WO2009056689A1 - Utilisation d'une albumine pa1a de legumineuse comme insecticide - Google Patents

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WO2009056689A1
WO2009056689A1 PCT/FR2007/001785 FR2007001785W WO2009056689A1 WO 2009056689 A1 WO2009056689 A1 WO 2009056689A1 FR 2007001785 W FR2007001785 W FR 2007001785W WO 2009056689 A1 WO2009056689 A1 WO 2009056689A1
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sequence
amino acid
paia
acid selected
aspartate
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Application number
PCT/FR2007/001785
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Inventor
Julie Petit
Marie-Gabrielle Duport
Frédéric GRESSENT
Yvan Rahbe
Emmanuel Guiderdoni
Jean-Christophe Breitler
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Institut National De La Recherche Agronomique
Centre De Cooperation Internationale En Recherche Agronomique Pour Le Developpement (Cirad)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to the construction of transgenic plants, especially cereals, expressing a leguminous PAIa albumin, and having increased resistance to insect pests, particularly grain pests.
  • insects attack cereal grains, from harvest to processed products (eg flours, semolina, etc.), to grains stored in silos. These insects cause considerable losses.
  • the loss can be as high as 50% according to some national reports, the average global percentage being of the order of 15%.
  • the losses represent about 75 million tonnes each year, without taking into account losses associated with rice grain products such as flour.
  • the main pests in addition to the grain moths belonging to the order Lepidoptera, are Coleoptera. These are mainly weevils (genus Sitophilus), grain borers (genus Rhyzopertha), grain beetles (genus Trogoderma and Tenebroide) and flour beetles (genus Tribolium) (Heinrichs E., Wiley Eastern Limited Publisher , 1994).
  • Another approach is to increase the resistance of plants to insects by expressing in these plants one or more entomotoxic proteins.
  • This approach initiated at the end of the 1980s with the creation of the first transgenic plants expressing Bacillus thuringiensis toxins, has since been exploited to increase resistance to attacking insects in the field of various plants of agronomic interest, monocotyledonous or broadleaf weeds.
  • transgenic rice expressing different toxins have already proved their resistance to the field against different pests, such as the "roded stem borer, SSB”, Chilo suppressalis, “yellow stem borer, YSB”, Scirpophaga incertulas), rice leaf folder (RLF), and leafhoppers ("brown plant hopper, BPH”, Nilaparvata lugens) (Giri et al. al., Biotechnol, Adv., 18, 653-683, 2000. Bajaj et al., Plant Biotechnology Journal, 3, 275-307, 2005).
  • PAIb proteins proteins known for their entomotoxic properties, and in particular their toxicity against grain weevils (Sitophilus oryzae, Sitophilus zeamais, Sitophilus granarius) are the PAIb proteins of legumes. PAIb albumins were initially detected in pea (Higgins et al., J. Biol. Chem. , 261, 11124-30, 1986), in soybeans (under the name of Leginsulin, Watanabe et al., Eur J.
  • PAIb proteins are highly conserved; they include in particular 11 invariant residues: 5 proline residues, and 6 cysteine residues forming 3 disulphide bridges.
  • the tertiary structure of PAIb (Jouvensal et al., Biochemistry 42, 11915-23, 2003) comprises a node formed by the three disulfide bridges, three anti-parallel ⁇ sheets, a loop L1 containing the conserved sequence CSPFE, and an L2 loop. whose hydrophobicity of the amino acids is preserved.
  • PCT application WO 99/58695 describes the demonstration of the entomotoxic activity of PAIb albumins, and their use as an insecticide, in particular to protect grain seeds.
  • PAIb comes from the processing of a polyprotein called PAl (for "pea albumin 1"), or albumin I, the expression of which appears to be limited to the Fabaceae (no homologue of the PA1 gene coding for this protein, has not been detected in other families of plants).
  • PA1 is composed, starting from the N-terminal end towards the C-terminal end, of a signal peptide, the subunit b (PAIb) and its propeptide, of the ⁇ subunit (PAIa) and its propeptide. After endopeptide cleavage of the signal peptide of PA1, the proprotein is addressed in the protein storage bodies of the seed. In these vacuole-derived structures, PAIa and PAIb propeptides are removed by endopeptidases, thus releasing two mature proteins: PAIb and PAIa.
  • the PAl / Albumin I protein family is referenced in the InterPro database (Mulder et al., Nucleic Acids Research, 35, Database issue D224-D228, 2007; http://www.ebi.ac.uk/interpro). under the number IPR012512, and in the Pfam database (FINN et al., Nucleic Acids Research, 34, Database issue D247-D251, 2006; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam), under the PfamO827 number.
  • PAl denotes any protein of this PAl / Albumin I family
  • FIG. 1 An alignment based on PA1 protein sequences available in the databases is shown in Figure 1.
  • the originating organism and the EMBL or GenBank accession number are indicated for each protein. Only sequences from pea (Pisum sativum), Medicago truncatula, and soy (Glycine max) (except CAE00463) are complete, PAIa sequences from other Fabaceae being only partially known.
  • the regions corresponding to the signal peptide and to the mature forms of the PAIa and PAIb subunits are framed in solid lines, those corresponding to the propeptides of PAIb and PAIa are framed in dotted lines.
  • the delimitation between protein and its propeptide is only known in peas; it is therefore not indicated for the isoforms of the PAIa protein present in other Fabaceae.
  • FIG. 1 The alignment of FIG. 1 shows that the PAIa sequence is very conserved in Fabaceae, in particular at its N-terminal portion. However, no biological function, other than that of reserve protein, has been attributed so far to PAIa. In contrast to PAIb, PAIa has been described as having no entomotoxic properties (S. LOUIS: Structural Diversity and Biological Activity of Entomotoxic Albumin Type Ib Albumins of Leguminous Seeds PhD Thesis, INSA Lyon, 2004).
  • the inventors have now found that, surprisingly, the seeds of transgenic rice plants expressing the PAIa protein, and not expressing the PAIb protein, had an increased resistance to the attacks of weevils, more particularly of adult weevils, with respect to the seeds. from unprocessed plants.
  • the subject of the present invention is therefore a method for improving the resistance of a plant to attack by insect pests, in particular insect pests of grain, characterized in that a protein coding sequence is expressed in said plant.
  • PAIa placed under transcriptional control of a suitable promoter in an expression cassette not comprising a sequence encoding a PAIb protein.
  • said expression cassette comprises a sequence coding for a PAIa protein whose sequence of the 28 N-terminal amino acids has at least 55%, preferably at least 60%, and in ascending order of preference, at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 95% identity, or at least 65%, of preferably at least 70%, and in ascending order of preference, at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 98% of similarity to the sequence of the 28 N-terminal amino acids of the SEQ sequence polypeptide ID NO: 1 below:
  • sequence SEQ ID NO: 1 used here as a reference sequence, is that of the mature form of the PAIa subunit of the Pisum sativum PAI isoform defined by the EMBL sequence CAE00465 (also SwissProt P62931).
  • sequence SEQ ID NO: 1 corresponds to amino acids 70-122 of the EMBL sequence CAE00465.
  • the percentages of identity and similarity referred to in the context of the disclosure of the present invention are determined on an overall alignment of the sequences to be compared, using the NEEDLEMAN and WUNSCH (J) algorithm. Mol Biol., 48, 443-453, 1970). This sequence comparison can be carried out for example using the EMBOSS suite (RICE et al., Trends in Genetics, 16, 276-277, 2000), using the following parameters: BLOSUM62 matrix, gap opening: 10 ; gap extension 0.5.
  • sequence of the 28 N-terminal amino acids of said PAIa protein is defined by the following general sequence (I) (SEQ ID NO: 11):
  • X1 represents an amino acid selected from aspartate, glutamate and lysine, and preferably from glutamate and aspartate
  • X 2 represents an amino acid selected from alanine, glutamine, aspartate, glutamate, lysine; preferably X 2 represents glutamate;
  • X 3 represents an amino acid selected from proline, leucine and alanine; preferably X3 is proline;
  • X 4 represents asparagine or histidine, preferably asparagine
  • Xs is leucine or isoleucine, preferably leucine
  • X ⁇ represents an amino acid selected from glutamine, glutamate and lysine, preferably from glutamine or glutamate;
  • X7 represents serine or threonine, preferably serine
  • Xs represents an amino acid selected from asparagine, aspartate and histidine; preferably Xs is aspartate;
  • Xg represents an amino acid selected from alanine, valine, leucine, aspartate and glutamate, preferably from alanine or aspartate;
  • X 10 represents aspartate or glutamate
  • Xn represents an amino acid selected from lysine, arginine, valine, leucine, isoleucine, methionine, and threonine, preferably from arginine or lysine;
  • X 12 represents an amino acid selected from lysine, asparagine and glutamate; preferably X 12 is lysine; X 13 represents an amino acid selected from glycine, glutamate and arginine; preferably X 13 represents glycine;
  • Xi4 represents an amino acid selected from lysine, asparagine, threonine, serine and aspartate, preferably from lysine, asparagine, or threonine;
  • X 15 represents glycine or alanine;
  • Xi 6 represents histidine or arginine
  • Xi 7 represents tyrosine or phenylalanine, preferably tyrosine;
  • Xi 8 represents an amino acid selected from proline, asparagine, aspartate, histidine and alanine, preferably proline or asparagine.
  • sequence of the 31 N-terminal amino acids of said PAIa protein has at least 55%, preferably at least 60%, and in increasing order of preference, at least 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, or 95% identity, or at least 65%, preferably at least 70%, and in increasing order of preference, at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95% , or 98% similarity with the sequence of the 31 N-terminal amino acids of the polypeptide of sequence SEQ ID NO: 1.
  • this sequence of 31 N-terminal amino acids is defined by the following general sequence (II) (SEQ ID NO: 12):
  • X 1 to X 1 are as defined above, H, C, K, S, G, F, P and N have their meanings. usual in 1-letter code, and:
  • X 19 represents an amino acid selected from glycine, asparate or tyrosine, preferably from glycine or aspartate;
  • X 20 represents an isoleucine or a methionine, preferably an isoleucine
  • X 21 represents aspartate or glutamate, preferably aspartate.
  • the sequence of the N-terminal 36 amino acids of said PAIa protein has at least 55%, preferably at least 60%, and in increasing order of preference, at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 95% identity, or at least 65%, preferably at least 70%, and in ascending order of preference, at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 98% of similarity with the sequence of the 36 N-terminal amino acids of the polypeptide of sequence SEQ ID NO: 1.
  • this sequence of 36 N-terminal amino acids is defined by the following general sequence (III) (SEQ ID NO: 13): Xi-X 2 -HX 3 -X 4 -X 5 -CX E -X 7 -X 8 -X 9 -Xi O -C-Xn-Xi 2 -K-X 13 -S-G-Xi 4- CF-X 15 -X I6 X I7 -PNX I8 -X I9 -X 20 -X 2I -X 22 -GWCF wherein X 1 to X 2 i are such that As defined above, H, C, G, K, S, G, F, P, W, and N have their usual meaning in 1-letter code, and X 22 represents a tyrosine or a histidine, preferably a tyrosine.
  • the sequence of the 42 N-terminal amino acids of said ACAP protein has at least 55%, preferably at least 60%, and by order of increasing preference, at least 65%, 70%, 75% , 80%, 85%, 90%, or 95% identity, or at least 65%, preferably at least 70%, and in increasing order of preference, at least 75%, 80%, 85%, 90% , 95%, or 98% similarity with the sequence of the 42 N-terminal amino acids of the polypeptide of sequence SEQ ID NO: 1.
  • this sequence of 42 N-terminal amino acids is defined by the following general sequence (IV) (SEQ ID NO: 14): Xi-X 2 -H-X 3 -X 4 -X 5 -CX E -X 7 -X S ⁇ X 9 -Xio ⁇ C-Xi 1 -Xi 2 -K-Xi 3 -SG- Xi 4 -FC-
  • X 23 represents an amino acid selected from the group consisting of alanine, glycine, serine and aspartate, preferably alanine;
  • X 24 represents an amino acid selected from the group consisting of lysine, asparagine and aspartate, preferably lysine;
  • X 25 represents serine or phenylalanine, preferably serine
  • X 26 represents glutamate or lysine, preferably glutamate.
  • sequence of said PAIa protein has at least 55%, preferably at least 60%, and in increasing order of preference, at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%. %, or 95% identity, or at least 65%, preferably at least 70%, and in increasing order of preference, at least 75%, 80%,
  • said PAIa protein is defined by the following general sequence (V) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 1)
  • X2 7 represents an amino acid selected from the group consisting of glutamate, glutamine, tyrosine and leucine; preferably X 27 is glutamate;
  • X 28 represents an amino acid selected from glutamate, aspartate, and lysine; preferably X 2 s represents aspartate;
  • X2 represents an amino acid selected from glycine, valine and phenylalanine, preferably from valine and phenylalanine;
  • X 30 represents an amino acid selected from serine, leucine and phenylalanine; preferably X 30 represents serine; X 3 i represents an amino acid selected from lysine, asparagine and alanine; preferably X 31 is lysine;
  • X 32 represents an amino acid selected from the group consisting of isoleucine, valine and methionine; preferably X 32 is isoleucine;
  • X 33 represents an amino acid selected from the group consisting of threonine, serine and proline; preferably X 33 is threonine;
  • X 34 representing an amino acid selected from the group consisting of glutamine, proline, serine and arginine; preferably X 34 is glutamine or proline;
  • X 35 representing an amino acid selected from the group consisting of lysine, asparagine and alanine; preferably X 35 represents lysine;
  • X 36 represents an amino acid selected from the group consisting of aspartate, arginine, proline and threonine; preferably X 36 represents aspartate.
  • said PAIa protein may be chosen from the PAIa subunits of Pisum sativum PAI isoforms whose sequences are available under the references EMBL CAE00465, CAE00466, CAE00467, CAE00468, CAB82859 and GenBank AAA33638 , AAA33639.
  • sequence of the PAIa subunit of the CAE00466 protein is represented in the attached sequence listing under the number SEQ ID NO: 2; the sequence of the PAIa subunit of the CAE00467 protein is represented in the attached sequence listing under the number SEQ ID NO: 3; the subunit sequence
  • PAIa of the CAE00468 protein is represented in the attached sequence listing under the number SEQ ID NO: 4; the PAIa subunit sequence of the protein
  • CAB82859 is represented in the sequence listing in annex number SEQ ID NO: 5; the sequence of the PAIa subunit of the AAA33638 protein is represented in the attached sequence listing under the number SEQ ID NO: 6; the sequence of the PAIa subunit of the AAA33639 protein is represented in the attached sequence listing under the number SEQ ID NO: 7.
  • said PAIa protein may be modified by the addition at its N-terminus of a polypeptide consisting of two to ten residues, preferably a sequence dipeptide (code 1 letter): MN.
  • PAI ⁇ proteins modified in this way are also part of the subject of the present invention.
  • the present invention also relates to expression cassettes that can be used for carrying out the process according to the invention.
  • the expression cassettes in accordance with the invention comprise a sequence coding for a PAIa protein, in native form or in modified form, as defined above.
  • This sequence can encode the mature PAIa protein, or its precursor, comprising the C-terminal propeptide of PAIa.
  • the presence of this propeptide is however not essential for the expression of PAIa, nor for its entomotoxic activity. They may also comprise other coding sequences, excluding any sequence coding for PAIb.
  • the coding sequences used in the expression cassettes according to the invention may optionally be modified, for example in the context of expression in monocotyledons, in order to optimize the expression by taking into account the codon preferences of the plant. selected host (Murray et al., Nucleic Acids Research, 17, 477 498 (1989).)
  • the expression cassettes according to the invention also contain a suitable promoter. controlling transcription of the coding sequence, and generally, a transcription terminator.
  • promoters in plant cells are known per se; the choice of the most appropriate promoter is carried out in a conventional manner by those skilled in the art, as a function, for example, of criteria such as the chosen host plants, and the spatial and / or temporal expression profile sought.
  • a constitutive promoter such as the CaMV 35S promoter or a derivative thereof, or the actin or ubiquitin promoter, etc.
  • an inducible producer or a tissue-specific promoter in order to express preferentially or exclusively the protein of interest at certain stages of the development of the plant, under certain environmental conditions, or in certain tissues or target organs.
  • inducible promoters that can be used for the implementation of the present invention, mention may be made of the promoter of the potato protease inhibitor II gene (Xu D et al., Plant Mol. Biol., 22, 573-88, 1993, Duan et al., Nat Biotechol., 14, 498-8, 1996) and the promoter of the mpi gene (Protease inhibitor protein) (Cordero et al., J. Plant. , 6, 141-50, 1994).
  • tissue-specific promoters that can be used for the implementation of the present invention, mention will be made, for example, of promoters expressing themselves preferentially in grains such as REG-2 and 01el8 promoters. Takaiwa, Plant Biotechnol J., 2, 113-25, 2004).
  • the transcription terminator can be any functional terminator in a plant cell: among the most commonly used, there will be mentioned for example, the 35S terminator of CaMV, or the NOS terminator of nopaline synthase.
  • the expression cassettes in accordance with the invention may furthermore comprise other elements, such as “enhancer” sequences, introns, or leader sequences (leader sequences), usually used in this type of expression. constructs to increase expression of the gene of interest.
  • the subject of the present invention is also any recombinant vector resulting from the insertion of an expression cassette according to the invention into a host vector.
  • Recombinant vectors in accordance with the invention may also comprise sequences allowing the monitoring of the transformation, and the identification and / or selection of the transformed cells or organisms.
  • reporter genes conferring on these cells or organisms a readily recognizable phenotype, or selection marker genes: only cells or organisms expressing a specific selection marker gene are viable under given conditions (selective conditions ).
  • reporter genes are, for example, beta-glucuronidase (GUS), luciferase, or green fluorescent protein (GFP).
  • Selection marker genes are generally antibiotic resistance genes, or also, in the case of plants or plant cells, a herbicide. There is a very large variety of selection marker genes among which the person skilled in the art can make his choice according to the criteria he himself has determined.
  • the present invention also encompasses host cells transformed with a recombinant vector according to the invention.
  • cell or organism transformed by an expression cassette is meant here any cell or organism whose genetic content has been modified by transfer of said expression cassette into said cell or said organism, whatever the method of transfer which has been used. has been used, and that the genetic information provided by said cassette is integrated into the chromosomal DNA or remains extrachromosomal.
  • the host cells may be prokaryotic or eukaryotic cells.
  • prokaryotic cells it may for example be E. coli, or Agrobacteria such as Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • eukaryotic cells it may be in particular plant cells, which may be derived from dicotyledonous or monocotyledonous plants.
  • the present invention also relates to a method for obtaining a transgenic plant expressing a PAIa protein, characterized in that it comprises the following steps:
  • the present invention also relates to transgenic plants comprising in their genome at least one copy of an expression cassette according to the invention.
  • a transgenic plant is defined here as a transformed plant in which the exogenous genetic information provided by a transforming polynucleotide is stably integrated into the chromosomal DNA, in the form of a transgene, and can thus be transmitted to the descendants of said plant.
  • This definition therefore also includes the descendants of the plants resulting from the initial transgenesis, since they contain in their genome a copy of the transgene.
  • the transgenic plants according to the invention express a PAIa protein in the whole plant, or at least in their seeds, and where appropriate in other tissues or organs. This expression of PAIa confers on the tissues and organs concerned a toxicity towards insect pests, and thus increases their resistance to the attacks of these insects.
  • transgenic plants according to the invention may also comprise, if appropriate, one or more other genes coding for one or more other (s). ) entomotoxins.
  • examples include Bacillus thuringiensis Cry3 toxins, including Cry3A, protease inhibitors, Vip toxins, avidin, lectins.
  • the present invention is applicable to all plants that do not naturally express PAIa. It is of particular interest to cereals, such as wheat, maize or rice.
  • the plant material (protoplasts, calli, cuttings, seeds, etc.) obtained from the transformed cells or transgenic plants according to the invention is also part of the subject of the present invention.
  • the invention also encompasses the products obtained from the plants according to the invention, in particular the seeds and their derivatives, for example flour or semolina.
  • EXAMPLE 1 OBTAINING TRANSGENIC RICE PLANTS EXPRESSING PA1A 1) Isolation of the coding sequence: for PAIa, with or without its propeptide.
  • PAIa-PP and PAIa The sequences coding for the PAIa protein, with or without its propeptide, hereinafter respectively called PAIa-PP and PAIa, were amplified from the sequence of the PAL gene whose accession number GenBank is AJ574794, respectively using the specific primer pairs SEQ ID NO: 8 (5 'GGATCCATGAATGATGAACACCCTAACT 3') and SEQ ID NO: 9 (5 'GGTACCTTAAGCAGTGGAAACACTCTTCA 3') and primers SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10 (5 'GGTACCTTAGTCTTTTGGGGTAATCTTAGAGAA 3'). The sequences thus amplified have a respective size of 204 bp and 180 bp.
  • the vector pC5300 Ubi-Tnos was cleaved by the enzymes BamHI and KpnI then the coding sequence for the protein PAIa was introduced at the corresponding sites, generating the vectors pC5300 Ubi-PAla-Tnos and pC5300 UbI-PAla-PP- Tnos.
  • FIG. 2 shows a schematic representation of the vector pC5300 Ubi-PAla- Tnos. Sequences essential for vector replication in E. coli are represented in dark gray, the sequences required for replication in Agrobacterium tumefaciens are shown in lighter gray (pVS1 rep and pVSl sta).
  • 1 to 2 ⁇ l of a plasmid DNA solution (vector pC5300 Ubi-PAla-PP-Tnos or vector pC5300 Ubipla-Tnos) (2 to 10 ng) are added gently into the 20 ⁇ l suspension of Agrobacterium.
  • the electrode chamber is then closed and placed in the electroporator (Invitrogen), previously set to 330 ⁇ F, 400 V, 4 k ⁇ .
  • An electric pulse is applied to depolarize phospholipids in the plasma membrane of Agrobacterium cells to diffusion the plasmid of interest.
  • the bacterial suspension is removed and incubated in 500 .mu.l of LB medium with stirring (250 rpm) at 28 ° C. for 2 hours.
  • the bacteria are then spread on agar medium supplemented with rifampicin (75 mg.L-1) whose resistance gene is carried by the EHA105 strain and the antibiotic whose resistance gene is carried by the transferred plasmid, here kanamycin (50 mg.L-1).
  • kanamycin 50 mg.L-1
  • Rice grains of the Japonica ZhongZuo321 variety are rinsed for 1 min in 100 ml of 70% ethanol. They are then disinfected by commercial 30% sodium hypochlorite treatment for 30 minutes. During this step, the grains are stirred every 5 min. They are then rinsed thoroughly with 2 to 3 liters of sterile distilled water. The grains are then deposited in petri dishes (Optilux 100x20 mm) containing the NB induction medium at a rate of 10 grains per dish. The culture dishes are incubated in the dark at 28 ° C for 20 days. At the end of this period, the proliferation of rice seed scutellum cells generated a callus that released small nodules.
  • the spherical and compact nodules of 0.5 to 1 mm are transferred to NB medium at the rate of 30 to 50 per petri dish (Optilux 100x15 mm) for 10 days in the dark at 28 ° C. These nodules proliferate to form calluses that fragment into nodules of variable size. The nodules obtained are then selected for the transformation. 5) Genetic transformation of rice
  • the sequence coding for PAIa or the sequence coding for PAIa and its propeptide, (PAIa-PP), under the control of the promoter of the ubiquitin-1 gene of maize, was introduced into rice by genetic transformation of embryogenic callus cells.
  • Japanica variety ZhongZuo321 hereinafter abbreviated ZZ321 via Agrobacterium tumefaciens.
  • the selection of embryogenic units for coculture is carried out before the preparation of the Agrobacterium solution. Only spherical nodules, white and opaque, with a rough surface, between 3 and 5 mm in size are used for co-culture in order to guarantee the explants an optimal physiological stage for processing. About thirty embryogenic units are used by construction to be transferred and are collected in a box of NB medium which allows to start liquid coculture synchronously. Preparation of Agrobact ⁇ rivaa Strains A preculture of Agrobacterium tumefaciens containing the construct to be transferred to rice is carried out.
  • the bacteria having grown on the AB medium plates are collected with a spatula and transferred into 30 ml of R2-CL medium contained in a 50 ml tube. The tube is vortexed until homogenization and then a 1 mL aliquot is used to measure the OD at 600 nm (a dilution may be performed for a more precise measurement). The OD must be between 0.1 and 1 (density 3-5 x 10 9 ). 25 ml of bacterial suspension are then transferred to a petri dish
  • the calli at the end of the coculture are transferred to the same density on the selection medium R2S (Optilux petri dish 100x20 mm). Calluses enveloped in viscous mucilage resulting from bacterial overdevelopment during coculture are eliminated. The boxes are incubated in the dark at 28 ° C. During these two weeks, some cocultivated calli will become necrotic, others will be "stuck" in a bacterial overdevelopment. At the end of the two weeks of selection, small white proliferations develop over the entire surface of the cocultivated calluses, which have browned. The cocultivated calli are then transferred to NBS medium (Optilux 100x20 mm box) at the rate of six calluses per dish, and the dishes are incubated in the dark at 28 ° C.
  • NBS medium Optilux 100x20 mm box
  • the dishes are opened and the proliferations, which are now in the form of globules, are spread all around the original cocultivated cal, so as to place them in contact with the selective medium.
  • the boxes are then incubated under the same conditions.
  • the spreading globular proliferations developed to form resistant calli of larger size than the other compact, yellow-white and rough-looking blooms. Calli remaining translucent and of smaller size, of beige color, of softer consistency and less defined contours are considered as non-transgenic.
  • Resistant calli are transferred to the PR-AG pre-regeneration medium containing 50 mg.L-1 of hygromycin in a petri dish
  • Transgenic calli increase in size and become compact, opaque, cream to slightly yellow, lobed and invaginated. The few calli that do not develop or are little are eliminated.
  • the calli are transferred to regeneration medium (RN) at a rate of 5 per petri dish (Optilux 100x20 mm), stored for two days in the dark and then transferred to light at an intensity of 110-130 mM / mPAR at 28 ° C. The calli then become more compact and white and are transferred under continuous light.
  • RN regeneration medium
  • RNA extraction is performed as follows:
  • RNAs are extracted by a conventional method, for example phenol / chloroform.
  • the total RNAs are retranscribed in cDNA according to standard techniques and then the chain polymerization reaction is carried out using the primers SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 with regard to the PAIa-PP construction and other share with primers SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10 with respect to PAIa.
  • the size of the amplification products expected is 204 bp for the PAIa-PP construction and 180 bp for the PAIa construction.
  • FIG. 3 shows the electrophoretic analysis of the products resulting from the amplification by RT-PCR of the total RNAs of the plants transformed with PAIa-PP (FIG. 3A) or PAIa (FIG. 3B).
  • Lanes 1, 2 and 3 are controls respectively corresponding to total RNAs extracted from leaves of the variety ZZ321 having undergone a PCR step, the same RNAs having undergone RT-PCR and the product of a RT-PCR in the absence total RNA.
  • Tracks 4 and 5 and Tracks 6 and 7 correspond to two independent samples of the analyzed construction.
  • the first track corresponds to the total RNA having undergone only PCR (wells 4 and 6)
  • the second track corresponds to the total RNAs having undergone RT-PCR (wells 5 and 7): the first track serves to detect a possible contamination of the total RNA extracts by Genomic DNA.
  • amplification carried out by RT-PCR on the total RNA samples from plants transformed with PAIa-PP reveals the presence of an amplification product of approximately 200 bp in the case of plant extracts transformed with PAIa-PP. (Fig.3A, lanes 5 and 7), this product not being present in the different control samples (lanes 1, 2, 3, 4 and 6). It therefore appears that the transgenic plants transformed by the PAIa-PP construct have well integrated into their genome the sequence coding for the polypeptide PAIa-PP and that the latter is correctly transcribed.
  • the transgenic plants transformed by the PAIa construct have well integrated into their genome a sequence encoding the correctly transcribed PAIa polypeptide.
  • the detection of the PAIa polypeptide was carried out on the T1 generation of the TO positive transgene rice grain line during the analysis by RT-PCR by the Western method in situ by adapting the protocol described by Qu et al. Plant CeIl Rep., 22, 282-5, 2003.
  • husked grains of rice and peas are placed in a 24-well plate and soaked in doubly distilled water for l ⁇ h at 40 ° C.
  • the impregnated grains are sectioned longitudinally so as to cut the embryo through the medium and then put in contact with acetone for 30 sec. All the following steps take place with stirring at room temperature.
  • the half-grains are then rinsed with bidistilled water and incubated in washing solution (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS) for 30 min.
  • the half grains are rinsed in TBST buffer (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.05% Tween 20) for 30 min.
  • TBS buffer 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl
  • the samples are incubated in a blocking solution (Western Blocker Solution, Sigma) for at least 3 hours.
  • the half-grains are placed for 16 h in the anti-PAIa polyclonal primary antibody solution (Le GaIl et al., J. Nutr., 135, 1215-22, 2005) diluted 500 to 2500 times in TBS buffer.
  • the samples are then rinsed in TBST buffer for 15 min and then three times for 5 min in TBS buffer.
  • the half-grains are incubated for 2 hours in the secondary antibody solution (Goat anti-rabbit IgG-AP conjugate, Bio-rad) diluted 2,000 to 5,000 times in TBS buffer. After rinsing in TBST buffer and 3 rinses in TBS buffer, identical to those described above, the half-grains are finally brought into contact with a mixture of reagents (Alkaline Phosphatase Conjugate Subtrate kit, Bio-rad).
  • the alkaline phosphatase carried by the secondary antibody will catalyze the production of a brown colored precipitate which allows, here, to locate the desired protein on the half grain of rice or peas.
  • Figure 4 shows half-grain photographs after Western in situ analysis:
  • Figure 4A represents a pea seed (positive control)
  • Figure 4B represents a wild ZZ321 grain of rice (negative control)
  • Figure 4C represents a rice grain processed by PlAa-PP construction. While no signal is observed for the rice grain wild (Fig.4B), the rice grain transformed by PAIa-PP construction is strongly colored (appearing in dark gray in Figure 4) at the level of the grain embryo (Fig.4C). Similar results were also obtained with rice processed by PAIa construction.
  • RT-PCR total RNA leaves of TO plants by western in situ T1 grains, as well as Southern blot determination of the T-DNA integration profile in the genomes of these same lineages, allowed to select genetic transformation events with 1 to 5 intact copies of T-DNA, the most interesting, to study their offspring.
  • the T1 transgenic grains of the selected lines were placed on an aqueous solution of hygromycin B (10 to 50 grains on Whatman paper No.
  • transgenic grains show signs of normal imbibition but have not germinated or germinated, but the seedlings do not exceed 5 mm and their root systems are not developed, ie the seeds have sprouted and the seedlings are are normally developed, that is to say similarly to seedlings resulting from the germination of non-transgenic grains with water.
  • the latter category of transgenic seedlings was selected for transfer into pots and placed in a containment greenhouse.
  • Tl transgenic plants have been the subject of a test of resistance to hygromycin B by application of 2 .mu.l of a solution 25mg.mL ⁇ 1 hygromycin B on a sheet. Plants whose leaves showed no symptoms (necrosis or burning) following the application of the hygromycin B solution were selected. The T2 grains derived from these T1 plants were then analyzed by western in situ in order to evaluate the expression of the PAIa protein.
  • T2 grains expressing PAIa protein were selected for testing with Sitophilus oryzae. 2) Insecticide activity test on adult weevils
  • Weevils (Sitophilus oryzae), adults aged one week after emergence, are used to carry out the tests. Mortality data, collected daily, are analyzed by survival measure in order to obtain TL50 values (Actuarial analysis, Statview, SAS). This time is defined as the time from which half of the test population is dead (control case mortality is usually nil). The protocol is performed as described by Louis et al. (2004), with some modifications which are detailed in the following paragraphs.
  • the negative control consists of non-transgenic kernels (ZZ321) while the positive control consists of artificial kernels made from non-transgenic grain flour (ZZ321) with 10% to 20% pea flour added (Louis et al., 2004 ).
  • the tests were carried out in parallel with transgenic plants expressing PAIb with its propeptide (PAIb-PP) or PAIb alone.
  • the bioassays are carried out on whole grains of the T2 and T3 generations with the susceptible Bouriz strain of Sitophilus oryzae
  • Figure 5 represents the mortality rate of the Sitophilus oryzae weevil observed at 10 days during bioassays carried out with whole grains (white histogram bars) of T2 generation, or at 21 days during bioassays carried out with kernels (bar of dark gray histograms).
  • the positive control (pea), ZZ abbreviated negative control ZZ321 abbreviated ZZ, as well as the tested lines are indicated at the bottom of the histogram.
  • the gray line appearing in the middle of the graph represents the maximum toxicity values obtained with non-transgenic grains. This figure indicates that the mortality of adult weevils observed on the non-transgenic control (ZZ321 grains) is 50% for whole grains and 40% for kernels.
  • the non-transgenic negative controls Ariete and ZZ321 (abbreviated ZZ), as well as the lines tested are indicated at the bottom of the histogram.
  • the gray line in the middle of the graph represents the minimum emergence value obtained with a non - transgenic grain.
  • Figure 6 indicates that the larvae contained in the non-transgenic kernels grew, and that 9 to 10 mature adults for the Ariete variety and 5-6 mature adults for the ZZ321 variety emerged from these kernels.
  • the difference in the number of Sitophilus oryzae adults emerging from non-transgenic kernels may be related to a varietal effect.

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Abstract

La présente invention concerne la construction des plantes transgéniques, notamment de céréales, exprimant une albumine PA1a de légumineuse. Cette expression leur confère une résistance accrue aux insectes ravageurs, en particulier aux ravageurs de grains.

Description

UTILISATION D'UNE ALBUMINE PAIa DE LEGUMINEUSE COMME
INSECTICIDE
La présente invention concerne la construction de plantes transgéniques, notamment de céréales, exprimant une albumine PAIa de légumineuse, et possédant une résistance accrue aux insectes ravageurs, en particulier aux ravageurs des grains.
Plusieurs catégories d' insectes attaquent les grains de céréales, depuis la récolte jusqu'aux produits transformés (par exemple farines, semoules, etc.), en passant par les grains stockés en silos. Ces insectes provoquent des pertes considérables. Par exemple, dans le cas du riz, la perte peut aller jusqu'à 50 % selon certains rapports nationaux, le pourcentage moyen mondial étant de l'ordre de 15 %. Les pertes représentent environ 75 millions de tonnes chaque année, sans tenir compte des pertes associées aux produits dérivés du grain de riz comme la farine.
Les principaux ravageurs, outre les teignes des grains qui appartiennent à l'ordre des Lépidoptères, sont des Coléoptères. Il s'agit essentiellement des charançons (genre Sitophilus) , des foreurs des grains (genre Rhyzopertha) , des Coléoptères du grain (genre Trogoderma et Tenebroide) et des Coléoptères de la farine (genre Tribolium) (Heinrichs E., Wiley Eastern Limited Publisher, 1994) .
Ces ravageurs détériorent les grains en se nourrissant de l'albumen, causant ainsi des pertes de poids et de qualité, et de l'embryon, provoquant une baisse du taux de germination des lots de grains. Deux catégories d' insectes se développant sur les stocks de grains peuvent être différenciées : les ravageurs primaires qui sont capables de forer et de s'alimenter à partir de grains intacts, et les ravageurs dits secondaires, qui se nourrissent de grains dont l'enveloppe a déjà été percée. Lutter contre les ravageurs primaires apparaît une stratégie efficace pour réduire les pertes de rendement lors du stockage car elle permet également de limiter les détériorations dues aux ravageurs secondaires. Le charançon du riz, Sitophilus oryzae L.
(Curculionidés) , est un des ravageur primaires les plus dévastateurs des grains de céréales lors de leur stockage. En conditions naturelles, la femelle charançon creuse un trou dans l'enveloppe du grain avec ses mandibules, y dépose un seul œuf et referme le trou à l'aide de mucilage. La larve éclot et se développe à l'intérieur du grain en se nourrissant de l'albumen. La mue larvo-nymphale se déroule à l'intérieur du grain. Le charançon adulte et mature se fraie un chemin en rongeant le grain afin d'en émerger, le détruisant ainsi totalement. Cet adulte va ensuite creuser les enveloppes d' autres grains pour se nourrir de leur albumen et de leur embryon, diminuant à son tour la production de riz.
A l'heure actuelle, la lutte contre ces insectes ravageurs fait principalement appel à l'utilisation d'insecticides. Ceux-ci sont toutefois fréquemment néfastes pour l'environnement et/ou toxiques pour l'homme et les animaux domestiques ; en outre l'apparition de résistance chez les insectes-cible est souvent observée. Par conséquent, trouver des alternatives pour contrôler efficacement ces ravageurs des grains devient urgent.
Pour remplacer ces insecticides ou limiter leur usage, différentes méthodes ont été proposées [pour revue, cf par exemple F. H ARTHUR, J. Stored Prod. Res . , 32, pp. 293-302, (1996)]. Les plus développées actuellement sont des méthodes physiques, telles que le refroidissement des silos, la conservation sous CO2 ou sous azote ; ces méthodes sont toutefois onéreuses, et leur mise en œuvre, qui nécessite une haute technicité, est délicate ; elles ne sont donc pas applicables partout .
Une autre approche consiste à augmenter la résistance des plantes aux insectes, en exprimant dans ces plantes une ou plusieurs protéines entomotoxiques . Cette approche, initiée à la fin des années 1980 avec la création des premières plantes transgéniques exprimant des toxines de Bacillus thuringiensis, a été depuis exploitée pour augmenter la résistance, face aux insectes attaquant au champ, de diverses plantes d'intérêt agronomique, monocotylédones ou dicotylédones. A titre d'exemples, des riz transgéniques exprimant différentes toxines ont d'ores et déjà fait la preuve de leur résistance au champ vis-à-vis de différents ravageurs, comme les foreurs de tiges (« striped stem borer, SSB », Chilo suppressalis ; « yellow stem borer, YSB », Scirpophaga incertulas) , la tordeuse des feuilles de riz (« rice leaf folder, RLF», Cnaphalocrocis medinalis) et les cicadelles (« brown plant hopper, BPH», Nilaparvata lugens) (Giri et al., Biotechnol. Adv., 18, 653-683, 2000 ; Bajaj et al., Plant Biotechnology Journal, 3, 275-307, 2005) . En revanche, bien que plusieurs classes de toxines de Bacillus thuringiensis (Cry3, Cry7, Cry8, Cryl4, Cryl8, Cry26 et Cry28) présentent une activité entomopathogène vis-à-vis des Coléoptères (Johnson et al., J. Biosci., 21, 673-85, 1996 ; De Maagd et al., Trends Genêt., 17, 193-9, 2001), aucune publication n'a à l'heure actuelle, rapporté la création de plantes transgéniques chez lesquelles l'expression de ces toxines conférait une résistance à ces insectes.
D' autre protéines connues pour leurs propriétés entomotoxiques, et notamment leur toxicité vis-à vis des charançons des grains (Sitophilus oryzae, Sitophilus zeamais, Sitophilus granarius) sont les albumines PAIb de légumineuses. Des albumines PAIb ont été mises en évidence initialement chez le pois (Higgins et al., J. Biol. Chem. , 261, 11124-30, 1986), chez le soja (sous la dénomination de leginsuline ; Watanabe et al., Eur. J. Biochem. , 224, 167-72, 1994), et ultérieurement, chez d'autres Fabacées appartenant notamment aux genres Vicia, Phaseolus, et Glycine (Louis et al., Plant. Sci . , 167, 705-14, 2004; LOUIS et al., Phytochemistry, 68, 521-35, 2007) . Il a été observé, notamment chez le pois, que plusieurs isoformes de PAIb peuvent coexister dans une même plante (Demande PCT WO 99/58695 ; Taylor et al., J. Agric. Food. Chem., 52, 7499-506, 2004 ; Taylor et al., J. Agric. Food. Chem., 52, 7491-8, 2004) .
Les séquences des protéines PAIb sont fortement conservées ; elles comprennent notamment 11 résidus invariants : 5 résidus proline, et 6 résidus cystéine formant 3 ponts disulfure. La structure tertiaire de PAIb (Jouvensal et al., Biochemistry 42, 11915-23, 2003) comprend un nœud formé par les trois ponts disulfures, trois feuillets β anti-parallèles, une boucle Ll contenant la séquence conservée CSPFE, et une boucle L2 dont l' hydrophobicité des acides aminés est conservée. Ces caractéristiques structurales ont permis de classer cette entomotoxine dans la famille des knottines . La- Demande PCT WO 99/58695 décrit la mise en évidence de l'activité entomotoxique des albumines PAIb, et leur utilisation comme insecticide, en particulier pour protéger des graines de céréales. Des plants de riz transgéniques exprimant une protéine PAIb de pois, conférant aux graines issues de ces plantes une meilleure résistance vis-à-vis de l'attaque des charançons, ont été produits par les Inventeurs,
PAIb provient de la maturation d' une polyprotéine dénommée PAl (pour « pea albumin 1 ») , ou Albumine I, dont l'expression apparaît limitée aux Fabacées (aucun homologue du gène PAl codant pour cette protéine, n'a été détecté chez d'autres familles de plantes) . PAl est composée, en partant de l'extrémité N- terminale vers l'extrémité C-terminale, d'un peptide signal, de la sous-unité b (PAIb) et de son propeptide, de la sous-unité a (PAIa) et de son propeptide. Après clivage endopeptidique du peptide signal de PAl, la proprotéine est adressée dans les corps protéiques de stockage de la graine. Dans ces structures dérivées de vacuoles, les propeptides PAIa et PAIb sont éliminés par des endopeptidases, libérant ainsi deux protéines matures : PAIb et PAIa.
La famille de protéines PAl/Albumine I est référencée dans la base de données InterPro (Mulder et al., Nucleic Acids Research, 35, Database issue D224- D228, 2007 ; http://www.ebi.ac.uk/interpro) sous le numéro IPR012512, et dans la base de données Pfam (FINN et al., Nucleic Acids Research, 34, Database issue D247- D251, 2006 ; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam), sous le numéro PfamO827. Dans le cadre de l'exposé de la présente invention, le terme « PAl » désigne toute protéine de cette famille PAl/Albumine I ; les termes « PAIa » et « PAIb » désignent respectivement les formes matures des sous-unités a et b d'une protéine PAl.
Un alignement établi à partir de séquences de protéines PAl disponibles dans les bases de données est représenté sur la Figure 1. L'organisme d'origine et le numéro d' accession EMBL ou GenBank sont indiqués pour chaque protéine. Seules les séquences issues du pois {Pisum sativum) , de Medicago truncatula, et du soja (Glycine max) (excepté CAE00463) sont complètes, les séquences PAIa issues des autres Fabacées n'étant que partiellement connues. Les régions correspondant au peptide signal et aux formes matures des sous-unités PAIa et PAIb sont encadrées en trait plein, celles correspondant aux propeptides de PAIb et PAIa sont encadrées en pointillés. La délimitation entre la protéine et son propeptide n'est connue que chez le pois; elle n'est donc pas indiquée pour les isoformes de la protéine PAIa présentes chez les autres Fabacées .
L'alignement de la Figure 1 montre que la séquence de PAIa est très conservée chez les Fabacées, en particulier au niveau de sa portion N-terminale. Cependant, aucune fonction biologique, autre que celle de protéine de réserves, n'a été attribuée jusqu'à présent à PAIa. Contrairement à PAIb, PAIa a été décrite comme ne possédant pas de propriétés entomotoxiques (S. LOUIS : Diversité structurale et d'activité biologique des Albumines entomotoxiques de type Ib des graines de Légumineuses. Thèse de doctorat, INSA de Lyon, 2004) .
Les Inventeurs ont maintenant constaté que, de manière surprenante, les graines de plants de riz transgéniques exprimant la protéine PAIa, et n'exprimant pas la protéine PAIb possédaient une résistance accrue aux attaques de charançons, plus particulièrement de charançons adultes, par rapport aux graines issues de plants non transformés.
La présente invention a en conséquence pour objet un procédé pour améliorer la résistance d'une plante aux attaques d'insectes ravageurs, en particulier des insectes ravageurs des grains, caractérisé en ce que l'on exprime dans ladite plante une séquence codant pour une protéine PAIa, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié dans une cassette d'expression ne comprenant pas de séquence codant pour une protéine PAIb. Selon un mode de mise en œuvre préféré de la présente invention, ladite cassette d' expression comprend une séquence codant pour une protéine PAIa dont la séquence des 28 acides aminés N-terminaux possède au moins 55%, de préférence au moins 60%, et par ordre croissant de préférence, au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% d'identité, ou au moins 65%, de préférence au moins 70%, et par ordre croissant de préférence, au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 98% de similarité avec la séquence des 28 acides aminés N- terminaux du polypeptide de séquence SEQ ID NO : 1 ci après :
DEHPNLCESDADCRKKGSGKFCGHYPNPGIEYGWCFASKSEAEDFFSKITQKD
La séquence SEQ ID NO: 1, utilisée ici comme séquence de référence, est celle de la forme mature de la sous-unité PAIa de l' isoforme de PAl de Pisum sativum définie par la séquence EMBL CAE00465 (également SwissProt P62931) . La séquence SEQ ID NO: 1 correspond aux acides aminés 70-122 de la séquence EMBL CAE00465.
Sauf indication contraire, les pourcentages d' identité et de similarité auxquels il est fait référence dans le cadre de l'exposé de la présente invention sont déterminés sur un alignement global des séquences à comparer, en utilisant l'algorithme de NEEDLEMAN et WUNSCH (J. Mol. Biol . 48, 443-453, 1970) . Cette comparaison de séquences peut être effectuée par exemple à l'aide de la suite EMBOSS (RICE et al., Trends in Genetics, 16, 276-277, 2000), en utilisant les paramètres suivants : matrice BLOSUM62, ouverture de brèche : 10 ; extension de brèche 0,5.
De manière avantageuse, la séquence des 28 acides aminés N-terminaux de ladite protéine PAIa est définie par la séquence générale (I) suivante (SEQ ID NO : 11) :
Xi-X2 ~H-X3—X4—X5—C-Xg-X7—X8~X9 ~Xio~"C—Xiχ—X12—K—X13—S—G—Xi4 — F—C— Xi5-Xi6Xi7-P-N-Xi8 dans laquelle H, C, K, S, G, F, P et N ont leur signification usuelle en code 1-lettre ;
Xi représente un acide aminé choisi parmi l'aspartate, le glutamate et la lysine, et de préférence parmi le glutamate et l'aspartate ; X2 représente un acide aminé choisi parmi l'alanine, la glutamine, l'aspartate, le glutamate, la lysine ; de préférence X2 représente le glutamate ;
X3 représente un acide aminé choisi parmi la proline, la leucine et l'alanine ; de préférence X3 représente la proline ;
X4 représente l'asparagine ou l'histidine, de préférence l'asparagine ;
Xs représente la leucine ou l' isoleucine, de préférence la leucine ;
Xβ représente un acide aminé choisi parmi la glutamine, le glutamate et la lysine, de préférence parmi la glutamine ou le glutamate ;
X7 représente la serine ou la thréonine, de préférence la serine ;
Xs représente un acide aminé choisi parmi l'asparagine, l'aspartate et l'histidine ; de préférence Xs représente l'aspartate ;
Xg représente un acide aminé choisi parmi l'alanine, la valine, la leucine, l'aspartate et le glutamate, de préférence parmi l'alanine ou l'aspartate ;
X1O représente l'aspartate ou le glutamate ;
Xn représente un acide aminé choisi parmi la lysine, l'arginine, la valine, la leucine, l' isoleucine, la méthionine, et la thréonine, de préférence parmi l'arginine ou la lysine ;
X12 représente un acide aminé choisi parmi la lysine, l'asparagine et le glutamate ; de préférence X12 représente la lysine ; X13 représente un acide aminé choisi parmi la glycine, le glutamate et l'arginine ; de préférence X13 représente la glycine ;
Xi4 représente un acide aminé choisi parmi la lysine, l'asparagine, la thréonine, la serine et l'aspartate, de préférence parmi la lysine, l'asparagine, ou la thréonine ; X15 représente la glycine ou l'alanine ;
Xi6 représente l'histidine ou l'arginine ;
Xi7 représente la tyrosine ou la phénylalanine, de préférence la tyrosine ; Xi8 représente un acide aminé choisi parmi la proline, l' asparagine, l'aspartate, l'histidine et l'alanine, de préférence parmi la proline ou 1' asparagine .
De manière avantageuse, la séquence des 31 acides aminés N-terminaux de ladite protéine PAIa possède au moins 55%, de préférence au moins 60%, et par ordre croissant de préférence, au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% d'identité, ou au moins 65%, de préférence au moins 70%, et par ordre croissant de préférence, au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 98% de similarité avec la séquence des 31 acides aminés N- terminaux du polypeptide de séquence SEQ ID NO : 1. De préférence, cette séquence de 31 acides aminés N- terminaux est définie par la séquence générale (II) suivante (SEQ ID NO : 12) :
Xi-X2—H—X3—X4—X5—C—Xg-X7-Xβ—Xg-Xio—C—Xn-Xi2-K—X13—S—G—X14—F—C-
Xl 5 -Xl 6Xl 7- P~N -Xig -Xi 9-X20-X21 dans laquelle Xi à Xiβ sont tels que définis ci-dessus, H, C, K, S, G, F, P et N ont leur signification usuelle en code 1-lettre, et :
X19 représente un acide aminé choisi parmi la glycine, l'asparate ou la tyrosine, de préférence parmi la glycine ou l'aspartate ;
X20 représente une isoleucine ou une méthionine, de préférence une isoleucine ;
X21 représente l'aspartate ou le glutamate, de préférence l'aspartate.
De manière particulièrement préférée, la séquence des 36 acides aminés N-terminaux de ladite protéine PAIa possède au moins 55%, de préférence au moins 60%, et par ordre croissant de préférence, au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% d'identité, ou au moins 65%, de préférence au moins 70%, et par ordre croissant de préférence, au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 98% de similarité avec la séquence des 36 acides aminés N-terminaux du polypeptide de séquence SEQ ID NO : 1. De préférence cette séquence de 36 acides aminés N-terminaux est définie par la séquence générale (III) suivante (SEQ ID NO : 13) : Xi-X2-H-X3-X4-X5-C-XE-X7-X8-X9-XiO-C-Xn-Xi2-K—X13—S—G-Xi4-F-C- X15-XI6XI7-P-N-XI8-XI9-X20-X2I-X22-G-W-C-F dans laquelle X1 à X2i sont tels que définis ci-dessus, H, C, G, K, S, G, F, P, W, et N ont leur signification usuelle en code 1-lettre, et X22 représente une tyrosine ou une histidine, de préférence une tyrosine.
De manière encore plus préférée, la séquence des 42 acides aminés N-terminaux' de ladite protéine PAIa possède au moins 55%, de préférence au moins 60%, et par ordre croissant de préférence, au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% d'identité, ou au moins 65%, de préférence au moins 70%, et par ordre croissant de préférence, au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 98% de similarité avec la séquence des 42 acides aminés N- terminaux du polypeptide de séquence SEQ ID NO : 1. De préférence cette séquence de 42 acides aminés N-terminaux est définie par la séquence générale (IV) suivante (SEQ ID NO : 14) : Xi-X2-H-X3-X4-X5-C-XE-X7-XS~X9-Xio~C-Xi1-Xi2-K-Xi3-S-G-Xi4-F-C-
X15-XI6XI7-P-N-XI8-XI9-X20-X2I-X22-G-W-C-F-X23-S-X24-X25-X26-A dans laquelle Xi à X22 sont tels que définis ci-dessus, A, H, C, G, K, S, G, F, P, W, et N ont leur signification usuelle en code 1-lettre, et :
X23 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par l'alanine, la glycine, la serine et l'aspartate, de préférence l'alanine ; X24 représente un acide aminé choisi dans la groupe constitué par la lysine, l'asparagine et l'aspartate, de préférence la lysine ;
X25 représente la serine ou la phénylalanine, de préférence la serine ;
X26 représente le glutamate ou la lysine, de préférence le glutamate.
De manière tout particulièrement préférée, la séquence de ladite protéine PAIa possède au moins 55%, de préférence au moins 60%, et par ordre croissant de préférence, au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% d'identité, ou au moins 65%, de préférence au moins 70%, et par ordre croissant de préférence, au moins 75%, 80%,
85%, 90%, 95%, ou 98% de similarité avec la séquence SEQ ID NO : 1. De préférence, ladite protéine PAIa est définie par la séquence générale (V) suivante (SEQ ID
NO : 15) :
Xi -X2-H-X3-X4 -X5- C -Xc-X7-Xe-Xg-XiO "C -Xn — X12-K-X13 - S-G- X14 — F— C— X15— X16X17 — P— N— Xig— X19— X2o~X2i~X22~G— W— C — F— X23 — S— X24 — X25~X26~A-X27~X28~X29~ F-X30-X31~X32~X33~X34 ~X35~X36 dans laquelle dans laquelle Xi à X26 sont tels que définis ci-dessus, A, H, C, G, K, S, G, F, P, W, et N ont leur signification usuelle en code 1-lettre, et :
X27 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par le glutamate, la glutamine, la tyrosine et la leucine ; de préférence X27 représente le glutamate ;
X28 représente un acide aminé choisi parmi le glutamate, l'aspartate, et la lysine ; de préférence X2s représente l'aspartate ;
X29 représente un acide aminé parmi la glycine, la valine et la phénylalanine, de préférence parmi la valine et la phénylalanine ;
X30 représente un acide aminé choisi parmi la serine, la leucine et la phénylalanine ; de préférence X30 représente la serine ; X3i représente un acide aminé choisi parmi la lysine, l'asparagine et l'alanine ; de préférence X31 représente la lysine ;
X32 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par l' isoleucine, la valine et la méthionine ; de préférence X32 représente l' isoleucine ;
X33 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par la thréonine, la serine et la proline ; de préférence X33 représente la thréonine ; X34 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué par la glutamine, la proline, la serine et l'arginine ; de préférence X34 représente la glutamine ou la proline ;
X35 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué par la lysine, l'asparagine et l'alanine ; de préférence X35 représente la lysine ;
X36 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par l'aspartate, l'arginine, la proline et la thréonine ; de préférence X36 représente l'aspartate.
A titre d'exemples non-limitatifs, ladite protéine PAIa peut être choisie parmi les sous-unités PAIa des isoformes de PAl de Pisum sativum dont les séquences sont disponibles sous les références EMBL CAE00465, CAE00466, CAE00467, CAE00468, CAB82859, et GenBank AAA33638, AAA33639.
La séquence de la sous-unité PAIa de la protéine CAE00466 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2; la séquence de la sous-unité PAIa de la protéine CAE00467 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 3 ; la séquence de la sous-unité
PAIa de la protéine CAE00468 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 4 ; la séquence de la sous-unité PAIa de la protéine
CAB82859 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 5 ; la séquence de la sous-unité PAIa de la protéine AAA33638 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 6 ; la séquence de la sous-unité PAIa de la protéine AAA33639 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 7.
Le cas échéant, ladite protéine PAIa peut être modifiée par l'addition à son extrémité N-terminale d'un polypeptide constitué de deux à dix résidus, de préférence un dipeptide de séquence (code 1 lettre) : MN.
Les protéines PAIa modifiées de la sorte, font également partie, en tant que telles, de l'objet de la présente invention.
La présente invention a également pour objet des cassettes d'expression utilisables pour la mise en œuvre du procédé conforme à l'invention.
Les cassettes d'expression conformes à l'invention comprennent une séquence codant pour une protéine PAIa, sous forme native ou sous forme modifiée, telles que définies ci-dessus. Cette séquence peut coder pour la protéine PAIa mature, ou pour son précurseur, comprenant le propeptide C-terminal de PAIa. La présence de ce propeptide n'est toutefois pas indispensable pour l'expression de PAIa, ni pour son activité entomotoxique . Elles peuvent également comprendre d'autres séquences codantes, à l'exclusion de toute séquence codant pour PAIb.
Les séquences codantes utilisées dans les cassettes d'expression conformes à l'invention peuvent optionnellement être modifiées, par exemple dans le cadre de l'expression chez des monocotylédones, afin d'optimiser l'expression en tenant compte des préférences de codons de la plante-hôte choisie (Murray et al. Nucleic Acids Research, 17, 477 498 (1989) . Les cassettes d'expression conformes à l'invention contiennent également un promoteur approprié contrôlant la transcription de la séquence codante, et généralement, un terminateur de transcription.
De très nombreux promoteurs fonctionnels dans des cellules végétales sont connus en eux-mêmes ; le choix du promoteur le plus approprié est effectué de manière classique par l'homme du métier, en fonction par exemple de critères tels que les plantes-hôtes choisies, et le profil spatial et/ou temporel d'expression recherché . Par exemple, on peut choisir un promoteur constitutif, tel que le promoteur 35S du CaMV ou l'un de ses dérivés, ou le promoteur de l'actine ou de celui l ' ubiquitine, etc. On peut également choisir un producteur inductible ou bien un promoteur tissu- spécifique, afin d'exprimer préférentiellement ou exclusivement la protéine d' intérêt à certains stades du développement de la plante, dans certaines conditions environnementales, ou dans certains tissus ou organes cibles . A titre d'exemples non-limitatifs de promoteurs inductibles utilisables pour la mise en œuvre de la présente invention, on citera le promoteur du gène pin2 de pomme de terre (Potato protease inhibitor II) (Xu D et al., Plant. Mol. Biol., 22, 573-88, 1993 ; Duan et al., Nat. Biotechol., 14, 498-8, 1996) et le promoteur du gène mpi (Protease inhibitor protein) (Cordero et al., Plant. J., 6, 141-50, 1994) .
A titre d'exemples non-limitatifs de promoteurs tissu-spécifiques utilisables pour la mise en œuvre de la présente invention, on citera par exemple des promoteurs s' exprimant préférentiellement dans les grains tels que les promoteurs REG-2 et 01el8 (Qu le Q, Takaiwa F, Plant Biotechnol. J., 2, 113-25, 2004) .
Le terminateur de transcription peut être n'importe quel terminateur fonctionnel dans une cellule végétale : parmi les plus communément utilisés, on citera par exemple le terminateur 35S de CaMV, ou le terminateur NOS de la nopaline synthase.
Le cas échéant, les cassettes d'expression conformes à l'invention peuvent comprendre en outre d'autres éléments, tels que des séquences « enhancer », des introns, ou des séquences de tête (leader séquences), usuellement employés dans ce type de constructions pour augmenter l'expression du gène d'intérêt.
La présente invention a également pour objet tout vecteur recombinant, résultant de l'insertion d'une cassette d'expression conforme à l'invention dans un vecteur hôte.
Parmi la très grande variété de vecteurs-hôtes disponibles, le choix du vecteur le plus approprié sera effectué, de manière classique, par l'homme du métier en fonction notamment de critères tels que la cellule ou l'organisme hôte choisi, le protocole de transformation envisagé, etc.
Des vecteurs recombinants conformes à l'invention peuvent également comprendre des séquences permettant le suivi de la transformation, et l'identification et/ou la sélection des cellules ou organismes transformés. Il s'agit notamment de gènes rapporteurs, conférant à ces cellules ou organismes un phénotype aisément reconnaissable, ou bien de gènes marqueurs de sélection : seuls les cellules ou organismes exprimant un gène marqueur de sélection déterminé, sont viables dans des conditions données (conditions sélectives) . Des gènes rapporteurs fréquemment employés sont par exemple celui de la bêta-glucuronidase (GUS) , celui de la luciférase, ou celui de la "green fluorescent protein" (GFP) . Des gènes marqueurs de sélection sont généralement des gènes de résistance à un antibiotique, ou également, dans le cas des plantes ou des cellules végétales, à un herbicide. Il existe une très grande variété de gènes marqueurs de sélection parmi lesquels l'homme du métier peut effectuer son choix en fonction des critères qu'il aura lui-même déterminés.
La présente invention englobe également des cellules-hôtes transformées par un vecteur recombinant conforme à l'invention.
On entend ici par cellule ou organisme transformé par une cassette d'expression, toute cellule ou organisme dont le contenu génétique a été modifié par transfert de ladite cassette d' expression dans ladite cellule ou ledit organisme, quelle que soit la méthode de transfert qui a été utilisée, et que l'information génétique apportée par ladite cassette soit intégrée dans l'ADN chromosomique ou demeure extra-chromosomique.
Les cellules hôtes peuvent être des cellules procaryotes, ou eucaryotes. Dans le cas de cellules procaryotes, il peut par exemple s'agir d'E. coli, ou d'Agrobactéries telles qu' Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes . Dans le cas de cellules eucaryotes, il peut s'agir notamment de cellules végétales, qui peuvent être issues de plantes dicotylédones ou monocotylédones .
La présente invention a également pour objet un procédé pour obtenir une plante transgénique exprimant une protéine PAIa, caractérisé en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :
- la transformation de cellules végétales par une cassette d'expression conforme à l'invention ; la régénération de plantes à partir des cellules transformées ; - la sélection des plantes ayant intégré dans leur génome ladite cassette d'expression.
Pour la mise en œuvre de la présente invention, des techniques très nombreuses de transformation de cellules végétales germinales ou somatiques, (isolées, sous forme de cultures de tissus ou d'organe, ou sur la plante entière), et de régénération des plantes sont disponibles. Le choix de la méthode la plus appropriée dépend généralement de la plante concernée .
A titre d'exemples non-limitatifs, on citera la transformation de protoplastes en présence de polyéthylèneglycol, l' électroporation, l'utilisation d'un canon à particules, la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire, ou la transformation par l'intermédiaire d' Agrobacterium. Dans le cas des plantes monocotylédones on utilisera préférentiellement la transformation par Agrobacterium tumefaciens.
La présente invention a également pour objet les plantes transgéniques comprenant dans leur génome au moins une copie d'une cassette d'expression conforme à l'invention.
On définit ici comme plante transgénique une plante transformée chez laquelle l'information génétique exogène apportée par un polynucléotide transformant est intégrée de manière stable dans l'ADN chromosomique, sous forme de transgène, et peut ainsi être transmise aux descendants de ladite plante. Cette définition englobe donc également les descendants des plantes résultant de la transgénèse initiale, dès lors qu' ils contiennent dans leur génome une copie du transgène. Les plantes transgéniques conformes à l'invention expriment une protéine PAIa dans la plante entière, ou au moins dans leurs graines, et le cas échéant dans d'autres tissus ou organes. Cette expression de PAIa confère aux tissus et organes concernés une toxicité vis-à-vis d'insectes ravageurs, et augmente donc leur résistance aux attaques de ces insectes. Les insectes concernés sont notamment les adultes d' insectes ravageurs des grains, notamment des coléoptères, et plus particulièrement des charançons, en particulier du genre Sitophilus, et plus particulièrement Sitophilus oryzae. Pour augmenter leur niveau ou accroître leur spectre de résistance vis-à-vis des insectes, des plantes transgéniques conformes à l'invention peuvent également comprendre, le cas échéant, un ou plusieurs autre (s) gènes codant pour une ou plusieurs autre (s) entomotoxines . A titre d'exemples on citera les toxines Cry3 de Bacillus thuringiensis, notamment Cry3A, des inhibiteurs de protéases, des toxines Vip, l'avidine, des lectines . La présente invention s'applique à toutes les plantes qui n'expriment pas naturellement PAIa. Elle présente un intérêt tout particulier chez les céréales, telles que le blé, le maïs ou le riz.
Le matériel végétal (protoplastes, cals, boutures, semences, etc..) obtenu à partir des cellules transformées ou des plantes transgéniques conformes à l'invention fait également partie de l'objet de la présente invention. L'invention englobe également les produits obtenus à partir des plantes conformes à l'invention, notamment les graines et leurs produits dérivés, par exemple farines ou semoules.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre qui se réfère à un exemple non-limitatif, illustrant l'obtention de riz transgénique exprimant une albumine PAIa de pois, et dont les graines possèdent une résistance accrue aux attaques de charançons.
EXEMPLE 1 : OBTENTION DE PLANTS DE RIZ TRANSGENIQUES EXPRIMANT PAlA 1) Isolement de la séquence codant: pour PAIa, avec ou sans son propeptide .
Les séquences codant pour la protéine PAIa, avec ou sans son propeptide, ci-après respectivement appelées PAIa-PP et PAIa, ont été amplifiées à partir de la séquence du gène pal dont le numéro d'accession GenBank est AJ574794, respectivement à l'aide des couples d'amorces spécifiques SEQ ID NO : 8 (5' GGATCCATGAATGATGAACACCCTAACT 3') et SEQ ID NO : 9 (5' GGTACCTTAAGCAGTGGAAACACTCTTCA 3' ) et des amorces SEQ ID NO : 8 et SEQ ID NO : 10 (5' GGTACCTTAGTCTTTTGGGGTAATCTTAGAGAA 3'). Les séquences ainsi amplifiées ont une taille respective de 204 pb et 180 pb.
2) Construction du vecteur d'expression pC5300 Ubi-PAla- Tnos
Une cassette d'expression Ubi-Tnos constituée du promoteur, du premier intron et du premier exon du gène de l'ubiquitine ubi-1 du maïs (Christensen et al., Plant Mol. Biol . , 18, 675-89, 1992 ; Cornejo et al. Plant Mol. Biol., 23, 567-81, 1993) et du terminateur du gène de la nopaline synthétase (Tnos ; DEPICKER et al., J. Mol. Appl. Genêt., 1, 561-573, 1982 ; Bevans et al., Nucleic acids Res., 11, 369-85, 1983) a été générée, puis clonée dans le site de clonage multiple du plasmide pC5300 (numéro d'accession GenBank AF294976), plasmide porteur du gène de résistance à la kanamycine, générant ainsi le vecteur pC5300 Ubi-Tnos.
Les séquences codant pour la protéine PAIa et pour la protéine PAIa-PP à tester, obtenues comme décrit en 1) ci-dessus, ont ensuite été clonées Individuellement dans le vecteur pC5300 Ubi-Tnos de sorte que l'expression de PAIa soit sous contrôle du promoteur de l'ubiquitine. Pour cela, le vecteur pC5300 Ubi-Tnos a été clivé par les enzymes BamHI et Kpnl puis la séquence codante pour la protéine PAIa a été introduite aux sites correspondants, générant les vecteur pC5300 Ubi-PAla-Tnos et pC5300 Ubi- PAla-PP-Tnos . Lors des étapes de clonage, les séquences PAIa et PAIa-PP ont été modifiées avec pour conséquence l'ajout à leur extrémité N-terminale d'une méthionine et d'un résidu asparagine qui correspond au dernier acide aminé du propeptide de PAIb. La Figure 2 montre une représentation schématique du vecteur pC5300 Ubi-PAla- Tnos . Les séquences essentielles à la réplication du vecteur dans E. coli sont représentées en gris foncé, les séquences nécessaires à la réplication dans Agrobacterium tumefaciens sont représentées en gris plus clair (pVSl rep et pVSl sta) .
3) Introduction du vecteur pC5300 Ubi-PAla-Tnos dans Agrobacterium tυmefacxβns
Une suspension de bactéries électrocompétentes (20 μL) , Agrobacterium tumefaciens souche EHA105, est déposée entre les électrodes d'une cuve à électroporation ( Invitrogen) . 1 à 2 μL d'une solution d'ADN plasmidique (vecteur pC5300 Ubi-PAla-PP-Tnos ou vecteur pC5300 Ubi- PAla-Tnos) (2 à 10 ng) sont ajoutés délicatement dans les 20 μL de suspension d' Agrobacterium. La cuve à électrodes est ensuite fermée et placée dans l' électroporateur (Invitrogen), préalablement réglé sur 330 μF, 400 V, 4 kΩ. Une impulsion électrique est appliquée permettant de dépolariser les phospholipides de la membrane plasmique des cellules d' Agrobacterium afin d'y introduire par diffusion le plasmide d'intérêt. Après électroporation, la suspension de bactéries est prélevée puis incubée dans 500 μL de milieu LB sous agitation (250 rpm) à 28°C pendant 2h. Les bactéries sont ensuite étalées sur milieu gélose additionné de rifampicine (75 mg.L-1) dont le gène de résistance est porté par la souche EHA105 et de l'antibiotique dont le gène de résistance est porté par le plasmide transféré, ici la kanamycine (50 mg.L-1). Après deux nuits d'incubation à 280C, seules les bactéries ayant incorporé le plasmide d' intérêt se seront divisées et auront formé des colonies. Ces colonies sont ensemencées dans 10 mL de LB/rifampicine/kanamycine en vue d'une extraction du plasmide pour vérifier son intégrité . 4) Obtention des modules embryogènes
Des nodules embryogènes ont été générés comme suit :
Des grains de riz de la variété Japonica ZhongZuo321 débarrassés de leurs glumes et glumelles sont rincés 1 min dans 100 mL d'éthanol 70%. Ils sont ensuite désinfectés par un traitement à l' hypochlorite de sodium commercial à 30% durant 30 min. Durant cette étape, les grains sont agités toutes les 5 min. Ils sont ensuite rincés abondamment avec 2 à 3 litres d'eau distillée stérile. Les grains sont ensuite déposés dans des boites de pétri (Optilux 100x20 mm) contenant le milieu d'induction NB à raison de 10 grains par boite. Les boites de culture sont mises en incubation à l'obscurité à 28°C pendant 20 jours. A la fin de cette période, la prolifération des cellules du scutellum des grains de riz a généré un cal qui a libéré de petits nodules. Les nodules sphériques et compacts de 0,5 à 1 mm sont transférés sur le milieu NB à raison de 30 à 50 par boite de pétri (Optilux 100x15 mm) pendant 10 jours à l'obscurité à 28°C. Ces nodules prolifèrent pour former des cals qui se fragmentent en nodules de taille variable. Les nodules obtenus sont ensuite sélectionnés pour la transformation. 5) Transformation génétique du riz
La séquence codant pour PAIa, ou la séquence codant pour PAIa et son propeptide, (PAIa-PP), sous contrôle du promoteur du gène de l' ubiquitine-1 du maïs a été introduite chez le riz par transformation génétique de cals embryogènes de la variété Japonica ZhongZuo321 (ci-après abrégé ZZ321) via Agrobacterium tumefaciens . Préparation du matériel végétal
La sélection des unités embryogènes pour la coculture est réalisée avant la préparation de la solution d' Agrobacterium. Seuls les nodules sphériques, blancs et opaques, présentant une surface rugueuse, de taille comprise entre 3 et 5 mm sont utilisés pour la coculture afin de garantir aux explants un stade physiologique optimal pour la transformation. Une trentaine d'unités embryogènes sont utilisées par construction à transférer et sont rassemblées dans une boite de milieu NB ce qui permet de débuter la coculture liquide de façon synchrone. Préparation des souches d' Agrobactβrivaa Une préculture d' Agrobacterium tumefaciens, contenant la construction à transférer chez le riz, est réalisée. 3 mL de milieu LB contenant les antibiotiques appropriés (ici rifampicine (75 mg.L"1) et kanamycine (50 mg.L 1J sont ensemencés par une colonie bactérienne et placés à 28°C pendant une à deux nuit (s) sous agitation constante (250 rpm) . Puis, 200 μL de la suspension bactérienne sont étalés sur une boîte de milieu AB contenant les antibiotiques appropriés. Deux boîtes de milieu AB sont ensemencées par construit à transférer. Les boîtes sont incubées à 28°C pendant 3 jours. Transformation
Les bactéries s' étant développées sur les boîtes de milieu AB sont collectées avec une spatule et transférées dans 30 mL de milieu R2-CL contenu dans un tube de 50 mL. Le tube est vortexé jusqu'à homogénéisation puis un aliquot de 1 mL est utilisé pour mesurer la DO à 600 nm (une dilution peut-être réalisée pour une mesure plus précise) . La DO doit être comprise entre 0,1 et 1 (densité 3-5 x 109) . 25 mL de suspension bactérienne sont alors transférés dans une boîte de pétri
(Optilux 100x20 mm) . La trentaine de cals est immergée pour une durée de 15 min avec une légère agitation manuelle. Les cals sont ensuite transférés sur une pile de huit feuilles rectangulaires de papier Whatman n°l autoclavées, puis roulés sur toute la longueur de trois feuilles successives jusqu'à un séchage complet (absence d'humidité au contact du papier) . Le séchage des cals est un point critique qui doit permettre d'éviter tout surdéveloppement bactérien. Les cals sont ensuite transférés à raison de dix par boite sur 20 mL de milieu R2-CS. Les boîtes scellées avec du parafilm sont mises en incubation pendant trois jours à l'obscurité à 25°C.
Sélection et régénération
Les cals, à l'issue de la coculture, sont transférés à la même densité sur le milieu de sélection R2S (boîte de pétri Optilux 100x20 mm) . Les cals enveloppés d'un mucilage visqueux résultant d'un surdéveloppement bactérien au cours de la coculture sont éliminés. Les boîtes sont mises en incubation à l'obscurité à 280C. Au cours de ces deux semaines, certains cals cocultivés vont se nécroser, d'autres vont être « englués » dans un surdéveloppement bactérien. A l'issue des deux semaines de sélection, de petites proliférations blanches se développent sur toute la surface des cals cocultivés, qui ont bruni. Les cals cocultivés sont alors transférés sur milieu NBS (boîte Optilux 100x20 mm) , à raison de six cals par boîte, et les boîtes sont mises à incuber à l'obscurité à 28°C. Après une semaine, les boîtes sont ouvertes et les proliférations, qui se présentent à présent sous forme de globules, sont étalées tout autour du cal cocultivé d'origine, de façon à les placer au contact du milieu sélectif. Les boîtes sont ensuite remises en incubation dans les mêmes conditions. Après une semaine, les proliférations globulaires étalées se sont développées pour former des cals résistants de taille supérieure aux autres proliférations, compacts, de couleur jaune-blanche et d'aspect rugueux. Les cals demeurant translucides et de taille inférieure, de couleur beige, de consistance plus molle et aux contours moins définis sont considérés comme non transgéniques. Les cals résistants sont transférés sur le milieu de prérégénération PR-AG contenant 50 mg.L-1 d' hygromycine en boîte de pétri
(Optilux 100x15 mm) et mis en incubation à l'obscurité à
28°C pendant 8 jours. Les cals transgéniques augmentent de taille et deviennent compacts, opaques, de couleur crème à légèrement jaune, de structure lobée et invaginée. Les rares cals qui ne se développent pas ou peu sont éliminés. Les cals sont transférés sur milieu de régénération (RN) à raison de 5 par boîte de pétri (Optilux 100x20 mm), conservés deux jours à l'obscurité, puis transférés à la lumière sous une intensité de 110- 130 mM/mPAR à 28 °C. Les cals deviennent alors plus compacts et blancs et sont transférés sous lumière continue . Développement et sevrage
Après trois semaines d'exposition à la lumière, les cals ont verdi et ont développé des tiges et des racines. Ces jeunes plantules de 2 à 5 cm sont transférées dans des tubes contenant 20 mL de milieu MS et placées dans les mêmes conditions de culture pendant 15 à 20 jours. Une fois que ces plantules ont formé un important réseau racinaire et que les feuilles atteignent le haut du tube, elles sont repiquées en pots de 1 litre dans un mélange de terreau et de pouzolane. Les plantules sont ensuite placées en serre de confinement. Les conditions sont celles de jours courts avec llh30 d'éclairement à 400 μmol EZm-2Zs"1 à 25°C sous 75% d' humidité .
EXEMPLE 2 : CARACTERISATION DES RIZ TRANSFORMES 1) Détection des transcrits de PAIa et PAIa-PP
Lors du transfert des plantes régénérées en serre, les feuilles de 24 transformants primaires du construit et des feuilles du témoin non transgénique
(ZZ321) ont été prélevées afin d'extraire les ARN totaux puis de les analyser par RT-PCR. Cette analyse a donc été effectuée à partir des ARN totaux extraits des feuilles de l'ensemble de la population TO afin de déterminer si la séquence codant pour PAIa ou PAIa-PP introduite dans le riz était correctement transcrite. L'extraction des ARN totaux est réalisée comme suit :
200 mg de feuilles sont placées en présence de deux billes de verre dans un microtube de plaque 96 puits préalablement dans l'azote liquide, soumis au broyage automatique (MM300 Mixer MiIl, Retsch) réalisé à 30Hz, deux fois 2 minutes. Les plaques sont ensuite placées dans la glace et 500 μL de TRI REAGENT (Sigma) sont ajoutés à chaque échantillon puis homogénéisée par retournement. Les plaques sont centrifugées 30 min à 5500 g à 4°C. Ensuite, les ARN totaux sont extraits par une méthode classique, par exemple au phénol/chloroforme.
Les ARN totaux sont rétrotranscrits en ADNc selon des techniques standards puis la réaction de polymérisation en chaine est réalisée à l'aide des amorces SEQ ID NO : 8 et SEQ ID NO : 9 en ce qui concerne la construction PAIa-PP et d'autre part avec les amorces SEQ ID NO : 8 et SEQ ID NO : 10 en ce qui concerne PAIa. La taille des produits d'amplification attendue est de 204 pb pour la construction PAIa-PP et 180 pb pour la construction PAIa.
La Figure 3 montre l'analyse électrophorétique des produits issus de l'amplification par RT-PCR des ARN totaux des plantes transformées par PAIa-PP (Fig.3A) ou PAIa (Fig.3B) . Les pistes 1, 2 et 3 sont des témoins correspondant respectivement à des ARN totaux extraits de feuilles de la variété ZZ321 ayant subi une étape de PCR, les même ARN ayant subi une RT-PCR et le produit d'une RT-PCR en absence d'ARN totaux. Les pistes 4 et 5 et les pistes 6 et 7 correspondent à deux échantillons indépendants de la construction analysée. Pour chaque échantillon, la première piste correspond aux ARN totaux ayant subi uniquement la PCR (puits 4 et 6) , la seconde piste correspond aux ARN totaux ayant subi la RT-PCR (puits 5 et 7) : la première piste sert à détecter une éventuelle contamination des extraits d'ARN totaux par de l'ADN génomique.
L'amplification réalisée par RT-PCR sur les échantillons d'ARN totaux issus des plantes transformées par PAIa-PP révèle la présence d'un produit d'amplification d'environ 200 pb dans le cas des extraits de plantes transformées par PAIa-PP (Fig.3A, pistes 5 et 7), ce produit n'étant pas présent dans les différents échantillons témoins (pistes 1, 2, 3, 4 et 6) . Il apparait donc que les plantes transgéniques transformées par la construction PAIa-PP ont bien intégré dans leur génome la séquence codant pour le polypeptide PAIa-PP et que cette dernière est correctement transcrite.
La même analyse peut être faite en ce qui concerne les plantes transformées par PAIa, notamment en comparant la piste 7 qui présente un produit d'amplification d'environ 180 pb aux pistes témoins 6, 1, 2 et 3 de la Figure 3B.
Les plantes transgéniques transformées par la construction PAIa ont bien intégré dans leur génome une séquence codant pour le polypeptide PAIa correctement transcrite.
2. Détection de l'expression de PAIa
La détection du polypeptide PAIa a été réalisée sur la génération Tl de la lignée de grain de riz transgénique TO positive en lors de l'analyse par RT- PCR par la méthode du Western in situ en adaptant le protocole décrit par Qu et al., Plant CeIl Rep., 22, 282- 5, 2003.
Brièvement, des grains décortiqués de riz et de pois sont placés dans une plaque 24 puits et imbibés dans de l'eau bidistillée pendant lβh à 40C. Les grains imbibés sont sectionnés longitudinalement de façon à sectionner l'embryon par le milieu, puis mis en contact avec de l'acétone pendant 30 sec. Toutes les étapes suivantes ont lieu sous agitation à température ambiante. Les demi-grains sont ensuite rincés avec de l'eau bidistillée et incubés dans une solution de lavage (Tris- HCl 125 mM, pH 6,8, SDS 2%) pendant 30 min. Les demi- grains sont rincés dans le tampon TBST (Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, Tween 20 0,05%) durant 30 min. Après trois rinçages de 5 min chacun dans le tampon TBS (Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM) , les échantillons sont incubés dans une solution de blocage (Western Blocker Solution, Sigma) pendant au minimum 3h. Les demi-grains sont placés pendant 16h dans la solution d'anticorps primaire polyclonal anti PAIa (Le GaIl et al., J. Nutr., 135, 1215-22, 2005) dilué 500 à 2 500 fois dans le tampon TBS. Les échantillons sont ensuite rincés dans le tampon TBST pendant 15 min puis trois fois durant 5 min dans du tampon TBS. Les demi-grains sont incubés pendant 2h dans la solution d'anticorps secondaire (Goat anti-rabbit IgG- AP conjugate, Bio-rad) dilué 2 000 à 5 000 fois dans le tampon TBS. Après un rinçage dans du tampon TBST et 3 rinçages dans du tampon TBS, identiques à ceux décrits précédemment, les demi-grains sont finalement mis en présence d'un mélange de réactifs (Alcaline Phosphatase Conjugate Subtrate kit, Bio-rad) . La phosphatase alcaline portée par l'anticorps secondaire va catalyser la production d'un précipité coloré en brun qui permet, ici, de localiser la protéine recherchée sur le demi-grain de riz ou de pois. La Figure 4 représente des photographies de demi-grains après analyse par Western in situ : la Figure 4A représente une graine de pois (témoin positif) , la Figure 4B représente un grain de riz ZZ321 sauvage (témoin négatif) et la Figure 4C représente un grain de riz transformé par la construction PlAa-PP. Alors qu'aucun signal n'est observé pour le grain de riz sauvage (Fig.4B), le grain de riz transformé par la construction PAIa-PP est fortement coloré (apparaissant en gris foncé sur la Figure 4) au niveau de l'embryon du grain (Fig.4C) . Des résultats similaires ont également été obtenus avec le riz transformé par la construction PAIa.
L'analyse par Western in situ démontre donc que le polypeptide PAIa est exprimé chez les riz transgéniques ayant été transformés par la construction PAIa-PP ou la construction PAIa.
EXEMPLE 3 : MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE INSECTICIDE DE LA PROTEINE PAIa EXPRIMEE PAR LES RIZ TRANSGENIQUES
1) Sélection des grains de riz transgéniques T2 utilisés pour les tests La comparaison des résultats d'analyses par
RT-PCR d'ARN totaux de feuilles des plantes TO, par western in situ de grains Tl, ainsi que la détermination par Southern blot du profil d'intégration de l'ADN-T dans le génomes de ces mêmes lignées, a permis de sélectionner les événements de transformation génétique, comportant de 1 à 5 copies intègres de l'ADN-T, les plus intéressants, afin d'étudier leurs descendants. Ainsi pour chaque construit PAIa-PP et PAIa, les grains transgéniques Tl des lignées sélectionnées ont été placés sur une solution aqueuse d' hygromycine B (10 à 50 grains sur du papier Whatman N°l imbibé avec 10 ml d'une solution aqueuse d' hygromycine B à SOmg.L"1) afin de sélectionner les plantules issues de grains dont le gène de résistance à cet antibiotique (hpt) était actif et d'éliminer les grains n'exprimant pas le gène hpt, ou l'ayant perdu par ségrégation durant la méiose. Les taux de germination des grains transgéniques ont été comparés à ceux des grains provenant du témoin négatif ZZ321, semés en présence d'eau, ou sur une solution aqueuse d' hygromycine B. Après 7 jours d'incubation en chambre de culture à la lumière, il est possible d'observer trois cas de figures ; soit les grains transgéniques présentent les signes d' une imbibition normale mais n'ont pas germé, soit ils ont germé, mais les plantules ne dépassent pas 5 mm et leurs systèmes racinaires ne sont pas développés, soit les grains ont germé et les plantules se sont développées normalement, c'est-à-dire similairement aux plantules issues de la germination de grains non transgéniques avec de l'eau. Cette dernière catégorie de plantules transgéniques a été sélectionnée afin d' être transférées en pot et placées en serre de confinement. Ne présentant pas de symptôme d'extinction de l'expression du gène hpt, ce qui se serait traduit par un arrêt ou un retard de croissance du système racinaire, des brûlures des feuilles et/ou des racines, ces plantules sont les plus susceptibles d'exprimer correctement le gène d'intérêt. Pour les deux construits PAIa-PP et PAIa, les descendants de 50 lignées avec un minimum de trois événements indépendants de transformation par construit, ont été transférées en serre et constituent la population de plantes Tl.
Les plantes transgéniques Tl ont fait l'objet d'un test de résistance à l' hygromycine B par application de 2 μl d'une solution à 25mg.mL~1 d' hygromycine B sur une feuille. Les plantes dont les feuilles ne présentaient pas de symptômes (nécrose ou brûlure) , suite à l'application de la solution d' hygromycine B, ont été sélectionnées. Les grains T2 issus de ces plantes Tl ont alors été analysés par western in situ afin d'évaluer l'expression de la protéine PAIa.
Les grains T2 exprimant la protéine PAIa ont été sélectionnés afin d'être testés avec Sitophilus oryzae. 2) Test d' activité insecticide sur charançons adultes
Des charançons {Sitophilus oryzae) adultes âgés d'une semaine après émergence, sont utilisés pour réaliser les essais. Les données de mortalité, recueillies journalièrement , sont analysées par mesure de survie afin d'obtenir des valeurs de TL50 (Analyse actuarielle, Statview, SAS) . Cette durée est définie comme le temps à partir duquel la moitié de la population testée est morte (la mortalité dans les boites témoins est généralement nulle) . Le protocole est réalisé comme décrit par Louis et al. (2004), avec quelques modifications qui sont détaillées dans les paragraphes suivants.
Grains entiers Les charançons adultes (20) sont mis en présence de 5 grains de riz entiers à 27,5°C avec une humidité relative variant de 80 à 90% (utilisation de bacs contenant une solution d'eau pure) . Les scores de mortalité de Sitophilus oryzae sont relevés à partir du deuxième jour puis tous les jours pendant 10 jours. Le contrôle négatif est constitué de grains non- transgéniques (ZZ321) tandis que le contrôle positif est constitué de grains artificiels composés de farine de grains non transgéniques (ZZ321) additionnée de 10% à 20% de farine de pois. A posteriori, les boites sont analysées pour la déhiscence des grains, et les rares boîtes où des grains ouverts sont identifiés sont éliminées de l'analyse, la survie des adultes y étant artificiellement prolongée. Les bioessais sont réalisés sur les grains entiers des générations T2 et T3 avec la souche sensible Bouriz.
Grains décortiqués , alimentation forcée
Les charançons adultes (30) sont mis en présence de 5 grains de riz décortiqués à 27,5°C avec une humidité relative de 60-65%. Les scores de mortalité de Sitophilus oryzae sont relevés à partir du deuxième jour, tous les jours pendant 21 jours. Un grain supplémentaire est ajouté en cas de consommation complète du lot. Ce dispositif assure une consommation complète du grain, y compris de ses couches cellulaires externes (alimentation dite forcée ou limitée) , alors que la fourniture de graines ad libitum (e.g. 10 grains pour 30 individus et 21 jours) entraîne la consommation préférentielle de l'amidon interne, au détriment des couches externes et de l'embryon du grain.
Le contrôle négatif est constitué de grains non transgéniques (ZZ321) tandis que le contrôle positif est constitué de grains artificiels composés de farine de grains non transgéniques (ZZ321) additionnée de 10% à 20% de farine de pois (Louis et al., 2004) . A titre de comparaison, les tests ont été réalisés en parallèle avec des plantes transgéniques exprimant PAIb avec son propeptide (PAIb-PP) ou PAIb seul. Les bioessais sont réalisés sur les grains entiers des générations T2 et T3 avec la souche sensible Bouriz de Sitophilus oryzae
La Figure 5 représente le taux de mortalité du charançon Sitophilus oryzae observé à 10 jours lors de bioessais réalisés avec des grains entiers (barres d'histogrammes blanches) de génération T2, ou à 21 jours lors de bioessais réalisés avec des grains décortiqués (barre d'histogrammes gris foncé) . Le témoin positif (pois), le témoin négatif non transgénique ZZ321 abrégé ZZ, ainsi que les lignées testées sont indiqués en bas de l'histogramme. La ligne grise apparaissant au milieu du graphique représente les valeurs maximales de toxicité obtenues avec des grains non transgéniques. Cette Figure indique que la mortalité des charançons adultes observée sur le témoin non transgénique (grains de ZZ321) est de 50% pour les grains entiers et de 40% pour les grains décortiqués. Des valeurs de toxicité aussi élevées suggèrent que d'autres facteurs sont intervenus lors de ces bioessais. Il pourrait s'agir de résidus de traitements chimiques présents sur les grains ou encore du taux d'humidité relative appliqué lors de l'expérimentation. Cependant, la présence d'un témoin positif, constitué de farine de grains de riz non transgéniques (variété ZZ321) et de 20% de farine de pois, a permis d'évaluer l'effet du polypeptide PAIa dans ces conditions expérimentales et de le comparer à la toxicité des grains transgéniques.
Ces résultats montrent que les lignées transgéniques contenant les transgènes PAIa-PP et PAIa codant respectivement pour la protéine PAIa avec ou sans son propeptide, ont été susceptibles d'induire une mortalité maximale des adultes de Sitophilus oryzae, similaire à la mortalité obtenue avec des lignées transgéniques contenant les transgènes PAIb-PP et PAIb codant respectivement pour la protéine PAIb avec ou sans son propeptide. Ces résultats indiquent que la protéine PAIa, produite dans les grains de riz et dans ces conditions expérimentales, est bien toxique pour les adultes de Sitophilus oryzae. En outre, ces résultats montrent que le propeptide de PAIa n'est pas nécessaire à l'activité insecticide de PAIa.
3) Test d'activité insecticide sur larves de charançon
Afin de compléter la caractérisation de la toxicité des lignées transgéniques PAIa-PP et PAIa, et par la même des construits PAIa, un test de développement larvaire a été réalisé avec des grains T2. En parallèle, les mêmes tests ont été réalisés avec les lignées transgéniques exprimant PAIb ou PAIb-PP.
Dans un tube grillagé, 10 grains T2 décortiqués ont été mis en présence de 20 charançons non sexes pendant 3 jours, pour leur permettre de pondre dans les grains. Trois répétitions sont effectuées pour chaque expérimentation (Boites 1, 2 ,3) . Un contrôle de la ponte est effectué après ces 3 jours sur des grains de riz témoin ZZ321 (Boites Ibis, 2bis, 3bis mises en observation sur une durée similaire) . Les charançons sont alors mis dans une enceinte climatique pendant 4 semaines sans observations individuelles, et les scores d'émergence journalière sont initiés en début de cinquième semaine, les adultes émergeant chaque jour étant retirés du lot et pesés. La Figure 6 représente le nombre de charançons adultes émergeant après 34 jours de grains de riz T2 lors de tests de développement larvaire réalisés avec des charançons Sitophilus oryzae. Les témoins négatif non transgénique Ariete et ZZ321 (abrégé ZZ), ainsi que les lignées testées sont indiqués en bas de l'histogramme. La ligne grise apparaissant au milieu du graphique représente la valeur d' émergence minimale obtenue avec un grain non transgénique.
La Figure 6 indique que les larves contenues dans les grains non transgéniques se sont développées, puis que 9 à 10 adultes matures pour la variété Ariete et 5 à 6 adultes matures pour la variété ZZ321 ont émergé de ces grains. La différence du nombre d'adultes de Sitophilus oryzae émergeant à partir des grains non transgéniques pourrait être liée à un effet variétal. Ces résultats obtenus à partir de témoins non transgéniques ont permis de déterminer une limite, représentée par une ligne grise sur le graphique de la Figure 6, correspondant au nombre minimal d'adultes de Sitophilus oryzae susceptibles d'émerger « normalement » d'un grain de riz.
Ces résultats indiquent que les grains de toutes lignées des construits PAIa-PP et PAIa testés ont généré des résultats d'émergence d'adultes de Sitophilus oryzae équivalents à ceux du témoin non transgénique ZZ321. En revanche, ces résultats montrent que les lignées des construits PAIb exprimant la protéine PAIb avec ou sans son propeptide semble capable de limiter efficacement l'émergence d'adultes de charançons. Ceci indique que la protéine PAIa serait toxique uniquement pour les insectes adultes de Sitophilus oryzae, et donc que le mécanisme de toxicité (mode d'action et effet dose) de cette protéine serait différent de celui lié à 1' entomotoxine PAIb.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé pour améliorer la résistance d'une plante aux attaques d'insectes ravageurs, caractérisé en ce que l'on exprime dans ladite plante une séquence codant pour une protéine PAIa, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié dans une cassette d'expression ne comprenant pas de séquence codant pour une protéine PAIb. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits insectes ravageurs sont des insectes ravageurs des grains.
3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que le ladite cassette d'expression comprend une séquence codant pour une protéine PAIa dont la séquence des 28 acides aminés N-terminaux possède au moins 55%, de préférence au moins 60%, et par ordre croissant de préférence, au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% d'identité, ou au moins 65%, de préférence au moins 70%, et par ordre croissant de préférence, au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 98% de similarité avec la séquence des 28 acides aminés N- terminaux du polypeptide de séquence SEQ ID NO : 1.
4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la séquence des 28 acides aminés N- terminaux de ladite protéine PAIa est définie par la séquence générale (I) suivante (SEQ ID NO : 11) : Xi-X2~H—X3—X4—X5—C-Xg-X7—Xs~Xg-XiO-C-Xn-X12—K—X13-S—G—Xi4—F-C— X15-Xi6Xi7-P-N-Xi8 dans laquelle H, C, K, S, G, F, P et N ont leur signification usuelle en code 1-lettre ;
Xi représente un acide aminé choisi parmi l'aspartate, le glutamate et la lysine, et de préférence parmi le glutamate et l'aspartate ; X2 représente un acide aminé choisi parmi l'alanine, la glutamine, l'aspartate, le glutamate, la lysine ; de préférence X2 représente le glutamate ;
X3 représente un acide aminé choisi parmi la proline, la leucine et l'alanine ; de préférence X3 représente la proline ;
X4 représente l'asparagine ou l'histidine, de préférence l'asparagine ;
X5 représente la leucine ou l' isoleucine, de préférence la leucine ;
Xζ représente un acide aminé choisi parmi la glutamine, le glutamate et la lysine, de préférence parmi la glutamine ou le glutamate ;
X7 représente la serine ou la thréonine, de préférence la serine ;
X8 représente un acide aminé choisi parmi l'asparagine, l'aspartate et l'histidine ; de préférence Xs représente l'aspartate ;
X9 représente un acide aminé choisi parmi l'alanine, la valine, la leucine, l'aspartate et le glutamate, de préférence parmi l'alanine ou l'aspartate ;
X10 représente l'aspartate ou le glutamate ;
X11 représente un acide aminé choisi parmi la lysine, l'arginine, la valine, la leucine, l' isoleucine, la méthionine, et la thréonine, de préférence parmi l'arginine ou la lysine ;
X12 représente un acide aminé choisi parmi la lysine, l'asparagine et le glutamate ; de préférence Xi2 représente la lysine ; Xi3 représente un acide aminé choisi parmi la glycine, le glutamate et l'arginine ; de préférence X13 représente la glycine ;
X14 représente un acide aminé choisi parmi la lysine, l'asparagine, la thréonine, la serine et l'aspartate, de préférence parmi la lysine, l'asparagine, ou la thréonine ; X15 représente la glycine ou l'alanine ;
Xi6 représente l'histidine ou l'arginine ;
X17 représente la tyrosine ou la phénylalanine, de préférence la tyrosine ; X18 représente un acide aminé choisi parmi la proline, l' asparagine, l'aspartate, l'histidine et l'alanine, de préférence parmi la proline ou l' asparagine
5) Procédé selon une quelconque des revendications 3 à 4, caractérisé en ce que la séquence des 31 acides aminés N-terminaux de ladite protéine PAIa possède au moins 55%, de préférence au moins 60%, et par ordre croissant de préférence, au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% d'identité, ou au moins 65%, de préférence au moins 70%, et par ordre croissant de préférence, au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 98% de similarité avec la séquence des 31 acides aminés N- terminaux du polypeptide de séquence SEQ ID NO : 1.
6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la séquence de 31 acides aminés N- terminaux est définie par la séquence générale (II) suivante (SEQ ID NO : 12) : X1-X2-H—X3—X^-X5-C-Xg-X7-X8-Xg-X1O-C-X11-X12-K-X1^-S—G-X]^-F—C— X15-X16X17-P-N-X18-X19-X20-X2I dans laquelle X1 à X18 sont tels que définis dans la revendication 4,
H, C, K, S, G, F, P et N ont leur signification usuelle en code 1-lettre, et : X19 représente un acide aminé choisi parmi la glycine, l'asparate ou la tyrosine, de préférence parmi la glycine ou l'aspartate ;
X20 représente une isoleucine ou une méthionine, de préférence une isoleucine ; X21 représente l'aspartate ou le glutamate, de préférence l'aspartate. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que la séquence des 36 acides aminés N-terminaux de ladite protéine PAIa possède au moins 55%, de préférence au moins 60%, et par ordre croissant de préférence, au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% d'identité, ou au moins 65%, de préférence au moins 70%, et par ordre croissant de préférence, au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 98% de similarité avec la séquence des 36 acides aminés N- terminaux du polypeptide de séquence SEQ ID NO : 1.
8) Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que la séquence de 36 acides aminés N-terminaux est définie par la séquence générale (III) suivante (SEQ ID NO : 13) :
Xl ~ X2 ~ H- X3 — Xi3 ~X5 ~ C ~X6~X7 ~X8 ~X9~Xl 0~C~Xi i ~Xi2 ~K — Xl 3 — S ~G ~Xi 4 "~ F~C ~
X15-Xi6Xi7- P-N-X18-Xi9-X20-X2i-X22-G-W-C-F dans laquelle Xi à X21 sont tels que définis dans les revendications 4 et 6,
H, C, G, K, S, G, F, P, W, et N ont leur signification usuelle en code 1-lettre, et X22 représente une tyrosine ou une histidine, de préférence une tyrosine .
9) Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisé en ce que la séquence des 42 acides aminés N-terminaux de ladite protéine PAIa possède au moins 55%, de préférence au moins 60%, et par ordre croissant de préférence, au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% d'identité, ou au moins 65%, de préférence au moins 70%, et par ordre croissant de préférence, au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 98% de similarité avec la séquence des 42 acides aminés N- terminaux du polypeptide de séquence SEQ ID NO : 1. 10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la séquence de 42 acides aminés N- terminaux est définie par la séquence générale (IV) suivante (SEQ ID NO : 14) : Xi—X2-H—X3—X4-X5-C-Xg-Xv-Xe-Xg-X10—C-Xn-Xi2-K—X13—S-G—X14—F—C— Xi5-Xi6Xn-P-N-Xi8-X19-X20-X2I-X22-G-W-C-F-X23-S-X24-X25-X2O-A dans laquelle X1 à X22 sont tels que définis dans les revendications 4, 6 et 8,
A, H, C, G, K, S, G, F, P, W, et N ont leur signification usuelle en code 1-lettre, et :
X23 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par l'alanine, la glycine, la serine et l'aspartate, de préférence l'alanine ;
X24 représente un acide aminé choisi dans la groupe constitué par la lysine, l'asparagine et l'aspartate, de préférence la lysine ;
X25 représente la serine ou la phénylalanine, de préférence la serine ;
X26 représente le glutamate ou la lysine, de préférence le glutamate.
11) Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que la séquence de ladite protéine PAIa possède au moins 55%, de préférence au moins 60%, et par ordre croissant de préférence, au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% d'identité, ou au moins 65%, de préférence au moins 70%, et par ordre croissant de préférence, au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 98% de similarité avec la séquence SEQ ID NO : 1.
12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ladite protéine PAIa est définie par la séquence générale (V) suivante (SEQ ID NO : 15) : Xl "X2 "H -X3 -X4 -Xs "C-Xg-X7 "Xe-X 9~Xl O-C-Xi l ~Xi2~ K-Xi 3 -
S -G-Xi4 - F-C-Xi5-Xi6Xi7 - P-N-Xi8-Xi9-X2o-X2i-X22 -G-W-C- F-X23- S -X24 -
X25~X26~A-X27 ~X28 ~X29~ F-X30-X31 ~X32~X33~X34 ~X35~X36 dans laquelle dans laquelle Xi à X26 sont tels que définis dans les revendications 4, 6, 8 et 10,
A, H, C, G, K, S, G, F, P, W, et N ont leur signification usuelle en code 1-lettre, et :
X27 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par le glutamate, la glutamine, la tyrosine et la leucine ; de préférence X27 représente le glutamate ;
X28 représente un acide aminé choisi parmi le glutamate, l'aspartate, et la lysine ; de préférence X28 représente l'aspartate ; X29 représente un acide aminé parmi la glycine, la valine et la phénylalanine, de préférence parmi la valine et la phénylalanine ;
X30 représente un acide aminé choisi parmi la serine, la leucine et la phénylalanine ; de préférence X30 représente la serine ;
X31 représente un acide aminé choisi parmi la lysine, l'asparagine et l'alanine ; de préférence X31 représente la lysine ;
X32 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par l' isoleucine, la valine et la méthionine ; de préférence X32 représente l' isoleucine ;
X33 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par la thréonine, la serine et la proline ; de préférence X33 représente la thréonine ; X34 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué par la glutamine, la proline, la serine et l'arginine ; de préférence X34 représente la glutamine ou la proline ;
X35 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué par la lysine, l'asparagine et l'alanine ; de préférence X35 représente la lysine ; X36 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par l'aspartate, l'arginine, la proline et la thréonine ; de préférence X36 représente 1' aspartate .
13) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ladite protéine PAIa est choisie parmi le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7.
14) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que ladite protéine PAIa est modifiée par l'addition à son extrémité N-terminale d'un peptide de 2 à 10 résidus.
15) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit peptide est le dipeptide methionine-Asparagine .
16) Cassette d'expression comprenant une séquence codant pour une protéine PAIa, telle que définie dans les revendications 1 à 15, et ne comprenant pas de séquence codant pour une protéine PAIb.
17) Vecteur recombinant comprenant une cassette d'expression selon la revendication 16.
18) Cellule comprenant une cassette d'expression selon la revendication 16.
19) Plante transgénique comprenant une cassette d'expression selon la revendication 16.
20) Procédé d'obtention d'une plante transgénique exprimant une protéine PAIa, caractérisé en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : - la transformation de cellules végétales par une cassette d'expression, selon la revendication 16 ; la régénération de plantes à partir des cellules transformées ; - la sélection des plantes ayant intégré dans leur génome ladite cassette d'expression.
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