final de glucosa. La conversión de glucosa en los tratamientos con maíz y sorgo decorticado fue igual las primeras 2 horas y posteriormente la concentración de glucosa del tratamiento de maíz supero la concentración de glucosa del tratamiento con sorgo decorticado, de manera que para las 6 horas, la concentración de glucosa del tratamiento con maíz había superado aproximadamente un 10% a la concentración de glucosa del tratamiento con sorgo decorticado. La concentración final de glucosa relativa a la observada en el hidrolizado de maíz fue de 88 y 72% para el sorgo decorticado y entero, respectivamente.
En cada uno de los tratamientos (maíz, sorgo entero y sorgo decorticado), el uso de la proteasa no afectó la concentración final de glucosa en los hidrolizados, sin embargo si tuvo un efecto sobre la velocidad de generación de glucosa. Esto indica que el uso de la proteasa puede disminuir tiempos de biocatalisis con la amiloglucosidasa. En el caso de maíz el incluir la etapa de hidrólisis con proteasa permitió generar en los primeros 30 minutos la misma concentración de glucosa que se generó a los 90 minutos con el proceso convencional. Al integrar las etapas de decorticación de sorgo e hidrólisis con proteasa en el proceso motivo de esta invención, se tiene que en el tratamiento con sorgo decorticado a los 30 minutos de iniciada la etapa de sacarificación alcanzó la misma concentración de glucosa que la observada hasta las 7 horas en el sorgo decorticado tratado sin proteasa. Todo esto evidencia que la integración en un mismo proceso de las etapas de decorticación e hidrólisis con proteasa logra un aumento en la velocidad de generación de dextrinas durante el paso de liquefacción y glucosa durante la sacarificación. Esto se traduce en una clara reducción en tiempos de proceso y ahorros energéticos.
f) Ajustar grados plato el mosto dulce concentrado
La etapa de ajustar a grados plato el mosto dulce concentrado se aplica por separado a los procesos identificados en la tabla 2, como: A, B, C, D, E, y F y comprende:
" Enfriar los mostos dulces concentrados obtenidos al sacarificar (etapa e) en preparación para la etapa crítica de fermentación que generalmente se lleva a cabo a una temperatura de 25°C
" Medir la concentración de los sólidos solubles como °Plato utilizando un refractómetro, solo si la concentración de solidos solubles en los mostos dulces concentrados es superior a 15o Plato, se continua en el paso siguiente. • Diluir con agua hasta obtener una lectura en el refractómetro preferentemente de 13° Plato. El ajuste en °Plato es necesario para asegurar que la concentración de glucosa no inhiba por presión osmótica a la levadura. El ajuste puede cambiar si se utilizan levaduras u otros microorganismos osmoresistentes. Existen cepas de levadura que pueden fermentar mostos ajustados hasta 20°Plato. i
En todos los tratamientos, se inicio con una concentración de glucosa que esta en función de los valores obtenidos durante el proceso de sacarificación (FIGURA 7 y 8) ajustado a la dilución necesaria para ajustar el nivel de azúcares fermentables.
g) Fermentar el mosto dulce estandarizado
La etapa de fermentar el mosto dulce concentrado se aplica por separado a los procesos identificados en la tabla 2, como: A, B, C, D, E, y F y comprende: • Ajustar el pH de los mostos dulces preferentmente a 4.5.
" Inocular los mostos dulces opcionalmente con Saccharomyces cereviseae ATCC 24858 en relación 1:100; es decir se agrego: 1 mL de inoculo por 100 mL de suspensión para iniciar la fermentación con una concentración de 15x106 células/900 mL de mosto dulce estandarizado. Para la etapa de fermentación en lote se utilizaron como bioreactores matraces Erlenmeyer con capacidad de IL.
Se trabajó con un volumen máximo y mínimo de 600 mL y 500 mL, respectivamente. Se sellaron todas las entradas dejando solo una válvula check y se colocaron los bioreactores en una incubadora (Lab-Line Modelo 3526) a 30°
C con 125 rpm de agitación durante 72 horas
Es importante considerar que el inoculo de Saccharomyces cereviseae ATCC 24858, fue previamente propagado a partir de un cultivo puro, y para ello se utilizó como medio de cultivo Caldo Maltosado de Levadura (Difco Sparks, MD). Del resguardó original se tomaron 5 mL los cuales se introdujeron en un reactor OminiPlus® con 2 litros de medio a una temperatura de 32° C y 500 rpm de agitación a pH=7.0 durante 48 horas, según condiciones recomendadas por la ATCC. Pasado este tiempo, se retiró la mezcla incubada y se centrifugó a 5000 rpm durante 5 minutos para colectar el precipitado que se almacenó a -80° C (REVCO Modelo Ultima II, Asheville, NC) en viales de crioconservación de 5 mL, adicionando 1 mL de glicerol por cada 4 mL de precipitado.
En las FIGURAS 9 y 10 se puede observar el perfil de consumo de glucosa a lo largo de la etapa de fermentación con Saccharomyces cereviseae ATCC 24858 para cada uno de los seis tratamientos diferentes.
Durante la etapa de fermentación se da un proceso de generación y consumo de glucosa, se inicia con una concentración de glucosa que esta en función de los valores obtenidos durante la etapa de sacarificación (FIGURAS 7 y 8) ajustado a la dilución necesaria para ajustar el nivel de azúcares fermentables. Esta concentración inicial aumenta hasta obtener un valor máximo, para una posterior disminución gradual hasta alcanzar el valor de "cero" (indicación de que la fermentación y producción de etanolo se llevo a cabo de manera completa). En la FIGURA 11 se gráfica el comportamiento de la concentración de α-ANL a diferentes tiempos de fermentación. El valor máximo de α-ANL se alcanzó a las 7 horas y después de 14 horas de fermentación no existieron diferencias significativas para los tres tipos de mostos.
Entre las concentraciones máximas de α-ANL alcanzados por cada tratamiento, se tiene que la concentración máxima de maíz es aproximadamente 220 mg/L, del sorgo decorticado aproximadamente 150 mg/L y del sorgo entero menor de 50mg/L en un tiempo aproximadamente de 7 horas. También se puede observar que en todos los casos, conforme fue pasando el tiempo los valores fueron disminuyendo de manera que para las 8 horas no existió diferencia significativa en la concentración de α-ANL del maíz y sorgo decorticado. Al comparar la concentración de α-ANL obtenida en cada uno de los tratamientos sometidos al proceso convencional con sus tratamientos homólogos con el proceso motivo de esta invención, se observa que los mostos obtenidos con el proceso motivo de esta invención alcanzaron valores de concentración de α-ANL tres veces mayor en comparación con los mostos obtenidos con los tratamientos sometidos al proceso convencional.
En el proceso convencional, los tratamientos con maíz y sorgo decorticado después de 21 horas de fermentación no existió diferencia significativa (p>0.05). Pero, los tratamientos con maíz y sorgo decorticado sometidos al proceso motivo de esta invención, alcanzaron casi el doble de la concentración de α-ANL en comparación con los mostos de los tratamientos sometidos al proceso convencional.
Después de 40 horas de fermentación, la concentración de α-ANL disminuyó en ambos proceso (convencional y el aquí propuesto) y la diferencia entre los seis tratamientos no fue significativa (p>0.05).
En las concentraciones de α-ANL para el tratamiento con sorgo, sometido al proceso convencional y el proceso motivo de esta invención, no existieron diferencias significativas. (FIGURA 11 y 12). El valor mas alto de α-ANL se presentó en el mostos obtenido del tratamiento con maíz sometido al proceso motivo de esta invención y el nulo efecto de este tratamiento sobre el perfil de azúcares reductores durante la licuefacción y el de glucosa durante la sacarificación y la fermentación, confirman el hecho del menor grado de interacción de la matriz proteica con el almidón de maíz. En el tratamiento con sorgo entero sometido al proceso motivo de esta invención, el implementar la etapa de hidrólisis con proteasa afectó la concentración de α-ANL probablemente debido a que la fibra contiene componentes inhibidores enzimáticos como son los fenólicos o simplemente por el impedimento al rápido ataque enzimático debido a la misma presencia del pericarpio fibroso. Las FIGURAS 13 y 14, presentan los perfiles de obtención de bioetanol durante la fermentación de los mostos de los diferentes tratamientos sometidos al proceso convencional y al proceso motivo de esta invención.
En la FIGURA 13 y 14, se puede observar que la máxima concentración final de bioetanol se obtuvo para el tratamiento con maíz sometido a ambos procesos (convencional y el aquí propuesto). La generación de bioetanol de maíz, a través del tiempo mostró un comportamiento muy similar cuando se compararon ambos procesos.
Por otro lado, el incluir únicamente la etapa de decorticación del sorgo propició que a las 4 horas se obtuviera tres veces más concentración de etanol comparado con la contraparte producida del sorgo entero (FIGURA 13). Para los tratamientos con sorgo entero y sorgo decorticado, el incluir la etapa de hidrólisis con proteasa incrementó la tasa de generación de bioetanol (FIGURA 14). Al analizar el efecto de solo integrar la etapa de hidrólisis con proteasa se observa que a las 12 horas de fermentación la concentración de bioetanol fue 1.5 veces mas en sorgo entero con proteasa en relación a sorgo entero sin proteasa y la concentración final de bioetanol fue 5% mayor para el sorgo decorticado tratado con proteasa que sin proteasa. Transcurridas 12 horas de la etapa de fermentación la concentración de bioetanol generado en los mostos del tratamiento con sorgo decorticado sometido al proceso motivo de esta invención, fue 1.8 mayor que el observado en el mosto del tratamiento con sorgo decorticado sometido al proceso convencional (que no incluye la etapa de hidrólisis con proteasa). La concentración final de bioetanol fue 2.6% mas para sorgo decorticado sometido al nuevo proceso que incluye hidrólisis con proteasa que para el sorgo decorticado sometido al proceso convencional que no incluye la etapa de hidrólisis con proteasa.
En lo que respecta a sorgo (FIGURA 14), sometido al proceso aquí propuesto que incluye las etapas de decorticación e hidrólisis con proteasa dio lugar a un cambio en el perfil de generación de bioetanol, permitiendo obtener concentraciones más cercanas a las observadas en el maíz pero en un menor tiempo.
El incluir únicamente la etapa de hidrólisis con proteasa en sorgo entero también aumentó la concentración de etanol pero esto se logró hasta las últimas etapas de la fermentación. En el caso de incluir la etapa de hidrólisis con proteasa en sorgo decorticado, presenta concentraciones importantes de bioetanol. Es importante notar que en los mostos del sorgo entero también se agotó la glucosa aunque mucho después que para los otros granos. En sorgo, el mayor rendimiento de bioetanol se obtuvo al incluir en el proceso las etapas de decorticación del grano e hidrólisis con proteasa antes y durante la primera parte de la etapa de licuefacción mientras que el menor rendimiento de etanol se presentó en el sorgo entero procesado por el proceso convencional (ver TABLA 4). Ni o en o en en
TABLA 4. Balance de materia de las etapas de sacarificación y fermentación y valores de
O O rendimiento de bioetanol en función de la harina y almidón que entraron al sistema. ve o
Figure imgf000032_0001
\
Almidón Almidón Salida Rendimiento Etanol
Harina1
Materia Prima harina residual Glucosa Etanol L/kg (L/kg Harina)
(g) (g) (g) (g) (mL) Almidón
Maíz base húmeda base seca (14%)
Sin Proteasa 100 76.74 1.51c>d 64.83a>b 44.17C 0.576c 0.442c 0.380° o Con Proteasa 100 76.74 1.31* 65.43a 45.67" 0.595" 0.457b 0.393b
Sorgo Entero
Sin Proteasa 100 73.24 2.82a 50.42d 32.40e 0.442e 0.324e 0.279e Con Proteasa 100 73.24 2.13' 61.05c 42.43d 0.579d 0.424d 0.365d
Sorgo Decorticado O
H
Sin Proteasa 100 75.80 1.54C 60.84c 45.12" 0.595b 0.451" 0.388b X Ki o o Con Proteasa 100 75.80 1.30d 63.98" 46.71a 0.616a 0.467a 0.402a O O O el peso de harina en la entrada al sistema se encuentra expresado en base seca
La integración de decorticación y uso de proteasa incremento en un 44% el rendimiento de etanol producido a partir de sorgo. Si se compara el rendimiento de etanol obtenido en el sorgo decorticado tratado con proteasa con el maíz tratado con proteasa no existió una diferencia significativa. Esto indica que es posible igualar los rendimientos de bioetanol a los comúnmente obtenidos en maíz si se utiliza el novedoso proceso aquí propuesto.
Las cantidades recuperadas de granos gastados o GGD para cada tratamiento se resumen en la TABLA 5.
TABLA 5. Rendimiento de granos gastados después de la fermentación de mostos de maíz, sorgo entero y decorticado en función del peso seco de los granos originales1.
Materia Prima Porcentaje
A Q Maíz Amarillo
Sin Proteasa 30.89b
Con Proteasa 29.41b Sorgo Entero
Sin Proteasa 35.20a
Con Proteasa 30.17b
-| 5 Sorgo Decorticado
Sin Proteasa 30.18b
Con Proteasa 27.20b
'Cada valor esta expresado en base húmeda y es el promedio de tres repeticiones. Letras diferentes en la misma columna representan valores estadísticamente diferentes.
20
Tal como se esperaba el sorgo entero procesado bajo el esquema convencional produjo el mayor porcentaje de GGD. Esto debido a que no se decorticó, a que su proteína fue más difícil de hidrolizar y además de que posiblemente la fibra y proteína atraparon a algunos granulos de almidón que no se gelatinizaron ni hidrolizaron con la α-amilasa
25 termoestable. El uso de proteasa disminuyó en un 5% la cantidad de granos gastados (TABLA 4). En lo que respecta a la composición química de estos GGD (TABLA 4) en todos los casos, los valores de humedad fueron altos, lo cual ocasiona que básicamente sea un subproducto muy perecedero. La composición química proximal de los GGD indican pocas diferencias cuando se compararon maíz y sorgo entero. Sin embargo, los
30 granos gastados del sorgo decorticado tuvieron un menor contenido de fibra y extracto etéreo ya que durante la decorticación se removió selectivamente el pericarpio y germen. Los altos contenidos de proteína observados en todos los granos gastados indican que estos subproductos pueden ser valiosos en alimentación animal, principalmente de rumiantes. Posiblemente los granos gastados obtenidos de sorgo decorticado tengan uso en alimentación de monogástricos debido a su menor contenido de fibra. La concentración de proteína fue mayor en los GGD del sorgo entero tanto con y sin proteasa y los menores valores se observaron en el maíz sin y con proteasa y sorgo decorticado con proteasa. La concentración de extracto etéreo fue mayor en el caso de los GGD del maíz sin proteasa y la menor fue para sorgo entero sin proteasa y decorticado sin y con proteasa. En relación al contenido de fibra cruda, los mayores valores se observaron en sorgo entero sin proteasa y los menores valores para sorgo decorticado sin y con proteasa.
En el caso de sorgo entero sin proteasa se conservó la mayor concentración de proteína (TABLA 6) y esto concuerda con lo observado en la producción de α-ANL durante el tratamiento con proteasa y licuefacción (FIGURA 5) mientras que en el sorgo entero sin proteasa presentó la menor concentración. También estos granos gastados presentaron la mayor concentración de almidón residual reafirmando la teoría de que la fibra y proteína atraparon a los granulos de almidón. Las menores concentraciones de almidón se presentaron en los granos gastados de maíz amarillo y en el sorgo decorticado tratado con proteasa. Al analizar el porcentaje de fibra cruda retenida en los granos gastados, se puede observar que en la mayoría de los casos se conserva entre el 80 y 98% con excepción del tratamiento de sorgo entero con proteasa que solo retiene el 66.9% de fibra cruda en relación al original. En esta caso, las pérdidas de fibra cruda se atribuyen al hecho del sistema de filtración, ya que se utilizó una malla de cuadrícula con 3mm por lado, lo cual permitió la pérdida de la fibra mas fina.
TABLA 6. Composición residual de los granos gastados en función a presencia de los compuestos en las harinas originales. Valores de recuperación expresados en base seca1.
Fibra
Cenizas Proteína Extracto ELN Almidón
Tratamiento Cruda
% % Etéreo % % %
%
Maíz Amarillo
Sin Proteasa 24.80 84.31 49.21 80.82 20.60 1.97
Con Proteasa 16.10 82.02 26.87 81.86 23.53 1.71
Sorgo Entero
Sin Proteasa 29.58 99.46 77.61 92.87 22.56 3.85
Con Proteasa 54.70 84.13 89.13 66.87 18.96 2.91
Sorgo Decorticado
Sin Proteasa 22.56 81.59 85.66 97.66 22.36 2.03
Con Proteasa 24.04 65.79 92.73 82.36 21.03 1.71
Cada valor es el promedio de tres repeticiones.
Los rendimientos de bioetanol obtenidos especialmente con el sorgo decorticado y tratado con proteasa da la pauta para presentar un proceso que permita obtener rendimientos iguales a los que se obtienen con maíz y superiores en un 40% en el caso del sorgo entero sin tratamiento con proteasa. El diagrama de flujo para este proceso se encuentra planteado en la FIGURA 1. De manera general, el proceso se divide en 9 etapas, y las etapas que se añaden al proceso convencional son: decorticación mecánica antes de la molienda seca e hidrólisis con proteasa previo y durante la primera parte de la licuefacción. Algunos aspectos a tener a consideración es cuidar durante la decorticación el sistema de separación de fibra para evitar pérdidas de almidón por grano quebrado, el tamaño de partícula obtenido durante la molienda, el control de temperatura y pH durante las etapas de licuefacción, sacarificación y fermentación, en esta última un cuidado especial para evitar la contaminación por microorganismos que puedan consumir los sustratos disminuyendo la concentración de etanol en el producto final. Una de las ventajas de este proceso es la obtención de una fibra de decorticación estable en almacenamiento y adecuada para alimentación de rumiantes, la entrada de más almidón por kilogramo de harina al proceso y la clara e importante reducción de tiempos de licuefacción, sacarificación y fermentación. Estos ahorros en tiempo seguramente se pueden traducir en ahorros en energía, mano de obra y un uso más efectivo de la biorefinería de etanol. Los granos gastados del sorgo decorticado posiblemente se puedan canalizar a la alimentación de monogástricos debido a su alto contenido de proteína y más bajo contenido de fibra.
h) Destilar mezcla fermentada
La etapa de destilar la mezcla fermentada obtenida en la etapa anterior, se aplica por separado a los procesos identificados en la tabla 2, como: A, B, C, D, E, y F y consiste en calentar preferentemente a 800C, la mezcla que contiene alcohol, agua y granos gastados de destilería. El bioetanol alcanza su punto de ebullición aproximadamente a
7O0C y entra a una columna de destilación, y se condensa como una mezcla bioetanol: agua, con relación de 95:5 respectivamente; y queda en remanente una mezcla de granos gastados de destileria:agua.
i) Deshidratar bioetanol
La etapa de deshidratar el bioetanol se aplica por separado a los procesos identificados en la tabla 2, como: A, B, C, D, E, y F y consiste en deshidratar el bioetanol obtenido en la destilación utilizando tamices moleculares empacados con zeolite o algún material semejante, para obtener bioetanol listo para su utilización como combustible.
j) Centrifugar granos gastados de destilería
La etapa de centrifugar los granos gastados de destilería residuales en la mezcla que ingreso en la etapa de destilación, y se aplica por separado a los procesos identificados en la tabla 2, como: A, B, C, D, E, y F y consiste en:
Centrifugar a 3000 rpm durante 20 minutos, los granos gastados de destilería para retirar el agua:etanol que pudo quedar atrapado y reintegrarlo al flujo que entra a destilación. Y el precipitado obtenido son los granos gastados de destilería.

Claims

REIVINDICACIONESHabiendo descrito suficiente nuestra invención, consideramos como una novedad y por lo tanto reclamamos como de nuestra exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas:
1. Un Proceso mejorado para la obtención de bioetanol a partir de grano de sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) caracterizado porque comprende las etapas de: a) Decorticar los granos de sorgo hasta remover entre un 7 - 10% del peso original del grano, b) Moler en seco los granos decorticados para obtener una harina con tamaño de particula tal, que permita endentar las etapas de hidrólisis enzimática y fermentación; la harina generalmente deben de tener cuando menos un perfil granulométrico con: 68% de las partículas con un tamaño de 420 μm; 11.5% de las partículas con un tamaño entre 250-420 μm; 7.7% de las partículas con un tamaño entre 149 a 250 μm y 11.1 % de las partículas con un tamaño de menor a 149 μm, c) Hidrólizar con al menos una proteasa una suspensión harina: agua, d) Licuificar con alfa amilasa preferentemente termoresistente a la suspensión obtenida en c), e) Sacarificar la suspensión de dextrinas obtenida en d) con amiloglucosidasa o un complejo amiloglucosidasa/pululanasa, f) Ajustar la concentración del mosto dulce concentrado entre 11 - 15° plato, g) Fermentar el mosto dulce con levadura obtenido en f), h) Destilar la mezcla fermentada, i) Deshidratar bioetanol, j) Centrifugar granos gastados de destilería.
2. El Proceso para obtener bioetanol a partir de grano de sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa a) la decorticación del grano de sorgo es mecánica.
3. El Proceso para obtener bioetanol a partir de grano de sorgo {Sorghum bicolor L. Moench) de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la etapa a) de decorticación del grano de sorgo se realiza preferentemente en un rango de 7 al 10% de peso para minimizar perdidas de endospermo que contiene el almidón.
4. El Proceso para obtener bioetanol a partir de grano de sorgo {Sorghum bicolor L. Moench) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa c) de hidrólisis enzimática, se realiza con al menos una proteasa.
5. El Proceso para obtener bioetanol a partir de grano de sorgo {Sorghum bicolor L. Moench) de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la etapa c) de hidrólisis enzimática con proteasas, se realiza antes de la licuefacción.
6. El Proceso para obtener bioetanol a partir de grano de sorgo {Sorghum bicolor L. Moench) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa c) de hidrólisis enzimática se realiza a un pH de 6.5 y a una temperatura de 6O0C o bien integrada al proceso de fermentación que se realiza a un pH de 4.5-6.5 y una temperatura de 32-36°C.
7. El Proceso para obtener bioetanol a partir de grano de sorgo {Sorghum bicolor L. Moench) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa g) de fermentación se realiza preferentemente con Saccharomyces cereviseae ATCC 24858 en relación 1:100.
8. Granos gastados de destilería obtenidos de conformidad con el proceso de la reivindicación 1 caracterizados porque el valor promedio de humedad es de 72.75%, de cenizas es de 1.08%, de proteína es de 26.36%, de extracto etéreo es de 2.25%, de fibra cruda es de 5.39%, de extracto libre de nitrógeno o ELN es de 64.78% y de almidón es de 4.75%.
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