WO2008022789A2 - Programmierbare oligonukleotidsynthese - Google Patents

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WO2008022789A2
WO2008022789A2 PCT/EP2007/007417 EP2007007417W WO2008022789A2 WO 2008022789 A2 WO2008022789 A2 WO 2008022789A2 EP 2007007417 W EP2007007417 W EP 2007007417W WO 2008022789 A2 WO2008022789 A2 WO 2008022789A2
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gene
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the invention relates to methods and apparatus for the production of synthetic nucleic acids.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Synthetic DNA also plays a role in the production of synthetic genes.
  • Methods of gene synthesis are described as an example in US Pat. No. 6,586,211 B1, in PCT / EP2004 / 013131, in WO 00/13017 A2, in S. Rayner et al., PCR Methods and Applications 8 (7), 741-747, 1998 in WO 90/00626 A1, in EP 385 410 A2, in WO 94/12632 A1, in WO 95/17413 A1, in EP 316 018 A2, in EP 022 242 A2, in LE Sindelar and JM Jaklevic, Nucl. Acids Res. 23 (6), 982-987, 1995, in D.A. Lashkari, Proc. Nat. Acad. Be. USA 92 (17), 7912-7915, 1995, and in WO 99/14318 A1, which are incorporated by reference.
  • the most widely used method for the production of synthetic nucleic acids is based on basic work by Caruthers and is described as a phosphitamide method (M.H. Caruthers, Methods in Enzymology 154, 287-313, 1987).
  • the sequence of the resulting molecules can be controlled by the synthesis sequence.
  • Other methods such as e.g. The H-phosphonate method serves the same purpose of successively building up a polymer from its subunits, but has not been able to assert itself as widely as the Caruthers method.
  • solid phases In order to automate the chemical process of polymer synthesis from subunits, solid phases are usually used which anchors the growing molecular chain. It is cleaved only after completion of the synthesis, including a suitable linker between the actual polymer and the solid phase is required.
  • the method typically employs solid phases for automation in the form of activated particles that are filled into a column, eg, controlled pore glass (CPG). Such solid phases usually carry only one definable removable species of oligo with a programmed sequence.
  • CPG controlled pore glass
  • Such solid phases usually carry only one definable removable species of oligo with a programmed sequence.
  • the addition of the individual synthesis reagents is now carried out in a controllable manner in an automatic machine which, above all, ensures the automated addition of the individual reagents to the solid phase.
  • the amount of molecules synthesized is controllable by the amount of support material and the size of the reaction mixtures. These amounts are either sufficient or even too high for the abovementioned molecular-biological methods (eg in the case of PCR primers).
  • a certain degree of parallelization for generating a multiplicity of different sequences is achieved by arranging several columns in an apparatus design. Thus, those skilled in the art devices with 96 parallel columns are known.
  • a variant and further development for the production of synthetic nucleic acids is the in situ synthesis of microarrays (array arrangement of the nucleic acids in a matrix). This is performed on a substrate that is loaded by the synthesis with a variety of different sequences.
  • the major advantage of in situ synthesis methods for microarrays is the provision of a variety of oligomers of different and defined sequence at addressable locations on a common carrier. The synthesis relies on a manageable set of starting materials (in DNA microarrays usually the 4 bases A, G, T and C) and builds on these arbitrary sequences of nucleic acid polymers.
  • the delimitation of the individual molecular species can take place, on the one hand, through separate fluidic compartments during the addition of the synthesis starting materials, as for example in the so-called in situ - A -
  • An alternative method is the spatially-resolved activation of synthetic sites, which is possible by selective exposure, by selective or spatially resolved generation of activating reagents (deprotection reagents), or by the selective addition of activating reagents (deprotection reagents).
  • the indirect projector-based light-controlled synthesis by means of light-activated photoacids and suitable reaction chambers or physically separated reaction spaces in a reaction support
  • the electronically induced synthesis by means of spatially resolved deprotection on individual electrodes on the support using an induced by the electrodes formation of protons (known, inter alia, by the products from Combimatrix) and the fluidic synthesis by means of spatially resolved deposition of the activated synthesis monomers (known from A. Blanchard, in Genetic
  • An improved process for the production of synthetic nucleic acids of random sequence, in particular nucleic acid double strands, by production of suitable solid-phase-supported synthetic libraries, also referred to as libraries, is to be provided.
  • an improved method is to be provided for producing synthetic nucleic acids of random sequence, especially nucleic acid double strands, by preparing suitable solid phase based synthetic libraries and then assembling at least two nucleic acid fragments from the library by binding or covalently linking these two nucleic acid fragments to each other, the preparation of the Library includes a control of the proportions of the components of the library to each other.
  • the assembly of the nucleic acid fragments is preferably carried out by a specific hybridization reaction between overlapping regions of mutually complementary sections of the nucleic acid fragments, wherein longer synthetic double-stranded nucleic acids are obtained.
  • the individual sequence segments used to build up longer nucleic acids preferably have a length of 20-100 or 20-300 nucleotide building blocks, preferably 25-50 or 25-100 nucleotide building blocks, for example about 30 nucleotide building blocks.
  • the sequence sections are preferably selected such that they at least partially overlap with a sequence section of the complementary strand of the complementary nucleic acid to be synthesized, so that the nucleic acid strand to be synthesized passes through Hybridization of individual sequence sections can be established.
  • sequence segments are preferably selected such that the sequence segments on both columns of the nucleic acid to be synthesized completely overlap, and therefore only the covalent linkage of the phosphorodiester backbone is necessary to produce a complete double strand.
  • the length of the complementary regions or overlaps between individual fragments is, for example, 10-50 or 10-100 nucleotide building blocks, preferably 12-25 or 20-80 nucleotide building blocks, more preferably about 15-20 nucleotide building blocks, and most preferably about 15 or about 20 nucleotide building blocks.
  • the binding constant is in comparison lower to GC-richer sequences.
  • hybridization between these fragments may be relatively ineffective for thermodynamic reasons. This can exert an influence on the assembly of 2 or more fragments.
  • One possible sequence-dependent consequence is a reduction in the yield of nucleic acid double strands with the correct target sequence.
  • thermodynamic parameters are modulated together in a reaction to bind at least 2 nucleic acid fragments. Modulation of the thermodynamic parameters is understood in particular to mean that the binding of the two nucleic acid fragments to one another, which is subject to the law of mass action, is improved. It is particularly preferred that the modulation of the the ⁇ nodynamischen parameter in the reaction is the control of the proportions of individual nucleic acid fragments, in particular by using higher amounts of nucleic acid fragments having a high proportion of AT.
  • nucleic acid fragments When at least some nucleic acid fragments are used to modulate their thermodynamic parameters in the reaction of at least 2 nucleic acid fragments in an amount increased over other fragments, this can be accomplished, for example, by exposing at least some nucleic acid fragments having a high AT content to one another other quantities increased amount can be used.
  • the amount of the population of the corresponding nucleic acid fragments may be preferably ⁇ 10%, more preferably ⁇ 50% or more, e.g. be increased by a factor of 100 or 1000 more compared to other nucleic acid fragments without high AT content.
  • the AT component Apart from the AT component, there are other parameters that have an influence on the yield of target sequences. This includes the different synthesis efficiency of the individual fragments or oligonucleotides during the extension in the synthesis process. It is known to the person skilled in the art, for example, that the building block G in the case of phosphoramidite processes couples with lower yield to the polymer strand to be extended than the other nucleotide building blocks. In addition, empirically visible, but not in any case already predictable, dependencies of the synthesis efficiency on the entire sequence of the polymer strand are known to the person skilled in the art. This includes, for example, the synthesis of several G building blocks in succession.
  • differences in the availability or kinetics of individual fragments for the assembly of two or more fragments to a target sequence can also be influenced by control or control and regulation of the proportions.
  • the deviation can be calculated and well-known or only known from empirical evidence and observed in experiments.
  • the method according to the invention can be optimized, for example, iteratively while measuring the result, that is, for example, the yield of target sequence.
  • One embodiment of the invention is the use of a programmable memory device to control, based on known laws for new fragment sequences and target sequences, the predicted optimal composition of the proportions. This can be done in the implementation by means of a computer or similar control techniques.
  • influencing variables and adjusting parameters can be recorded in a database, which in one embodiment is contained in a programmable logic device and is used directly or indirectly in the control of the synthesis.
  • reaction products of a library synthesis are characterized by a large variety of sequences that can be freely programmed during the synthesis process.
  • a numerical example illustrates the diversity of such a library.
  • a microarray of the Geniom® ® system wherein the nucleic acid molecule populations are synthesized on individual synthesis locations in a special microfluidic carrier may, for example, status 2006 synthesize up to 60,000 Arbitrary oligonucleotides having a sequence of up to 60 nucleotides.
  • the devices synthesize the nucleic acids in a spatially resolved manner using a projector-based method (see eg WO 00/13018 or WO 00/13017).
  • the purpose of the improved method is to provide nucleic acids with high and rationally programmable diversity of the sequences and controllable proportions of the individual sequence representatives or Fragments (library components) for subsequent procedures in a next step.
  • nucleic acid fragments as primers for primer extension methods, strand displacment amplification, polymerase chain reaction, site directed mutagenesis or rolling circle amplification, production of synthetic genes, gene fragments, gene clusters, gene ferries, gene vectors, chromosomes, Genomes, optimized genomes, minimal gene clusters, minimal genomes, fully synthetic genomes or mixtures with targeted or randomized variants of synthetic genes, gene fragments, gene clusters, gene ferries, gene vectors, chromosomes, genomes, optimize genomes, minimal gene Clusters, minimal genomes, fully synthetic genomes,
  • RNAi or antisense methods Gene expression modulation by means of RNAi or antisense methods, it being still possible to provide a copy of the nucleic acid or nucleic acids produced by an RNA polymerase,
  • sample preparation for the logical subordinate analysis by microarrays, by sequencing methods, by parallel sequencing methods, by Amplifi cation method (Strand Displacment Amplification, Polymerase Chain Reaction or Rolling
  • RNA libraries with e.g. 2 or more translation sequences in vitro or in vivo,
  • Genomes minimal gene clusters, minimal genomes, fully synthetic genomes or mixtures with targeted or randomized variants of synthetic genes, gene fragments, gene clusters, gene ferries, gene vectors, chromosomes, genomes, optimize genomes, minimal gene clusters, minimal genomes, fully synthetic genomes,
  • Hydrocarbon a pharmaceutical or a precursor thereof, a nucleic acid, a pheromone, or other substance for the provision of a human used goods or for the production of a substance, which is subsequently supplied for further use,
  • nucleic acids Ligation of nucleic acids into vectors, YACs, BACs, chromosomes or plasmids, validation or testing of hybridization assays and associated reagents and kits using the generated nucleic acid polymers in the fields of microarrays, biochips, dot blots, Southern or
  • binding agents such as aptamers and ribozymes as well as indirect production via translation in vivo or in vitro by Peptides, proteins, antibodies, antibody fragments, antibodies analogous peptides, antibodies analog-acting proteins, - production via translation in vivo or in vitro of glycoproteins, proteoglycans or complexes with either peptide content, protein content, RNA content or DNA Portion, such as ribosomes or proteasomes.
  • the preparation of the synthetic nucleic acids is carried out by synthesizing a multiplicity of different nucleic acid fragments at different positions of a common solid carrier.
  • the synthesis of the nucleic acid fragments comprises a construction of nucleotide building blocks by means of wet and / or photochemical methods on the support, subsequent detachment of the nucleic acid fragments and assembly of the fragments to the desired nucleic acid double strand.
  • the synthesis may comprise amplification steps in which the synthesized nucleic acid fragments or / and optionally formed double-stranded intermediates formed therefrom of an amplification, e.g. a PCR.
  • nucleotide units and an enzyme which causes an amplification can be supplied. Amplifications can be performed on the support, i. before and / or after detachment of the nucleic acid fragments, or / and after elution from the carrier.
  • the carrier can be selected from flat carriers, porous carriers, reaction carriers with electrodes, reaction carriers with particles or beads, microfluidic reaction carriers, if appropriate Surface modifications such as gels, linkers, spacers, polymers, amorphous layers and / or 3D matrices, and combinations of the aforementioned supports.
  • the carrier is a microfluidic carrier.
  • the nucleic acid fragments are preferably generated by spatially and / or time-resolved in situ synthesis on the support, for example by spatially or / and time-resolved exposure by means of a programmable light source matrix.
  • the spatially or / and time-resolved synthesis can be carried out in a microfluidic carrier with one or more fluidic reaction spaces and one or more reaction areas within a fluidic reaction space.
  • nucleic acid fragment species used for assembly can be generated by using multiple regions and / or larger regions for the synthesis of the respective nucleic acid fragments on the support.
  • a correspondingly modified carrier is also the subject of the invention.
  • Another - optionally independent - object of the invention is to carry out the assembly of nucleic acid fragments to nucleic acid double strands in several steps.
  • a first step the nucleic acid fragments synthesized on the support at the 5 1 - or / and 3-end with one or more generic primer sequences of preferably 10-20 or 10-100 bases, more preferably 10-30 bases, even more preferred about 15 bases, wherein the primer sequences are selected such that amplification is possible directly for the single fragment, for a part of all fragments in a mixture, for all fragments in a mixture or after hybridization of two or more nucleic acid fragments with partial complementary sequence , After cleavage of the nucleic acid fragments provided with primers from the carrier and optionally after elution from the carrier and optionally hybridization of fragment pairs with complementary sequence, a subsequent Amplification, eg by PCR, by adding appropriate primers.
  • the amplification reaction produces nucleic acid fragments containing the generic primer sequence at their ends. After cleavage of the primer sequence, for example by means of restriction endonucleases, the resulting nucleic acid fragments can be subjected to further amplification cycles in order to generate a nucleic acid double strand.
  • the nucleic acid double strand generated by synthesis of fragments and their subsequent assembly is transformed in one embodiment into a vector, e.g. into a plasmid and inserted into a suitable host cell, e.g. a bacterial cell, transferred.
  • a vector e.g. into a plasmid and inserted into a suitable host cell, e.g. a bacterial cell, transferred.
  • the preparation of the nucleic acid polymers provides at several points of the
  • Primers or nucleic acid analogs having particular properties e.g. special melting temperature or accessibility for enzymes.
  • Embodiments of the invention can thereby have the following functions and
  • a measuring device e.g. an optical, magnetic, electrical or chemiluminescent measuring device or method
  • oligonucleotides Detection of the oligonucleotides, the fragments, covalently or non-covalently linked hybrid strands constructed therefrom and the target sequences, degradation, selective separation, opening, degradation or enzymatic digestion of the oligonucleotides, the fragments, covalently or non-covalently linked hybrid strands constructed therefrom and the target sequences, attachment of the oligonucleotides, the fragments of covalently or non-covalently linked hybrid strands constructed therefrom and the target sequences to a target structure or to target structures, eg in or on a reaction support, on a glass slide, in a reaction vessel, on a target organelle, on a target cell, on a target organ, on an organism, on a surface, on a biological surface, on a molecular
  • Complex such as a chromosome, virus particle or protein complex.
  • the primer sequence can be chosen so that a PCR reaction is possible by hybridization of two oligos each with complementary sequence.
  • the amplicon is cloned into bacteria using a plasmid, and after growth of clones, a number of 10 clones or 10 inserts in the clones are sequenced.
  • the sequence-tested synthetic gene is available. It is known in the art that the use of different proportions of the individual oligonucleotides to each other for an assembly of synthetic genes increases the rate of correct sequences (Gao, X et al., Nucleic Acids Research, 2003, VoI 31, No.22; P: 143).
  • the stoichiometry of the oligonucleotides has an influence on the thermodynamic parameters and has an effect on the law of mass action.
  • the design i. the concrete loading and assignment of area and location on the reaction support for a single oligonucleotide
  • Oligonucleotides In principle, this is possible with all in-situ synthesis processes known to those skilled in the art and listed at the outset. Particularly preferred for the embodiments of the invention are those methods which can be flexibly programmed and no physical changes
  • the amount of the individual oligonucleotides is accordingly controllable after detachment and elution of the oligos in the pool of various oligo species in solution.
  • the quantity distribution can be adjusted by the number of micromirrors or projection elements (exposure pixels). It will be apparent to those skilled in the art from this example that the design, by analogy, also determines the amounts. For example, in a photolithographic process, the amount over the area of the synthetic sites is determined by the amount, in an indirect photoacid method, of the number of physically separated reaction sites used for a sequence.
  • the adjustment and control of the proportions can be done by a user or by software. Software can be used to program settings for setting the proportions. This allows the process to be automated in certain places.
  • the specifications can be derived from theoretical models, bioinformatics, sequence comparisons, empirical data or information in databases.
  • Hybridization reaction can be used on a microarray.
  • the selected oligos in solution on a microarray For this purpose, the selected oligos in solution on a
  • the result can be determined in one embodiment by fluorescent markers attached directly or indirectly to the oligos in solution.
  • the signals from individual analysis spots can then be evaluated or quantified relative to each other.
  • the ratio can be adjusted by changing the synthesis design.
  • a comparatively lower binding strength of an oligo with a suitable sequence on a second oligo can, among other parameters, by the base composition, especially by the AT content (if only natural bases are used), by the tendency to Secondary structures or caused by further interactions with other oligos in the mixture.
  • the amplification of the detached oligonucleotides is part of the process.
  • the oligonucleotides or a part thereof can be synthesized with generic 5 'and / or 3' sequences attached to the sequence of the nucleic acid to be produced, so that subsequently an amplification of the oligonucleotides or a part thereof can take place.
  • the amplification or primer sequences are complementary to corresponding amplification primers and may contain one or more cleavage sites, preferably Typll cleavage sites. These cleavage sites allow cleavage of the primer sequences after amplification, e.g. by PCR.
  • Several pairs of amplification primer sequences can be used on a support to provide multiplex amplification, e.g. PCR, in an oligonucleotide library.
  • subpopulations of the oligonucleotide fragments may contain specific but different amplification sequences or pairs of amplification sequences.
  • the amplicons may be purified or added directly to the amplification reaction, e.g. for PCR.
  • the method may be used to selectively amplify a subpopulation of the carrier-derived sequences. It also allows the completion of nucleic acid fragments which were not in full length form after synthesis.
  • the amplifications can be carried out directly in the microchannels of the carrier or / and separated from the carrier in a suitable reaction vessel. In this way, the amount of nucleic acid fragments available for gene synthesis can be significantly increased.
  • the truncated fragments formed during the synthesis which can inhibit the assembly reaction, are diluted and in comparison to the amplified full-length fragments in negligible concentrations.
  • the increase of the proportion of full-length fragments in a mixture intended for gene synthesis by the upstream amplification and thus dilution of shortened synthesis products can be part of this embodiment.
  • isolation of nucleic acid fragments having the desired correct sequence can be made from a mixture of nucleic acids.
  • known techniques such as emulsion-based PCR or single-molecule arrays, can be used in which clonal molecule populations or single molecules can be isolated and sequenced from a mixture of DNA fragments.
  • the assembled gene can be "monoclonalized" and each of the individual fragments separately sequenced
  • the fragment having the desired sequence can be identified, isolated and processed further, eg by cloning, DNA-based assays, in In vitro protein expression etc.
  • the mixture of DNA fragments may be a PCR product, a ligation product or an oligonucleotide library.
  • an emulsion-based PCR preferably simultaneously contains in each case a bead or particles in the micelles or aqueous compartments. These are in particularly optimized and preferred for the invention variants smaller than 1 mm in diameter.
  • the method of Company 454 is known, which enables the sequencing of sections in the range 200 to 300 bases (as of 2006). This DNA is fragmented into smaller sections and then supplemented by ligation with uniform linker or adapter sequences. This mixture is incubated with the beads described in an emulsion PCR. The primers for the PCR reaction are on the beads as a solid phase.
  • the result of the reaction is a multiplicity of beads, each clonally only one fragment from the previous one carry fragmented DNA material covalently on the surface.
  • the beads are immobilized in a reaction support containing wells corresponding to the beads and their size, and then, in parallel, the sequences on each of the beads are detected by a so-called Sequencing by synthesis reaction known to those skilled in the art.
  • one or more assembly reactions can first be assembled from the oligos from the parallel synthesis.
  • the target sequences are to be selected in accordance with the read lengths of the sequencing reaction and are therefore preferably from 10 to 1000 nucleotides, particularly preferably from 40 to 500.
  • the advantage of this embodiment is therefore a mixture of assembled sequences, each constituted by 2 or more oligos and which may contain defects, in the above procedure on the beads to amplify clonal populations and then to sequence them.
  • cloning and quality control of the target sequences can be summarized in one step. Immobilization in the carrier during sequencing causes localization.
  • a label is made by spatially resolved addition of a label, e.g. a specific or nonspecific binding optical label, e.g. an intercalator (Sybergreen).
  • a label e.g. a specific or nonspecific binding optical label, e.g. an intercalator (Sybergreen).
  • An optionally independent embodiment comprises a method for, in particular, parallel sequencing of at least one nucleic acid in a mixture comprising assembled nucleic acids possibly containing defective nucleotides, comprising the steps: (a) amplifying a mixture comprising assembled nucleic acids, each composed of 2 or more nucleic acid fragments, to clonal populations,
  • step (b) sequencing at least one clonal population from step (a) and
  • the isolation is carried out in a preferred embodiment by isolation of one or more of the beads. In an alternative embodiment, the isolation is carried out by selective amplification by means of spatially resolved
  • labeling is performed by spatially resolved addition of a label, e.g. a specific or nonspecific binding optical label, e.g. of an intercalator (Sybergreen), and subsequent elution by laser
  • Undesirable or incorrectly recognized clones (beads) can be physically eliminated. This can be done by selective in one embodiment
  • further immobilization or derivatization may occur, e.g. in a light-dependent reaction, e.g. a crosslinking, covalent
  • the desired target sequences eluted, isolated or otherwise made available for further steps can in turn be used to construct even longer target sequences. They can also be used as a mixture for subsequent process steps.
  • all components of a genome considered necessary are prepared in this process.
  • these DNA sections are introduced in a subsequent step into a target organism which builds an assembled genome therefrom in vivo.
  • a particularly preferred target organism is Deinococcus radiodurans (also known as Micrococcus radiodurans), which can assemble its own genome after fragmentation, eg ionizing radiation, into fragments smaller than 10,000 bases in vivo.
  • the beads can be isolated or stored in the sequestering reaction carrier and used again at a later time.
  • the recovery of the clonal sequences may be a detachment or a copy without destruction of the covalent attachment to the bead. With copy without destruction of the covalent attachment to the bead, a bead is later available for recovery of the clonal sequences.
  • composition of a library of oligos becomes parallel
  • Synthetic methods such as the method according to the invention in a parallel sequencing method with at least 100, preferably checked at 1,000 to 10,000, more preferably 10,000 to 100,000 and in particular with 100,000 to 100 million parallel sequencing reactions.
  • control logic may be used as part of the invention.
  • the high degree of parallelism of the sequencing methods included here allows the acquisition of large amounts of data and thus the rational adaptation of synthesis parameters, so as to reduce the proportion of usable target sequences on the basis of defined criteria, e.g. Proportion of correct target sequences.
  • One possible independent embodiment of the invention relates to the generation of libraries containing a plurality of variants of a gene by synthesizing multiple variants of one or more of the nucleic acid fragments on the support prior to gene assembly.
  • Yet another - optionally independent - embodiment of the invention relates to the enzymatic cleavage of the nucleic acid fragments from the carrier.
  • Yet another - optionally independent - embodiment of the invention relates to the purification of a library of nucleic acid fragments by rehybridization on a support containing the complementary sequences.
  • Yet another - optionally independent - embodiment of the invention relates to the addition of primer-specific DNA sequences to the Nucleic acid fragments which form the 5 'end and the 3' end of the nucleic acid double strand to be synthesized. In this way, several consecutive reactions can be carried out with the same primer pair. In addition, different genes from different carriers can be amplified simultaneously with the same primers, thereby automating the process.
  • Yet another, optionally independent embodiment of the invention relates to the generation of synthetic target nucleic acids for standard microarray analysis methods, e.g. of probes immobilized on standard microarrays.
  • reaction carriers and solid phases can be used for the process according to the invention, for which a synthesis of a matrix of nucleic acid polymers is possible.
  • reaction carrier formats include, by way of example, the following reaction carrier formats and solid phases known to the person skilled in the art: flat reaction carrier, also called “chip”,
  • Reaction carrier with electrodes reaction carrier with temporarily or permanently immobilized solid phase of particles or beads, microfluidic reaction carrier,
  • reaction carriers can be used in combination, eg a microfluidic reaction carrier with porous surfaces.
  • the structure of the DNA probes is preferably by light-controlled in situ synthesis on a microfluidic carrier, eg in a GENIOM ® one instrument (febit biotech GmbH) using suitable protecting group chemistry in a three-dimensional microstructure instead.
  • a cyclic synthesis process exposures and condensations of the nucleotides alternate until the desired DNA sequence has been completely established at each position of the array in the microchannels. In this way, for example, up to 48,000 oligonucleotides with a length of, for example, up to 60 individual building blocks can be produced.
  • the oligonucleotides can covalently bind to a spacer molecule, a chemical spacer on the glass surface of the reaction carrier.
  • the synthesis is software-controlled and allows a high degree of flexibility in the design of the array, which the user can thus individually configure according to his needs.
  • the length of the oligonucleotides, the number of nucleic acid probes produced or internal controls can be optimally adapted to the respective experiment.
  • high quality and sequence freely programmable nucleic acids in the form of oligonucleotides of 10- 200 bases in length are inexpensively and efficiently provided in a variety of 10 or more different sequences to produce synthetic coding double-stranded DNA (synthetic genes).
  • a preferred sequence of a gene synthesis according to the invention is as follows:
  • a synthesis of many individual nucleic acid strands is carried out by applying the method according to the invention for highly parallel template-based DNA synthesis.
  • the nucleic acids are in single-stranded form and can be eluted from the carrier or reacted directly in the reaction carrier.
  • the template can be written off multiple times without destroying them, and at the same time an increase in the number of sequences encoded in the matrix is achieved.
  • the proportion of truncated nucleic acid polymers on the solid phase can also be masked out by copying from distal to proximal when the copy initiation site is distal.
  • An example of this is a distally attached promoter sequence.
  • the carrier with the matrix of solid phase bound molecules can be stored for later reuse.
  • the variety of sequences generated in a reaction support by in situ synthesis is provided for further process steps.
  • the design of the copying reaction a high quality of the written sequences can be achieved.
  • the assembly of the single-stranded building blocks into double-stranded building blocks takes place within a reaction space which, in a simple approach, comprises a conventional reaction vessel, e.g. a plastic tube, can be.
  • the reaction space is part of the reaction carrier, which in a variant may be a microfluidic reaction carrier in which the necessary reactions take place.
  • Another advantage of an integrated microfluidic reaction carrier is the possibility of integrating further process steps, e.g. a quality control by optical analysis.
  • the synthesis of the matrix has already taken place in a microfluidic carrier, which is then simultaneously usable as a reaction space for the downstream assembly.
  • the sequence of the individual building blocks is selected such that, when the individual building blocks are brought into contact with each other, complementary regions are available at the two ends that are brought together, in order to allow a specific juxtaposition of DNA strands by hybridizing these areas. This results in longer DNA hybrids.
  • the phosphodiester backbone of the DNA molecule is closed by ligases. If the sequences are chosen so that there are single-stranded gaps in these hybrids, these gaps are filled in a known procedure enzymatically by means of polymerases. (e.g., Klenow fragment or Sequenase). This results in longer double-stranded DNA molecules. Should it be necessary for further use to present these extended DNA strands as single strands, this can be done by the methods known to those skilled in the art for melting DNA double strands, such as e.g. Temperature or alkali.
  • Particularly preferred for the method according to the invention are those technologies that generate the array of nucleic acid polymers in a largely freely programmable manner and not on the establishment of technical components, such as. photolithographic masks, are dependent. Accordingly, particularly preferred embodiments are the projector-based light-assisted synthesis, the indirect projector-based light-triggered synthesis using photoacids and reaction chambers in a microfluidic reaction support, the electronically induced synthesis by means of spatially resolved deprotection on individual electrodes on the support and the fluidic synthesis by means of spatially resolved deposition of the activated synthesis monomers built up.
  • the building blocks must be produced flexibly and economically in their individual sequence. This is achieved by using a programmable light source matrix for the light-dependent spatially resolved in situ synthesis of the DNA strands, which are used as building blocks.
  • This flexible synthesis allows the free programming of the individual sequences of the building blocks and thus the generation of any variants of the partial sequences or the final sequence, without any significant changes of Components of the system (hardware) would be connected. Only through this programmed synthesis of the building blocks and thus the final synthesis products can the diversity of genetic elements be systematically processed.
  • the use of computer-programmable synthesis allows automation of the entire process, including communication with appropriate databases.
  • the selection of the sequence of the individual building blocks can be carried out efficiently given the target sequence, taking into account biochemical and functional parameters. In doing so, after entering the target sequence (e.g., from a database), an algorithm looks for the appropriate overlap ranges. Depending on the task, different numbers of subsequences can be created, namely distributed within a reaction carrier to be exposed or distributed over several reaction carriers.
  • the attachment conditions for the formation of the hybrids e.g. Temperature, salt concentration, etc., are matched by an appropriate algorithm to the available overlapping areas. This ensures maximum specificity of the juxtaposition.
  • the data for the target sequence can also be taken directly from public or private databases in a fully automatic version and converted into corresponding target sequences. In turn, the resulting products may optionally be fed into appropriately automated operations, e.g. in the cloning in suitable target cells.
  • stepwise construction by synthesis of the individual DNA strands in reaction areas within bounded reaction spaces also allows the construction of difficult sequences, for example, those with internal repeats of sequence sections, such as those found in retroviruses and corresponding retroviral vectors.
  • a synthesis of any sequence can be carried out without problems due to the assignment of the overlapping areas arise on the individual blocks.
  • the miniaturized reaction carrier is carried out so that a detachment process in the individual reaction spaces is possible, and thus the DNA strands synthesized on the reaction areas lying within these reaction spaces are detached in clusters.
  • the assembly of the building blocks in a stepwise process in reaction spaces is possible, in addition the removal of building blocks, partial sequences or the final product, or the sorting or separation of the molecules.
  • the target sequence can be introduced as an integrated genetic element by transfer into cells and thereby be cloned and examined in the course of functional studies.
  • Another possibility is to further purify or analyze the synthesis product first, this analysis being e.g. can be a sequencing.
  • the process of sequencing may also begin by direct coupling to a corresponding device, e.g. with an apparatus for the integrated synthesis and analysis of polymers which is described in patent application DE 19924 327. It is also conceivable to isolate and analyze the generated target sequences after cloning.
  • the inventive method provides on the thus generated integrated genetic elements provide a tool that captures biodiversity in a systematic process for the advancement of molecular biology.
  • the generation of DNA molecules with desired genetic information is thus no longer the bottleneck of molecular biology work, as all molecules can be synthesized from small plasmids to complex vectors to mini-chromosomes and are available for further work.
  • the manufacturing method allows the parallel generation of numerous nucleic acid molecules and thus a systematic approach to issues concerning regulatory elements, DNA binding sites for regulators, signaling cascades, receptors, action and interactions of growth factors, etc.
  • the known genetic tools such as plasmids and vectors
  • plasmids and vectors can continue to be used and it can be built on the corresponding experience.
  • these experiences will change rapidly due to the desired optimization of the existing vectors, etc.
  • the mechanisms e.g. make a plasmid suitable for propagation in a particular cell type, can be rationally investigated for the first time on the basis of the method according to the invention.
  • the synthetic DNA molecules are fully compatible with the existing one at each stage of the development of the method described here
  • Interfaces even for hitherto little-used enzymes, are not a limiting factor in integrated genetic elements.
  • constructs that interfere with gene expression via the RNAi mechanism If such constructs code for more than one RNAi species, multiple genes can be simultaneously inhibited in a multiplexed approach.
  • the gene or genes are synthesized as a DNA molecule and then (after appropriate preparation, such as cleaning, etc.) introduced directly into target cells and studied the result.
  • the multistep usually via microorganisms, such as E. coli, ongoing cloning process (eg DNA isolation, purification, analysis, recombination, cloning in bacteria, Isolation, analysis, etc.) is thus reduced to the last transfer of the DNA molecule into the final effector cells.
  • clonal propagation in an intermediate host usually E. coli
  • an intermediate host usually E. coli
  • probes eg, by PCR are used to search for clones in cDNA libraries that do not contain the entire sequence of the messenger RNA originally used in their preparation (messenger RNA, mRNA).
  • an antibody is searched for in an expression gene library (screening)
  • Screening Both methods can be extremely shortened with the method according to the invention: in the presence of an "in silico" specific gene Sequence (ie after recognition of a corresponding pattern in a DNA sequence by the computer), or after decryption of a protein sequence, a corresponding vector with the sequence or variants thereof can be generated directly via programmed synthesis of an integrated genetic element and introduced into suitable target cells.
  • the process involves the integration of the synthesis, the replacement of the synthesis products and the assembly into a DNA molecule in one system.
  • all the necessary functions and process steps up to the purification of the final product can be integrated in a miniaturized reaction carrier. These may be synthesis regions, cleavage regions (clusters), reaction spaces, feed channels, valves, pumps, concentrators, separation areas, etc.
  • Plasmids and expression vectors can be prepared directly for sequenced proteins or corresponding subsequences and the products analyzed biochemically and functionally, e.g. using appropriate regulatory elements. This makes the search for clones in one
  • ORFs open reading frames from sequencing work (e.g., human genome project) can be programmed directly into appropriate vectors and with desired genetic
  • the method according to the invention is characterized by lower material expenditure.
  • a microfluidic system requires significantly fewer starting materials than a conventional solid phase synthesizer for a single DNA oligomer (using a single column).
  • microliters are compared to the consumption of milliliters, ie a factor of 1000.
  • DNA vaccine an extremely efficient and rapid vaccine design

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Abstract

Die Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuredoppelsträngen. Dabei werden eine Vielzahl von unterschiedlichen Nukleinsäuref ragmenten an einem Träger synthetisiert und nach Abspaltung von der festen Phase zusammengefügt. Das beanspruchte Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass bestimmte Nukleinsäuref ragmente in grosserer Menge als andere Fragmente synthetisiert werden. Bei den in grosserer Menge synthetisierten Fragmenten handelt es sich in der Regel um AT-reiche Nukleinsäuref ragmente, die reduzierte Schmelztemperatur aufweisen.

Description

Programmierbare Oligonukleotidsynthese
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren.
Einleitung
Der Bedarf an synthetischen Nukleinsäuren ist durch die Molekularbiologie und die biomedizinische Forschung und Entwicklung hoch. Die Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren (DNA, RNA oder deren Analoga) wird überwiegend mit Hilfe von säulengestützten Synthesizern durchgeführt.
Besonders wichtige und weit verbreitete Einsatzgebiete für synthetische Nukleinsäurepolymere sind Primer für die Polymerase chain reaction (PCR) (Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 26 (3/4), 301-334, 1991) und die Sequenziermethode nach Sanger (Proc. Nat. Acad. Sei. 74, 5463-5467, 1977).
Synthetische DNA spielt auch für die Herstellung von synthetischen Genen eine Rolle. Beschrieben werden Methoden der Gensythese als Beispiel in US 6 586 211 B1 , in PCT/EP2004/013131 , in WO 00/13017 A2, in S. Rayner et al., PCR Methods and Applications 8 (7), 741-747, 1998, in WO 90/00626 A1 , in EP 385 410 A2, in WO 94/12632 A1 , in WO 95/17413 A1 , in EP 316 018 A2, in EP 022 242 A2, in L. E. Sindelar and J. M. Jaklevic, Nucl. Acids Res. 23 (6), 982-987, 1995, in D. A. Lashkari, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 92 (17), 7912-7915, 1995, und in WO 99/14318 A1 , die als Referenz eingeschlossen werden.
Zwei weitere Anwendungsfelder mit steigendem Bedarf sind die Herstellung von Mikroarrays oder Biochips aus Oligonukleotid-Sonden (1. Nature Genetics, Vol. 21 , Supplement (gesamt), Jan. 1999, 2. Nature Biotechnology, Vol. 16, 981-983, Okt. 1998, 3. Trends in Biotechnology, Vol. 16, 301-306, JuI. 19989) und die Herstellung von interferierender RNA (iRNA oder RNAi) für die Modulation der Genexpression in Zielzellen (PCT/EP01/13968).
Die genannten Anwendungsgebiete der Molekularbiologie liefern wertvolle Beiträge in der Wirkstoff-Entwicklung, der Wirkstoff-Produktion, der kombinatorischen Biosynthese (Antikörper, Effektoren wie Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter etc.), in der Biotechnologie (z.B. Enzymdesign, Pharming, biologische Herstellungsverfahren, Bioreaktoren etc.), in der molekularen Medizin im Tissue Engineering, in der Entwicklung und Anwendung neuer Materialien (z.B. Werkstoffe wie Spinnenseide und Perlmutt), in der Entwicklung und Anwendung von Diagnostika (Mikroarrays, Rezeptoren und Antikörper, Enzymdesign etc.) oder in der Umwelttechnik (spezialisierte oder maßgeschneiderte Mikroorganismen,
Produktionsverfahren, Sanierung, Sensoren etc.). Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann somit in allen diesen Bereichen erfolgen.
Stand der Technik
Die am weitesten verbreitete Methode zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren basiert auf Grundlagenarbeiten von Caruthers und wird als Phosphitamid-Methode beschrieben (M. H. Caruthers, Methods in Enzymology 154, 287-313, 1987). Die Sequenz der entstehenden Moleküle kann dabei durch die Syntheseabfolge gesteuert werden. Andere Verfahren, wie z.B. die H-Phosphonat-Methode, dienen dem gleichen Zweck des sukzessiven Aufbaues eines Polymers aus seinen Untereinheiten, haben sich aber nicht so weit durchsetzen können wie die Methode nach Caruthers.
Um das chemische Verfahren der Polymersynthese aus Untereinheiten automatisieren zu können, werden meistens feste Phasen verwendet, an denen die wachsende Molekülkette verankert ist. Sie wird erst nach Fertigstellung der Synthese abgespalten, wozu ein geeigneter Linker zwischen dem eigentlichen Polymer und der festen Phase erforderlich ist. Die Methode verwendet zur Automatisierung in der Regel feste Phasen in Form aktivierter Partikel, die in eine Säule gefüllt werden, z.B. controled pore glass (CPG). Solche festen Phasen tragen in der Regel nur eine definiert entnehmbare Art von Oligo mit einer programmierten Sequenz. Die Zugabe der einzelnen Synthesereagenzien erfolgt nun in einer steuerbaren Art und Weise in einem Automaten, der vor allem die automatisierte Zugabe der einzelnen Reagenzien zur festen Phase sicherstellt. Die Menge an synthetisierten Molekülen ist durch die Menge des Trägermaterials und die Größe der Reaktionsansätze steuerbar. Diese Mengen sind für die oben genannten molekular-biologischen Verfahren entweder ausreichend oder sogar zu hoch (z.B. bei PCR-Primem). Eine gewisse Parallelisierung zur Erzeugung einer Vielzahl unterschiedlicher Sequenzen wird durch Anordnung von mehreren Säulen in einem apparativen Aufbau erreicht. So sind dem Fachmann Geräte mit 96 parallelen Säulen bekannt.
Eine Variante und Weiterentwicklung für die Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren ist die in situ Synthese von Mikroarrays (Array-Anordnung der Nukleinsäuren in einer Matrix). Diese wird auf einem Substrat durchgeführt, das durch die Synthese mit einer Vielzahl unterschiedlicher Sequenzen beladen wird. Der große Vorteil der in situ Syntheseverfahren für Mikroarrays ist die Bereitstellung einer Vielzahl von Oligomeren unterschiedlicher und definierter Sequenz an adressierbaren Lokationen auf einem gemeinsamen Träger. Die Synthese greift dabei auf ein überschaubares Set aus Einsatzstoffen zurück (bei DNA-Mikroarrays in der Regel die 4 Basen A, G, T und C) und baut aus diesen beliebige Sequenzen der Nukleinsäurepolymere auf.
Die Abgrenzung der einzelnen Molekülspezies kann zum einen durch getrennte fluidische Kompartimente bei der Zugabe der Syntheseeinsatzstoffe erfolgen, wie es z.B. in der so genannten in situ - A -
Spotting Methode oder Piezoelektrischen Techniken der Fall ist, die auf der Tintenstrahldrucktechnik beruht (A. Blanchard, in Genetic Engineering, Principles and Methods, Vol. 20, Ed. J. Sedlow, 111-124, Plenum Press; A. P. Blanchard, R. J. Kaiser, L. E. Hood, High-Density Oligonucleotide Arrays, Biosens. & Bioelectronics 11, 687, 1996).
Eine alternative Methode ist die ortsaufgelöste Aktivierung von Syntheseplätzen, was durch selektive Belichtung, durch selektive oder ortsaufgelöste Generierung von Aktivierungsreagenzien (Entschützungsreagenzien) oder durch selektive Zugabe von Aktivierungsreagenzien (Entschützungsreagenzien) möglich ist.
Beispiele für die bisher bekannten Verfahren für die in situ Synthese von Mikroarrays sind - die photolithographische lichtgestützte Synthese (McGaII, G. et al; J. Amer. Chem. Soc. 119; 5081-5090; 1997),
- die projektorbasierte lichtgestützte Synthese (PCT/EP99/06317), die fluidische Synthese mittels physischer Trennung der Reaktionsräume (dem Fachmann bekannt aus den Arbeiten von Prof. E. Southern, Oxford, UK, und von Firma Oxford Gene Technologies,
Oxford, UK)1
- die indirekte projektorbasierte lichtgesteuerte Synthese mittels lichtaktivierter Photosäuren und geeigneten Reaktionskammern oder physisch getrennten Reaktionsräumen in einem Reaktionsträger, - die elektronisch induzierte Synthese mittels ortsaufgelöster Entschützung an einzelnen Elektroden auf dem Träger unter Nutzung einer durch die Elektroden induzierten Entstehung von Protonen (bekannt u.a. durch die Produkte der Firma Combimatrix) und die fluidische Synthese mittels ortsaufgelöster Deposition der aktivierten Synthese-Monomere (bekannt aus A. Blanchard, in Genetic
Engineering, Principles and Methods, Vol. 20, Ed. J. Sedlow, 111-124, Plenum Press; A. P. Blanchard, R. J. Kaiser, L. E. Hood, High-Density Oligonucleotide Arrays, Biosens. & Bioelectronics 11 , 687, 1996). Verfahren zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren, insbesondere Nukleinsäuredoppelsträngen an einem gemeinsamen festen Träger sind außerdem aus WO 00/49142 und WO 2005/051970 bekannt.
Gegenstand der Erfindung
Bereitgestellt werden soll ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren wahlfreier Sequenz, insbesondere Nukleinsäuredoppelsträngen, durch Herstellung geeigneter festphasengestützter synthetischer Bibliotheken, auch als Libraries bezeichnet. Außerdem soll ein verbessertes Verfahren bereitgestellt werden zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren wahlfreier Sequenz, insbesondere Nukleinsäuredoppelsträngen, durch Herstellung geeigneter festphasengestützter synthetischer Bibliotheken und die anschließende Zusammenfügung von mindestens zwei Nukleinsäurefragmenten aus der Bibliothek durch eine Bindung oder kovalente Verknüpfung dieser zwei Nukleinsäurefragmente miteinander, wobei die Herstellung der Bibliothek eine Steuerung der Mengenverhältnisse der Bestandteile der Bibliothek zueinander umfasst.
Die Zusammenfügung der Nukleinsäurefragmente erfolgt vorzugsweise durch eine spezifische Hybridisierungsreaktion zwischen Überlappungsbereichen zueinander komplementärer Abschnitte der Nukleinsäurefragmente, wobei längere synthetische doppelsträngige Nukleinsäuren erhalten werden. Die einzelnen, zum Aufbau längerer Nukleinsäuren verwendeten Sequenzabschnitte haben vorzugsweise eine Länge von 20-100 oder 20-300 Nukleotidbausteinen, bevorzugt von 25-50 oder 25-100 Nukleotidbausteinen, beispielsweise etwa 30 Nukleotidbausteinen. Die Sequenzabschnitte werden dabei vorzugsweise so gewählt, dass sie mit einem Sequenzabschnitt des Gegenstrangs der zu synthetisierenden komplementären Nukleinsäure zumindest teilweise überlappen, so dass der zu synthetisierende Nukleinsäurestrang durch Hybridisierung einzelner Sequenzabschnitte aufgebaut werden kann. In einer alternativen Ausführungsform werden die Sequenzabschnitte vorzugsweise so gewählt, dass die Sequenzabschnitte auf beiden Strägen der zu synthetisierenden Nukleinsäure vollständig überlappen, demnach zur Herstellung eines soweit vollständigen Doppelstranges nur noch die kovalente Verknüpfung des Phosphordiester-Rückgrates notwendig ist. Die Länge der Komplementärbereiche bzw. Überlappungen zwischen einzelnen Fragmenten beträgt z.B. 10-50 oder 10-100 Nukleotidbausteine, vorzugsweise 12-25 oder 20-80 Nukleotidbausteine, besonders bevorzugt etwa 15-20 Nukleotidbausteine und am stärksten bevorzugt etwa 15 oder etwa 20 Nukleotidbausteine. Wenn der Überlappungs- bzw. Komplementaritätsbereich zwischen zwei Nukleinsäurefragmenten einen hohen AT-Gehalt, z.B. einen AT-Gehalt > 50 %, vorzugsweise einen AT- Gehalt > 60 %, besonders bevorzugt einen AT-Gehalt > 65 % aufweist, ist die Bindungskonstante im Vergleich zu GC-reicheren Sequenzen niedriger. Demzufolge kann die Hybridisierung zwischen diesen Fragmenten aus thermodynamischen Gründen vergleichsweise wenig effektiv sein. Dies kann einen Einfluss auf die Zusammenlagerung von 2 oder mehr Fragmenten ausüben. Eine mögliche sequenzabhängige Folge ist eine Verringerung der Ausbeute von Nukleinsäuredoppelsträngen mit der korrekten Ziel-Sequenz.
Ein Ziel des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Beineinflussung der thermodynamischen Zusammenhänge während der Zusammenlagerung aus 2 oder mehr Fragmenten durch Steuerung oder durch Steuerung und Kontrolle der Mengenverhältnisse der Fragmente in einem Reaktionsansatz, um die Ausbeute an korrekten Nukleinsäuredoppelsträngen zu verbessern. Hierbei werden insbesondere die thermodynamischen Parameter in einer Reaktion zur Bindung von mindestens 2 Nukleinsäurefragmenten aneinander moduliert. Unter Modulation der thermodynamischen Parameter wird insbesondere verstanden, dass die Bindung der beiden Nukleinsäurefragmente aneinander, die dem Massenwirkungsgesetz unterliegt, verbessert wird. Besonders bevorzugt ist, dass die Modulation der theπnodynamischen Parameter in der Reaktion die Steuerung der Mengenverhältnisse einzelner Nukleinsäurefragmente ist, insbesondere durch Verwendung höherer Mengen von Nukleinsäurefragmenten, die einen hohen AT-Anteil aufweisen. Wenn mindestens einige Nukleinsäurefragmente zur Modulation ihrer thermodynamischen Parameter in der Reaktion von mindestens 2 Nukleinsäurefragmenten in einer gegenüber anderen Fragmenten gesteigerten Menge eingesetzt werden, so kann dies zum Beispiel bewirkt werden, indem mindestens einige Nukleinsäurefragmente, die einen hohen AT-Gehalt aufweisen, in einer gegenüber anderen Fragmenten gesteigerten Menge eingesetzt werden.
Durch Steuerung der Mengenverhältnisse einzelner Nukleinsäurefragmente, insbesondere durch Verwendung höherer Mengen von Nukleinsäurefragmenten, die einen hohen AT-Anteil aufweisen, kann die Ausbeute an korrekten Hybridisierungsprodukten und somit auch die Ausbeute an korrekten Nukleinsäuredoppelsträngen verbessert werden. Dabei kann die Menge der Population der entsprechenden Nukleinsäurefragmente um vorzugsweise ≥ 10 %, besonders bevorzugt ≥ 50 % oder noch mehr, z.B. bis um den Faktor 100 oder 1000 mehr gegenüber anderen Nukleinsäurefragmenten ohne hohen AT-Anteil, gesteigert werden.
Außer dem AT-Anteil gibt es noch weitere Parameter, die einen Einfluss auf die Ausbeute an Zielsequenzen haben. Hierzu gehört die unterschiedliche Syntheseeffizienz der einzelnen Fragmente oder Oligonukleotide während der Verlängerung im Syntheseprozess. Es ist dem Fachmann z.B. bekannt, dass der Baustein G bei Phosphoramidit-Verfahren mit geringerer Ausbeute an den zu verlängernden Polymerstrang koppelt als die anderen Nukleotid- Bausteine. Außerdem sind dem Fachmann empirisch sichtbare, aber nicht in jedem Fall bereits vorhersagbare Abhängigkeiten der Syntheseeffizienz von der gesamten Sequenz des Polymerstranges bekannt. Hierzu zählt z.B. die Synthese von mehreren G Bausteinen nacheinander. Diese Abweichungen in der Verfügbarkeit oder Kinetik einzelner Fragmente für die Zusammenlagerung von 2 oder mehr Fragmenten zu einer Zielsequenz können ebenfalls durch Steuerung oder Steuerung und Kontrolle (Regelung) der Mengenverhältnisse beeinflusst werden. Dabei kann die Abweichung berechenbar und gut bekannt oder lediglich aus der Empirie bekannt und im Experiment beobachtet sein. Dementsprechend kann das erfindungsgemäße Verfahren z.B. iterativ unter Messung des Ergebnisses, also z.B der Ausbeute an Zielsequenz, optimiert werden. Eine Ausführungsform der Erfindung ist die Nutzung einer speicherprogrammierbaren Einrichtung, um auf Grundlage bekannter Gesetzmäßigkeiten für neue Fragmente-Sequenzen und Zielsequenzen die vorhergesagte optimale Zusammensetzung der Mengenverhältnisse zu steuern. Dies kann in der Umsetzung mittels eines Computers oder ähnlicher Steuerungstechniken erfolgen. Dabei können Einflussgrößen und Stellparameter in einer Datenbank erfasst werden, die in einer Ausführungsform in einer speicherprogrammierbaren Einrichtung enthalten ist und bei der Steuerung der Synthese mittelbar oder unmittelbar eingesetzt wird.
Die Reaktionsprodukte einer Bibliothekssynthese zeichnen sich durch große Vielfalt der Sequenzen aus, die während des Synthesevorgangs frei wählbar programmiert werden können. Ein Zahlenbeispiel illustriert die Vielfalt einer solchen Bibliothek. Ein Mikroarray aus dem Geniom®-System, bei dem die Nukleinsäure-Molekülpopulationen auf einzelnen Syntheseplätzen in einem speziellen mikrofluidischen Träger synthetisiert werden, kann zum Beispiel mit Stand 2006 bis zu 60.000 frei wählbare Oligonukleotide mit einer Sequenz von bis zu 60 Nukleotiden synthetisieren. Die Geräte synthetisieren die Nukleinsäuren ortsaufgelöst unter Nutzung eines projektorbasierten Verfahrens (siehe z.B. WO 00/13018 oder WO 00/13017).
Zweck des verbesserten Verfahrens ist die Bereitstellung von Nukleinsäuren mit hoher und rationell programmierbarer Diversität der Sequenzen und steuerbaren Mengenverhältnissen der einzelnen Sequenz-Vertreter oder Fragmente (Bestandteile der Bibliothek) für in einem nächsten Schritt nachfolgende Verfahren.
Beispiele für nachfolgende Verfahren, für die die Erfindung verwendet werden kann, sind:
- die Herstellung von Nukleinsäurefragmenten als Primer für Primer Extension Methoden, Strand Displacment Amplifikation, Polymerase Chain Reaction, Site Directed Mutagenesis oder Rolling Circle Amplifikation, - Herstellung von synthetischen Genen, Genfragmenten, Gen-Clustern, Gen-Fähren, Gen-Vektoren, Chromosomen, Genomen, optimierten Genomen, minimalen Gen-Clustern, minimalen Genomen, vollsynthetischen Genomen oder von Mischungen mit gezielten oder randomisierten Varianten von synthetischen Genen, Genfragmenten, Gen-Clustern, Gen-Fähren, Gen-Vektoren, Chromosomen, Genomen, optimieren Genomen, minimalen Gen-Clustern, minimalen Genomen, vollsynthetischen Genomen,
- Genexpressions-Modulation mittels RNAi oder Antisense-Methoden, wobei noch eine Abschrift von der erzeugten Nukleinsäure oder den Nukleinsäuren durch eine RNA Polymerase vorgesehen sein kann,
Herstellung, Extraktion, Aufreinigung, Isolation oder Vorbereitung von Analyten (sample preparation) für die logisch nachgeordnete Analyse durch Mikroarrays, durch Sequenzierverfahren, durch parallele Sequenzierverfahren, durch Amplifi kationsverfahren (Strand Displacment Amplifikation, Polymerase Chain Reaction oder Rolling
Circle Amplifikation) oder Analyse in einer Gelelektrophorese,
- RNA-Bibliotheken mit z.B. 2 oder mehr Sequenzen für die Translation in vitro oder in vivo,
- Klonierung der erzeugten Nukleinsäuren alleine oder in Kombination mit weiteren Sequenzen mittels Vektoren oder Plasmiden,
- Herstellung von Minimalgenomen, optimierten Genomen, reduzierten Genomen, gemischten Genomen verschiedener Spezies, wobei der gesamte geplante Bestand des Genomes oder ein Teil davon durch die synthetischen Nukleinsäuren kodiert werden kann, Herstellung von Zielorganismen mit permanent oder temporär integrierten, transformierten, transfizierten oder anderweitig eingebrachten synthetischen Genen, Genfragmenten, Gen-Clustem, Gen-Fähren, Gen-Vektoren, Chromosomen, Genomen, optimierten
Genomen, minimalen Gen-Clustern, minimalen Genomen, vollsynthetischen Genomen oder von Mischungen mit gezielten oder randomisierten Varianten von synthetischen Genen, Genfragmenten, Gen-Clustern, Gen-Fähren, Gen-Vektoren, Chromosomen, Genomen, optimieren Genomen, minimalen Gen-Clustern, minimalen Genomen, vollsynthetischen Genomen,
Herstellung der im vorhergehenden Punkt beschriebenen Zielorganismen für die Verbesserung, Veränderung oder Reduktion eines in dem Zielorganismus anfallenden Naturstoffes, z.B. einer Aminosäure-Kette, eines Proteins, einer organischen Substanz, eines
Kohlenwasserstoffs, eines Pharmakons oder einer Vorstufe davon, einer Nukleinsäure, eines Pheromons, oder einer anderen Substanz für die Bereitstellung eines von Menschen genutzten Gutes oder für eine Herstellung einer Substanz, die anschließend einer weiteren Nutzung zugeführt wird,
Ligation der Nukleinsäuren in Vektoren, YACs, BACs, Chromosomen oder Plasmide, Validierung oder Test von Hybridisierungs-Assays und zugehörigen Reagenzien und Kits mittels der erzeugten Nukleinsäurepolymeren in den Bereichen Mikroarrays, Biochips, Dot blots, Southern- oder
Northern-Blots, Bead-Arrays, Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), PCR , real time PCR,
Referenz- oder Kalibrier-Verfahren oder Verfahrensschritte innerhalb von Assays aus den Bereichen Mikroarrays, Dot blots, Southern- oder Northern-Blots, Bead-Arrays, Serial Analysis of Gene Expression
(SAGE), PCR, real time PCR,
Herstellung von bindenden Agenzien wie Aptameren und Ribozymen sowie indirekte Herstellung über die Translation in vivo oder in vitro von Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antikörperfragmenten, Antikörper analog wirkenden Peptiden, Antikörper-analog wirkenden Proteinen, - Herstellung über die Translation in vivo oder in vitro von Glykoproteinen, Proteoglykanen oder Komplexen mit wahlweise Peptid-Anteil, Protein- Anteil, RNA-Anteil oder DNA-Anteil, wie Ribosomen oder Proteasomen.
Ausführliche Beschreibung von Erfindung und Ausführungsformen
Bevorzugte Verfahren zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren aus einem festen Träger sind aus WO 00/49142 und WO 2005/051970 bekannt. Auf den Inhalt dieser Dokumente wird ausdrücklich Bezug genommen, und sie werden in ihrer Gesamtheit hierin eingeschlossen.
Vorzugsweise erfolgt im erfindungsgemäßen Verfahren die Herstellung der synthetischen Nukleinsäuren dadurch, dass eine Vielzahl von unterschiedlicher Nukleinsäurefragmente an verschiedenen Positionen eines gemeinsamen, festen Trägers synthetisiert wird. Vorzugsweise umfasst die Synthese der Nukleinsäurefragmente einen Aufbau aus Nukleotidbausteinen mittels nass- und/oder fotochemischer Verfahren auf dem Träger, anschließendes Ablösen der Nukleinsäurefragmente und Assemblieren der Fragmente zu dem gewünschten Nukleinsäuredoppelstrang. Weiterhin kann die Synthese Amplifikationsschritte umfassen, bei denen die synthetisierten Nukleinsäurefragmente oder/und daraus gebildete, gegebenenfalls doppelsträngige Zwischenprodukte einer Amplifikation, z.B. einer PCR, unterzogen werden. Hierzu können Nukleotidbausteine und ein Enzym, das eine Amplifikation bewirkt, zugeführt werden. Amplifikationen können auf dem Träger, d.h. vor oder/und nach Ablösung der Nukleinsäurefragmente, oder/und nach Elution vom Träger erfolgen.
Der Träger kann ausgewählt werden aus flachen Trägern, porösen Trägern, Reaktionsträgern mit Elektroden, Reaktionsträgern mit Partikeln oder Beads, mikrofluidischen Reaktionsträgern, die gegebenenfalls Oberflächenmodifikationen wie Gele, Linker, Spacer, Polymere, amorphe Schichten oder/und 3D-Matrices aufweisen, und Kombinationen der zuvor genannten Träger. Vorzugsweise ist der Träger ein mikrofluidischer Träger.
Die Nukleinsäurefragmente werden vorzugsweise durch orts- oder/und zeitaufgelöste in situ Synthese auf dem Träger erzeugt, beispielsweise durch orts- oder/und zeitaufgelöste Belichtung mittels einer programmierbaren Lichtquellenmatrix. Die ort- oder/und zeitaufgelöste Synthese kann in einem mikrofluidischen Träger mit einem oder mehreren fluidischen Reaktionsräumen und einem oder mehreren Reaktionsbereichen innerhalb eines fluidischen Reaktionsraums erfolgen.
Unterschiedliche Mengen von für die Assemblierung verwendeten Nukleinsäurefragmentspezies können durch Verwendung von mehreren Bereichen und/oder größeren Bereichen für die Synthese der jeweiligen Nukleinsäurefragmente auf dem Träger erzeugt werden. Ein entsprechend modifizierter Träger ist auch Gegenstand der Erfindung.
Ein weiterer - gegebenenfalls unabhängiger - Gegenstand der Erfindung besteht darin, die Assemblierung von Nukleinsäurefragmenten zu Nukleinsäuredoppelsträngen in mehreren Schritten durchzuführen. In einem ersten Schritt werden dabei die auf dem Träger synthetisierten Nukleinsäurefragmente am 51- oder/und 3-Ende mit einer oder mehreren generischen Primersequenzen von vorzugsweise 10-20 oder 10-100 Basen, besonders bevorzugt von 10-30 Basen, noch stärker bevorzugt etwa 15 Basen versehen, wobei die Primersequenzen so gewählt sind, dass eine Amplifikation direkt für das einzelne Fragment, für einen Teil aller Fragmente in einem Gemisch, für alle Fragmente in einem Gemisch oder nach Hybridisierung von zwei oder mehr Nukleinsäurefragmenten mit teilweisen komplementärer Sequenz möglich ist. Nach Abspalten der mit Primern versehenen Nukleinsäurefragmente vom Träger und gegebenenfalls nach Elution aus dem Träger und gegebenenfalls einer Hybridisierung von Fragmentpaaren mit komplementärer Sequenz erfolgt eine anschließende Amplifikation, z.B. durch PCR, durch Zugabe entsprechender Primer. In der Amplifikationsreaktion entstehen Nukleinsäurefragmente, die an ihren Enden die generische Primersequenz enthalten. Nach Abspaltung der Primersequenz, z.B. mittels Restriktionsendonukleasen, können die resultierenden Nukleinsäurefragmente weiteren Amplifikationszyklen unterzogen werden, um einen Nukleinsäuredoppelstrang zu erzeugen.
Der durch Synthese von Fragmenten und deren anschließende Assemblierung erzeugte Nukleinsäuredoppelstrang wird in einer Ausführungsform in einen Vektor, z.B. in ein Plasmid, eingebaut und in eine geeignete Wirtszelle, z.B. eine Bakterienzelle, überführt.
Die Herstellung der Nukleinsäurepolymere bietet an mehreren Stellen des
Verfahrens die Möglichkeit, mit bekannten Methoden in die Reaktionsprodukte Modifikationen oder Markierungen einzuführen. Hierzu zählen markierte Nukleotide, die z.B. mit Haptenen oder optischen Markern, wie Fluorophoren und Lumineszenz-Markern, modifiziert sind, markierte
Primer oder Nukleinsäure-Analoga mit besonderen Eigenschaften, wie z.B. besondere Schmelztemperatur oder Zugänglichkeit für Enzyme. Ausführungsformen der Erfindung können dadurch folgende Funktionen und
Methoden einschließen und die zugehörigen Laborprozesse ermöglichen:
Markierung der Oligonukleotide, der Fragmente, von daraus aufgebauten kovalent oder nicht-kovalent verbundenen Hybridsträngen sowie der Zielsequenzen, für eine direkte oder indirekte Erfassung mit einem Messgerät, z.B. einem optischen, magnetischen, elektrischen oder chemilumineszenten Messgerät oder Messverfahren,
Markierung der Oligonukleotide, der Fragmente, von daraus aufgebauten kovalent oder nicht-kovalent verbundenen Hybridsträngen sowie der Zielsequenzen, für eine direkte oder indirekte Erfassung durch andere molekulare Strukturen wie z.B. Enzyme, Rezeptoren,
Proteine,
Isolation oder Extraktion der Oligonukleotide, der Fragmente, von daraus aufgebauten kovalent oder nicht-kovalent verbundenen Hybridsträngen sowie der Zielsequenzen,
Bindung der Oligonukleotide, der Fragmente, von daraus aufgebauten kovalent oder nicht-kovalent verbundenen Hybridsträngen sowie der Zielsequenzen mittels der Haptene oder anderer in einer molekularen Erkennungsreaktion einsetzbaren Bausteine, einer funktionellen Gruppe oder einer Modifikation,
Detektion der Oligonukleotide, der Fragmente, von daraus aufgebauten kovalent oder nicht-kovalent verbundenen Hybridsträngen sowie der Zielsequenzen, - Abbau, selektive Trennung, Öffnung, Degradation oder enzymatischer Verdau der Oligonukleotide, der Fragmente, von daraus aufgebauten kovalent oder nicht-kovalent verbundenen Hybridsträngen sowie der Zielsequenzen, Anlagerung der Oligonukleotide, der Fragmente, von daraus aufgebauten kovalent oder nicht-kovalent verbundenen Hybridsträngen sowie der Zielsequenzen an eine Zielstruktur oder an Zielstrukturen, z.B. in einem oder auf einem Reaktionsträger, auf einem Glas- Objektträger, in einem Reaktionsgefäß, an einer Zielorganelle, an einer Zielzelle, an einem Zielorgan, an einem Organismus, an einer Oberfläche, an einer biologischen Oberfläche, an einem molekularen
Komplex wie z.B. einem Chromosom, Viruspartikel oder Proteinkomplex.
Im Folgenden ist eine beispielhafte Ausführungsform der Erfindung und Ablauf des Verfahrens unter Nutzung der GENIOM®-Plattform dargestellt:
1. Design eines Mikroarrays aus 6.000 verschiedenen 30-40meren, insbesondere 30meren oder 40meren Nukleinsäurefragmenten in einem GENIOM®-Gerät. Bei dem Design des Mikroarrays wird die Anzahl der Synthesespots pro Sequenz zwischen 1 und 100 (in einfachen Schritten) gewählt, wobei Nukleinsäurefragmente (Oligos) mit geprüfter oder vorhergesagter schwächerer Bindung relativ zu anderen Sequenzen, die später an einer Zusammenlagerung teilnehmen, mit einer um vorzugsweise 50 % oder mehr größeren Anzahl an Synthesespots vertreten sind, als mindestens eine andere Oligo-Sequenz, um den prozentualen Anteil im Gemisch zu erhöhen und so die entsprechenden Hybride gegenüber den stärker bindenden anderen Sequenzen zu fördern.
2. Anfügen einer generischen Primer-Sequenz von 10-15, insbesondere 10 oder 15 Basen an allen 6.000 Oligos, insbesondere jeweils an beiden Enden, so dass alle Sequenzen z.B. 60 Basen umfassen. Die Primersequenz kann so gewählt werden, dass eine PCR-Reaktion durch Hybridisierung von jeweils zwei Oligos mit komplementärer Sequenz möglich ist.
3. Herstellen des Mikroarrays anhand des Designs aus 1. und 2. durch Synthese im GENIOM®-Gerät.
4. Abspalten und Elution der Oligos aus dem Reaktionsträger. 5. PCR der Library unter Zugabe eines zu den unter 2 angefügten Primer- Sequenzen passenden Primerpaares. In der PCR entstehen z.B. 60mere, die jeweils ein Insert von z.B. 40 Basen mit wahlfreier Sequenz und einheitliche Sequenzen an beiden Enden tragen können. 6. Abspalten der Primer-Sequenz. 7. Inkubation der resultierenden 30-40mer Library bzw. der 30mer oder 40mer Library mit neuen PCR-Reagenzien unter Zugabe eines Primerpaares, welches z.B. nur an im Hybrid um mindestens 2 Fragmente auseinander liegenden Sequenzen bindet und somit zu einer „nested PCR" eines längeren Fragments führt (eine direkte Zusammenlagerung und PCR Amplifikation eines synthetischen Gens ist dem Fachmann durch Publikationen bekannt).
8. Weitere Bearbeitung oder Lagerung des resultierenden Vervielfältigungsproduktes (Amplikon). In einer Ausführungsform wird das Amplikon unter Nutzung eines Plasmids in Bakterien kloniert und nach Anwachsen von Klonen eine Anzahl von 10 Klonen oder 10 Inserts in den Klonen sequenziert. Das sequenzgeprüfte synthetische Gen steht zur Verfügung. Im Stand der Technik ist bekannt, dass die Nutzung von unterschiedlichen Mengenverhältnissen der einzelnen Oligonukleotide zueinander für eine Zusammenlagerung von synthetischen Genen die Rate an korrekten Sequenzen erhöht (Gao, X et al., Nucleic Acids Research, 2003, VoI 31 ; No.22; P:143). Die Stöchiometrie der Oligonukleotide hat einen Einfluss auf die thermodynamischen Parameter und wirkt sich durch das Massenwirkungsgesetz aus.
In der bevorzugten Ausführungsform und in einer Reihe der eingangs beschriebenen Herstellverfahren für die Herstellung von Mikroarrays in situ kann das Design, d.h. die konkrete Beladung und Zuweisung von Fläche und Lokation auf dem Reaktionsträger für eine einzelne Oligonukleotid-
Spezies, flexibel gewählt werden und somit auch die Menge der einzelnen
Oligonukleotide. Grundsätzlich ist dies mit allen dem Fachmann bekannten und eingangs aufgelisteten in situ Syntheseverfahren möglich. Besonders bevorzugt für die Ausführungsformen der Erfindung sind solche Verfahren, die flexibel programmiert werden können und keine Änderung physischer
Teile im Produktionsaufbau erfordern. Hier sind z.B. vor allem die ink jet
Spotting Verfahren, die Projektions-Verfahren und die elektrochemische Methode nach Combimatrix vorteilhaft.
Die Menge der einzelnen Oligonukleotide ist entsprechend nach Ablösen und Elution der Oligos auch in dem Pool an diversen Oligo-Spezies in Lösung steuerbar. Bei Verwendung von Projektionstechnologie für die Synthese auf dem Reaktionsträger kann die Mengenverteilung über die Anzahl der Mikrospiegel oder Projektionselemente (Belichtungspixel) eingestellt werden. Dem Fachmann ist aus diesem Beispiel ersichtlich, dass auch bei anderen Verfahren in Analogie das Design die Mengen bestimmt. So wird zum Beispiel bei einem photolithographischen Verfahren über die Fläche der Syntheseplätze die Menge bestimmt, bei einer indirekten, über Photosäuren arbeitenden Methode über die Anzahl an physisch abgetrennten Reaktionsplätzen, die für eine Sequenz verwendet werden. Die Einstellung und Steuerung der Mengenverhältnisse kann durch einen Anwender oder durch eine Software erfolgen. Durch eine entsprechende Software können Vorgaben für die Einstellung der Mengenverhältnisse programmiert werden. Dadurch kann der Prozess an bestimmten Stellen automatisiert werden. Die Vorgaben können aus theoretischen Modellen, Bioinformatik, Sequenz-Vergleichen, empirischen Daten oder Informationen in Datenbanken abgeleitet sein.
Für die empirische Bestimmung und für die Ermittlung der optimalen Anzahl an Syntheseeinheiten pro Sequenz, in einer bevorzugten Ausführungsform an Mikrospiegeln in einer Projektionseinheit, kann eine
Hybridisierungsreaktion auf einem Mikroarray verwendet werden. Dazu werden die in Lösung befindlichen ausgewählten Oligos auf einen
Mikroarray hybridisiert, der solche Sequenzen enthält, wie sie für die Zusammenlagerung als jeweils komplementäre Gegenparts auf den jeweils korrespondierenden Oligos vorgesehen sind. Diese Analyse simuliert die
Zusammenlagerungsreaktion. Das Ergebnis kann in einer Ausführungsform durch Fluoreszenzmarker, die direkt oder indirekt an den in Lösung befindlichen Oligos befestigt sind, ermittelt werden. Die Signale von einzelnen Analyse-Spots kann man dann relativ zueinander auswerten oder quantifizieren. Als Ergebnis dieser Analyse kann das Mengenverhältnis durch Veränderung des Synthese-Design angepasst werden.
Die Anpassung der Mengenverhältnisse verbessert die Bindungsbedingungen für Oligos mit erhöhter Menge in dem Gemisch, und inhärent vergleichsweise niedrigere Bindungsstärken werden ausgeglichen. Die Wahrscheinlichkeit für die korrekte Einlagerung in das Gesamtensemble von Oligos, die an der Reaktion teilnehmen, wird für alle Oligos equilibriert.
Eine vergleichsweise niedrigere Bindungsstärke eines Oligos mit einer passenden Sequenz auf einem zweiten Oligo kann neben weiteren Parametern durch die Basenzusammensetzung, vor allem durch den AT- Anteil (wenn nur natürliche Basen verwendet werden), durch die Neigung zu Sekundärstrukturen oder durch weitere Interaktionen mit anderen Oligos in dem Gemisch verursacht sein.
In einer Ausführungsform ist die Vervielfältigung der abgelösten Oligonukleotide Bestandteil des Verfahrens.
Die Oligonukleotide oder ein Teil davon können mit generischen 5'- und/oder 3'-Sequenzen, angefügt an die Sequenz der herzustellenden Nukleinsäure, synthetisiert werden, so dass anschließend eine Amplifikation der Oligonukleotide oder eines Teils davon erfolgen kann. Die Amplifikations- bzw. Primersequenzen sind komplementär zu entsprechenden Amplifikationsprimem und können eine oder mehrere Spaltungsstellen, vorzugsweise Typll-Spaltungsstellen, enthalten. Diese Spaltungsstellen ermöglichen eine Abspaltung der Primersequenzen nach der Amplifikation, z.B. durch PCR. Auf einem Träger können mehrere Paare von Amplifikationsprimersequenzen verwendet werden, um eine Multiplex- Amplifikation, z.B. PCR, in einer Oligonukleotidbibliothek zu ermöglichen. Dies bedeutet, dass Subpopulationen der Oligonukleotidfragmente spezifische, aber unterschiedliche Amplifikationssequenzen oder Paare von Amplifikationssequenzen enthalten können. Die Amplikons können aufgereinigt oder direkt für die Amplifikationsreaktion, z.B. für die PCR, eingesetzt werden.
In dieser Ausführungsform kann das Verfahren zur selektiven Amplifikation einer Subpopulation der von Träger stammenden Sequenzen verwendet werden. Dabei wird auch die Vervollständigung von Nukleinsäurefragmenten ermöglicht, die nach der Synthese nicht in Volllängenform waren. Die Amplifikationen können direkt in den Mikrokanälen des Trägers oder/und vom Träger getrennt in einem geeigneten Reaktionsgefäß erfolgen. Auf diese Weise kann die Menge der für die Gensynthese verfügbaren Nukleinsäurefragmente signifikant erhöht werden. Weiterhin werden die während der Synthese entstandenen verkürzten Fragmente, welche die Assemblierungsreaktion hemmen können, verdünnt und liegen im Vergleich zu den amplifizierten Volllängenfragmenten in vernachlässigbaren Konzentrationen vor. Damit kann auch die Erhöhung des Anteils an Volllängenfragmenten in einem für die Gensynthese vorgesehenen Gemisch durch die vorgeschaltete Amplifikation und damit Verdünnung von verkürzten Syntheseprodukten Bestandteil dieser Ausführungsform sein.
In noch einer weiteren - gegebenenfalls unabhängigen - Ausführungsform kann eine Isolierung von Nukleinsäurefragmenten mit der gewünschten korrekten Sequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäuren erfolgen. Hierzu können beispielsweise bekannte Techniken, wie emulsionsbasierte PCR oder Einzelmolekülarrays, verwendet werden, bei denen klonale Molekülpopulationen oder Einzelmoleküle aus einem Gemisch von DNA- Fragmenten isoliert und sequenziert werden können. Durch Anwendung derartiger Verfahren während des Gensyntheseverfahrens kann das assemblierte Gen „monoklonalisiert" und jedes der einzelnen Fragmente separat sequenziert werden. Nach Sequenzverifikation kann das Fragment mit der gewünschten Sequenz identifiziert, isoliert und weiter prozessiert werden, z.B. durch Klonierung, DNA-basierende Assays, in vitro Proteinexpression etc. Das Gemisch von DNA-Fragmenten kann ein PCR- Produkt, ein Ligationsprodukt oder eine Oligonukleotidbibliothek sein.
Bekannt sind dem Fachmann Verfahren, bei denen eine emulsionsbasierte PCR gleichzeitig noch in den Micellen bzw. wässrigen Kompartimenten vorzugsweise jeweils ein Bead oder Partikel enthalten. Diese sind in besonders optimierten und für die Erfindung bevorzugten Varianten kleiner als 1 mm im Durchmesser. Bekannt ist z.B. das Verfahren der Firma 454, das die Sequenzierung von Abschnitten im Bereich 200 bis 300 Basen (Stand 2006) ermöglicht. Dabei wird DNA in kleinere Abschnitte fragmentiert und diese dann mit einheitlichen Linker- oder Adapter-Sequenzen durch Ligation ergänzt. Dieses Gemisch wird mit den beschriebenen Beads in einer Emulsions-PCR inkubiert. Die Primer für die PCR-Reaktion befinden sich auf den Beads als feste Phase. Als Reaktionsergebnis liegt eine Vielzahl von Beads vor, die jeweils klonal nur ein Fragment aus dem zuvor fragmentierten DNA-Material kovalent an der Oberfläche tragen. Im nächsten Schritt werden die Beads in einem Reaktionsträger immobilisiert, der zu den Beads und ihrer Größe passende Kavitäten enthält, und dann durch eine dem Fachmann bekannte so genannte Sequencing by synthesis Reaktion parallel die Sequenzen auf jedem der Beads erfasst.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren oder in einer gegebenenfalls unabhängigen Ausführungsform können aus den Oligos aus der parallelen Synthese zunächst ein oder mehrere Assemblierungsreaktionen zusammengestellt werden. Die Zielsequenzen sind in einer Ausführungsform bei Nutzung der Emulsion-Bead-PCR entsprechend den Leseweiten der Sequenzierreaktion zu wählen und damit bevorzugt 10 bis 1.000 Nukleotide lang, besonders bevorzugt 40 bis 500. Der Vorteil dieser Ausführungsform liegt nun darin, ein Gemisch von assemblierten Sequenzen, die jeweils aus 2 oder mehr Oligos aufgebaut wurden und die möglicherweise Fehlstellen enthalten, in dem oben ausgeführten Verfahren auf den Beads zu klonalen Populationen zu amplifizieren und diese dann zu sequenzieren. Damit können in einer bevorzugten Ausführungsform Klonierung und Qualitätskontrolle der Zielsequenzen in einem Schritt zusammengefasst werden. Durch die Immobilisierung im Träger bei der Sequenzierung wird eine Lokalisation bewirkt. Es können diejenigen DNA- Zielsequenzen mit Sequenzen, die einem vorgegebenen Kriterium entsprechen, in einem nächsten Schritt entnommen werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt eine Markierung durch ortsaufgelöste Zugabe eines Markers, z.B. eines spezifisch oder unspezifisch bindenden optischen Markers, wie z.B. einem Interkalator (Sybergreen).
Eine gegebenenfalls unabhängige Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur insbesondere parallelen Sequenzierung von mindestens einer Nukleinsäure in einem Gemisch umfassend assemblierte Nukleinsäuren, welche möglicherweise fehlerhafte Nukleotide enthalten, umfassend die Schritte: (a) Amplifizieren eines Gemisches umfassend assemblierte Nukleinsäuren, die jeweils aus 2 oder mehr Nukleinsäurefragmenten aufgebaut sind, zu klonalen Populationen,
(b) Sequenzieren mindestens einer klonalen Populationen aus Schritt (a) und
(c) gegebenenfalls Isolieren mindestens einer Nukleinsäure, welche Fehler enthält, oder/und mindestens einer Nukleinsäure, welche korrekt ist.
Die Isolation erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform durch Isolation von einem oder mehreren der Beads. In einer alternativen Ausführungsform erfolgt die Isolation durch selektive Amplifikation mittels ortsaufgelöster
Zugabe von PCR-Reagenzien. In einer alternativen Ausführungsform erfolgt eine Markierung durch ortsaufgelöste Zugabe eines Markers, z.B. eines spezifisch oder unspezifisch bindenden optischen Markers, wie z.B. eines Interkalators (Sybergreen), und anschließende Eluation mittels Laser
Capture Methode, die dem Fachmann aus der Isolation einzelner Zellen bekannt ist.
Unerwünschte oder als fehlerhaft erkannte Klone (Beads) können physisch eliminiert werden. Dies kann in einer Ausführungsform durch selektive
Behandlung mit einer starken Lichtquelle wie einem Laser geschehen.
Alternativ kann eine weitere Immobilisierung oder Derivatisierung erfolgen, z.B. in einer lichtabhängigen Reaktion, z.B. eine Vernetzung, kovalente
Modifikation oder die Anbindung eines Moleküls, das eine Extraktion oder Eliminierung unterstützt. So können Beads mit unerwünschter Sequenz bei der weiteren Verwertung des sequenzierten Produktes bzw. der Vielzahl an
Produkten selektiv ausgeschlossen werden.
Die eluierten, isolierten oder anderweitig für weitere Schritte verfügbar gemachten erwünschten Zielsequenzen können ihrerseits zum Aufbau noch längerer Zielsequenzen eingesetzt werden. Sie können auch als Gemisch für nachfolgende Verfahrensschritte eingesetzt werden. In einer Ausführungsform werden alle als notwendig erachteten Bestandteile eines Genoms in diesem Verfahren hergestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden diese DNA-Abschnitte in einem nachfolgenden Schritt in einen Zielorganismus eingebracht, der daraus in vivo ein assembliertes Genom aufbaut. Ein besonders bevorzugter Zielorganismus ist Deinococcus radiodurans (auch als Micrococcus radiodurans bekannt), der sein eigenes Genom nach Fragmentierung, z.B. ionisierender Strahlung, in Fragmente kleiner als 10.000 Basen in vivo assemblieren kann.
Die Beads können isoliert oder im Sequzenzier-Reaktionsträger gelagert und zu einem späteren Zeitpunkt erneut eingesetzt werden.
Die Gewinnung der klonalen Sequenzen kann eine Ablösung oder eine Kopie ohne Zerstörung der kovalenten Anknüpfung an den Bead erfolgen. Mit Kopie ohne Zerstörung der kovalenten Anknüpfung an den Bead steht ein Bead später für eine erneute Gewinnung der klonalen Sequenzen zur Verfügung.
Parallele Sequenziermethoden wie die oben beschriebene eignen sich für die Überprüfung von Gemischen an Oligonukleotiden, wie sie als Teil der
Erfindung und als Ausgangsmaterial für die Gensynthese beschrieben sind.
In einer weiteren - gegebenenfalls unabhängigen - Ausführungsform wird die Zusammensetzung einer Bibliothek von Oligos aus einem parallelen
Syntheseverfahren wie dem erfindungsgemäßen Verfahren in einem parallelen Sequenzierverfahren mit mindestens 100, vorzugsweise mit 1.000 bis 10.000, besonders bevorzugt mit 10.000 bis 100.000 und insbesondere mit 100.000 bis 100 Millionen parallelen Sequenzierreaktionen überprüft.
Dem Fachmann sind weitere Sequenzierverfahren bekannt, welche in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, so z.B. die Herstellung von so genannten Polonies als klonale DNA auf einem Reaktionsträger und nachfolgende Sequenzierung mittels Sequencing by synthesis Reaktion oder mittels Sequencing by ligation. Produkte, die diese Verfahren nutzen, sind u.a. erhältlich von der Firma Applied Biosystems (ABI, USA) unter dem Namen Solid sowie von der Firma Solexa/Illumina (USA). Eine spezielle Ausführungsform mit besonders sensitivem Nachweis ist das „true Single molecule sequencing" (tSMS) von der Firma Helicos (USA), das ebenfalls parallel abläuft und somit ebenfalls für die Erfindung eingesetzt werden kann.
In Kombination mit der weiter oben ausgeführten Auswahl der Anzahl an Synthesekapazität, z.B. Belichtungspixeln, kann eine Steuerungs- oder Regelungslogik als Teil der Erfindung zum Einsatz kommen. Die hohe Parallelität der hier umfassten Sequenziermethoden erlaubt die Erfassung großer Datenmengen und damit die rationelle Anpassung von Syntheseparametern, um so den Anteil an verwertbaren Zielsequenzen anhand definierter Kriterien, z.B. Anteil korrekter Zielsequenzen, vorzunehmen.
Eine - gegebenenfalls unabhängige - weitere Ausführungsformen der Erfindung betrifft die Erzeugung von Bibliotheken, die eine Vielzahl von Varianten eines Gens enthalten, durch Synthese multipler Varianten von einem oder mehreren der Nukleinsäurefragmente auf dem Träger vor der Genassemblierung .
Noch eine weitere - gegebenenfalls unabhängige - Ausführungsform der Erfindung betrifft die enzymatische Abspaltung der Nukleinsäurefragmente vom Träger.
Noch eine weitere - gegebenenfalls unabhängige - Ausführungsform der Erfindung betrifft die Aufreinigung einer Bibliothek von Nukleinsäurefragmenten durch Rehybridisierung auf einem Träger, welcher die komplementären Sequenzen enthält.
Noch eine weitere - gegebenenfalls unabhängige - Ausführungsform der Erfindung betrifft die Anfügung primerspezifischer DNA-Sequenzen an die Nukleinsäurefragmente, welche das 5 -Ende und das 3'-Ende des zu synthetisierenden Nukleinsäuredoppelstrangs bilden. Auf diese Weise können mehrere aufeinander folgende Reaktionen mit dem gleichen Primerpaar durchgeführt werden. Außerdem können unterschiedliche Gene aus unterschiedlichen Trägern gleichzeitig mit denselben Primern amplifiziert werden, wodurch das Verfahren automatisiert wird.
Noch eine weitere - gegebenenfalls unabhängige - Ausführungsform der Erfindung betrifft die Erzeugung synthetischer Targetnukleinsäuren für Standard-Mikroarrayanalyseverfahren, z.B. von Sonden, die auf Standard- Mikroarrays immobilisiert werden.
Die zuvor genannten Ausführungsformen können selbstverständlich miteinander kombiniert werden.
Generell können alle Reaktionsträger und festen Phasen für das erfindungsgemäße Verfahren genutzt werden, für die eine Synthese einer Matrix aus Nukleinsäurepolymeren möglich ist.
Dazu gehören als beispielhafte Vertreter die folgenden, dem Fachmann bekannten Reaktionsträger-Formate und festen Phasen: Flacher Reaktionsträger, auch „Chip" genannt,
- Poröser Träger,
- Reaktionsträger mit Elektroden, - Reaktionsträger mit temporär oder permanent immobilisierter fester Phase aus Partikeln oder Beads, Mikrofluidischer Reaktionsträger,
Oberflächen-Modifikation: Gele, Linker, Spacer, Polymere, amorphe Schichten, 3D-Matrizes.
Einige dieser Reaktionsträger können in Kombination verwendet werden, z.B. ein mikrofluidischer Reaktionsträger mit porösen Oberflächen. Der Aufbau der DNA-Sonden findet vorzugsweise durch lichtgesteuerte in situ Synthese auf einem mikrofluidischen Träger, z.B. in einem GENIOM® one Instrument (febit biotech GmbH) unter Verwendung geeigneter Schutzgruppenchemie in einer dreidimensionalen Mikrostruktur statt. In einem zyklischen Syntheseprozess wechseln sich Belichtungen und Kondensationen der Nukleotide so lange ab, bis an jeder Position des Arrays in den Mikrokanälen die gewünschte DNA-Sequenz vollständig aufgebaut wurde. Auf diese Weise können z.B. bis zu 48.000 Oligonukleotide mit einer Länge von z.B. bis zu 60 Einzelbausteinen hergestellt werden. Die Oligonukleotide können dabei kovalent an ein Spacermolekül, einen chemischen Abstandhalter auf der Glasoberfläche des Reaktionsträgers binden. Die Synthese verläuft softwaregesteuert und ermöglicht eine hohe Flexibilität beim Aufbau des Arrays, den der Anwender damit seinen Bedürfnissen entsprechend individuell konfigurieren kann. So können z.B. die Länge der Oligonukleotide, die Zahl der erzeugten Nukleinsäure-Sonden oder interne Kontrollen optimal auf das jeweilige Experiment abgestimmt werden.
In einer Ausführungsform werden qualitativ hochwertige und in der Sequenz frei programmierbare Nukleinsäuren in Form von Oligonukleotiden mit 10- 200 Basen Länge kostengünstig und effizient in einer Vielfalt von 10 oder mehr unterschiedlichen Sequenzen bereitgestellt, um synthetische kodierende doppelsträngige DNA (synthetische Gene) herzustellen.
Der Aufbau von doppelsträngiger DNA aus Oligonukleotiden ist seit den 60er Jahren des letzten Jahrhunderts bekannt (Arbeiten von Khorana und anderen; siehe „Shabarova: Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids", VCH Weinheim). Er geschieht in der Mehrzahl der Fälle mit einem von zwei Verfahren (siehe Holowachuk et. al., PCR Methods and Applications, CoId Spring Harbor Laboratory Press).
Einmal erfolgt die Synthese des gesamten Doppelstrangs durch Synthese von einzelsträngigen Nukleinsäuren (geeigneter Sequenz), Aneinanderlagerung durch Hybridisieren komplementärer Bereiche dieser Einzelstränge und Verbinden des molekularen Rückgrats durch Enzyme, meist Ligase.
Demgegenüber gibt es auch die Möglichkeit einer Synthese von an den Rändern überlappenden Bereichen als einzelsträngige Nukleinsäuren, Aneinanderlagerung durch Hybridisieren, Auffüllen der einzelsträngigen Bereiche durch Enzyme (Polymerasen) und dann Verbinden des Rückgrats durch Enzyme, meist Ligase.
Ein bevorzugter Ablauf einer Gensynthese gemäß der Erfindung ist wie folgt: Allgemein wird im Rahmen eines modularen Systems eine Synthese vieler einzelner Nukleinsäurestränge durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur hochparallelen DNA-Synthese auf Matrizenbasis durchgeführt. Es entstehen als Reaktionsprodukte Sets von Nukleinsäuren, die als Bausteine in einem nachgeschalteten Prozess dienen. Damit wird eine Sequenz-Matrix erzeugt, die über 100.000 unterschiedliche Sequenzen enthalten kann. Die Nukleinsäuren liegen in einzelsträngiger Form vor und können aus dem Träger eluiert werden oder direkt im Reaktionsträger zur Reaktion gebracht werden. Durch wiederholtes Kopieren in einem oder mehreren Arbeitsgängen kann die Matrize mehrfach abgeschrieben werden, ohne diese zu zerstören, und gleichzeitig wird eine Vermehrung der jeweiligen in der Matrix kodierten Sequenzen erreicht. Wie an anderer Stelle ausführlicher beschrieben, kann durch Kopieren von distal nach proximal dabei auch der Anteil an verkürzten Nukleinsäurepolymeren an der festen Phase ausgeblendet werden, wenn distal die Kopier-Initiationsstelle liegt. Eine Beispiel hierfür ist eine distal angefügte Promoter-Sequenz.
Der Träger mit der Matrix an festphasengebundenen Molekülen kann für spätere erneute Verwendung aufbewahrt werden. Somit wird in einer effizienten Weise die Vielfalt an Sequenzen, die in einem Reaktionsträger durch eine in situ Synthese erzeugt wurde, für weitere Prozessschritte zur Verfügung gestellt. Gleichzeitig kann durch das Design der Kopierreaktion eine hohe Qualität der abgeschriebenen Sequenzen erzielt werden.
Danach werden geeignete Kombinationen der abgelösten DNA-Stränge gebildet. Die Zusammenlagerung der einzelsträngigen Bausteine zu doppelsträngigen Bausteinen erfolgt innerhalb eines Reaktionsraums, der in einem einfachen Ansatz ein übliches Reaktionsgefäß, z.B. ein Plastikröhrchen, sein kann. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Reaktionsraum Teil des Reaktionsträgers, der in einer Variante ein mikrofluidischer Reaktionsträger sein kann, in dem die notwendigen Reaktionen ablaufen. Ein weiterer Vorteil eines integrierten mikrofluidischen Reaktionsträgers ist die Möglichkeit der Integration weiterer Prozessschritte, wie z.B. eine Qualitätskontrolle durch optische Analytik. In einer Ausführungsform hat bereits die Synthese der Matrix in einem mikrofluidischen Träger stattgefunden, der dann gleichzeitig als Reaktionsraum für die nachgeschaltete Zusammenlagerung nutzbar ist.
Die Sequenz der einzelnen Bausteine wird dabei so gewählt, dass beim Inkontaktbringen der einzelnen Bausteine zueinander komplementäre Bereiche an den beiden zusammengebrachten Enden zur Verfügung stehen, um durch Hybridisierung dieser Bereiche eine spezifische Aneinanderlagerung von DNA-Strängen zu ermöglichen. Damit entstehen längere DNA-Hybride. Das Phosphodiester-Rückgrat des DNA-Moleküls wird durch Ligasen geschlossen. Sollten die Sequenzen so gewählt werden, dass in diesen Hybriden einzelsträngige Lücken bestehen, so werden diese Lücken in bekannter Vorgehensweise enzymatisch mittels Polymerasen aufgefüllt. (z.B. Klenow-Fragment oder Sequenase). So entstehen längere doppelsträngige DNA-Moleküle. Sollte es für die weitere Verwendung notwendig sein, diese verlängerten DNA-Stränge als Einzelstränge vorzulegen, so kann dies mit den dem Fachmann bekannten Verfahren zum Aufschmelzen von DNA-Doppelsträngen geschehen, wie z.B. Temperatur oder Alkali.
Durch die Zusammenführung von Clustern an derart synthetisierten DNA- Strängen innerhalb von Reaktionsräumen können wiederum längere Teilsequenzen des finalen DNA-Moleküls erzeugt werden. Dies kann stufenweise geschehen, und die Teilsequenzen werden dabei zu immer längeren DNA-Molekülen zusammengesetzt. Auf diese Weise lassen sich sehr lange DNA-Sequenzen als vollsynthetisches Molekül mit einer Länge von über 100.000 Basenpaaren erzeugen. Dies entspricht bereits dem Größenbereich eines Bacterial Artificial Chromosome BAC. Für den Aufbau einer Sequenz von 100.000 Basenpaaren aus überlappenden Bausteinen von 20 Nukleotiden Länge werden 10.000 individuelle Bausteine benötigt.
Dies kann mit den meisten der eingangs beschriebenen hochparallelen Synthese-Verfahren geleistet werden. Besonders bevorzugt sind für das erfindungsgemäße Verfahren dabei diejenigen Technologien, die den Array aus Nukleinsäurepolymeren in einer weitgehend frei programmierbaren Weise erzeugen und nicht auf das Einrichten von technischen Komponenten, wie z.B. photolithographischer Masken, angewiesen sind. Demnach sind besonders bevorzugte Ausführungsformen auf die projektorbasierte lichtgestützte Synthese, die indirekte projektorbasierte lichtgesteuerte Synthese mittels Photosäuren und Reaktionskammern in einem mikrofluidischen Reaktionsträger, die elektronisch induzierte Synthese mittels ortsaufgelöster Deprotektion an einzelnen Elektroden auf dem Träger und die fluidische Synthese mittels ortsaufgelöster Deposition der aktivierten Synthese-Monomere aufgebaut.
Für die rationelle Bearbeitung genetischer Moleküle und die systematische Erfassung aller möglichen Varianten müssen die Bausteine in ihrer individuellen Sequenz flexibel und ökonomisch hergestellt werden. Dies leistet das Verfahren durch den Einsatz einer programmierbaren Lichtquellenmatrix für die lichtabhängige ortsaufgelöste in situ Synthese der DNA-Stränge, die als Bausteine Verwendung finden. Diese flexible Synthese erlaubt die freie Programmierung der individuellen Sequenzen der Bausteine und damit auch die Erzeugung von beliebigen Varianten der Teilsequenzen oder der finalen Sequenz, ohne dass damit wesentliche Veränderungen von Komponenten des Systems (Hardware) verbunden wären. Nur durch diese programmierte Synthese der Bausteine und damit der finalen Syntheseprodukte kann die Vielfalt genetischer Elemente systematisch bearbeitet werden. Gleichzeitig erlaubt die Verwendung der computergesteuert programmierbaren Synthese die Automatisierung des gesamten Prozesses inklusive der Kommunikation mit entsprechenden Datenbanken.
Die Auswahl der Sequenz der einzelnen Bausteine kann bei Vorgabe der Zielsequenz rationell unter Berücksichtigung von biochemischen und funktionellen Parametern erfolgen. Dabei sucht ein Algorithmus nach Eingabe der Zielsequenz (z.B. aus einer Datenbank) die geeigneten Überlappungsbereiche heraus. Je nach der Aufgabenstellung können unterschiedlich viele Teilsequenzen erstellt werden, und zwar innerhalb eines zu belichtenden Reaktionsträgers oder auf mehrere Reaktionsträger verteilt. Die Anlagerungsbedingungen für die Bildung der Hybride, wie z.B. Temperatur, Salzkonzentration etc., werden durch einen entsprechenden Algorithmus auf die zur Verfügung stehenden Überlappungsbereiche abgestimmt. So wird eine maximale Spezifität der Aneinanderlagerung gewährleistet. Die Daten für die Zielsequenz können in einer vollautomatischen Version auch direkt aus öffentlichen oder privaten Datenbanken entnommen und in entsprechende Zielsequenzen umgewandelt werden. Die entstehenden Produkte können wiederum optional in entsprechend automatisierte Abläufe eingespeist werden, z.B. in die Klonierung in geeigneten Zielzellen.
Der stufenweise Aufbau durch Synthese der einzelnen DNA-Stränge in Reaktionsbereichen innerhalb umgrenzter Reaktionsräume erlaubt auch den Aufbau schwieriger Sequenzen, z.B. solche mit internen Wiederholungen von Sequenzabschnitten, wie sie z.B. bei Retroviren und entsprechenden retroviralen Vektoren vorkommen. Durch die Ablösung der Bausteine innerhalb der fluidischen Reaktionsräume kann eine Synthese beliebiger Sequenz erfolgen, ohne dass Probleme durch die Zuordnung der überlappenden Bereiche auf den einzelnen Bausteinen entstehen.
Die hohen Qualitätsanforderungen, die beim Aufbau sehr langer DNA- Moleküle notwendig sind, werden u.a. durch die Verwendung einer Echtzeit- Qualitätskontrolle erfüllt. Dabei wird die ortsaufgelöste Synthese der Bausteine überwacht, ebenso die Ablösung und die Zusammenlagerung bis hin zur Erstellung der finalen Sequenz. Dann laufen alle Prozesse in einem lichtdurchlässigen Reaktionsträger ab. Des Weiteren wird die Möglichkeit geschaffen, im Durchlicht Reaktionen und fluidische Vorgänge durch z.B. eine CCD-Detektion zu verfolgen.
Der miniaturisierte Reaktionsträger wird so ausgeführt, dass ein Ablösevorgang in den einzelnen Reaktionsräumen möglich ist, und somit die auf den innerhalb dieser Reaktionsräume liegenden Reaktionsbereichen synthetisierten DNA-Stränge in Clustern abgelöst werden. Bei geeigneter Ausführung des Reaktionsträgers ist die Zusammenlagerung der Bausteine in einem stufenweisen Prozess in Reaktionsräumen möglich, außerdem die Entnahme von Bausteinen, Teilsequenzen oder des finalen Produktes, oder auch die Sortierung bzw. Auftrennung der Moleküle.
Die Zielsequenz kann nach ihrer Fertigstellung als integriertes genetisches Element durch Transfer in Zellen eingebracht und dadurch Moniert und im Zuge funktioneller Studien untersucht werden. Eine weitere Möglichkeit ist es, das Syntheseprodukt zuerst weiter aufzureinigen oder zu analysieren, wobei diese Analyse z.B. eine Sequenzierung sein kann. Der Prozess der Sequenzierung kann auch durch direkte Kopplung mit einem entsprechenden Gerät beginnen, z.B. mit einer nach dem in der Patentanmeldung DE 19924 327 arbeitenden Vorrichtung zur integrierten Synthese und Analyse von Polymeren. Es ist ebenfalls denkbar, die erzeugten Zielsequenzen nach der Klonierung zu isolieren und zu analysieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt über die damit erzeugten integrierten genetischen Elemente ein Werkzeug zur Verfügung, das für die Weiterentwicklung der molekularen Biologie die biologische Vielfalt in einem systematischen Prozess erfasst. Die Erzeugung von DNA-Molekülen mit gewünschter genetischer Information ist damit nicht mehr der Engpass molekularbiologischer Arbeiten, da von kleinen Plasmiden über komplexe Vektoren bis zu Mini-Chromosomen alle Moleküle synthetisch erzeugt werden können und für weitere Arbeiten zur Verfügung stehen.
Das Herstellungsverfahren erlaubt die parallele Erzeugung von zahlreichen Nukleinsäuremolekülen und damit einen systematischen Ansatz für Fragestellungen betreffend Regulationselemente, DNA-Bindestellen für Regulatoren, Signalkaskaden, Rezeptoren, Wirkung und Interaktionen von Wachstumsfaktoren etc.
Durch die Integration von genetischen Elementen in eine vollsynthetische Gesamt-Nukleinsäure können die bekannten genetischen Werkzeuge, wie Plasmide und Vektoren, weiter genutzt und es kann so auf die entsprechenden Erfahrungen aufgebaut werden. Andererseits werden sich diese Erfahrungen durch die angestrebte Optimierung der vorhandenen Vektoren etc. rasch verändern. Die Mechanismen, die z.B. ein Plasmid für die Propagation in einem bestimmten Zelltyp geeignet machen, lassen sich auf der Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens erstmals rationell untersuchen.
Durch diese rationelle Untersuchung großer Varianten-Zahlen lässt sich der gesamte Kombinationsraum genetischer Elemente erschließen. Damit wird neben die zur Zeit in rascher Entwicklung befindliche hochparallele Analytik (u.a. auf DNA-Arrays oder DNA-Chips) als zweites wichtiges Element die programmierte Synthese integrierter genetischer Elemente geschaffen. Nur beide Elemente zusammen können das Fundament einer rationellen molekularen Biologie bilden.
Bei der programmierten Synthese von entsprechenden DNA-Molekülen ist nicht nur die beliebige Zusammensetzung der kodierenden Sequenzen und funktionellen Elemente möglich, sondern auch die Anpassung der Zwischenbereiche. Dies sollte rasch zu Minimal-Vektoren und Minimai- Genomen führen, womit wiederum Vorteile durch die geringere Größe entstehen. Übertragungsvehikel, wie z.B. virale Vektoren, können dadurch effizienter gemacht werden, z.B. bei Verwendung von retroviralen oder adenoviralen Vektoren.
Über die Kombination bekannter genetischer Sequenzen hinaus ist die Entwicklung neuer genetischer Elemente möglich, die auf der Funktion vorhandener aufbauen kann. Gerade für solche Entwicklungsarbeiten ist die Flexibilität des Systems von enormem Wert.
Die synthetischen DNA-Moleküle sind dabei auf jeder Stufe der Entwicklung des hier beschriebenen Verfahrens voll kompatibel mit der vorhandenen
Rekombinationstechnologie. Auch für „traditionelle" molekularbiologische
Anwendungen können integrierte genetische Elemente bereitgestellt werden, z.B. durch entsprechende Vektoren. Der Einbau entsprechender
Schnittstellen auch für bisher wenig verwendete Enzyme ist bei integrierten genetischen Elementen kein limitierender Faktor.
Ermöglicht wird mit diesem Verfahren die Integration aller gewünschten funktionellen Elemente als „genetische Module", wie z.B. Gene, Teile von Genen, Regulationselemente, virale Verpackungssignale etc., in das synthetisierte Nukleinsäuremolekül als Träger genetischer Information. Durch diese Integration ergeben sich u.a. folgende Vorteile:
Es können damit hochgradig funktionsintegrierte DNA-Moleküle entwickelt werden, wobei unnötige DNA-Bereiche wegfallen (Minimal-Gene, Minimal- Genome).
Die freie Kombination der genetischen Elemente sowie die Veränderungen der Sequenz, wie z.B. zur Anpassung an den exprimierenden Organismus/Zelltyp (Codonnutzung), werden ebenso ermöglicht wie Veränderungen der Sequenz zur Optimierung funktioneller genetischer Parameter, wie beispielsweise Genregulation.
Ebenfalls ermöglicht werden Veränderungen der Sequenz zur Optimierung funktioneller Parameter des Transkripts, z.B. Spleißen, Regulation auf mRNA-Ebene, Regulation auf Translationsebeπe, und darüber hinaus die Optimierung funktioneller Parameter des Genprodukts, wie z.B. die Aminosäuresequenz (z.B. Antikörper, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, Kanäle, Poren, Transporter etc.).
Darüber hinaus ist es möglich, Konstrukte zu erstellen, die über den RNAi- Mechanismus in die Genexpression eingreifen. Wenn solche Konstrukte für mehr als eine RNAi-Spezies kodieren, können in einem Multiplex-Ansatz mehrere Gene gleichzeitig inhibiert werden.
Insgesamt ist das mit dem Verfahren realisierte System extrem flexibel und erlaubt in bisher nicht vorhandener Weise die programmierte Erstellung von genetischem Material mit stark verringertem Aufwand an Zeit, Materialien und Arbeit.
Größere DNA-Moleküle, wie z.B. Chromosomen von mehreren hundert kbp, waren mit den vorhandenen Methoden nahezu nicht gezielt manipulierbar. Bereits komplexere (d.h. größere) virale Genome von mehr als 30 kbp (z.B. Adenoviren) sind mit den klassischen Methoden der Gentechnik schwierig zu handhaben und zu manipulieren.
Es kommt zu einer erhebliche Verkürzung bis zur letzten Stufe der Klonierung eines Gens: Das Gen oder die Gene werden als DNA-Molekül synthetisiert und dann (nach geeigneter Vorbereitung, wie Reinigung etc.) direkt in Zielzellen eingebracht und das Ergebnis studiert. Der mehrstufige, meist über Mikroorganismen, wie E.coli, laufende Klonierungsprozess (z.B. DNA-Isolation, Reinigung, Analyse, Rekombination, Klonierung in Bakterien, Isolation, Analyse etc.) wird damit auf die letzte Übertragung des DNA- Moleküls in die finalen Effektorzellen reduziert. Bei synthetisch hergestellten Genen oder Genfragmenten ist eine klonale Vermehrung in einem Zwischenwirt (zumeist E.coli) nicht mehr notwendig. Damit umgeht man die Gefahr, dass das für die Zielzelle bestimmte Genprodukt eine toxische Wirkung auf den Zwischenwirt ausübt. Damit hebt man sich deutlich ab von der Toxizität mancher Genprodukte, die bei der Verwendung klassischer Plasmid-Vektoren häufig zu erheblichen Problemen bei der Klonierung der entsprechenden Nukleinsäurefragmente führt.
Eine weitere erhebliche Verbesserung ist die Zeitverkürzung und die Reduktion der Arbeitsschritte, bis nach dem Sequenzieren von genetischem Material die dabei vorgefundenen potentiellen Gene als solche verifiziert und Moniert werden. Normalerweise werden nach Auffinden interessierender Muster, die als ORF in Frage kommen, mit Sonden (z.B. mittels PCR) in cDNA-Bibliotheken entsprechende Klone gesucht, die allerdings nicht die ganze Sequenz der ursprünglich bei ihrer Herstellung verwendeten Boten- RNA (messenger RNA, mRNA) enthalten müssen (Problem der „füll lenght clones"). Bei anderen Verfahren wird mittels eines Antikörpers in einer Expressions-Genbibliothek gesucht (Screening). Beide Verfahren lassen sich mit dem erfahrungsgemäßen Verfahren extrem abkürzen: bei Vorliegen einer „in silico" bestimmten Gen-Sequenz (d.h. nach der Erkennung eines entsprechenden Musters in einer DNA Sequenz durch den Computer), oder nach Entschlüsselung einer Proteinsequenz, kann ein entsprechender Vektor mit der Sequenz oder Varianten davon direkt über programmierte Synthese eines integrierten genetischen Elementes erzeugt und in geeignete Zielzellen eingebracht werden.
Die so erfolgende Synthese von DNA-Molekülen bis zu mehreren 100 kbp erlaubt die direkte Komplett-Synthese von viralen Genomen, z.B. Adenoviren. Diese sind ein wichtiges Werkzeug in der Grundlagenforschung (u.a. Gentherapie), aber wegen der Größe ihres Genoms (ca. 40 kbp) schwer mit klassischen Methoden der Gentechnik zu handhaben. Besonders die rasche und ökonomische Erzeugung von Varianten zur Optimierung ist dadurch stark limitiert. Diese Limitierung wird durch das erfindungsgemäße Verfahren aufgehoben.
Durch das Verfahren erfolgen die Integration der Synthese, die Ablösung der Syntheseprodukte und die Zusammenlagerung zu einem DNA-Molekül in einem System. Mit Herstellungsverfahren der Mikrosystemtechnik können alle notwendigen Funktionen und Verfahrensschritte bis zur Aufreinigung des finalen Produktes in einem miniaturisierten Reaktionsträger integriert werden. Dies können Synthesebereiche, Ablösungsbereiche (Cluster), Reaktionsräume, Zuführungskanäle, Ventile, Pumpen, Konzentratoren, Auftrennungsbereiche etc. sein.
Plasmide und Expressionsvektoren können für sequenzierte Proteine oder entsprechende Teilsequenzen direkt hergestellt und die Produkte biochemisch und funktionell analysiert werden, z.B. unter Verwendung geeigneter Regulationselemente. Damit fällt die Suche nach Klonen in einer
Gen-Bibliothek weg. Entsprechend können offene Leseraster („open reading frames" ORF) aus Sequenzierarbeiten (z.B. Humangenomprojekt) direkt in entsprechende Vektoren programmiert und mit gewünschten genetischen
Elementen kombiniert werden. Eine Identifikation von Klonen, z.B. in durch aufwendiges Screening von cDNA Bibliotheken, entfällt. Damit ist der
Informationsfluss von der Sequenz-Analyse zur Funktions-Analyse stark verkürzt worden, denn am selben Tag, an dem ein ORF durch Analyse von Primärdaten im Computer vorliegt, kann ein entsprechender Vektor inklusive des vermuteten Gens synthetisiert und zur Verfügung gestellt werden.
Gegenüber konventioneller Festphasen-Synthese zur Gewinnung synthetischer DNA zeichnet sich das Verfahren gemäß Erfindung durch geringeren Materialaufwand aus. Zur Herstellung tausender von unterschiedlichen Bausteinen für die Erzeugung von einem komplexen integrierten genetischen Element mit mehreren 100.000 kbp Länge, in entsprechend parallelisiertem Format und bei entsprechender Miniaturisierung (siehe Ausführungsbeispiele), braucht ein mikrofluidisches System deutlich weniger Einsatzstoffe als ein konventioneller Festphasensynthese-Automat für einen einzelnen DNA-Oligomer (bei Verwendung einer einzigen Säule). Hier stehen Mikroliter dem Verbrauch von Millilitern gegenüber, d.h. ein Faktor von 1000.
Unter Berücksichtigung neuester Erkenntnisse der Immunologie erlaubt das vorgestellte Verfahren ein extrem rationelles und schnelles Impfstoff-Design (DNA-Vakzine).

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren, insbesondere von Nukleinsäuredoppelsträngen, umfassend die Schritte:
(a) Herstellen einer Vielzahl von unterschiedlichen
Nukleinsäurefragmenten durch Festphasensynthese, vorzugsweise an verschiedenen Positionen eines gemeinsamen festen Trägers, und (b) Zusammenfügen von mindestens zwei Nukleinsäurefragmenten aus
(a) durch Bindung aneinander, wobei mindestens einige Nukleinsäurefragmente zur Modulation ihrer thermodynamischen Parameter in der Reaktion in einer gegenüber anderen Fragmenten gesteigerten Menge für Schritt (b) eingesetzt werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Festphasensynthese mittels Licht zwischen 300 nm und 800 nm gesteuert wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Steuerung mittels Licht und eines programmierbaren Projektors erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Projektion mittels einer Vielzahl von Spiegeln erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei der Träger eine Vielzahl von immobilisierten Partikeln enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei Nukleinsäurefragmente als Primer für Primer Extension Methoden, Strand Displacment Amplifikation, Polymerase Chain Reaction, Site Directed Mutagenesis oder/und Rolling Circle Amplifikation oder/und Nukleinsäurefragmente für die Herstellung von synthetischen Genen, von Genfragmenten, von Gen-Clustern, von Gen- Fähren, von Gen-Vektoren, von Chromosomen, von Genomen, von 5 optimierten Genomen, von minimalen Gen-Clustern, von minimalen
Genomen oder/und von vollsynthetischen Genomen hergestellt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Nukleinsäurefragmente als Mischungen mit gezielten oder/undo randomisierten Varianten von synthetischen Genen, von
Genfragmenten, von Gen-Clustern, von Gen-Fähren, von Gen-Vektoren, von Chromosomen, von Genomen, von optimieren Genomen, von minimalen Gen-Clustern, von minimalen Genomen und/oder von vollsynthetischen Genomen hergestellt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erzeugten Nukleinsäurefragmenten für die Genexpressions- Modulation mittels RNAi oder/und Antisense-Methoden eingesetzt werden, wobei noch eine Abschrift von Nukleinsäuren durch eine RNA-0 Polymerase vorgesehen sein kann.
9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erzeugten Nukleinsäurefragmente für die Herstellung, Extraktion, Aufreinigung, Isolation oder/und Vorbereitung von Analyten5 oder/und Proben (sample preparation) eingesetzt werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Analyten oder/und Proben für die Analyse durch Mikroarrays, durch Sequenzierverfahren, durch parallele Sequenzierverfahren, durcho Amplifikationsverfahren (Strand Displacment Amplifikation, Polymerase
Chain Reaction oder/und Rolling Circle Amplifikation) oder/und für die Analyse in einer Gelelektrophorese eingesetzt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die erzeugten Nukleinsäurefragmente für die Herstellung von Zielorganismen mit permanent oder temporär integrierten, transformierten, transfizierten oder/und anderweitig eingebrachten synthetischen Genen, Genfragmenten, Gen-Clustem, Gen-Fähren, Gen-
Vektoren, Chromosomen, Genomen, optimierten Genomen, minimalen Gen-Clustern, minimalen Genomen, vollsynthetischen Genomen oder/und von Mischungen mit gezielten oder/und randomisierten Varianten von synthetischen Genen, Genfragmenten, Gen-Clustern, Gen-Fähren, Gen-Vektoren, Chromosomen, Genomen, optimierten
Genomen, minimalen Gen-Clustern, minimalen Genomen oder/und vollsynthetischen Genomen eingesetzt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , wobei in den Zielorganismen die Produktion, die Verbesserung, die
Veränderung oder/und die Reduktion eines in dem Zielorganismus anfallenden Naturstoffes, z.B. einer Aminosäure-Kette, eines Proteins, einer organischen Substanz, eines Kohlenwasserstoffs, eines Pharmakons oder/und einer Vorstufe davon, einer Nukleinsäure oder/und eines Pheromons oder/und einer anderen Substanz für die
Bereitstellung eines von Menschen genutzten Gutes oder/und für eine Herstellung einer Substanz, die anschließend einer weiteren Nutzung zugeführt wird, umfasst ist.
13. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die erzeugten Nukleinsäurefragmente für die Validierung, die Referenzierung, die Kalibrierung oder/und den Test von Hybridisierungs- Assays, zugehörigen Reagenzien oder/und Kits mittels der erzeugten Nukleinsäurepolymeren in den Bereichen Mikroarrays, Biochips, Dot blots, Southem-Blots, Northern-Blots, Bead-Arrays, Serial Analysis of
Gene Expression (SAGE), PCR, real time PCR, Sequenzierung oder/und paralleler Sequenzierung eingesetzt werden.
14. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die erzeugten Nukleinsäurefragmente für die Herstellung von bindenden Agenzien wie Aptameren, Ribozymen, Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antikörperfragmenten, Antikörper-analog wirkenden 5 Peptiden oder/und Antikörper-analog wirkenden Proteinen eingesetzt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erzeugten Nukleinsäurefragmente für die Herstellung über die io Translation in vivo oder/und in vitro von Proteinen, Peptiden,
Glykoproteinen, Proteoglykanen oder/und Komplexen mit Peptid-Anteil, Protein-Anteil, RNA-Anteil oder/und DNA-Anteil, wie Ribosomen oder Proteasomen, eingesetzt werden.
i5 16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erzeugten Oligonukleotide, die Nukleinsäurefragmente oder/und die Zielsequenzen eine Markierung für eine direkte oder indirekte Erfassung mit einem Messgerät, z.B. einem optischen, magnetischen, elektrischen oder/und chemilumineszenten Messgerät
20 oder/und Messverfahren erhalten.
17. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die erzeugten Oligonukleotide, die Nukleinsäurefragmente oder/und die Zielsequenzen eine Markierung für eine direkte oder 25 indirekte Erfassung durch andere molekulare Strukturen wie z.B.
Enzyme, Rezeptoren, Proteine erhalten.
18. Verfahren nach Anspruch 1 , weiterhin umfassend die Isolation oder/und Extraktion der erzeugten 30 Oligonukleotide, der Nukleinsäurefragmente, der Zielsequenzen oder/und von daraus aufgebauten kovalent oder/und nicht-kovalent verbundenen Hybridsträngen.
19. Verfahren nach Anspruch 1 , weiterhin umfassend die Bindung der Oligonukleotide, der Fragmente, von daraus aufgebauten kovalent oder/und nicht-kovalent verbundenen Hybridsträngen oder/und der Zielsequenzen mittels Haptene oder anderer in einer molekularen Erkennungsreaktion einsetzbaren
Bausteine, einer funktionellen Gruppe oder/und einer Modifikation, die während einem der Schritte in die Nukleinsäuren eingebracht wird.
20. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend die Detektion der Oligonukleotide, der Fragmente, von daraus aufgebauten kovalent oder/und nicht-kovalent verbundenen Hybridsträngen oder/und der Zielsequenzen.
21. Verfahren nach Anspruch 1 , weiterhin umfassend den Abbau, die selektive Trennung, die Öffnung, die Degradation oder/und den enzymatischen Verdau der Oligonukleotide, der Fragmente, von daraus aufgebauten kovalent oder nicht-kovalent verbundenen Hybridsträngen oder/und der Zielsequenzen.
22. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend die Anlagerung der Oligonukleotide, der Fragmente, von daraus aufgebauten kovalent oder/und nicht-kovalent verbundenen Hybridsträngen oder/und der Zielsequenzen an eine Zielstruktur oder an Zielstrukturen in einem oder/und auf einem
Reaktionsträger, auf einem Glas-Objektträger, in einem Reaktionsgefäß, an einer Zielorganelle, an einer Zielzelle, an einem Zielorgan, an einem Organismus, an einer Oberfläche, an einer biologischen Oberfläche, an einem molelularen Komplex, an einem Chromosom, an einem Viruspartikel oder/und an einem Proteinkomplex.
23. Verfahren zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren, insbesondere von Nukleinsäuredoppelsträngen, umfassend die Schritte: (a) Herstellen einer Vielzahl von unterschiedlichen Nukleinsäurefragmenten durch Festphasensynthese, vorzugsweise an verschiedenen Positionen eines gemeinsamen festen Trägers, und (b) Zusammenfügen von mindestens zwei Nukleinsäurefragmenten aus
(a) durch Bindung aneinander, wobei mindestens einige Nukleinsäurefragmente, die einen hohen AT-
Gehalt aufweisen, in einer gegenüber anderen Fragmenten gesteigerten
Menge für Schritt (b) eingesetzt werden.
24. Verfahren zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren, insbesondere von Nukleinsäuredoppelsträngen, umfassend die Schritte:
(a) Herstellen einer Vielzahl von unterschiedlichen Nukleinsäurefragmenten durch Festphasensynthese, vorzugsweise an verschiedenen Positionen eines gemeinsamen festen Trägers, und
(b) Zusammenfügen von mindestens zwei Nukleinsäurefragmenten aus (a) durch Bindung aneinander, wobei das Verfahren Amplifikationsschritte umfasst, bei denen die synthetisierten Nukleinsäurefragmente oder/und daraus gebildete, gegebenenfalls doppelsträngige Zwischenprodukte einer Amplifikation, z.B. einer PCR, unterzogen werden.
25. Verfahren zur Ermittlung der Sequenz eines Polypeptids mit definierten Eigenschaften durch Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren mit der zugehörigen Sequenz, insbesondere von
Nukleinsäuredoppelsträngen, umfassend die Schritte:
(a) Herstellen einer Vielzahl von unterschiedlichen Nukleinsäurefragmenten durch Festphasensynthese, vorzugsweise an verschiedenen Positionen eines gemeinsamen festen Trägers, und
(b) Zusammenfügen von mindestens zwei Nukleinsäurefragmenten aus (a) durch Bindung aneinander, wobei mindestens einige Nukleinsäurefragmente zur Modulation ihrer thermodynamischen Parameter in der Reaktion, in einer gegenüber anderen Fragmenten gesteigerten Menge für Schritt (b) eingesetzt werden, wobei das Verfahren weiterhin umfasst:
(c) Einsetzen der Zielsequenz für die Herstellung des Polypeptids und
(d) Bestimmen der Eigenschaften des Polypeptids.
26. Polypeptid mit definierten Eigenschaften für den Einsatz als pharmazeutisch wirksame Substanz oder/und für den Einsatz bei der
Herstellung einer pharmazeutisch wirksamen Substanz, hergestellt durch Synthese von synthetischen Nukleinsäuren mit der das Polypeptid kodierenden Sequenz, insbesondere von Nukleinsäuredoppelsträngen, umfassend die Schritte: (a) Herstellen einer Vielzahl von unterschiedlichen
Nukleinsäurefragmenten durch Festphasensynthese, vorzugsweise an verschiedenen Positionen eines gemeinsamen festen Trägers,
(b) Zusammenfügen von mindestens zwei Nukleinsäurefragmenten aus (a) durch Bindung aneinander, wobei mindestens einige Nukleinsäurefragmente zur Modulation ihrer thermodynamischen Parameter in der Reaktion, in einer gegenüber anderen Fragmenten gesteigerten Menge für Schritt (b) eingesetzt werden, und wobei das Verfahren weiterhin umfasst:
(c) Herstellung des Polypeptids unter Einsatz dieser Sequenz.
27. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, insbesondere eines Polypeptids nach Anspruch 26, umfassend die Schritte (a), (b) und (c) aus Anspruch 26.
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US13/441,186 US8367335B2 (en) 2006-08-23 2012-04-06 Programmable oligonucleotide synthesis
US13/741,231 US9644225B2 (en) 2006-08-23 2013-01-14 Programmable oligonucleotide synthesis
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010094772A1 (en) 2009-02-20 2010-08-26 Febit Holding Gmbh Synthesis of sequence-verified nucleic acids
CN110468171A (zh) * 2019-09-20 2019-11-19 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 核酸的合成方法

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008027558A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Codon Devices, Inc. Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
US10207240B2 (en) 2009-11-03 2019-02-19 Gen9, Inc. Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly
WO2011066185A1 (en) 2009-11-25 2011-06-03 Gen9, Inc. Microfluidic devices and methods for gene synthesis
WO2011085075A2 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Gen9, Inc. Assembly of high fidelity polynucleotides
WO2012064975A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
ES2548400T3 (es) 2010-11-12 2015-10-16 Gen9, Inc. Métodos y dispositivos para la síntesis de ácidos nucleicos
US9809904B2 (en) * 2011-04-21 2017-11-07 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods for retrieval of sequence-verified DNA constructs
US9752176B2 (en) 2011-06-15 2017-09-05 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods for preparative in vitro cloning
EP2944693B1 (de) 2011-08-26 2019-04-24 Gen9, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur hochqualitativen anordnung von nukleinsäuren
WO2014153188A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Life Technologies Corporation High efficiency, small volume nucleic acid synthesis
EP2768607B1 (de) 2011-09-26 2021-08-18 Thermo Fisher Scientific GENEART GmbH Multiwell-platte für die hocheffiziente kleinvolumige nukleinsäuresynthese
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
EP4001427A1 (de) 2012-04-24 2022-05-25 Gen9, Inc. Verfahren zum sortieren von nukleinsäuren und zur multiplexierten, vorbereitenden in-vitro-klonung
JP6509727B2 (ja) 2012-06-25 2019-05-15 ギンゴー バイオワークス， インコーポレイテッド 核酸アセンブリおよび高処理シークエンシングのための方法
TWI721929B (zh) 2013-08-05 2021-03-11 美商扭轉生物科技有限公司 重新合成之基因庫
WO2015191815A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Life Technologies Corporation Multiplex nucleic acid amplification
WO2016011174A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Life Technologies Corporation Compositions and methods for nucleic acid assembly
CN107532129B (zh) 2014-12-09 2022-09-13 生命技术公司 高效小体积核酸合成
WO2016126987A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Compositions and methods for synthetic gene assembly
CA2975852A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
US10376126B2 (en) * 2015-03-02 2019-08-13 Foshan Shunde Midea Washing Appliances Mfg. Co., Ltd. Spray arm assembly for dishwasher, and dishwasher
WO2016172377A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
WO2017007925A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Thermo Fisher Scientific Geneart Gmbh Enzymatic synthesis of nucleic acid sequences
IL258164B (en) 2015-09-18 2022-09-01 Twist Bioscience Corp Methods to regulate the activity of proteins and cells and a method for the production of nucleic acids
WO2017053450A1 (en) 2015-09-22 2017-03-30 Twist Bioscience Corporation Flexible substrates for nucleic acid synthesis
US20180291413A1 (en) 2015-10-06 2018-10-11 Thermo Fisher Scientific Geneart Gmbh Devices and methods for producing nucleic acids and proteins
CN108603307A (zh) 2015-12-01 2018-09-28 特韦斯特生物科学公司 功能化表面及其制备
WO2018038772A1 (en) 2016-08-22 2018-03-01 Twist Bioscience Corporation De novo synthesized nucleic acid libraries
JP6871364B2 (ja) 2016-09-21 2021-05-12 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション 核酸に基づくデータ保存
EA201991262A1 (ru) 2016-12-16 2020-04-07 Твист Байосайенс Корпорейшн Библиотеки вариантов иммунологического синапса и их синтез
SG11201907713WA (en) 2017-02-22 2019-09-27 Twist Bioscience Corp Nucleic acid based data storage
EP3595674A4 (de) 2017-03-15 2020-12-16 Twist Bioscience Corporation Variante bibliotheken der immunologischen synapse und synthese davon
CN111566209A (zh) 2017-06-12 2020-08-21 特韦斯特生物科学公司 无缝核酸装配方法
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
US11407837B2 (en) 2017-09-11 2022-08-09 Twist Bioscience Corporation GPCR binding proteins and synthesis thereof
KR20240024357A (ko) 2017-10-20 2024-02-23 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 가열된 나노웰
US10936953B2 (en) 2018-01-04 2021-03-02 Twist Bioscience Corporation DNA-based digital information storage with sidewall electrodes
KR20210013128A (ko) 2018-05-18 2021-02-03 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 하이브리드화를 위한 폴리뉴클레오타이드, 시약 및 방법
EP3814494B1 (de) 2018-06-29 2023-11-01 Thermo Fisher Scientific GENEART GmbH Hochdurchsatzanordnung von nukleinsäuremolekülen
SG11202109283UA (en) 2019-02-26 2021-09-29 Twist Bioscience Corp Variant nucleic acid libraries for antibody optimization
AU2020229349A1 (en) 2019-02-26 2021-10-14 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for GLP1 receptor
GB201905303D0 (en) 2019-04-15 2019-05-29 Thermo Fisher Scient Geneart Gmbh Multiplex assembly of nucleic acid molecules
EP3987019A4 (de) 2019-06-21 2023-04-19 Twist Bioscience Corporation Barcode-basierte nukleinsäuresequenzanordnung
WO2022086866A1 (en) 2020-10-19 2022-04-28 Twist Bioscience Corporation Methods of synthesizing oligonucleotides using tethered nucleotides

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0022242A2 (de) 1979-07-05 1981-01-14 Genentech, Inc. Klonierungsvektor, Verfahren zu seiner Konstruktion, Verfahren zur Herstellung eines menschlichen Wachstumshormons und Bakterien dafür
EP0316018A2 (de) 1985-03-29 1989-05-17 Cetus Oncology Corporation Modifikation von DNS-Sequenzen
WO1990000626A1 (en) 1988-07-14 1990-01-25 Baylor College Of Medicine Solid phase assembly and reconstruction of biopolymers
EP0385410A2 (de) 1989-02-28 1990-09-05 Canon Kabushiki Kaisha Partiell doppelsträngiges Oligonukleotid und Verfahren zu seiner Bildung
WO1994012632A1 (en) 1992-11-27 1994-06-09 University College London Improvements in nucleic acid synthesis by pcr
WO1995017413A1 (de) 1993-12-21 1995-06-29 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven design und synthese funktionaler polymere auf der basis von formenelementen und formencodes
WO1999014318A1 (en) 1997-09-16 1999-03-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes
WO2000013017A2 (de) 1998-08-28 2000-03-09 Febit Ferrarius Biotechnology Gmbh Verfahren und vorrichtung zur herstellung und/oder analyse von biochemischen reaktionsträgern
WO2000049142A1 (de) 1999-02-19 2000-08-24 Febit Ferrarius Biotechnology Gmbh Verfahren zur herstellung von polymeren
WO2002044321A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rna interference mediating small rna molecules
WO2005051970A2 (de) 2003-11-18 2005-06-09 Febit Biotech Gmbh Hochparalleler dna-synthesizer auf matrizenbasis

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5639603A (en) * 1991-09-18 1997-06-17 Affymax Technologies N.V. Synthesizing and screening molecular diversity
US7932025B2 (en) * 2002-12-10 2011-04-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods for high fidelity production of long nucleic acid molecules with error control

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0022242A2 (de) 1979-07-05 1981-01-14 Genentech, Inc. Klonierungsvektor, Verfahren zu seiner Konstruktion, Verfahren zur Herstellung eines menschlichen Wachstumshormons und Bakterien dafür
EP0316018A2 (de) 1985-03-29 1989-05-17 Cetus Oncology Corporation Modifikation von DNS-Sequenzen
WO1990000626A1 (en) 1988-07-14 1990-01-25 Baylor College Of Medicine Solid phase assembly and reconstruction of biopolymers
EP0385410A2 (de) 1989-02-28 1990-09-05 Canon Kabushiki Kaisha Partiell doppelsträngiges Oligonukleotid und Verfahren zu seiner Bildung
WO1994012632A1 (en) 1992-11-27 1994-06-09 University College London Improvements in nucleic acid synthesis by pcr
WO1995017413A1 (de) 1993-12-21 1995-06-29 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven design und synthese funktionaler polymere auf der basis von formenelementen und formencodes
WO1999014318A1 (en) 1997-09-16 1999-03-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes
WO2000013017A2 (de) 1998-08-28 2000-03-09 Febit Ferrarius Biotechnology Gmbh Verfahren und vorrichtung zur herstellung und/oder analyse von biochemischen reaktionsträgern
WO2000013018A2 (de) 1998-08-28 2000-03-09 Febit Ferrarius Biotechnology Gmbh Träger für analytbestimmungsverfahren und verfahren zur herstellung des trägers
WO2000049142A1 (de) 1999-02-19 2000-08-24 Febit Ferrarius Biotechnology Gmbh Verfahren zur herstellung von polymeren
US6586211B1 (en) 1999-02-19 2003-07-01 Febit Ferrarius Biotechnology Gmbh Method for producing polymers
WO2002044321A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rna interference mediating small rna molecules
WO2005051970A2 (de) 2003-11-18 2005-06-09 Febit Biotech Gmbh Hochparalleler dna-synthesizer auf matrizenbasis

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. BLANCHARD: "Genetic Engineering, Principles and Methods", vol. 20, PLENUM PRESS, pages: 111 - 124
A. P. BLANCHARD; R. J. KAISER; L. E. HOOD: "High-Density Oligonucleotide Arrays", vol. 11, 1996, BIOSENS. & BIOELECTRONICS, pages: 687
CRITICAL REVIEWS IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 26, no. 3-4, 1991, pages 301 - 334
D. A. LASHKARI, PROC. NAT. ACAD. SCI. USA, vol. 92, no. 17, 1995, pages 7912 - 7915
GAO, X ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 31, no. 22, 2003, pages 143
HOLOWACHUK: "PCR Methods and Applications", COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
L. E. SINDELAR; J. M. JAKLEVIC, NUCL. ACIDS RES., vol. 23, no. 6, 1995, pages 982 - 987
M. H. CARUTHERS, METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 154, 1987, pages 287 - 313
MCGALL, G. ET AL., J. AMER. CHEM. SOC., vol. 119, 1997, pages 5081 - 5090
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 16, 3 October 1998 (1998-10-03), pages 981 - 983
NATURE GENETICS, vol. 21, January 1999 (1999-01-01), pages 2
PROC. NAT. ACAD. SCI., vol. 74, 1977, pages 5463 - 5467
S. RAYNER ET AL., PCR METHODS AND APPLICATIONS, vol. 8, no. 7, 1998, pages 741 - 747
TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, vol. 16, July 1998 (1998-07-01), pages 301 - 306

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010094772A1 (en) 2009-02-20 2010-08-26 Febit Holding Gmbh Synthesis of sequence-verified nucleic acids
EP2398915A1 (de) * 2009-02-20 2011-12-28 Febit Holding GmbH Synthese von nukleinsäuren mit verifizierter sequenz
EP2398915B1 (de) * 2009-02-20 2016-08-24 Synthetic Genomics, Inc. Synthese von nukleinsäuren mit verifizierter sequenz
CN110468171A (zh) * 2019-09-20 2019-11-19 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 核酸的合成方法

Also Published As

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US9644225B2 (en) 2017-05-09
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