WO2008003388A1 - VERFAHREN ZUM QUALITATIVEN NACHWEIS VON ZUGESETZTEN EIWEIß- STOFFEN IN LEBENSMITTELN - Google Patents

VERFAHREN ZUM QUALITATIVEN NACHWEIS VON ZUGESETZTEN EIWEIß- STOFFEN IN LEBENSMITTELN Download PDF

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WO2008003388A1 PCT/EP2007/005211 EP2007005211W WO2008003388A1 WO 2008003388 A1 WO2008003388 A1 WO 2008003388A1 EP 2007005211 W EP2007005211 W EP 2007005211W WO 2008003388 A1 WO2008003388 A1 WO 2008003388A1
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Detlef Timmermann
Meinhard Behrens
Willpeter Doderer
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Detlef Timmermann
Meinhard Behrens
Willpeter Doderer
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G01N33/12—Meat; Fish

Definitions

  • the invention relates to a method for the qualitative detection of added protein substances in foods, in particular of added protein hydrolysates or blood plasma in meat and meat products, wherein the foods are separated in the sample preparation in precipitate and fluid phase.
  • Food chemistry is a branch of applied chemistry that focuses on the composition, function of food and their components.
  • the monitoring of manufacturers, trade and transport of foodstuffs and the proof of possible deception and misleading of the consumer are priorities of this area.
  • Qualitative and quantitative analyzes of foods for authorized or prohibited food additives, residues of pesticides, fertilizers, solvents, antibiotics, hormones and heavy metals have been well known for many years.
  • Protein-containing additives in the form of high molecular weight meat powders or protein hydrolysates have been around for over 30 years and are originally from Asia. They must not be used according to the meat regulation in meat products. Excluded are vegetable proteins, gelatin for well-defined meat products and spices, which must comply with their definition of total nitrogen content and amino acid nitrogen content. When using such additives, a declaration in the list of ingredients is mandatory in any case.
  • the use of blood plasma is also permitted only for a few and well-defined meat products, with the restriction of use being precisely regulated in the Guidelines of the Meat Ordinance. Approved products must also declare the use of blood plasma in the ingredients list.
  • DE 195 16 077 C1 discloses a method for the qualitative detection of added protein hydrolysates in food, especially of added animal and vegetable protein hydrolysates in meat and meat products, which is characterized in that the food is processed to free amino acids containing samples and in the processed samples existing free amino acids are determined qualitatively and quantitatively, wherein the determined sample contents of free amino acids are compared with such sample contents, which come from the corresponding, not with protein hydrolysates treated food.
  • the problem on which the invention is based thus results in a method for the qualitative analysis of the presence of added protein hydrolysates and of blood plasma in foods, which detects a large number of such supplements in a safe and broadband manner.
  • the foodstuffs in particular meat and meat products, are separated into precipitate and fluid phase during sample preparation.
  • the homogenate is mixed with sulfosalicylic, so that high molecular weight proteins within a certain time at a certain temperature (for example, 30 minutes at + 4 ° C in the refrigerator) precipitate and subsequently the sample is filtered with a paper filter, leaving the precipitated proteins as filter residue as the precipitate phase, while the filtrate is present as such as a fluid phase.
  • the fluid phase contains free amino acids and di- to oligopeptides, wherein according to the invention at least a portion of the fluid phase is hydrolyzed or can be, for example and preferably by means of 6N HCl, so that ultimately only free and released amino acids in the fluid Phase are present.
  • the released amino acids obtained in this way are determined qualitatively and quantitatively, the determined sample contents of these fluid-released amino acids being compared with those sample contents which originate from the corresponding foods not treated with protein hydrolysates and / or blood plasma.
  • the released amino acids previously obtained as free amino acids as well as by the hydrolysis which are now free in the fluid phase, in the sum of qualified tatively and quantitatively, wherein to analyze to what extent and how much amino acids have been released by the hydrolysis of the fluid phase, this can be done by means of a counter-control of a part of not yet subjected to the hydrolysis fluid phase, to the corresponding difference of the individual To recognize amino acids, which are present and in what amount of the amino acids released by the hydrolysis and which free amino acids and at what level were present in the fluid phase from the beginning.
  • At least part of the precipitate phase can be hydrolyzed and the released amino acids obtained in this way can be determined qualitatively and quantitatively, the determined sample contents of these precipitate-released amino acids being compared with those sample contents obtained from the corresponding protein hydrolyzates and / or blood plasma-derived foods.
  • the fluid phase or precipitate phase is hydrolyzed to the di- to oligopeptides still in the fluid phase or precipitate phase break into their individual amino acids to provide this as a further basis for the later correlation. let the change in the addition of protein hydrolysates in the hands to keep.
  • amino acids when adding animal protein hydrolyzate, at least one of the following amino acids changed the concentration in the hydrolysed fluid phase compared to an untreated sample, the amino acids being aspartic acid, Threonine, serine, glutamic acid, glycine, alanine, valine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, lysine, arginine, proline, hydroxyproline and hydroxylysine.
  • the foods to be examined are processed in the manner according to the invention via the corresponding separation and hydrolyzing steps to free and released amino acids containing samples, which are then subjected to a corresponding amino acid determination to the free and the released amino acids and their contents determine.
  • the sample preparation as well as the amino acid determination proceed according to conventional methods.
  • the foodstuffs are first accurately weighed, diluted with distilled water, homogenized and then the fluid phase as well as the precipitate phase with the free or released amino acids contained ion exchange-chromatographically separated and after color reaction with ninhydrin or ortho-phthalene - Dialdehyde detected. This process is usually automated.
  • the amino acids z.Bsp.
  • Phenylsenföl, FMOC, dabsyl chloride or Dansylclorid derivatized and subjected to liquid chromatography, in particular a HPLC (High Performance Liquid Chromatography) with reversed-phase characteristic.
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • the chromatograms obtained are evaluated both qualitatively and quantitatively.
  • the amounts of the free or released amino acids obtained from the individual samples, which are obtained from foods treated with protein hydrolysates, are compared with those sample quantities which originate from corresponding untreated foods, to which no protein hydrolysates have been added.
  • samples for added animal protein hydrolyzate in the hydrolyzed fluid phase which are the following potential amino acids, which are to be considered: aspartic acid, threonine, serine, glutamic acid, glycine, alanine, valine, isoleucine, Leucine, tyrosine, phenylalanine, lysine, arginine, proline, hydroxyproline and hydroxylysine.
  • the amino acids hydroxyproline and hydroxylysine should advantageously be taken into account. The same is not possible in the investigation on added vegetable protein hydrolyzate in the precipitate phase due to the lack of clarity with respect to individual amino acids.
  • the proteins contained in the food are first precipitated from the food before separation from the free amino acids or the di- to oligopeptides. It is also advantageous that the precipitated proteins are filtered off from them before the determination of the free amino acids or of the amino acids released from the fluid phase in order not to induce disturbances, and it is also advantageous in this context since in practice Proves that prior to filtration, the proteins and the free amino acids or di- to oligopeptides are subjected to a centrifugation.
  • the detection method according to the invention is economically interesting, since no additional equipment specially developed for the method is necessary, so that the devices located in a laboratory park can be used.
  • FIG. 1 is a schematic flow diagram of the amino acid analysis according to the invention.
  • Tab. 1-10 the respective amino acid concentrations without or with respective additives (x a mean value, see standard deviation).
  • the various protein substances were mixed with water in the ratio 1: 4.
  • the food samples are processed and analyzed in a specific manner.
  • the sample is crushed with a Moulinette or similar nert. Then, weigh 5 grams of crushed sample material to the nearest lmg with 35 ml distilled water. homogenized in a beaker using an Ultra Turrax. For protein precipitation, 10 ml of 105% sulphosalicylic acid are added to the sample and mixed. To precipitate high molecular weight proteins, the sample is incubated for 30 minutes at 4 0 C in the refrigerator. Subsequently, the sample is filtered with a paper-folded filter.
  • NPN fraction a fraction with medium to high molecular weight proteins (called precipitate, since larger proteins precipitate on addition of sulfosalicylic acid) and another fraction in which free amino acids, dipeptides and oligopeptides are present.
  • This fraction is called the NPN fraction.
  • This NPN fraction is to some extent doubly analyzed in the present process.
  • the per se free amino acids are determined in their concentration, on the other hand, all other nitrogen components are decomposed by acid hydrolysis (6N HCI addition) into free or released amino acids.
  • the precipitate fraction is also decomposed by acid hydrolysis into released or free amino acids. Overall, therefore, three determinations of the concentration of free or released amino acids take place. Two determinations from the NPN fraction and one from the precipitate faction.
  • the principle of amino acid analysis is shown schematically in Figure 1.
  • Figure 2 shows an amino acid chromatogram of a prepared sample without protein hydrolyzate additive. The individual peaks are assigned the respective amino acids. The individual peak areas correspond to the respective amino acid amounts. These are compared directly with a prepared sample with protein hydrolyzate additive ( Figure 3).
  • Table 1 shows the amino acid concentration of hydrolyzed NPN in mg / 100g chicken breast fillet (fresh meat) without (lot 1), with 1% (lot 2) and with 3% (lot 3) of animal protein hydrolysis kit (poultry). It can be seen that even a protein hydrolyzate addition of 1% leads to a significant change in the amino acid concentration.
  • the mean comparisons show that the amino acids asparagine acid, threonine, serine, glutamic acid, glycine, alanine, valine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, lysine, arginine, proline, hydroxyproline and hydroxylysine from batches 2 and 3 with animal protein hydrolyzate additive Compared to batch 1 (without animal protein hydrolyzate supplement) have significantly increased concentrations.
  • Table 3 shows a significant increase in the concentrations of the amino acids aspartic acid, threonine, serine, glutamic acid, glycine, alanine, valine, isoleucine in the mean value comparisons of the hydrolyzed NPN , Leucine, tyrosine, phenylalanine, lysine, arginine and proline.
  • Table 5 shows the amino acid concentration of hydrolyzed NPN in mg / 100g cooked ham without additive
  • Table 7 shows a significant increase in the concentrations of the amino acids aspartic acid, threonine, serine, glutamic acid, glycine, alanine, valine in the averaging of NPN , Isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, lysine, arginine and proline.
  • the protein additive blood plasma also leaves some traces.
  • the amino acid hydroxylysine is a good indicator of the presence of blood plasma in the sample.
  • Tables 9 and 10 show that at the free amino acid concentrations, the amino acid hydroxylysine is significantly increased in the samples with a dry blood plasma addition of 1% and 3%.
  • the detection method according to the invention is economically very interesting.
  • the problem is international.
  • the affected meat and convenience area is huge and steadily growing, so there is a large sample potential.
  • the detection method does not require any apparatuses specially developed for the method and equipment. Many laboratories already have adequate equipment due to other analytical methods. If not, the corresponding equipment components can easily be obtained from the laboratory retailer. The detection method can thus be established relatively quickly as routine analysis.

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Abstract

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum qualitativen Nachweis von zugesetzten Eiweißstoffen in Lebensmitteln bereitgestellt, insbesondere von zugesetzten Eiweißhydrolysaten oder Blutplasma in Fleisch und Fleischwaren, wobei die Lebensmittel bei der Probenaufbereitung in Präzipitat - und Fluid-Phase getrennt werden, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß zumindest ein Teil der Fluidphase und/oder zumindest ein Teil der Präzipitatphase hydrolysiert wird und die auf diese Weise erhaltenen freigesetzten Aminosäuren qualitativ und quantitativ bestimmt werden, wobei die ermittelten Probengehalte dieser fluidphasen- und/oder präzipitatphasen- freigesetzten Aminosäuren verglichen werden mit solchen Probengehalten, die aus den entsprechenden, nicht mit Eiweißhydrolysaten und/oder Blutplasma behandelten Lebensmitteln stammen.

Description

Verfahren zum qualitativen Nachweis von zugesetzten Eiweiß-Stoffen in Lebensmitteln
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum qualitativen Nachweis von zugesetzten Eiweiß-Stoffen in Lebensmitteln, insbesondere von zugesetzten Eiweißhydro- lysaten oder Blutplasma in Fleisch und Fleischwaren, wobei die Lebensmittel bei der Probenaufbereitung in Präzipitat- und Fluid-Phase getrennt werden.
Die Lebensmittelchemie ist ein Zweig der angewandten Chemie, der sich insbesondere mit der Ermittlung der Zusammensetzung, der Funktion von Lebensmitteln und deren einzelnen Komponenten befaßt . Die Überwachung der Hersteller, des Handels und des Verkehrs mit Lebensmitteln und der Nachweis möglicher Täuschung und Irreführung des Verbrauchers sind Schwerpunkte dieses Gebietes. Qualitative und quantitavie Analysen von Lebensmitteln auf erlaubte oder verbotene Lebensmittel - zusatzstoffe, auf Rückstände von Pestiziden, Düngemitteln, Lösungsmitteln, Antibiotika, Hormonen und Schwermetallen sind seit vielen Jahren bekannte Untersuchungsparameter .
Durch die Globalisierung des zwischenstaatlichen Handels, von dem auch die Lebensmittelindustrie in starkem Maße betroffen ist, sind zuverlässige und reproduzierbare Analysemethoden unerlässlich. Analytikbedarf besteht für die gesamte Kette vom Hersteller, der seine Rohwaren überprüfen möchte, über den Handel, der möglichst viele und verlässliche Qualitätsparameter beim Einkauf seiner Produkte wünscht, bis zum Konsumenten, der qualitativ einwandfreie und authentische Produkte erwerben möchte .
Eiweißhaltige Zusätze in Form von hochmolekularen Fleischpulvern bzw. Eiweißhydrolysaten gibt es seit über 30 Jahren und kommen ursprünglich aus dem asiatischen Raum. Sie dürfen nach der Fleischverordnung in Fleischereierzeugnissen nicht verwendet werden. Ausgenommen sind pflanzliche Eiweiße, Gelantine für genau definierte Fleischerzeugnisse und Gewürze, die ihrer Definition hinsichtlich Gesamtstickstoffgehalt und Anteile von Aminosäurestickstoff entsprechen müssen. Bei Verwendung solcher Zusätze ist auf jeden Fall eine Deklaration im Zutatenverzeichnis zwingend vorgeschrieben. Der Einsatz von Blutplasma ist ebenfalls nur für wenige und genau definierte Fleischwaren zulässig, wobei die Verwendungseinschränkung in den Leitsätzen der Fleischverordnung genau geregelt ist. Auch in zulässigen Produkten muß die Verwendung von Blutplasma im Zutatenverzeichnis deklariert werden.
Von unzulässigen Zusätzen von Eiweißhydrolysaten und Blutplasma sowie von Deklarationsverstößen sind viele Produkte aus dem Fleisch- und Wurstwarenbereich betroffen. Durch den Einsatz von Eiweishydrolysaten läßt sich zusätzlich Wasser ins Produkt einführen, ohne daß sich das Eiweiß-Wasser-Verhältnis völlig verschiebt. Insbesondere bei Wurstwaren kann die Stickstoffbilanz dadurch nach oben verschoben werden, so daß sich der Anteil an wertbestimmendem Muskelfleisch reduzieren läßt. Blutplasma, welches naturbedingt ein hohes Wasserbindungsvermögen aufweist, ermöglicht ebenfalls außergewöhnliche Wassereinträge in verschiedenste Pro- dukte. So lassen sich beispielsweise die Produktionsverluste durch Garung beim Kochschinken und anderer Kochpökelwaren reduzieren bzw. sogar überkompensieren, das heißt, daß die Endprodukte schwerer als die Ausgangsprodukte vor der Garung sind.
DE 195 16 077 Cl offenbart ein Verfahren zum qualitativen Nachweis von zugesetzten Eiweißhydrolysaten in Lebensmitteln, insbesondere von zugesetzten tierischen und pflanzlichen Eiweißhydrolysaten in Fleisch und Fleischwaren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Lebensmittel zu freie Aminosäuren enthaltenden Proben aufbereitet werden und die in den aufbereiteten Proben vorhandenen freien Aminosäuren qualitativ und quantitativ bestimmt werden, wobei die ermittelten Probengehalte an freien Aminosäuren mit solchen Probengehalten verglichen werden, die aus den entsprechenden, nicht mit Eiweißhydrolysaten behandelten Lebensmitteln stammen.
Mit Hilfe eines solchen Verfahrens ist es zwar möglich, schon teilweise gezielte Aussagen über Zusätze von Eiweißdydrolysaten in Fleisch und Fleischwaren zu treffen, jedoch sind diese Aussagen in nicht wenigen Fällen unvollständig, so daß nach wie vor ein Bedürfnis an einer weiteren und genaueren Analytik in diesem Bereich besteht .
Aus dem Stand der Technik ist somit bis heute kein hochgradig zuverlässiges und breitbandig angelegtes Analyseverfahren zur Bestimmung von zugesetzten tierischen und pflanzlichen Eiweißhydrolysaten in Lebens- . mittein, insbesondere Fleisch und Fleischwaren, bekannt. Auch der Nachweis von Schweine- bzw. Rinderblutplasma ist bislang ebenfalls nicht möglich.
Daß der Erfindung zugrundeliegende Problem ergibt sich somit darin, ein Verfahren zum qualitativen Nach- weis von zugesetzten Eiweißhydrolysaten und von Blutplasma in Lebensmitteln bereitzustellen, das eine Vielzahl solcher Zugaben sicher und breitbandig erfasst.
Dieses Problem wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach Anspruch 1 gelöst .
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden die Lebensmittel, insbesondere Fleisch und Fleischwaren bei der Probenaufbereitung in Präzipitat- und Fluid-Phase getrennt. Dies geschieht beispielsweise und insbesondere durch Zerkleinerung einer Probe und Homogenisierung mit Wasser, wobei das Homogenisat mit Sulfosalicylsäure versetzt wird, so daß hochmolekulare Proteine innerhalb einer bestimmten Zeit bei einer bestimmten Temperatur (beispielsweise 30 Minuten bei +4°C im Kühlschrank) ausfallen und im Anschluß die Probe mit einem Papierfilter filtriert wird, wobei die ausgefallenen Proteine als Filterrückstand als Präzipitat-Phase übrig bleiben, während das Filtrat als solches als Fluid-Phase vorliegt. Die Fluid-Phase enthält freie Aminosäuren sowie Di- bis Oligopeptide, wobei erfindungsgemäß zumindest ein Teil der Fluid-Phase hydrolysiert wird bzw. werden kann, beispiels- und vorzugsweise mittels 6N HCl, so daß dadurch schließlich nur noch freie und freigesetzte Aminosäuren in der Fluid-Phase vorhanden sind. Die auf diese Weise erhaltenen freigesetzten Aminosäuren werden qualitativ und quantitativ bestimmt, wobei die ermittelten Probengehalte dieser fluid-freigesetzten Aminosäuren verglichen werden mit solchen Probengehalten, die aus den entsprechenden, nicht mit Eiweißhydrolysaten und/oder Blutplasma behandelten Lebensmitteln stammen. Darüberhinaus ist es auch möglich, daß die sowohl vorher als freie Aminosäuren als auch durch die Hydrolyse erhaltenen freigesetzten Aminosäuren, die nunmehr in der Fluid-Phase frei vorliegen, in der Summe quali- tativ und quantitativ bestimmt werden, wobei zur Analyse dahingehend, welche und wie viel Aminosäuren freigesetzt worden sind durch die Hydrolyse der Fluid-Phase, dies mittels einer Gegenkontrolle eines Teils der noch nicht der Hydrolyse unterworfenen Fluidphase geschehen kann, um aus der entsprechenden Differenz der einzelnen Aminosäuren zu erkennen, welche und in welcher Höhe die durch die Hydrolyse freigesetzten Aminosäuren vorliegen bzw. welche freien Aminosäuren und in welcher Höhe von Anfang an in der Fluid-Phase vorlagen.
Erfindungsgemäß kann bzw. wird zumindest ein Teil der Präzipitat -Phase hydrolysiert und die auf diese Weise erhaltenen freigesetzten Aminosäuren qualitativ und quantitativ bestimmt, wobei die ermittelten Probengehalte dieser Präzipitat -freigesetzten Aminosäuren verglichen werden mit solchen Probengehalten, die aus den entsprechenden, nicht mit Eiweißhydrolysaten und/oder Blutplasma behandelten Lebensmitteln stammen.
Weiterhin ist es von Vorteil, die aus zumindest einem Teil der Fluid-Phase stammenden freien Aminosäuren qualitativ und quantitativ zu bestimmen, wobei die ermittelten Probengehalte dieser freien Aminosäuren verglichen werden mit solchen Probengehalten, die aus den entsprechenden, nicht mit Eiweißhydrolysaten und/oder Blutplasma behandelten Lebensmitteln stammen, um weitere Informationen über die Lebensmittel zu erhalten.
Unter anderem erfindungswesentlich ist die Tatsache, daß im Gegensatz zum in DE 195 16 077 Cl aufgezeigten Verfahren die Fluid-Phase bzw. Präzipitat-Phase hydrolysiert wird, um die sich noch in der Fluid-Phase bzw. Präzipitat-Phase befindenden Di- bis Oligopeptide in ihre einzelnen Aminosäuren aufzubrechen, um dies als weitere Grundlage für die spätere Korrelation hinsieht- lieh der Veränderung bei Zugabe von Eiweißhydrolysaten in den Händen zu halten.
Bei den diesbezüglichen korrelierenden Auswertungen konnte gefunden werden, daß sich bei Zugabe von tierischem Eiweißhydrolysat mindestens eine der folgenden Aminosäuren im Vergleich zu einer unbehandelten Probe die Konzentration in der hydrolysierten Fluid- Phase sich veränderte, wobei es sich bei den Aminosäuren um folgende handelte: Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Lysin, Arginin, Prolin, Hydroxyprolin sowie Hydroxylysin.
Entsprechendes gilt in vorteilhafterweise, da in der Praxis aufgefunden und somit bewährt, daß bei der Untersuchung auf zugesetztes pflanzliches Eiweißhydrolysat in der hydrolysierten Fluid-Phase mindestens eine der folgenden Aminosäuren berücksichtigt wird, sich somit Ihre Konzentration ändert: Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Lysin, Arginin sowie Prolin.
Darüberhinaus ist es vorteilhaft, da aufgefunden und in der Praxis somit bewährt, daß bei der Untersuchung auf zugesetztes tierisches Eiweißhydrolysat in der Präzipitat-Phase mindestens eine der folgenden Aminosäuren berücksichtigt wird: Hydroxyprolin sowie Hydroxylysin.
Es konnte darüberhinaus gefunden werden, daß bei Zugabe von rein pflanzlichem Eiweißhydrolysat zum Lebensmittel sich in der Präzipitat-Phase keine wesentlichen Änderungen von Aminosäurekonzentrationen ergaben.
Allerdings ist es vorteilhaft, da dies aufgefunden werden konnte und somit in der Praxis bewährt, daß bei der Untersuchung auf zugesetztes Blutplasma in der Fluid-Phase Hydroxylysin berücksichtigt wird, da dies einen Hinweis auf die Zugabe von Blutplasma im Lebensmittel aufzeigt.
Aufgrund der teilweise summarischen jedoch vielfältigen Typen- und Konzentrationsänderungen der einzelnen Aminosäuren können über kombinierende Korrelationsanalyse der einzelnen Aminosäuren und deren Konzentrationen entsprechende Rückschlüsse durch Vergleich von unbehandelten mit unbehandelten Referenzproben und bewußt behandelten Proben schließlich entsprechend zumindest qualitative Aussagen gemacht werden, die dann bei einer entsprechenden unbekannten Lebensmittelprobe über die vorher bekannten Korrelationsregeln quasi re- tro-analytisch Aussagen in qualitativer Hinsicht über Reinheit bzw. Zugabe von Eiweißhydrolysaten - sowohl tierischen als auch pflanzlichen Ursprungs - zulassen.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden die zu untersuchenden Lebensmittel auf die erfindungsgemäße Art und Weise über die entsprechenden Trennungs- und Hydrolysierungsschritte zu freie und freigesetzte Aminosäuren enthaltenden Proben aufbereitet, die anschließend einer entsprechenden Aminosäurebestimmung unterworfen werden, um die freien als auch die freigesetzten Aminosäuren und deren Gehalte zu bestimmen. Die Probenaufbereitung sowie die Aminosäurebestimmung verlaufen nach konventionellen Methoden. Beispielsweise werden die Lebensmittel zunächst genau eingewogen, mit destilliertem Wasser verdünnt, homogenisiert und anschließend die Fluid-Phase als auch als auch die Präzipitat-Phase mit den darin enthaltenen freien bzw. freigesetzten Aminosäuren ionenaustausch-chromatographisch getrennt und nach Farbreaktion mit Ninhydrin oder Ortho-Phthal- dialdehyd nachgewiesen. Dieser Vorgang ist in der Regel automatisiert. Selbstverständlich ist es auch denkbar, daß die Aminosäuren z.Bsp. Phenylsenföl , FMOC, Dabsyl- chlorid oder Dansylclorid, derivatisiert und einer Flüssigkeitschromatographie, insbesondere einer HPLC (High Performance Liquid Chromatography) mit Reversed- Phase-Characteristic unterworfen werden. Die erhaltenen Chromatogramme werden sowohl qualitativ als auch quantitativ ausgewertet. Die zu den einzelnen Proben ermittelten Mengenangaben der freien bzw. freigesetzten Aminosäuren, die aus mit Eiweißhydrolysaten behandelten Lebensmitteln stammen, werden mit solchen Proben- Mengenangaben verglichen, die aus entsprechenden unbehandelten Lebensmitteln stammen, denen also keine Eiweiß- hydrolysate zugesetzt worden sind. Überschreiten einige Aminosäuregehalte die aus den entsprechenden, unbehandelten Lebensmittelproben ermittelten Werte, so ist dies zumindest ein Indiz für eine unzulässige Eiweiß- hydrolysat-Zugabe, jedoch noch kein Beweis, da die in Spezies vorkommenden Aminosäuren immer einer gewissen Schwankungsbreite unterliegen. Bei Vergleich der ermittelten Gehalte der einzelnen Aminosäuren stellte man jedoch überraschenderweise fest, daß einzelne Aminosäuregehalte trotz Zugabe von Eiweißhydrolysaten in Lebensmitteln, insbesondere von Fleisch und Fleischwaren, annähernd konstant bleiben, bei Eiweißhydrolysatzusatz tierischen Ursprungs vorzugsweise Serin und Asparagin- säure, während andere Aminosäuregehalte sich signifikant verändern, vorzugsweise Glycin und Alanin. Diese überraschende Erkenntnis erlaubt somit zumindest den direkten Vergleich der in einer natürlichen Schwankungsbreite vorkommendenm, jedoch bei Eiweißhydrolysatzusatz sich signifikant verändernde Aminosäuregehalte mit aus Erfahrung festgelegten Werten, um Rückschlüsse auf eventuelle Zusätze in Form von Eiweißhydrolysaten zu ziehen bzw. erlaubt, falls ohne Eiweiß- hydrolysat versetzte entsprechende Lebensmittel zur Verfügung stehen, sogar den Vergleich der ermittelten Probengehalte an bei Eiweißhydrolysatzugäbe sich mengenmäßig signifikant verändernden Aminosäuren mit Probengehalten an diesen Aminosäuren, die aus nicht mit Eiweißhydrolysaten behandelten Lebensmitteln stammen. Durch die Signifikanz der zur Beurteilung herangezogenen Wertung ist eine sichere Aussage über Eiweißhydro- lysatzusätze möglich.
Dadurch, daß bei Eiweißhydrolysatzusatz tierischen Ursprungs bestimmte Aminosäuregehalte sich signifikant verändern, während andere nahezu unverändert bleiben, ist es zweckmäßig, für einen Zusatz von Eiweißhydrolysaten tierischen Ursprungs Probengehalte von freien als auch freigesetzten Aminosäuren, die sich durch den Zusatz erhöhen, mit Probengehalten freier bzw. freigesetzter Aminosäuren, die durch den Zusatz praktisch unverändert bleiben, zur Durchführung des Vergleichs in Beziehung zu setzen. Insbesondere Glycin und Alanin verändern sich bei Eiweißhydrolysatzugäbe tierischen Ursprungs signifikant, während Serin und Asparaginsäure nahezu konstant bleiben. Die Quotienten werden auf die Art und Weise gebildet, daß ein bei Zusatz sich stark verändernder Aminosäuregehalt durch einen nahezu unabhängigen Aminosäuregehalt dividiert wird, wobei auch der Kehrwert eines solchen Quotienten verwendbar ist. Die Quotientenbildung ermöglicht es, Proben auffällig als mit tierischen Eiweißhydrolysaten behandelt zu identifizieren, deren Aminosäuregehalte trotz unzulässiger Zusätze noch in der natürlichen Schwankungsbreite liegen und somit auch diese Grenzfälle sicher erfasst werden.
Da bei Zugabe von pflanzlichen Eiweißhydrolysaten nahezu sämtliche Gehalte an freien Aminosäuren zuneh- men, ist es zweckmäßig, daß für einen Zusatz von pflanzlichen Eiweißhydrolysaten Probengehalte im wesentlichen aller freien Aminosäuren zur Durchführung des Vergleichs verwendet werden. Dies steht nicht im Widerspruch dazu, daß bei der Untersuchung auf zugesetztes pflanzliches Eiweißhydrolysat in der hydroly- sierten Fluid-Phase mindestens eine der folgenden Aminosäuren berücksichtigt wird, wobei es sich hierbei handelt um: Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Tyro- sin, Phenylalanin, Lysin, Arginin sowie Prolin. Entsprechendes gilt im Zusammenhang mit der Untersuchung von Proben auf zugesetztes tierisches Eiweißhydrolysat in der hydrolysierten Fluid-Phase, wobei es sich um folgende potentielle Aminosäuren handelt, die zu berücksichtigen sind: Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Lysin, Arginin, Prolin, Hydroxyprolin sowie Hydroxylysin.
Bei Untersuchung auf zugesetztes tierisches Eiweißhydrolysat in der Präzipitat-Phase sollten vorteilhafterweise die Aminosäuren Hydroxyprolin sowie Hydroxylysin, zumindest eine davon, berücksichtigt werden. Entsprechendes ist bei der Untersuchung auf zugesetztes pflanzliches Eiweißhydrolysat in der Präzipitat-Phase aufgrund der nicht vorhandenen Eindeutigkeit in Bezug auf einzelne Aminosäuren nicht möglich.
In diesem Zusammenhang ist es als Indikator auf die Zugabe eines möglichen Blutplasmas gegeben, daß in der Fluid-Phase die Änderungen der Aminosäure Hydroxylysin berücksichtigt werden, wobei dann zur endgültigen verifizierenden Bestimmung ein Test mit einem entsprechend spezifischen Antikörper durchgeführt werden muss . Damit die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens gesteigert wird, ist es zweckmäßig, daß bei der Probenaufbereitung die in den Lebensmittel enthaltenen freien Aminosäuren sowie die noch freizusetzenden Aminosäuren aus den Di- bis Oligopeptiden von den in den Lebensmitteln enthaltenen Proteinen getrennt werden, so daß sich die Proteine nicht störend bei der Aminosäurebesimmung auswirken können, wobei die entstehende Präzipitat -Phase erfindungsgemäß dann auch bei entsprechender Behandlung in Bezug auf die dann freigesetzten Aminosäuren noch wertvollere Informationen liefern kann.
Vorteilhafterweise werden die in den Lebensmitteln enthaltenen Proteine vor Trennung von den freien Aminosäuren bzw. der Di- bis Oligopeptide zunächst aus den Lebensmitteln ausgefällt . Dabei ist es weiterin vorteilhaft, daß die ausgefällten Proteine vor der Bestimmung der freien Aminosäuren bzw. der aus der Fluid-Phase freigesetzten Aminosäuren von diesen abfiltriert werden, um keine Störungen zu induzieren, wobei es auch in diesem Kontext vorteilhaft ist, da in der Praxis bewährt, daß vor dem Filtrieren die Proteine und die freien Aminosäuren bzw. Di- bis Oligopeptide einer Zen- trifugierung unterworfen werden.
Schließlich hat es sich noch in der Praxis bewährt, daß die Hydrolyse sowohl der Fluid-Phase als auch der Präzipitat-Phase mittels Zugabe von HCl, vorzugsweise 6N-HC1, bewerkstelligt wird.
Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren ist wirtschaftlich gesehen interessant, da keine zusätzlichen speziell für das Verfahren entwickelten Apparaturen notwendig sind, so daß die sich in einem Laborpark befindenden Geräte verwendet werden können.
Das in den Zeichnungen und in den Tabellen gezeig- te Beispiel soll die Erfindung näher erläutern.
Es zeigen:
Abb. 1 - eine schematische Flußdiagrammdarstellung der erfindungsgemäßen Aminosäurenanalytik,
Abb. 2+3 - jeweilige Aminosäurechromatogramme von Proben ohne bzw. mit Eiweiß- hydrolysatzusatz,
Tab. 1-10 - die jeweiligen Aminosäurekonzentrationen ohne bzw. mit jeweiligen Zusätzen (x ä Mittelwert, s ä Standardabweichung) .
Für die nachfolgend erläuterten Versuche wurden folgende Proben hergestellt:
1. Hähnchenbrustfilet (Frischfleisch) ohne und mit Zusatz von 1% und 3% tierischem Eiweißhydrolysat (Geflügel)
2. Hähnchenbrustfilet (Frischfleisch) ohne und mit Zusatz von 1% und 3% pflanzlichem Eiweißhydrolysat (Soja) .
3. Kochschinken ohne und mit Zusatz von 1% und 3% tierischem Eiweißhydrolysat (Schwein) .
4. Kochschinken ohne und mit Zusatz von 1% und 3% pflanzlichem Eiweißhydrolysat (Soja).
5. Kochschinken ohne und mit Zusatz von 1% und 3% Trockenblutplasma (Schwein) .
6. Brühwurst ohne und mit Zusatz von 1% und 3% Trockenblutplasma (Rind) .
Die verschiedenen Eiweiß-Stoffe wurden mit Wasser im Verhältnis 1:4 versetzt.
Bei diesem Verfahren werden die Lebensmittelproben nach einer bestimmten Art und Weise aufgebarbeitet und analysiert .
Die Probe wird mit einer Moulinette o.a. zerklei- nert . Anschließend werden 5 Gramm zerkleinertes Probematerial auf lmg genau eingewogen, mit 35ml Aqua dest . in einem Becherglas mit Hilfe eines Ultra Turrax homogenisiert. Für die Eiweißfällung werden der Probe 10ml 105ige SuIfosalicylsäure zugegeben und gemischt. Zur Ausfällung hochmolukularer Proteine wird die Probe für 30 Minuten bei 40C im Kühlschrank inkubiert. Im Anschluß wird die Probe mit einem Papier-Faltenfilter filtriert. Dabei entstehen prinzipiell zwei Fraktionen, nämlich eine Fraktion mit mittel- bis hochmolekularen Proteinen (Präzipitat genannt, da größere Proteine bei Zugabe von Sulfosalicylsäure ausfallen) und eine weitere Fraktion in der sich frei Aminosäuren, Dipeptide und Oligopeptide befinden. Diese Fraktion wird als NPN- Fraktion bezeichnet. Diese NPN-Fraktion wird beim vorliegenden Verfahren in gewisser Weise doppelt analysiert. Einerseits werden die per se freien Aminosäuren in ihrer Konzentration bestimmt, andererseits werden alle anderen Stickstoff-Komponenten mittels saurer Hydrolyse (6N HCI-Zusatz) in freie bzw. freigesetzte Aminosäuren zerlegt. Die Präzipitat-Fraktion wird ebenfalls durch saure Hydrolyse in freigesetzte bzw. freie Aminosäuren zerlegt. Insgesamt finden also drei Bestimmungen der Konzentration an freien bzw. freigesetzten Aminosäuren statt. Zwei Bestimmungen aus der NPN-Fraktion und eine Bestimmung aus der Präzipitat-Fraktion. Das Prinzip der Aminosäureanalytik ist in der Abbildung 1 schematisch dargestellt.
Die Bestimmung der Konzentration der jeweiligen Aminosäuren erfolgt idealerweise mit Hilfe eines Amino- säureanalysators oder aber mittels HPLC (High Performance Liquid Chromatography) . Die erhaltenen Aminosäu- rechromatogramme werden sowohl qualitativ als auch quantitativ ausgewertet. Die Abbildung 2 zeigt ein Aminosäurechromatogramm einer aufbereiteten Probe ohne Eiweißhydrolysatzusatz . Den einzelnen Peaks sind die jeweiligen Aminosäuren zugeordnet. Die einzelnen Peakflachen entsprechen den jeweiligen Aminosäuremengen. Diese werden direkt mit einer aufbereiteten Probe mit Eiweißhydrolysatzusatz (Abbildung 3) erhaltenen Werten verglichen.
Die in den Tabellen angegebenen Mittelwerte und deren Varianzen wurden jeweils mit n = 6 Werten mit Hilfe der zweifaktoriellen Varianzanalyse bestimmt.
Die in den Tabellen aufgeführten Proben von den Chargen 1 sind nicht mit Eiweißhydrolysat versetzt worden. Die zu diesen Chargen angegebenen Werte zeigen eine natürliche Schwankungsbreite der einzelnen Aminosäurekonzentration und dienen als Vergleichsparameter für eine Bewertung hinsichtlich eines Eiweißhydroly- satzusatzes .
Tabelle 1 zeigt die Aminosäurekonzentration von hydrolysiertem NPN in mg/100g Hähnchenbrustfilet (Frischfleisch) ohne (Charge 1) , mit 1 % (Charge 2) und mit 3 % (Charge 3) tierischem Eiweißhydrolysatzusatz (Geflügel) . Es ist zu erkennen, daß bereits ein Eiweißhydrolysatzusatz von 1 % zu einer signifikanten Veränderung der Aminosäurekonzentration führt. Die Mittelwertvergleiche zeigen, daß die Aminosäuren Asparagin- säure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Lysin, Arginin, Prolin, Hydroxyprolin und Hydroxylysin von den Chargen 2 und 3 mit tierischem Eiweißhydrolysatzusatz im Vergleich zur Charge 1 (ohne tierischen Eiweißhydrolysatzusatz) signifikant erhöhte Konzentrationen aufweisen.
Die Aminosäurekonzentration von hydrolysiertem Präzipitat (Tabelle 2) zeigen bei den Mittelwertsver- gleichen nur bei den Aminosäuren Hydroxyprolin und Hy- droxylysin eine signifikante Erhöhung der Konzentrationen. Beide Aminosäuren sind für diese Fraktion verläßliche Indikatoren für EiweißhydrolysatZusätze tierischer Herkunft .
Bei einem Zusatz von 1 % und 3 % pflanzlichem Eiweißhydrolysat (Soja) zeigt die Tabelle 3 von dem hy- drolysierten NPN bei den Mittelwertsvergleichen eine signifikante Erhöhung der Konzentrationen von den Aminosäuren Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Lysin, Arginin und Prolin.
Bei dem hydrolysiertem Präzipitat wurden keine Veränderungen der Aminosäurenkonzentrationen festgestellt (Tabelle 4) .
Tabelle 5 zeigt die Aminosäurekonzentration von hydrolysiertem NPN in mg/100g Kochschinken ohne Zusatz
(Charge 1) , mit 1 % (Charge 2) und mit 3 % (Charge 3) tierischem Eiweißhydrolysatzusatz (Schwein) . Auch hierbei führt bereits ein geringer Zusatz Eiweißhydrolysat von 1 % zu einer signifikanten Veränderung der Aminosäurekonzentrationen. Die Mittelwerte zeigen, daß die Aminosäuren Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Lysin, Arginin, Prolin, Hydroxyprolin und Hydroxylysin von den Chargen 2 und 3 mit tierischem Eiweißhydrolysatzusatz im Vergleich zur Charge 1
(ohne tierischen Einweißhydrolysatzusatz) signifikant erhöhte Konzentrationen aufweisen.
Die Aminosäurekonzentrationen von hydrolysiertem Präzipitat (Tabelle 6) zeigen bei den Mittelwertvergleichen, genau wie beim Zusatz von tierischem Hydoly- satz mit Geflügelursprung, nur bei den Aminosäuren Hydroxyprolin und Hydroxylysin signifikante Erhöhungen der Konzentrationen.
Bei einem Zusatz von 1 % und 3 % pflanzlichem Ei- weißhydrolysat (Soja) zeigt die Tabelle 7 von dem hy- drolysiertem NPN bei den Mittelwertsvergleichen eine signifikante Erhöhung der Konzentrationen von den Aminosäuren Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Lysin, Arginin und Prolin.
Bei dem hydrolysiertem Präzipitat wurden keine Veränderungen der Aminosäurenkonzentrationen festgestellt (Tabelle 8) .
Die Unterschiede bei den Werten zwischen den Aminosäurenkonzentrationen von dem hydrolysierten NPN vom Hähnchenbrustfilet und Kochschinken mit pflanzlichem Eiweißhydrolysatzusatz (Soja) sind auf unterschiedlich hohe Hydrolysegrade bei der Eiweißhydrolysatherstellung zurückzuführen (vgl. Tabellen 3 und 7) .
So wie sich Eiweißhydrolysate tierischen und pflanzlichen Ursprungs tendenziell in den Aminosäurespektren unterscheiden, hinterläßt das Eiweißadditiv Blutplasma ebenfalls gewisse Spuren. Insbesondere die Aminosäure Hydroxylysin ist ein guter Indikator für das Vorhandensein von Blutplasma in der Probe. Die Tabellen 9 und 10 zeigen, daß bei den freien Aminosäurekonzentrationen die Aminosäure Hydroxylysin bei den Proben mit einem Trockenblutplasmazusatz von 1% und 3% signifikant erhöht ist.
Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren ist wirtschaftlich gesehen äußerst interessant. Die Problematik besteht international. Darüberhinaus ist der betroffene Fleischwaren- und Convenience-Bereich riesig und stetig wachsend, somit ist ein großes Probenpotential gegeben. Vorteilhafter Weise benötigt das Nachweisverfahren keine speziell für das Verfahren entwickelte Apparaturen und Gerätschaften. Viele Laboratorien verfügen - bedingt durch andere Analyseverfahren - bereits über eine entsprechende Ausstattung. Falls nicht, lassen sich die entsprechenden Ausstattungskomponenten problemlos im Laborfachhandel beziehen. Das Nachweisverfahren läßt sich somit relativ schnell als Routineanalytik etablieren.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum qualitativen Nachweis von zugesetzten Eiweiß-Stoffen in Lebensmitteln, insbesondere von zugesetzten Eiweißhydrolysaten oder Blutplasma in Fleisch und Fleischwaren, wobei die Lebensmittel bei der Probenaufbereitung in Präzipitat- und Fluid-Phasen getrennt werden, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Teil der Fluidphase und/oder zumindest ein Teil der Präzipitatphase hydrolysiert wird und die auf diese Weise erhaltenen freigesetzten Aminosäuren qualitativ und quantitativ bestimmt werden, wobei die ermittelten Probengehalte dieser fluidphasen- und/oder präzipi- tatphasen- freigesetzten Aminosäuren verglichen werden mit solchen Probengehalten, die aus den entsprechenden, nicht mit Eiweißhydrolysaten und/oder Blutplasma behandelten Lebensmitteln stammen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die aus zumindest einem Teil der Fluidphase stammenden freien Aminosäuren qualitativ und quantitativ bestimmt werden, wobei die ermittelten Probengehalte dieser freien Aminosäuren verglichen werden mit solchen Probengehalten, die aus den entsprechenden, nicht mit Eiweißhydrolysaten und/oder Blutplasma behandelten Lebensmitteln stammen.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß für einen Zusatz von Eiweißhydrolysaten tierischen Ursprungs Probengehalte freier Aminosäuren, die sich durch den Zusatz erhöhen, mit Probengehalten freier Aminosäuren, die durch den Zusatz praktisch unverändert bleiben, zur Durchführung des Vergleichs in Beziehung gesetzt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß für einen Zusatz von pflanzlichen Eiweißhydrolysaten Probengehalte im wesentlichen aller freien Aminosäuren zur Durchführung des Vergleichs verwendet werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Probenaufbereitung die in den Lebensmitteln enthaltenen freien Aminosäuren von den in den Lebensmitteln enthaltenen Proteinen getrennt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die in den Lebensmitteln enthaltenen Proteine vor Trennung von den freien Aminosäuren zunächst aus den Lebensmitteln ausgefällt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die ausgefällten Proteine vor der Bestimmung der freien Aminosäuren von diesen abfiltriert werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Filtrieren die Proteine und die freien Aminosäuren einer Zentrifugierung unterworfen werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Lebensmittel mittels Zu- gäbe von SuIfosalicylsäure in Präzipitat- und Fluid- Phasen getrennt werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse der Fluidphase mittels Zugabe von HCl bewerkstelligt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse der Präzipi- tätphase mittels Zugabe von HCl bewerkstelligt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Untersuchung auf zugesetztes tierisches Eiweißhydrolysat in der hydroly- sierten Fluidphase mindestens eine der folgenden Aminosäuren berücksichtigt wird: Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Lysin, Arginin, Prolin, Hydroxyprolin und Hydroxylysin.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Untersuchung auf zugesetztes pflanzliches Eiweißhydrolysat in der hydroly- sierten Fluidphase mindestens eine der folgenden Aminosäuren berücksichtigt wird: Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Lysin, Arginin, Prolin.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Untersuchung auf zugesetztes tierisches Eiweißhydrolysat in der Präzipi- tatphase mindestens eine der folgenden Aminosäuren berücksichtigt wird: Hydroxyprolin, Hydroxylysin.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Untersuchung auf zugesetztes Blutplasma in der Fluidphase Hydroxylysin berücksichtigt wird.
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