WO2008153447A2 - Convection polymerase chain reaction method - Google Patents

Convection polymerase chain reaction method Download PDF

Info

Publication number
WO2008153447A2
WO2008153447A2 PCT/RU2008/000462 RU2008000462W WO2008153447A2 WO 2008153447 A2 WO2008153447 A2 WO 2008153447A2 RU 2008000462 W RU2008000462 W RU 2008000462W WO 2008153447 A2 WO2008153447 A2 WO 2008153447A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pcr
reaction
temperature
dna
convection
Prior art date
Application number
PCT/RU2008/000462
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2008153447A3 (fr
Inventor
Dmitry Alekseevich Chemeris
Aleksei Viktorovich Chemeris
Eduard Gavisovich Magdanov
Ravil Rinatovich Garafutdinov
Vener Absatarovich Vakhitov
Said Fedorovich Urmancheev
Yury Anatolievich Lebedev
Original Assignee
Institut Biokhimii I Genetiki Ufimskogo Nauchnogo Tsentra Ran
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Biokhimii I Genetiki Ufimskogo Nauchnogo Tsentra Ran filed Critical Institut Biokhimii I Genetiki Ufimskogo Nauchnogo Tsentra Ran
Priority to US12/663,248 priority Critical patent/US20110033899A1/en
Priority to EP08794074.8A priority patent/EP2157187A4/en
Publication of WO2008153447A2 publication Critical patent/WO2008153447A2/ru
Publication of WO2008153447A3 publication Critical patent/WO2008153447A3/ru

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B01L7/525—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples with physical movement of samples between temperature zones
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/18—Means for temperature control
    • B01L2300/1805—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/18—Means for temperature control
    • B01L2300/1805—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks
    • B01L2300/1827—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks using resistive heater
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0442—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces thermal energy, e.g. vaporisation, bubble jet
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0442—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces thermal energy, e.g. vaporisation, bubble jet
    • B01L2400/0445—Natural or forced convection
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0442—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces thermal energy, e.g. vaporisation, bubble jet
    • B01L2400/0448—Marangoni flow; Thermocapillary effect
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0472—Diffusion
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5082—Test tubes per se
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • B01L3/50851—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates specially adapted for heating or cooling samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the invention relates to molecular biology and biotechnology and is associated with the analysis of nucleic acid molecules by amplification of their specific fragments. It can be used in DNA diagnostics, including in the field, in medicine, veterinary medicine, sanitary and epidemiological studies to detect pathogens of dangerous infections, including possible bioterrorist attacks, in forensics to identify criminals, in the food industry when identifying food from genetically modified organisms, determining the quality of raw materials, etc.
  • PCR-PB polymerase chain reaction
  • PCR requires a cyclical change in temperature, because in order for a new cycle to begin, amplicons must be denatured (usually at a temperature of about 95 ° C), followed by annealing of the primers (most often at temperatures from 50 to 6 ° C) and their elongation (most commonly used temperatures are 72-75 0 C). But in view of the fact that temperature transitions in the reaction block and, accordingly, in the reaction mixture do not occur instantaneously, considerable time is spent on heating and cooling the block itself and then the contents of the tubes to the desired temperature values, which often takes up to 80% of the total reaction time .
  • reaction blocks of some high-speed thermal cyclers are not made of commonly used aluminum, but of gilded silver, which conducts heat much better, but is noticeably more expensive.
  • amplification of DNA fragments up to 1 thousand pairs of nucleotides in size for 25-30 cycles in thermal cyclers of this type takes from 30 minutes to 2 hours.
  • thermo cyclers based on Peltier elements are devices where very fast heating (up to 15 ° C / sec) is carried out by a powerful infrared lamp, and cooling is performed by a powerful fan [Wittwer et al., 1990; 1995].
  • a powerful infrared lamp for carrying very fast heating
  • cooling is performed by a powerful fan
  • some drawback of such devices is that the reaction is usually carried out in special glass capillaries, and not in standard polypropylene tubes, which are noticeably cheaper and more convenient.
  • a faster temperature change in the reaction block is achieved by alternately supplying hot and cold gases under pressure, which, however, significantly complicates the entire structure. So, one of the fastest DNA thermocyclers at the end point, working due to the action of gases, is called PCRJet. It is reported that with its help, 35 cycles are stacked in 8 minutes [ ⁇ bme Canalr Canalt réellel., 2004].
  • a US patent for a thermal cycler based on the same principle refers to a change in temperature at a rate of 17 0 C per second [Quittapar, Nelsop, 2002].
  • a constantly changing inhomogeneous temperature in the reaction mixture is also characteristic of cases of PCR using the effect of thermal convection.
  • the temperature inside the reaction mixture changes due to the gradient of the surface tension force caused by temperature differences, and this convection cell is called the Marangoni cell.
  • a method for PCR was proposed, designed to amplify not in test tubes, but in a flowing microfluidic device [Le et al., 2006]. Its disadvantage is the low reaction rate and poor scalability.
  • Another mechanism for moving the fluid layers underlying the so-called Benard-Rayleigh convection cell is driven by buoyancy, which is the difference between Archimedean and gravity.
  • a convection cell for PCR was proposed, which is a vertical channel with a depth of 1.5 cm and a volume of 35 ⁇ l in a Plexiglas cube [Krishpap et al., 2002]. From below, the cube was heated to 97 0 C, and from above it was thermostated at a temperature of 61 0 C. As a result, a specific PCR product was produced after 1.5 hours of reaction, the amount of which was sufficient to be seen using agarose gel electrophoresis.
  • reaction vessels also proposed in this work was 9 cm sections of a polymer tube containing 15 ⁇ l of liquid. As in the case of the cartridge with wells, some overflow was also recommended here when filling, which must be done by bending the tube in the shape of the letter U. Although in this case, the presence of a small air bubble is not so dangerous for the reaction to pass. Closing the tube into the ring after filling it is carried out with a small segment of another tube of suitable diameter, after which such a reaction vessel can be shaped into different shapes, providing the appropriate temperatures for the corresponding sections of the tube to allow convection cells and fluid flows to occur.
  • reaction vessel as a thick-walled glass tube open from the upper side. Its height was 55-60 mm, the inner diameter was 2 mm, the outer diameter was 8 mm, and the sealed lower end had a wall thickness of 3 mm. It was placed in a solid reaction block, divided by an insulator into the upper and lower parts, where each had its own temperature. The target product on electrophoresis appeared only after an hour of incubation, and during convection PCR, the reaction vessel was under a nitrogen pressure of 1, 2 atm. All these difficulties also cast doubt on the massive use of such convection PCR.
  • the purpose of the invention is to significantly accelerate using convection based on the buoyancy force, the course of PCR and simplify its implementation while maintaining a high specificity of the reaction.
  • the essence of the invention lies in the fact that the rapid amplification of the target PCR products is carried out in a special DNA thermal cycler equipped with a special reaction thermal block, which provides standard polypropylene tubes in the reaction vessels with an inclined temperature gradient oriented at an angle to the direction of gravity.
  • the reaction block in a convection DNA thermal cycler consists of two aluminum (or from another suitable metal) strips with special samples (for the bottom) and curvatures (for the upper or side strip), which provide the most tight contact with the desired in situ reactive polypropylene 0.2 ml tubes containing usually 30 ⁇ l of the reaction mixture (Fig. 1). Maintaining the required temperature of metal strips is carried out using Peltier elements and is controlled by the processor. Due to the short reaction time (1-5 minutes), it is not necessary to prevent evaporation using either a hot cap or layering of mineral oil.
  • the lower temperature (temperature of denaturation) instead of an aluminum strip is maintained using a metal (aluminum) plate with the corresponding numerous samples, the number of which coincides with the number of tubes used and represents the capacity of the thermal cycler.
  • the shape of the samples repeats the profile of the near-bottom part of the tube so that close contact is ensured only on one side of the bottom and on the side. Due to the standard square-nested arrangement of the tubes, this reaction unit does not require alteration of standard optical modules to record the progress of the reaction in real time.
  • one cycle takes about 2-3 seconds and in 1-2 minutes it takes from 20 to 60. Due to the fact that the liquid in the middle part of the tube describes a smaller ellipse, the DNA molecules in it do not appear in the high temperatures where denaturation could occur amplicons and, accordingly, then annealing the primers, accompanied by their elongation. However, due to the diffusion and fluctuations of the flows, the fluid layers from the central part are displaced and are also involved in this temperature cycle. It is absolutely unimportant that all amplicons at the same time do not behave the same. The main thing is that so many molecules have time to multiply that it can be recorded either at the end point by electrophoresis or in real time by the glow of the corresponding solvent (s).
  • convection PCR is not to produce extended DNA fragments for their subsequent cloning or sequencing, but it is designed for mass analysis, where amplicons are usually not large , and you need only a large method throughput when conducting diagnostic tests. So, for carrying out specific PCR it is quite enough to detect a fragment of about 40 pairs of nucleotides using primers annealed butt-to-face (on different chains) or even with a conditional overlap of 1 nucleotide.
  • thermostable DNA polymerases The speed of operation of many thermostable DNA polymerases is very high and in the moments (less than a second) that the amplicon with the annealed primer is in the zone optimal for the elongation of the DNA chain, the enzyme manages to build 20 or more nucleotides.
  • FIG. 2 using convection PCR with an inclined temperature gradient, it is quite possible to confidently amplify DNA fragments with a length of at least up to 100 pairs of nucleotides.
  • thermoconvection controlled polymerase chain reaction The proposed method for amplification of specific DNA or RNA fragments using a thermoconvection controlled polymerase chain reaction is illustrated by the following examples.
  • the figure 1 shows a diagram of the application of heating (cooling) points, which ensure the appearance of an inclined temperature gradient inside the reaction tube, oriented at an angle to the direction of gravity.
  • Figure 2 shows an electrophoretic analysis of convection PCR products with an inclined temperature gradient in an 8% polyacrylamide gel amplified using thermostable Vpt exo DNA polymerase.
  • PCR was carried out in 30 ⁇ l of the reaction mixture containing a buffer (40 mm Tris-Hcl pr ⁇ . O, 2.5 mm MgCl 2 , 25 mm KCl); 1 unit Act. Taq DNA polymerase; by
  • PCR was carried out in an experimental sample of convection DNA amplifier, where the temperature was maintained at the bottom of the tube at 95 ° C, and the temperature optimal for annealing the selected primers was set in the place located obliquely from the first.
  • the application to the indicated places (Fig. 1) of the denaturation and annealing temperatures ensured the formation of an inclined temperature gradient and the occurrence of convection.
  • the incubation time ranged from 1 minute to 5 minutes.
  • thermosusler forarid PCR // CIm. Lab. Med. 2007.
  • V.27. P.215-223. Wermeth W. J., Ricards J.B., Milan F. P. Compatible Driver PCR Thermal Susp; // US Patent No. 6,586,233 B2. JuI. 1, 2003.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕР АЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ПОМОЩЬЮ КОНВЕКЦИИ
Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии и связано с анализом молекул нуклеиновых кислот путем амплификации их специфичных фрагментов. Оно может быть использовано при проведении ДНК- диагностики, в том числе в полевых условиях, в медицине, ветеринарии, санитарно-эпидемиологических исследованиях для обнаружения возбудителей опасных инфекций, включая возможные биотеррористические атаки, в криминалистике для идентификации преступников, в пищевой промышленности при выявлении продуктов питания из генетически модифицированных организмов, определении качества сырья и т.д.
Существующие способы ДНК- диагностики основаны преимущественно на амплификации специфичных фрагментов ДНК или РНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ее модификаций. В последние годы, помимо обычной ПЦР по конечной точке, требующей электрофоретического разделения продуктов реакции (или их анализа каким-нибудь другим методом), все более широкое применение находит так называемая ПЦР в реальном времени (ПЦР -PB), когда детекция целевого продукта ведется прямо в ходе амплификации с помощью специальных ДНК-термоциклеров, оснащенных оптическим модулем. После своего появления в середине 80-х годов двадцатого столетия ПЦР, по крайней мере, по масштабу применимости довольно быстро стала фактически методом N°l в медико-биологических науках и в диагностике. Тем не менее, вслед за ПЦР большей частью на рубеже 90-х гг. появился целый ряд других реакций амплификации и способов высокочувствительной детекции специфичных фрагментов ДНК или РНК. Однако ни один из тех методов, ни появившихся позже в силу ряда причин так до сих пор и не смогли составить серьезной конкуренции ПЦР.
Для своего осуществления ПЦР требует циклического изменения температур, поскольку для того, чтобы начался новый цикл, должна произойти денатурация ампликонов (обычно при температуре около 950C) с последующим отжигом праймеров (чаще всего при температурах от 50 до 6O0C) и их удлинением (наиболее часто используются температуры 72-750C). Но ввиду того, что температурные переходы в реакционном блоке и соответственно в реакционной смеси не происходят мгновенно, значительное время тратится на то, чтобы нагреть и охладить сам блок и затем содержимое пробирок до нужных значений температур, на что часто уходит свыше 80% общего времени реакции. Для ускорения смены температур в самой реакционной смеси в ПЦР предложено использовать специальные тонкостенные полипропиленовые пробирки, поставляемые в настоящее время многими фирмами. Тем не менее, практически сразу после появления метода ПЦР стали разрабатываться всевозможные способы быстрого изменения температур в реакционных пробирках. Так, в первых коммерческих моделях термоциклеров, нагрев реакционных блоков осуществлялся за счет электрических тэнов, а охлаждение было или воздушным или водяным. В настоящее время, подавляющее большинство термоциклеров основаны на элементах Пельтье, позволяющих достаточно легко и быстро менять температуру в реакционном блоке. Скорости смены температур для основанных на элементах Пельтье разных моделей термоциклеров разных фирм варьируют в среднем от 2 до 60C в секунду. При этом реакционные блоки некоторых скоростных термоциклеров изготовлены не из обычно используемого алюминия, а из позолоченного серебра, которое гораздо лучше проводит тепло, но заметно дороже. Как правило, амплификация фрагментов ДНК размером до 1 тысячи пар нуклеотидов в течение 25-30 циклов в термоциклерах такого типа занимает от 30 минут до 2 часов.
Альтернативой термоциклерам на базе элементов Пельтье служат приборы, где очень быстрый нагрев (до 15°C/ceк) осуществляется мощной инфракрасной лампой, а охлаждение - мощным вентилятором [Wittwеr еt аl., 1990; 1995]. В этом случае как таковой реакционный блок отсутствует, и вместо него имеется воздушная камера, что исключает инерционность смены температур, поскольку воздух одной температуры очень быстро заменяется другим, благодаря чему типичные 30 циклов в таких приборах завершаются за 15 минут. Однако некоторым недостатком таких приборов является то, что реакция, как правило, ведется в специальных стеклянных капиллярах, а не в стандартных полипропиленовых пробирках, которые заметно дешевле и удобнее. Более быстрая смена температур в реакционном блоке достигается путем попеременной подачи под давлением горячего и холодного газов, что, впрочем, заметно усложняет всю конструкцию. Так, один из самых быстрых ДНК- термоциклеров по конечной точке, работающий за счет действия газов, получил название РСRJеt. Сообщается, что с его помощью 35 циклов укладываются в 8 минут [Еbmеiеr еt аl., 2004]. В выданном патенте США на термоциклер, основанный на том же принципе говорится о смене температур со скоростью 170C в секунду [Quiпtапаr, Nеlsоп, 2002]. Дополнительными недостатками этих моделей помимо необходимости применения газов под давлением является использование вместо удобных стандартных пробирок специальных кювет.
Другое решение относительно быстрой смены температур реализовано в приборах Rоbосусlеr фирмы Strаtаgепе, в которых имеется 4 блока, постоянно поддерживающих каждый свою температуру (или градиент температур в некоторых моделях), между которыми с помощью манипулятора происходит механическое перемещение реакционных планшет, на которое также требуется время и поэтому продолжительность одного только цикла составляет около 3 минут.
Все эти вышеописанные способы быстрой смены температур предусматривают еще и то, что внутри воздушной камеры или металлического термоблока будет обеспечена униформная температура, отличающаяся для расположенных в разных местах пробирок на десятые доли градуса.
Принципиально иным подходом являлся способ проведения ПЦР в термоциклере оригинальной конструкции (Nаkапо еt аl., 1994). Главной особенностью этого прибора было то, что полимеразная цепная реакция протекала не как обычно в пробирке, а в потоке жидкости, с помощью специального пневматического насоса постоянно движущейся по тефлоновому капилляру, отдельные отрезки которого были помещены в зоны с соответствующими температурами денатурации ДНК, отжига праймеров и построения новых цепей. Таким образом, определенные части общей реакционной смеси в этом случае находятся одновременно в разных температурных условиях, что кардинально отличает данный режим от классических подходов и несет некоторые преимущества, благодаря чему эта идея впоследствии получила заметное развитие при разработке ПЦР в микрожидкостных устройствах.
Постоянно меняющаяся неоднородная температура в реакционной смеси характерна и для случаев проведения ПЦР с использованием эффекта термоконвекции. В одном варианте конвекционной ПЦР смена температур внутри реакционной смеси происходит за счет градиента силы поверхностного натяжения, вызванного температурными различиями, и такая конвекционная ячейка носит название ячейки Марангони. На ее основе предложен способ проведения ПЦР, рассчитанный на проведение амплификации не в пробирках, а в проточном микрожидкостном устройстве [Lее еt аl., 2006]. Его недостатком является невысокая скорость протекания реакции и плохая масштабируемость.
Другой механизм перемещения слоев жидкости, лежащий в основе так называемой конвекционной ячейки Бенара-Рэлея, приводится в действие силой плавучести, являющейся разницей между архимедовой силой и силой тяжести. На этом принципе была предложена конвекционная ячейка для проведения ПЦР, представляющая собой вертикальный канал глубиной 1,5 см и объемом 35 мкл в кубике из оргстекла [Кrishпап еt аl., 2002]. Снизу производился нагрев кубика до 970C, а сверху он был термостатирован при температуре 610C. В результате за 1,5 часа реакции наработался специфичный ПЦР-продукт, количество которого оказалось достаточным, чтобы его увидеть с помощью агарозного гель- электрофореза.
Позднее этими же авторами [Кrishпап еt аl., 2004] конвекционная ПЦР- система была несколько улучшена, но сохранила основные недостатки в виде малой скорости реакции и трудности заполнения реакционных сосудов. Так, вместо одноканального кубика был изготовлен специальный многоколодцевый картридж из оргстекла, который сверху и снизу нагревался до нужных температур алюминиевыми пластинами. Однако серьезная проблема исключения образования вверху полости воздушных пузырьков, способных кардинально изменить устанавливаемый температурный режим, можно сказать была не решена, поскольку предлагалось слегка переполнять полость жидкостью, не допуская при этом перекрестного загрязнения образцов, что сразу свидетельствует об абсолютной нетехнологичности данного способа амплификации. Отбор жидкости из данных вертикальных весьма узких каналов после завершения реакции затруднителен или, по крайней мере, довольно длителен. Другим вариантом реакционных сосудов, также предложенных в этой работе, были 9-ти сантиметровые отрезки полимерной трубки, вмещающие в себя 15 мкл жидкости. Как и в случае с картриджем с колодцами, здесь также рекомендовался некоторый перелив при заполнении, которое необходимо производить, изогнув трубку в форме буквы U. Хотя в этом случае наличие небольшого воздушного пузырька и не столь опасно для прохождения реакции. Замыкание трубки в кольцо после ее заполнения производится маленьким отрезком другой трубки подходящего диаметра, после чего такому реакционному сосуду можно придавать разные формы, обеспечивая подвод к соответствующим участкам трубки нужных температур, для возникновения конвекционных ячеек и потоков жидкости. Сообщается, что в такой конвекционной ПЦР приблизительно 40 минут инкубации требуется для наработки целевого продукта, сравнимого по количеству с таковым при проведении обычной ПЦР [Кrishпап еt аl., 2004]. Способ проведения ПЦР в отрезке трубки получил в дальнейшем свое развитие, что позволило этим же авторам [Аgrаwаl, Ugаz, 2007; Аgrаwаl еt аl., 2007] создать карманный конвекционный термоциклер, питающийся от батареек типа AA. Но при этом такой портативный способ амплификации с помощью конвекционной ПЦР сохранил все недостатки своих более крупногабаритных предшественников.
Еще один тип конвекционной ячейки для проведения ПЦР был предложен другими авторами [Вrаuп еt аl., 2003]. Несмотря на то, что им удалось добиться относительно высокой скорости амплификации, завершающейся приблизительно за 10 минут, благодаря тому, что время, затрачиваемое на один стандартный цикл (денатурация, отжиг, элонгация) составляло всего около 15 секунд, их реакционный сосуд представлял собой тонкий слой жидкости между покровными стеклами для микроскопических исследований, герметизированных силиконом, и никак не мог быть рекомендован для массовых экспериментов и тем более для ДНК-диагностики. Еще более ел ожноу строенная ячейка с вертикальным градиентом температур, в которой должна возникать конвекция и происходить ПЦР, предложена в патенте США N° 6,586,233 [Веппеt еt аl., 2003]. Однако массовость применения этого способа конвекционной ПЦР ввиду сложности и явной дороговизны самой рабочей камеры, где происходит амплификация, крайне сомнительна. В работе других авторов [Нwапg еt аl., 2004] реакционным сосудом служила открытая с верхней стороны толстостенная стеклянная трубка. Ее высота составляла 55-60 мм, внутренний диаметр - 2 мм, внешний диаметр - 8 мм, запаянный нижний конец имел толщину стенок 3 мм. Она помещалась в полнотелый реакционный блок, разделенный изолятором на верхнюю и нижнюю части, где для каждого задавалась своя температура. Целевой продукт на электрофорезе появлялся лишь после часовой инкубации, причем в ходе конвекционной ПЦР реакционный сосуд находился под давлением азота в 1 ,2 атм. Все эти сложности также ставят под сомнение массовое применение подобной конвекционной ПЦР.
Таким образом, ни один из предложенных в настоящее время способов конвекционной ПЦР не обеспечивает действительно быстрой смены температур и не рассчитан на широкомасштабное применение.
Ближайшими прототипами предлагаемому нами способу амплификации нуклеиновых кислот с помощью конвекционной ПЦР служат способы, основанные на конвекционных ячейках Бенара-Рэлея, поскольку вклад сил поверхностного натяжения, характерных для ячейки Марангони, в нашем случае несущественен.
Цель изобретения состоит в значительном ускорении с помощью конвекции, основанной на силе плавучести, протекания ПЦР и упрощении ее проведения с сохранением высокой специфичности реакции.
Сущность изобретения заключается в том, что быстрая амплификация целевых продуктов ПЦР ведется в специальном ДНК термоциклере, оснащенном особым реакционным термоблоком, обеспечивающем в реакционных сосудах, которыми служат стандартные полипропиленовые пробирки, наклонный градиент температуры, ориентированный под углом к направлению действия силы тяжести.
Реакционный блок в конвекционном ДНК-термоциклере представляет собой две алюминиевые (или из другого подходящего металла) полоски со специальными выборками (для нижней) и искривлениями (для верхней или боковой полоски), обеспечивающими максимально плотный контакт с нужными местами реакционных полипропиленовых 0.2 мл пробирок, содержащих обычно 30 мкл реакционной смеси (фиг. 1). Поддержание требуемой температуры металлических полосок осуществляется с помощью элементов Пельтье и управляется процессором. Ввиду короткого времени протекания реакции (1-5 минут) не требуется предотвращения испарения ни с помощью горячей крышки, ни наслаиванием минерального масла.
В другом варианте нижняя температура (температура денатурации) вместо алюминиевой полоски поддерживается с помощью металлической (алюминиевой) пластины с соответствующими многочисленными выборками, количество которых совпадает с числом используемых пробирок и представляет собой вместимость термоциклера. Форма выборок повторяет профиль околодонной части пробирки с таким расчетом, что плотный контакт обеспечивается только с одной стороны дна и сбоку. Ввиду стандартного квадратно-гнездового расположения пробирок этот реакционной блок не требует переделки стандартных оптических модулей для регистрации протекания реакции в режиме реального времени.
После приложения заданных температур к реакционным пробиркам внутри них очень быстро создается наклонный градиент температур, запускающий механизм конвекции, основанный на силе плавучести. Причем, благодаря наклонному градиенту температур возникает направленное движение слоев жидкости, в массе своей не разбивающееся на многочисленные ячейки Бенара как это часто происходит в случае приложения вертикального градиента температур. С помощью специальных пробных частиц была оценена скорость вращения жидкости по эллипсоподобному пути, составившая от 2 до 3 секунд на оборот, благодаря чему за это время жидкость из зоны с высокой температурой (зона денатурации) проходит зону средней температуры (нерабочая зона), попадает в зону низкой температуры (зона отжига), вновь попадает в зону средней температуры (зона элонгации) и затем опять в зону высокой температуры и т.д. Таким образом, один цикл занимает около 2-3 секунд и за 1-2 минуты их происходит от 20 до 60. Ввиду того, что жидкость в средней части пробирки описывает меньший эллипс, то молекулы ДНК, находящиеся в ней, не оказываются в зоне высокой температуры, где могла бы произойти денатурация ампликонов и соответственно затем отжиг праймеров, сопровождающийся их удлинением. Однако, благодаря имеющей место диффузии и флуктуациям потоков, слои жидкости из центральной части смещаются и оказываются также вовлеченными в этот температурный круговорот. При этом абсолютно неважно, что все ампликоны одновременно не ведут себя одинаково. Главное, чтобы успело размножиться молекул столько, что это можно будет регистрировать или по конечной точке электрофорезом или в реальном времени по свечению соответствующего кpacитeля(eй).
Что касается малого времени пребывания молекул ДНК в каждой из температурных зон, то следует заметить, что главное предназначение конвекционной ПЦР это не наработка протяженных фрагментов ДНК для их последующего клонирования или секвенирования, а она рассчитана на проведение массовых анализов, где размер ампликонов обычно не бывает большим, а нужна лишь большая пропускная способность метода при проведении диагностических тестов. Так, для проведения специфичной ПЦР вполне достаточно детектировать фрагмент размером около 40 пар нуклеотидов с помощью праймеров, отжигающихся встык (на разных цепях) или даже с условным перекрытием в 1 нуклеотид. При этом специфичность амплификации при правильном подборе праймеров будет обеспечена, поскольку число всех вариантов перебора азотистых оснований во фрагменте длиной 40 нуклеотидов составит гигантскую величину в 440, что приблизительно равно гептиллиону (1024) комбинаций и случайное нахождение таких участков нуклеотидной последовательности возможно с вероятностью 8x10" , и поскольку геномов с такими размерами не существует то, следовательно, такое событие можно считать крайне маловероятным.
Скорость работы многих термостабильных ДНК полимераз весьма высока и за те мгновения (менее секунды), что ампликон с отожженым праймером находится в зоне, оптимальной для элонгации цепи ДНК, фермент вполне успевает построить 20 и более нуклеотидов. Как можно видеть из фиг. 2 с помощью конвекционной ПЦР с наклонным градиентом температур вполне удается уверенно амплифицировать фрагменты ДНК длиной, по крайней мере, до 100 пар нуклеотидов. Время отжига праймеров и денатурации ДНК в виде образования и разрушения водородных связей, по разным оценкам измеряемое от пикосекунд до миллисекунд, также не является лимитирующим.
Предлагаемый способ амплификации специфичных фрагментов ДНК или РНК с помощью полимеразной цепной реакции, управляемой термоконвекцией, иллюстрируется нижеследующими примерами.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 показана схема приложения точек нагрева (охлаждения), обеспечивающих возникновение внутри реакционной пробирки наклонного градиента температуры, ориентированного под углом к направлению действия силы тяжести.
На фигуре 2 представлен электрофоретический анализ продуктов конвекционной ПЦР с наклонным градиентом температур в 8%-нoм полиакриламидном геле, амплифицированных с помощью термостабильной Vепt ехо- ДНК полимеразы. 1 - праймеры; 2 - продукты ПЦР разного размера, начиная с 60 пар нуклеотидов, с увеличением на 20 пар нуклеотидов (видны не полностью израсходованные праймеры).
Пример 1
Проведение конвекционной ПЦР
ПЦР проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей буфер (40 мМ Трис-НСl рrø.О, 2.5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl); 1 ед. акт. Таq ДНК полимеразы; по
0.5 пмоль каждого из 2 праймеров и соответствующее количество дистиллированной воды. ПЦР проводили в экспериментальном образце конвекционного ДНК-амплификатора, где в нижней части пробирки поддерживалась температура 95°C, а в месте, расположенном наискосок от первого задавалась температура, оптимальная для отжига выбранных праймеров.
Приложение к указанным местам (фиг. 1) температур денатурации и отжига обеспечивало формирование наклонного градиента температур и возникновение конвекции. Время инкубации варьировало от 1 минуты до 5 минут.
Пример 2 Электрофоретический анализ продуктов ПЦР
Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили в 8%-oм полиакриламидном геле в трис-ацетатном буфере рН 7.8 в неденатурирующих условиях при градиенте напряжения 4V на см длины геля в приборе вертикального типа в течение 4 часов. По завершению электрофореза гель после окрашивания бромистым этидием фотографировали в фотодокументационной системе GeI Саmеrа Sуstеm (UVP, Iпс). Литература
Аgrаwаl N., Наssап Y.A., Ugаz V.М. А Росkеt-Sizеd Сопvесtivе PCR Тhеrmосусlеr // Апgеw. Сhеm. Iпt. Ed. Епgl. 2007. V.46. P.4316-4319.
Аgrаwаl N., Ugаz V.М. А buоуапсу-drivеп соmрасt thеrmосусlеr fоr rарid PCR // CIm. Lаb. Меd. 2007. V.27. P.215-223. Веrmеt W. J., Riсhаrds J.B., Мilапоviсh F.Р. Сопvесtivеlу drivеп PCR thеrmаl- сусliпg // US Patent No 6,586,233 B2. JuI. 1, 2003.
Braun D., Gоddаrd N.L., Libсhаbеr А. Ехропепtiаl DNA rерliсаtiоп bу lаmiпаr сопvесtiоп // Рhуs. Rеv. Lеtt. 2003. V.91. 158103.
Еbmеiеr R., Whitney S., Аluguраllу S., Nelson M., Раdhуе N., Gоgоs G., ViIj oen HJ. Rапquе - Нilsсh vоrtех tubе thеrmосусlеr fоr DNA аmрlifϊсаtiоп // Iпstrum. Sсi. Тесhпоl. 2004. V.32. P.567-570.
Нwапg HJ., Кim J.H., Jеопg К. Меthоd апd арраrаtus fоr аmрlifiсаtiоп оf пuсlеiс асid sеquепсеs bу usiпg thеrmаl сопvесtiоп // US Patent Аррliсаtiоп Publication No 2004/0152122 Al. Аug. 5, 2004. Krishnan M., Аgrаwаl N., Вurпs M.A., Ugаz V.М. Rеасtiопs апd fluidiсs iп miпiаturizеd паturаl сопvесtiоп sуstеms // Апаl. Сhеm. 2004. V.76. P.6254-6265.
Krishnan M., Ugаz V.M., Вurпs М.А. PCR iп а Rауlеigh-Вепаrd сопvесtiоп сеll // Sсiепсе. 2002. V.298. P.793.
Lее Y-S., Кuk К., Oh Y-S., Shih S-H., Кim M-S. Роlуmеr сhаiп rеасtiоп арраrаtus usiпg Маrапgопi соvесtiоп апd роlуmеr сhаiп rеасtiоп mеthоd usiпg thе same // US Patent Аррliсаtiоп Publication No 2006/0216725 Al. Sер. 28, 2006.
Nаkапо H., Маtsudа К., Yоhdа M., Nаgатuпе Т., Епdо L, Yатапе T. Нigh sрееd роlутеrаsе сhаiп rеасtiоп iп сопstапt flоw // Вiоsсi. Вiоtесh. Вiосhет. 1994. V.58. P.349-352. Quiпtапаr А., Nеlsоп R.М. Нigh sрееd рrосеss апd арраrаtus fоr атрlifуiпg
DNA // US Patent No. 6,472,186 Bl. Осt. 29, 2002.
Wittwеr СТ., Fillтоrе G.C., Gаrliпg DJ. Мiпiтiziпg thе tiте rеquirеd fоr DNA amplification by efficient heat transfer tо smаll sаmрlеs // Апаl. Вiосhеm. 1990. V.186. P.328-331.
Wittwеr СТ., Нillуаrd D.R., Ririе К.М. Rарid thеrmаl сусliпg dеviсе // US РаtепtNо 5,455,175. Осt. 3, 1995.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ амплификации специфичных фрагментов нуклеиновых кислот с помощью полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что благодаря эффекту ускоренной конвекции, возникающей под действием силы плавучести, вызванной прилагаемым к реакционному сосуду наклонным градиентом температур, ориентированным под углом к направлению действия силы тяжести, циклические смены температур, необходимые для многократного последовательного осуществления стадий денатурации, отжига и элонгации, в реакционной смеси за счет постоянного направленного перемешивания слоев жидкости происходят очень быстро.
2. Способ по п.l, отличающийся тем, что используют реакционный сосуд, представляющий собой стандартную полипропиленовую пробирку.
3. Способ по п.l, отличающийся тем, что регистрация процесса амплификации нуклеиновых кислот ведется в режиме реального времени.
4. Способ по п.l, отличающийся тем, что приложение одинаковых температур к соответствующим частям реакционного сосуда и их синхронная смена вместо возникновения градиента температур обеспечивает достаточную однородность температуры для всей жидкости и при необходимости позволяет проводить обычную ПЦР.
PCT/RU2008/000462 2007-06-14 2008-07-11 Convection polymerase chain reaction method WO2008153447A2 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/663,248 US20110033899A1 (en) 2007-06-14 2008-07-11 Convection polymerase chain reaction method
EP08794074.8A EP2157187A4 (en) 2007-06-14 2008-07-11 METHOD FOR IMPLEMENTING CONVECTION POLYMERASE CHAIN REACTION

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2007121893 2007-06-14
RU2007121893/10A RU2413770C2 (ru) 2007-06-14 2007-06-14 Способ проведения полимеразной цепной реакции с помощью конвекции

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2008153447A2 true WO2008153447A2 (en) 2008-12-18
WO2008153447A3 WO2008153447A3 (fr) 2009-02-12

Family

ID=40130343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2008/000462 WO2008153447A2 (en) 2007-06-14 2008-07-11 Convection polymerase chain reaction method

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20110033899A1 (ru)
EP (1) EP2157187A4 (ru)
RU (1) RU2413770C2 (ru)
WO (1) WO2008153447A2 (ru)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102876569A (zh) * 2011-07-11 2013-01-16 瑞基海洋生物科技股份有限公司 用于热对流聚合酶连锁反应装置的毛细管
RU2018103106A (ru) * 2012-06-28 2019-02-22 Флюоресентрик, Инк. Устройство для обнаружения химического индикатора
US20180264476A1 (en) * 2015-09-16 2018-09-20 Fluoresentric, Inc. Apparatus, systems and methods for dynamic flux amplification of samples
CN109554295B (zh) * 2019-01-21 2022-03-29 武汉理工大学 远洋船员的pcr扩增与疾病检测装置
CN112899151A (zh) * 2021-02-01 2021-06-04 青岛迪诺瓦基因科技有限公司 一种流动液体变温装置及其使用方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5455175A (en) * 1990-06-04 1995-10-03 University Of Utah Research Foundation Rapid thermal cycling device
US6472186B1 (en) * 1999-06-24 2002-10-29 Andre Quintanar High speed process and apparatus for amplifying DNA
US6586233B2 (en) * 2001-03-09 2003-07-01 The Regents Of The University Of California Convectively driven PCR thermal-cycling
KR100488281B1 (ko) * 2001-09-15 2005-05-10 아람 바이오시스템 주식회사 열 대류를 이용한 염기서열 증폭 방법 및 장치
US7537890B2 (en) * 2003-10-03 2009-05-26 The Regents Of The University Of Michigan Methods of performing biochemical reactions in a convective flow field
KR100647289B1 (ko) * 2004-09-15 2006-11-23 삼성전자주식회사 마랑고니 대류를 이용한 ｐｃｒ 장치 및 이를 이용한ｐｃｒ 방법
RU2005132940A (ru) * 2006-03-01 2007-11-27 Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН (RU) Способ детекции специфических фрагментов днк или рнк с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
US8735103B2 (en) * 2006-12-05 2014-05-27 Electronics And Telecommunications Research Institute Natural convection-driven PCR apparatus and method using disposable polymer chip

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of EP2157187A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2413770C2 (ru) 2011-03-10
US20110033899A1 (en) 2011-02-10
EP2157187A2 (en) 2010-02-24
EP2157187A4 (en) 2014-12-24
RU2007121893A (ru) 2008-12-20
WO2008153447A3 (fr) 2009-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhu et al. The vision of point-of-care PCR tests for the COVID-19 pandemic and beyond
Auroux et al. Miniaturised nucleic acid analysis
US20020068357A1 (en) Miniaturized integrated nucleic acid processing and analysis device and method
Dimov et al. Integrated microfluidic tmRNA purification and real-time NASBA device for molecular diagnostics
Santiago-Felipe et al. Isothermal DNA amplification strategies for duplex microorganism detection
EP1045038A1 (en) Rapid heat block thermocycler
US10195610B2 (en) Cartridge-based thermocycler
JP2002010777A (ja) 反応容器、反応装置および反応液の温度制御方法
US20090226972A1 (en) Rapid Microfluidic Thermal Cycler for Nucleic Acid Amplification
ES2621347T3 (es) Cuantificación de muestras de títulos altos por PCR digital
JP5876569B2 (ja) 物質の温度を変えるためのシステム及び方法
US20100159582A1 (en) Disposable multiplex polymerase chain reaction (pcr) chip and device
McCalla et al. Microfluidic reactors for diagnostics applications
JP2015532094A (ja) ハニカムチューブ
Shi et al. Real-time PCR of single bacterial cells on an array of adhering droplets
WO2008153447A2 (en) Convection polymerase chain reaction method
US9803238B1 (en) Method and apparatus for purifying nucleic acids and performing polymerase chain reaction assays using an immiscible fluid
Xiang et al. Advances in improvement strategies of digital nucleic acid amplification for pathogen detection
US8389273B2 (en) Polymerase chain reaction method, polymerase chain reaction droplet device, and polymerase chain reaction droplet device array
Li et al. Rapid detection of genetically modified organisms on a continuous-flow polymerase chain reaction microfluidics
CN116440969A (zh) 具有优化的相流的微流控芯片架构
US20120088234A1 (en) Device for performing pcrs
US20200216875A1 (en) Nucleic acid determination method
Ugaz et al. Novel convective flow based approaches for high-throughput PCR thermocycling
US20190344280A1 (en) Fast pcr with molecular crowding

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08794074

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008794074

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12663248

Country of ref document: US