WO2008090126A1 - Beverages for patients with celiac disease and gluten/gliadin-sensitive persons, and method for production thereof - Google Patents

Beverages for patients with celiac disease and gluten/gliadin-sensitive persons, and method for production thereof Download PDF

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Olaf Langer
Jens Zotzel
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N-Zyme Biotec Gmbh
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    • C12Y503/04—Intramolecular oxidoreductases (5.3) transposing S-S bonds (5.3.4)
    • C12Y503/04001—Protein disulfide-isomerase (5.3.4.1), i.e. disufide bond-forming enzyme

Definitions

  • the present invention relates to beverages for celiac patients and gluten / gliadin-sensitive persons and to processes for their preparation.
  • Prolamins are a heterogeneous group of ethanol-soluble proteins of various cereals and are referred to as gliadins in wheat, as hordeins in barley, as secalines in rye and as avensins in oats. Despite structural differences within the primary sequence, the prolamins, whether derived from wheat or other cereals, are also commonly referred to as glutins or gliadins.
  • a large number of cereals used in the food and beverage industry contain Prolamine in z.T. considerable quantities. Examples of the beverage industry are: all types of beer and mixed beer beverages, malt-based soft drinks (e.g., malt beer), corn or cereal coffee.
  • Celiac disease or sprue is a chronic autoimmune disease that is triggered in genetically predisposed patients by certain cereal proteins (prolamins, gluten).
  • celiac disease patients intestinal malabsorption syndromes usually occur as early as the first or second year of life as a result of extensive lesions of the small intestine mucosa caused by the action of gluten.
  • the vast majority of patients express so-called HLA-DQ2 and / or HLA-DQ8 molecules.
  • HLA-DQ2 and / or HLA-DQ8 molecules The current scientific opinion assumes that interaction of specific gliadin molecules with HLA DQ2 / HLA-DQ8 antigens the proliferation of T lymphocytes is induced. This excessive immune response is causally related to the degeneration of the small intestinal mucosa.
  • Patients with Duhring's disease also have celiac disease in up to 24% of cases, although typical symptoms of the latter can often be absent.
  • In small bowel biopsies up to 85% of dermatitis herpeticiformis patients have celiac disease-specific changes with variable villus atrophy.
  • Patients with Dermatitis herpetiformis Duhring should therefore be tested for celiac disease. In such cases, the gluten-free diet usually leads in the long term to the disappearance of the skin lesions.
  • Gliadin / gluten sensitivity is known as mini-celiac disease and has been reported in more than 90% of the white Anglo-Saxon population with neurodegenerative diseases (Fajcsak (2002) FDP- health & nutrition today, The world of food ingredients 09: 75-82).
  • the selection and cultivation of food grain has been based on a high protein and thus also gluten content for two reasons:
  • Protein is the most nutritionally-phy- siological component of starch and other polysaccharides, and gluten is crucial for certain technological properties in cereal processing.
  • the content and the structure of the adhesive determine the essential physico-chemical properties such as elasticity, gas retention, stickiness or fermentation stability of doughs.
  • gliadins are also present in the product, and in quantities that prohibit consumption by celiac disease patients.
  • gliadin-free cereals buckwheat, rice, millet, etc.
  • these drinks usually also have altered organoleptic properties such as taste or mouthfeel.
  • organoleptic properties such as taste or mouthfeel.
  • Physicochemical properties, such as foam formation and foam stability usually do not match those of traditional products expected by the consumer.
  • EP 0 949 329 A1 describes a gluten-free beer brewed from buckwheat and hydrolyzed cornstarch using amylolytic enzymes and glucanase.
  • the published patent application DE 10 2004 037 696 likewise describes a process for producing a gliadin-free beer using gluten-free raw materials and an enzyme feed for liquefaction or saccharification of mash.
  • Crosslinking enzymes are enzymes that can generate covalent bonds within proteins or between proteins and other substances such as carbohydrates and phenols, thus causing the formation of protein aggregates, possibly with the participation of other substances.
  • Typical representatives are transglutaminases, peroxidases, hexose oxidases, Tyrosinases and laccases, see also Thalmann CR & Lötzbeyer T 2002: Enzyme cross-linking of proteins with tyrosinase. Eur. Food Res. Technol. 214: 276-281; Boeriu CG, Oudgenoeg G, Spekking WT, Berendsen LB, Vancon L, Boumans H, Groups H, van Berkel WJ, Laane. US Pat.
  • Transglutaminases protein glutamine: amine ⁇ -glutamyltransferase, E.C. 2.3.2.13 catalyze the construction of stable cross-links between proteins.
  • the ⁇ -carboxyamide function of glutamine side chains is transferred to the ⁇ -amino group of lysine residues with the release of ammonium ions (FoIk and Finlayson, Adv. Protein Chem. 31, 1-133 (1977)).
  • the bacterial transglutaminase of Streptomyces mobaraensis, Streptomyces hygroscopius and Streptomyces fradiae is particularly suitable.
  • the bacterial transglutaminase is derived from the non-pathogenic and non-toxic Streptomyces mobaraensis. This TGase preparation has been classified by the Food and Drug Administration (FDA) as Generally Recognized as Safe (GRAS) (GRN 000095).
  • FDA Food and Drug Administration
  • GRAS Generally Recognized as Safe
  • Examples include: Crosslinking of meat, fish, cheese, milk, whey proteins, soy proteins and wheat proteins to achieve an improved structure, a higher viscosity or a pleasant mouthfeel.
  • WO 02/051873 describes a process for obtaining purified starch from proteinaceous vegetable raw materials by the action of cross-linking agents, e.g. Transglutaminase. After cross-linking of the proteins occurring in the raw material or additionally added by transglutaminase, a facilitated separation of the starch from the protein network is possible.
  • cross-linking agents e.g. Transglutaminase
  • EP 1 190 624 A2 describes methods for improving the baking technology quality of low-wheat doughs by means of transglutaminase. Due to the use of enzymes u.a. an increased gas-holding capacity, a lower dough stickiness and an improved fermentation stability can be achieved.
  • US 6,106,887 discloses a process for producing modified cereal flours using transglutaminase during the tempering and / or milling process.
  • EP 0 760 209 A1 discloses the use of transglutaminase for producing bakery products with a multilayer structure.
  • WO 01/65948 discloses protein preparation prepared from the action of transglutaminase from wheat protein and whey protein having improved technological properties such as emulsifying ability, gelling ability or water binding capacity.
  • WO 2006/051093 describes a process for the preparation of prolamine-reduced beverages by modification of the prolamins by means of transglutaminase and subsequent removal of the prolamines modified in this way.
  • prolactin levels below 20 ppm could be achieved.
  • these products, as well as other products with prolactin content ⁇ 20 ppm can continue to cause disease in celiac patients.
  • the object of the present invention was to overcome the stated disadvantages and problems of the prior art, in particular to provide a method for producing beverages which are suitable for celiac patients and gluten / gliadin-sensitive persons, and related products.
  • the object is achieved by a method for producing a beverage, a beverage base, a beverage concentrate or a beverage additive with a reduced content of prolamine fragments from prolaminhalti- gene raw materials with the following steps:
  • Cereals such as wheat, rye, oats, barley, spelled, green wheat, einkorn, emmer, triticale, bulgur, kamut or mixtures thereof are particularly suitable as prolamin-containing raw materials.
  • Suitable crosslinking enzymes are, in particular, those from the enzyme classes of transglutaminases (EC 2.3.2.13), peroxidases (EC 1.11.1.7), hexose oxidases (EC 1.1.3.5), tyrosinases (EC 1.14.18.1), laccases (EC 1.10.3.2), protein disulfide isomerases (EC 5.3.4.1) and combinations thereof.
  • a particularly preferred cross-linking enzyme are bacterial transglutaminases, in particular Ca 2+ -independent transglutaminases from Streptomyces mobaraensis.
  • prolamins are ethanol-soluble proteins from cereal species, which are also referred to as gluten, gluten, gliadins, hordeins, secalines or avensins.
  • Prolamine fragments are fragments of prolamins that can be found in beverages and that respond to celiac and gluten / and gliadin-sensitive individuals with symptoms.
  • the prolamine fragments can be formed by the activity of malzsten enzymes, the use of enzymes during production or by enzymes formed by added microorganisms.
  • the term “prolamine fragments” is synonymous with the term “peptides potentially toxic to celiac disease patients”.
  • ELISA 2 For the quantification of the prolamine fragments, a competitive ELISA ("ELISA 2") specified for prolamin fragments is available (r-Biopharm, Darmstadt). "Drink” means a food that can be consumed in liquid form.
  • “Beverage base” or “beverage concentrate” means a precursor for producing a foodstuff in solid or liquid form that can be consumed as food after further processing.
  • the inventive method the content of Prolaminfragmen- th in the drinks, beverage concentrates or beverage precursors can be reduced, the physico-chemical properties of the beverage are as little as possible changed.
  • the content of prolamine fragments is reduced by at least 50%, preferably by at least 80%, more preferably by at least 90%.
  • the treatment with transglutaminase according to the invention can be used for the production of beers whose organoleptic and physico-chemical properties correspond to those of conventional beers. This applies in particular to foaming behavior and foam stability, density, color, extract content, degree of fermentation or bitterness units.
  • the amount of enzyme to be used depends on the enzyme preparation and can vary within wide limits. It depends on the proliferous content of the raw materials and intermediates used, the reaction time, reaction temperature, pH, etc., as known to those skilled in the art of dealing with enzymes.
  • beverages can be produced which are selected from the group consisting of alcoholic beer, alcohol-reduced beer, non-alcoholic beer, malt beer, beer mixed drinks, lemonades, soft drinks, fruit juice drinks, emulsion drinks, fruit juice mixed drinks and mixtures thereof.
  • vegetable or microbial proteins may be added to the beverage or precursor of the beverage before, during or after contact with the crosslinking enzymes for food-approved proteins and protein hydrolysates such as gelatin, milk and whey proteins.
  • all compounds which function as amine donors for example lysine-rich peptides
  • are accepted by the crosslinking enzymes as substrates are suitable as further ingredients, so that the prolamine fragments can be bound to corresponding substrates.
  • immobilized substrates are added so that the prolamine fragments are bound by the cross-linking enzymes to these immobilized substrates.
  • This binding to the solid phase (matrix) improves the efficiency of the reaction and significantly facilitates the removal of prolamine fragments.
  • an adsorption step is carried out to remove the modified prolamine fragments. Filtration of silica, in particular amorphous silica such as kieselguhr, has proven particularly suitable. Depending on the process, kieselguhr filtration may also be the only step to remove the modified prolamine fragments.
  • the transglutaminase is also removed from the beverage, so that processes for inactivating the enzyme can be made significantly more product-friendly, since no or only a slight temperature effect is necessary for inactivating the enzyme activity.
  • the enzymes can be used in purified form or in the form of a preparation, e.g. an extract from a food-compatible organism.
  • contacting with crosslinking enzymes can be accomplished by adding microorganisms that produce recombinant cross-linking enzymes.
  • microorganisms yeasts are particularly suitable.
  • recombinant cross-linking enzymes are already expressed in the cereals, which then come into contact with the prolamine fragments in the course of the process.
  • the transglutaminase is bound to a solid phase, for example to polymeric carriers, silica gels such as kieselguhr, bentonite or silica sol.
  • a solid phase for example to polymeric carriers, silica gels such as kieselguhr, bentonite or silica sol.
  • Such solid phase-bound transglutaminases are particularly easy to remove during the separation steps.
  • the selection of the process conditions can be determined in accordance with the manufacturing process by a person skilled in the art. It is known to the person skilled in the art that the reaction rate of an enzyme reaction generally increases with the amount of enzymes and the temperature. Low Temperatures require higher amounts or longer reaction times. At higher temperatures, lower quantities or shorter reaction times suffice.
  • contacting with the beverage or beverage precursor and crosslinking enzymes occurs for a period of between 10 minutes and 72 hours.
  • the temperature is between 0 and 60 ° C.
  • the contacting is followed by an inactivation step of the enzymes, in particular a heat treatment.
  • Another object of the invention is a beverage, beverage base, beverage concentrate or beverage additive obtainable by the inventive method and a food containing the beverage base or the beverage concentrate, for example in the form of a yogurt, a milk mix beverage or a dietary beverage with cereal portions, or a beverage powder.
  • the process reduces the content of prolamine and prolamine fragments of the beverage.
  • the prolactin content after treatment using ELISA 1 is below 200 ppm, more preferably below 100 ppm, even more preferably below 50 ppm, and most preferably below 20 ppm.
  • the content of prolamine fragments using ELISA 2 is preferably below 2000 ppm, more preferably below 1500 ppm, even more preferably below 1200 ppm, and most preferably within the detection limit of the test method.
  • the detection limit for Elisa 2 determined on specified gluten-free foods is 922 ppm (as of August 2006).
  • a drink is obtained, which due to the reduced prolactin content better compatibility for patients with Zö- liakie, dermatitis herpetiformis or gluten / gliadin sensitivity.
  • corresponding drinks also have improved physiological properties, in particular with regard to turbidity stability (colloidal stability).
  • Celiac patients should be supplemented with calcium, with a daily dose of at least 1200 mg (Pazianas et al 2005, Osteoporos Int., 16: 56-63).
  • Many cereal-based gluten-free products (rice, corn, etc.) contain significantly lower levels of thiamine, riboflavin or niacin compared to standard wheat products.
  • the use of highly processed, non-fortified cereal-based gluten-free products may result in malnutrition of the vitamins thiamine, riboflavin or niacin (Thompson 1999, J. Am. Diet. Assoc. 99: 858-862).
  • 30 contained less folate than the comparable standard products.
  • the drink according to the invention can also be useful for the celiac disease patient to improve the situation with regard to vital substances.
  • the following table shows a selection of vital signs Substances whose average contents are contained in a Pilsener beer (Selected chapters of brewery technology, W. Back (Ed.), ausverlag Hans Carl, Nuremberg, 20005) and daily doses recommended by the DGE (2004).
  • the drink according to the invention may additionally be enriched with minerals, vitamins, trace elements.
  • contents which are higher than the naturally occurring contents of such substances are particularly suitable.
  • the levels can be determined according to international recommendations for use (daily intake) for food including dietetic foods and do not exceed the requirements of European food legislation.
  • Figure 1 shows the calibration curve of a RIDASCREEN ® Gliadin competitive as- says.
  • FIG. 2 shows the removal of prolamine and prolamine fragments from beer by using immobilized or soluble transglutaminase.
  • FIG. 3 shows the transglutaminase activity in the filtrate after treatment with diatomaceous earth in various diatomaceous earth concentrations.
  • FIG. 4 shows the determination of the transglutaminase concentration after filtration with diatomaceous earth (lane M: MV marker, lane 1: before filtration, lane 2: 5 g of silica gel / l, lane 3: 10 g of kieselguhr / l, lane 4: 25 g Kieselguhr / l, Lane 5: 50 g kieselguhr / l, Lane 6: 100 g kieselguhr / l, Lane 7: 50 ng BSA, Lane 8: 25 ng BSA, Lane 9: 10 ng BSA).
  • FIG. 5 shows the transglutaminase activity in beer after treatment with kieselguhr and filtration.
  • FIG. 6 shows an overview of the content of toxic peptides in different types of beer.
  • the analytical detection of prolamine fragments in raw materials, intermediates and final drinks was carried out with the RIDASCREEN ® gliadin competitive test, a competitive enzyme immunoassay for the quantitative determination of peptide sequences of prolamins from wheat (gliadin), rye (secalin) and barley (hordein) in food.
  • the monoclonal antibody R5 used recognizes, inter alia, the toxic sequence QQPFP, which occurs repeatedly in prolamins.
  • the PFP motif to which the R5 antibody binds occurs repeatedly in small peptides toxic to celiac disease patients (see Kahlenberg et al., Proceedings of the 18th Meeting of the Working Group on Prolamin Analysis Toxicity, published by Scientific Scripts).
  • the test principle is based on an antigen-antibody reaction.
  • the wells of the microtiter strips are coated with gliadin as the antigen.
  • Glialin standards calibrated against the QQPFP peptide or sample to be analyzed, and anti-gliadin antibodies (monoclonal R5 antibody) coupled to peroxidase are added simultaneously.
  • the labeled antibodies (enzyme conjugate) bind to gliadin of the microtiter plate and the prolamin peptides in the sample solution.
  • bound enzyme conjugate in the solution is removed which remains conjugate to the microtiter plate.
  • Detection is carried out by adding the substrate urea peroxide and a chromogen (tetramethylbenzidine).
  • the antibody bound to the antibody converts the colorless chromogen into a blue end product.
  • the addition of a stop reagent (H 2 SO 4 ) leads to a color change from blue to yellow.
  • the measurement is carried out photometrically at 450 nm in a microtiter plate reader.
  • the QQPPP concentration in ⁇ g / g (ppm) corresponding to the absorbance at 450 nm of the sample is read from the calibration curve and from this the actual QQPFP content of the sample is calculated.
  • transglutaminase formulation 1 g was dissolved in 1000 ml of an acetic acid / acetate buffer (pH 4.6). After adding diatomaceous earth, it was stirred for 15 minutes and then filtered through a fluted filter. Non-kieselguhr bound transglutaminase was removed by washing with cold beer several times. 1 g of the transglutaminase-coupled kieseigur were added to 1000 ml of beer. With constant stirring, the suspension was incubated at 5 ° C. After completion of the reaction, undissolved constituents were filtered through a pleated filter. The concentration of toxic peptides was determined in the filtrate (see Example 1).
  • the transglutaminase concentration is calculated to be ⁇ 0.8 mg / l (see FIG. 4).
  • the contaminants present in the transglutaminase preparation are also removed by the method described.
  • transglutaminase activity in the filtrate was determined (FIG. 5).

Abstract

Method for the production of a beverage, a basic substance of a beverage, and a beverage concentrate, or a beverage additive with a reduced content of prolamine fragments made of prolamine-containing raw materials, comprising the following steps: a) bringing the beverage or a precursor of the beverage into contact with cross-linked enzymes to obtain modified prolamine fragments, b) at least partial removal of the modified prolamine fragments.

Description

Getränke für Zöliakiepatienten und Gluten/Gliadin-sensitive Personen und Verfahren zur Herstellung Beverages for celiac patients and gluten / gliadin-sensitive individuals and methods of preparation
Die vorliegende Erfindung betrifft Getränke für Zöliakiepatienten und Gluten- /Gliadin-sensitive Personen und Verfahren zu ihrer Herstellung.The present invention relates to beverages for celiac patients and gluten / gliadin-sensitive persons and to processes for their preparation.
Prolamine (Gluten, Klebereiweiß) sind eine heterogene Gruppe von Ethanol- löslichen Proteinen verschiedener Getreidearten und werden bei Weizen als Gliadine, bei Gerste als Hordeine, bei Roggen als Secaline und bei Hafer als Avenine bezeichnet. Trotz struktureller Unterschiede innerhalb der Primärsequenz werden die Prolamine unabhängig, ob sie von Weizen oder einer ande- ren Getreideart stammen häufig auch allgemein als Glutene bzw. Gliadine bezeichnet. Eine große Zahl von in der Lebensmittel- und Getränkeindustrie verwendeten Getreidearten enthalten Prolamine in z.T. erheblichen Mengen. Beispielhaft für die Getränkeindustrie genannt sind : alle Typen von Bier und Biermischgetränken, alkoholfreie Getränke auf Malzbasis (z.B. Malzbier), MaIz- oder Getreidekaffee. Mit einem Pro-Kopf-Verbrauch von ca. 80 L ist Bier immer noch eines der am meisten konsumierten Getränke in Europa. Alternativ erfreuen sich Biermischgetränke und sog. innovative Getränke mit einem Zusatznutzen innerhalb der jüngeren Generation einer immer größeren Beliebtheit. Aus diesem Grund und wegen seiner ernährungsphysiologisch hochwerti- gen Inhaltsstoffe werden für auf Getreiderohstoffen basierte Getränke gute Marktchancen prognostiziert. Da all diese Getränke aber immer Prolamine (Gluten) und daraus während des Herstellungsprozesses entstandene Fragmente in unterschiedlichen Konzentrationen aufweisen, ist der Konsum dieser Getränke für den Zöliakiepatienten strengstens untersagt.Prolamins (gluten, gluten proteins) are a heterogeneous group of ethanol-soluble proteins of various cereals and are referred to as gliadins in wheat, as hordeins in barley, as secalines in rye and as avensins in oats. Despite structural differences within the primary sequence, the prolamins, whether derived from wheat or other cereals, are also commonly referred to as glutins or gliadins. A large number of cereals used in the food and beverage industry contain Prolamine in z.T. considerable quantities. Examples of the beverage industry are: all types of beer and mixed beer beverages, malt-based soft drinks (e.g., malt beer), corn or cereal coffee. With a per capita consumption of around 80 L, beer is still one of the most consumed drinks in Europe. Alternatively, mixed beer drinks and so-called innovative drinks with an added benefit within the younger generation are becoming increasingly popular. For this reason and because of its nutritionally high-quality ingredients, good market opportunities are forecast for beverages based on cereal raw materials. However, since all these drinks always contain prolamines (gluten) and fragments thereof during the manufacturing process in different concentrations, the consumption of these drinks for the celiac patient is strictly prohibited.
Zöliakie oder Sprue ist eine chronische Autoimmunkrankheit, die in genetisch prädisponierten Patienten durch bestimmte Getreideeiweiße (Prolamine, Gluten) ausgelöst wird. Bei Zöliakiepatienten kommt es meist schon im 1. oder 2. Lebensjahr zu intestinalen Malabsorptionssyndromen infolge ausgedehnter Läsionen der Dünndarmmukosa, hervorgerufen durch die Einwirkung von Gluten. Die überwiegende Mehrheit der Patienten exprimiert sogenannte HLA-DQ2 und/oder HLA-DQ8-Moleküle. Die aktuelle wissenschaftliche Meinung geht davon aus, dass durch Interaktion von spezifischen Gliadinmolekülen mit HLA- DQ2 / HLA-DQ8-Antigenen die Proliferation von T-Lymphozyten induziert wird. Diese überschießende Immunantwort wird ursächlich in Zusammenhang mit der Degeneration der Dünndarmschleimhaut gebracht. Bei anhaltender GIu- teneinwirkung wird die Epithelregeneration unzureichend, es kommt zur Atro- phie der Darmzotten des Dünndarms und verursacht die verminderte Absorptionsleistung, Wachstumsstillstand, Dystrophie, muskulärer Hypoionie, übel riechende Stühlen; es besteht sogar die Möglichkeit von malignen Sarkomen. Weitere Symptome sind Depression und Blutarmut.Celiac disease or sprue is a chronic autoimmune disease that is triggered in genetically predisposed patients by certain cereal proteins (prolamins, gluten). In celiac disease patients, intestinal malabsorption syndromes usually occur as early as the first or second year of life as a result of extensive lesions of the small intestine mucosa caused by the action of gluten. The vast majority of patients express so-called HLA-DQ2 and / or HLA-DQ8 molecules. The current scientific opinion assumes that interaction of specific gliadin molecules with HLA DQ2 / HLA-DQ8 antigens the proliferation of T lymphocytes is induced. This excessive immune response is causally related to the degeneration of the small intestinal mucosa. If the gluten persists, epithelial regeneration becomes inadequate, causing the intestinal villi to become atrophy of the small intestine and causing decreased absorption, growth arrest, dystrophy, muscular hypoionia, foul-smelling stools; There is even the possibility of malignant sarcomas. Other symptoms include depression and anemia.
Da aktuell keine Medikamente, die zu einer Heilung der Sprue/Zöliakie führen, existieren, besteht die einzig mögliche Therapie in einem lebenslangen Verzicht auf glutenhaltige Lebensmittel. Während man in früheren Jahren in den Industrienationen von einer Inzidenzrate von 1 : 1200 ausgegangen ist, stellt man heute durch umfangreiche Untersuchungen und verbesserte diagnostische Möglichkeiten eine Verbreitung von 1 : 100 bis 1 :200 fest, so dass man davon ausgehen kann, dass Zöliakie die häufigste chronische Darmerkrankung in der westlichen Bevölkerung darstellt.Since currently no medications that lead to a cure of sprue / celiac disease, exist, the only possible therapy is a lifelong renunciation of gluten-containing foods. Whereas in the past years an incidence rate of 1: 1200 was assumed in the industrialized nations, today a widespread investigation and improved diagnostic possibilities reveal a prevalence of 1: 100 to 1: 200, so that it can be assumed that celiac disease is the cause of celiac disease represents the most common chronic intestinal disease in the western population.
Die Dermatitis herpetiformis oder Morbus Duhring ist eine stark juckende, pa- pulovesikulöse (Papeln = Knötchen und Vesikel = Bläschen) Dermatose. Patienten mit Morbus Duhring weisen in bis zu 24% der Fälle auch eine Zöliakie auf, obschon typische Symptome letztgenannter Erkrankung häufig fehlen können. In Dünndarmbiopsien haben sogar bis zu 85% der Dermatitis herpeti- formis-Kranken zöliakietypische Veränderungen mit variabler Zottenatrophie. Patienten mit Dermatitis herpetiformis Duhring sollten dementsprechend unbedingt auf Zöliakie getestet werden. In solchen Fällen führt die glutenfreie Ernährung langfristig meist zum Verschwinden der Hautläsionen.Dermatitis herpetiformis or Duhring's disease is a severe itchy, papulovesiculous (papules = nodules and vesicles = blisters) dermatosis. Patients with Duhring's disease also have celiac disease in up to 24% of cases, although typical symptoms of the latter can often be absent. In small bowel biopsies up to 85% of dermatitis herpeticiformis patients have celiac disease-specific changes with variable villus atrophy. Patients with Dermatitis herpetiformis Duhring should therefore be tested for celiac disease. In such cases, the gluten-free diet usually leads in the long term to the disappearance of the skin lesions.
Die Gliadin-/Gluten-Sensitivität wird als Mini-Zöliakie bezeichnet und wurde bei mehr als 90% der weißen, angelsächsischen Bevölkerung mit neurodege- nerativen Erkrankungen beobachtet (Fajcsak (2002) FDP- health & nutrition today, The world of food ingredients 09:75-82). Bei der Auswahl und Züchtung von Lebensmittelgetreide wurde seit langem auf einen hohen Eiweiß- und damit auch Klebereiweißgehalt aus zwei Gründen geachtet:Gliadin / gluten sensitivity is known as mini-celiac disease and has been reported in more than 90% of the white Anglo-Saxon population with neurodegenerative diseases (Fajcsak (2002) FDP- health & nutrition today, The world of food ingredients 09: 75-82). For a long time, the selection and cultivation of food grain has been based on a high protein and thus also gluten content for two reasons:
Eiweiß ist gegenüber Stärke und anderen Polysacchariden der ernährungsphy- siologisch wertvollere Bestandteil und Klebereiweiß ist entscheidend für gewisse technologische Eigenschaften bei der Getreideverarbeitung. So sind z.B. der Gehalt und die Struktur des Klebers ausschlaggebend für die wesentlichen physiko-chemischen Eigenschaften wie Elastizität, Gashaltefähigkeit, Klebrigkeit oder Gärstabilität von Teigen.Protein is the most nutritionally-phy- siological component of starch and other polysaccharides, and gluten is crucial for certain technological properties in cereal processing. Thus, e.g. the content and the structure of the adhesive determine the essential physico-chemical properties such as elasticity, gas retention, stickiness or fermentation stability of doughs.
Deshalb sind in allen wichtigen Getreidearten wie Weizen, Roggen, Gerste, aber auch Dinkel, Grünkern, Einkorn, Emmer, Kamut, Triticale, Bulgur und Hafer Prolamine enthalten, welche daraus hergestellte Lebensmittel und Getränke für den Zöliakiepatienten ungenießbar bzw. für gliadin/gluten-sensitive Personen nur eingeschränktkonsumierbar machen.Therefore, in all important cereals such as wheat, rye, barley, but also spelled, greens, einkorn, emmer, kamut, triticale, bulgur and oats contain prolamins, which produced foods and drinks for the celiac patient inedible or gliadin / gluten- sensitive persons can only be restrictedly consumable.
Bei der Verwendung von prolaminhaltigen Getreidearten für Getränke ist in den allermeisten Fällen davon auszugehen, dass sich Gliadine auch im Produkt befinden und zwar in Mengen, welche den Konsum durch Zöliakiepatienten verbietet. Sowohl die Verwendung von gliadinfreiem Getreide (Buchweizen, Reis, Hirse, etc.) als auch eine Verfahrensführung während der Getränkeher- Stellung, welche eine generelle Eiweißabtrennung garantiert, ist aus vielen Gründen meist nicht möglich. Neben der nicht immer gesicherten Verfügbarkeit der Rohwaren, besitzen diese Getränke meist auch veränderte organoleptische Eigenschaften wie Geschmack oder Mundgefühl. Auch physikochemische Eigenschaften wie Schaumbildung und Schaumstabilität entspre- chen meist nicht denen von traditionellen Produkten, die vom Konsumenten erwartet werden. Ein weiteres Problem stellt die Kontaminationsgefahr von gliadinfreien Rohwaren/Zwischenprodukten mit gliadinhaltigen Rohwaren/Zwischenprodukten während Produktion, Transport, Lagerung und Verarbeitung dar (Thompson, 2005, J. Am. Diet. Ass, 105, 348-349) EP 0 949 329 Al beschreibt ein glutenfreies Bier, gebraut aus Buchweizen und hydrolysierter Maisstärke unter Verwendung von amylolytischen Enzymen und Glucanase.When using proline-containing cereals for drinks, it is generally assumed that gliadins are also present in the product, and in quantities that prohibit consumption by celiac disease patients. Both the use of gliadin-free cereals (buckwheat, rice, millet, etc.) as well as a procedure during beverage production, which guarantees a general protein separation, is usually not possible for many reasons. In addition to the not always guaranteed availability of raw materials, these drinks usually also have altered organoleptic properties such as taste or mouthfeel. Physicochemical properties, such as foam formation and foam stability, usually do not match those of traditional products expected by the consumer. Another problem is the risk of contamination of gliadin-free raw materials / intermediates with gliadin-containing raw materials / intermediates during production, transport, storage and processing (Thompson, 2005, J. Am. Diet. Ass, 105, 348-349). EP 0 949 329 A1 describes a gluten-free beer brewed from buckwheat and hydrolyzed cornstarch using amylolytic enzymes and glucanase.
Ebenfalls beschreibt die Offenlegungsschrift DE 10 2004 037 696 ein Verfah- ren zur Herstellung eines gliadinfreien Bieres unter Verwendung glutenfreier Rohstoffe und eines Enzymeinsatzes zur Verflüssigung bzw. Verzuckerung von Maische.The published patent application DE 10 2004 037 696 likewise describes a process for producing a gliadin-free beer using gluten-free raw materials and an enzyme feed for liquefaction or saccharification of mash.
DE 10 2005 020 639 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von glutenfrei- em Bier aus glutenfreien Getreidearten unter Verwendung eines Malzes mit einem Weichegrad zwischen 48 und 51°C.DE 10 2005 020 639 describes a process for the production of gluten-free beer from gluten-free cereals using a malt with a degree of softness between 48 and 51 ° C.
DE 10 2004 057 546 beschreibt ein glutenfreies Getränk, vornehmlich Bier, substituiert aus aromatisierten Stoffen.DE 10 2004 057 546 describes a gluten-free drink, primarily beer, substituted from flavored substances.
Alternativ zielen aktuelle Forschungsaktivitäten auf die Entwicklung von genetisch veränderten Getreidearten ab, die keine Gliadine mehr produzieren kön- nen. Die Entwicklungen sind noch in einem frühen Stadium und es ist momentan nicht abzusehen, ob und wann diese Pflanzen kommerziell angebaut werden, ob die daraus gewonnenen Rohstoffe weiterhin für den Brauprozess eingesetzt werden können und welche Akzeptanz diese genetisch modifizierten Getreidearten beim Verbraucher letztendlich erreichen werden.Alternatively, current research activities target the development of genetically modified cereals that can no longer produce gliadins. The developments are still at an early stage and it is currently not clear if and when these plants are grown commercially, whether the raw materials derived from them can continue to be used for the brewing process and what acceptance these genetically modified cereals will eventually reach the consumer.
Aus diesem Grund enthalten fast alle erhältlichen Getränke auf Basis konventioneller Getreidearten nachweisbare Mengen an Gliadinen, besonders hoch ist deren Gehalt in Bieren, zu deren Herstellung Gerste und Weizen verwendet wird.For this reason, almost all available beverages based on conventional cereals contain detectable amounts of gliadins, and their content is particularly high in beers, for which barley and wheat are used.
Quervernetzende Enzyme sind Enzyme, die innerhalb von Proteinen oder zwi- sehen Proteinen und anderen Substanzen wie z.B. Kohlenhydraten, Phenolen kovalente Bindungen erzeugen können und so die Ausbildung von Proteinaggregaten, gegebenenfalls unter Beteiligung weiterer Substanzen herbeiführen. Typische Vertreter sind Transglutaminasen, Peroxidasen, Hexose-Oxidasen, Tyrosinasen und Laccasen, siehe auch Thalmann CR & Lötzbeyer T 2002: En- zymatic cross-linking of proteins with tyrosinase. Eur. Food Res. Technol. 214: 276-281; US 6,358,543 (Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products), Boeriu CG, Oudgenoeg G, Spekking WT, Berendsen LB, Vancon L, Boumans H, Gruppen H, van Berkel WJ, Laane C, Voragen AG 2004 Horseradish peroxidase- catalyzed cross-linking of feruloylated arabinoxylans with beta-casein. J Agric Food Chem. 2004 Oct 20;52(21) :6633-9.Crosslinking enzymes are enzymes that can generate covalent bonds within proteins or between proteins and other substances such as carbohydrates and phenols, thus causing the formation of protein aggregates, possibly with the participation of other substances. Typical representatives are transglutaminases, peroxidases, hexose oxidases, Tyrosinases and laccases, see also Thalmann CR & Lötzbeyer T 2002: Enzyme cross-linking of proteins with tyrosinase. Eur. Food Res. Technol. 214: 276-281; Boeriu CG, Oudgenoeg G, Spekking WT, Berendsen LB, Vancon L, Boumans H, Groups H, van Berkel WJ, Laane. US Pat. No. 6,358,543 (method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products) C, Voragen AG 2004 Horseradish peroxidase-catalyzed cross-linking of feruloylated arabinoxylans with beta-casein. J Agric Food Chem. 2004 Oct 20; 52 (21): 6633-9.
Transglutaminasen (Protein-Glutamin : Amin-γ-glutamyltransferase; E. C. 2.3.2.13) katalysieren den Aufbau stabiler Querbrücken zwischen Proteinen. Dabei wird die γ-Carboxyamidfunktion von Glutaminseitenketten unter Freisetzung von Ammoniumionen auf die ε-Aminogruppe von Lysinresten übertragen (FoIk and Finlayson, Adv. Protein Chem. 31, 1-133 (1977)).Transglutaminases (protein glutamine: amine γ-glutamyltransferase, E.C. 2.3.2.13) catalyze the construction of stable cross-links between proteins. The γ-carboxyamide function of glutamine side chains is transferred to the ε-amino group of lysine residues with the release of ammonium ions (FoIk and Finlayson, Adv. Protein Chem. 31, 1-133 (1977)).
Die gebildete Isopeptidbindung hält auch einer Hydrolyse durch Proteasen stand und wird physiologisch erst nach vollständigem Abbau der Proteine durch die γ-Glutamylamin-Cyclotransferase und durch die γ- Glutamyltransferase gespalten (Fink et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 4564- 4568 (1980), Seguro et al.; J. Agric. Food Chem. 43; 1977-1981(1995)).The isopeptide bond formed also withstood hydrolysis by proteases and is physiologically cleaved only after complete degradation of the proteins by the γ-glutamylamine cyclotransferase and by the γ-glutamyltransferase (Fink et al., Proc. Natl. Acad., USA 77, 4564 - 4568 (1980), Seguro et al .; J. Agric. Food Chem. 43; 1977-1981 (1995)).
Für technische Anwendungen eignet sich insbesondere die bakterielle Transglutaminase von Streptomyces mobaraensis, Streptomyces hygroscopius und Streptomyces fradiae. Die bakterielle Transglutaminase stammt vom nicht-pathogenen und nicht-toxischen Streptomyces mobaraensis. Von der "Food and Drug Administration" (FDA) wurde diese TGase-Präparation als "Generally regarded as safe" (GRAS) eingestuft (GRN 000095). Eine kosten- günstige Herstellung, das breite Substratspektrum sowie hohe Reaktionsraten prädestinieren das Enzym für industrielle Anwendungen im Nahrungsmittelbereich. Beispielhaft genannt sind : Vernetzung von Fleisch, Fisch, Käse, Milch, Molkeproteinen, Sojaproteinen und Weizenproteinen zur Erreichung einer verbesserten Struktur, einer höheren Viskosität oder eines angenehmen Mundge- fühls. Die Kreation neuer Nahrungsprodukte durch den Einsatz von Transglu- taminase wurde hierdurch möglich (Yokoyama et al., Appl. Microbiol. Biotech- nol. 64, 447-454 (2004)).For technical applications, the bacterial transglutaminase of Streptomyces mobaraensis, Streptomyces hygroscopius and Streptomyces fradiae is particularly suitable. The bacterial transglutaminase is derived from the non-pathogenic and non-toxic Streptomyces mobaraensis. This TGase preparation has been classified by the Food and Drug Administration (FDA) as Generally Recognized as Safe (GRAS) (GRN 000095). A cost-effective production, the wide substrate range and high reaction rates predestine the enzyme for industrial applications in the food industry. Examples include: Crosslinking of meat, fish, cheese, milk, whey proteins, soy proteins and wheat proteins to achieve an improved structure, a higher viscosity or a pleasant mouthfeel. The creation of new food products through the use of transglu- This made taminase possible (Yokoyama et al., Appl. Microbiol., Biotechol., 64, 447-454 (2004)).
WO 02/051873 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von aufgereinigter Stärke aus proteinhaltigen pflanzlichen Rohstoffen unter Einwirkung von quer- vernetzenden Agenzien, z.B. Transglutaminase. Nach Quervernetzung der im Rohstoff vorkommenden bzw. zusätzlich zugesetzten Proteine durch Transglutaminase, ist eine erleichterte Abtrennung der Stärke vom Protein-Netzwerk möglich.WO 02/051873 describes a process for obtaining purified starch from proteinaceous vegetable raw materials by the action of cross-linking agents, e.g. Transglutaminase. After cross-linking of the proteins occurring in the raw material or additionally added by transglutaminase, a facilitated separation of the starch from the protein network is possible.
EP 1 190 624 A2 beschreibt Verfahren zur Verbesserung der backtechnologi- sehen Qualität von weizenarmen Teigen mittels Transglutaminase. Durch den Enzymeinsatz konnte u.a. eine erhöhte Gashaltefähigkeit, eine geringere Teig- klebrigkeit sowie eine verbesserte Gärstabilität erreicht werden.EP 1 190 624 A2 describes methods for improving the baking technology quality of low-wheat doughs by means of transglutaminase. Due to the use of enzymes u.a. an increased gas-holding capacity, a lower dough stickiness and an improved fermentation stability can be achieved.
US 6,106,887 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von modifizierten Getreidemehlen unter Verwendung von Transglutaminase während des Anmach- und/oder Mahlverfahrens.US 6,106,887 discloses a process for producing modified cereal flours using transglutaminase during the tempering and / or milling process.
EP 0 760 209 Al offenbart den Einsatz von Transglutaminase zur Herstellung von Backprodukten mit Mehrschichtstruktur.EP 0 760 209 A1 discloses the use of transglutaminase for producing bakery products with a multilayer structure.
WO 01/65948 offenbart unter Einwirkung von Transglutaminase hergestellte Proteinpräparation aus Weizenprotein und Molkenprotein mit verbesserten technologischen Eigenschaften wie Emulgierfähigkeit, Gelierfähigkeit oder Wasserbindevermögen.WO 01/65948 discloses protein preparation prepared from the action of transglutaminase from wheat protein and whey protein having improved technological properties such as emulsifying ability, gelling ability or water binding capacity.
WO 2006/051093 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung prolaminreduzierter Getränke durch Modifikation der Prolamine mittels Transglutaminase und anschließender Entfernung der so modifizierten Prolamine. Auf diesem Wege konnten Prolamingehalte unter 20 ppm erreicht werden. Es zeigt sich jedoch, dass diese Produkte und auch andere Produkte, die Prolamingehalte < 20 ppm aufweisen, weiterhin bei Zöliakiepatienten zu Krankheitssymptomen führen können. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, die genannten Nachteile und Probleme des Standes der Technik zu überwinden, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Getränken, die für Zöliakiepatienten und Gluten-/Gliadin- sensitive Personen geeignet sind, und verwandter Produkte bereitzustellen.WO 2006/051093 describes a process for the preparation of prolamine-reduced beverages by modification of the prolamins by means of transglutaminase and subsequent removal of the prolamines modified in this way. In this way, prolactin levels below 20 ppm could be achieved. However, it has been shown that these products, as well as other products with prolactin content <20 ppm, can continue to cause disease in celiac patients. The object of the present invention was to overcome the stated disadvantages and problems of the prior art, in particular to provide a method for producing beverages which are suitable for celiac patients and gluten / gliadin-sensitive persons, and related products.
Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung eines Getränkes, eines Getränkegrundstoffs, eines Getränkekonzentrates oder eines Getränkezusatzes mit vermindertem Gehalt an Prolaminfragmenten aus prolaminhalti- gen Rohstoffen mit folgenden Schritten :The object is achieved by a method for producing a beverage, a beverage base, a beverage concentrate or a beverage additive with a reduced content of prolamine fragments from prolaminhalti- gene raw materials with the following steps:
a) Inkontaktbringen des Getränkes oder einer Vorstufe des Getränks mit quervernetzenden Enzymen, um modifizierte Prolamine und Prolaminfrag- mente zu erhalten b) mindestens teilweise Entfernung der modifizierten Prolamine und Prola- minfragmente.a) contacting the beverage or a precursor of the beverage with cross-linking enzymes to obtain modified prolamins and prolamine fragments b) at least partial removal of the modified prolamins and prolamine fragments.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass "glutenfreie" Getränke teilweise Substanzen enthalten, die zu Krankheitssymptomen führen können. Bei diesen Substanzen handelt es sich um Abbauprodukte des Glutens (Prolaminfragmen- te), die auf die gleiche Weise wie das gesamte Protein die typischen Symptome der Zöliakie auslösen können, aber mittels der bis vor kurzem akzeptierten Analysenmethode eines Sandwich-Elisa (RIDASCREEN® Gliadin; Fa. r- Biopharm, Darmstadt, „ELISA 1") nicht nachgewiesen werden konnten. Aufgrund einer im Jahr 2006 auf den Markt gekommenen Nachweismethode speziell zum Nachweis von Prolaminfragmenten in prozessierten Produkten (RIDASCREEN® Gliadin competitive, Fa. R-Biopharm, Darmstadt, „ELISA 2") ist es nun möglich, Vorkommen und Konzentration der Prolaminfragmente in prozes- sierten Produkten, insbesondere Bier zu bestimmen. Entsprechende Analysen zeigen, dass Getränke, die nach Analyse mit ELISA 1 als „glutenfrei" bezeichnet werden können, da der mit Elisa 1 bestimmte Glutengehalt unter 200 ppm (Produkte aus konventionellen Rohstoffen) bzw. unter 20 ppm (Produkte aus alternativen Rohstoffen) betrug, signifikante Mengen von toxisch einzustufen- den Gliadinfragmenten enthalten. Im Rahmen eines Screenings internationaler Biersorten zeigte sich, dass der überwiegende Anteil der Biere Gehalte an Pro- laminfragmenten von über 1500 ppm aufwies (siehe Figur 6).Surprisingly, it has been shown that "gluten-free" drinks contain some substances that can lead to disease symptoms. These substances are degradation products of the gluten (Prolaminfragmen- te) that can cause the typical symptoms of celiac disease in the same way as the entire protein, but by who until recently accepted method of analysis of a sandwich ELISA (RIDASCREEN ® gliadin; could fa. r- Biopharm, Darmstadt, "ELISA 1") not be detected. As a result of coming in in 2006 to market the detection method specifically for the detection of Prolaminfragmenten in processed products (RIDASCREEN ® gliadin competitive, Messrs. R-Biopharm, Darmstadt, "ELISA 2"), it is now possible to determine the presence and concentration of prolamine fragments in processed products, in particular beer. Corresponding analyzes show that beverages which, after analysis with ELISA 1, can be described as "gluten-free", since the gluten content determined with Elisa 1 was below 200 ppm (products from conventional raw materials) or below 20 ppm (products from alternative raw materials), significant levels of toxicity classified contain the gliadin fragments. As part of a screening of international beers, it was found that the vast majority of beers had levels of pro- lamin fragments of more than 1500 ppm (see Figure 6).
Als prolaminhaltige Rohstoffe eignen sich insbesondere Getreide, wie Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Dinkel, Grünkorn, Einkorn, Emmer, Triticale, Bulgur, Kamut oder Mischungen davon.Cereals such as wheat, rye, oats, barley, spelled, green wheat, einkorn, emmer, triticale, bulgur, kamut or mixtures thereof are particularly suitable as prolamin-containing raw materials.
Als quervernetzende Enzyme eignen sich insbesondere solche aus den Enzymklassen der Transglutaminasen (EC 2.3.2.13), Peroxidasen (EC 1.11.1.7), He- xose-Oxidasen (EC 1.1.3.5), Tyrosinasen (EC 1.14.18.1), Laccasen (EC 1.10.3.2), Proteindisulfidisomerasen (EC 5.3.4.1) und Kombinationen hiervon.Suitable crosslinking enzymes are, in particular, those from the enzyme classes of transglutaminases (EC 2.3.2.13), peroxidases (EC 1.11.1.7), hexose oxidases (EC 1.1.3.5), tyrosinases (EC 1.14.18.1), laccases (EC 1.10.3.2), protein disulfide isomerases (EC 5.3.4.1) and combinations thereof.
Ein besonders bevorzugtes, quervernetzendes Enzym sind bakterielle Transglutaminasen, insbesondere Ca2+-unabhängige Transglutaminasen aus Streptomyces mobaraensis.A particularly preferred cross-linking enzyme are bacterial transglutaminases, in particular Ca 2+ -independent transglutaminases from Streptomyces mobaraensis.
"Prolamine" im Sinne dieser Anmeldung sind ethanollösliche Proteine aus Ge- treidearten, die auch als Gluten, Klebereiweiß, Gliadine, Hordeine, Secaline oder Avenine bezeichnet werden.For the purposes of this application, "prolamins" are ethanol-soluble proteins from cereal species, which are also referred to as gluten, gluten, gliadins, hordeins, secalines or avensins.
"Prolaminfragmente" sind auf unterschiedliche Weise entstandene Bruchstücke der Prolamine, die in Getränken enthalten sein können und auf die Zöliakiepa- tienten und Gluten-/und Gliadin-sensitive Personen mit Symptomen reagieren. Die Prolaminfragmente können durch die Aktivität malzeigener Enzyme, den Einsatz von Enzymen während der Herstellung oder durch von zugesetzten Mikroorganismen gebildete Enzyme entstehen. Der Begriff "Prolaminfragmente" ist gleichbedeutend mit dem Begriff "für Zöliakiepatienten potentiell toxische Peptide"."Prolamine fragments" are fragments of prolamins that can be found in beverages and that respond to celiac and gluten / and gliadin-sensitive individuals with symptoms. The prolamine fragments can be formed by the activity of malzeigener enzymes, the use of enzymes during production or by enzymes formed by added microorganisms. The term "prolamine fragments" is synonymous with the term "peptides potentially toxic to celiac disease patients".
Für die Quantifizierung der Prolaminfragmente steht ein für Prolaminfragmente spezifizierter kompetitiver ELISA ("ELISA 2") zur Verfügung (r-Biopharm, Darmstadt). "Getränk" bedeutet ein Lebensmittel, das in flüssiger Form verzehrt werden kann.For the quantification of the prolamine fragments, a competitive ELISA ("ELISA 2") specified for prolamin fragments is available (r-Biopharm, Darmstadt). "Drink" means a food that can be consumed in liquid form.
"Getränkegrundstoff" oder "Getränkekonzentrat" bedeutet eine Vorstufe zur Herstellung eines Lebensmittels in fester oder flüssiger Form, der nach Weiter- Verarbeitung als Lebensmittel verzehrt werden kann."Beverage base" or "beverage concentrate" means a precursor for producing a foodstuff in solid or liquid form that can be consumed as food after further processing.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann der Gehalt an Prolaminfragmen- ten in den Getränken, Getränkekonzentraten oder Getränkevorstufen reduziert werden, wobei die physiko-chemischen Eigenschaften des Getränkes möglichst wenig verändert werden.The inventive method, the content of Prolaminfragmen- th in the drinks, beverage concentrates or beverage precursors can be reduced, the physico-chemical properties of the beverage are as little as possible changed.
Bevorzugt wird der Gehalt an Prolaminfragmenten um mindestens 50%, bevorzugt um mindestens 80%, mehr bevorzugt um mindestens 90% reduziert.Preferably, the content of prolamine fragments is reduced by at least 50%, preferably by at least 80%, more preferably by at least 90%.
Beispielsweise kann die erfindungsgemäße Behandlung mit Transglutaminase zur Herstellung von Bieren genutzt werden, deren organoleptische und physiko-chemischen Eigenschaften denen von konventionellen Bieren entsprechen. Dies gilt insbesondere für Schaumverhalten und Schaumstabilität, Dichte, Farbe, Extraktgehalt, Vergärungsgrad oder Bittereinheiten.For example, the treatment with transglutaminase according to the invention can be used for the production of beers whose organoleptic and physico-chemical properties correspond to those of conventional beers. This applies in particular to foaming behavior and foam stability, density, color, extract content, degree of fermentation or bitterness units.
Die einzusetzende Enzymmenge ist abhängig von der Enzympräparation und kann in breiten Grenzen variieren. Sie richtet sich nach dem Prolamingehalt der verwendeten Rohstoffe und Zwischenprodukte, der Reaktionszeit, Reak- tionstemperatur, pH-Wert, etc. wie es dem Fachkundigen im Umgang mit Enzymen bekannt ist.The amount of enzyme to be used depends on the enzyme preparation and can vary within wide limits. It depends on the proliferous content of the raw materials and intermediates used, the reaction time, reaction temperature, pH, etc., as known to those skilled in the art of dealing with enzymes.
Bei der Getränkeherstellung aus Getreide, besonders bei der Herstellung von Bieren gibt es meist Prozessschritte, welche den Zusatz der Transglutaminase im Sinne dieser Erfindung ohne höheren Zeit- und Kostenaufwand ermögli- chen. In der Regel folgt diesen Schritten ein Hitzeinaktivierungs-, Filtrationsoder Zentrifugationsschritt, womit die vollständige Inaktivierung der Enzymaktivität und die zumindest teilweise Abtrennung der modifizierten Prolamine und Prolaminfragmente möglich sind. Erfindungsgemäß lassen sich Getränke herstellen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus alkoholhaltigem Bier, alkoholreduziertem Bier, alkoholfreiem Bier, Malzbier, Bier-Mischgetränken, Limonaden, Softdrinks, Fruchtsaftgetränken, Emulsionsgetränken, Fruchtsaftmischgetränken und Mischungen davon.In the production of beverages from cereals, especially in the production of beers, there are usually process steps which make it possible to add transglutaminase for the purposes of this invention without requiring much time and expense. Typically, these steps are followed by a heat inactivation, filtration or centrifugation step which allows complete inactivation of the enzyme activity and at least partial separation of the modified prolamines and prolamine fragments. According to the invention, beverages can be produced which are selected from the group consisting of alcoholic beer, alcohol-reduced beer, non-alcoholic beer, malt beer, beer mixed drinks, lemonades, soft drinks, fruit juice drinks, emulsion drinks, fruit juice mixed drinks and mixtures thereof.
Im Rahmen des Verfahrens können dem Getränk oder der Vorstufe des Getränkes vor, während oder nach dem Inkontaktbringen mit den quervernetzenden Enzymen für Lebensmittel zugelassene Proteine und Proteinhydrolysate, wie Gelatine, Milch- und Molkenproteine pflanzliche oder mikrobielle Protei- ne zugesetzt werden.As part of the process, vegetable or microbial proteins may be added to the beverage or precursor of the beverage before, during or after contact with the crosslinking enzymes for food-approved proteins and protein hydrolysates such as gelatin, milk and whey proteins.
Als weitere Zutaten eignen sich grundsätzlich alle Verbindungen, die als Amin- donatoren (z.B. lysinreiche Peptide) fungieren und von den quervernetzenden Enzymen als Substrate akzeptiert werden, so dass die Prolaminfragmente an entsprechende Substrate gebunden werden können.In principle, all compounds which function as amine donors (for example lysine-rich peptides) and are accepted by the crosslinking enzymes as substrates are suitable as further ingredients, so that the prolamine fragments can be bound to corresponding substrates.
In einer weiteren Ausführungsform werden immobilisierte Substrate zugegeben, so dass die Prolaminfragmente durch die quervernetzenden Enzyme an diese immobilisierten Substrate gebunden werden. Diese Bindung an die Festphase (Matrix) verbessert die Effizienz der Reaktion und erleichtert die Entfernung der Prolaminfragmente deutlich.In another embodiment, immobilized substrates are added so that the prolamine fragments are bound by the cross-linking enzymes to these immobilized substrates. This binding to the solid phase (matrix) improves the efficiency of the reaction and significantly facilitates the removal of prolamine fragments.
Zur Entfernung der modifizierten Prolaminfragmente eignen sich gängige Abtrennungsverfahren wie z.B. Filtration, Zentrifugation, Sedimentation oder Siebung. Häufig lassen sich Verfahrensschritte aus der Getränkeherstellung gleichzeitig zur Abtrennung des modifizierten Prolamins nutzen.For removal of the modified prolamine fragments, common separation methods such as e.g. Filtration, centrifugation, sedimentation or sieving. Frequently, process steps from beverage production can be used at the same time for the separation of the modified prolamin.
Zum einen ist es überraschend, dass es mit den quervernetzenden Enzymen überhaupt möglich ist, Fragmente von Prolamin umzusetzen. Auf der anderen Seite hat sich gezeigt, dass die Entfernung solcher Peptide schwieriger ist als die Entfernung von modifizierten Prolaminen, da die erhaltenen Proteingrößen deutlich kleiner sind. Bevorzugt erfolgt - gegebenenfalls nach einem initialen Abtrennungsverfahren durch Filtration, Zentrifugation, Sedimentation oder Siebung - ein Adsorptionsschritt, um die modifizierten Prolaminfragmente zu entfernen. Als besonders geeignet hat sich eine Filtration an Siliciumdioxid, insbesondere amorphem Siliciumdioxid, wie Kieselgur erwiesen. In Abhängigkeit von der Verfahrensführung kann die Kieselgurfiltration auch der einzige Schritt zur Entfernung der modifizierten Prolaminfragmente sein.First, it is surprising that it is even possible with the cross-linking enzymes to implement fragments of prolamin. On the other hand, it has been found that the removal of such peptides is more difficult than the removal of modified prolamins because the protein sizes obtained are significantly smaller. Preferably, optionally after an initial separation process by filtration, centrifugation, sedimentation or sieving, an adsorption step is carried out to remove the modified prolamine fragments. Filtration of silica, in particular amorphous silica such as kieselguhr, has proven particularly suitable. Depending on the process, kieselguhr filtration may also be the only step to remove the modified prolamine fragments.
In vorteilhafter Weise wird hierbei auch die Transglutaminase aus dem Getränk entfernt, so dass Verfahren zur Inaktivierung des Enzyms deutlich pro- duktschonender gestaltet werden können, da keine oder eine nur geringe Temperatureinwirkung zur Inaktivierung der Enzymaktivität nötig ist.In an advantageous manner, the transglutaminase is also removed from the beverage, so that processes for inactivating the enzyme can be made significantly more product-friendly, since no or only a slight temperature effect is necessary for inactivating the enzyme activity.
Die Enzyme können in aufgereinigter Form oder in Form einer Präparation eingesetzt werden, z.B. einem Extrakt aus einem lebensmittelkompatiblen Organismus.The enzymes can be used in purified form or in the form of a preparation, e.g. an extract from a food-compatible organism.
In einer Ausführungsform kann das Inkontaktbringen mit quervernetzenden Enzymen dadurch erfolgen, dass Mikroorganismen zugesetzt werden, die re- kombinant quervernetzende Enzyme produzieren. Als Mikroorganismen eignen sich insbesondere Hefen. Alternativ ist es auch möglich, dass im Getreide bereits rekombinant quervernetzende Enzyme exprimiert werden, die dann im Rahmen des Verfahrens mit den Prolaminfragmente in Kontakt gelangen.In one embodiment, contacting with crosslinking enzymes can be accomplished by adding microorganisms that produce recombinant cross-linking enzymes. As microorganisms yeasts are particularly suitable. Alternatively, it is also possible that recombinant cross-linking enzymes are already expressed in the cereals, which then come into contact with the prolamine fragments in the course of the process.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Transglutaminase an eine feste Phase gebunden, beispielsweise an polymere Träger, Kieselgele wie Kieselgur, Bentonit oder Kieselsol. Solche festphasengebundenen Transglutaminasen lassen sich bei den Abtrennungsschritten besonders ein- fach entfernen. Die Auswahl der Prozessbedingungen kann in Anpassung an den Herstellungsprozess durch den Fachmann ermittelt werden. Dem Fachmann ist bekannt, dass die Umsetzungsgeschwindigkeit einer Enzymreaktion im Regelfall mit der Menge an Enzymen und der Temperatur steigt. Niedrige Temperaturen bedingen höhere Mengen oder längere Reaktionszeiten. Bei höheren Temperaturen genügen geringere Mengen bzw. kürzere Einwirkzeiten.In a particularly preferred embodiment, the transglutaminase is bound to a solid phase, for example to polymeric carriers, silica gels such as kieselguhr, bentonite or silica sol. Such solid phase-bound transglutaminases are particularly easy to remove during the separation steps. The selection of the process conditions can be determined in accordance with the manufacturing process by a person skilled in the art. It is known to the person skilled in the art that the reaction rate of an enzyme reaction generally increases with the amount of enzymes and the temperature. Low Temperatures require higher amounts or longer reaction times. At higher temperatures, lower quantities or shorter reaction times suffice.
Typischerweise erfolgt das Inkontaktbringen mit dem Getränk oder der Getränkevorstufe und den quervernetzenden Enzymen für einen Zeitraum zwi- sehen 10 min und 72 Stunden. Typischerweise liegt die Temperatur zwischen 0 und 600C.Typically, contacting with the beverage or beverage precursor and crosslinking enzymes occurs for a period of between 10 minutes and 72 hours. Typically, the temperature is between 0 and 60 ° C.
In einer Ausführungsform des Verfahrens schließt sich an das Inkontaktbringen ein Inaktivierungsschritt der Enzyme an, insbesondere eine Hitzebehandlung.In one embodiment of the method, the contacting is followed by an inactivation step of the enzymes, in particular a heat treatment.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Getränk, Getränkegrundstoff, Getränkekonzentrat oder Getränkezusatz erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren sowie ein Lebensmittel, das den Getränkegrundstoff oder das Getränkekonzentrat enthält, beispielsweise in Form eines Joghurts, eines Milchmischgetränkes oder eines diätetischen Getränkes mit Getreideanteilen, oder eines Getränkepulvers.Another object of the invention is a beverage, beverage base, beverage concentrate or beverage additive obtainable by the inventive method and a food containing the beverage base or the beverage concentrate, for example in the form of a yogurt, a milk mix beverage or a dietary beverage with cereal portions, or a beverage powder.
Erfindungsgemäß wird durch das Verfahren der Gehalt an Prolamin und Prola- minfragmenten des Getränkes gesenkt. Bevorzugt liegt der Prolamingehalt nach der Behandlung unter Verwendung von ELISA 1 (Sandwich-ELISA) unter 200 ppm, mehr bevorzugt unter 100 ppm, noch mehr bevorzugt unter 50 ppm und am meisten bevorzugt unter 20 ppm.According to the invention, the process reduces the content of prolamine and prolamine fragments of the beverage. Preferably, the prolactin content after treatment using ELISA 1 (sandwich ELISA) is below 200 ppm, more preferably below 100 ppm, even more preferably below 50 ppm, and most preferably below 20 ppm.
Der Gehalt an Prolaminfragmenten liegt unter Verwendung von ELISA 2 (kom- petitiver ELISA) bevorzugt unter 2000 ppm, mehr bevorzugt unter 1500 ppm, noch mehr bevorzugt unter 1200 ppm und am meisten bevorzugt im Bereich der Nachweisgrenze des Testverfahrens. Die an spezifizierten glutenfreien Le- bensmitteln ermittelte Nachweisgrenze für den Elisa 2 liegt bei 922 ppm (Stand : August 2006).The content of prolamine fragments using ELISA 2 (Competitive ELISA) is preferably below 2000 ppm, more preferably below 1500 ppm, even more preferably below 1200 ppm, and most preferably within the detection limit of the test method. The detection limit for Elisa 2 determined on specified gluten-free foods is 922 ppm (as of August 2006).
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird ein Getränk erhalten, das durch den verminderten Prolamingehalt bessere Verträglichkeit für Patienten mit Zö- liakie, Dermatitis herpetiformis oder einer Gluten/Gliadin-Sensitivität aufweist. Überraschenderweise haben entsprechende Getränke auch verbesserte physiologische Eigenschaften, insbesondere im Hinblick auf die Trübungsstabilität (kolloidale Stabilität).By the method according to the invention a drink is obtained, which due to the reduced prolactin content better compatibility for patients with Zö- liakie, dermatitis herpetiformis or gluten / gliadin sensitivity. Surprisingly, corresponding drinks also have improved physiological properties, in particular with regard to turbidity stability (colloidal stability).
Es ist bekannt, dass Getreide eine Vielzahl ernährungsphysiologischer Vitalstoffe enthalten, die dem Zöliakie-Patienten auf Grund strikter glutenfreier Diäten nicht zugänglich sind. Neben Ballaststoffen zählen insbesondere Vitamine, Mineralien und Spurenelemente zu diesen Vitalstoffen. Trotz kontroverser Diskussion und nicht eindeutiger wissenschaftlicher Evidenz werden in einer Vielzahl von Untersuchungen zu geringe Gehalte an Vitalstoffen bei Zöliakie- Patienten gefunden. Beispielhaft sind folgende Untersuchungen genannt.It is known that cereals contain a large number of nutritional vital substances that are not accessible to celiac disease patients due to strict gluten-free diets. In addition to fiber, especially vitamins, minerals and trace elements are among these vital substances. In spite of controversial discussions and ambiguous scientific evidence, too few levels of vital substances are found in celiac disease patients in a large number of studies. By way of example, the following investigations are mentioned.
Zöliakie-Patienten sollten mit Kalzium supplementiert werden, wobei die tägliche Dosis mindestens 1200 mg betragen sollte (Pazianas et al. 2005, Osteopo- ros Int., 16: 56-63). Viele glutenfreie Produkte auf Getreidebasis (Reis, Mais, etc.) enthalten deutlich geringere Gehalte an Thiamin, Riboflavin oder Niacin im Vergleich zu Standard-Weizenprodukten. Die Verwendung von hoch prozessierten, nicht angereicherten, auf Getreidebasis basierten glutenfreien Produkten kann zu einer Mangelernährung hinsichtlich der Vitamine Thiamin, Riboflavin oder Niacin führen (Thompson 1999, J. Am. Diet. Assoc. 99:858-862). Von 37 untersuchten glutenfreien Produkten auf Getreidebasis enthielten 30 Produkte geringere Folatgehalte als die vergleichbaren Standardprodukte. Annähernd 80% der untersuchten Produkte wiesen geringere Eisenwerte auf. Keines der Nudelprodukte wies eine Eisen-Anreicherung auf (Thompson, 2000, J. Am. Diet. Assoc. 100: 1389-1396). Hallert et al. (2002) (Aliment. Pharmacol. Ther. 16: 1333-1339) schlussfolgern aus ihren Untersuchungen, dass die Hälfte der erwachsenen Zöliakie-Patienten, welche eine strikte glutenfreie Diät befolgen, einen mangelhaften Vitaminstatus besitzen.Celiac patients should be supplemented with calcium, with a daily dose of at least 1200 mg (Pazianas et al 2005, Osteoporos Int., 16: 56-63). Many cereal-based gluten-free products (rice, corn, etc.) contain significantly lower levels of thiamine, riboflavin or niacin compared to standard wheat products. The use of highly processed, non-fortified cereal-based gluten-free products may result in malnutrition of the vitamins thiamine, riboflavin or niacin (Thompson 1999, J. Am. Diet. Assoc. 99: 858-862). Of the 37 cereal-based gluten-free products tested, 30 contained less folate than the comparable standard products. Nearly 80% of the products tested had lower iron values. None of the noodle products had iron fortification (Thompson, 2000, J. Am. Diet, Assoc. 100: 1389-1396). Hallert et al. (2002) (Aliment Pharmacol Ther 16: 1333-1339) conclude that half of adult celiac patients who follow a strict gluten-free diet are deficient in vitamin status.
Da Bier eine große Menge dieser Vitalstoffe besitzt, kann das erfindungsgemäße Getränk auch dem Zöliakie-Patienten dienlich sein, die Situation hinsichtlich Vitalstoffen zu verbessern. Die folgende Tabelle zeigt eine Auswahl an Vital- Stoffen, deren durchschnittliche Gehalte in einem Pilsener Bier (Ausgewählte Kapitel der Brauereitechnologie. W. Back (Hrsg.), Fachverlag Hans Carl, Nürnberg, 20005) sowie von der DGE (2004) empfohlenen Tagesdosen.Since beer has a large amount of these vital substances, the drink according to the invention can also be useful for the celiac disease patient to improve the situation with regard to vital substances. The following table shows a selection of vital signs Substances whose average contents are contained in a Pilsener beer (Selected chapters of brewery technology, W. Back (Ed.), Fachverlag Hans Carl, Nuremberg, 20005) and daily doses recommended by the DGE (2004).
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Das erfindungsgemäße Getränk kann zusätzlich mit Mineralien, Vitaminen, Spurenelementen angereichert sein. Besonders geeignet sind somit Gehalte, die höher sind als die natürlich vorkommenden Gehalte solcher Substanzen. Die Gehalte können sich nach internationalen Gebrauchsempfehlungen (tägliche Aufnahmemenge) für Lebensmittel inklusive diätetischer Lebensmittel richten und übersteigen nicht die Vorgaben der europäischen Lebensmittelgesetzgebung.The drink according to the invention may additionally be enriched with minerals, vitamins, trace elements. Thus, contents which are higher than the naturally occurring contents of such substances are particularly suitable. The levels can be determined according to international recommendations for use (daily intake) for food including dietetic foods and do not exceed the requirements of European food legislation.
Figur 1 zeigt die Kalibrierkurve eines RIDASCREEN® Gliadin competitive as- says.Figure 1 shows the calibration curve of a RIDASCREEN ® Gliadin competitive as- says.
Figur 2 zeigt die Entfernung von Prolamin und Prolaminfragmenten aus Bier durch Verwendung von immobilisierter bzw. löslicher Transglutaminase. Figur 3 zeigt die Transglutaminaseaktivität im Filtrat nach Behandlung mit Kieselgur in verschiedenen Kieselgurkonzentration.FIG. 2 shows the removal of prolamine and prolamine fragments from beer by using immobilized or soluble transglutaminase. FIG. 3 shows the transglutaminase activity in the filtrate after treatment with diatomaceous earth in various diatomaceous earth concentrations.
Figur 4 zeigt die Bestimmung der Transglutaminasekonzentration nach Filtration mit Kieselgur (Spur M : MV-Marker, Spur 1 : vor Filtration, Spur 2: 5 g Kie- selgur/l, Spur 3: 10 g Kieselgur/l, Spur 4: 25 g Kieselgur/l, Spur 5: 50 g Kieselgur/l, Spur 6: 100 g Kieselgur/l, Spur 7 : 50 ng BSA, Spur 8: 25 ng BSA, Spur 9: 10 ng BSA).FIG. 4 shows the determination of the transglutaminase concentration after filtration with diatomaceous earth (lane M: MV marker, lane 1: before filtration, lane 2: 5 g of silica gel / l, lane 3: 10 g of kieselguhr / l, lane 4: 25 g Kieselguhr / l, Lane 5: 50 g kieselguhr / l, Lane 6: 100 g kieselguhr / l, Lane 7: 50 ng BSA, Lane 8: 25 ng BSA, Lane 9: 10 ng BSA).
Figur 5 zeigt die Transglutaminaseaktivität im Bier nach Behandlung mit Kieselgur und Filtration.FIG. 5 shows the transglutaminase activity in beer after treatment with kieselguhr and filtration.
Figur 6 zeigt eine Übersicht über den Gehalt toxischer Peptide in verschiedenen Biersorten.FIG. 6 shows an overview of the content of toxic peptides in different types of beer.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden, nicht-limitierenden Beispiele weiter erläutert.The invention will be further elucidated by the following, non-limiting examples.
BeispieleExamples
1) Bestimmung des Gehalts von Prolaminfragmenten1) Determination of the content of prolamine fragments
Der analytische Nachweis von Prolaminfragmenten in Rohwaren, Zwischenprodukten und Endgetränken erfolgte mit dem RIDASCREEN® Gliadin competitive Test, einem kompetitiven Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Peptidsequenzen von Prolaminen aus Weizen (Gliadin), Roggen (Secalin) und Gerste (Hordein) in Lebensmitteln. Der eingesetzte monoklonale Antikörper R5 erkennt unter anderem die toxische Sequenz QQPFP, die wiederholt in Prolaminen vorkommt. Insbesondere das PFP-Motiv, an das der R5-Antikörper bindet, kommt wiederholt in kleinen, für Zöliakiepatienten toxischen Peptiden vor (vgl. Kahlenberg et al., Proceedings of the 18th meeting of the working group on prolamin analysis toxicity, Verlag Wissenschaftliche Scripten, Zwi- ckau, 2004, 71-77 und Shan et al., J. Proteome Res. 2005, 4, 1732-41) Dieser ELISA wurde entwickelt zur Untersuchung von Stärke, Sirup und Bier. Durch chemische Modifizierungen oder enzymatische Prozesse können in den genannten Lebensmitteln die intakten Proteinmoleküle denaturiert werden und kleine Bruchstücke entstehen. Diese Bruchstücke können von einem Sand- wich-ELISA-Format nicht identifiziert werden, da sie das antigene Epitop nur einmal enthalten. Gleichzeitig können diese Peptide toxisch für Zöliakiepatien- ten sein.The analytical detection of prolamine fragments in raw materials, intermediates and final drinks was carried out with the RIDASCREEN ® gliadin competitive test, a competitive enzyme immunoassay for the quantitative determination of peptide sequences of prolamins from wheat (gliadin), rye (secalin) and barley (hordein) in food. The monoclonal antibody R5 used recognizes, inter alia, the toxic sequence QQPFP, which occurs repeatedly in prolamins. In particular, the PFP motif to which the R5 antibody binds occurs repeatedly in small peptides toxic to celiac disease patients (see Kahlenberg et al., Proceedings of the 18th Meeting of the Working Group on Prolamin Analysis Toxicity, published by Scientific Scripts). Zwickau, 2004, 71-77 and Shan et al., J. Proteome Res. 2005, 4, 1732-41). This ELISA was developed for the investigation of starch, syrup and beer. By Chemical modifications or enzymatic processes can denature the intact protein molecules in the mentioned foods and small fragments develop. These fragments can not be identified by a sandwich ELISA format as they contain the antigenic epitope only once. At the same time, these peptides can be toxic for celiac disease patients.
Das Testprinzip beruht auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Vertiefungen der Mikrotiterstreifen sind mit Gliadin als Antigen beschichtet. Glia- dinstandards, kalibriert gegen das QQPFP-Peptid, oder zu analysierende Probe sowie an Peroxidase gekoppelte anti-Gliadin-Antikörper (monoklonaler R5- Antikörper) werden gleichzeitig zugegeben. Die markierten Antikörper (En- zymkonjugat) binden an Gliadin der Mikrotiterplatte und die Prolaminpeptide in der Probelösung. Es entstehen Antigen-Antikörper-Komplexe. In einem Waschschritt wird gebundenes Enzymkonjugat in der Lösung entfernt, das an die Mikrotiterplatte gebundene Konjugat bleibt. Der Nachweis erfolgt durch Zugabe des Substrats Harnstoffperoxid sowie eines Chromogens (Tetra- methylbenzidin). Das an den Antikörper gebundene Enzym wandelt das farblose Chromogen in ein blaues Endprodukt um. Die Zugabe eines Stopp- Reagenzes (H2SO4) führt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. Die Mes- sung erfolgt photometrisch bei 450 nm in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät. Die der Extinktion bei 450 nm der Probe entsprechende QQPFP-Konzentration in μg/g (ppm) wird aus der Kalibrationskurve abgelesen und daraus der tatsächliche QQPFP-Gehalt der Probe berechnet.The test principle is based on an antigen-antibody reaction. The wells of the microtiter strips are coated with gliadin as the antigen. Glialin standards calibrated against the QQPFP peptide or sample to be analyzed, and anti-gliadin antibodies (monoclonal R5 antibody) coupled to peroxidase are added simultaneously. The labeled antibodies (enzyme conjugate) bind to gliadin of the microtiter plate and the prolamin peptides in the sample solution. There are antigen-antibody complexes. In a washing step, bound enzyme conjugate in the solution is removed which remains conjugate to the microtiter plate. Detection is carried out by adding the substrate urea peroxide and a chromogen (tetramethylbenzidine). The antibody bound to the antibody converts the colorless chromogen into a blue end product. The addition of a stop reagent (H 2 SO 4 ) leads to a color change from blue to yellow. The measurement is carried out photometrically at 450 nm in a microtiter plate reader. The QQPPP concentration in μg / g (ppm) corresponding to the absorbance at 450 nm of the sample is read from the calibration curve and from this the actual QQPFP content of the sample is calculated.
Ergebnisse: siehe Figur 1 (Kalibrierkurve)Results: see Figure 1 (calibration curve)
2) Analyse von kommerziellen Bieren mit Elisa 22) Analysis of commercial beers with Elisa 2
Unter Verwendung des kompetetiven Assays (Elisa 2) weisen die überwiegende Mehrheit der untersuchten deutschen und internationalen Biere QQPFP- Werte auf, die deutlich über dem Wert liegen, der für glutenfreie Produkte vom Kit-Hersteller als Nachweisgrenze benannt wird. Außerhalb der Gruppe der glutenfreien Biere auf Basis alternativer Rohwaren findet man in allen Bierka- tegorien (alkoholfrei, helle deutsche Biere, helle und dunkle internationale Bie- re) Biere mit ganz unterschiedlichen QQPFP-Werten, die überwiegend über dem vom Kit-Hersteller angegebenen Grenzwert liegen.Using the competitive assay (Elisa 2), the vast majority of the German and international beers examined have QQPFP values well above the value designated as the detection limit for gluten-free products by the kit manufacturer. Outside the group of gluten-free beers based on alternative raw materials, all beer ka- categories (non-alcoholic, light German beers, light and dark international beers) beers with very different QQPFP values, which are predominantly above the limit specified by the kit manufacturer.
Ergebnisse: siehe Figur 6Results: see FIG. 6
3) Entfernung von Prolamin und Prolaminfragmenten durch Zugabe immobilisierter Transglutaminase3) Removal of prolamine and prolamine fragments by addition of immobilized transglutaminase
1 g einer Transglutaminase-Formulierung wurde in 1000 ml eines Essigsäure/ Acetat- Puffers (pH 4,6) gelöst. Nach Zugabe von Kieselgur wurde 15 min gerührt und anschließend über einen Faltenfilter filtriert. Nicht an Kieselgur gebundene Transglutaminase wurde durch mehrmaliges Waschen mit kaltem Bier entfernt. 1 g des Transglutaminase-gekoppelten Kieseigurs wurden zu 1000 ml Bier gegeben. Unter stetigem Rühren wurde die Suspension bei 5°C inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurden ungelöste Bestandteile über einen Faltenfilter filtiert. Im Filtrat wurde die Konzentration der toxischen Pep- tide bestimmt (siehe Beispiel 1).1 g of a transglutaminase formulation was dissolved in 1000 ml of an acetic acid / acetate buffer (pH 4.6). After adding diatomaceous earth, it was stirred for 15 minutes and then filtered through a fluted filter. Non-kieselguhr bound transglutaminase was removed by washing with cold beer several times. 1 g of the transglutaminase-coupled kieseigur were added to 1000 ml of beer. With constant stirring, the suspension was incubated at 5 ° C. After completion of the reaction, undissolved constituents were filtered through a pleated filter. The concentration of toxic peptides was determined in the filtrate (see Example 1).
Ergebnisse: siehe Figur 2Results: see Figure 2
(Abnahme der QQPFP-Konzentration mit steigender Reaktionszeit; im Vergleich ein unbehandeltes Bier sowie der Verlauf der QQPFP-Konzentration bei Verwendung von löslicher Transglutaminase)(Decrease in QQPFP concentration with increasing reaction time, compared to an untreated beer and the course of QQPFP concentration when using soluble transglutaminase)
4) Entfernung von löslicher Transglutaminase aus einem Getränk durch einen Filtrationsschritt unter Verwendung eines Filtrationshilfsmittels4) Removal of soluble transglutaminase from a beverage by a filtration step using a filtration aid
Eine Lösung von Transglutaminase in Essigsäure/Acetat-Puffer (pH 4,6) mit einer Enzymaktivität von 3,5 U/ml wurde auf 5 0C temperiert. Nach Zugabe von Kieselgur (25 g/l) wurde 15 min leicht gerührt. Nach Filtration über einen Faltenfilter wurde das Filtrat analysiert:A solution of transglutaminase in acetic acid / acetate buffer (pH 4.6) with an enzyme activity of 3.5 U / ml was heated to 5 ° C. After adding diatomaceous earth (25 g / l) was stirred gently for 15 min. After filtration through a fluted filter, the filtrate was analyzed.
(1) Mittels Hydroxamattest wurde die Transglutaminase-Aktivität im Filtrat bestimmt. Ergebnis: - I i(1) Hydroxamate test was used to determine the transglutaminase activity in the filtrate. Result: - I i
Im Filtrat ist Transglutaminase-Aktivität nur in geringen Spuren nachweisbar (siehe Figur 3).In the filtrate transglutaminase activity is detectable only in slight traces (see Figure 3).
(2) Mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese(2) By sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
(SDS-PAGE) und anschließender Silberfärbung wurde die Transglutami- nase-Konzentration bestimmt.(SDS-PAGE) and subsequent silver staining, the transglutaminase concentration was determined.
Ergebnis:Result:
Auf Basis der mittels BSA bestimmten Nachweisgrenze der Silberfärbung berechnet sich die Transglutaminase-Konzentration zu < 0,8 mg/1 (siehe Figur 4). Auch die in der Transglutaminase-Präparation vorhandenen Verunreinigun- gen werden durch das beschriebene Verfahren entfernt.On the basis of the detection limit of silver staining determined by means of BSA, the transglutaminase concentration is calculated to be <0.8 mg / l (see FIG. 4). The contaminants present in the transglutaminase preparation are also removed by the method described.
Eine Lösung von Transglutaminase in einem nach Pilsener Brauart hergestellten Bier mit einer Enzymaktivität von 3,5 U/ml wurde auf 5 0C temperiert. Nach Zugabe von Kieselgur (25 g/l) wurde 15 min leicht gerührt. Nach Filtration über einen Faltenfilter wurde die Transglutaminase-Aktivität im Filtrat be- stimmt (Figur 5).A solution of transglutaminase in a beer produced according to Pilsener brewing method with an enzyme activity of 3.5 U / ml was heated to 5 0 C. After adding diatomaceous earth (25 g / l) was stirred gently for 15 min. After filtration through a pleated filter, the transglutaminase activity in the filtrate was determined (FIG. 5).
5) Herstellung eines mit Vitalspuren angereicherten Getränks5) Preparation of fortified drink
Durchschnittliche Gehalte von Vitamin-, Mineralien- und Spurenelementen in Pilsener Lagerbier sowie die empfohlene Tagesdosis an diesen Vitalstoffen (Ausgewählte Kapitel der Brauereitechnologie. W. Back (Hrsg.), Fachverlag Hans Carl 2005, Nürnberg).Average contents of vitamin, mineral and trace elements in Pilsener Lager as well as the recommended daily dose of these vital substances (Selected chapters of brewery technology, W. Back (Ed.), Fachverlag Hans Carl 2005, Nuremberg).
Beispiel eines vitaminangereicherten BiergetränkesExample of a vitamin-enriched beer beverage
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Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Herstellung eines Getränkes, eines Getränkegrundstoffs, eines Getränkekonzentrates oder eines Getränkezusatzes mit vermindertem Gehalt an Prolaminfragmente aus prolaminhaltigen Rohstoffen mit fol- genden Schritten :1. A process for the preparation of a beverage, a beverage base, a beverage concentrate or a beverage additive with a reduced content of prolamine fragments from prolaminhaltigen raw materials with the following steps:
a) Inkontaktbringen des Getränkes oder einer Vorstufe des Getränks mit quervernetzenden Enzymen, um modifizierte Prolaminfragmente zu erhalten b) mindestens teilweise Entfernung der modifizierten Prolaminfragmente.a) contacting the beverage or a precursor of the beverage with cross-linking enzymes to obtain modified prolamine fragments b) at least partially removing the modified prolamine fragments.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die quervernetzenden Enzyme zumindest teilweise entfernt werden.2. The method according to claim 1, characterized in that the crosslinking enzymes are at least partially removed.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die quervernetzenden Enzyme ausgewählt sind aus den Enzymklassen der Transglutaminasen (EC 2.3.2.13), Peroxidasen (EC 1.11.1.7), Hexose- Oxidasen (EC 1.1.3.5), Tyrosinasen (EC 1.14.18.1), Laccasen (EC3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the crosslinking enzymes are selected from the enzyme classes of transglutaminases (EC 2.3.2.13), peroxidases (EC 1.11.1.7), hexose oxidases (EC 1.1.3.5), tyrosinases ( EC 1.14.18.1), Laccases (EC
1.10.3.2), Proteindisulfidisomerase (EC 5.3.4.1) und Kombinationen hiervon, insbesondere Ca2+-unabhängige Transglutaminasen aus Streptoverti- ci IH um mobaraense.1.10.3.2), protein disulphide isomerase (EC 5.3.4.1) and combinations thereof, in particular Ca 2+ -independent transglutaminases from Streptovertci IH to mobaraense.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als prolaminhaltiger Rohstoff, Getreide wie Weizen, Roggen, Hafer,4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that as prolaminhaltiger raw material, cereals such as wheat, rye, oats,
Gerste, Dinkel, Grünkorn, Einkorn, Emmer, Tricitale, Bulgur, Kamut, andere prolaminhaltige Rohstoffe oder Mischungen davon eingesetzt werden.Barley, spelled, green grain, Einkorn, Emmer, Tricitale, Bulgur, Kamut, other prolaminhaltige raw materials or mixtures thereof are used.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Getränk ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus alkohol- haltigem Bier, alkoholreduziertem Bier, alkoholfreiem Bier, Malzbier, Bier-5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the beverage is selected from the group consisting of alcoholic beer, alcohol-reduced beer, non-alcoholic beer, malt beer, beer
Mischgetränken, Limonaden, Softdrinks, Fruchtsaftgetränken, Emulsionsgetränken, Fruchtsaftmischgetränken, Trinkjoghurts, diätetische Getränken mit Getreideanteil und Mischungen davon. Mixed drinks, sodas, soft drinks, fruit juice drinks, emulsion drinks, fruit juice mixed drinks, drink yoghurts, cereal dietetic drinks and mixtures thereof.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass dem Getränk oder der Vorstufe des Getränkes vor, während oder nach dem Inkontaktbringen mit den quervernetzenden Enzymen für Lebensmittel zugelassene Proteine und Proteinhydrolysate, wie Gelatine, Milch- und Molkenproteine zugesetzt werden.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the beverage or the precursor of the beverage before, during or after the contacting with the crosslinking enzymes for food-approved proteins and protein hydrolysates, such as gelatin, milk and whey proteins are added.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur mindestens teilweisen Entfernung der modifizierten Prola- minfragmente eine gängige Abtrennungsmethode, wie Filtration, Zentrifu- gation, Sedimentation oder Siebung durchgeführt wird, insbesondere eine Adsorption an Kieselgur.7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that for the at least partial removal of the modified Prola- minfragmente a common separation method, such as filtration, centrifugation, sedimentation or screening is performed, in particular an adsorption on diatomaceous earth.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkontaktbringen mit quervernetzenden Enzymen durch Zugabe von Mikroorganismen und/oder Getreide erfolgt, wobei die Mikroorganismen oder das Getreide rekombinant quervernetzende Enzyme produzie- ren, insbesondere mit einer Hefe.8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the contacting with crosslinking enzymes by the addition of microorganisms and / or cereals takes place, wherein the microorganisms or the grain ren recombinant cross-linking enzymes produce, in particular with a yeast.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das quervernetzende Enzym festphasengebunden vorliegt.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the crosslinking enzyme is solid phase bound.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Inkontaktbringen eine Inaktivierung der quervernetzenden Enzyme erfolgt, insbesondere durch eine Hitzebehandlung.10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that after contacting takes place inactivation of the crosslinking enzymes, in particular by a heat treatment.
11. Getränk, Getränkegrundstoff, Getränkekonzentrat oder Getränkezusatz erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.11. beverage, beverage base, beverage concentrate or beverage additive obtainable by a method according to any one of claims 1 to 9.
12. Lebensmittel enthaltend den Getränkegrundstoff, das Getränkekonzentrat oder den Getränkezusatz gemäß Anspruch 11.12. Food containing the beverage base, the beverage concentrate or the beverage additive according to claim 11.
13. Getränk hergestellt aus prolaminhaltigen Rohstoffen, dadurch gekennzeichnet, dass der Prolamingehalt <. 20 ppm und der Gehalt an Prola- minfragmenten <. 922 ppm (angegebene Nachweisgrenze des Kits Ridasc- reen Gliadin competitive der Firma R-Biopharm, Darmstadt), gemessen als QQPFP liegt.13. beverage produced from prolaminhaltigen raw materials, characterized in that the prolanol content < . 20 ppm and the content of prolamin fragments < . 922 ppm (indicated detection limit of the kit Ridasc reen gliadin competitive from R-Biopharm, Darmstadt), measured as QQPFP.
14. Verwendung von quervernetzenden Enzymen zur Modifizierung von Prola- minfragmenten in Getränken, Getränkegrundstoffen, Getränkekonzentra- ten oder Getränkezusätzen aus prolaminhaltigem Getreide. 14. Use of cross-linking enzymes for modifying proline fragments in beverages, beverage bases, beverage concentrates or beverage additives from prolamin-containing cereals.
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