WO2008080505A1 - Neuer spezifischer arabinose-transporter aus der hefe pichia stipitis und dessen verwendungen - Google Patents

Neuer spezifischer arabinose-transporter aus der hefe pichia stipitis und dessen verwendungen Download PDF

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WO2008080505A1
WO2008080505A1 PCT/EP2007/010668 EP2007010668W WO2008080505A1 WO 2008080505 A1 WO2008080505 A1 WO 2008080505A1 EP 2007010668 W EP2007010668 W EP 2007010668W WO 2008080505 A1 WO2008080505 A1 WO 2008080505A1
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arabinose
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Eckhard Boles
Marco Keller
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Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide having a novel specific arabinose transporter function and to nucleic acids coding therefor.
  • the invention further relates to host cells, in particular modified yeast strains, which contain the coding nucleic acids and express the polypeptide and functionally integrate into the plasma membrane and thus can take up L-arabinose.
  • modified host cells expressing other proteins of the arabinose pathway arabinose can be fermented by these cells, especially to ethanol.
  • the present invention is therefore inter alia important in the context of the production of biochemicals from biomass, such as e.g. Bioethanol.
  • the beer, wine and baker's yeast Saccharomyces cerevisiae has been used for centuries for bread, wine and beer production due to its ability to ferment sugar to ethanol and carbon dioxide.
  • S. cerevisiae is used in addition to the production of heterologous proteins, especially in ethanol production for industrial purposes.
  • Ethanol is used in many industries as a starting substrate for syntheses. Due to the ever-shrinking oil reserves, the rising oil prices and the steadily increasing worldwide gasoline demand, ethanol is gaining more and more importance as a fuel alternative.
  • lignocellulosic biomass such as straw, waste from wood and agriculture and the organic portion of the everyday household waste, as a starting substrate offers. This is on the one hand very cheap and on the other hand in large quantity available.
  • the three largest components of lignocellulose are lignin, cellulose and hemicellulose. Hemicellulose, the second most abundant polymer after cellulose, is a highly branched heteropolymer.
  • pentoses L-arabinose, D-xylose
  • uronic acids 4- O-methyl-D-glucuronic acid, D-galacturonic acid
  • hexoses D-mannose, D-galactose, L-rhamnose, D-glucose
  • pentoses L-arabinose and D-xylose which are normally unreactable by the yeast S. cerevisiae.
  • S. cerevisiae In order to use pentoses for fermentation, they must first enter the cell via the plasma membrane. Although S. cerevisiae is unable to metabolize D-xylose, it can ingest it into the cell. S. cerevisiae has no specific transporter. The transport takes place with the help of the numerous hexosetransporters. However, the affinity of transporters for D-xylose is significantly lower than that for D-glucose (Kotter and Ciriacy, 1993). In yeasts capable of metabolizing D-xylose, e.g. P. stipitis, C. shehatae, or P.
  • yeasts such as Candida tropicalis, Pachyselen tannophilus, Pichia stipitis, Candida shehatae, that can naturally ferment or at least assimilate L-arabinose.
  • these lack the ability to ferment L-arabinose to ethanol entirely or they have only a very low ethanol yield (Dien et al., 1996).
  • yeast C. shehatae one assumes a proton symport (Lucas and Uden, 1986).
  • S 1 . cerevisiae is known from galactose permease Gal2, which also transports L-arabinose, which is similar in structure to D-galactose (Kou et al, 1970).
  • Jeppson et al. (2006) describe xylose fermentation by S. cerevisiae by introducing a xylose metabolic pathway which is either similar to that in the yeasts Pichia stipitis and Candida shehatae, which naturally use xylose, or similar to the bacterial pathway.
  • Katahira et al. (2006) describe sulfuric acid hydrolysates of lignocellulosic biomass, such as wood chips, as an important material for the production of fuel bioethanol.
  • a recombinant yeast strain was constructed that can ferment xylose and cellooligosaccharide.
  • various genes were integrated into this yeast strain, namely for the intercellular expression of xylose reductase and xylitol dehydrogenase from Pichia stipitis and xylulokinase from S. cerevisiae and for the presentation of beta-glucosidase from Aspergillus acleatus on the cell surface.
  • xylose and cellooligosaccharides were completely fermented by the recombinant strain after 36 hours.
  • the activities of the key enzymes of the pentose phosphate pathway were increased 2-fold, while the concentrations of their substrates (pentose-5-phosphate, sedoheptulose-7-phosphate) were correspondingly lowered.
  • Becker and Boles (2003) describe the engineering and selection of a laboratory strain of S. cerevisiae that is able to use L-arabinose for growth and to ferment it to ethanol. This was possible by the overexpression of a bacterial L-arabinose pathway consisting of Bacillus subtilis AraA and Escherichia coli AraB and AraD and simultaneous overrexpression of the L-arabinose-transporting yeast galactose permease in the yeast strain. Molecular analysis of the selected strain showed that the crucial prerequisite for the use of L-arabinose is a low is more activity of L-ribulokinase. However, among other things, a very slow growth is reported by this yeast strain (see FIG. 2).
  • polypeptides which have an in vitro and / or in vivo pentose transport function, and variants and fragments thereof.
  • the polypeptide of the invention is selected from the group of a. a polypeptide which is at least 70%, preferably at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and has an in vitro and / or in vivo pentose transport function, b. a naturally occurring variant of a polypeptide comprising the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1, which has an in vitro and / or in vivo pentose transport function, c. a polypeptide identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having an in vitro and / or in vivo pentose transport function, and d. a fragment of the polypeptide of a., b. or c, comprising a fragment of at least 100 continuous amino acids according to SEQ ID NO: 1.
  • the polypeptide according to the invention comprises a fragment of at least 200 or 300 continuous amino acids according to SEQ ID NO: 1.
  • a fragment is characterized in that it has an in vitro and / or in vivo pentose transport function.
  • a polypeptide of the invention comprises a fragment of 502 amino acids corresponding to the first 502 amino acids of SEQ ID NO: 1.
  • a fragment is characterized by having an in vitro and / or in vivo pentose transport function.
  • the polypeptide of the invention comprises a polypeptide which is at least 90%, preferably 95%, more preferably 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and has an in vitro and / or in vivo pentose transport function.
  • Variants of the polypeptides of the invention may also be those that have conservative amino acid substitutions or smaller deletions and / or insertions, as long as these changes do not significantly affect the in vitro and / or in vivo pentose transport function.
  • Polypeptides of the invention may further comprise heterologous amino acid sequences.
  • Suitable heterologous amino acid sequences can be selected by the person skilled in the art depending on the application or use.
  • the pentose is preferably arabinose, in particular L-arabinose, so that a polypeptide according to the invention preferably has an in vitro and / or in vivo arabinose transport function, in particular an L-arabinose transport function.
  • the polypeptide according to the invention is preferably derived from a yeast, preferably from Pichia, in particular Pichia stipitis.
  • nucleic acid molecules which code for a polypeptide according to the invention.
  • a nucleic acid molecule according to the invention is at least 90%, preferably 95% and more preferably 99% identical to the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or 3.
  • a nucleic acid molecule according to the invention further comprises vector nucleic acid sequences, preferably expression vector sequences.
  • Vector nucleic acid sequences are preferably selected from sequences derived from the vectors of the group consisting of YEp24, p426HXT7- 6HIS, p426Met25, pYES260, pYES263, pVTU260, pVTU263, pVTL260, pVTL263.
  • Nucleic acid molecules according to the invention can furthermore comprise nucleic acid sequences which code for further heterologous polypeptides.
  • Suitable heterologous nucleic acid sequences which code for further heterologous polypeptides can be selected by the person skilled in the art according to the application or use. These include, for example, antibiotic resistance marker sequences.
  • Nucleic acid molecules according to the invention preferably comprise dsDNA, ssDNA, PNA, CNA, RNA or mRNA or combinations thereof.
  • the object is further achieved according to the invention by providing host cells which contain at least one erf ⁇ ndungsconcees nucleic acid molecule. Host cells according to the invention additionally express this at least one nucleic acid molecule according to the invention.
  • a host cell according to the invention is in particular a fungal cell and preferably a yeast cell, such as Saccharomyces species, e.g. S. cerevisiae, Kluyveromyces sp., E.g. K. lactis, Hansenula sp., E.g. H. polymorpha, Pichia sp. , e.g. P. pastoris, Yarrowia sp., E.g. Y. lipolytica.
  • Saccharomyces species e.g. S. cerevisiae, Kluyveromyces sp., E.g. K. lactis, Hansenula sp., E.g. H. polymorpha
  • Pichia sp. e.g. P. pastoris
  • Yarrowia sp. E.g. Y. lipolytica.
  • host cells according to the invention furthermore contain nucleic acid molecules which code for proteins of the arabinose metabolic pathway, in particular for L-ribulokinase, L-ribulose-5-P 4-epimerase, L-arabinose isomerase.
  • proteins of the bacterial arabinose metabolic pathway in particular E. coli araB L-ribulokinase, E. coli araD L-ribulose-5-P 4-epimerase and B. subtilis araA L-arabinose isomerase. See also FIGS. 2 and 3.
  • Particularly preferred host cells of this invention are cells of the strain MKY06-4P deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures on August 23, 2006 under the accession number DSM 18544. See also FIG. 3.
  • a preferred host cell according to this invention is a yeast cell modified by introduction and expression of the genes araA (L-arabinose isomerase), araB (L-ribulokinase) and araD (L-ribulose-5-P-4-epimerase), and additionally overexpressing a TALI (transaldolase) gene, as described for example by the inventors in EP 1 499 708 B1, and additionally containing at least one nucleic acid molecule according to the invention.
  • araA L-arabinose isomerase
  • araB L-ribulokinase
  • araD L-ribulose-5-P-4-epimerase
  • the object is further achieved according to the invention by the provision of antibodies or antibody fragments, comprising an immunologically active part which binds selectively to a polypeptide of the invention.
  • Methods of generating antibodies or antibody fragments are known in the art.
  • the object is further achieved according to the invention by processes for the preparation of a polypeptide according to the invention.
  • Such a method comprises cultivating a host cell according to the invention under conditions under which a nucleic acid molecule according to the invention is expressed.
  • General methods for generation of polypeptides by cell culture are known in the art.
  • kits comprising a compound which binds selectively to a polypeptide according to the invention, optionally with further auxiliaries and instructions for use.
  • the compound is preferably a pentose, such as arabinose, and especially L-arabinose, or a derivative of such a pentose.
  • the object is further achieved according to the invention by methods for identifying a compound which binds to a polypeptide of the invention and / or modulates its activity.
  • Such a method comprises the following steps:
  • the compound is preferably a pentose, such as arabinose, and especially L-arabinose, or a derivative of such a pentose.
  • the object is further achieved according to the invention by methods for modulating the activity of a polypeptide according to the invention.
  • Such a method comprises contacting a polypeptide or cell expressing a polypeptide of the invention with a compound that binds to the polypeptide in a concentration sufficient to modulate the activity of the polypeptide.
  • the compound is preferably a pentose, such as arabinose, and especially L-arabinose, or a derivative of such a pentose.
  • Such a method according to the invention comprises the expression of a nucleic acid molecule according to the invention in a host cell according to the invention.
  • polypeptides according to the invention, nucleic acid molecules and host cells are particularly preferably used for the production of bioethanol.
  • polypeptides according to the invention, nucleic acid molecules and host cells are furthermore used with particular preference for the recombinant fermentation of pentose-containing biomaterial.
  • a test system has succeeded in finding a specific L-arabinose transporter gene from the genome of P. stipitis.
  • pAraTl and pAraT7 genome fragments from P. stipitis are localized, which are responsible for a specific growth on L-arabinose but not on D-glucose, D-mannose or D-galactose medium.
  • the observed low growth on D-galactose was not caused by the plasmids pAraTl or pAraT7. This was only the weak growth of the EBY.VW4000, the parent strain of the MKY06, which was already described by Wieczorke et al.
  • HGT2 was annotated as a putatively high affinity glucose transporter due to its high homology to the high-affinity glucose transporter HGTl of Candida albicans. Examining the sequence for possible transmembrane domains gives 12 transmembrane domains, which is typical for transporters. It is therefore surprising that it is a pentose transporter (arabinose transporter) and not a hexose transporter.
  • TALI had to be overexpressed genomically in this strain.
  • the transporter according to the invention is the first described specific arabinose transporter of eukaryotes
  • the arabinose transporter according to the invention is also of great importance for their utilization.
  • Possible uses of a functional and yet specific arabinose transporter in the yeast S. cerevisiae include the production of bioethanol and the production of high-quality precursor products for further chemical syntheses.
  • SEQ ID NO: 1 the protein sequence of the AraT ORF
  • SEQ ID NO: 2 shows the sequence of the open reading frame (ORF) of AraT
  • SEQ ID NO: 3 shows the sequence of the open reading frame (ORF) of AraT in a codon-optimized form
  • SEQ ID NO: 4 shows the sequence of the open reading frame (ORF) of AraT with 500 promoter, ORF and 300 terminator.
  • the second most abundant hemicellulose is a highly branched polymer consisting of pentoses, uronic acids, and hexoses.
  • the hemicellulose consists to a large extent of the pentoses xylose and arabinose.
  • Figure 2 Scheme for the use of L-arabinose in recombinant S. cerevisiae by integration of a bacterial L-arabinose mass transfer pathway.
  • FIG. 3 Construction of the yeast strain MKY06-4P according to the invention.
  • the starting strain for the construction of the MKY06-4P was the yeast strain EBY.VW4000, in which all hexose transporter genes (HXT's) were deleted.
  • HXT's hexose transporter genes
  • the endogenous transaldolase TAL1 was overexpressed by replacing the native promoter with the truncated / £ ⁇ T7 promoter (HXT7-Prom). This resulted in the strain MKY06.
  • Each smear was the MKY06-3P and additionally a plasmid from the gene bank YEpTW.
  • a negative control (-)
  • the p426HXT7-6HIS was transformed instead of a plasmid of the gene bank and the pHL125 re as positive control (+).
  • Colonies 1 and 7 grew on L-arabinose but not on D-glucose, D-mannose and only weak on D-galactose.
  • the complete open reading frame of the transporter according to the invention was sequenced double-stranded with overlapping regions.
  • the promoter and terminator region was sequenced in single-stranded fashion.
  • the arrows indicate the areas of individual sequencing
  • the plasmid pAraT1 (B) as well as the plasmid pAraT7 are thus based on the YEp24 and differ only in the size of the insert.
  • the open reading frame (ORF) of the arabinose transporter according to the invention was amplified by the pAraT1 and cloned behind the truncated strong HAT7 promoter of the plasmid p426HXT7-6HIS (C). This resulted in the plasmid p426H7-AraT (D), which has a uracil marker.
  • Another possible expression plasmid is p426Met25 (E).
  • Figure 7 Growth on arabinose using a specific arabinose transporter.
  • FIG. 8 Ethanol formation using a specific arabinose transporter.
  • the results of HPLC analyzes of the strain BWY1 with the plasmids p423H7araABs re , p424H7araB re , p425H7araD re and p426H7-AraT in SFM medium with 1.7% L-arabinose under semi-anaerobic conditions are shown.
  • EBY.VW4000 (genotype: MATa Ieu2-3,112 ura3-52 trp 1-289 his3-Al MAL2-8c SUC2 Ahxtl-
  • MKY06 (genotype: MATa leu2-3,112 ura3-52 trpl-289 his3-l MAL2-8c SUC2 hxtl-17 ga1 stllr.loxP agtl :: loxP mph2 :: loxP mph3 :: loxP PromTALI :: loxP-Prom-vkHXT7, Description : EBY.VW4000 PromTALl :: loxP-Prom-vkHXT7)
  • MKY06-3P (genotype: MATa leu2-3,112 ura3-52 trpl-289 his3-l MAL2-8c SUC2 hxtl-17 gal2 stll :: loxP agtlr.loxP mph2 :: loxP mph3 :: loxP PromTALl :: loxP-Prom-vkHXT7 , Description: EBY.VW4000 PromTALI :: loxP-Prom-vkHXT7); includes the plasmids p423H7araABs re , p424H7araB re and P 425H7araD re . Trunk with the accession number DSM 18544
  • MKY06-4P (genotype: MATa Ieu2-3, U2 uraS-52 trpl-289 his3-l MAL2-8c SUC2 hxtl-17 gas :: loxP agtl :: loxP mph2 :: loxP mph3 ::!
  • OxP PromTALl :: loxP Prom-vkHXT7, Description: EBY.VW4000 PromTALI :: loxP-Prom-vkHXT7); includes the plasmids p423H7araABs re , p424H7araB re , p425H7araD re and p426H7-AraT.
  • BWY1 is based on strain JBY25 (genotype: MATa Ieu2-3, U2 ura3-52 trpl-289 his3- ⁇ .lMAL2-8c SUC2 + unknown mutations for better growth on L-arabinose) (Becker and Boles, 2003); strain JBY25 was further selected and has other mutations for improved growth on L-arabinose under oxygen-restricted conditions (Wiedemann, 2005).
  • yeast nitrogen base w / o amino acids and ammonium sulfate, 0.5% ammonium sulfate, 20 mM potassium dihydrogen phosphate, pH 6.3, amino acid / nucleobase solution without the amino acids corresponding to the auxotrophic markers of the plasmids used, carbon source in the concentration indicated in each case
  • Vitamins biotin, 0.05 mg / 1; p-aminobenzoic acid, 0.2 mg / l; Nicotinic acid, 1 mg / l; Calcium pantothenate, 1 mg / l; Pyridoxine HCl, 1 mg / 1; Thiamine HCl, 1 mg / 1; minositol, 25 mg / 1
  • Solid full and selective media also contained 1.9% agar.
  • the cultivation of the yeast cells was carried out at 30 ° C.
  • the synthetic mineral medium used for the fermentations contained salts, trace metals and vitamins at the concentrations listed above and the indicated carbon source.
  • a stock solution was prepared.
  • the trace metal solution was autoclaved (20 min, 121 ° C) and the vitamin solution sterile filtered. Both were stored at 4 ° C.
  • the pH value was crucial and prevented the precipitation of individual components.
  • the various trace metals had to be dissolved completely in water in the above order one by one. After each addition, the pH had to be adjusted to 6.0 with KOH before the next trace metal could be added.
  • the pH was adjusted to 4.0 with HCl.
  • 50 ⁇ l / l of antifoam (Antifoam204, Sigma) was added to the medium.
  • 2.5 ml / l of a Tween80 ergosterol solution was added to the medium after autoclaving. This consists of 16,8g Tween ⁇ O and 0,4g Ergosterol, which were filled with ethanol to 50ml and dissolved in it. The solution was sterile filtered. The salts, the appropriate amounts of trace metal solution and the antifoam were autoclaved together with the complete fermenter. The carbon source was separated - -
  • YEpTW Pichia stipitis Genbank with chromosomal fragments of Pichia stipitis in the over-expression plasmid YEp24, WL45 marker gene (Weierstall et ⁇ /., 1999)
  • S. cerevisiae The transformation of S. cerevisiae was performed using the lithium acetate method (Gietz and Woods, 2002). To select for genetic resistance, the cells were incubated for 4 h at 30 ° C. in complete medium after transformation and then plated on G418-containing medium plates.
  • E. coli cells The transformation of E. coli cells was carried out by the electroporation method (Dower et al., 1988; Wirth, 1993) using EQUIBO Easyject prima.
  • the supernatant was mixed with 150 ⁇ l of Buffer 3 and incubated on ice for 10 minutes, after a 15-minute centrifugation at 10000 U / min was used, the supernatant and the plasmid DNA with 400 ul of isopropanol (-20 0 C, 10 min).
  • the collected by centrifugation (30min, 13000rpm) pelleted DNA was washed with 70% cold ethanol and taken up in 20 .mu.l of water The DNA was then used for transformation into E. coli or DNA amplification by PCR.
  • the isolation of plasmid DNA from E. coli was carried out with the "Plasmid Mini Kit” from Qiagen according to the manufacturer.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the polymerase was added ("hot start PCR")
  • the number of synthesis steps, the annealing temperature and the elongation time were adapted to the specific melting temperatures of the oligonucleotides used or to the size of the expected product checked by subsequent agarose gel electrophoresis and then purified.
  • the purification of the PCR products was carried out with the "QIAquick PCR Purification Kit” from Qiagen according to the manufacturer.
  • the separation of DNA fragments with a size of 0.15-20 kb was carried out in 1 to 4% agarose gels.
  • lxTAE buffer 40 mM Tris, 40 mM acetic acid, 2 mM EDTA
  • the size standard used was either a lambda phage DNA cut with the restriction endonucleases EcoRI and Hin ⁇ III, or the 2-log DNA ladder (N ⁇ B).
  • the DNA samples were spiked with 1/10 volume of blue marker (lxTA ⁇ buffer, 10% glycerol, 0.004% bromophenol blue) prior to application. After separation, the gels were incubated in a ⁇ thidium bromide bath and the DNA fragments visualized by irradiation with UV light (254 nm).
  • the desired DNA fragment was excised from the TA ⁇ agarose gel under long-wave UV light (366 nm) and isolated using the "QIAex II Gel Extraction Kit” or the “QIAquick Gel Extraction Kit” from Qiagen according to the manufacturer's instructions.
  • the autosampler "AS50”, the column oven “TCC-100”, the gradient pump “GS50” (all Dionex) and the RI-detector “RI-101” (Shodex) were used for the measurement.
  • the column used was the VA 300 / 7.7 Nucleogel Sugar 810H (Macherey-Nagel) with 20% sulfuric acid as eluent (0.6 ml / min).
  • Chromeleon TM (Version 6.50, Dionex) was used.
  • Example 1 Construction of a test system for the investigation of L-arabinose
  • the transformation with the three plasmids took place simultaneously.
  • the transformants were plated on SC medium with 2% maltose.
  • the transporter Gal2 known as L-arabinose
  • was transformed into a positive control and the empty plasmid p426HXT7-6HIS was transformed into a negative control and replated again on maltose-containing medium plates.
  • the positive control containing an L-arabinose transporter and the three plasmids for L-arabinose utilization and overexpressing transaldolase should be able to grow on L-arabinose.
  • the negative control should show no growth due to the missing transporter. This was investigated.
  • the growth behavior was also examined in liquid medium with 2% maltose or 2% L-arabinose.
  • test system has now been used to search for possible L-arabinose transporter genes in a gene bank of Pichia stipitis, one of the yeasts capable of utilizing L-arabinose.
  • the gene bank YEpTW used here was prepared from the Pichia stipitis strain CBS5774. Chromosomal DNA was partially digested with the restriction endonuclease Sau3A and ligated into the BamHI linearized vector YEp24 (Weierstall et al, 1999).
  • Genbank like the plasmid pHL125 re, had a uracil auxotrophic marker.
  • Gene library YEpTW was transformed into strain MKY06-3P and plated on SC medium containing 2% maltose. The colonies obtained after three days at 30 ° C were replica-plated onto SC medium plates containing 2% L-arabinose. After 10 days, colonies were searched for L-arabinose growth. Growth was only possible if the gene bank plasmid encoded a transporter capable of transporting L-arabinose.
  • the GAL2 was overexpressed in the positive control by a strong promoter and the genes on the plasmids of the gene bank had their native promoter.
  • the plasmids pAraTl and pAraT7 since these only mediated growth on L-arabinose medium. These showed no growth on D-glucose and D-mannose. Only the pAraTl caused slight growth on D-galactose.
  • the growth of pAraT7 on D-galactose corresponded to the weak growth of the negative control (see Figure 4). This has previously been reported for the parent strain of MKY06, the EBY.VW4000 (Wieczorke et ⁇ /., 1999).
  • the colonies with the pAraTö, pAraT7 and pAraTl l were used in liquid SC medium with 2% L-arabinose and made therefrom glycerol cultures, which are stored for later investigations at -70 ° C.
  • the plasmids pAraTl and pAraT7 were further worked on and the growth behavior of the strains in liquid medium was investigated.
  • the MKY06-3P which additionally contained the pAraTl or pAraT7, behaved identically to the positive (additionally pHL125 re ) and the negative control (additionally p426HXT7-6HIS).
  • the growth rates were 0.197h "1 .
  • the gene bank plasmids had to be isolated again from the yeast. It should be noted that the strain MKY06 not only contains the plasmid from the gene bank YEpTW, which encodes the desired transporter, but at the same time also the three plasmids for the L-arabinose metabolism (p423H7araABs re , p424H7araB re , p425H7araD re ) and that the plasmid p423H7araABs re occurs in a much higher number in the cells, than the remaining three plasmids.
  • the cells were inoculated starting from the L-arabinose plates in maltose liquid medium without uracil (ura-). After reaching the stationary phase, these were inoculated into fresh maltose ura medium and used again. The cells were used with the four plasmids five times in maltose ura liquid medium to the stationary phase. The aim of this was an enrichment of the plasmid pAraTl or pAraT7. Separate smears were made on these maltose ura medium plates from both cultures.
  • the resulting colonies were replica plated on additional maltose plates and incubated for two days at 30 ° C. These plates contained the corresponding amino acid for the auxotrophy marker of the other three plasmids (re histidine for p423H7araABs acid, tryptophan or leucine for p424H7araB for p425H7araD re) not. These replica plates were compared to the maltose ura plates. Colonies growing only on the maltose ura plate were selected. These only had the plasmid pAraTl or pAraT7. The plasmids were isolated from yeast. The plasmids were then amplified in E. coli and characterized after isolation from E. coli by means of a restriction analysis. Restriction enzymes used were Ncol and Nhel. Ncol only cuts in the URA3 marker gene. If it is the searched plasmid from the Genbank, then a 934bp fragment is created.
  • the complete ORF of the transporter found was sequenced double-stranded with overlapping regions.
  • the promoter and terminator region was sequenced in single-stranded fashion (compare FIG. 5).
  • the arrows indicate the areas of individual sequencing. - 5 -
  • the two plasmids pAraT1 and pAraT7 contain overlapping fragments of the same gene. It is one and the same transporter and not two different transporter genes.
  • the plasmid pAraTl has an insert of about 5kb; it contains the complete open reading frame (ORF) of the AraT which consists of 1629 bases and consequently 542 amino acids (plus the STOP codon). In addition, promoter and terminator sequences.
  • the plasmid pAraT7 has an insert which is about 3kb in size; it does not include the complete ORF of the AraT, but only the first 1507 bases. Nevertheless, this fragment was functional.
  • HGT2 was annotated as a putatively high affinity glucose transporter due to its high homology to the high-affinity glucose transporter HGTl of Candida albicans. Examining the sequence for possible transmembrane domains gives 12 transmembrane domains, which is typical for transporters.
  • the plasmid YEp24 was the plasmid YEp24.
  • the plasmid pAraTl as well as the plasmid pAraT7 are thus based on the YEp24 and differ only in the size of the insert.
  • the vector YEp24 is an episomal plasmid.
  • the open reading frame (ORF) of the arabinose transporter found was amplified by the pA-raTI and cloned behind the truncated strong / E YT7 promoter of the plasmid p426HXT7-6HIS. This resulted in the plasmid p426H7-AraT, which has a uracil marker.
  • strain MKY06-4P The growth of the strain MKY06-4P was studied under aerobic conditions as a function of the L-arabinose concentration in the medium. As a comparison, the strain MKY06-3P was used, which additionally contained the plasmid pHL125 re or p426HXT7-6HIS.
  • Figs. 7A to 7C The results are shown in Figs. 7A to 7C.
  • the strain MKY06-4P grows faster under all three conditions than the comparative strain MKY06-3P, which still contains the plasmid pHL125 re .
  • FIG. 7A 0.5% L-arabinose
  • FIG. 7B the strain with the p426H7-AraT grows faster than the comparison strain.
  • FIG. 7C Even with an L-arabinose concentration of 2% (FIG. 7C), the strain with the p426H7-AraT grows faster than the comparison strain with the pHL125 re , which, however, at this concentration achieves a higher optical density at the end of the growth.
  • the strains were used aerobically in the same medium to a high optical density.
  • the cells were spun down and seeded for semi-anaerobic fermentation - -
  • Wiedemann, B. (2005) Molecular genetic and physiological characterization of a recombinant pentose-fermenting yeast strain. Thesis. Johann Wolfgang Goethe University, Frankfurt am Main.
  • Electroporation An alternative method for transforming bacteria with plasmid DNA. , Forum Microbiology 11 (507-515).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid, das eine neue spezifische Arabinose-Transporterfunktion aufweist, sowie auf dafür kodierende Nukleinsäuren. Die Erfindung betrifft des weiteren Wirtszellen, insbesondere modifizierte Hefe-Stämme, die die kodierenden Nukleinsäuren enthalten und das Polypeptid exprimieren und funktionell in die Plasmamembran integrieren und somit L-Arabinose aufnehmen können. Bei der Verwendung von modifizierten Wirtszellen, die weitere Proteine des Arabinose-Stoffwechselweges exprimieren, kann Arabinose durch diese Zellen fermentiert werden, insbesondere zu Ethanol. Die vorliegende Erfindung ist somit unter anderem bedeutsam im Zusammenhang mit der Produktion von Biochemikalien aus Biomasse, wie z.B. Bioethanol.

Description

Neuer spezifischer Arabinose-Transporter aus der Hefe Pichia stipitis und dessen Verwendungen
1. Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Polypeptid, das eine neue spezifische Arabi- nose-Transporterfunktion aufweist, sowie auf dafür kodierende Nukleinsäuren. Die Erfindung bezieht sich des weiteren auf Wirtszellen, insbesondere modifizierte Hefe-Stämme, die die kodierenden Nukleinsäuren enthalten und das Polypeptid exprimieren und funktionell in die Plasmamembran integrieren und somit L-Arabinose aufnehmen können. Bei der Verwendung von modifizierten Wirtszellen, die weitere Proteine des Arabinose-Stoffwechselweges exprimieren, kann Arabinose durch diese Zellen fermentiert werden, insbesondere zu Ethanol. Die vorliegende Erfindung ist somit unter anderem bedeutsam im Zusammenhang mit der Produktion von Biochemikalien aus Biomasse, wie z.B. Bioethanol.
2. Hintergrund der Erfindung
Die Bier-, Wein- und Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wird aufgrund ihrer Eigenschaft, Zucker zu Ethanol und Kohlendioxid zu fermentieren, schon seit Jahrhunderten für die Brot-, Wein- und Bierherstellung genutzt. In der Biotechnologie findet S. cerevisiae neben der Produktion von heterologen Proteinen vor allem in der Ethanolproduktion für industrielle Zwek- ke Verwendung. Ethanol wird in zahlreichen Industriezweigen als Ausgangssubstrat für Synthesen benutzt. Durch die immer knapper werdenden Ölvorkommen, die steigenden Ölpreise und den stetig steigenden weltweiten Benzinbedarf gewinnt Ethanol als Kraftstoffalternative mehr und mehr an Bedeutung.
Um eine kostengünstige und effiziente Bioethanol-Produktion zu ermöglichen bietet sich die Verwendung von lignozellulosehaltiger Biomasse, wie z.B. Stroh, Abfälle aus der Holz- und Landwirtschaft und der organische Anteil aus dem alltäglichen Hausmüll, als Ausgangssubstrat an. Diese ist zum einen sehr günstig und zum anderen in großer Menge vorhanden. Die drei größten Bestandteile der Lignozellulose sind Lignin, Zellulose und Hemizellulose. Hemi- zellulose, nach Zellulose das am zweithäufigsten vorkommende Polymer, ist ein stark verzweigtes Heteropolymer. Es besteht aus Pentosen (L-Arabinose, D-Xylose), Uronsäuren (4- O-Methyl-D-Glucuronsäure, D-Galacturonsäure) und Hexosen (D-Mannose, D-Galactose, L- Rhamnose, D-Glucose) (siehe Figur 1). Hemizellulose lässt sich zwar leichter als Zellulose hydrolysieren, besitzt aber die Pentosen L-Arabinose und D-Xylose, die von der Hefe S. cere- visiae normalerweise nicht umgesetzt werden können.
Um Pentosen für Fermentationen nutzen zu können, müssen diese zuerst über die Plasmamembran in die Zelle hinein gelangen. Obwohl S. cerevisiae nicht in der Lage ist, D-Xylose zu metabolisieren, kann es diese in die Zelle aufnehmen. S. cerevisiae besitzt aber keine spezifischen Transporter. Der Transport findet mit Hilfe der zahlreichen Hexosetransporter statt. Die Affinität der Transporter zu D-Xylose ist aber deutlich niedriger als die zu D-Glucose (Kotter und Ciriacy, 1993). In Hefen, die D-Xylose metabolisieren können, wie z.B. P. stipi- tis, C. shehatae oder P. tannophilus (Du Preez et al., 1986), gibt es sowohl unspezifische niederaffine Transporter, die D-Glucose transportieren, als auch spezifische hochaffine Protonen- Symporter nur für D-Xylose (Hahn-Hagerdal et al, 2001).
In früheren Versuchen konnten einige Hefen, wie zum Beispiel Candida tropicalis, Pachyso- len tannophilus, Pichia stipitis, Candida shehatae gefunden werden, die von Natur aus L- Arabinose fermentieren oder zumindest assimilieren können. Diesen fehlt jedoch die Fähigkeit, L-Arabinose zu Ethanol zu fermentieren ganz oder sie besitzen nur eine sehr geringe Ethanolausbeute (Dien et al., 1996). Man weiß zudem über die Aufnahme von L-Arabinose noch sehr wenig. In der Hefe C. shehatae geht man von einem Protonen-Symport aus (Lucas und Uden, 1986). In S1. cerevisiae ist von der Galactosepermease Gal2 bekannt, dass diese auch die in der Struktur zu D-Galactose ähnliche L-Arabinose transportiert (Kou et al, 1970).
Alkoholische Fermentation von Pentosen in biotechnologisch veränderten Hefestämmen der S. cerevisiae, wobei unter anderem verschiedene Gene des Hefestammes Pichia stipitis zur genetischen Veränderung der S. cerevisiae herangezogen werden, wurde in den letzten Jahren vor allem in Zusammenhang mit der Fermentation von Xylose beschrieben. Dabei konzentrierte sich das Engineering vor allem auf die Einführung der Gene für die initiale Xylose- Assimilation aus Pichia stipitis, einer Xylose-fermentierneden Hefe in S. cerevisiae, also in eine Hefe, die traditionell bei der Ethanol-Produktion aus Hexose eingesetzt wird (Jin et al. 2004). - -
Jeppson et al. (2006) beschreiben Xylose-Fermentation durch S. cerevisiae mittels Einführung eines Xylose-Stoffwechselweges, der entweder ähnlich zu dem in den Hefen Pichia stipitis und Candida shehatae ist, die natürlicherweise Xylose verwenden, oder ähnlich zum bakteriellen Stoffwechselweg ist.
Katahira et al. (2006) beschreiben Schwefelsäure-Hydrolysate von Lignozellulose-Biomasse, wie Holzspäne, als bedeutendes Material für die Produktion von Treibstoff-Bioethanol. In dieser Studie wurde ein rekombinanter Hefestamm konstruiert, der Xylose und Zellooligosac- charide fermentieren kann. Dazu wurden in diesen Hefestamm verschiedene Gene integriert, und zwar zur interzellulären Expression von Xylose-Reduktase und Xylitol-Dehydrogenase aus Pichia stipitis und Xylulokinase aus S. cerevisiae sowie zur Präsentation von Beta- Glucosidase aus Aspergillus acleatus auf der Zelloberfläche. Bei der Fermentation der Schwefelsäure-Hydrolysate von Holzspänen wurden Xylose und Zellooligosaccharide durch den rekombinanten Stamm nach 36 Stunden vollständig fermentiert.
Pitkanen et al. (2005) beschreiben die Gewinnung und Charakterisierung von Xylose- Chemostat-Isolaten eines S. cerevmαe-Stammes, der für Xylose-Reduktase und Xylitol- Dehydrogenase kodierende Gene aus Pichia stipitis and das Gen, das die endogene Xylulokinase kodiert, überexprimiert. Die Isolate wurden aus aeroben Chemostat-Kulturen auf Xylose als einzige oder hauptsächliche Kohlenstoffquelle gewonnen. Unter aeroben Bedingungen auf Minimalmedium mit 30 g/l Xylose war die Wachstumsrate der Chemostat-Isolate 3 -fach höher als die des Originalstammes (0,15 h"1 gegenüber 0,05 h'1). Die Xylose- Aufnahmerate war fast 2-fach erhöht. Die Aktivitäten der Schlüsselenzyme des Pentosephosphat- Stoffwechselweges (Transketolase, Transaldolase) waren 2-fach erhöht, während die Konzentrationen ihrer Substrate (Pentose-5-phosphate, Sedoheptulose-7-phosphat) entsprechend erniedrigt waren.
Becker und Boles (2003) beschreiben das Engineering und die Selektion eines Laborstamm- nes von S. cerevisiae, der in der Lage ist, L-Arabinose zum Wachstum zu verwenden und zu Ethanol zu fermentieren. Dies war möglich durch die Überexpression eines bakteriellen L- Arabinose-Stoffwechselweges, bestehend aus Bacillus subtilis AraA and Escherichia coli AraB and AraD and simultaner Überrexpression der L-Arabinose-transportierenden Hefe- Galaktose-Permease in dem Hefestamm. Molekulare Analyse des selektierten Stammes zeigte, dass die entscheidende Voraussetzung für eine Verwendung von L-Arabinose eine niedri- gere Aktivität von L-Ribulokinase ist. Von diesem Hefestamm wird jedoch unter anderem ein sehr langsames Wachstum berichtet, (siehe Figur 2)
Es besteht also im Stand der Technik Bedarf für spezifische Pentose-Transporter, insbesondere L-Arabinose-Transporter, die es ermöglichen, Pentosen, insbesondere L-Arabinose spezifisch in Zellen, wie Hefezellen, aufzunehmen und somit eine Verwertung und Fermentation von Pentosen, insbesondere L-Arabinose zu begünstigen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, spezifische Pentose-Transporter, wie L- Arabinose-Transporter, zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch das zur Verfügung stellen von Polypeptiden, die eine in vitro und/oder in vivo Pentose-Transportfunktion aufweisen, und Varianten und Fragmenten davon.
Insbesondere ist das erfindungsgemäße Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe von a. einem Polypeptid, das zu mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80% identisch zu der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 1 ist und eine in vitro und/oder in vivo Pentose-Transportfunktion aufweist, b. einer natürlich auftretenden Variante eines Polypeptids umfassend die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 1, die eine in vitro und/oder in vivo Pentose- Transportfunktion aufweist, c. einem Polypeptid, das identisch zu der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 1 ist und eine in vitro und/oder in vivo Pentose-Transportfunktion aufweist, und d. einem Fragment des Polypeptids aus a., b. oder c, umfassend ein Fragment von mindestens 100 kontinuierlichen Aminosäuren nach SEQ ID NO: 1.
Bevorzugterweise umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid ein Fragment von mindestens 200 oder 300 kontinuierlichen Aminosäuren nach SEQ ID NO: 1. Dabei wird ein solches Fragment dadurch charakterisiert, dass es eine in vitro und/oder in vivo Pentose- Transportfunktion aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Polypeptid ein Fragment von 502 Aminosäuren, das den ersten 502 Aminosäuren nach SEQ ID NO: 1 entspricht. Ein solches Fragment ist dadurch charakterisiert, dass es eine in vitro und/oder in vivo Pentose-Transportfunktion aufweist.
Bevorzugterweise umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid ein Polypeptid das zu mindestens 90%, bevorzugt 95%, weiter bevorzugt zu 99% identisch zu der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO :1 ist und eine in vitro und/oder in vivo Pentose-Transportfunktion aufweist.
Varianten der erfindungsgemäße Polypeptide können auch solche sein, die konservative Aminosäure-Austausche aufweisen oder kleinere Deletionen und/oder Insertionen, solange diese Veränderungen die in vitro und/oder in vivo Pentose-Transportfunktion nicht wesentlich beeinflussen.
Erfindungsgemäße Polypeptide können weiterhin heterologe Aminosäuresequenzen umfassen. Geeignete heterologe Aminosäuresequenzen kann der Fachmann je nach Anwendung oder Verwendung selbst auswählen.
Bevorzugterweise ist die Pentose Arabinose, insbesondere L-Arabinose, so dass ein erfindungsgemäßes Polypeptid bevorzugt eine in vitro und/oder in vivo Arabinose- Transportfunktion, insbesondere eine L-Arabinose-Transportfunktion aufweist.
Das erfindungsgemäße Polypeptid stammt bevorzugt aus einer Hefe, bevorzugt aus Pichia, insbesondere Pichia stipitis, ab.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen von isolierten Nukleinsäuremolekülen, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodieren, gelöst.
Bevorzugterweise ist ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül zu mindestens 90%, bevorzugt 95% und weiter bevorzugt 99% identisch zu der Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO:2 oder 3.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül umfasst weiter Vektor-Nukleinsäuresequenzen, bevorzugt Expressionsvektor-Sequenzen. Vektor-Nukleinsäuresequenzen sind bevorzugt ausgewählt aus Sequenzen, die von den Vektoren der Gruppe bestehend aus YEp24, p426HXT7- 6HIS, p426Met25, pYES260, pYES263, pVTU260, pVTU263, pVTL260, pVTL263 umfasst werden. Für weitere Ausführungen siehe Figuren 6A-E und Beispiel 3.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle können weiterhin Nukleinsäuresequenzen, die für weitere heterologe Polypeptide kodieren, umfassen. Geeignete heterologe Nukleinsäuresequenzen, die für weitere heterologe Polypeptide kodieren, kann der Fachmann je nach Anwendung oder Verwendung selbst auswählen. Dazu zählen beispielsweise Antibiotika- Resistenzmarker-Sequenzen.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle umfassen bevorzugt dsDNA, ssDNA, PNA, CNA, RNA oder mRNA oder Kombinationen davon.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch das zur Verfügung stellen von Wirtszellen, die mindestens ein erfϊndungsgemäßes Nukleinsäuremolekül enthalten. Erfindungsgemäße Wirtszellen exprimieren dieses mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül zudem bevorzugt.
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle ist insbesondere eine Pilzzelle und bevorzugt eine Hefezelle, wie Saccharomyces species, z.B. S. cerevisiae, Kluyveromyces sp., z.B. K. lactis, Hansenu- Ia sp., z.B. H. polymorpha, Pichia sp. , z.B. P. pastoris, Yarrowia sp., z.B. Y. lipolytica.
Bevorzugterweise enthalten erfindungsgemäße Wirtszellen weiterhin Nukleinsäuremoleküle, die für Proteine des Arabinose-Stoffwechselweges kodieren, insbesondere für L- Ribulokinase, L-Ribulose-5-P 4-Epimerase, L-Arabinose-Isomerase.
Dabei handelt es sich bevorzugt um Proteine des bakteriellen Arabinose-Stoffwechselweges, insbesondere E. coli araB L-Ribulokinase, E. coli araD L-Ribulose-5-P 4-Epimerase und B. subtilis araA L-Arabinose-Isomerase. Siehe auch Figuren 2 und 3.
Besonders bevorzugte Wirtszellen dieser Erfindung sind Zellen des Stammes MKY06-4P der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen am 23. August 2006 unter der Hinterlegungsnummer DSM 18544 hinterlegt wurde. Siehe auch Figur 3. Eine bevorzugte Wirtszelle gemäß dieser Erfindung ist eine Hefezelle, die durch Einführung und Expression der Gene araA (L-Arabinose-Isomerase), araB (L-Ribulokinase) und araD (L- Ribulose-5-P-4-epimerase) modifiziert wurde und zudem ein TALl (Transaldolase) -Gen überexprimiert, wie beispielsweise von den Erfindern in der EP 1 499 708 Bl beschrieben, und zusätzlich dazu wenigstens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül enthält.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch das zur Verfügung stellen von Antikörpern oder Antikörper-Fragmenten, umfassend einen immunologisch aktiven Teil, der selektiv an ein erfindungsgemäßes Polypeptid bindet. Verfahren zur Generation von Antikörpern oder Antikörper-Fragmenten sind im Stand der Technik bekannt.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids. Ein solches Verfahren umfasst das Kultivieren einer erfϊn- dungsgemäßen Wirtszelle unter Bedingungen, unter denen ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül exprimiert wird. Allgemeine Verfahren zur Generation von Polypeptiden mittels Zellkultur sind im Stand der Technik bekannt.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch einen Kit, umfassend eine Verbindung, die selektiv an ein erfindungsgemäßes Polypeptid bindet, gegebenenfalls mit weiteren Hilfsstoffen und Gebrauchsanweisungen.
Die Verbindung ist bevorzugt eine Pentose, wie zum Beispiel Arabinose, und insbesondere L- Arabinose, oder ein Derivat einer solchen Pentose.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die an ein erfindungsgemäßes Polypeptid bindet und/oder seine Aktivität moduliert. Ein solches Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
In Kontakt bringen eines Polypeptids oder einer Zelle, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimiert, mit einer Testverbindung, und
Bestimmen, ob das Polypeptid an die Testverbindung bindet und, gegebenenfalls, Bestimmen, ob die Testverbindung die Aktivität des Polypeptids moduliert.
Die Verbindung ist bevorzugt eine Pentose, wie zum Beispiel Arabinose, und insbesondere L- Arabinose, oder ein Derivat einer solchen Pentose. Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch Verfahren zur Modulierung der Aktivität eines erfindungsgemäßen Polypeptids. Ein solches Verfahren umfasst in Kontakt bringen eines Polypeptids oder einer Zelle, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimiert, mit einer Verbindung, die an das Polypeptid bindet in einer ausreichenden Konzentration, um die Aktivität des Polypeptids zu modulieren.
Die Verbindung ist bevorzugt eine Pentose, wie zum Beispiel Arabinose, und insbesondere L- Arabinose, oder ein Derivat einer solchen Pentose.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch Verfahren zur Produktion von Bioethanol. Ein solches erfindungsgemäßes Verfahren umfasst die Expression eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls in einer erfindungsgemäßen Wirtszelle.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide, Nukleinsäuremoleküle und Wirtszellen werden insbesondere bevorzugt zur Produktion von Bioethanol verwendet. Für bevorzugte Ausfuhrungsformen wird auf Figur 8 und Beispiel 4 verwiesen.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide, Nukleinsäuremoleküle und Wirtszellen werden weiter insbesondere bevorzugt zur rekombinanten Fermentation von Pentose-haltigem Biomaterial verwendet.
Spezifische Gene aus Pichia stipitis, die die Aufnahme der Pentose L- Arabinose in S. cerevi- siae spezifisch erhöhen, wurden unter Verwendung einer Genbank isoliert und in den Hefestamm MKY06-3P integriert, der dann in der Lage ist, die L-Arabinose zu Ethanol zu vergären. Das Screening der relevanten Gene führte zu einem neuen spezifischen L-Arabinose- Transporter, dessen Nukleotid- und Proteinsequenz vorliegt (siehe SEQ ID NOs: 1-4). Dazu wird auch auf die Beispiele und Figuren verwiesen.
Aufgrund der Spezifität dieses neuen Transporters kann nach Expression in bestehenden Ethanol-produzierenden Systemen die Aufhahmerate für L-Arabinose verbessert werden, da zum einen bei hohen L-Arabinose-Konzentrationen die Konkurrenzsituation gegenüber Glukose verbessert wird und zum anderen bei niedrigen L-Arabinose-Konzentrationen aufgrund einer hohen Affinität der Transport von L-Arabinose effizienter wird. - -
Aufnahme von L-Arabinose
Damit die Pentose L-Arabinose von S. cerevisiae metabolisiert werden kann, muss diese zuerst von der Zelle aufgenommen werden. Bezüglich dieser Aufnahme ist erst wenig bekannt. Man kennt bisher in Eukaryonten noch keine Gene, die für spezifische L-Arabinose- Transporter kodieren. Alle für die Pentose D-Xylose getesteten Hexosetransporter besitzen eine viel höhere Affinität zu D-Glucose als zu D-Xylose. Für L-Arabinose wird ähnliches vermutet. Von allen bisher konstruierten Stämmen, die Pentosen (D-Xylose oder L- Arabinose) verwerten können, wird ein relativ langsames Wachstum berichtet. Als Grund hierfür wird vor allem die langsame und schlechte Aufnahme der Pentosen genannt (Becker und Boles, 2003; Richard et al, 2002). Bei Fermentationen in einem Zuckergemisch, bestehend aus D-Glucose und D-Xylose oder D-Glucose und L-Arabinose, werden die Zucker nicht simultan umgesetzt. Durch die hohe Affinität der Transporter zu D-Glucose wird diese zuerst metabolisiert. Es tritt ein so genannter Diauxie-Shift ein. Erst nachdem die D-Glucose aufgebraucht ist, wird die Pentose in einer zweiten deutlich langsameren Wachstumsphase umgesetzt (Kuyper et al, 2005a; Kuyper et al, 2005b). Als eine Erklärung wird das Fehlen von spezifischen Transportern für Pentosen angeführt.
Neuer spezifischer L-Arabinose Transporter aus P. stipitis
Für industrielle Anwendungen wäre es ideal, wenn der verwendete Mikroorganismus alle im Medium vorhandenen Zucker möglichst gleichzeitig umsetzen könnte (Zaldivar et al, 2001). Um dies zu erreichen, wären spezifische Transporter für jeden Zuckertyp von großem Nutzen. Besonders für L-Arabinose kannte man bisher noch keinen.
In dieser Erfindung ist es mit einem Testsystem (siehe Beispiele) gelungen, ein spezifisches L-Arabinose-Transportergen aus dem Genom von P. stipitis zu finden. Auf den Plasmiden pAraTl und pAraT7 sind Genomfragmente aus P. stipitis lokalisiert, welche für ein spezifisches Wachstum auf L-Arabinose aber nicht auf D-Glucose, D-Mannose oder D-Galactose Medium verantwortlich sind. Das beobachtete geringe Wachstum auf D-Galactose wurde nicht von den Plasmiden pAraTl oder pAraT7 verursacht. Hierbei handelte es sich nur um das schwache Wachstum des EBY.VW4000, dem Ausgangstamm des MKY06, welches bereits von Wieczorke et al. (1999) berichtet wurde. Die Möglichkeit, dass das erhaltene Wachstum durch eine genomische Mutation im MKY06 bewirkt wurde, konnte ausgeschlossen werden. Nach einer Selektion auf den Verlust des Plasmids der P. stipitis Genbank durch zweimaligen Ausstrich auf FOA-Medium wurde bei erneutem Ausstreichen auf L-Arabinose Medium kein Wachstum mehr festgestellt. Somit rührte das Wachstum von den Plasmiden der P. stipitis Genbank her (siehe Beispiele). Es konnte gezeigt werden, dass die gefundenen Plasmide einen Transporter codieren.
Bei einer BLAST-Recherche mit dem kürzlich veröffentlichten Genom von Pichia stipitis (siehe http://genome.jgi-psf.org/euk_home.html) zeigte sich eine Übereinstimmung von 100 % mit HGT2. HGT2 wurde aufgrund seiner hohen Homologie zum hochaffinen Glucose- Transporter HGTl von Candida albicans als putativer hochaffiner Glucose-Transporter annotiert. Wenn man die Sequenz hinsichtlich der möglichen Transmembran-Domänen untersucht, erhält man 12 Transmembran-Domänen, was für Transporter typisch ist. Es ist daher überraschend, dass es sich um einen Pentose-Transporter (Arabinose-Transporter) und nicht um einen Hexose-Transporter handelt.
Des weiteren waren eine Vielzahl von experimentellen Hürden und Schwierigkeiten beim Auffinden und Bereitstellen des erfindungsgemäßen Transporters zu überwinden, die sich in größerem Detail auch aus den Beispielen und Figuren ergeben.
- Im Ausgangsstamm EBY.VW4000 mussten insgesamt 21 Monosaccharid-Transporter Gene deletiert werden.
- Weiterhin musste in diesem Stamm TALl genomisch überexprimiert werden.
- Die Etablierung der optimalen Wachstumsbedingungen für die Durchführung des Screens gestaltete sich sehr schwierig und zeitaufwendig.
- Bei dem erfindungsgemäßen Transporter handelt es sich um den ersten beschriebenen spezifischen Arabinose-Transporter von Eukaryonten
- Es handelt sich um einen heterolog exprimierten und zugleich funktionell in der Plasmamembran von S. cerevisiae eingebauten Transporter, was nicht unbedingt zu erwarten ist.
Über die Schwierigkeiten bezüglich heterolog exprimierter Transporter gibt es einige Berichte, siehe dazu Chapter 2 im „Buch Transmembrane Transporters" (Boles, 2002) und den Artikel von Wieczorke et al., 2003. Weitere Biomasse mit signifikanten Mengen an Arabinose (Quelle der Daten: U.S. Department of Energy http://www.eere.energy.gov/biomass/progs/searchl.cgi): Art der Biomasse L- Arabinose \%\
Switchgras 3,66
Grosses Bartgras 3,55
Hohes Schwingelgras 3,19
Robinie 3
Com Stover 2,69
Weizen Stroh 2,35
Zuckerrohr Bagasse 2,06
Chinesischer Buschklee 1,75
Futterhirse 1,65
Auch für deren Verwertung ist der erfindungsgemäße Arabinose-Transporter von großer Bedeutung.
Nutzungsmöglichkeiten eines in der Hefe S. cerevisiae funktionellen und zugleich spezifischen Arabinose-Transporters sind zum einen die Produktion von Bioethanol und die Herstellung von hochwertigen Vorläufer-Produkten für weitere chemische Synthesen.
Folgende Auflistung stammt aus der Studie „Top Value Added Chemicals From Biomass" (siehe wwwl.eere.energy.gov/biomass/pdfs/35523.pdf). Hierbei wurden 30 Chemikalien als besonders wertvoll eingestuft, welche aus Biomasse hergestellt werden können.
Figure imgf000012_0001
Sobald diese Chemikalien aus Lignozellulose durch Biokonversion (z.B. Fermentationen mit Hefen) hergestellt werden, ist es wichtig, einen spezifischen Transporter für die Hemizellulo- se Arabinose zu besitzen. Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Figuren, Sequenzen und Beispielen weiter verdeutlicht, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Die zitierten Referenzen sind hiermit durch Bezugnahme vollständig aufgenommen. In den Sequenzen und Figuren zeigt:
SEQ ID NO: 1 die Proteinsequenz des AraT-ORF's,
SEQ ID NO: 2 die Sequenz des offenen Leserahmens (ORF) von AraT,
SEQ ID NO: 3 die Sequenz des offenen Leserahmens (ORF) von AraT in einer Codon- optimierten Form, und
SEQ ID NO: 4 die Sequenz des offenen Leserahmens (ORF) von AraT mit 500 Promotor, ORF und 300 Terminator.
Figur 1. Zusammensetzung der Biomasse.
Die am zweithäufigsten vorkommende Hemizellulose ist ein aus Pentosen, Uronsäuren und Hexosen bestehender stark verzweigter Polymer. Die Hemizellulose besteht zu einem großen Anteil aus den Pentosen Xylose und Arabinose.
Figur 2. Schema für die Verwendung von L-Arabinose in rekombinanter S. cerevisiae durch Integration eines bakteriellen L-Arabinose-Stofßvechselweges.
Figur 3. Konstruktion des erfindungsgemäßen Hefestammes MKY06-4P. Ausgangsstamm für die Konstruktion des MKY06-4P war der Hefestamm EBY.VW4000, in dem alle Hexosetransportergene (HXT 's) deletiert wurden. In diesem Stamm wurde die endogene Transaldolase TALl durch den Austausch des nativen Promotors gegen den verkürzten /£\T7-Promotor (HXT7-Prom) überexprimiert. Dies führte zu dem Stamm MKY06. In diesem Stamm wurden die Plasmide p423H7araABsre (araA), p424H7araBre (araB) und p425H7araDre (araD) für den Arabinose-Stoffwechsel hineintransformiert (=MKY06-3P). Zusätzlich wurde noch das Plasmid p426H7-araT (araT), welches den erfindungsgemäßen Arabinose-Transporter aus Pichia stipitis kodiert hineintransformiert und so der Stamm MKY06-4P erhalten. Der Transporter wird exprimiert und funktionell in die Plasmamembran eingebaut (AraT). Figur 4. Ausstrich des MKY06 mit den Plasmiden für den L-Arabinose Stoffwechsel und den gefundenen L-Arabinose-Transportern auf unterschiedlichen Kohlenstoffquellen.
Es handelte sich bei jedem Ausstrich um den MKY06-3P und zusätzlich einem Plasmid aus der Genbank YEpTW. Als Negativkontrolle (-) wurde anstatt eines Plasmids der Genbank das p426HXT7-6HIS und als Positivkontrolle (+) das pHL125re hineintransformiert.
1 : pAraTl , 6: pAraTό, 7: pAraT7, 8: pAraTδ, 11 : pAraTl 1,
-: Negativkontrolle, +: Positivkontrolle.
A: Medium 2% L-Arabinose
B: Medium jeweils 2% D-Galactose, D-Glucose oder D-Mannose
Alle SC-Mediumsplatten wurden bei 30°C inkubiert. Die L-Arabinose-Platte (A) zeigt das
Wachstum nach 9 und alle anderen Platten (B) nach 2 Tagen. Die Kolonien 1 und 7 wuchsen auf L-Arabinose aber nicht auf D-Glucose, D-Mannose und nur schwach auf D-Galactose.
Figur 5. Sequenzierung des Arabinose-Transporters.
Der komplette offene Leserahmen des erfindungsgemäßen Transporters wurde doppelsträngig mit überlappenden Bereichen sequenziert. Der Promotor und Terminator-Bereich wurde ein- zelsträngig sequenziert. Die Pfeile zeigen die Bereiche von einzelnen Sequenzierungen an
Figur 6. Verwendete Vektoren und deren Aufbau.
Ausgangsplasmid für die Herstellung der P. stipitis Genbank war das Plasmid YEp24 (A). Das Plasmid pAraTl (B) als auch das Plasmid pAraT7 basieren somit auf dem YEp24 und unterscheiden sich nur in der Größe des Inserts. Der offene Leserahmen (ORF) des erfϊn- dungsgemäßen Arabinose-Transporters wurde von dem pAraTl amplifiziert und hinter den verkürzten starken HÄT7-Promotor des Plasmids p426HXT7-6HIS (C) kloniert. Hierbei entstand das Plasmid p426H7-AraT (D), welches einen Uracil-Marker besitzt. Ein anderes mögliches Expressionsplasmid ist p426Met25 (E).
Figur 7. Wachstum auf Arabinose unter Verwendung eines spezifischen Arabinose- Transporters.
Wachstum des MKY06-3P, welcher zusätzlich noch das Plasmid pHL125re oder das Plasmid p426H7-AraT (=MKY06-4P) enthält, in SM-Medium mit A) 0,5%, B) 1% und C) 2% L- Arabinose unter aeroben Bedingungen. Die Stämme mit den verschiedenen Plasmiden wurden in SM-Medium mit 1% L-Arabinose herangezogen und mit einer ODöoonm = 0,2 in 30ml SM-Medium mit A) 0,5%, B) 1% und C) 2% L-Arabinose angeimpft. Die Inkubation erfolgte - -
in 300 ml Schüttelkolben unter aeroben Bedingungen bei 300C. Mehrmals am Tag wurden Proben zur Bestimmung der optischen Dichte genommen.
Figur 8. Ethanolbildung unter Verwendung eines spezifischen Arabinose-Transporters. Gezeigt werden die Ergebnisse von HPLC- Analysen des Stammes BWYl mit den Plasmiden p423H7araABsre, p424H7araBre, p425H7araDre und p426H7-AraT in SFM-Medium mit 1,7% L-Arabinose unter semi-anaeroben Bedingungen.
Beispiele Methoden
1. Stämme und Medien - Bakterien
E. coli SURE (Stratagene)
Vollmedium LB 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, pH 7,5 (siehe Maniatis, 1982) Für die Selektion auf eine plasmidkodierte Antibiotikaresistenz wurde dem Medium nach dem Autoklavieren 40 μg/ml Ampicillin zugesetzt. Feste Nährmedien enthielten zusätzlich 1,9% Agar. Die Anzucht erfolgte bei 37°C.
- Hefe
Stamm EBY.VW4000
EBY.VW4000 (Genotyp: MATa Ieu2-3,112 ura3-52 trp 1-289 his3-Al MAL2-8c SUC2 Ahxtl-
17 Agal2 stllA::loxP agtlA::loxP mph2A::loxP mph3A::loxP) (Wieczorke et al, 1999)
Stamm MKY06
MKY06 (Genotyp: MATa Ieu2-3,112 ura3-52 trpl-289 his3-l MAL2-8c SUC2 hxtl-17 gaü stllr.loxP agtl::loxP mph2::loxP mph3::loxP PromTALl::loxP-Prom-vkHXT7, Beschreibung: EBY.VW4000 PromTALl::loxP-Prom-vkHXT7)
Stamm MKY06-3P
MKY06-3P (Genotyp: MATa Ieu2-3,112 ura3-52 trpl-289 his3-l MAL2-8c SUC2 hxtl-17 gal2 stll::loxP agtlr.loxP mph2::loxP mph3::loxP PromTALl::loxP-Prom-vkHXT7, Beschreibung: EBY.VW4000 PromTALl::loxP-Prom-vkHXT7); beinhaltet die Plasmide p423H7araABsre, p424H7araBre und P425H7araDre. Stamm mit der Hinterlegungsnummer DSM 18544
MKY06-4P (Genotyp: MATa Ieu2-3,U2 uraS-52 trpl-289 his3-l MAL2-8c SUC2 hxtl-17 gaü stll::loxP agtl::loxP mph2::loxP mph3::!oxP PromTALl::loxP-Prom-vkHXT7, Beschreibung: EBY.VW4000 PromTALl::loxP-Prom-vkHXT7); beinhaltet die Plasmide p423H7araABsre, p424H7araBre, p425H7araDre und p426H7-AraT.
Stamm BWYl:
BWYl basiert auf dem Stamm JBY25 (Genotyp: MATa Ieu2-3,U2 ura3-52 trpl-289 his3- Δ.lMAL2-8c SUC2 + unbekannte Mutationen für besseres Wachstum auf L-Arabinose) (Becker und Boles, 2003); der Stamm JBY25 wurde weiter selektioniert und besitzt noch weitere Mutationen für verbessertes Wachstum auf L-Arabinose unter Sauerstoff-limitierten Bedingungen (Wiedemann, 2005).
- Vollmedium YEP
1% Hefeextrakt, 2% bakteriologisches Pepton, Kohlenstoffquelle in der jeweils angegebenen Konzentration
- synthetisches Komplettselektivmedium SC
0,67% Yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulphate, 0,5% Ammoniumsulfat, 2OmM Kaliumdihydrogenphosphat, pH 6,3, Aminosäure/Nukleobase- Lösung ohne die für die Auxotrophie-Marker der verwendeten Plasmide entsprechenden Aminosäuren, Kohlenstoffquelle in der jeweils angegeben Konzentration
- synthetisches Minimalselektivmedium SM:
0,67% Yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulphate, 0,5% Ammoniumsulfat, 2OmM Kalium-dihydrogenphosphat, pH 6,3, Kohlenstoffquelle in der jeweils angegeben Konzentration
- synthetisches Fermentationsmedium (Mineralmedium) SFM
(Verduyn et al, 1992), pH5,0
Salze: (NH4^SO4, 5 g/l; KH2PO4, 3 g/l; MgSO4 *7H2O, 0,5g/l - -
Spurenmetalle: EDTA, 15 mg/1; ZnSO4 *7H2O, 4,5 mg/1; MnCl2 *4H2O, 0,1 mg/1;
CoCl2 *6H2O, 0,3 mg/1; CuSO4, 0,192 mg/1; Na2MoO4 *2H2O, 0,4 mg/1; CaCl2
*2H20, 4,5 mg/1; FeSO4*7H2O, 3mg/l; H3BO3, 1 mg/1; KI, 0,lmg/l
Vitamine: Biotin, 0,05 mg/1; p-Aminobenzoesäure, 0,2mg/l; Nicotinsäure, lmg/1; CaI- ciumpantothenat, 1 mg/1; Pyridoxin-HCl, 1 mg/1; Thiamin-HCl, 1 mg/1; minositol, 25 mg/1
Konzentration der Aminosäuren und Nukleobasen im synthetischen Komplettmedium (Zimmermann, 1975): Adenin (0,08 mM), Arginin (0,22 mM), Histidin (0,25 mM), Isoleucin (0,44 mM), Leucin (0,44 mM), Lysin (0,35 mM), Methionin (0,26 mM), Phenylalanin (0,29 mM), Threonin (0,48 mM), Tryptophan (0,19 mM), Tyrosin (0,34 mM), Uracil (0,44 mM) und Va- lin (0,49 mM). Als Kohlenstoffquellen wurden L-Arabinose, D-Glucose, D-Galactose, D- Mannose und Maltose verwendet. Zur Selektion auf Verlust eines Plasmids mit URAS- Selektionsmarkergen wurden synthetische Komplettmediumsplatten verwendet, die neben Uracil 1 mg/ml 5-FOA enthielten, welches nach dem Autoklavieren zugegeben wurde (Boeke et al, 1984).
Feste Voll- und Selektivmedien enthielten zusätzlich 1,9% Agar. Die Anzucht der Hefezellen erfolgte bei 30°C. Das für die Fermentationen eingesetzte synthetische Mineralmedium enthielt Salze, Spurenmetalle und Vitamine in den oben aufgelisteten Konzentrationen und die angegebene Kohlenstoffquelle. Von den Spurenmetallen und den Vitaminen wurde eine Stammlösung angesetzt. Die Spurenmetalllösung wurde autoklaviert (20min, 121 °C) und die Vitaminlösung sterilfiltriert. Beide wurden bei 4°C gelagert. Für die Herstellung der Spurenmetalllösung war der pH- Wert von entscheidender Rolle und verhinderte das Ausfallen einzelner Komponenten. Die verschiedenen Spurenmetalle mussten in der obigen Reihenfolge nacheinander in Wasser vollständig gelöst werden. Nach jeder Zugabe musste der pH- Wert mit KOH auf 6,0 justiert werden bevor das nächste Spurenmetall zugegeben werden konnte. Am Ende wurde der pH Wert mit HCl auf 4,0 justiert. Um Schaumbildung zu vermeiden, wurde dem Medium 50μl/l Antischaum (Antifoam204, Sigma) zugegeben. Bei anaeroben Versuchen wurde dem Medium noch 2,5ml/l einer Tween80-Ergosterol-Lösung nach dem Autoklavieren zugegeben. Diese besteht aus 16,8g TweenδO und 0,4g Ergosterol, welche mit Ethanol auf 50ml aufgefüllt und darin gelöst wurden. Die Lösung wurde sterilfiltriert. Die Salze, die entsprechenden Mengen an Spurenmetalllösung und der Antischaum wurden gemeinsam mit dem kompletten Fermenter autoklaviert. Die Kohlenstoffquelle wurde getrennt - -
vom restlichen Medium autoklaviert. Vor dem Autoklavieren wurde bei allem der pH auf 5,0 eingestellt. Die sterile Vitaminlösung wurde nach dem Abkühlen zum Medium gegeben.
2. Plasmide
Plasmid Quelle/Referenz Beschreibung
p423H7araABsre Becker und Boles, B. subtilis araA in p423HXT7-His,
2003 reisoliert aus JBY25-4M p424H7araBre Becker und Boles, E. coli araB in p423HXT7-His;
2003 reisoliert aus JBY25-4M, Mutation in araB p425H7araDre Becker und Boles, E. coli araD in p425HXT7-His;
2003 reisoliert aus JBY25-4M p426HXT7- Becker und Boles, 2μ Plasmid zur Überexpression von Genen und
6HIS 2003 zur Herstellung von Fusionsproteinen mit 6xHis- Epitop; £/&45-Markergen, verkürzter HXT7- Promotor und CYCl -Terminator pHL125re Guldener et al. , 2μ Plasmid mit dem GAL2-Gen exprimiert hinter 1996 dem ADHl -Promotor, £/&45-Markergen, reisoliert aus JBY25-4M p426H7-araT 2μ Plasmid mit dem Pichia stipitis ARA T exprimiert hinter dem verkürten /ZλT7-Promotor, URA3- Markergen
3. Pichia stipitis Genbank
YEpTW Pichia stipitis: Genbank mit chromosomalen Fragmenten von Pichia stipitis im Übe- rexpressionsplasmid YEp24, WL45-Markergen (Weierstall et α/., 1999)
4. Transformation
- Transformation von S. cerevisiae
Die Transformation von S. cerevisiae wurde mit der Lithium-Acetat Methode (Gietz und Woods, 2002) durchgeführt. Zur Selektion auf eine Geneticin-Resistenz wurden die Zellen nach der Transformation für 4h bei 30°C in Vollmedium inkubiert und im Anschluss auf G418-haltigen Mediumsplatten ausplattiert.
- Transformation von E. coli
Die Transformation der E. coli Zellen erfolgte durch die Elektroporationsmethode (Dower et al, 1988; Wirth, 1993) mittels eines Easyject prima Geräts von EQUIBO.
5. Präparation von DNA - -
- Isolierung von Plasmid-DNA aus S. cerevisiae
Die Zellen einer stationären Hefekultur (5 ml) wurden geerntet, gewaschen und in 100 μl Puffer 1 (entnommen aus dem „Plasmid Mini Kit") resuspendiert. Nach Zugabe von 200 μl Puffer 2 und 2/3 Volumen Glasperlen (0 = 0,45 mm) wurden die Zellen 8 min lang auf einem Vibrax (Janke und Kunkel, Vibrax-VXR) bei 4°C aufgeschlossen. Der Überstand wurde mit 150μl Puffer 3 vermischt und für 10 min auf Eis inkubiert. Nach einer 15-minütigen Zentrifu- gation bei 10000 U/min wurde der Überstand verwendet und die Plasmid-DNA mit 400μl Isopropanol gefällt (-200C, 10min). Die durch Zentrifugation (30min, 13000rpm) pelletierte DNA wurde mit 70%igem kaltem Ethanol gewaschen und in 20μl Wasser aufgenommen. Die DNA wurde anschließend für eine Transformation in E. coli oder eine DNA-Amplifizierung mittels PCR eingesetzt.
- Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli erfolgte mit dem „Plasmid Mini Kit" der Firma Qiagen nach Angaben des Herstellers.
- Bestimmung der DNA-Konzentration
Die DNA-Konzentration wird spektralphotometrisch in einem Wellenlängenbereich von 240- 300 nm gemessen. Liegt die Reinheit der DNA, bestimmt durch den Quotient E260nm/E280nm bei 1,8, so entspricht die Extinktion E260nm = 1,0 einer DNAKonzentrati- on von 50 μg dsDNA/ml (Maniatis, 1982).
6. DNA-Amplifizierung mittels PCR
- Verwendung des Expand™ High Fidelity Systems
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) erfolgte mit dem „Expand™ High Fidelity PCR System" der Firma Roche nach Angaben des Herstellers. Zu der zu amplifizierenden Plasmid- oder Genomischen-DNA wurden 0,2 mM dNTP-Mix, Ix Puffer 2 (enthält 1,5 mM MgC12), 1 U Polymerase und je 100 pmol der entsprechenden Oligonukleotidprimer zusammengegeben. Die PCR-Reaktion wurde in einem Thermocycler (Techne) oder Mastercycler (Eppendorf) durchgefühlt.
Zur Amplifizierung der DNA wurden folgende Temperaturzyklus gewählt.
1. Ix 950C, 4min Denaturierung der DNA
2. 18-35x 95°C, 45-60sec Denaturierung der DNA 55-60°C, 45-60sec Bindung der Primer an die DNA (Annealing) 72°C, 1 -3min DNA Synthese (Elongation) 3. Ix 72°C, 4min DNA Synthese (Elongation)
Nach dem ersten Schritt wurde die Polymerase zugegeben („hot Start PCR"). Die Anzahl der Syntheseschritte, die Annealingtemperatur und die Elongationszeit wurden an die spezifischen Schmelztemperaturen der verwendeten Oligonukleotide bzw. an die Größe des zu erwarteten Produkts angepasst. Die PCR-Produkte wurden durch eine anschließende Agarose- gelelektrophorese überprüft und anschließend aufgereinigt.
- DNA-Aufreinigung von PCR-Produkten
Die Aufreinigung der PCR-Produkte erfolgte mit dem „QIAquick PCR Purification Kit" der Firma Qiagen nach Herstellerangaben.
- Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten
Die Auftrennung von DNA-Fragmenten mit einer Größe von 0,15-20 kb erfolgte in l-4%igen Agarosegelen. Als Gel- und Laufpuffer wurde lxTAE-Puffer (40 mM Tris, 40 mM Essigsäure, 2 mM EDTA) verwendet (Maniatis, 1982). Als Größenstandard diente entweder eine mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und Hinάlll geschnittene Lambda-Phagen-DNA oder der 2-Log DNA Ladder (NΕB). Die DNA-Proben wurden vor dem Auftragen mit 1/10 Volumen Blaumarker (lxTAΕ-Puffer, 10% Glycerin, 0,004% Bromphenolblau) versetzt. Nach der Auftrennung wurden die Gele in einem Εthidiumbromidbad inkubiert und die DNA- Fragmente durch Bestrahlung mit UV-Licht (254 nm) sichtbar gemacht.
- Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Das gewünschte DNA-Fragment wurde aus dem TAΕ-Agarosegel unter langwelligem UV- Licht (366nm) ausgeschnitten und mit dem „QIAex II Gel Εxtraction Kit" oder dem „QIAquick Gel Εxtraction Kit" der Firma Qiagen nach Angaben des Herstellers isoliert.
7. Εnzymatische Modifikation von DNA
- DNA-Restriktion
Sequenzspezifische Spaltungen der DNA mit Restriktionsendonukleasen wurden unter den vom Hersteller empfohlenen Inkubationsbedingungen für 2-3 Stunden mit 2-5U Enzym pro μg DNA durchgeführt. 8. HPLC-Analysen
Die bei den Versuchen entnommenen Proben wurden für 10min bei 3000 U/min zentrifugiert, um die Hefezellen zu pellettieren. Der Überstand wurde abgenommen und sofort bei -20°C eingefroren. Für die Proteinfällung wurde später 50%ige Sulfosalizylsäure zugegeben, gemischt und für 30min bei 13000 U/min und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, daraus eine 1/10 Verdünnung mit Wasser hergestellt und für die HPLC-Analysen eingesetzt. Als Standards für die Messungen dienten Proben mit D-Glucose, L-Arabinose und Ethanol, welche in Konzentrationen von 0,l%w/w, 0,5%w/w und 1,0% w/w eingesetzt wurden. Die Zucker- und die Ethanolkonzentration wurden mittels BioLC (Dionex) gemessen. Es wurde der Autosampier „AS50", der Säulenofen „TCC-100", die Gradienten-Pumpe „GS50" (alle Dionex) und der RI -Detektor „RI-101" (Shodex) bei der Messung verwendet. Als Säule wurde die VA 300/7.7 Nucleogel Sugar 810H (Macherey-Nagel) mit 20%iger Schwefelsäure als Laufmittel (0,6ml/min) benutzt. Zur Auswertung der Analysendaten wurde das Programm Chromeleon™ (Version 6.50, Dionex) verwendet.
Beispiel 1: Aufbau eines Testsystems zur Untersuchung von L-Arabinose-
Transportern
A) Konstruktion des MKY06
In dem Hefestamm EBY.VW4000 wurden alle Gene der Hexosetransporter-Familie und zusätzlich drei Gene der Maltosetransporter-Familie deletiert. Dieser Stamm wuchs auf Maltose-Medium unverändert, konnte jedoch nicht mehr auf Glucose, Fructose und Mannose und nur sehr schwach auf Galactose wachsen (Wieczorke et al, 1999). Da alle Hexosetransporter deletiert sind, ist davon auszugehen, dass der Stamm auch keine L-Arabinose mehr aufnehmen kann und sich somit zu L-Arabinose-Transportuntersuchungen eignet.
In voraus gegangenen Versuchen (siehe Becker und Boles, 2003) hatte sich gezeigt, dass zusätzlich zu einem funktionellen L-Arabinose-Stoffwechselweg auch eine erhöhte Aktivität der Transaldolase für die Verwertung von L-Arabinose nötig war. Aus diesem Grund wurde durch Austausch des endogenen Promotors von TALl im EBY.VW4000 gegen den verkürzten HAT7-Promotor TALl überexprimiert. Dieser Stamm wurde MKY06 genannt und ist dazu vorgesehen, mit den Plasmiden für den L-Arabinose-Stoffwechsel und einem Transporter, welcher L-Arabinose transportieren kann, auf dieser Kohlenstoffquelle zu wachsen. - -
B) Einführung des L-Arabinose-Stoffwechselwegs
Der Stamm MKY06 wurde mit den Plasmiden p423H7araABsre, p424H7araBre und p425H7araDre transformiert (=MKY06-3P), damit er die Fähigkeit der L-Arabinose- Verwertung erhielt. Die Transformation mit den drei Plasmiden erfolgte gleichzeitig. Die Transformanten wurden auf SC-Medium mit 2% Maltose ausplattiert. In einer weiteren Transformation wurden als Positivkontrolle noch der als L-Arabinose bekannte Transporter Gal2 und als Negativkontrolle das Leerplasmid p426HXT7-6HIS hinein transformiert und erneut auf Maltose-haltigen Mediumsplatten ausplattiert. Die Positivkontrolle, die einen L- Arabinose-Transporter und die drei Plasmide für die L-Arabinose-Verwertung enthält und die Transaldolase überexprimiert, sollte auf L-Arabinose wachsen können. Die Negativkontrolle sollte aufgrund des fehlenden Transporters kein Wachstum zeigen. Dies wurde untersucht.
C) Überprüfung des Testsystems
Um das konstruierte Testsystem weiter verwenden zu können, mussten zuerst die Positiv- und Negativkontrolle auf ihr Wachstum hin untersucht werden. Mehrere Kolonien von den auf den SC-Platten mit 2% Maltose erhaltenen Transformanten wurden mit einer sterilen Impföse abgenommen und auf SC-Platten mit 2% L-Arabinose ausgestrichen und bei 30°C für zehn Tage inkubiert. Die Positivkontrolle zeigte nach dieser Zeit ein deutliches Wachstum und die Negativkontrolle wie erwartet kein Wachstum.
Das Wachstumsverhalten wurde ebenfalls in Flüssigmedium mit 2% Maltose oder 2% L- Arabinose untersucht. Hierzu wurden Vorkulturen mit den entsprechenden Kohlenstoffquellen (Maltose oder L-Arabinose) unter aeroben Bedingungen bei 30°C angezogen. Nach Erreichen der späten exponentiellen Phase wurden diese Vorkulturen verwendet, um 30ml des gleichen Mediums mit einer Anfangs-OD6oonm =0,2 anzuimpfen. Da die Negativkontrolle nicht auf L-Arabinose- haltigen Mediumplatten wuchs, wurde von der Vorkultur mit 2% Maltose ausgehend 30ml SC-Medium mit 2% L-Arabinose angeimpft. Das Wachstumsverhalten wurde über mehrere Tage durch Messung der optischen Dichte bei 600nm verfolgt. In Maltose- Medium zeigte die Positiv- und die Negativkontrolle wie erwartet identisches Wachstum mit einer Wachstumsrate von 0,197h"1. In L-Arabinose- Wachstum zeigte sich genau wie schon bei den Versuchen mit den L-Arabinose-Mediumsplatten nur bei der Positivkontrolle Wachstum (μ = 0,01h"1), welche gegenüber der Negativkontrolle noch den Transporter Gal2 besaß. Das geringe Wachstum zu Beginn bei der Negativkontrolle kann dadurch erklärt werden, dass die Zellen vor dem Umimpfen von Maltose auf L-Arabinose-haltigem Medium nicht gewa- schen wurden. Außerdem ermöglichen die Glykogen- Vorräte der Hefe noch ein geringfügiges Wachstum.
Somit war dieses Testsystem funktionell und konnte für die Untersuchung von L-Arabinose- Transportern eingesetzt werden. Als Vergleich diente hierbei immer die hier genannte Positiv- und Negativkontrolle.
Beispiel 2 Screen mit einer Pichia stipitis Genbank
Das Testsystem wurde nun verwendet, um in einer Genbank von Pichia stipitis, eine der Hefen die L-Arabinose verwerten können, nach möglichen L-Arabinose-Transportergenen zu suchen.
A) Durchführung des Screens
Die hier verwendete Genbank YEpTW wurde aus dem Pichia stipitis Stamm CBS5774 hergestellt. Chromosomale DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease Sau3A partiell verdaut und in den mit BamHl linearisierten Vektor YEp24 ligiert (Weierstall et al, 1999).
Die Genbank besaß genau wie das Plasmid pHL125re einen Uracil-Auxotrophie-Marker. Die Genbank YEpTW wurde in den Stamm MKY06-3P hinein transformiert und auf SC-Medium mit 2% Maltose ausgestrichen. Die nach drei Tagen bei 30°C erhaltenen Kolonien wurden auf SC-Mediumsplatten mit 2% L-Arabinose replikaplattiert. Nach 10 Tagen wurde nach Kolonien gesucht, die auf L-Arabinose Wachstum zeigten. Wachstum war nur möglich, wenn das Plasmid der Genbank einen Transporter kodierte, der L-Arabinose transportieren konnte.
Um genomische Mutationen, welche für das Wachstum verantwortlich sein könnten, ausschließen zu können, wurden die gefundenen Kolonien auf Komplettmedium mit 5 -FOA ausgestrichen. Dadurch wurde auf einen Verlust des Plasmids der Genbank selektioniert. Diese Kolonien der 5-FOA Platte konnten bei erneutem Ausstreichen auf L-Arabinose-Medium hierauf nicht mehr wachsen. Somit konnte eine genomische Mutation als Ursache für das Wachstum ausgeschlossen werden. Die gefundenen Kolonien wurden auch noch auf anderen Kohlenstoffquellen ausgestrichen, um das Substratspektrum auszutesten.
B) Wachstumsverhalten Von den über 30000 replikaplattierten Kolonien wurden die elf hierbei gefundenen Kolonien, welche geringfügiges Wachstum zeigten, nochmals auf L-Arabinose-Platten ausgestrichen. Hierbei zeigten aber nur fünf Kolonien erneut Wachstum auf L-Arabinose. Es handelte sich hierbei um den Stamm MKY06-3P, welcher zusätzlich noch das Plasmid pAral, pAraTό, pAraT7, pAraT8 oder pAraTl 1 aus der Genbank YEpTW (siehe Figur 4) enthielt. Das stärkste Wachstum zeigte der MKY06-3P mit dem pAraTl 1. Die restlichen wuchsen im Vergleich mit der Positivkontrolle schwächer. Beachten muss man hierbei aber, dass das GAL2 in der Positivkontrolle durch einen starken Promotor überexprimiert wurde und die Gene auf den Plasmiden der Genbank ihren nativen Promotor besaßen. Von besonderem Interesse sind die Plasmide pAraTl und pAraT7, da diese nur auf L-Arabinose-Medium Wachstum vermittelten. Diese zeigten auf D-Glucose und auf D-Mannose kein Wachstum. Auf D-Galactose bewirkte lediglich das pAraTl geringfügiges Wachstum. Das Wachstum des pAraT7 auf D- Galactose entsprach dem schwachen Wachstum der Negativkontrolle (vgl. Figur 4). Dieses wurde schon früher für den Ausgangsstamm des MKY06, den EBY.VW4000, berichtet (Wieczorke et α/., 1999).
Die Kolonien mit dem pAraTö, pAraT7 und pAraTl l wurden in flüssigem SC-Medium mit 2% L-Arabinose herangezogen und hiervon Glycerinkulturen angefertigt, welche für spätere Untersuchungen bei -70°C gelagert werden. Mit den Plasmiden pAraTl und pAraT7 wurde weiter gearbeitet und das Wachstumsverhalten der Stämme in Flüssigmedium untersucht. In SC-Medium mit 2% Maltose verhielt sich der MKY06-3P, welcher zusätzlich das pAraTl oder pAraT7 enthielt, identisch zu der Positiv- (zusätzlich noch pHL125re) und der Negativkontrolle (zusätzlich noch p426HXT7-6HIS). Die Wachstumsraten betrugen 0,197h"1.
Auf SC-Medium mit 2% L-Arabinose zeigten sich Unterschiede. Die Negativkontrolle (p426HXT7-6HIS) zeigte kein Wachstum auf diesem Medium. Das geringe Wachstum zu Beginn resultierte von dem fehlenden Waschschritt bei der Umimpfung von der Vorkultur auf Maltose-Medium zu der Hauptkultur in L-Arabinose-Medium. Beide gefundenen L- Arabinose-Transporter verhielten sich ähnlich. In der Wachstumsrate (μ = 0,087h"1) als auch in der maximalen OD60onm gab es keine Unterschiede zwischen dem MKY06-3P mit dem Plasmid pAraTl oder dem pAraT7. Vergleicht man das Wachstumsverhalten der zwei neuen Transporter mit der Positivkontrolle (pHL125re, μ = 0,1h"1) so zeigte sich eine etwas niedrigere Wachstumsrate und eine niedrigere Maximale OD60onm- - -
C) Isolierung der gefundenen L-Arabinose Transporter
Um die gefundenen Transporter auf genomischer Ebene analysieren zu können, mussten zuerst die Genbank-Plasmide wieder aus der Hefe isoliert werden. Hierbei war zu beachten, dass der Stamm MKY06 nicht nur das Plasmid aus der Genbank YEpTW enthält, welches den gesuchten Transporter kodiert, sondern gleichzeitig auch noch die drei Plasmide für den L- Arabinose-Stoffwechsel (p423H7araABsre, p424H7araBre, p425H7araDre) und dass das Plasmid p423H7araABsre in einer viel höheren Anzahl in den Zellen vorkommt, als die restlichen drei Plasmide. Da die Plasmide der Genbank YEpTW einen Uracil-Auxotrophie-Marker besaßen, wurden die Zellen von den L-Arabinose-Platten ausgehend in Maltose-Flüssigmedium ohne Uracil (ura-) angeimpft. Nach Erreichen der stationären Phase wurden diese in frisches Maltose-ura-Medium umgeimpft und wieder herangezogen. Dabei wurden die Zellen mit den vier Plasmiden fünfmal in Maltose-ura- Flüssigmedium bis zur stationären Phase herangezogen. Ziel hiervon war eine Anreicherung des Plasmids pAraTl beziehungsweise pAraT7. Von diesen beiden Kulturen wurden Vereinzelungsausstriche auf Maltose-ura- Mediumsplatten angefertigt. Die entstandenen Kolonien wurden auf weitere Maltose Platten replikaplattiert und für zwei Tage bei 30°C inkubiert. Diese Platten enthielten die entsprechende Aminosäure für den Auxotrophie-Marker eines der anderen drei Plasmide (Histidin für p423H7araABsre, Tryptophan für p424H7araBre oder Leucin für p425H7araDre) nicht. Diese Replikaplatten wurden mit den Maltose-ura- Platten verglichen. Kolonien, die nur auf der Maltose-ura- Platte wuchsen, wurden ausgewählt. Diese besaßen nur noch das Plasmid pAraTl beziehungsweise pAraT7. Die Plasmide wurden aus Hefe isoliert. Danach wurden die Plasmide in E. coli am- plifiziert, und nach der Isolierung aus E. coli mit Hilfe einer Restriktionsanalyse charakterisiert. Als Restriktionsenzyme wurden Ncol und Nhel verwendet. Ncol schneidet nur im URA3 -Markergen. Wenn es sich um das gesuchte Plasmid aus der Genbank handelt, dann entsteht ein 934bp großes Fragment.
Beispiel 3 Charakterisierung des neuen Arabinose-Transporters (araT) A) Sequenzierung
Die auf den in Beispiel 2 gefundenen Plasmiden pAraTl und pAraT7 lokalisierten chromosomalen Fragmente aus P. stipitis wurden sequenziert.
Der komplette ORF des gefundenen Transporters wurde doppelsträngig mit überlappenden Bereichen sequenziert. Der Promotor und Terminator-Bereich wurde einzelsträngig sequenziert (vgl. Figur 5). Die Pfeile zeigen die Bereiche von einzelnen Sequenzierungen an. - 5 -
Bei der Sequenzierung zeigte sich, daß die zwei Plasmide pAraTl und pAraT7 überlappende Fragmente des gleichen Gens beinhalten. Es handelt sich um ein und denselben Transporter und nicht um zwei verschiedene Transportergene. Das Plasmid pAraTl besitzt ein Insert mit etwa 5kb; es beinhaltet den kompletten offenen Leserahmen (ORF) des AraT, welcher aus 1629 Basen und folglich 542 Aminosäuren (plus das STOP-Codon) besteht. Zusätzlich noch Promotor und Terminator-Sequenzen. Das Plasmid pAraT7 besitzt ein Insert, welches etwa 3kb groß ist; es beinhaltet nicht den kompletten ORF des AraT, sondern nur die ersten 1507 Basen. Dieses Fragment war aber trotzdem funktionell.
Bei einer BLAST-Recherche mit dem kürzlich veröffentlichten Genom von Pichia stipitis (siehe http://genome.jgi-psf.org/euk_home.html) zeigte sich eine Übereinstimmung von 100 % mit HGT2. HGT2 wurde aufgrund seiner hohen Homologie zum hochaffinen Glucose- Transporter HGTl von Candida albicans als putativer hochaffiner Glucose-Transporter annotiert. Wenn man die Sequenz hinsichtlich der möglichen Transmembran-Domänen untersucht, erhält man 12 Transmembran-Domänen, was für Transporter typisch ist.
B) Beispiele für Vektoren für der AraT
Ausgangsplasmid für die Herstellung der Genbank war das Plasmid YEp24. Das Plasmid pA- raTl als auch das Plasmid pAraT7 basieren somit auf dem YEp24 und unterscheiden sich nur in der Größe des Inserts. Bei dem Vektor YEp24 handelt es sich um ein episomales Plasmid.
Der offene Leserahmen (ORF) des gefundenen Arabinose-Transporters wurde von dem pA- raTl amplifiziert und hinter den verkürzten starken /£YT7-Promotor des Plasmids p426HXT7-6HIS kloniert. Hierbei entstand das Plasmid p426H7-AraT, welches einen Uracil- Marker besitzt.
Ein anderes mögliches Expressionsplasmid ist p426Met25. Für Vektorkarten, siehe Figuren 6A bis 6E.
Weitere mögliche Expressionsvektoren sind pYES260, pYES263, pVTU260, pVTU263, pVTL260 und pVTL263. Nähere Angaben zu diesen Vektoren finden sich unter http://web.uni-frankfurt.de/fbl 5/mikro/euroscarf/data/km_expr.html. C) Wachstum in Abhängigkeit von der L-Arabinose-Konzentration im Medium
Das Wachstum des Stammes MKY06-4P wurde unter aeroben Bedingungen in Abhängigkeit von der L-Arabinose-Konzentration im Medium untersucht. Als Vergleich wurde der Stamm MKY06-3P verwendet, der zusätzlich noch das Plasmid pHL125re oder p426HXT7-6HIS enthielt.
Die Stämme mit den verschiedenen Plasmiden wurden in SM-Medium mit 1% L-Arabinose herangezogen und mit einer OD60onm = 0,2 in 30ml SM-Medium mit 0,5%, 1% bzw. 2% L- Arabinose angeimpft. Die Inkubation erfolgte in 300ml Schüttelkolben unter aeroben Bedingungen bei 30°C. Mehrmals am Tag wurden Proben zur Bestimmung der optischen Dichte genommen.
Die Ergebnisse sind in den Figuren 7A bis 7C gezeigt. Der Stamm MKY06-4P wächst unter allen 3 Bedingungen schneller als der Vergleichsstamm MKY06-3P, welcher noch das Plasmid pHL125re enthält. Es zeigt sich bei 0,5% L-Arabinose (Figur 7A) ein deutlicher Vorteil des p426H7-AraT gegenüber des pHL125re. Der Stamm wächst deutlich schneller und auch zu einer höheren optischen Dichte heran. Auch bei 1% L-Arabinose (Figur 7B) wächst der Stamm mit dem p426H7-AraT schneller als der Vergleichsstamm. In der am Ende des Wachstums erreichten optischen Dichte zeigt sich jedoch kein Unterschied. Auch bei einer L- Arabinose Konzentration von 2% (Figur 7C) wächst der Stamm mit dem p426H7-AraT schneller als der Vergleichsstamm mit dem pHL125re, welcher aber bei dieser Konzentration eine höhere optische Dichte am Ende des Wachstums erreicht.
Damit wird gezeigt, daß das erfindungsgemäße L-Arabinose-Aufhahmesystem es den rekom- binanten S. cerevisiae Zellen ermöglicht, L-Arabinose wesentlich effizienter zu verwerten.
Beispiel 4 Verwendung des neuen Arabinose-Transporters (araT) zur Bildung von Ethanol
In Figur 8 werden die Ergebnisse von FIPLC- Analysen des Stammes BWYl mit den Plasmiden p423H7araABsre, p424H7araBre, p425H7araDre und zusätzlich dem p426H7-AraT oder als Vergleich dem pHL125re in SFM-Medium mit 1,7% L-Arabinose unter semi-anaeroben Bedingungen gezeigt.
Die Stämme wurden aerob im gleichen Medium zu einer hohen optischen Dichte herangezogen. Die Zellen wurden abzentrifugiert und zum Animpfen der semi-anaeroben Fermentations - -
Versuche verwendet. Bereits nach etwa 25 Stunden setzt bei beiden Stämmen die Ethanol Produktion ein. In dem Stamm, der das Plasmid p426H7-AraT beinhaltet ist eine höhere Ethanol Produktion zu Beginn festzustellen. Andererseits nimmt die Arabinose Konzentration am Ende des Versuches bei Zellen mit dem p426H7-AraT stärker ab als bei dem pHL125re, was darauf hindeutet, dass hier eine höhere Affinität des AraT zu einer verbesserten Fermentation von niedrigen Arabinose-Konzentrationen führt.
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Claims

Patentansprtiche
1. Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe von a. einem Polypeptid, das zu mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80% identisch zu der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 1 ist und eine in vitro und/oder in vivo Pentose- Transportfunktion aufweist, b. einer natürlich auftretenden Variante eines Polypeptids umfassend die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 1, die eine in vitro und/oder in vivo Pentose-Transportfunktion aufweist, c. einem Polypeptid, das identisch zu der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 1 ist und eine in vitro und/oder in vivo Pentose-Transportfunktion aufweist, und d. einem Fragment des Polypeptids aus a., b. oder c, umfassend ein Fragment von mindestens 100 kontinuierlichen Aminosäuren nach SEQ ID NO: 1.
2. Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend ein Fragment von mindestens 200 oder 300 kontinuierlichen Aminosäuren nach SEQ ID NO: 1.
3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, umfassend ein Fragment von 502 Aminosäuren, das den ersten 502 Aminosäuren nach SEQ ID NO: 1 entspricht.
4. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend ein Polypeptid das zu mindestens 90%, bevorzugt 95% identisch zu der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO :1 ist und eine in vitro und/oder in vivo Pentose-Transportfunktion aufweist.
5. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiter umfassend heterologe Aminosäuresequenzen.
6. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Pentose Arabinose, insbesondere L-Arabinose ist.
7. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid aus einer Hefe, bevorzugt aus Pichia, insbesondere Pichia stipitis, abstammt.
8. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
9. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8, wobei die Nukleinsäure zu mindestens 90%, bevorzugt 95% und weiter bevorzugt 99% identisch zu der Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO:2 oder 3 ist.
10. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8 oder 9, weiter umfassend Vektor- Nukleinsäuresequenzen, bevorzugt Expressionsvektor-Sequenzen.
11. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 8 bis 10, weiter umfassend Nukleinsäu- resequenzen, die für weitere heterologe Polypeptide kodieren.
12. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das Nukleinsäuremolekül dsDNA, ssDNA, PNA, CNA, RNA oder mRNA oder Kombinationen davon umfaßt.
13. Wirtszelle, die ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 8 bis 12 enthält und bevorzugt dieses exprimiert.
14. Wirtszelle nach Anspruch 13, die eine Pilzzelle und bevorzugt eine Hefezelle, wie Sac- charomyces species, Kluyveromyces sp., Hansenula sp., Pichia sp. oder Yarrowia sp., ist.
15. Wirtszelle nach Anspruch 13 oder 14, weiterhin enthaltend Nukleinsäuremoleküle, die für Proteine des Arabinose-Stoffwechselweges kodieren.
16. Wirtszelle nach Anspruch 15, wobei die Nukleinsäuremoleküle für Proteine des bakteriellen Arabinose-Stoffwechselweges kodieren.
17. Wirtszelle des Stammes MKY06-4P, der am 23. August 2006 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen unter der Hinterlegungsnummer DSM 18544 hinterlegt wurde.
18. Antikörper oder Antikörper-Fragment, umfassend einen immunologisch aktiven Teil, der selektiv an ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bindet. - -
19. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend Kultivieren der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 17 unter Bedingungen, unter denen das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 8 bis 12 exprimiert wird.
20. Kit, umfassend eine Verbindung, die selektiv an ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bindet, gegebenenfalls mit weiteren Hilfsstoffen und Gebrauchsanweisungen.
21. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die an ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bindet und/oder seine Aktivität moduliert, umfassend die Schritte von:
In Kontakt bringen eines Polypeptids oder einer Zelle, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 exprimiert, mit einer Testverbindung, und
Bestimmen, ob das Polypeptid an die Testverbindung bindet und, gegebenenfalls, Bestimmen, ob die Testverbindung die Aktivität des Polypeptids moduliert.
22. Verfahren zur Modulierung der Aktivität eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend in Kontakt bringen eines Polypeptids oder einer Zelle, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 exprimiert, mit einer Verbindung, die an das Polypeptid bindet in einer ausreichenden Konzentration, um die Aktivität des Polypeptids zu modulieren.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Verbindung eine Pentose, wie zum Beispiel Arabinose, und insbesondere L-Arabinose, oder ein Derivat einer solchen Pentose ist.
24. Verfahren zur Produktion von Bioethanol, umfassend die Expression eines Nukleinsäure- moleküls nach einem der Ansprüche 8 bis 12 in einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 17.
25. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7, eines Nukleinsäuremo- leküls nach einem der Ansprüche 8 bis 12 oder einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 17 zur Produktion von Bioethanol.
26. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7, eines Nukleinsäuremo- leküls nach einem der Ansprüche 8 bis 12 oder einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 17 zur rekombinanten Fermentation von Pentose-haltigem Biomaterial.
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