WO2008145110A1 - Verfahren und vorrichtung zur charakterisierung einer probe mit zwei oder mehr optischen fallen - Google Patents

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WO2008145110A1
WO2008145110A1 PCT/DE2008/000897 DE2008000897W WO2008145110A1 WO 2008145110 A1 WO2008145110 A1 WO 2008145110A1 DE 2008000897 W DE2008000897 W DE 2008000897W WO 2008145110 A1 WO2008145110 A1 WO 2008145110A1
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optical
traps
light
probe
sample
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PCT/DE2008/000897
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Sven-Peter Heyn
Jacob Kerssemakers
Detlef Knebel
Helge Eggert
Torsten JÄHNKE
Jörn KAMPS
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Lpi Light Power Instruments Gmbh
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    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/32—Micromanipulators structurally combined with microscopes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y35/00—Methods or apparatus for measurement or analysis of nanostructures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q10/00—Scanning or positioning arrangements, i.e. arrangements for actively controlling the movement or position of the probe
    • G01Q10/04—Fine scanning or positioning
    • G01Q10/06—Circuits or algorithms therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q30/00—Auxiliary means serving to assist or improve the scanning probe techniques or apparatus, e.g. display or data processing devices
    • G01Q30/04—Display or data processing devices
    • G01Q30/06—Display or data processing devices for error compensation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for measuring properties of a sample by means of a scanning probe method, in particular with a "photonic force microscope” (PFM), also called light force microscope.
  • PFM photonic force microscope
  • the PFM is a scanning probe method in which the probe is represented by a particle or a plurality of particles trapped in an optical trap.
  • the optical trap fulfills the role of the cantilever, as it is known from atomic force microscopy.
  • the position of the optical trap can be changed by movable or variable optical elements in the beam path (acousto-optic deflectors (AOD), galvanically suspended mirrors, spatial light modulators (SLM), piezoelectrically suspended mirrors).
  • AOD acousto-optic deflectors
  • SLM spatial light modulators
  • the position of a trapped particle or a plurality of trapped particles can be determined by a detection system. Here one differentiates basically two methods.
  • Back Focal Plane Interferometry uses the interference of the light scattered by the particle with the transmitted light to obtain the exact three-dimensional position of the particle within the focus volume of the optical trap.
  • Measuring signal are the intensity of the transmitted light, as well as the difference signals of a quadrant photodiode (QPD).
  • QPD quadrant photodiode
  • US Pat. No. 6,833,923 discloses a light force microscope in which the detection system is based on the described interferometric measuring method.
  • the described detection systems have in common that the detection is based on interaction of the light forming the optical trap with the particle within the optical trap. An interaction of this light with the sample is undesirable, but can not be avoided. Thus, local changes result in refractive index and / or absorption coefficient the sample to changes in the measurement signal, which is used for location. This can lead to errors in the determination of the position and / or movement of the particle.
  • the disturbances can also be temporally variable, for example if they are living cells, or the sample is changed by interaction with the probe.
  • the object of the invention is to provide a method and a device which increases the possibilities of the scanning probe method for characterizing a sample.
  • disturbances of the sample or their effect on the measurement result, as caused by the interaction between the measurement setup and the sample, should be reduced.
  • the method according to the invention for scanning probe microscopic examination of a sample comprises the following:
  • the measurement data inevitably includes perturbations that result from the interaction between the light forming the optical trap and the sample.
  • the invention is based on the observation that the characterization of the sample can be improved by two or more optical traps by correlating the measurement data associated with each of the optical traps.
  • each location of the sample is measured at least twice, namely through the first and second optical traps, the measurement taking place in a relatively short time interval, e.g. within less than 20 ms. Due to the correlation of the data, mathematically systematic measurement errors, which are caused by the interaction of the optical trap with the sample, can be corrected.
  • the systematic errors can be detected and eliminated by correlation of the measurement data because the sample reacts differently to the optical trap occupied by a probe than to a trap occupied by no probe.
  • the two optical traps may act differently on the sample due to different characteristics of the light used (e.g., wavelength, polarization, or propagation direction).
  • the measured interaction between probe and sample e.g. The Von der Waals force between the probe and the sample is the same for both cases, each of which is occupied by a probe, in particular the same probe.
  • the measurements are due to the two optical traps in each case the same place within a short period of time, because thereby errors in the location determination, as they can be largely eliminated by a movement of the sample (eg a Brown's movement or a movement of a living sample).
  • a movement of the sample eg a Brown's movement or a movement of a living sample.
  • one of the two optical traps is occupied by a probe while the other optical trap contains no probe. This corresponds to a blank measurement with the second optical trap to determine the effect of the interaction between sample and - A -
  • the correlation of the measured data comprises, in particular, a subtraction of the measured data. In this case, all disturbances by the sample, which can lead to a falsified position determination of the probe, eliminated.
  • both optical traps may also contain a probe, either identical or different probes.
  • probes either identical or different probes.
  • there is also a different interaction between sample and probe so that systematic measurement errors caused thereby can also be eliminated by the differential measurement with both traps.
  • the focusing volumes of the two optical traps have identical dimensions. This embodiment is particularly preferred if a trap performs a blank measurement, thereby ensuring that the perturbations caused by the trap on the sample are the same for both measurements.
  • the two or more optical traps are formed by two or more independent beams simultaneously producing optical traps, or by traps being generated at a plurality of positions by a rapid change of position of a trap.
  • the change of position of a trap must be fast enough to cause particles or a probe, which due to external influences, such. Brown's see movement, moving, still in the focus volume.
  • An optical trap in the sense of this description, therefore need not be generated by a temporally continuous light beam.
  • the repetition rate need only be high enough to trap a probe in the trap for a period of time that is very large relative to the repetition rate, e.g. 10 minutes to capture.
  • the relative position of the traps relative to one another is adjustable in the three spatial dimensions according to an embodiment of the invention.
  • An example of realizing multiple traps that are adjustable in three spatial directions is shown, for example, in E. Klallman et al., "Applied Optics," Vol 36, No. 10 (1997)
  • the relative position can also be adjusted only in the lateral direction be.
  • the movement of the traps through the sample is coupled with each other in different ways.
  • a possible embodiment of the invention may provide that a probe makes a measurement, such as e.g. the recording of a topography and a second probe performs another measurement, e.g. a chemical picture. This can be done by different probes according to an embodiment of the invention. This makes it possible to separate the topography from the chemical measurement. Are e.g. Binding sites on a cell would not be recognizable without a knowledge of the topography, in particular including eventual disturbances. By using two or more traps, it is ensured that the time difference between the two measurements is minimal, so that dynamic changes in the sample do not affect the measurement.
  • Another embodiment of the invention provides for the use of one filled and one or more empty traps. If a probe is present in one of the traps while the others are empty, interference from the signal can be mathematically eliminated from the signal as soon as the filled traps and one of the empty traps have passed the same location. The difference in time between the passage of the two traps can be significantly less by using two or more independent traps than when using only one trap.
  • the two traps are moved one behind the other on a common trajectory, in particular at a constant distance, e.g. minimal of the simple wavelength in the medium and maximum of up to 50 ⁇ m.
  • the coupled movement of the traps may provide that two traps move along the predefined trajectory, with either the front trailing or trailing trailing traps containing a probe.
  • both traps may also contain probes, e.g. differ in their chemical properties.
  • the position of the trap of the movement of the probe will be tracked by means of a feedback. If such a movement takes place with a probe filled trap, the coupled movement of the traps may provide that one or more traps follow this movement. If the direction of the movement of the filled trap can be approximately predetermined, for example by an algorithm, then one or more traps may precede this movement.
  • the coupled movement of the two traps may also provide that the movements of one or more empty traps form one or more shells around the trapped trap.
  • the spherical shells can be completely or only partially closed.
  • the position of at least one empty trap may be detected by a fast-moving optical element such as e.g. an acousto-optic deflector or a galvanically suspended mirror are controlled.
  • This empty trap may then scan a plurality of positions around the filled trap during standstill or comparatively low movement of the filled trap. This makes it more probable that the probe's path has already been scanned by an empty trap when the probe is controlled by external influences.
  • the invention relates to a device which is able to detect the signals of at least two traps independently.
  • the inventive method is to be fulfilled in an optimal way.
  • Different physical principles can be used individually or in combination to separate the signals.
  • the trap When the trap is filled, its signal consists of the combination of all possible disturbances in the beam path and the position of the probe. When the trap is empty, the signal from the trap will only contain the eventual disturbances.
  • a preferred embodiment of the invention provides that the signals from two traps, whose polarization is perpendicular to each other, by a corresponding optical element such as. a polarizing beam splitter cube are separated. The signals of the two traps can then be detected at different locations.
  • a further embodiment of the invention provides that light of different wavelengths is used for the traps.
  • the number of traps is given by the number of different wavelengths used.
  • Signals of optical traps of various Wavelength can be separated by optical elements such as dichroic beam splitters and detected at different locations.
  • An embodiment of the invention can also provide for the separation of the signals from two traps whose light propagates in different propagation directions, in particular in opposite directions. Due to the different propagation direction, the signals of the traps are separated and can be detected at different locations.
  • the two traps can be generated by splitting the light of a laser or by using two lasers.
  • An embodiment of the invention may allow the common movement of the traps by one or more elements in the common beam path.
  • Such elements may include movable optical elements, e.g. Mirrors or lenses, but it can also be fixed optical elements such. acousto-optic deflectors or spatial light modulators. A movement of the light source is also conceivable.
  • a preferred embodiment of the invention may allow independent movement of the traps through one or more elements in separate beam paths.
  • Such elements may include movable optical elements, e.g. Mirrors or lenses, but it can also be fixed optical elements such. acousto-optic deflectors or spatial light modulators. If the traps are generated by different light sources, it is also conceivable to move these light sources.
  • An embodiment of the invention may also provide that one or more of the detectors are movable to follow a mobile signal.
  • the highest sensitivity is achieved when the signal is approximately equally distributed over the four quadrants. If the probe now moves in a PFM, the signal leaves the range of highest sensitivity, with large movement even the detection range. If the detector, e.g. By a piezoelectric phaser, the signal sensed, a higher sensitivity and a larger measuring range can be achieved.
  • a further embodiment of the invention may also provide that the Nachf ⁇ ihrung of the position signal not by moving the detector, but by elements in the beam path happens.
  • Such elements may be, for example, movable mirrors or lenses, or acousto-optical deflectors or spatial light modulators.
  • 1 shows a simplified illustration of two optical traps with possible interference of the optical path.
  • Fig. 2 is a scheme for generating two traps which differ in light polarization and the separation of the signal of the two traps.
  • Fig. 3 is a diagram for the generation of two traps which differ in the wavelength of light and the separation of the signal of the two traps. 4 shows a scheme for generating two traps which differ at least in the propagation direction and the spatially separate detection of the two signals.
  • Fig. 5a and b Scheme for possible coupled movements of two traps
  • Fig. 6 shows a scheme for possible coupled movements of two or more traps
  • the optical traps 1 and 2 are shown schematically, which are located at a fixed spatial distance.
  • the probe 4 shown in case 1 and probe 3 in case 2 should not necessarily be present at the same time and are both shown only to illustrate the optical traps.
  • a disturbance 5 which may be fixed for example on the cover glass 6.
  • the disorder 5 can also be freely movable.
  • the disturbance 5 leads to a change in the position signal of the probe 4 on the detector 7, while the position signal for the probe 3 on the detector 8 learn no change.
  • Fig. 2 shows the possible provision of two mutually polarized traps.
  • the light of the laser 4 is split in the polarizing beam splitter cube 5 into two sub-beams polarized perpendicular to one another. Through the two mirrors 6 and 7, the beams are deflected and brought together again in the polarizing beam splitter cube 8. Possibilities for dependent or independent movement of the traps are not shown here for the sake of clarity.
  • the objective 2 focuses the light within the sample chamber 1 and generates the optical traps. From the condenser 3, the light is bundled again and separated by the polarizing beam splitter 9 back to the polarization directions. The light is then detected directly by the detector 11 or after the deflection mirror 10 from the detector 12.
  • a structure is schematically illustrated, which allows the simultaneous generation of two traps with light of different wavelengths.
  • the detection of the position of probes in the traps is accomplished by separation by wavelength.
  • the two lasers 4 and 13 generate light of the frequencies vi and v2.
  • the light from the laser 4 is directed via the mirror 7 in to the lens 2, the light of the laser 13 via the dichroic beam splitter 14.
  • the lens 2 focuses the light within the sample chamber 1 and generates the optical traps.
  • the light is again bundled and separated by the dichroic beam splitter 15 according to the wavelengths. If the beam splitter 15 reflects light of frequency 1, this light is detected by the detector 11.
  • the transmitted in this case by the beam splitter 15 light of frequency v2 is directed through the mirror 10 to the detector 12 and detected there.
  • Fig. 4 shows the structure for the realization of two traps generated by counter propagating light.
  • the light of the laser 4 is directed by the mirror 7 to the lens 2 and focused there in the sample chamber.
  • the light of the laser 4 is then focused by the condenser 3 and directed by the beam splitter 17 to the detector 11.
  • the optional optical isolator 19 By means of the optional optical isolator 19, light of the laser 4 transmitted by the beam splitter 17 can be blocked.
  • light from the laser 20 is directed through the mirror 10 in the direction of the condenser 3, which focuses the light in the sample chamber 1 into an optical trap.
  • the objective 2 concentrates the light again and it is then directed by the beam splitter 16 to the detection 12.
  • the likewise optional optical isolator 18 blocks the light of the laser 20 transmitted by the beam splitter 16.
  • the object jektiv 2 for the light of the laser 4 at the same time as a condenser for the light of the laser 20 and the condenser 3 for the light of the laser 4 acts simultaneously as
  • a possible trajectory 43 is shown, along which the two probes 41 and 42 are moved.
  • the trajectory is shown as a straight line for simplified representation, but it can describe any path in three dimensions.
  • the order in which the two probes are moved along the trajectory can depend on the embodiment.
  • FIG. 5b shows the possibility that a trap 44 filled with a probe and an empty trap 45 move along the trajectory 44, wherein in FIG. 5b as well as in FIG. 6 the filled trap is indicated by the position of its probe and the empty trap (s) is represented by the blank (s) where a probe can be captured.
  • the trajectory is shown as a straight line for simplified representation, but it can describe any path in three dimensions. The order in which the two traps are moved along the trajectory may depend on the experiment.
  • FIG. 6 shows the diagram of the implementation when one or more empty traps 52 form a spherical shell around the trap 51 filled with a probe.
  • a two-dimensional cross-section through the spherical shell is shown here.
  • the center of the ball shell for example, can shift in the direction of this movement.
  • the spherical shell can be formed either by the simultaneous presence of multiple traps or by rapid change of position of a trap.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Untersuchen einer Probe (5, 6) mittels Rasterphotonenmikroskopie oder Lichtkraftmikroskopie, sowie eine entsprechend eingerichtete Vorrichtung. Das Verfahren bzw. die Vorrichtung sieht zwei optische Fallen (1, 2) vor, die in einem örtlichen Bereich der Probe (5, 6) bewegbar sind, wobei in wenigstens einer der beiden Fallen (1, 2) eine Sonde (3, 4) gefangen ist. Die Probe (5, 6) wird mit beiden Fallen (1, 2) gescannt und die Messdaten aus beiden Fallen (1, 2) werden getrennt erfasst und durch Korrelation ausgewertet. Durch das Verfahren lassen sich insbesondere Störsignale, die aus einer Wechselwirkung zwischen Probe und Lichtfalle resultieren, eliminieren.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Charakterisierung einer Probe mit zwei oder mehr optischen Fallen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung von Eigenschaften einer Probe mittels eines Rastersondenverfahren, insbesondere mit einem „Photonic force microscope" (PFM), auch Lichtkraftmikroskop genannt.
Hintergrund der Erfindung
Das PFM ist ein Rastersondenverfahren, bei dem die Sonde durch ein Partikel oder eine Vielzahl von Partikeln, die in einer optischen Falle gefangen sind, dargestellt wird. Die optische Falle erfüllt dabei die Rolle des Cantilevers, wie er aus der Rasterkraftmikroskopie bekannt ist. Die Position der optischen Falle kann dabei durch bewegliche oder veränderliche optische Elemente im Strahlengang (Akustooptische Deflektoren (AOD), galvanisch aufgehängte Spiegel, Spatial light modulators (SLM), Piezoelektrisch aufgehängte Spiegel) geändert werden. Weiterhin kann die Position eines gefangenen Partikels oder einer Mehrzahl von gefangenen Partikeln durch ein Detektionssystem bestimmt werden. Hierbei unterscheidet man grundsätzlich zwei Methoden. Bei der Back Focal Plane Interferometrywird die Interferenz des vom Partikel gestreuten Lichtes mit dem transmittierten Licht genutzt, um die genaue dreidimensionale Position des Partikels innerhalb des Fokusvolumens der optischen Falle zu erhalten. Messsignal sind dabei die Intensität des transmittierten Lichts, sowie die Differenzsignale einer Quadrantenphotodiode (QPD). Daneben existiert noch das Verfahren der Videomikroskopie, bei der die Erkennung der Bewegung der Partikel mittels computergestützter Bilderkennung eines beispielsweise durch eine CCD-Kamera aufgezeichneten Videos ge- schieht.
Aus der Patentschrift US 6,833,923 ist ein Lichtkraftmikroskop bekannt, bei dem das Detektionssystem auf der beschriebenen interferrometrischen Messmethode beruht.
Den geschilderten Detektionssystemen ist gemeinsam, dass die Detektion auf Interaktion des Lichtes, das die optische Falle bildet, mit dem Partikel innerhalb der optischen Falle beruht. Eine Interaktion dieses Lichtes mit der Probe ist unerwünscht, kann aber nicht vermieden werden. So führen örtliche Änderungen in Brechungsindex und/oder Absorptionskoeffizient der Probe zu Änderungen im Messsignal, das zur Ortsbestimmung verwendet wird. Dadurch kann es zu Fehlern in der Bestimmung der Position und/oder Bewegung des Partikels kommen. Die Störungen können dabei auch zeitlich veränderlich sein, wenn es sich dabei zum Beispiel um lebende Zellen handelt, oder aber die Probe durch Interaktion mit der Sonde ver- ändert wird.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, welches die Möglichkeiten des Rastersondenverfahrens zur Charakterisierung einer Probe erhöht. Insbesondere sollen Störungen der Probe, bzw. deren Auswirkung auf das Messergeb- nis, wie sie durch die Wechselwirkung zwischen dem Messaufbaus und der Probe hervorgerufen werden, verringert werden.
Gegenstand der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren gemäß dem unabhängigen Anspruch 1 sowie durch eine Vorrichtung gemäß dem unabhängigen Anspruch 16 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen und Ausgestaltungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum rastersondenmikroskopischen Untersuchen einer Pro- be, insbesondere mittels der Rasterphotonenmikroskopie, umfasst das Folgende:
Erzeugen von zwei optischen Fallen durch fokussiertes Licht mit zwei Fokussierungs- volumina, die in einem örtlichen Bereich der Probe bewegbar sind, wobei in wenigstens einem der beiden Fokussierungsvolumina eine Sonde angeordnet ist, Scannen der Probe mit den beiden optischen Fallen durch Bewegen ihrer Fokussie- rungsvolumina gegenüber der Probe,
Erfassen von Messdaten, welche der ersten optischen Falle, welche die Sonde enthält, zugeordnet sind, während des Scannens,
Erfassen von Messdaten, welche der zweiten optischen Falle zugeordnet sind, während des Scannes, - Auswerten der Messdaten durch Korrelieren der Messdaten, die der ersten bzw. der zweiten optischen Falle zugeordnet sind. Wie im Zusammenhang mit dem Stand der Technik erläutert, sind in den Messdaten zwangsläufig Störungen enthalten, die sich aufgrund der Wechselwirkung zwischen dem Licht, das die optische Falle bildet, und der Probe ergeben. Die Erfindung beruht nun auf der Beobachtung, dass sich die Charakterisierung der Probe durch zwei oder noch mehr optischer Fallen verbessern lässt, indem die Messdaten, welche jeweils einer der optischen Fallen zugeordnet ist, miteinander korreliert werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Korrelation der Messdaten von der ersten optischen Falle, die zu jeweils einem ersten Zeitpunkt des Scans erfasst wurden, mit den Messdaten der zweiten optischen Falle, die zu jeweils einem zweiten Zeitpunkt erfasst wurden, an dem sich das Fokussierungsvolumen der zweiten optischen Fallen an dem Ort oder an einem unmittelbar benachbarten Ort des Fokussierungsvolumens der ersten optischen Falle zum ersten Zeitpunkt befand. Durch dieses Verfahren wird jeder Ort der Probe wenigstens zweimal gemessen, nämlich durch die erste und durch die zweite optische Falle, wobei die Messung in einem verhältnismäßig kurzen zeitlichen Abstand erfolgt, z.B. innerhalb von weniger als 20 ms. Durch die Korrelation der Daten können rechnerisch systematische Messfehler, welche durch die Wechselwirkung der optischen Falle mit der Probe hervorgerufen werden, korrigiert werden. Beispielsweise können die systematischen Fehler ermittelt und durch Korrelation der Messdaten eliminiert werden, weil die Probe auf die mit einer Sonde besetzten optische Falle anders reagiert als auf eine mit keiner Sonde besetzten Falle. Ferner können die beiden optischen Fallen durch unterschiedliche Eigenschaften des verwendeten Lichts (z.B. Wellenlänge, Polarisation oder Propagationsrichtung) unterschiedlich mit der Probe einwirken. Die gemessene Wechselwirkung zwischen Sonde und Probe, wie z.B. die Von-der-Waals-Kraft zwischen Sonde und Probe, ist für beide Fallen, die jeweils mit einer Sonde, insbesondere der gleichen Sonde, besetzt sind, die Gleiche Dabei ist es von besonderem Vorteil, dass die Messungen durch die zwei optischen Fallen an jeweils dem gleichen Ort innerhalb einer kurzen Zeitspanne erfolgt, weil dadurch Fehler in der Ortbestimmung, wie sie durch eine Bewegung der Probe (z.B. eine Brown' sehe Bewegung oder eine Bewegung einer lebenden Probe) weitestgehend eliminiert werden können.
Gemäß einer Ausführungsform ist eine der zwei optischen Fallen mit einer Sonde besetzt, während die andere optische Falle keine Sonde enthält. Dies entspricht einer Leermessung mit der zweiten optischen Falle, um die Auswirkung der Wechselwirkung zwischen Probe und - A -
Falle auf die Messdaten wie vorhergehend beschrieben, auszuschließen. Bei diesem Verfahren umfasst die Korrelation der Messdaten insbesondere eine Differenzbildung der Messdaten. Hierbei werden alle Störungen durch die Probe, die zu einer verfälschten Positionsbestimmung der Sonde führen können, beseitigt.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform können auch beide optische Fallen eine Sonde enthalten, entweder gleiche oder unterschiedliche Sonden. Bei der Verwendung von unterschiedlichen Sonden ist auch eine unterschiedliche Wechselwirkung zwischen Probe und Sonde gegeben, so dass sich auch dadurch hervorgerufene systematische Messfehler durch die differenzielle Messung mit beiden Fallen eliminieren lassen.
Gemäß einer Ausführungsform besitzen die Fokussierungsvolumina der beiden optischen Fallen identische Abmessungen. Diese Ausführungsform ist insbesondere bevorzugt, falls eine Falle eine Leermessung durchfuhrt, weil dabei gewährleistet ist, dass die Störungen, die von der Falle an der Probe hervorgerufen werden, für beide Messungen die gleichen sind.
Gemäß einer Ausführungsform werden die zwei oder mehr optischen Fallen gebildet, indem zwei oder mehr unabhängige Strahlen gleichzeitig optische Fallen erzeugen, oder indem durch einen schnellen Positionswechsel einer Falle, Fallen an mehreren Positionen erzeugt werden. Der Positionswechsel der einen Falle muss dabei schnell genug sein, um Partikel bzw. eine Sonde, die sich aufgrund äußerer Einflüsse, wie z.B. der Brown' sehen Bewegung, bewegen, noch im Fokussierungsvolumen vorzufinden sind. Eine optische Falle, im Sinne dieser Beschreibung, muss daher nicht durch einen zeitlich kontinuierlichen Lichtstrahl erzeugt werden. Die Repetitionsrate muss nur hoch genug sein, um eine Sonde in der Falle für einen Zeitraum, der sehr groß gegenüber der Repetitionsrate ist, z.B. 10 Minuten, einfangen zu können.
Die relative Position der Fallen zueinander ist gemäß einer Ausführungsform der Erfindung in den drei Raumdimensionen einstellbar. Ein Beispiel zur Realisierung von mehreren Fallen, die in drei Raumrichtungen einstellbar sind, ist z.B. gezeigt in E. Fällman et äl., „Applied Op- tics", Band 36, Nr. 10 (1997). Diese oder andere Vorrichtungen können zur Erzeugung der zwei beweglichen Fallen gemäß der Erfindung vorgesehen sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die relative Position auch nur in lateraler Richtung einstellbar sein. Die Bewegung der Fallen durch die Probe ist dabei auf verschiedene Weise miteinander gekoppelt.
Eine mögliche Ausführung der Erfindung kann vorsehen, dass eine Sonde eine Messung durchfuhrt wie z.B. die Aufnahme einer Topographie und eine zweite Sonde eine andere Messung durchfuhrt, wie z.B. eine chemische Abbildung. Die kann gemäß einer Ausführungsform der Erfindung durch unterschiedliche Sonden erfolgen. Hierdurch ist es möglich die Topographie von der chemischen Messung zu trennen. Sind z.B. Bindungsstellen auf einer Zelle, so wären diese ohne eine Kenntnis der Topographie insbesondere inklusive eventu- eller Störungen, nicht erkennbar. Durch die Verwendung von zwei oder mehr Fallen wird dabei sichergestellt, dass der zeitliche Unterschied zwischen den beiden Messungen minimal ist und so dynamische Veränderungen in der Probe die Messung nicht beeinflussen.
Eine weitere Ausführung der Erfindung sieht die Verwendung einer gefüllten und einer oder mehrerer leerer Fallen vor. Befindet sich in einer der Fallen eine Sonde, während die anderen leer sind, können Störungen durch die Probe aus dem Signal rechnerisch eliminiert werden, sobald die gefüllte und eine der leeren Fallen den gleichen Ort passiert haben. Der zeitliche Unterschied zwischen Passage der beiden Fallen kann dabei durch die Verwendung von zwei oder mehr unabhängigen Fallen wesentlich geringer sein, als bei Verwendung nur einer Falle.
Gemäß einer Ausführungsform werden die zwei Fallen hintereinander auf einer gemeinsamen Trajektorie bewegt, insbesondere mit einem konstanten Abstand, z.B. minimal der einfachen Wellenlänge im Medium und maximal bis zu 50 μm.
Die gekoppelte Bewegung der Fallen kann dabei vorsehen, dass sich zwei Fallen entlang der vordefinierten Trajektorie bewegen, wobei entweder die in Bewegungsrichtung vordere oder die in Bewegungsrichtung hintere Falle eine Sonde enthalten kann. Bei einer solchen Bewegung können auch beide Fallen Sonden enthalten, die sich z.B. in ihren chemischen Eigenschaften unterscheiden.
Wird eine Bewegung der Sonde in einer Falle, hervorgerufen durch eine äußere Kraft, die auf die Sonde wirkt, detektiert, so wird mittels einer Rückkopplung die Position der Falle der Bewegung der Sonde nachgeführt werden. Erfolgt eine solche Bewegung der mit einer Sonde gefüllten Falle, so kann die gekoppelte Bewegung der Fallen vorsehen, dass eine oder mehrere Fallen dieser Bewegung folgen. Kann die Richtung der Bewegung der gefüllten Falle, durch z.B. einen Algorithmus, angenähert vorherbestimmt werden, so können auch eine oder mehrere Fallen dieser Bewegung vorausgehen.
Die gekoppelte Bewegung der beiden Fallen kann auch vorsehen, dass die Bewegungen einer oder mehrerer leerer Fallen eine oder mehrere Kugelschalen um die mit einer Sonde gefüllte Falle bilden. Die Kugelschalen können dabei vollständig oder nur teilweise geschlossen sein.
Die Position von mindestens einer leeren Falle kann über ein schnell bewegliches optisches Element wie z.B. einen akusto-optischen Deflektor oder einen galvanisch aufgehängten Spiegel gesteuert werden. Diese leere Falle kann dann während Stillstand oder vergleichsweise geringer Bewegung der gefüllten Falle eine Vielzahl von Positionen um die gefüllte Falle scannen. Dadurch wird es bei einer durch äußere Einflüsse gesteuerten Bewegung der Sonde wahrscheinlicher, dass der Weg der Sonde schon durch eine leere Falle gescannt wurde.
Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung, die in der Lage ist, die Signale von wenigstens zwei Fallen unabhängig voneinander zu detektieren. Hiermit ist das erfinderische Verfahren in optimaler Weise zu erfüllen. Dabei können verschiedene physikalische Prinzipien ein- zeln oder in Kombination zur Trennung der Signale verwendet werden. Bei gefüllter Falle besteht ihr Signal aus der Kombination aller eventueller Störungen im Strahlengang und der Position der Sonde. Bei leerer Falle enthält das Signal der Falle nur die eventuellen Störungen.
Eine bevorzugte Ausführung der Erfindung sieht vor, dass die Signale von zwei Fallen, deren Polarisation senkrecht zueinander steht, durch ein entsprechendes optisches Element wie z.B. einen polarisierenden Strahlteilerwürfel voneinander getrennt werden. Die Signale der beiden Fallen können dann an verschiedenen Orten detektiert werden.
Eine weitere Ausführung der Erfindung sieht vor, dass Licht unterschiedlicher Wellenlänge für die Fallen verwendet wird. Die Zahl der Fallen ist dabei durch die Zahl der verwendeten, unterschiedlichen Wellenlängen gegeben. Die Signale der optischen Fallen verschiedener Wellenlänge können durch optische Elemente, wie z.B. dicroitische Strahlteiler voneinander getrennt und an verschiedenen Orten detektiert werden.
Eine Ausführung der Erfindung kann auch die Trennung der Signale von zwei Fallen vorse- hen, deren Licht sich in unterschiedlichen Propagationsrichtungen, insbesondere in gegenläufige Richtungen, ausbreitet. Durch die unterschiedliche Ausbreitungsrichtung sind die Signale der Fallen getrennt und können an unterschiedlichen Orten detektiert werden. Die beiden Fallen können dabei durch Aufspaltung des Lichtes eines Lasers oder auch durch Verwendung von zwei Lasern erzeugt werden.
Eine Ausführung der Erfindung kann die gemeinsame Bewegung der Fallen durch ein oder mehrere Elemente im gemeinsamen Strahlengang erlauben. Solche Elemente können bewegliche optische Elemente wie z.B. Spiegel oder Linsen sein, es können aber auch feste optische Elemente wie z.B. akusto-optische Deflektoren oder räumliche Lichtmodulatoren sein. Eine Bewegung der Lichtquelle ist ebenfalls denkbar.
Eine bevorzugte Ausfuhrung der Erfindung kann die unabhängige Bewegung der Fallen durch ein oder mehrere Elemente in getrennten Strahlengängen erlauben. Solche Elemente können bewegliche optische Elemente wie z.B. Spiegel oder Linsen sein, es können aber auch feste optische Elemente wie z.B. akusto-optische Deflektoren oder räumliche Lichtmodulatoren sein. Werden die Fallen durch unterschiedliche Lichtquellen erzeugt, so ist auch eine Bewegung dieser Lichtquellen denkbar.
Eine Ausführung der Erfindung kann auch vorsehen, dass einer oder mehrere der Detektoren beweglich sind, um einem beweglichen Signal zu folgen. Bei einem QPD ist die höchste Empfindlichkeit erreicht, wenn das Signal etwa gleich über die vier Quadranten verteilt ist. Bewegt sich nun die Sonde in einem PFM, so verlässt das Signal den Bereich höchster Empfindlichkeit, bei großer Bewegung sogar den Detektionsbereich. Wird nun der Detektor, z.B. durch einen Piezoelektrischen Versteller, dem Signal nachgefühlt, kann eine höhere Empfind- lichkeit und ein größerer Messbereich erreicht werden.
Eine weitere Ausführung der Erfindung kann auch vorsehen, dass die Nachfϊihrung des Positionssignals nicht durch Bewegen des Detektors, sondern durch Elemente im Strahlengang passiert. Solche Elemente können z.B. bewegliche Spiegel oder Linsen, oder akusto-optische Deflektoren oder räumliche Lichtmodulatoren sein.
Beschreibung bevorzugter Ausfiihrungsbeispiele der Erfindung
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von bevorzugten Ausfuhrungsformen im Zusammenhang mit den beigefügten Figuren erklärt. Hierbei zeigen:
Fig. 1 eine vereinfachte Darstellung von zwei optischen Fallen mit möglicher Stö- rung des optischen Weges.
Fig. 2 ein Schema zur Erzeugung von zwei Fallen, die sich in der Lichtpolarisation unterscheiden und die Trennung des Signals der beiden Fallen.
Fig. 3 ein Schema zur Erzeugung von zwei Fallen, die sich in der Lichtwellenlänge unterscheiden und die Trennung des Signals der beiden Fallen. Fig. 4 ein Schema zur Erzeugung von zwei Fallen, die sich mindestens in der Ausbreitungsrichtung unterscheiden und die räumlich getrennte Detektion der beiden Signale.
Fig. 5a und b Schema für mögliche gekoppelte Bewegungen von zwei Fallen Fig. 6 ein Schema für mögliche gekoppelte Bewegungen von zwei oder mehr Fallen
In Fig. 1 sind schematisch die optischen Fallen 1 und 2 dargestellt, die sich in einem festen räumlichen Abstand befinden. Die gezeigten Sonde 4 in Falle 1 und Sonde 3 in Falle 2 sollen nicht notwendigerweise gleichzeitig vorhanden sein und sind nur zur Verdeutlichung der optischen Fallen beide eingezeichnet. Im Strahlengang der Falle 1 befindet sich eine Störung 5, die zum Beispiel auf dem Deckglas 6 befestigt sein kann. Die Störung 5 kann aber auch frei beweglich sein. Die Störung 5 führt zu einer Änderung des Positionssignals der Sonde 4 auf dem Detektor 7, während das Positionssignal für die Sonde 3 auf dem Detektor 8 keine Änderung erfahrt. Durch einen Scan an der Position der Falle 1 zuerst mit einer Sonde und dann ohne eine Sonde, wie sich durch Wegbewegung der mit Sonde 4 gefüllten Falle 1 und nach- führende Bewegung der leeren Falle 2 geschehen kann, kann die Störung 5 bestimmt und vom Positionssignal für die Sonde 4 abgezogen werden. Fig. 2 zeigt die mögliche Bereitstellung von zwei senkrecht zueinander polarisierten Fallen. Das Licht des Lasers 4 wird in dem polarisierenden Strahlteilerwürfel 5 in zwei senkrecht zueinander polarisierte Teilstrahlen aufgespalten. Durch die beiden Spiegel 6 und 7 werden die Strahlen umgelenkt und im polarisierenden Strahlteilerwürfel 8 wieder zusammengeführt. Möglichkeiten zur abhängigen oder unabhängigen Bewegung der Fallen sind hier der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt. Das Objektiv 2 fokussiert das Licht innerhalb der Probenkammer 1 und erzeugt die optischen Fallen. Vom Kondensor 3 wird das Licht wieder gebündelt und durch den polarisierenden Strahlteiler 9 wieder nach den Polarisationsrichtungen getrennt. Das Licht wird dann direkt vom Detektor 11 oder nach dem Umlenkspiegel 10 vom Detektor 12 detektiert.
In Fig. 3 ist ein Aufbau schematisch dargestellt, der die gleichzeitige Erzeugung von zwei Fallen mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge erlaubt. Die Detektion der Position von Sonden in den fallen wird durch Trennung nach der Wellenlänge erreicht. Die beiden Laser 4 und 13 erzeugen Licht der Frequenzen vi und v2. Das Licht vom Laser 4 wird über den Spiegel 7 in zum Objektiv 2 gelenkt, das Licht des Lasers 13 über den dicroitischen Strahlteiler 14. Das Objektiv 2 fokussiert das Licht innerhalb der Probenkammer 1 und erzeugt die optischen Fallen. Vom Kondensor 3 wird das Licht wieder gebündelt und durch den dicroitischen Strahlteiler 15 nach den Wellenlängen getrennt. Reflektiert der Strahlteiler 15 Licht der Frequenz 1, so wird vom Detektor 11 dieses Licht detektiert. Das in diesem Fall durch den Strahlteiler 15 transmittierte Licht der Frequenz v2 wird über den Spiegel 10 zum Detektor 12 gelenkt und dort detektiert.
Fig. 4 zeigt den Aufbau für die Realisierung von zwei Fallen, die durch gegenläufig propagie- rendes Licht erzeugt werden. Das Licht des Lasers 4 wird durch den Spiegel 7 zum Objektiv 2 gelenkt und dort in die Probenkammer fokussiert. Das Licht des Lasers 4 wird dann vom Kondensor 3 gebündelt und vom Strahlteiler 17 auf den Detektor 11 gelenkt. Durch den optionalen optischen Isolator 19 kann durch den Strahlteiler 17 transmittiertes Licht des Lasers 4 geblockt werden. In der Gegenrichtung wird Licht des Lasers 20 durch den Spiegel 10 in Richtung des Kondensors 3 gelenkt, der das Licht in der Probenkammer 1 zu einer optischen Falle fokussiert. Das Objektiv 2 bündelt das Licht wieder und es wird dann vom Strahlteiler 16 zur Detektion 12 gelenkt. Der ebenfalls optionale optische Isolator 18 blockt das vom Strahlteiler 16 transmittierte Licht des Lasers 20. Bei dieser Ausführungsform wirkt das Ob- jektiv 2 für das Licht des Lasers 4 gleichzeitig als Kondensor für das Licht des Lasers 20 und der Kondensor 3 für das Licht des Lasers 4 wirkt gleichzeitig als Objektiv für das Licht des Lasers 20.
In Fig. 5a ist eine mögliche Trajektorie 43 gezeigt, entlang derer die beiden Sonden 41 und 42 bewegt werden. Die Trajektorie ist dabei zur vereinfachten Darstellung als Gerade eingezeichnet, sie kann aber einen beliebigen Weg in drei Dimensionen beschreiben. Die Reihenfolge, in der die beiden Sonden entlang der Trajektorie bewegt werden kann dabei von der Ausführungsform abhängen.
In Fig. 5b ist die Möglichkeit dargestellt, dass sich entlang der Trajektorie 44 eine mit einer Sonde gefüllten Falle 44 und eine leere Falle 45 bewegen, wobei in der Fig. 5b ebenso wie in der Fig. 6 die gefüllte Falle durch die Position ihrer Sonde und die leere(n) Falle(n) durch die Leerstelle(n), an der eine Sonde eingefangen werden kann, dargestellt ist/sind. Die Trajektorie ist dabei zur vereinfachten Darstellung als Gerade eingezeichnet, sie kann aber einen beliebigen Weg in drei Dimensionen beschreiben. Die Reihenfolge, in der die beiden Fallen entlang der Trajektorie bewegt werden kann dabei vom Experiment abhängen.
Fig. 6 zeigt das Schema der Durchführung, wenn eine oder mehrere leere Fallen 52 eine Ku- gelschale um die mit einer Sonde gefüllten Falle 51 bilden. Zur vereinfachten Darstellung ist hier ein zweidimensionaler Querschnitt durch die Kugelschale gezeigt. Bei Bewegung der Falle 51 kann sich das Zentrum der Kugelschale beispielsweise in Richtung dieser Bewegung verlagern. Die Kugelschale kann entweder durch gleichzeitiges Vorhandensein mehrerer Fallen oder aber durch schnelle Positionswechsel einer Falle gebildet werden.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Figuren offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausfuhrungsformen von Bedeutung sein.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum rastersondenmikroskopischen Untersuchen einer Probe (6), insbesondere mittels Rasterphotonenmikroskopie, das folgendes umfasst: - Erzeugen von wenigstens zwei optischen Fallen (1, 2) durch fokussiertes Licht mit zwei Fokussierungsvolumina, die in dem örtlichen Bereich in der Probe bewegbar sind, wobei in wenigstens einem der beiden Fokussierungsvolumina eine Sonde (3; 4) angeordnet ist, Scannen der Probe (6) mit den beiden optischen Fallen (1, 2) durch Bewegen beider Fokussierungsvolumina gegenüber der Probe (6),
Erfassen von Messdaten, welche der ersten optischen Falle (1), welche die Sonde (4) enthält, zugeordnet sind, während des Scannens, Erfassen von Messdaten, welche der zweiten optischen Falle (2) zugeordnet sind, während des Scannens, - Auswerten der Messdaten durch Korrelieren der Messdaten der ersten und zweiten optischen Falle (1, 2).
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Auswerten der Messdaten durch Korrelieren der Messdaten von der ersten optischen Falle (1), die zu jeweils einem ersten Zeit- punkt des Scans erfasst werden, mit den Messdaten der zweiten optischen Falle (2), die zu jeweils einem zweiten Zeitpunkt erfasst wurden, an dem sich das Fokussie- rungsvolumen der zweiten optischen Falle am gleichen Ort oder an einem unmittelbar benachbarten Ort des Fokussierungsvolumens der ersten optischen Falle (1) zum ersten Zeitpunkt befand.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweite optische Falle (2) ebenfalls eine Sonde (3) enthält, insbesondere die gleiche oder eine unterschiedliche Sonde wie die erste optische Falle (1).
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die zweite optische Falle (2) keine Sonde enthält.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fokussierungsvolu- mina der wenigstens zwei optischen Fallen (1, 2) identische Abmessungen besitzen.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bewegung der opti- sehen Fallen (1, 2) hintereinander auf einer gemeinsamen Trajektorie erfolgt, insbesondere mit einem konstanten Abstand.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei während des Scannens eine der beiden Fallen (1) um die andere Falle (2) bewegt wird, insbesondere in Form einer vollständigen oder teilweise geschlossenen Kugelschale.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Erzeugung der zwei optischen Fallen (1, 2) durch zwei Lichtstrahlen erfolgt, die jeweils eines der Fokus- sierungsvolumina definieren.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Erzeugung der beiden Fallen (1 , 2) durch einen Lichtstrahl erfolgt, dessen Position sich mit einer Frequenz ändert, die es erlaubt, in zwei örtlich getrennten Fokussierungsvolumina jeweils eine Sonde einzufangen.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Korrelieren der Messsignale die Bildung eines Differenzmesssignals von den Messsignalen der ersten optischen Falle (1) und der zweiten optischen Falle (1) umfasst.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Erzeugen der ersten und der zweiten optische Falle (1, 2) durch Licht unterschiedlicher Polarisation erfolgt, insbesondere durch Licht mit orthogonaler Polarisation.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Erzeugen der ersten und zweiten optischen Falle (1, 2) durch Licht unterschiedlicher Wellenlänge erfolgt.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Erzeugen der ersten und der zweiten optischen Falle durch Licht unterschiedlicher Propagationsrichtung erfolgt, insbesondere durch Licht gegenläufiger Propagationsrichtung.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Erzeugen der optischen Fallen (1, 2) durch Licht von unterschiedlichen Lasern (4, 13; 4, 20) erfolgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Erzeugen der zwei optischen Fallen (1, 2) durch Licht eines Lasers (4) erfolgt, dessen Licht durch einen Strahlteiler (5) aufgespalten wird.
16. Vorrichtung zum rastersondenmikroskopischen Untersuchen einer Probe (6), insbe- sondere nach einem Verfahren der vorhergehenden Ansprüche, die folgendes umfasst: optische Einrichtung zum Erzeugen von zwei optischen Fallen (1, 2) durch fokussier- tes Licht, wobei die optische Einrichtung und/oder ein Probenhalter, ein örtliches Bewegen der Fokussierungsvolumina gegenüber einer Probe ermöglicht, wenigstens eine Sonde (3; 4), die in einer der beiden optischen Fallen (1, 2) angeord- net ist,
Steuerungseinrichtung, welche die Bewegung der beiden Fokussierungsvolumina zum Scannen der Probe (6) steuert, erste Detektionseinrichtung (11), welche zum Erfassen von Messdaten eingerichtet ist, welche der ersten optischen Falle (1), in der die Sonde angeordnet ist, zuzuordnen sind, zweite Detektionseinrichtung (12), die zum Erfassen von Messdaten eingerichtet ist, welche der zweiten optischen Falle (2) zuzuordnen sind, und
Auswerteeinrichtung, welche die Messdaten der ersten Detektionseinrichtung (11) und die Messdaten zweiten Detektionseinrichtung (12) empfängt und die Messdaten korre- liert.
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