WO2009010392A1 - Mittel enthaltend proteasen aus stenotrophomonas maltophilia - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Mittelzusammensetzungen, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, die eine Protease aus einem Bakterienstamm der Art Stenotrophomonas maltophilia enthalten sowie diese Proteasen selbst. Weiterhin betrifft die Erfindung Reinigungsverfahren, in denen diese Mittel eingesetzt werden sowie Verwendungen dieser Mittel. Ferner betrifft die Erfindung die Herstellung und Verwendung dieser Proteasen selbst.

Description

Mittel enthaltend Proteasen aus Stenotrophomonas maltophilia

Die Erfindung betrifft Mittelzusammensetzungen, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, die eine Protease aus einem Bakterienstamm der Art Stenotrophomonas maltophilia enthalten sowie diese Proteasen selbst. Weiterhin betrifft die Erfindung Reinigungsverfahren, in denen diese Mittel eingesetzt werden sowie Verwendungen dieser Mittel. Ferner betrifft die Erfindung die Herstellung und Verwendung dieser Proteasen selbst.

Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass Bakterienstämme der Art Stenotrophomonas maltophilia Enzyme produzieren, die eine proteolytische Aktivität besitzen.

So beschreiben Vazquez et al. (Rev. Argent Microbiol. 32(2):53-62), 2000), dass die beiden Stenotrophomonas maltophilia-Stämme ANT-1-1 und ANT-7-1 Proteasen exprimieren und diese Enzyme in das umgebende Medium szernieren. Ferner wird offenbart, dass die Protease- produktion dieser Stämme abhängig ist von Faktoren wie der Konzentration von Kalzium, dem pH- Wert des Kulturmediums, u.a.

In der Veröffentlichung von Windhorst et al. (Journal of Biologial Chemistry Vol. 277, No. 13: 11042-11049, 2002) wird die hauptsächlich vorhandene extrazelluläre Protease eines humanpathogenen Stenotrophomonas maltophilia-Stammes eines Patienten der Hamburger Universitätsklinik charakterisiert. Die Sequenz dieser Protease mit der Bezeichnung StmPri ist unter der der Zugangsnummer (accession number) AJ291488 in einer öffentlich zugänglichen Datenbank (GenBank™ / EBI Data Bank) hinterlegt und gemäß SEQ ID NO.3 dieser Anmeldung beigefügt.

Auch in den Veröffentlichungen von Miyaji et al. (Lett. Appl. Microbiol. 41 (3): 253-7, 2005) und Dünne et al. (Microbiology 146(8): 2069-78, 2000) werden Stenotrophomonas-Stämme beschrieben, die Enzyme mit proteolytischer Aktivität exprimieren. Konkret werden die Stämme Stenotrophomonas maltophilia S-1 sowie Stenotrophomonas maltophilia W81 offenbart.

Aus dem Stand der Technik sind hingegen keine Mittel, insbesondere keine Wasch- und Reinigungsmittel, bekannt, in denen eine Protease aus einem Bakterienstamm der Art Stenotrophomonas maltophilia eingesetzt ist.

Für Wasch- und Reinigungsmittel werden bevorzugt Proteasen vom Subtilisin-Typ eingesetzt. Beispiele hierfür sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase® von der Firma Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dänemark, erhältlich. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase®, beziehungsweise Savinase® von der Firma Novozymes vertrieben. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1 ) leiten sich die unter der Bezeichnung BLAP® geführten Varianten ab, die insbesondere in WO 92/21760 A1 , WO 95/23221 A1 , WO 02/088340 A2 und WO 03/038082 A2 beschrieben werden. Weitere verwendbare Proteasen aus verschiedenen Bacillus sp. und B. gibsonii gehen aus den Patentanmeldungen WO 03/054185 A1 , WO 03/056017 A2, WO 03/055974 A2 und WO 03/054184 A1 hervor.

Weitere verwendbare Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® und Ovozyme® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime und Properase® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme.

Die in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzten Proteasen stammen entweder ursprünglich aus Mikroorganismen, beispielsweise der Gattungen Bacillus, Streptomyces, Humicola, oder Pseudomonas, und/oder werden nach an sich bekannten biotechnologischen Verfahren durch geeignete Mikroorganismen produziert, beispielsweise durch transgene Expressionswirte der Gattungen Bacillus oder durch filamentöse Fungi.

Ein Nachteil dieser bevorzugt in Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzten Proteasen aus dem Stand der Technik ist, dass sie insbesondere bei niedrigen Temperaturen, beispielsweise zwischen 2O⁰C und 6O⁰C, keine zufrieden stellende proteolytische Aktivität aufweisen und daher insbesondere in Waschmitteln und Geschirrspülmitteln in diesem Temperaturbereich keine optimale Reinigungsleistung zeigen.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Mittel bereitzustellen, die bei niedrigen Temperaturen, insbesondere in einem Temperaturbereich zwischen 20 und 6O⁰C, eine verbesserte Entfernung proteinhaltiger Rückstände in Bezug auf zumindest eine Anschmutzung, vorzugsweise in Bezug auf mehrere Anschmutzungen, zeigen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eben solche Protease-Enzyme bereitzustellen, die für den Einsatz in erfindungsgemäßen Mitteln geeignet sind und sich durch eine gute, bevorzugt durch eine verbesserte proteolytische Aktivität in Bezug auf zumindest eine An- schmutzung, vorzugsweise in Bezug auf mehrere Anschmutzungen, in dem vorstehend genannten Temperaturbereich auszeichnen, wenn sie in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt sind.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst gemäß der Lehre des Anspruchs 1 durch die Bereitstellung von Mitteln, die eine Protease enthalten, die aus einem Bakterienstamm der Art Stenotrophomonas maltophilia natürlicherweise erhältlich ist. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass Proteasen aus Stenotrophomonas maltophilia Stämmen vorteilhaft in erfindungsgemäßen Mitteln einsetzbar sind und in erfindungsgemäßen Mitteln bei niedrigen Temperaturen, insbesondere in einem Temperaturbereich zwischen 20 und 6O⁰C, eine verbesserte Entfernung protease-sensitiver Rückstände, beispielsweise Anschmutzungen auf Textilien oder Geschirr, ermöglichen.

Einen Gegenstand der Erfindung bilden somit Mittel enthaltend eine Protease, die in einem Bakterienstamm der Art Stenotrophomonas maltophilia natürlicherweise vorhanden ist und/oder die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 8 oder SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz in einem Teilstück von mindestens 100 zusammenhängenden Aminosäureresten mindestens zu 50% identisch ist. In weiteren Ausführungsformen der Erfindung enthalten die Mittel eine Protease, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 8 oder SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz in einem Teilstück von zunehmend bevorzugt 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 477, 500, 550, 578 zusammenhängenden Aminosäureresten mindestens zu 50% identisch ist. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthalten die Mittel eine Protease, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 8 oder SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 50% identisch ist.

Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Proteasen und Nukleinsäuren bzw. entsprechende Teilstücke sind bevorzugt natürlicherweise vorhanden in einem Bakterienstamm der Art Stenotrophomonas maltophilia bzw. in Bakterien, die zugehörig sind zu einem solchen Bakterienstamm. Sie sind daher auch aus solchen Bakterien erhältlich.

Natürlicherweise vorhanden bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Protease eine bakterieneigene Protease ist, die aus dem Bakterium isoliert werden kann. Es werden daher insbesondere solche Proteasen nicht mit eingeschlossen, die mit Hilfe gentechnologischer Verfahren in einen erfindungsgemäßen Bakterienstamm eingebracht wurden und von diesem rekombinant exprimiert werden. Allgemein aus dem Stand der Technik bekannte Proteasen, die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Bakterienstammes produziert werden - d.h. für die der Bakterienstamm der Art Stenotrophomonas maltophilia lediglich der Produktionsorganismus auf der Basis der Einbringung des für die Protease kodierenden Gens in diesen Organismus mittels gentechnologischer Verfahren ist -, sind daher nicht Gegenstand der Erfindung.

Die Berücksichtigung von erfindungsgemäßen Teilstücken ist für die Betrachtung aller Erfindungsgegenstände von wesentlicher Bedeutung, da die Proteasen posttranslational modifiziert werden. Insbesondere können sie Aminosäuresequenzen umfassen wie beispielsweise ein oder mehrere N-terminale(s) Signalpeptid(e) (z.B. als Sekretionssignal) und/oder ein oder mehrer weitere Propeptid(e) und/oder eine oder mehrere weitere Domäne(n), die in dem reifen Protein, d.h. der reifen Protease, nicht mehr vorhanden sind. Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Teilstücke, insbesondere für den Einsatz in erfindungsgemäßen Mitteln, Verfahren und Verwendungen, sind daher diejenigen, die die proteolytische Aktivität verleihen, d.h. die proteolytisch aktiv sind. Ebenfalls bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Teilstücke die fertig prozessierten, d.h. reifen Proteasen gebildet von Bakterien des jeweiligen Bakterienstammes der Art Stenotrophomonas maltophilia. Neben möglichen weiteren Modifikationen weisen diese beispielsweise kein N- terminales Signalpeptid mehr auf.

Das klassische Vorgehen zur Gewinnung der Enzyme ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie bekannt und besteht darin, die Mikroorganismen-haltige Proben aus beispielsweise natürlichen Habitaten zu entnehmen und unter den als geeignet angesehenen Bedingungen - zum Beispiel in alkalischem Milieu - zu kultivieren. Auf diese Weise erhält man Anreicherungskulturen der Mikroorganismen, die die gewünschten Enzyme, im vorliegenden Fall also die Protease-Enzyme, enthalten, welche unter den betreffenden Bedingungen aktiv sind. Hieraus werden dann beispielsweise über Ausplattieren auf proteinhaltigen Agarplatten und Ausmessen der gebildeten Lysehöfe die Mikroorganismen mit den leistungsfähigsten Enzyme ausgewählt und aufgereinigt beziehungsweise die betreffenden Gene kloniert.

Solch ein Vorgehen wird beispielsweise in dem Lehrbuch „Alkalophilic Mikroorganisms. A new microbial world" von K.Horikoshi und T.Akiba (1982), Japan Scientific Societies Press, Springer- Verlag, New York, Heidelberg, Berlin, ISBN 0-387-10924-2, Kapitel 2, Seiten 9-26 beschrieben. Beispielsweise auch WO 00/24882 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer Genbank, die dadurch erhalten wird, dass Mikroorganismen enthaltende Proben aus beliebigen Habitaten, beispielsweise dem Pansen, unter den interessierenden Bedingungen kultiviert und somit angereichert werden und daraus interessierende Nukleinsäuren isoliert und kloniert werden. So werden bereits natürlicherweise, vorzugsweise mikrobiell gebildete alkalische Proteasen in

Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzt. Beispielsweise ist nach der Anmeldung

WO 93/07276 A1 die aus Bacillus spec. 164-A1 erhältliche Protease 164-A1 der Firmen Chemgen

Corp., Gaithersburg, MD, USA, und Vista Chemical Company, Austin, TX, USA, für den Gebrauch in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet. Andere Beispiele sind die Alkalische Protease aus

Bacillus sp. PD138, NCIMB 40338 der Fa. Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dänemark,

(WO 93/18140 A1 ), die aus Bacillus sp. ferm. BP-3376 stammende Proteinase K-16 der Fa. Kao

Corp., Tokyo, Japan, (US-Patent 5344770) und gemäß WO 96/25489 A1 (Fa. Procter & Gamble,

Cincinatti, OH, USA) die Protease aus dem psychrophilen Organismus Flavobacterium balustinum.

Weitere Alkalische Proteasen, die von Mikroorganismen gebildet werden, die aus natürlichen Habitaten isolierbar sind, gehen beispielsweise aus den Anmeldungen WO 03/054185 A1 (aus Bacillus gibsonii (DSM 14391 )), WO 03/056017 A2 (aus Bacillus sp. (DSM 14390)), WO 03/055974 A2 (aus Bacillus sp. (DSM 14392)) und WO 03/054184 A1 (aus Bacillus gibsonii (DSM 14393)) hervor. All diese Anmeldungen offenbaren auch entsprechende Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen Alkalischen Proteasen.

Weitere Ausführungsformen der Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass die in den erfindungsgemäßen Mitteln enthaltene Protease eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 8 oder SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz in einem Teilstück von mindestens 100 zusammenhängenden Aminosäureresten zunehmend bevorzugt zu mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist. In weiteren Ausführungsformen der Erfindung enthalten die Mittel eine Protease, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 8 oder SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz in einem Teilstück von zunehmend bevorzugt 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 477, 500, 550, 578 zusammenhängenden Aminosäureresten zunehmend bevorzugt zu mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Teilstück derart gewählt, dass dessen C-Terminus der Position 470 oder Position 471 oder Position 472 oder Position 473 oder Position 474 oder Position 475 oder Position 476 oder Position 477 oder Position 478 oder Position 479 oder Position 480 entspricht, bezogen auf SEQ ID NO. 2. Das bedeutet, dass in einem Alignment die C-terminale Aminosäure des erfindungsgemäßen Teilstückes der genannten Position in SEQ ID NO. 2 zugeordnet ist, wobei die C-terminale Aminosäure des Teilstückes und die korrespondierende Aminosäure in SEQ ID NO. 2 nicht identisch sein müssen, jedoch identisch sein können. Relevant ist die positionsbezogene Zuordnung der Aminosäuren, nicht deren Übereinstimmung. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthalten die Mittel eine Protease, die eine Aminosäure- sequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 8 oder SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Mittel dadurch gekennzeichnet, dass die Waschleistung der enthaltenen Protease mindestens derjenigen einer Protease entspricht, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz oder der in SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz in einem Teilstück von zunehmend bevorzugt 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 477, 500, 550, 578 zusammenhängenden Aminosäureresten entspricht, wobei die Waschleistung in einem Waschsystem bestimmt wird, das ein Waschmittel in einer Dosierung zwischen 4,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte sowie die Protease enthält, wobei die zu vergleichenden Proteasen aktivitätsgleich eingesetzt sind und die Waschleistung gegenüber einer Anschmutzung Ganzei/Ruß bzw. Vollei/Pigment auf Baumwolle, insbesondere der Anschmutzung Vollei/Pigment auf Baumwolle 10N, bestimmt wird durch Messung des Weißheitsgrades der gewaschenen Textilien, der Waschvorgang für mindestens 30 Minuten, optional 60 Minuten, bei einer Temperatur von 4O⁰C erfolgt und das Wasser eine Wasserhärte zwischen 15,5 und 16,5° deutscher Härte aufweist.

Erfindungsgemäß sind die Begriffe Ganzei/Ruß bzw. Vollei/Pigment hinsichtlich der Anschmutzungen als gleichwertig und einander entsprechend zu betrachten. Eine geeignete Anschmutzung ist beispielsweise die kommerziell erhältliche Anschmutzung 10N (Vollei/Pigment) der wfk Testgewebe GmbH (Christenfeld 10, D-41379 Brüggen-Bracht, Deutschland).

Ein bevorzugtes flüssiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3- 0,5% Xanthan Gum, 0,2-0,4% Anti-Schaummittel, 6-7% Glycerin, 0,3-0,5% Ethanol, 4-7% FAEOS (Fettalkoholethersulfat) , 24-28% nichtionische Tenside, 1 % Borsäure, 1-2% Natriumeitrat (Dihydrat), 2-4% Soda, 14-16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP (1-Hydroxyethan-(1 ,1-di-phosphonsäure)), 0-0,4% PVP (Polyvinylpyrrolidon), 0-0,05% optischer Aufheller, 0-0,001 % Farbstoff, Rest demineralisiertes Wasser. Bevorzugt beträgt die Dosierung des flüssigen Waschmittels zwischen 4,5 und 5,5 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 4,9 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH- Wertebereich zwischen pH 8 und pH 10,5, bevorzugt zwischen pH 8 und pH 9.

Ein bevorzugtes pulverförmiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 10 % lineares Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz), 1 ,5 % C12-C18-Fettalkoholsulfat (Natrium-Salz), 2,0 % C12-C18-Fettalkohol mit 7 EO, 20 % Natriumcarbonat, 6,5 % Natriumhydrogencarbonat, 4,0 % amorphes Natriumdisilikat, 17 % Natriumcarbonat-peroxohydrat, 4,0 % TAED, 3,0 % Polyacrylat, 1 ,0 % Carboxymethylcellulose, 1 ,0 % Phosphonat, 25 % Natriumsulfat, Rest: optional Schauminhibitoren, optischer Aufheller, Duftstoffe und ggfs. Wasser ad 100%. Bevorzugt beträgt die Dosierung des flüssigen Waschmittels zwischen 6,0 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 6,7 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 9 und pH 11.

Der Weißheitsgrad, d.h. die Aufhellung der Anschmutzungen, wird bevorzugt mit optischen Messverfahren bestimmt, bevorzugt photometrisch. Ein hierfür geeignetes Gerät ist beispielsweise das Spektrometer Minolta CM508d. Üblicherweise werden die für die Messung eingesetzten Geräte zuvor mit einem Weißstandard, bevorzugt einem mitgelieferten Weißstandard, kalibriert.

Durch den aktivitätsgleichen Einsatz wird sichergestellt, dass auch bei einem etwaigen Auseinanderklaffen des Verhältnisses von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften, also beispielsweise die Waschleistung an bestimmten Anschmutzungen, verglichen werden. Generell gilt, dass eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann. Verfahren zur Bestimmung der Proteaseaktivitäten sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie geläufig und werden von ihm routinemäßig angewendet. Beispielsweise sind solche Verfahren offenbart in Tenside, Band 7 (1970), S. 125-132. Die Proteaseaktivität wird vorzugsweise in PE (Protease-Einheiten) angegeben. Beispielsweise geeignete Proteaseaktivitäten betragen 5 oder 10 PE (Protease-Einheiten) pro ml Waschflotte. Die Proteaseaktivität ist jedoch nicht gleich Null.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Mittel dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel ein Waschmittel, Handwaschmittel, Spülmittel, Handgeschirrspülmittel, Maschinengeschirr- spülmittel, Reinigungsmittel, Zahnprothesen- oder Kontaktlinsenpflegemittel, Nachspülmittel, Desinfektionsmittel oder ein Mittel zur Behandlung von Filtermedien, Textilien, Pelzen, Papier, Fellen oder Leder, ist. Bevorzugt ist das Mittel dadurch gekennzeichnet, dass es ein Wäschewaschmittel oder ein Geschirrspülmittel ist.

Hiermit werden alle Arten von Mitteln, insbesondere Gemische, Rezepturen, Lösungen etc., deren Einsetzbarkeit durch Zugabe eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins verbessert wird, in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Es kann sich dabei je nach Einsatzgebiet beispielsweise um feste Gemische, beispielsweise Pulver mit gefriergetrockeneten oder verkapselten Proteinen, oder um gelförmige oder flüssige Mittel handeln. Bevorzugte Rezepturen enthalten beispielsweise Puffersubstanzen, Stabilisatoren, Reaktionspartner und/oder Cofaktoren der Proteasen und/oder andere mit den Proteasen synergistische Inhaltsstoffe. Insbesondere sind darunter Mittel für die weiter unten ausgeführten Einsatzgebiete zu verstehen. Weitere Einsatzgebiete gehen aus dem Stand der Technik hervor und werden beispielsweise in dem Handbuch „Industrial enyzmes and their applications" von H. UhNg, Wiley-Verlag, New York, 1998 dargestellt.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Mittel dadurch gekennzeichnet, dass es ein Waschmittel, Handwaschmittel, Spülmittel, Handgeschirrspülmittel, Maschinengeschirrspülmittel, Reinigungsmittel, Zahnprothesen- oder Kontaktlinsenpflegemittel, Nachspülmittel, Desinfektionsmittel, kosmetisches Mittel, pharmazeutisches Mittel oder ein Mittel zur Behandlung von Filtermedien, Textilien, Pelzen, Papier, Fellen oder Leder, ist.

Diesem Erfindungsgegenstand werden als bevorzugte Ausführungsform Mittel zugerechnet, bei denen es sich um Wasch- oder Reinigungsmittel handelt.

Denn wie in den Ausführungsbeispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt ist, konnte für Wasch- und Reinigungsmitteln mit einer erfindungsgemäß bevorzugten Protease eine Leistungssteigerung gegenüber einem proteasefreien Mittel festgestellt werden und eine sehr gute Reinigungsleistung im Hinblick auf Protease-sensitive Anschmutzungen erreicht werden.

Zu diesem Erfindungsgegenstand zählen alle denkbaren Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Hand-Wäsche beziehungsweise -Reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder; für solche wird nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet.

Ein erfindungsgemäßes Mittel kann sowohl ein Mittel für Großverbraucher oder technische Anwender als auch ein Produkt für den Privatverbraucher sein, wobei alle im Stand der Technik etablierten Wasch- und Reinigungsmittelarten ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen. Dazu gehören beispielsweise Konzentrate und unverdünnt anzuwendende Mittel zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Handwäsche beziehungsweise -reinigung. Ebenso gehören dazu beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Weiterhin gehören dazu beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder; für solche wird nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet.

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle etablierten und/oder alle zweckmäßigen Darreichungsformen. Dazu zählen beispielsweise feste, pulverförmige, flüssige, gelförmige oder pastöse Mittel, die gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen bestehen können sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Einen weiteren Erfindungsgegenstand stellen daher Mittel dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie als Einkomponentensystem vorliegen. Solche Mittel bestehen bevorzugt aus einer Phase. Selbstverständlich können erfindungsgemäße Mittel aber auch aus mehreren Phasen bestehen. Einen weiteren Erfindungsgegenstand bilden daher Mittel, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie in mehrere Komponenten aufgeteilt sind. Zu den erfindungsgemäßen Darreichungsformen zählen ferner Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches, die sowohl in Großgebinden als auch portionsweise abgepackt vorliegen können. Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Mittel dadurch gekennzeichnet, dass es die Protease in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels enthält.

Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel, die als insbesondere pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können außer dem erfindungsgemäß eingesetzten Wirkstoff - einer erfindungsgemäßen Protease - im Prinzip alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist. Die erfindungsgemäßen Mittel können insbesondere Buildersubstanzen, oberflächenaktive Tenside, Bleichmittel auf Basis organischer und/oder anorganischer Persauerstoffverbindungen, Bleichaktivatoren, wassermischbare organische Lösungsmittel, Enzyme, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, pH-Regulatoren und weitere Hilfsstoffe wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Schaumregulatoren sowie Färb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthalten.

Insbesondere eine Kombination einer erfindungsgemäßen Protease mit einem oder mehreren weiteren lnhaltsstoff(en) der Mittel erweist sich als vorteilhaft, da ein solches Mittel eine verbesserte Reinigungsleistung durch sich ergebende Synergismen, insbesondere zwischen der Protease und dem weiteren Inhaltsstoff, aufweist. Dies bedeutet, dass das Mittel eine verbesserte Entfernung von Anschmutzungen, beispielsweise proteinhaltigen Anschmutzungen, bewirkt im Vergleich mit einem Mittel, welches entweder nur eine der beiden Komponenten beinhaltet, oder auch im Vergleich zur erwarteten Reinigungsleistung eines Mittels mit beiden Komponenten auf Grund der bloßen Addition der jeweiligen Einzelbeiträge dieser beiden Komponenten zur Reinigungsleistung des Mittels. Insbesondere durch die Kombination einer erfindungsgemäßen Protease mit einem der nachfolgend beschriebenen Tenside und/oder Buildersubstanzen und/oder Bleichmittel wird ein solcher Synergismus erreicht.

Die erfindungsgemäßen Mittel können ein Tensid oder mehrere Tenside enthalten, wobei insbesondere anionische Tenside, nichtionische Tenside und deren Gemische, aber auch kationische, zwitterionische und amphotere Tenside in Frage kommen.

Geeignete nichtionische Tenside sind insbesondere Alkylglykoside und Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte von Alkylglykosiden oder linearen oder verzweigten Alkoholen mit jeweils 12 bis 18 C-Atomen im Alkylteil und 3 bis 20, vorzugsweise 4 bis 10 Alkylethergruppen. Weiterhin sind entsprechende Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte von N-Alkyl-aminen, vicinalen Diolen, Fettsäureestern und Fettsäureamiden, die hinsichtlich des Alkylteils den genannten langkettigen Alkoholderivaten entsprechen, sowie von Alkylphenolen mit 5 bis 12 C- Atomen im Alkylrest brauchbar.

Als nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise 8 bis 18 C-Atomen und durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid (EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der Alkoholrest linear oder bevorzugt in 2-Stellung methylverzweigt sein kann beziehungsweise lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so wie sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. Insbesondere sind jedoch Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C-Atomen, z.B. aus Kokos-, Palm-, Taigfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8 EO pro Mol Alkohol bevorzugt. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen gehören beispielsweise C₁₂- Ci₄-Alkohole mit 3 EO oder 4 EO, C₉-Ci i-Alkohole mit 7 EO, Ci₃-Ci₅-Alkohole mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, Ci₂-Ci₈-Alkohole mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus Ci₂-Ci₄-Alkohol mit 3 EO und Ci₂-C-ι₈-Alkohol mit 7 EO. Die angegebenen Ethoxylierungsgrade stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können. Bevorzugte Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung auf (narrow ränge ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen nichtionischen Tensiden können auch Fettalkohole mit mehr als 12 EO eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind (TaIg-) Fettalkohole mit 14 EO, 16 EO, 20 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO. Insbesondere in Mitteln für den Einsatz in maschinellen Verfahren werden üblicherweise extrem schaumarme Verbindungen eingesetzt. Hierzu zählen vorzugsweise C₁₂-C₁₈-Alkylpolyethylenglykol- polypropylenglykolether mit jeweils bei zu 8 Mol Ethylenoxid- und Propylenoxideinheiten im Molekül. Man kann aber auch andere bekannt schaumarme nichtionische Tenside verwenden, wie zum Beispiel C₁₂-C₁₈-Alkylpolyethylenglykol-polybutylenglykolether mit jeweils bis zu 8 Mol Ethylenoxid- und Butylenoxideinheiten im Molekül sowie endgruppenverschlossene Alkylpolyalkylenglykol- mischether. Besonders bevorzugt sind auch die hydroxylgruppenhaltigen alkoxylierten Alkohole, wie sie in der europäischen Patentanmeldung EP 0 300 305 beschrieben sind, sogenannte Hydroxymischether. Zu den nichtionischen Tensiden zählen auch Alkylglykoside der allgemeinen Formel RO(G)_x eingesetzt werden, in der R einen primären geradkettigen oder methylverzweigten, insbesondere in 2-Stellung methylverzweigten aliphatischen Rest mit 8 bis 22, vorzugsweise 12 bis 18 C-Atomen bedeutet und G für eine Glykoseeinheit mit 5 oder 6 C-Atomen, vorzugsweise für Glucose, steht. Der Oligomerisierungsgrad x, der die Verteilung von Monoglykosiden und Oligoglykosiden angibt, ist eine beliebige Zahl - die als analytisch zu bestimmende Größe auch gebrochene Werte annehmen kann - zwischen 1 und 10; vorzugsweise liegt x bei 1 ,2 bis 1 ,4. Ebenfalls geeignet sind Polyhydroxyfettsäureamide der Formel (IM), in der R¹CO für einen aliphatischen Acylrest mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, R² für Wasserstoff, einen Alkyl- oder Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und [Z] für einen linearen oder verzweigten Polyhydroxyalkylrest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen und 3 bis 10 Hydroxylgruppen steht:

R^z

R¹-CO-N-[Z] (III)

Vorzugsweise leiten sich die Polyhydroxyfettsäureamide von reduzierenden Zuckern mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere von der Glucose ab. Zur Gruppe der Polyhydroxyfettsäureamide gehören auch Verbindungen der Formel (IV),

R⁴-O-R⁵

(IV)

R³-CO-N-[Z]

in der R³ für einen linearen oder verzweigten Alkyl- oder Alkenylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, R⁴ für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylenrest oder einen Arylenrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen und R⁵ für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest oder einen Oxy-Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht, wobei d-C₄-Alkyl- oder Phenylreste bevorzugt sind, und [Z] für einen linearen Polyhydroxyalkylrest, dessen Alkylkette mit mindestens zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, oder alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder propoxylierte Derivate dieses Restes steht. [Z] wird auch hier vorzugsweise durch reduktive Aminierung eines Zuckers wie Glucose, Fructose, Maltose, Lactose, Galactose, Mannose oder Xylose erhalten. Die N-Alkoxy- oder N-Aryloxy-substituierten Verbindungen können dann beispielsweise durch Umsetzung mit Fettsäuremethylestern in Gegenwart eines Alkoxids als Katalysator in die gewünschten Polyhydroxyfettsäureamide überführt werden. Eine weitere Klasse bevorzugt eingesetzter nichtionischer Tenside, die entweder als alleiniges nichtionisches Tensid oder in Kombination mit anderen nichtionischen Tensiden, insbesondere zusammen mit alkoxylierten Fettalkoholen und/oder Alkylglykosiden, eingesetzt werden, sind alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder ethoxylierte und propoxylierte Fettsäurealkylester, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, insbesondere Fettsäuremethylester. Auch nichtionische Tenside vom Typ der Aminoxide, beispielsweise N-Kokosalkyl-N,N-dimethylaminoxid und N-Talgalkyl-N,N-dihydroxyethylaminoxid, und der Fettsäurealkanolamide können geeignet sein. Die Menge dieser nichtionischen Tenside beträgt vorzugsweise nicht mehr als die der ethoxylierten Fettalkohole, insbesondere nicht mehr als die Hälfte davon. Als weitere Tenside kommen sogenannte Gemini-Tenside in Betracht. Hierunter werden im Allgemeinen solche Verbindungen verstanden, die zwei hydrophile Gruppen pro Molekül besitzen. Diese Gruppen sind in der Regel durch einen sogenannten "Spacer" voneinander getrennt. Dieser Spacer ist in der Regel eine Kohlenstoffkette, die lang genug sein sollte, dass die hydrophilen Gruppen einen ausreichenden Abstand haben, damit sie unabhängig voneinander agieren können. Derartige Tenside zeichnen sich im Allgemeinen durch eine ungewöhnlich geringe kritische Micellkonzentration und die Fähigkeit, die Oberflächenspannung des Wassers stark zu reduzieren, aus. In Ausnahmefällen werden unter dem Ausdruck Gemini-Tenside nicht nur derartig "dimere", sondern auch entsprechend "trimere" Tenside verstanden. Geeignete Gemini-Tenside sind beispielsweise sulfatierte Hydroxymischether oder Dimeralkohol-bis- und Trimeralkohol-tris-sulfate und -ethersulfate. Endgruppenverschlossene dimere und trimere Mischether zeichnen sich insbesondere durch ihre Bi- und M u Itif u nktional ität aus. So besitzen die genannten endgruppenverschlossenen Tenside gute Netzeigenschaften und sind dabei schaumarm, so dass sie sich insbesondere für den Einsatz in maschinellen Wasch- oder Reinigungsverfahren eignen. Eingesetzt werden können aber auch Gemini-Polyhydroxyfettsäureamide oder Poly-Polyhydroxy- fettsäureamide. Geeignet sind auch die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid ethoxylierten geradkettigen oder verzweigten C₇-C₂i-Alkohole, wie 2-Methylverzweigte C₉-Cn- Alkohole mit im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder Ci₂-Ci₈-Fettalkohole mit 1 bis 4 EO. Zu den bevorzugten Aniontensiden gehören auch die Salze der Alkylsulfobernsteinsäure, die auch als Sulfosuccinate oder als Sulfobernsteinsäureester bezeichnet werden, und die Monoester und/oder Diester der Sulfobernsteinsäure mit Alkoholen, vorzugsweise Fettalkoholen und insbesondere ethoxylierten Fettalkoholen darstellen. Bevorzugte Sulfosuccinate enthalten C₈- bis Ci₈- Fettalkoholreste oder Mischungen aus diesen. Insbesondere bevorzugte Sulfosuccinate enthalten einen Fettalkoholrest, der sich von ethoxylierten Fettalkoholen ableitet, die für sich betrachtet nichtionische Tenside darstellen. Dabei sind wiederum Sulfosuccinate, deren Fettalkohol-Reste sich von ethoxylierten Fettalkoholen mit eingeengter Homologenverteilung ableiten, besonders bevorzugt. Ebenso ist es auch möglich, Alk(en)ylbernsteinsäure mit vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatomen in der AI k(en)yl kette oder deren Salze einzusetzen. Als weitere anionische Tenside kommen Fettsäure-Derivate von Aminosäuren, beispielsweise von N-Methyltaurin (Tauride) und/oder von N-Methylglycin (Sarkoside) in Betracht. Insbesondere bevorzugt sind dabei die Sarkoside beziehungsweise die Sarkosinate und hier vor allem Sarkosinate von höheren und gegebenenfalls einfach oder mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie Oleylsarkosinat. Als weitere anionische Tenside kommen insbesondere Seifen in Betracht. Geeignet sind insbesondere gesättigte Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, hydrierten Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere aus natürlichen Fettsäuren, zum Beispiel Kokos-, Palmkern- oder Taigfettsäuren, abgeleitete Seifengemische. Zusammen mit diesen Seifen oder als Ersatzmittel für Seifen können auch die bekannten Alkenylbernsteinsäuresalze eingesetzt werden.

Die anionischen Tenside, einschließlich der Seifen, können in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze sowie als lösliche Salze organischer Basen, wie Mono-, Di- oder Triethanolamin, vorliegen. Vorzugsweise liegen die anionischen Tenside in Form ihrer Natrium- oder Kaliumsalze, insbesondere in Form der Natriumsalze vor.

Tenside sind in erfindungsgemäßen Mitteln in Mengenanteilen von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von 8 Gew.-% bis 30 Gew.-%, enthalten.

Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält vorzugsweise mindestens einen wasserlöslichen und/oder wasserunlöslichen, organischen und/oder anorganischen Builder. Zu den wasserlöslichen organischen Buildersubstanzen gehören Polycarbonsäuren, insbesondere Citronensäure und Zuckersäuren, monomere und polymere Aminopolycarbonsäuren, insbesondere Methylglycin- diessigsäure, Nitrilotriessigsäure und Ethylendiamintetraessigsäure sowie Polyasparaginsäure, Polyphosphonsäuren, insbesondere Aminotris(methylenphosphonsäure), Ethylendiamintetra- kis(methylenphosphonsäure) und 1-Hydroxyethan-1 ,1-diphosphonsäure, polymere Hydroxy- verbindungen wie Dextrin sowie polymere (Poly-)carbonsäuren, insbesondere die durch Oxidation von Polysacchariden beziehungsweise Dextrinen zugänglichen Polycarboxylate, polymere Acryl- säuren, Methacrylsäuren, Maleinsäuren und Mischpolymere aus diesen, die auch geringe Anteile polymerisierbarer Substanzen ohne Carbonsäurefunktionalität einpolymerisiert enthalten können. Die relative Molekülmasse der Homopolymeren ungesättiger Carbonsäuren liegt im allgemeinen zwischen 3 000 und 200 000, die der Copolymeren zwischen 2 000 und 200 000, vorzugsweise 30 000 bis 120 000, jeweils bezogen auf freie Säure. Ein besonders bevorzugtes Acrylsäure- Maleinsäure-Copolymer weist eine relative Molekülmasse von 30 000 bis 100 000 auf. Handelsübliche Produkte sind zum Beispiel Sokalan® CP 5, CP 10 und PA 30 der Firma BASF. Geeignete, wenn auch weniger bevorzugte Verbindungen dieser Klasse sind Copolymere der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Vinylethern, wie Vinylmethylethern, Vinylester, Ethylen, Propy- len und Styrol, in denen der Anteil der Säure mindestens 50 Gew.-% beträgt. Als wasserlösliche organische Buildersubstanzen können auch Terpolymere eingesetzt werden, die als Monomere zwei ungesättigte Säuren und/oder deren Salze sowie als drittes Monomer Vinylalkohol und/oder einem veresterten Vinylalkohol oder ein Kohlenhydrat enthalten. Das erste saure Monomer bezie- hungsweise dessen Salz leitet sich von einer monoethylenisch ungesättigten C₃-C₈-Carbonsäure und vorzugsweise von einer C₃-C₄-Monocarbonsäure, insbesondere von (Meth)-acrylsäure ab. Das zweite saure Monomer beziehungsweise dessen Salz kann ein Derivat einer C₄-C₈-Dicarbonsäure, wobei Maleinsäure besonders bevorzugt ist, und/oder ein Derivat einer Allylsulfonsäure, die in 2- Stellung mit einem Alkyl- oder Arylrest substituiert ist, sein. Derartige Polymere weisen im Allgemeinen eine relative Molekülmasse zwischen 1 000 und 200 000 auf. Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die als Monomere vorzugsweise Acrolein und Acrylsäure/Acrylsäuresalze beziehungsweise Vinylacetat aufweisen. Die organischen Buildersubstanzen können, insbesondere zur Herstellung flüssiger Mittel, in Form wäßriger Lösungen, vorzugsweise in Form 30- bis 50- gewichtsprozentiger wäßriger Lösungen eingesetzt werden. Alle genannten Säuren werden in der Regel in Form ihrer wasserlöslichen Salze, insbesondere ihre Alkalisalze, eingesetzt.

Derartige organische Buildersubstanzen können gewünschtenfalls in Mengen bis zu 40 Gew.-%, insbesondere bis zu 25 Gew.-% und vorzugsweise von 1 Gew.-% bis 8 Gew.-% enthalten sein. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in pastenförmigen oder flüssigen, insbesondere wasserhaltigen, erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt.

Als wasserlösliche anorganische Buildermaterialien kommen insbesondere Alkalisilikate, Alkalicarbonate und Alkaliphosphate, die in Form ihrer alkalischen, neutralen oder sauren Natriumoder Kaliumsalze vorliegen können, in Betracht. Beispiele hierfür sind Trinatriumphosphat, Tetra- natriumdiphosphat, Dinatriumdihydrogendiphosphat, Pentanatriumtriphosphat, sogenanntes Natriumhexametaphosphat, oligomeres Trinatriumphosphat mit Oligomerisierungsgraden von 5 bis 1000, insbesondere 5 bis 50, sowie die entsprechenden Kaliumsalze beziehungsweise Gemische aus Natrium- und Kaliumsalzen. Als wasserunlösliche, wasserdispergierbare anorganische Buildermaterialien werden insbesondere kristalline oder amorphe Alkalialumosilikate, in Mengen von bis zu 50 Gew.-%, vorzugsweise nicht über 40 Gew.-% und in flüssigen Mitteln insbesondere von 1 Gew.-% bis 5 Gew.-%, eingesetzt. Unter diesen sind die kristallinen Natriumalumosilikate in Waschmittelqualität, insbesondere Zeolith A, P und gegebenenfalls X, allein oder in Mischungen, beispielsweise in Form eines Co-Kristallisats aus den Zeolithen A und X (Vegobond® AX, ein Handelsprodukt der Condea Augusta S.p.A.), bevorzugt. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in festen, teilchenförmigen Mitteln eingesetzt. Geeignete Alumosilikate weisen insbesondere keine Teilchen mit einer Korngröße über 30 μm auf und bestehen vorzugsweise zu wenigstens 80 Gew.-% aus Teilchen mit einer Größe unter 10 μm. Ihr Calcium- bindevermögen, das nach den Angaben der deutschen Patentschrift DE 24 12 837 bestimmt werden kann, liegt in der Regel im Bereich von 100 bis 200 mg CaO pro Gramm.

Geeignete Substitute beziehungsweise Teilsubstitute für das genannte Alumosilikat sind kristalline Alkalisilikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können. Die in den erfindungsgemäßen Mitteln als Gerüststoffe brauchbaren Alkalisilikate weisen vorzugsweise ein molares Verhältnis von Alkalioxid zu SiO₂ unter 0,95, insbesondere von 1 :1 ,1 bis 1 :12 auf und können amorph oder kristallin vorliegen. Bevorzugte Alkalisilikate sind die Natriumsilikate, insbesondere die amorphen Natriumsilikate, mit einem molaren Verhältnis Na₂O:SiO₂ von 1 :2 bis 1 :2,8. Als kristalline Silikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können, werden vorzugsweise kristalline Schichtsilikate der allgemeinen Formel Na₂Si_xO_2x+1 y H₂O eingesetzt, in der x, das sogenannte Modul, eine Zahl von 1 ,9 bis 22, insbesondere 1 ,9 bis 4 und y eine Zahl von 0 bis 33 ist und bevorzugte Werte für x 2, 3 oder 4 sind. Bevorzugte kristalline Schichtsilikate sind solche, bei denen x in der genannten allgemeinen Formel die Werte 2 oder 3 annimmt. Insbesondere sind sowohl ß- als auch δ-Natriumdisilikate (Na₂Si₂O₅ y H₂O) bevorzugt. Auch aus amorphen Alkalisilikaten hergestellte, praktisch wasserfreie kristalline Alkalisilikate der obengenannten allgemeinen Formel, in der x eine Zahl von 1 ,9 bis 2,1 bedeutet, können in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel wird ein kristallines Natriumschichtsilikat mit einem Modul von 2 bis 3 eingesetzt, wie es aus Sand und Soda hergestellt werden kann. Kristalline Natriumsilikate mit einem Modul im Bereich von 1 ,9 bis 3,5 werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel eingesetzt. Kristalline schichtförmige Silikate der oben angegebenen Formel (I) werden von der Fa. Clariant GmbH unter dem Handelsnamen Na-SKS vertrieben, z.B. Na-SKS-1 (Na₂Si₂₂O₄₅XH₂O, Kenyait), Na-SKS-2 (Na₂Si₁₄O₂₉XH₂O, Magadiit), Na-SKS-3 (Na₂Si₈O₁₇XH₂O) oder Na-SKS-4 (Na₂Si₄O₉XH₂O, Makatit). Von diesen eignen sich vor allem Na- SKS-5 (OC-Na₂Si₂O₅), Na-SKS-7 (ß-Na₂Si₂0₅, Natrosilit), Na-SKS-9 (NaHSi₂O₅3H₂O), Na-SKS-10 (NaHSi₂O₅3H₂O, Kanemit), Na-SKS-11 (t-Na₂Si₂0₅) und Na-SKS-13 (NaHSi₂O₅), insbesondere aber Na-SKS-6 (5-Na₂Si₂O₅). In einer bevorzugten Ausgestaltung erfindungsgemäßer Mittel setzt man ein granuläres Compound aus kristallinem Schichtsilikat und Citrat, aus kristallinem Schichtsilikat und oben genannter (co-)polymerer Polycarbonsäure, oder aus Alkalisilikat und Alkalicarbonat ein, wie es beispielsweise unter dem Namen Nabion® 15 im Handel erhältlich ist.

Buildersubstanzen sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise in Mengen bis zu 75 Gew.-%, insbesondere 5 Gew.-% bis 50 enthalten.

Als für den Einsatz in erfindungsgemäßen Mitteln geeignete Persauerstoffverbindungen kommen insbesondere organische Persäuren beziehungsweise persaure Salze organischer Säuren, wie Phthalimidopercapronsäure, Perbenzoesäure oder Salze der Diperdodecandisäure, Wasserstoffperoxid und unter den Waschbedingungen Wasserstoffperoxid abgebende anorganische Salze, zu denen Perborat, Percarbonat, Persilikat und/oder Persulfat wie Caroat gehören, in Betracht. Sofern feste Persauerstoffverbindungen eingesetzt werden sollen, können diese in Form von Pulvern oder Granulaten verwendet werden, die auch in im Prinzip bekannter Weise umhüllt sein können. Falls ein erfindungsgemäßes Mittel Persauerstoffverbindungen enthält, sind diese in Mengen von vor- zugsweise bis zu 50 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 30 Gew.-%, vorhanden. Der Zusatz geringer Mengen bekannter Bleichmittelstabilisatoren wie beispielsweise von Phosphonaten, Boraten beziehungsweise Metaboraten und Metasilikaten sowie Magnesiumsalzen wie Magnesiumsulfat kann zweckdienlich sein.

Als Bleichaktivatoren können Verbindungen, die unter Perhydrolysebedingungen aliphatische Peroxocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder gegebenenfalls substituierte Perbenzoesäure ergeben, eingesetzt werden. Geeignet sind Substanzen, die O- und/oder N-Acylgruppen der genannten C-Atomzahl und/oder gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppen tragen. Bevorzugt sind mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere Tetraacetylethylendiamin (TAED), acylierte Triazinderivate, insbesondere 1 ,5- Diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1 ,3,5-triazin (DADHT), acylierte Glykolurile, insbesondere Tetraacetylglykoluril (TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoylsuccinimid (NOSI), acylierte Phenolsulfonate, insbesondere n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- bzw. iso- NOBS), Carbonsäureanhydride, insbesondere Phthalsäureanhydrid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere Triacetin, Ethylenglykoldiacetat, 2,5-Diacetoxy-2,5-dihydrofuran und Enolester sowie acetyliertes Sorbitol und Mannitol beziehungsweise deren beschriebene Mischungen (SORMAN), acylierte Zuckerderivate, insbesondere Pentaacetylglukose (PAG), Pentaacetylfruktose, Tetraacetylxylose und Octaacetyllactose sowie acetyliertes, gegebenenfalls N-alkyliertes Glucamin und Gluconolacton, und/oder N-acylierte Lactame, beispielsweise N- Benzoylcaprolactam. Die hydrophil substituierten Acylacetale und die Acyllactame werden ebenfalls bevorzugt eingesetzt. Auch Kombinationen konventioneller Bleichaktivatoren können eingesetzt werden. Derartige Bleichaktivatoren können, insbesondere bei Anwesenheit obengenannter Wasserstoffperoxid-Iiefernder Bleichmittel, im üblichen Mengenbereich, vorzugsweise in Mengen von 0,5 Gew.-% bis 10 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis 8 Gew.-%, bezogen auf gesamtes Mittel, enthalten sein, fehlen bei Einsatz von Percarbonsäure als alleinigem Bleichmittel jedoch vorzugsweise ganz.

Zusätzlich zu den konventionellen Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können auch Sulfonimine und/oder bleichverstärkende Übergangsmetallsalze beziehungsweise Übergangsmetallkomplexe als sogenannte Bleichkatalysatoren enthalten sein.

Zu den in den erfindungsgemäßen Mitteln, insbesondere wenn sie in flüssiger oder pastöser Form vorliegen, neben Wasser verwendbaren organischen Lösungsmitteln gehören Alkohole mit 1 bis 4 C-Atomen, insbesondere Methanol, Ethanol, Isopropanol und tert.-Butanol, Diole mit 2 bis 4 C-Atomen, insbesondere Ethylenglykol und Propylenglykol, sowie deren Gemische und die aus den genannten Verbindungsklassen ableitbaren Ether. Derartige wassermischbare Lösungsmittel sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise in Mengen nicht über 30 Gew.-%, insbesondere von 6 Gew.-% bis 20 Gew.-%, vorhanden.

Zur Einstellung eines gewünschten, sich durch die Mischung der übrigen Komponenten nicht von selbst ergebenden pH-Werts können die erfindungsgemäßen Mittel System- und umweltverträgliche Säuren, insbesondere Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure und/oder Adipinsäure, aber auch Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure, oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide, enthalten. Derartige pH-Regulatoren sind in den erfindungsgemäßen Mitteln in Mengen von vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1 ,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%, enthalten.

Vergrauungsinhibitoren haben die Aufgabe, den von der Textilfaser abgelösten Schmutz in der Flotte suspendiert zu halten. Hierzu sind wasserlösliche Kolloide meist organischer Natur geeignet, beispielsweise Stärke, Leim, Gelatine, Salze von Ethercarbonsäuren oder Ethersulfonsäuren der Stärke oder der Cellulose oder Salze von sauren Schwefelsäureestern der Cellulose oder der Stärke. Auch wasserlösliche, saure Gruppen enthaltende Polyamide sind für diesen Zweck geeignet. Weiterhin lassen sich andere als die obengenannten Stärkederivate verwenden, zum Beispiel Aldehydstärken. Bevorzugt werden Celluloseether, wie Carboxymethylcellulose (Na-SaIz), Methylcellulose, Hydroxyalkylcellulose und Mischether, wie Methylhydroxyethylcellulose, Methyl- hydroxypropylcellulose, Methylcarboxymethylcellulose und deren Gemische, beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Mittel, eingesetzt.

Erfindungsgemäße Textilwaschmittel können als optische Aufheller beispielsweise Derivate der Diaminostilbendisulfonsäure beziehungsweise deren Alkalimetallsalze enthalten, obgleich sie für den Einsatz als Colorwaschmittel vorzugsweise frei von optischen Aufhellern sind. Geeignet sind zum Beispiel Salze der 4,4'-Bis(2-anilino-4-morpholino-1 ,3,5-triazinyl-6-amino)stilben-2,2'- disulfonsäure oder gleichartig aufgebaute Verbindungen, die anstelle der Morpholino-Gruppe eine Diethanolaminogruppe, eine Methylaminogruppe, eine Anilinogruppe oder eine 2- Methoxyethylaminogruppe tragen. Weiterhin können Aufheller vom Typ der substituierten Diphenylstyryle anwesend sein, zum Beispiel die Alkalisalze des 4,4'-Bis(2-sulfostyryl)-diphenyls, 4,4'-Bis(4-chlor-3-sulfostyryl)-diphenyls, oder 4-(4-Chlorstyryl)-4'-(2-sulfostyryl)-diphenyls. Auch Gemische der vorgenannten optischen Aufheller können verwendet werden.

Insbesondere beim Einsatz in maschinellen Verfahren kann es von Vorteil sein, den Mitteln übliche Schauminhibitoren zuzusetzen. Als Schauminhibitoren eignen sich beispielsweise Seifen natürlicher oder synthetischer Herkunft, die einen hohen Anteil an C₁₈-C₂₄-Fettsäuren aufweisen. Geeignete nichttensidartige Schauminhibitoren sind beispielsweise Organopolysiloxane und deren Gemische mit mikrofeiner, gegebenenfalls silanierter Kieselsäure sowie Paraffine, Wachse, Mikrokristallinwachse und deren Gemische mit silanierter Kieselsäure oder Bisfettsäurealkylendiamiden. Mit Vorteilen werden auch Gemische aus verschiedenen Schauminhibitoren verwendet, zum Beispiel solche aus Silikonen, Paraffinen oder Wachsen. Vorzugsweise sind die Schauminhibitoren, insbesondere Silikon- und/oder Paraffin-haltige Schauminhibitoren, an eine granuläre, in Wasser lösliche beziehungsweise dispergierbare Trägersubstanz gebunden. Insbesondere sind dabei Mischungen aus Paraffinen und Bistearylethylendiamid bevorzugt.

Die zu wählenden Inhaltsstoffe wie auch die Bedingungen, unter denen das Mittel eingesetzt wird, wie beispielsweise Temperatur, pH-Wert, lonenstärke, Redox-Verhältnisse oder mechanische Einflüsse, sollten für das jeweilige Reinigungsproblem optimiert sein. So liegen übliche Temperaturen für Wasch- und Reinigungsmittel in Bereichen von 1O⁰C bei manuellen Mitteln über 4O⁰C und 6O⁰C bis hin zu 95° bei maschinellen Mitteln oder bei technischen Anwendungen. Da bei modernen Wasch- und Spülmaschinen die Temperatur meist stufenlos einstellbar ist, sind auch alle Zwischenstufen der Temperatur eingeschlossen. Vorzugsweise werden die Inhaltsstoffe der betreffenden Mittel aufeinander abgestimmt. Bevorzugt sind Synergien hinsichtlich der Reinigungsleistung. Besonders bevorzugt diesbezüglich sind Synergien, die in einem Temperaturbereich zwischen 2O⁰C und 6O⁰C vorhanden sind, da auch die in den erfindungsgemäßen Mitteln enthaltene Protease in diesem Temperaturbereich katalytisch aktiv ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Mittel, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, ferner

- 5 Gew.-% bis 70 Gew.-%, insbesondere 5 Gew.-% bis 30 Gew.-% Tenside und/oder

- 10 Gew.-% bis 65 Gew.-%, insbesondere 12 Gew.-% bis 60 Gew. -% wasserlösliches oder wasserdispergierbares anorganisches Buildermaterial und/oder

- 0,5 Gew.-% bis 10 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis 8 Gew.-%, wasserlösliche organische Buildersubstanzen und/oder

- 0,01 bis 15 Gew.-% feste anorganische und/oder organische Säuren beziehungsweise saure Salze und/oder

- 0,01 bis 5 Gew.-% Komplexbildner für Schwermetalle und/oder

- 0,01 bis 5 Gew.-% Vergrauungsinhibitor und/oder

- 0,01 bis 5 Gew. -% Farbübertragungsinhibitor und/oder

- 0,01 bis 5 Gew.-% Schauminhibitor.

Optional kann das Mittel ferner optische Aufheller umfassen, bevorzugt von 0,01 bis 5 Gew-%. Die Herstellung erfindungsgemäßer fester Mittel bietet keine Schwierigkeiten und kann auf bekannte Weise, zum Beispiel durch Sprühtrocknen oder Granulation, erfolgen, wobei Enzyme und eventuelle weitere thermisch empfindliche Inhaltsstoffe wie zum Beispiel Bleichmittel gegebenenfalls später separat zugesetzt werden. Zur Herstellung erfindungsgemäßer Mittel mit erhöhtem Schüttgewicht, insbesondere im Bereich von 650 g/l bis 950 g/l, ist ein einen Extrusionschritt aufweisendes Verfahren bevorzugt.

Zur Herstellung von erfindungsgemäßen Mitteln in Tablettenform, die einphasig oder mehrphasig, einfarbig oder mehrfarbig und insbesondere aus einer Schicht oder aus mehreren, insbesondere aus zwei Schichten bestehen können, geht man vorzugsweise derart vor, dass man alle Bestandteile - gegebenenfalls je einer Schicht - in einem Mischer miteinander vermischt und das Gemisch mittels herkömmlicher Tablettenpressen, beispielsweise Exzenterpressen oder Rundläuferpressen, mit Preßkräften im Bereich von etwa 50 bis 100 kN, vorzugsweise bei 60 bis 70 kN verpreßt. Insbesondere bei mehrschichtigen Tabletten kann es von Vorteil sein, wenn mindestens eine Schicht vorverpreßt wird. Dies wird vorzugsweise bei Preßkräften zwischen 5 und 20 kN, insbesondere bei 10 bis 15 kN durchgeführt. Man erhält so problemlos bruchfeste und dennoch unter Anwendungsbedingungen ausreichend schnell lösliche Tabletten mit Bruch- und Biegefestigkeiten von normalerweise 100 bis 200 N, bevorzugt jedoch über 150 N. Vorzugsweise weist eine derart hergestellte Tablette ein Gewicht von 10 g bis 50 g, insbesondere von 15 g bis 40 g auf. Die Raumform der Tabletten ist beliebig und kann rund, oval oder eckig sein, wobei auch Zwischenformen möglich sind. Ecken und Kanten sind vorteilhafterweise abgerundet. Runde Tabletten weisen vorzugsweise einen Durchmesser von 30 mm bis 40 mm auf. Insbesondere die Größe von eckig oder quaderförmig gestalteten Tabletten, welche überwiegend über die Dosiervorrichtung beispielsweise der Geschirrspülmaschine eingebracht werden, ist abhängig von der Geometrie und dem Volumen dieser Dosiervorrichtung. Beispielhaft bevorzugte Ausführungsformen weisen eine Grundfläche von (20 bis 30 mm) x (34 bis 40 mm), insbesondere von 26x36 mm oder von 24x38 mm auf.

Flüssige beziehungsweise pastöse erfindungsgemäße Mittel in Form von übliche Lösungsmittel enthaltenden Lösungen werden in der Regel durch einfaches Mischen der Inhaltsstoffe, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer gegeben werden können, hergestellt.

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen somit alle derartigen festen, pulverförmigen, flüssigen, gelförmigen oder pastösen Darreichungsformen der Mittel, die gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen bestehen können sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellen daher Mittel dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie als Einkomponentensystem vorliegen. Solche Mittel bestehen bevorzugt aus einer Phase. Selbstverständlich können erfindungsgemäße Mittel aber auch aus mehreren Phasen bestehen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel daher dadurch gekennzeichnet sind, dass es in mehrere Komponenten aufgeteilt ist.

Zu den erfindungsgemäßen festen Darreichungsformen zählen ferner Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches, die sowohl in Großgebinden als auch portionsweise abgepackt vorliegen können. Alternativ liegt das Mittel als rieselfähiges Pulver vor, insbesondere mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l oder 600 g/l bis 850 g/l.

Ferner können erfindungsgemäße Mittel auch flüssig, gelförmig oder pastös sein. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist daher dadurch gekennzeichnet, dass das Wasch- oder Reinigungsmittel in flüssiger, gelförmiger oder pastöser Form vorliegt, insbesondere in Form eines nicht-wäßrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wäßrigen Paste oder in Form eines wäßrigen Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste.

Das erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel kann in einem Behältnis, vorzugsweise einem luftdurchlässigen Behältnis, verpackt sein, aus dem es kurz vor Gebrauch oder während des Waschvorgangs freigesetzt wird. Insbesondere kann ferner die in dem Mittel enthaltene Protease und/oder weitere Inhaltsstoffe des Mittels mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für das Enzym undurchlässigen Substanz umhüllt sein, welche unter Anwendungsbedingungen des Mittels durchlässig für das Enzym wird. Eine solche Ausführungsform der Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet, dass die Protease mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für die Protease undurchlässigen Substanz umhüllt ist.

Erfindungsgemäße Mittel können ausschließlich eine Protease enthalten. Alternativ können sie auch weitere Proteasen oder andere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration enthalten. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen, wobei prinzipiell alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar sind. Als weitere Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere Proteasen, Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Mannanasen, Tannasen, Xylanasen, Xanthanasen, ß-Glucosidasen, Carrageenasen, Oxidasen, Oxidoreduktasen oder Lipasen, sowie vorzugsweise deren Gemische. Diese Enzyme sind im Prinzip natürlichen Ursprungs; ausgehend von den natürlichen Molekülen stehen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Varianten zur Verfügung, die entsprechend bevorzugt eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Mittel enthalten Enzyme vorzugsweise in Gesamtmengen von 1 x 10^~8 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein. Bevorzugt sind die Enzyme von 0,001 bis 5 Gew.-%, weiter bevorzugt von 0,01 bis 5 Gew.-%, noch weiter bevorzugt von 0,05 bis 4 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,075 bis 3,5 Gew.-% in erfindungsgemäßen Mitteln enthalten, wobei jedes enthaltene Enzym in den genannten Mengenverhältnissen vorliegen kann.

Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M. M. David, J. Biol. Chem., X]l_ (1948), S. 751-766) bestimmt werden. Besonders bevorzugt unterstützen die weiteren Enzyme die Wirkung des Mittels, beispielsweise die Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels, hinsichtlich bestimmter Anschmutzungen oder Flecken. Besonders bevorzugt zeigen die Enzyme synergistische Effekte hinsichtlich ihrer Wirkung gegenüber bestimmter Anschmutzungen oder Flecken, d.h. die in der Mittelzusammensetzung enthaltenen Enzyme unterstützen sich in ihrer Reinigungsleistung gegenseitig. Synergistische Effekte können nicht nur zwischen verschiedenen Enzymen, sondern auch zwischen einem oder mehreren Enzymen und weiteren Inhaltsstoffen des erfindungsgemäßen Mittels auftreten. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße Mittel somit dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein weiteres Enzym enthält, welches eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, ß-Glucosidase, Carrageenase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase ist.

Die in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzten Enzyme stammen entweder ursprünglich aus Mikroorganismen, etwa der Gattungen Bacillus, Streptomyces, Humicola, oder Pseudomonas, und/oder werden nach an sich bekannten biotechnologischen Verfahren durch geeignete Mikroorganismen produziert, beispielsweise durch transgene Expressionswirte der Gattungen Bacillus oder durch filamentöse Fungi.

Die Proteaseaktivität in derartigen Mitteln kann nach der in Tenside, Band 7 (1970), S. 125-132, beschriebenen Methode ermittelt werden. Sie wird dementsprechend in PE (Protease-Einheiten) angegeben.

Bei dem Vergleich der Leistungen zweier Waschmittelenzyme, wie etwa in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung, muß zwischen proteingleichem und aktivitätsgleichem Einsatz unterschieden werden. Insbesondere bei gentechnisch erhaltenen, weitgehend neben- aktivitätsfreien Präparationen ist der proteingleiche Einsatz angebracht. Denn damit ist eine Aussage darüber möglich, ob dieselben Proteinmengen - als Maß für den Ertrag der fermentativen Produktion - zu vergleichbaren Ergebnissen führen. Klaffen die jeweiligen Verhältnisse von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) auseinander, so ist ein aktivitätsgleicher Vergleich zu empfehlen, weil hierüber die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften verglichen werden. Generell gilt, daß eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann. Hierbei handelt es sich letztlich um eine ökonomische Erwägung.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines oben beschriebenen erfindungsgemäßen Mittels zur Entfernung von protease-sensitiven Anschmutzungen auf Textilien oder harten Oberflächen, d.h. zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, dar.

Denn erfindungsgemäße Mittel können, insbesondere entsprechend den oben beschriebenen Eigenschaften, dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen proteinhaltige Verunreinigungen zu beseitigen. Ausführungsformen stellen beispielsweise die Handwäsche, die manuelle Entfernung von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen oder die Verwendung im Zusammenhang mit einem maschinellen Verfahren dar.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung werden die betreffenden erfindungsgemäßen Mittel, vorzugsweise Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittel, nach einer der oben ausgeführten Ausführungsform bereitgestellt.

Einen weiteren eigenen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar, bei denen wenigstens in einem der Verfahrensschritte ein erfindungsgemäßes Mittel verwendet wird. Das Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen ist demnach dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein erfindungsgemäßes Mittel angewendet ist.

Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren aufgrund ihrer präziseren Steuerbarkeit, was beispielsweise die eingesetzten Mengen und Einwirkzeiten angeht, bevorzugt sind.

Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung dieses Mittels behandelt wird. Das gleiche gilt für Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, welche unter dem Begriff harte Oberflächen zusammengefasst werden. Alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um ein erfindungsgemäßes Mittel bereichert werden, und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform solcher Verfahren werden die betreffenden erfindungsgemäßen Enzyme im Rahmen einer der oben ausgeführten Rezepturen für erfindungsgemäße Mittel, vorzugsweise erfindungsgemäße Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittel, bereitgestellt.

Da bevorzugte erfindungsgemäße Enzyme natürlicherweise bereits eine proteinauflösende Aktivität besitzen und diese auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen, wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner Teilschritt eines solchen Verfahrens zur maschinellen Reinigung von Textilien darin bestehen, daß gewünschtenfalls neben stabilisierenden Verbindungen, Salzen oder Puffersubstanzen als einzige reinigungsaktive Komponente ein erfindungsgemäßes Enzym aufgebracht wird. Dies stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.

Wie vorstehend bereits erläutert besteht eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, Protease-Enzyme bereitzustellen, die für den Einsatz in erfindungsgemäßen Mitteln geeignet sind und sich durch eine durch eine gute, bevorzugt durch eine verbesserte proteolytische Aktivität in Bezug auf zumindest eine Anschmutzung, vorzugsweise in Bezug auf mehrere Anschmutzungen, in dem vorstehend genannten Temperaturbereich auszeichnen, wenn sie in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt sind. Gelöst wird diese Aufgabe durch Proteasen, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die in einem Teilstück von mindestens 100 zusammenhängenden Aminosäureresten zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 97,2% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 6 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 93,7% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 94%, 94,25%, 94,5%, 94,75%, 95%, 95,25%, 95,5%, 95,75%, 96%, 96,25%, 96,5%, 96,75%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 8 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 92,4% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 92,75%, 93%, 93,25%, 93,5%, 93,75%, 94%, 94,25%, 94,5%, 94,75%, 95%, 95,25%, 95,5%, 95,75%, 96%, 96,25%, 96,5%, 96,75%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 10 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 96,8% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 92,4% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 92,75%, 93%, 93,25%, 93,5%, 93,75%, 94%, 94,25%, 94,5%, 94,75%, 95%, 95,25%, 95,5%, 95,75%, 96%, 96,25%, 96,5%, 96,75%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, und insbesondere eine, die in einem Bakterienstamm der Art Stenotrophomonas maltophilia natürlicherweise vorhanden ist.

Solche Proteasen stellen daher einen weiteren Gegenstand der Erfindung dar. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die Protease dadurch gekennzeichnet, dass die vorstehenden Identitätsangaben bezogen sind auf ein Teilstück von zunehmend bevorzugt 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 477, 500, 550 oder 578 zusammenhängende Aminosäurereste. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Teilstück derart gewählt, dass dessen C-Terminus der Position 470 oder Position 471 oder Position 472 oder Position 473 oder Position 474 oder Position 475 oder Position 476 oder Position 477 oder Position 478 oder Position 479 oder Position 480 entspricht, bezogen auf SEQ ID NO. 2. Das bedeutet, dass in einem Alignment die C-terminale Aminosäure des erfindungsgemäßen Teilstückes der genannten Position in SEQ ID NO. 2 zugeordnet ist, wobei die C-terminale Aminosäure des Teilstückes und die korrespondierende Aminosäure in SEQ ID NO. 2 nicht identisch sein müssen, jedoch identisch sein können. Relevant ist die positionsbezogene Zuordnung der Aminosäuren, nicht deren Übereinstimmung. Auf die Bedeutung erfindungsgemäßer Teilstücke wurde vorstehend hingewiesen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Protease dadurch gekennzeichnet, dass die vorstehenden Identitätsangaben bezogen sind auf die in SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 8 oder SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 12 angegeben Aminosäuresequenzen.

Diese Identitätsangaben wurden ermittelt durch Sequenzvergleiche zwischen erfindungsgemäßen Proteasen und einer Protease mit der Bezeichnung StmPr2, die jeweils die nächstähnliche Protease bezogen auf die Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 8 oder SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 12 darstellt. Die Aminosäuresequenz dieser Protease StmPr2 ist unter der der Zugangsnummer (accession number) AAP13815 bzw. AY253983 (Nukleinsäuresequenz und entsprechende Aminosäuresequenz) in der öffentlich zugänglichen Datenbank des NCBI (National Center for Biotechnology Information, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894) hinterlegt und gemäß SEQ ID NO.4 dieser Anmeldung beigefügt. Alle in der vorliegenden Patentanmeldung durchgeführten Sequenzvergleiche und Bestimmungen von Homologie- und/oder Identitätswerten wurden mit dem Computer-Programm Vector NTI^® Suite 7.0, erhältlich von der Firma InforMax, Inc., Bethesda, USA, mit den vorgegebenen Default-Parametern durchgeführt. Dieser Sequenzvergleich lieferte folgende Identitätswerte:

In den Schutzbereich eingeschlossen werden können somit alle Proteasen, die wie vorstehend beschrieben mindestens zu 97,2% identisch zu SEQ ID NO. 2 bzw. zu einem Teilstück derselben, mindestens zu 93,7% identisch zu SEQ ID NO. 6 bzw. zu einem Teilstück derselben, mindestens zu 92,4% identisch zu SEQ ID NO. 8 bzw. zu einem Teilstück derselben, mindestens zu 96,8% identisch zu SEQ ID NO. 10 bzw. zu einem Teilstück derselben und mindestens zu 92,4% identisch zu SEQ ID NO. 12 bzw. zu einem Teilstück derselben sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Protease dadurch gekennzeichnet, dass ihre Wasch leistung mindestens derjenigen einer Protease entspricht, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz oder der in SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz in einem Teilstück von zunehmend bevorzugt 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 477, 500, 550, 578 zusammenhängenden Aminosäureresten entspricht, wobei die Waschleistung in einem Waschsystem bestimmt wird, das ein Waschmittel in einer Dosierung zwischen 4,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte sowie die Protease enthält, wobei die zu vergleichenden Proteasen aktivitätsgleich eingesetzt sind und die Waschleistung gegenüber einer Anschmutzung Ganzei/Ruß bzw. Vollei/Pigment auf Baumwolle, insbesondere der Anschmutzung Vollei/Pigment auf Baumwolle 1 ON, bestimmt wird durch Messung des Weißheitsgrades der gewaschenen Textilien, der Waschvorgang für mindestens 30 Minuten, optional 60 Minuten, bei einer Temperatur von 4O⁰C erfolgt und das Wasser eine Wasserhärte zwischen 15,5 und 16,5° deutscher Härte aufweist.

Die vorstehenden Angaben und Erläuterungen zum Vergleich der Waschleistung der Proteasen gelten entsprechend.

Unter einem Enzym ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein Protein zu verstehen, das eine bestimmte biokatalytische Funktion ausübt. Unter Protease im Sinne der vorliegenden Anmeldung wird ein Enzym verstanden, welches die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert und dadurch in der Lage ist, Peptide oder Proteine zu spalten.

Ein Protein ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein aus den natürlichen Aminosäuren zusammengesetztes, weitgehend linear aufgebautes, zur Ausübung seiner Funktion zumeist dreidimensionale Struktur annehmendes Polymer, d.h. ein Polypeptid, zu verstehen. Ein Peptid bezeichnet In der vorliegenden Anmeldung werden die proteinogenen, natürlich vorkommenden L- Aminosäuren mit den international gebräuchlichen 1- und 3-Buchstaben-Codes bezeichnet. Zahlreiche Proteine werden als sogenannte Präproteine, also zusammen mit einem Signalpeptid gebildet. Darunter ist dann der N-terminale Teil des Proteins zu verstehen, dessen Funktion zumeist darin besteht, die Ausschleusung des gebildeten Proteins aus der produzierenden Zelle in das Periplasma oder das umgebende Medium und/oder dessen korrekte Faltung zu gewährleisten. Anschließend wird das Signalpeptid unter natürlichen Bedigungen durch eine Signalpeptidase vom übrigen Protein abgespalten, so dass dieses seine eigentliche katalytische Aktivität ohne die zunächst vorhandenen N-terminalen Aminosäuren ausübt. Pro-Proteine sind inaktive Vorstufen von Proteinen. Deren Vorläufer mit Signalsequenz werden als Prä-Pro-Proteine bezeichnet. Für technische Anwendungen sind aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität die maturen, d.h. reifen Peptide, d.h. die nach ihrer Herstellung prozessierten Enzyme gegenüber den Präproteinen bevorzugt. Die Proteine können von den sie produzierenden Zellen nach der Herstellung der Polypeptidkette modifiziert werden, beispielsweise durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche Modifikationen werden als posttranslationale Modifikationen bezeichnet. Diese posttranslationalen Modifizierungen können, müssen jedoch nicht einen Einfluss auf die Funktion des Proteins ausüben.

Durch Vergleich mit bekannten Enzymen, die beispielsweise in allgemein zugänglichen Datenbanken hinterlegt sind, lässt sich aus der Aminosäure- oder Nukleotid-Sequenz die enzymatische Aktivität eines betrachteten Enzyms folgern. Diese kann durch andere Bereiche des Proteins, die nicht an der eigentlichen Reaktion beteiligt sind, qualitativ oder quantitativ modifiziert werden. Dies könnte beispielsweise die Enzymstabilität, die Aktivität, die Reaktionsbedingungen oder die Substratspezifität betreffen.

Solch ein Vergleich geschieht dadurch, dass ähnliche Abfolgen in den Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen der betrachteten Proteine einander zugeordnet werden. Dies nennt man Homologisierung. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Bei der Analyse von Nukleotidsequenzen sind wiederum beide komplementären Stränge und jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen; ebenso die Degeneriertheit des genetischen Codes und die organismenspezifische Verwendung der Codons (Codon-Usage). Inzwischen werden Alignments über Computerprogramme erstellt, wie beispielsweise durch die Algorithmen FASTA oder BLAST; dieses Vorgehen wird beispielsweise von D. J. Lipman und W. R. Pearson (1985) in Science, Band 227, S. 1435-1441 beschrieben.

Eine Zusammenstellung aller in den verglichenen Sequenzen übereinstimmenden Positionen wird als Konsensus-Sequenz bezeichnet.

Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit oder Homologie der verglichenen Sequenzen zueinander. Diese wird in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben bzw. in einem Alignment einander entsprechenden Positionen wiedergegeben. Ein weiter gefaßter Homologiebegriff bezieht die konservierten Aminosäure-Austausche in diesen Wert mit ein. Es ist dann von Prozent Ähnlichkeit die Rede. Solche Aussagen können über ganze Proteine oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden.

Homologe Bereiche von verschiedenen Proteinen sind durch Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz definiert. Diese können auch durch identische Funktion gekennzeichnet sein. Sie geht bis zu völligen Identitäten in kleinsten Bereichen, sogenannten Boxen, die nur wenige Aminosäuren umfassen und meist für die Gesamtaktivität essentielle Funktionen ausüben. Unter den Funktionen der homologen Bereiche sind kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Protein ausgeübten Funktion zu verstehen, wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasserstoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder Übergangskomplexes.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die erfindungsgemäße Protease dadurch gekennzeichnet, dass sie in einem Bakterienstamm der Art Stenotrophomonas maltophilia natürlicherweise vorhanden ist. Alternativ kann die Protease auch in einem Bakterienstamm der Art Stenotrophomonas rhizophilia natürlicherweise vorhanden sein.

Proteasen bzw. Enzyme im allgemeinen können durch verschiedene Verfahren, z.B. gezielte genetische Veränderung durch Mutageneseverfahren, weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich spezieller Eigenschaften, beispielsweise katalytische Aktivität, Stabilität, usw., optimiert werden.

Es ist aus dem Stand der Technik weiterhin allgemein bekannt, dass sich vorteilhafte Eigenschaften einzelner Mutationen, z.B. einzelner Punktmutationen, ergänzen können. Eine hinsichtlich bestimmter Eigenschaften bereits optimierte Protease, zum Beispiel hinsichtlich ihrer Stabilität gegenüber Tensiden oder anderen Komponenten, kann erfindungsgemäß zusätzlich weiterentwickelt werden.

Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit Proteasen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie aus einer erfindungsgemäßen Protease als Ausgangsmolekül erhaltbar sind durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfassen, die über eine Länge von mindestens 100 und zunehmend bevorzugt mindestens 150, 200, 250, 300, 350, 400 und ganz besonders bevorzugt mindestens 450 zusammenhängenden Aminosäurepositionen mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt. Ebenfalls umfasst sind Proteasen, die ausgehend von den zuvor genannten erfindungsgemäßen Proteasen durch Derivatisierung oder Inversionsmutation erhältlich sind, wobei hierbei natürlich zwingend ist, dass die vorstehend genannten zusammenhängenden Aminosäurepositionen erhalten bleiben.

Unter Fragmenten werden alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als natürliche Proteine und beispielsweise auch synthetisch erhalten werden können. Aufgrund ihrer Aminosäuresequenzen können sie den betreffenden vollständigen Proteinen zugeordnet werden. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen annehmen oder proteolytische Aktivitäten oder Teilaktivitäten ausüben, wie beispielsweise die Komplexierung eines Substrats. Fragmente und Deletionsvarianten von Ausgangsproteinen sind prinzipiell gleichartig; während Fragmente eher kleinere Bruchstücke darstellen, fehlen den Deletionsmutanten eher nur kurze Bereiche, und damit nur einzelne Teilfunktionen.

Unter Chimären oder hybriden Proteinen sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine zu verstehen, deren Sequenz die Sequenzen oder Teilsequenzen von mindestens zwei Ausgangsproteinen umfasst. Die Ausgangsproteine können diesbezüglich aus verschiedenen oder aus demselben Organismus stammen. Chimäre oder hybride Proteine können beispielsweise durch Rekombinationsmutagenese erhalten werden. Der Sinn einer solchen Rekombination kann beispielsweise darin bestehen, mithilfe des heranfusionierten Proteinteils eine bestimmte enzymatische Funktion herbeizuführen oder zu modifizieren. Es ist dabei im Sinne der vorliegenden Erfindung unwesentlich, ob solch ein chimäres Protein aus einer einzelnen Polypeptidkette oder mehreren Untereinheiten besteht, auf weiche sich unterschiedliche Funktionen verteilen können.

Unter durch Insertionsmutation erhaltene Proteine sind solche Varianten zu verstehen, die durch Einfügen eines Proteinfragments in die Ausgangssequenzen erhalten worden sind. Sie sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen den Chimären Proteinen zuzuordnen. Sie unterscheiden sich von jenen lediglich im Größenverhältnis des unveränderten Proteinteils zur Größe des gesamten Proteins. In solchen insertionsmutierten Proteinen ist der Anteil an Fremdprotein geringer als in Chimären Proteinen.

Inversionsmutagenese, also eine partielle Sequenzumkehrung, kann als Sonderform sowohl der Deletion, als auch der Insertion angesehen werden. Dasselbe gilt für eine von der ursprünglichen Aminosäureabfolge abweichende Neugruppierung verschiedener Molekülteile. Sie kann sowohl als Deletionsvariante, als Insertionsvariante, als auch als Shuffling-Variante des ursprünglichen Proteins angesehen werden.

Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäure kette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen können beispielsweise biologisch im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch die Wirtszelle erfolgen. Hierfür können molekularbiologische Methoden eingesetzt werden. Sie können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Bei solch einer Verbindung kann es sich beispielsweise auch um andere Proteine handeln, die beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. Derartige Modifizierungen können beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein. Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen, genauso wie auch ein nichtkovalenter Einschluss in geeignete makromolekulare Käfigstrukturen.

Proteine können auch über die Reaktion mit einem Antiserum oder einem bestimmten Antikörper zu Gruppen immunologisch verwandter Proteine zusammengefaßt werden. Die Angehörigen einer Gruppe zeichnen sich dadurch aus, dass sie dieselbe, von einem Antikörper erkannte antigene Determinante aufweisen.

Einen weiteren Erfindungsgegenstand bilden daher Proteasen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei oder vier übereinstimmende antigene Determinanten mit einer erfindungsgemäßen Protease aufweisen.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden alle Enzyme, Proteine, Fragmente und Derivate, sofern sie nicht explizit als solche angesprochen zu werden brauchen, unter dem Oberbegriff Proteine zusammengefaßt.

Das pH-Profil der erfindungsgemäßen Enzyme ist kompatibel mit dem erforderlichen pH-Wert bei technischem Einsatz sowie mit typischen erfindungsgemäßen Mitteln, insbesondere Produkten wie Wasch- und Reinigungsmitteln.

Weitere Gegenstände der Erfindung bilden Nukleinsäuremoleküle, die für eine erfindungsgemäße Protease kodieren sowie Vektoren enthaltend eine solche Nukleinsäure.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Nukleinsäure, die für eine erfindungsgemäße Protease kodiert, eine Nukleinsäuresequenz, die in einem Teilstück von mindestens 300 zusammenhängenden Nukleotiden zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 95% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 5 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 90% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 7 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 90% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 9 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 90% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 11 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 90% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 13 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 90% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%.

Besonders bevorzugt ist eine solche Nukleinsäure in einem Bakterienstamm der Art Stenotrophomonas maltophilia natürlicherweise vorhanden.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass die vorstehenden Identitätsangaben bezogen sind auf ein Teilstück von zunehmend bevorzugt 450, 600, 750, 900, 1050, 1200, 1350, 1431 , 1500, 1650, 1734 zusammenhängenden Nukleinsäureresten. Weiter bevorzugt enthält ein solches Teilstück kein Stopcodon. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Teilstück derart gewählt, dass das letzte für eine Aminosäure kodierende Codon (Basentriplett) für eine C-terminale Aminosäure des Teilstückes kodiert, die der Position 470 oder Position 471 oder Position 472 oder Position 473 oder Position 474 oder Position 475 oder Position 476 oder Position 477 oder Position 478 oder Position 479 oder Position 480 entspricht, bezogen auf SEQ ID NO. 2. Das bedeutet, dass in einem Alignment die C-terminale Aminosäure des erfindungsgemäßen Teilstückes der genannten Position in SEQ ID NO. 2 zugeordnet ist, wobei die C-terminale Aminosäure des Teilstückes und die korrespondierende Aminosäure in SEQ ID NO. 2 nicht identisch sein müssen, jedoch identisch sein können. Relevant ist die positionsbezogene Zuordnung der Aminosäuren, nicht deren Übereinstimmung. In weiteren besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die Protease dadurch gekennzeichnet, dass die vorstehenden Identitätsangaben bezogen sind auf die in SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 9 oder SEQ ID NO. 11 oder SEQ ID NO. 13 angegeben Nukleinsäuresequenzen.

Die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO. 1 1 und SEQ ID NO. 13 unterscheiden sich nur in wenigen Basenpaaren, nämlich in zwei Basenpaaren, obwohl sie aus verschiedenen Stenotrophomonas maltophilia-Stämmen stammen. Sie kodieren daher für zueinander identische Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID NO. 12 und SEQ ID NO. 14 angegeben sind.

Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung die natürlicherweise aus Nukleotiden aufgebauten als Informationsträger dienenden Moleküle zu verstehen, die für die lineare Aminosäureabfolge in Proteinen oder Enzymen codieren. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Als der natürlicherweise dauerhaftere Informationsträger ist die Nukleinsäure DNA für molekularbiologische Arbeiten bevorzugt. Demgegenüber wird für die Realisierung der Erfindung in natürlicher Umgebung, wie beispielsweise in einer exprimierenden Zelle, eine RNA gebildet, weshalb erfindungswesentliche RNA-Moleküle ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.

Bei DNA sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codon-Triplets für dieselben Aminosäuren codieren können, so dass eine bestimmte Aminosäure-Abfolge von mehreren unterschiedlichen und möglicherweise nur geringe Identität aufweisenden Nukleotidsequenzen abgeleitet werden kann, was als Degeneriertheit des genetischen Codes bezeichnet wird. Außerdem weisen verschiedene Organismen Unterschiede im Gebrauch dieser Codons auf. Aus diesen Gründen müssen sowohl Aminosäuresequenzen als auch Nukleotidsequenzen in die Betrachtung des Schutzbereichs einbezogen werden. Daher sind sämtliche Nukleotidsequenzen in die Erfindung mit eingeschlossen, die eine der vorstehend beschriebenen Proteasen kodieren können. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleotidsequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind. Daher kann der Fachmann ausgehend von einer sind jeweils nur als eine beispielhafte Codierung für eine bestimmte Aminosäurefolge anzusehen.

Die einem Protein entsprechende Informationseinheit wird auch im Sinne der vorliegenden Anmeldung als Gen bezeichnet. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Herstellung rekombinanter Proteine. Hierunter sind erfindungsgemäß alle gentechnischen oder mikrobiologischen Verfahren zu verstehen, die darauf beruhen, dass die Gene für die interessierenden Proteine in eine für die Produktion geeignete Wirtszelle eingebracht und von dieser transkribiert und translatiert werden. Geeigneterweise erfolgt die Einschleusung der betreffenden Gene über Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren; aber auch über solche, die bewirken, dass das interessierende Gen in der Wirtszelle in ein bereits vorhandenes genetisches Element wie das Chromosom oder andere Vektoren eingefügt werden kann. Die funktionelle Einheit aus Gen und Promotor und eventuellen weiteren genetischen Elementen wird erfindungsgemäß als Expressionskassette bezeichnet. Sie muß dafür jedoch nicht notwendigerweise auch als physische Einheit vorliegen.

Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3. Edition CoId Spring Laboratory Press, bekannt.

Änderungen der Nukleotidsequenz, wie sie beispielsweise durch an sich bekannte molekularbiologische Methoden herbeigeführt werden können, werden als Mutationen bezeichnet. Je nach Art der Änderung kennt man beispielsweise Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutationen oder solche, bei denen verschiedene Gene oder Teile von Genen miteinander fusioniert oder rekombiniert werden; dies sind Genmutationen. Die zugehörigen Organismen werden als Mutanten bezeichnet. Die von mutierten Nukleinsäuren abgeleiteten Proteine werden als Varianten bezeichnet. So führen beispielsweise Deletions-, Insertions- Substitutionsmutationen oder Fusionen zu deletions-, insertions- substitutionsmutierten oder Fusionsgenen und auf Proteinebene zu entsprechenden Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten, beziehungsweise Fusionsproteinen.

Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich ein interessierendes Gen enthalten. Sie vermögen dieses in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkuläre genetische Elemente. Man unterscheidet in der Gentechnik einerseits zwischen solchen Vektoren, die der Lagerung und somit gewissermaßen auch der gentechnischen Arbeit dienen, den sogenannten Klonierungsvektoren, und andererseits denen, die die Funktion erfüllen, das interessierende Gen in der Wirtszelle zu realisieren, das heißt, die Expression des betreffenden Proteins zu ermöglichen. Diese Vektoren werden als Expressionsvektoren bezeichnet.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure geeigneterweise in einen Vektor kloniert. Die molekularbiologische Dimension der Erfindung besteht somit in Vektoren mit den Genen für die entsprechenden Proteine. Dazu können beispielsweise solche gehören, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Viren oder von Bacteriophagen ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren, sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Es ist dabei im Sinne der Erfindung unerheblich, ob sie sich extrachomosomal als eigene Einheiten etablieren oder in ein Chromosom integrieren. Welches der zahlreichen aus dem Stand der Technik bekannten Systeme gewählt wird, hängt vom Einzelfall ab. Ausschlaggebend können beispielsweise die erreichbare Kopienzahl, die zur Verfügung stehenden Selektionssysteme, darunter vor allem Antibiotikaresistenzen, oder die Kultivierbarkeit der zur Aufnahme der Vektoren befähigten Wirtszellen sein.

Die Vektoren bilden geeignete Ausgangspunkte für molekularbiologische und biochemische Untersuchungen des betreffenden Gens oder zugehörigen Proteins und für erfindungsgemäße Weiterentwicklungen und letztlich für die Amplifikation und Produktion erfindungsgemäßer Proteine. Sie stellen insofern Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar, als die Sequenzen der enthaltenen erfindungsgemäßen Nukleinsäurebereiche jeweils innerhalb der oben näher bezeichneten Homologiebereiche liegen.

Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit Vektoren dar, die mindestens ein Nukleinsäuremolekül beinhalten, welches für eine erfindungsgemäße Protease kodiert, insbesondere ein Nukleinsäuremolekül, wie vorstehend beschrieben ist. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Vektor dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Klonierungsvektor ist. Diese Klonierungsvektoren eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifikation oder der Selektion des interessierenden Gens für die Charakterisierung des betreffenden Gens, etwa über das Erstellen einer Restriktionskarte oder die Sequenzierung. Klonierungsvektoren sind auch deshalb bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, weil sie eine transportierbare und lagerfähige Form der beanspruchten DNA darstellen. Sie sind auch bevorzugte Ausgangspunkte für molekularbiologische Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise die Polymerasekettenreaktion. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Vektor dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Expressionsvektor ist. Expressionsvektoren sind chemisch den Klonierungsvektoren ähnlich, unterscheiden sich aber in jenen Teilsequenzen, die sie dazu befähigen, in den für die Produktion von Proteinen optimierten Wirtszellen oder Wirtsorganismen zu replizieren und dort das enthaltene Gen zur Expression zu bringen. Bevorzugte Ausführungsformen sind Expressionsvektoren, die selbst die zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen. Die Expression wird beispielsweise von Promotoren beeinflußt, welche die Transkription des Gens regulieren. So kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch nach gentechnischer Fusion sowohl durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle als auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle.

Bevorzugte Ausführungsformen sind solche Expressionsvektoren, die über Änderungen der Kulturbedingungen oder Zugabe von bestimmten Verbindungen, wie beispielsweise die Zelldichte oder spezielle Faktoren, regulierbar sind. Expressionsvektoren ermöglichen, dass das zugehörige Protein heterolog, also in einer anderen Zelle bzw. Wirtszelle als derjenigen, aus der es natürlicherweise gewonnen werden kann, produziert wird. Die Zellen können dabei durchaus zu verschiedenen Organismen zugehörig sein oder von verschiedenen Organismen stammen. Auch eine homologe Proteingewinnung aus einer das Gen natürlicherweise exprimierenden Wirtszelle über einen passenden Vektor liegt innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. Diese kann den Vorteil aufweisen, dass natürliche, mit der Translation in einem Zusammenhang stehende Modifikationsreaktionen an dem entstehenden Protein genauso durchgeführt werden, wie sie auch natürlicherweise ablaufen würden.

Eine weitere Ausführungsform stellen Expressionssysteme dar, bei denen zusätzliche Gene, beispielsweise solche, die auf anderen Vektoren zur Verfügung gestellt werden, die Produktion erfindungsgemäßer Proteine beeinflussen. Hierbei kann es sich um modifizierende Genprodukte handeln oder um solche, die mit dem erfindungsgemäßen Protein gemeinsam aufgereinigt werden sollen, etwa um dessen enzymatische Funktion zu beeinflussen. Dabei kann es sich beispielsweise um andere Proteine oder Enzyme, um Inhibitoren oder um solche Elemente handeln, die die Wechselwirkung mit verschiedenen Substraten beinflussen.

Alternative Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Derartige Expressionssysteme sind im Stand der Technik ebenfalls etabliert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine nicht menschliche Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Protease oder ein Fragment derselben beinhaltet oder die zu deren Herstellung angeregt werden kann, vorzugsweise unter Einsatz eines Expressionsvektors. Die In-vivo-Synthese eines erfindungsgemäßen Enzyms, also die durch lebende Zellen, erfordert den Transfer des zugehörigen Gens in eine Wirtszelle, deren sogenannte Transformation. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Zellen, das heißt prokaryotische oder eukaryotische Zellen. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit dem Expressionsvektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Zudem zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Häufig müssen aus der Fülle an verschiedenen nach dem Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systeme die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermitteln werden. Jedes erfindungsgemäße Protein kann auf diese Weise aus einer Vielzahl von Wirtszellen gewonnen werden. Auch solche Wirtszellen sind bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie nach Transformation mit einem der oben beschriebenen Vektoren erhalten worden sind. Dabei kann es sich beispielsweise um Klonierungsvektoren handeln, die zur Lagerung und/oder Modifikation beispielsweise in einen beliebigen Bakterienstamm oder eine andere erfindungsgemäße Wirtszelle eingebracht worden sind. Solche Schritte sind in der Lagerung und in der Weiterentwicklung betreffender genetischer Elemente allgemein verbreitet. Da aus diesen Wirtszellen die betreffenden genetischen Elemente in nachfolgende, zur Expression geeignete Wirtszellen unmittelbar übertragen werden können, handelt es sich auch bei den vorangegangenen Transformationsprodukten um Verwirklichungen des betreffenden Erfindungsgegenstands.

Bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Expressionsvektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine sehr wirtschaftliche Produktion der interessierenden Proteine.

Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryontische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich gegenüber Eukaryonten in der Regel durch kürzere Generationszeiten und geringere Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren zur Gewinnung erfindungsgemäßer Proteine etabliert werden. Bei gram-negativen Bakterien, wie beispielsweise Escherichia coli (E. coli), werden eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sekretiert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Grampositive Bakterien, wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales, besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so dass sekretierte Proteine sogleich in das die Zellen umgebende Nährmedium abgegeben werden, aus welchem sich nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die exprimierten erfindungsgemäßen Proteine direkt aufreinigen lassen.

Bevorzugtermaßen ist die Wirtszelle daher dadurch gekennzeichnet, dass sie das erfindungsgemäße Protein oder ein Fragment oder Derivat hiervon ins umgebende Medium sezerniert. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit Wirtszellen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie die Protease oder ein Fragment derselben in das die Wirtszelle umgebende Medium sezernieren.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, insbesondere eines, welches ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Bacillus und Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Wirtszelle um ein Bakterium, welches ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus und Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia.

Die Wirtszellen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere um solche Wirtszellen handeln, die zusätzlich zu dem erfindungsgemäß hergestellten Protein noch weitere, insbesondere wirtschaftlich interessante Proteine exprimieren.

Die Wirtszelle kann aber auch eine eukaryontische Zelle sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt daher eine Wirtszelle dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt.

Im Gegensatz zu prokaryontischen Zellen sind eukaryontische Zellen in der Lage, das gebildete Protein posttranslational zu modifizieren. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Dazu gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide.

Die erfindungsgemäßen Wirtszellen werden in an sich bekannter Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Wirtszellen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig Produkt aus dem Medium entnommen werden kann.

Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes, beispielsweise des rekombinanten Proteins. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem der oben ausgeführten Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Proteine beruhen, stellen entsprechend bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.

Hierbei müssen die für die eingesetzten Herstellungsverfahren, für die Wirtszellen und/oder die herzustellenden Proteine jeweils optimalen Bedingungen anhand der zuvor optimierten Kulturbedingungen der betreffenden Stämme nach dem Wissen des Fachmanns, beispielsweise hinsichlich Fermentationsvolumen, Medienzusammensetzung, Sauerstoffversorgung oder Rührergeschwindigkeit experimentell ermittelt werden.

Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen ebenfalls in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert; man spricht auch von einer Zufütterungsstrategie. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte, als auch in der Biotrockenmasse und/oder vor allem der Aktivität des interessierenden Proteins erreicht werden.

Analog dazu kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden.

Das hergestellte Protein kann nachträglich aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Dieses Fermentationsverfahren ist gegenüber der Produktaufbereitung aus der Trockenmasse bevorzugt, erfordert jedoch die Zurverfügungstellung geeigneter Sekretionsmarker und Transportsysteme. Ohne Sekretion ist u.U. die Aufreinigung des Proteins aus der Zellmasse erforderlich, auch dazu sind verschiedene Verfahren bekannt, wie Fällung z.B durch Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder die chromatographische Reinigung, wenn erforderlich bis zur Homogenität. Die Mehrzahl der beschriebenen technischen Verfahren dürfte jedoch mit einer angereicherten, stabilisierten Präparation auskommen. Alle bereits oben ausgeführten Elemente können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar. Das optimale Verfahren muß für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden.

Durch Expression oder Klonierung können die erfindungsgemäßen Proteasen in der für den technischen Einsatz erforderlichen Menge zur Verfügung gestellt werden.

Einen eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen somit auch Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Protease dar.

Dazu gehört jedes Verfahren, das zur Herstellung einer oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Protease geeignet ist beziehungsweise das den Erhalt einer erfindungsgemäßen Protease ermöglicht. Hierzu zählen beispielsweise auch chemische Syntheseverfahren.

Demgegenüber bevorzugt sind jedoch alle im Stand der Technik etablierten, oben in einzelnen Aspekten bereits angesprochenen molekularbiologischen, mikrobiologischen, beziehungsweise biotechnologischen Herstellverfahren, die auf den oben bezeichneten erfindungsgemäßen Proteinen oder Nukleinsäuren aufbauen. Hierfür kann entsprechend dem oben Gesagten beispielsweise auf die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 9 oder SEQ ID NO. 11 oder SEQ ID NO. 13 angegebene Nukleinsäure oder hieraus erhaltene Mutanten oder Teilsequenzen zurückgegriffen werden.

Vorzugsweise handelt es sich dabei um Verfahren, die unter Einsatz einer zuvor bezeichneten Nukleinsäure, vorzugsweise unter Einsatz eines vorstehend beschriebenen Vektors und besonders bevorzugt vorzugsweise unter Einsatz einer zuvor bezeichneten, vorteilhafterweise gentechnisch modifizierten Wirtszelle erfolgen. Denn hierdurch wird die entsprechend bevorzugte genetische Information in mikrobiologisch verwertbarer Form zur Verfügung gestellt.

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auf der Grundlage der zugehörigen Nukleinsäuresequenzen auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Alle bereits oben ausgeführten Elemente können auch zu neuen Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar, so dass optimale Verfahren für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden müssen. Entsprechend dem oben Gesagten sind unter den genannten Verfahren weiterhin solche bevorzugt, bei denen die Nukleotidsequenz in einem, vorzugsweise mehreren Codons an die Codon-Usage des Wirtsstamms angepasst worden ist.

Einen weiteren Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar, bei denen wenigstens in einem der Verfahrensschritte eine erfindungsgemäße Protease verwendet wird. Das Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen ist demnach dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Protease proteolytisch aktiv ist.

Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren aufgrund ihrer präziseren Steuerbarkeit, was beispielsweise die eingesetzten Mengen und Einwirkzeiten angeht, bevorzugt sind.

Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung dieses Mittels behandelt wird. Das gleiche gilt für Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, welche unter dem Begriff harte Oberflächen zusammengefasst werden. Alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um eine erfindungsgemäße Protease bereichert werden, und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.

In den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform solcher Verfahren werden die betreffenden erfindungsgemäßen Polypeptide im Rahmen einer der oben ausgeführten Rezepturen für erfindungsgemäße Mittel, vorzugsweise erfindungsgemäße Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittel, bereitgestellt.

Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, bei denen in wenigstens einem der Verfahrensschritte eine erfindungsgemäße Protease aktiv wird. Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen bevorzugt, und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.

Es kann sich dabei beispielsweise um Verfahren handeln, in denen Materialien zur Verarbeitung in Textilien vorbereitet werden, etwa zur Antifilzausrüstung, oder beispielsweise um Verfahren, welche die Reinigung getragener Textilien um eine pflegende Komponente bereichern. Wegen der oben beschriebenen Wirkung von Proteasen auf natürliche, proteinhaltige Rohstoffe handelt es sich in bevorzugten Ausführungsformen um Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen, insbesondere mit Wolle oder Seide.

Einen weiteren eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung einer oben beschriebenen erfindungsgemäßen Protease zur Entfernung von protease-sensitiven Anschmutzungen auf Textilien oder harten Oberflächen, d.h. zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, dar.

Denn erfindungsgemäße Proteasen können, insbesondere auf Grund der vorstehend beschriebenen Eigenschaften, dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen proteinhaltige Verunreinigungen zu beseitigen. Ausführungsformen stellen beispielsweise die Handwäsche, die manuelle Entfernung von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen oder die Verwendung im Zusammenhang mit einem maschinellen Verfahren dar. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung werden die betreffenden erfindungsgemäßen Proteasen nach einer der vorstehend ausgeführten Rezepturen bereitgestellt.

Bevorzugt zeichnet sich eine erfindungsgemäße Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease dadurch aus, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:

Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme, Baukästen (Kits) und Geräte wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.

Beispiel 1 : Identifikation von proteolytisch aktiven Stenotrophomonas maltophilia-Stämmen Die Bakterienkulturen wurden auf NB-Platten (Nährbouillon Agar, alle Angaben in Gramm pro Liter: Pepton aus Casein 3,5; Pepton aus Fleisch 2,5; Pepton aus Gelatine 2,5; Hefeextrakt 2,5; Natriumchlorid 5,0; Agar 12) überstrichen und nach zwei bis drei Tagen auf Skim-Milk-Platten (alle Angaben in Gramm pro Liter: Pepton aus Casein 5; Hefeextrakt 2,5; Glucose 1 ,0. Ferner: 100ml/l 10% Magermilchlösung; 15% Agar) überstrichen. Nach 48 Stunden Inkubation bei 25 bis 3O⁰C wurden die Kulturen mit eindeutigen Lysehöfen erneut auf NB-Platten überimpft. Von diesen Platten wurden dann 25 ml Flüssigkultur angeimpft und zwei Tage bei 25 bis 3O⁰C inkubiert.

Nach der Zellernte wurde der Medienüberstand auf Proteaseaktivität untersucht und die Proteaseaktivität bestimmt. Hierfür wurden 250 μl Azocaseinlösung (2%iges Azocasein in 50 mM Phopshatpuffer pH 7) mit 150 μl Enzym bei 37⁰C genau 30 Minuten inkubiert, das Reaktionsgemisch mit 1 ,2 ml 10% Trichloressigsäure versetzt und nach 15 Minuten Inkubation der Niederschlag bei 8.000g abzentrifugiert. 600 μl Überstand wurden mit 700 μl 1 M NaOH gemischt und photometrisch bei 440 nm Wellenlänge vermessen. 1 Unit ist die Enzymmenge, die benötigt wird, um eine Absorptionsänderung von 1 ,0 pro Minute in einer 1 cm dicken Küvette zu erreichen.

Beispiel 2: Rekombinante Expression klonierter erfindungsgemäßer Proteasen aus Stenotrophomonas maltophilia

Die Gene kodierend für erfindungsgemäße Proteasen wurden durch PCR (Polymerase- Kettenreaktion)-Amplifizierung aus der genomischen DNA der entsprechenden Stämme in fachüblicher Art und Weise erhalten. Die erhaltenen Gene wurden in geeignete Expressionsvektoren kloniert, diese in E. coli BL21-Gold Bakterien transformiert und die Proteasen in diesen Bakterien rekombinant exprimiert.

Folgende erfindungsgemäße Proteasen aus Stenotrophomonas maltophilia rekombinant exprimiert, wobei die Nomenklatur und Nummerierung mit derjenigen des nachfolgenden Beispiels zur Dokumentation der Waschleistung übereinstimmt:

SEQ ID NO.2 (Protease SmP2)

SEQ ID NO. 6 (Protease Nr. 1 im nachfolgenden Beispiel) SEQ ID NO. 8 (Protease Nr. 5 im nachfolgenden Beispiel) SEQ ID NO. 10 (Protease Nr. 7 im nachfolgenden Beispiel) SEQ ID NO. 12 (Protease Nr. 10 im nachfolgenden Beispiel) SEQ ID NO. 14 (Protease Nr. 6 im nachfolgenden Beispiel)

Die Klone der Stämme wurden in Schüttelkultur angezüchtet: 30 ml LB/Ampicillin (Konz. 100μg/ml)-Medium wurden inokuliert und über Nacht bei 3O⁰C und 160 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. 200 ml LB/Ampicillin-Medium wurden mit der Übernachtkultur bis zu einer optischen Dichte (OD) 600 = 0.1 beimpft und bei 3O⁰C und 200 Umdrehungen pro Minute bis zu einer OD 600 = 0.6-0,8 geschüttelt. Zu diesem Zeitpunkt erfolgte die Induktion der Kultur mit 0,05 mM IPTG bei 2O⁰C. Die Ernte erfolgte nach einer Induktionsdauer von 25h.

Beispiel 3: Ermittlung der Waschleistung bei Einsatz in handelsüblichen Waschmittelrezepturen Für dieses Beispiel wurden standardisiert verschmutze Textilien eingesetzt, die von der Eidgenössischen Material-Prüfungs- und -Versuchsanstalt, St. Gallen, Schweiz (EMPA), oder der wfk Testgewebe GmbH (Christenfeld 10, D-41379 Brüggen-Bracht, Deutschland) bezogen worden waren. Dabei wurden folgende Anschmutzungen und Textilien verwendet: A (Gras auf Baumwolle, EMPA 164), B (Ganzei/Ruß auf Baumwolle, 10N), C (Blut/Milch auf Baumwolle, C-5 (044)).

Mit diesem Testmaterial wurden verschiedene Waschmittelrezepturen, die sich durch die jeweils enthaltene Protease unterschieden, auf ihre Waschleistung hin untersucht. Dafür wurden die Ansätze für 60 Minuten bei einer Temperatur von 4O⁰C gewaschen. Die weitere Versuchsdurchführung, insbesondere die Waschmittelzusammensetzung und Dosierung, entsprach dem vorstehend beschriebenen Waschsystem und der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise zur Ermittlung der Waschleistung der erfindungsgemäßen Proteasen. Es wurde mit Stadtwasser mit einer Wasserhärte von etwa 16° deutscher Härte gewaschen.

Die Waschmittelrezeptur wurde für die verschiedenen Versuchsreihen aktivitätsgleich mit verschiedenen erfindungsgemäßen Proteasen aus Stenotrophomonas maltophilia Stämmen versetzt. Die Proteasen wurden entweder rekombinant exprimiert oder aus dem Kulturmedium (bzw. als Kulturüberstand) entsprechender Stenotrophomonas maltophilia-Stämme in fachüblicher Art und Weise erhalten. Als Referenzenzym wurde die Protease verwendet, die in Figur 2 bzw. SEQ ID NO. 3 der internationalen Offen leg ungsschrift WO 03/057713 offenbart ist. Diese Protease zeigte in den verwendeten Rezepturen bzw. Formulierungen die beste Waschleistung unter den getesteten Subtilisinen und stellt daher ein geeignetes Referenzenzym dar (nachfolgend bezeichnet als Referenz 1 ). In einer pulverförmigen Mittelzusammensetzung diente alternativ entweder eine stabilisierte und damit leistungsverbesserte Protease Variante (Blap X) der alkalischen Protease aus Bacillus lentus (Bacillus lentus DSM 5843, die neben weiteren Proteasevarianten in der internationalen Offenlegungsschrift WO 92/21760 beschrieben ist (nachfolgend bezeichnet als Referenz 2), oder die Protease aus Bacillus lentus Variante F49 (WO 95/23221 , nachfolgend bezeichnet als Referenz 3), als Referenzenzym.

Nach dem Waschen wurde der Weißheitsgrad der gewaschenen Textilien gemessen. Die Messung erfolgte an einem Spektrometer Minolta CM508d, Lichtart D65, in fachüblicher Art und Weise. Das Gerät wird zuvor mit einem mitgelieferten Weißstandard kalibriert. Die erhaltenen Ergebnisse sind die Differenzremissionseinheiten zwischen einem Waschvorgang mit einem Waschmittel enthaltend eine Protease und einem parallel durchgeführten Kontrollwaschgang mit einem Waschmittel ohne Protease. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 bis 3 zusammengestellt. Sie erlauben einen unmittelbaren Rückschluss auf den Beitrag des jeweils enthaltenen Enzyms zur Waschleistung des verwendeten Mittels.

Tabelle 1 zeigt die Waschergebnisse einer erfindungsgemäßen flüssigen Mittelzusammensetzung, die eine erfindungsgemäße Protease (SmP2, SEQ ID NO. 2) enthält, im Vergleich mit einer Mittelzusammensetzung, die die Protease Referenz 1 enthält. Es wird deutlich, dass die erfindungsgemäße Mittelzusammensetzung bzw. die erfindungsgemäße Protease bei 4O⁰C an den Anschmutzungen die Subtilisin-Waschleistung übertreffen, insbesondere bei den Anschmutzungen B (Ganzei-Ruß) und C (Blut/Milch).

Tabelle 1 :

Tabelle 2 zeigt die Waschergebnisse einer erfindungsgemäßen pulverförmigen Mittelzusammensetzung, die eine erfindungsgemäße Protease (SmP2, SEQ ID NO. 2) enthält, im Vergleich mit einer Mittelzusammensetzung, die die Protease Referenz 2 enthält. Es wird deutlich, dass die erfindungsgemäße Mittelzusammensetzung bzw. die erfindungsgemäße Protease bei 4O⁰C die Subtilisin-Waschleistung übertrifft.

Tabelle 2:

Tabelle 3 a) bis e) zeigt die Waschergebnisse von weiteren erfindungsgemäßen flüssigen Mittelzusammensetzungen, die Proteasen aus Stenotrophomonas maltophilia (Proteasen Nr. 1 bis 8, 10 bis 20 und 22 bis 25) enthalten, im Vergleich mit einer Mittelzusammensetzung, die die Protease Referenz 1 enthält. Die Aminosäuresequenzen der Proteasen mit den Nummern 1 , 5, 6, 7 und 10 sind in SEQ ID NO. 6 (Protease Nr. 1 ), SEQ ID NO. 8 (Protease Nr. 5), SEQ ID NO. 14 (Protease Nr. 6), SEQ ID NO. 10 (Protease Nr. 7) und SEQ ID NO. 12 (Protease Nr. 10) angegeben, die zugehörigen Nukleinsäuresequenzen in SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 9 und SEQ ID NO. 11. Man erkennt, dass die erfindungsgemäßen Mittelzusammensetzungen bzw. die erfindungsgemäße Proteasen bei 4O⁰C an den Anschmutzungen die Subtilisin-Waschleistung übertreffen, insbesondere bei den Anschmutzungen B (Ganzei-Ruß) und C (Blut/Milch).

Tabelle 3: a)

b)

d)

e)

Tabelle 4 zeigt die Waschergebnisse von weiteren erfindungsgemäßen pulverförmigen Mittelzusammensetzungen, die Proteasen aus Stenotrophomonas maltophilia wie angegeben enthalten, im Vergleich mit einer Mittelzusammensetzung, die die Protease Referenz 3 enthält. Die Aminosäuresequenzen der Proteasen mit den Nummern 1 , 5, 6, 7 und 10 sind in SEQ ID NO. 6 (Protease Nr. 1 ), SEQ ID NO. 8 (Protease Nr. 5), SEQ ID NO. 14 (Protease Nr. 6), SEQ ID NO. 10 (Protease Nr. 7) und SEQ ID NO. 12 (Protease Nr. 10) angegeben, die zugehörigen Nukleinsäuresequenzen in SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 9 und SEQ ID NO. 1 1. Man erkennt, dass die erfindungsgemäßen Mittelzusammensetzungen bzw. die erfindungsgemäße Proteasen bei 4O⁰C an den Anschmutzungen die Subtilisin-Waschleistung übertreffen, insbesondere bei den Anschmutzungen A (Gras) und C (Blut/Milch).

Tabelle 4:

Vergleichbare Waschleistungen wurden für flüssige bzw. pulverförmige Waschmittel erhalten, die anstelle der Gesamtlängen-Proteasen C-terminal verkürzte Varianten dieser Proteasen enthielten, deren C-Terminus der Position 477 entsprach, zugeordnet in einem Alignment und bezogen auf SEQ ID NO. 2.

Beschreibung der Figuren:

Figur 1 : Sequenzvergleich (Alignment) der folgenden Aminosäuresequenzen:

(1 ) erfindungsgemäße Protease (SmP2) aus Stenotrophomonas maltophilia (S. maltophilia DSM 50170) gemäß SEQ ID NO. 2,

(2) Protease StmPr2 (SEQ ID NO:4) aus Stenotrophomonas maltophilia gemäß Zugangsnummer (accession number) AAP13815 bzw. AY253983 (Nukleinsäuresequenz und entsprechende Aminosäuresequenz) der öffentlich zugänglichen Datenbank des NCBI (National Center for Biotechnology Information, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894),

(3) Protease StmPri (SEQ ID NO:3) aus Stenotrophomonas maltophilia gemäß der Veröffentlichung von Windhorst et al. (Journal of Biologial Chemistry Vol. 277, No. 13: 11042- 11049, 2002), GenBankTM Zugangsnummer (accession number) AJ291488, und der

(4) Protease BPN^' als Beispiel für eine Protease vom Subtilisin-Typ.

Der Sequenzvergleich liefert die folgenden Identitätswerte:

Ein Vergleich von SmP2 mit einer verkürzten StmPri -Sequenz (467 Aminosäuren lang) gemäß Datenbankeintrag AJ291488.2, die die putative reife Protease darstellt, lieferte einen Identitätswert von lediglich 37,3%.

Figur 2: Sequenzvergleich (Alignment) der Aminosäuresequenzen der erfindungsgemäßen Proteasen gemäß SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 12 und SEQ ID NO. 14. Zusätzlich angegeben ist die Aminosäuresequenz der Protease StmPr2 (SEQ ID NO:4) aus Stenotrophomonas maltophilia gemäß Zugangsnummer (accession number) AAP13815 bzw. AY253983 (Nukleinsäuresequenz und entsprechende Aminosäuresequenz) der öffentlich zugänglichen Datenbank des NCBI.

Claims

Patentansprüche

1. Mittel enthaltend eine Protease, die in einem Bakterienstamm der Art Stenotrophomonas maltophilia natürlicherweise vorhanden ist und/oder die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 8 oder SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz in einem Teilstück von mindestens 100 zusammenhängenden Aminosäureresten mindestens zu 50% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und ganz besonders bevorzugt zu 100%.

2. Mittel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es ein Waschmittel, Handwaschmittel, Spülmittel, Handgeschirrspülmittel, Maschinengeschirrspülmittel, Reinigungsmittel, Zahnprothesen- oder Kontaktlinsenpflegemittel, Nachspülmittel, Desinfektionsmittel, kosmetisches Mittel, pharmazeutisches Mittel oder ein Mittel zur Behandlung von Filtermedien, Textilien, Pelzen, Papier, Fellen oder Leder, ist, insbesondere ein Wäschewaschmittel oder ein Geschirrspülmittel.

3. Mittel nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es als Einkomponentensystem vorliegt oder dass es in mehrere Komponenten aufgeteilt ist, und insbesondere eines, das die Protease in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels enthält.

4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es in fester Form vorliegt, insbesondere als rieselfähiges Pulver mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l, oder dass es in pastöser oder in flüssiger Form vorliegt.

5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für die Protease undurchlässigen Substanz umhüllt ist.

6. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es eines oder mehrere weitere Enzyme umfasst, insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, ß-Glucosidase, Carrageenase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase.

7. Verwendung eines Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Entfernung von protease- sensitiven Anschmutzungen auf Textilien oder harten Oberflächen.

8. Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6 angewendet ist.

9. Protease umfassend eine Aminosäuresequenz, die in einem Teilstück von mindestens 100 zusammenhängenden Aminosäureresten zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 97,2% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 6 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 93,7% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 94%, 94,25%, 94,5%, 94,75%, 95%, 95,25%, 95,5%, 95,75%, 96%, 96,25%, 96,5%, 96,75%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 8 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 92,4% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 92,75%, 93%, 93,25%, 93,5%, 93,75%, 94%, 94,25%, 94,5%, 94,75%, 95%, 95,25%, 95,5%, 95,75%, 96%, 96,25%, 96,5%, 96,75%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 10 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 96,8% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 92,4% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 92,75%, 93%, 93,25%, 93,5%, 93,75%, 94%, 94,25%, 94,5%, 94,75%, 95%, 95,25%, 95,5%, 95,75%, 96%, 96,25%, 96,5%, 96,75%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, und insbesondere eine, die in einem Bakterienstamm der Art Stenotrophomonas maltophilia natürlicherweise vorhanden ist.

10. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie für eine Protease nach Anspruch 9, kodiert, insbesondere eine, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die in einem Teilstück von mindestens 300 zusammenhängenden Nukleotiden zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 95% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 5 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 90% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 7 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 90% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 9 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 90% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 11 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 90% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%, oder zu der in SEQ ID NO. 13 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 90% identisch ist, insbesondere zunehmend bevorzugt zu mindestens 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,25%, 97,5%, 97,75%, 98%, 98,25%, 98,5%, 98,75%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100%.

11. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäure nach Anspruch 10, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor.

12. Nicht menschliche Wirtszelle, die eine Protease nach Anspruch 9 oder ein Fragment derselben beinhaltet oder die zu deren Herstellung angeregt werden kann, vorzugsweise unter Einsatz eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 11 , insbesondere eine, die die Protease oder ein Fragment derselben in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert.

13. Wirtszelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Zellkern besitzt.

14. Wirtszelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Bacillus und Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus und Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia.

15. Verfahren zur Herstellung einer Protease gemäß Anspruch 9, insbesondere unter Einsatz einer Nukleinsäure nach Anspruch 10, vorzugsweise unter Einsatz eines Vektors nach Anspruch 11 , besonders bevorzugt unter Einsatz einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 bis 14.

16. Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine Protease nach Anspruch 9 proteolytisch aktiv ist, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist.

17. Verwendung einer Protease nach Anspruch 9 zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist.