WO2007145306A1 - 腫瘍組織で選択的に分解性を示す血中滞留性素子 - Google Patents

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Hiroshi Kikuchi
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Definitions

  • Retentive element in blood that is selectively degradable in tumor tissue
  • the present invention includes a phospholipid derivative to which polyalkylene glycol or the like is bound via a peptide and is useful as a constituent lipid of a lipid membrane structure such as a liposome, and a tumor tissue containing the phospholipid derivative.
  • the present invention relates to a blood retentive element that is selectively degradable by a method such as Background art
  • MEN D Multilunctional envelope-type nano device
  • the problem is that the fine particle carrier such as ribosome and the above-mentioned MEND is easily trapped by reticuloendothelial tissues such as liver and spleen, which have poor retention in blood when administered intravenously. Have.
  • these fine particle carriers also have problems that the inclusions leak and the fine particles aggregate.
  • This measure is based on the fact that when the hydrated layer of PEG covers fine particle carriers such as ribosomes, opsoninism such as serum protein adsorption is suppressed, and as a result, phagocytosis by macrophages and uptake by reticuloendothelial tissue can be avoided.
  • polyalkylene glycol is conjugated.
  • a combined phospholipid has been proposed, and it is known that the surface of the ribosome can be modified with polyalkylene glycol using this phospholipid.
  • PEG-modified ribosomes with particle diameters controlled to 100-200 nm accumulate almost selectively in solid tumors due to the EPR (Enhanced Permeability and Retention) effect, and tumors are collected for a long time without being collected again in the blood.
  • EPR Enhanced Permeability and Retention
  • MMP matrix meta-oral protease
  • peptide-bound phospholipids that can be used as ribosome-constituting lipids are known (Japanese Patent Publication No. 2003-513009).
  • the above publication describes that this phospholipid peptide may be modified with PEG (polyethylene glycol) or the like (paragraph [0016] in the above publication).
  • PEG polyethylene glycol
  • the ribosome containing this lipid as a constituent lipid becomes unstable and the contents are released at that site, so it is specific for peptidase-secreting cells. The contents can be delivered automatically.
  • matrix meta-oral protease can be used as the above-mentioned beptidase, and that liposomes can be used by targeting tumor cells (paragraphs [0021] and [0042] above).
  • liposomes can be used by targeting tumor cells (paragraphs [0021] and [0042] above).
  • the delivery efficiency of drugs or genes by ribosomes using this phospholipid is not sufficient.
  • Non-patent literature l Nature Biotechnology, 19, pp.661, 2001
  • Patent Document 1 Japanese Translation of Special Publication 2003-513009
  • An object of the present invention is to use a lipid membrane structure such as a ribosome whose surface is modified with polyalkylene glycol or MEND as a fine particle carrier, and a disease associated with matrix metaprotease (malignant tumor, emphysema) , Pulmonary fibrosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, periodontitis, corneal ulcer, uveitis, diabetic retinopathy, proliferative vitreous, age-related macular degeneration, blistering disease, chronic skin ulcer, multiple Sclerosis, glomerulonephritis, lupus nephritis, chronic hepatitis, cirrhosis, heart failure, etc.).
  • matrix metaprotease malignant tumor, emphysema
  • drugs such as antitumor agents and genes for gene therapy such as malignant tumors are delivered to the vicinity of disease sites such as malignant tumors related to matrix meta-oral proteases or neovascularization, and then targeted. It is intended to provide a means for efficiently incorporating drugs such as antitumor agents and genes into target cells for delivery into cells.
  • a specific phospholipid modified with a polyalkylene glycol or the like, a modified portion such as a polyalkylene glycol, and a phospholipid An oligopeptide that can be hydrolyzed by matrix meta-protease is interposed between the two parts, and lipid membrane structures such as ribosomes and MENDs are prepared using the lipids and used as fine particle carriers such as antitumor agents and genes.
  • a modification site such as polyalkylene glycol keeps the ribosome and MEND highly retained in the blood, while the ribosome and MEND reaching the target tissue have a matrix.
  • the oligopeptide moiety is hydrolyzed by the metaprotease and the modified site such as polyalkylene glycol is eliminated. .
  • the antitumor agent retained in the lipid membrane structure is unable to maintain its structure because the stability of the ribosome and MEND from which the modification site such as polyalkylene glycol has been eliminated decreases.
  • Etc. The lipid membrane structure is efficiently incorporated into the target cell as it is by the method of releasing it outside the cell, or the other is changed to ribosome or MEND from which the modification with polyalkylene glycol is eliminated. It was found that the antitumor agent and the gene can be delivered into the target cell at a high introduction rate by combining these two methods or by combining these two methods. It was also found that an extremely high antitumor effect can be achieved by efficiently delivering an antitumor agent or gene to target cells in this way (Japanese Patent Application No. 2006-049567).
  • a lipid membrane structure such as MEND is prepared in combination with a modified phospholipid such as polyargylene glycol without the intervention of an oligopeptide and the antitumor drug gene is delivered to the malignant tumor cell as a target cell.
  • a phospholipid derivative comprising a residue of an alcoholic compound and a residue of a phospholipid, and a peptide between the residue of the alcoholic compound and the residue of the phospholipid.
  • the alcohol compound is an alcoholic compound selected from the group consisting of polyalkylene glycols, glycerins, and polyglycerins,
  • Phospholipid power Phosphatidylethanolamines, phosphatidylcholines, phosphatidylserines, phosphatidylinositols, phosphatidylglycerols, cardiolipins, sphingomyelins, ceramide phosphorylethanolamines, ceramide phosphorylglycerols Ceramide phosphorylglycerol phosphates, 1,2-dimyristoyl-1,2-deoxyphosphatidylcholines, plasmarogens, and phosphatidic acids
  • the peptide is a peptide containing a substrate peptide that can be a matrix metabolite protease substrate (however, the substrate peptide contains 1 amino acid or 2 or 8 amino acids at both ends or one end). Oligopeptides may be bound,)
  • Phospholipid derivatives and (2) A phospholipid derivative containing a residue of an alcoholic compound and a residue of a phospholipid, and containing no peptide between the residue of the alcoholic compound and the residue of the phospholipid.
  • the alcohol compound is an alcoholic compound selected from the group consisting of polyalkylene glycols, glycerins, and polyglycerins,
  • Phospholipid power Phosphatidylethanolamines, phosphatidylcholines, phosphatidylserines, phosphatidylinositols, phosphatidylglycerols, cardiolipins, sphingomyelins, ceramide phosphorylethanolamines, ceramide phosphorylglycerols , Ceramide phosphorylglycerol phosphates, 1,2-dimyristoyl-1,2-deoxyphosphatidylcholines, plasmarogens, and phosphatidic acids
  • a lipid membrane structure containing as a constituent lipid is provided by the present invention.
  • the lipid membrane structure holding a drug effective for a disease associated with a matrix meta-oral protease and a gene for gene therapy; and the lipid membrane structure being a liposome Is provided.
  • the alcohol compound is a polyalkylene glycol
  • the phospholipid is a phosphatidylethanolamine
  • the phospholipid derivative (1) wherein the peptide is a peptide containing Va) Pro- Leu- Ser- Leu- Tyr- Ser-Gly; and the phospholipid derivatives (1) and (2), the alcohol
  • the compound is polyethylene glycol
  • the phospholipid is dioleyl phosphatidylethanolamine or distearoylphosphatidylethanolamine
  • the peptide contains Gly-Gly-Gly as a linker.
  • the above lipid membrane structure; and the phospholipid derivative (1), wherein the peptide is Gly-Gly-Gly-Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Tyr-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly Lipid membrane structure
  • the body is provided.
  • the above lipid membrane structure is provided in which the ratio of the phospholipid derivative (1) and the phospholipid derivative (2) to the total lipid amount of the lipid membrane structure is about 20 mol%.
  • a pharmaceutical composition for preventing and / or treating a disease associated with a matrix meta-protease comprising the above lipid membrane structure retaining a gene for child therapy.
  • a method for treating a disease associated with matrix meta-oral protease, wherein the lipid membrane structure having a drug or gene therapy gene effective for a disease involving matrix meta-oral protease is retained in humans A method comprising the step of administering to a mammal comprising
  • the peptide portion of the phospholipid derivative (1) is cleaved by matrix meta-oral protease to release the modification site such as polyalkylene glycol, while the phospholipid derivative ( The polyalkylene glycol derived from 2) remains on the surface of the lipid membrane structure.
  • the lipid membrane structure of the present invention is stable in the blood due to the presence of the modified site, and the modified site is detached in the vicinity of malignant tumor cells or neovascular vessels that secrete matrix meta-oral protease.
  • the stability of the lipid membrane structure is reduced and the structure cannot be maintained, and the antitumor agent or gene retained in the lipid membrane structure is released outside the target cell, or the lipid membrane structure Is efficiently incorporated into the target cell, whereby a drug or gene can be efficiently introduced into the target cell. Furthermore, in the lipid membrane structure of the present invention, a part of the modification site such as polyalkylene glycol remains even in the vicinity of malignant tumor cells, new blood vessels, etc., and can maintain sufficient retention in blood. There is.
  • FIG. 1 shows the effect of MMP-2 addition on the gene expression activity of PPD-MEND and PEG-MEND in HEK293 cells.
  • FIG. 2 shows the gene expression activity of PPD-MEND in various cell lines.
  • FIG. 3 shows the results of an in vivo experiment using PPD-MEND and PEG-MEND.
  • FIG. 4 shows the results of an in vivo experiment using PEG / PPD-MEND.
  • At least one phospholipid derivative contains a residue of an alcoholic compound and a residue of a phospholipid, Al A phospholipid derivative containing a peptide between the residue of the Kolley compound and the residue of the phospholipid,
  • the alcohol compound is an alcoholic compound selected from the group consisting of polyalkylene glycols, glycerins, and polyglycerins,
  • Phospholipid power Phosphatidylethanolamines, phosphatidylcholines, phosphatidylserines, phosphatidylinositols, phosphatidylglycerols, cardiolipins, sphingomyelins, ceramide phosphorylethanolamines, ceramide phosphorylglycerols Ceramide phosphorylglycerol phosphates, 1,2-dimyristoyl-1,2-deoxyphosphatidylcholines, plasmarogens, and phosphatidic acids
  • the peptide is a peptide containing a substrate peptide that can be a matrix metabolite protease substrate (however, the substrate peptide contains 1 amino acid or 2 or 8 amino acids at both ends or one end). Oligopeptides may be bound,)
  • the other one phospholipid derivative contains an alcoholic compound residue and a phospholipid residue.
  • the alcohol compound is an alcoholic compound selected from the group consisting of polyalkylene glycols, glycerins, and polyglycerins,
  • Phospholipid power Phosphatidylethanolamines, phosphatidylcholines, phosphatidylserines, phosphatidylinositols, phosphatidylglycerols, cardiolipins, sphingomyelins, ceramide phosphorylethanolamines, ceramide phosphorylglycerols , Ceramide phosphorylglycerol phosphates, 1,2-dimyristoyl-1,2-deoxyphosphatidylcholines, plasmarogens, and phosphatidic acids
  • Examples of the alcohol compound include polyethylene glycol and polypropylene glycol. Any polyalkylene glycol, glycerin such as glycerin or glycerin ester, or polyglycerin such as diglycerin, triglycerin, tetraglycerin, pentaglycerin, hexaglycerin, heptaglycerin, or otatagglycerin can be used. . Of these, polyethylene glycol is particularly preferred, with polyalkylene glycol being preferred. When polyethylene glycol is used, the molecular weight is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art in order to impart desired properties such as retention in blood to the lipid membrane structure.
  • the residue of an alcohol compound means a group obtained by removing an appropriate atom such as a hydrogen atom or an appropriate functional group such as a hydroxyl group or a halogen atom from an alcohol compound or a chemically modified alcohol compound.
  • an appropriate atom such as a hydrogen atom or an appropriate functional group such as a hydroxyl group or a halogen atom from an alcohol compound or a chemically modified alcohol compound.
  • it means a monovalent group.
  • Residue obtained by removing a hydrogen atom from a hydroxyl group of an alcohol compound a residue obtained by removing a hydrogen atom bonded to a carbon atom of an alcohol compound, or a carboxyl group at the end of an alcohol compound
  • examples thereof include, but are not limited to, a residue obtained by introducing a functional group containing and removing a hydroxyl group or a hydrogen atom from the carboxyl group.
  • Phospholipids include phosphatidylethanolamines, phosphatidylcholines, phosphatidylserines, phosphatidylinositols, phosphatidylglycerols, cardiolipins, sphingomyelins, ceramide phosphorylethanolamines, ceramide phosphoryls Glycerols, ceramide phosphorylglycerol phosphates, 1,2-dimyristyl-1,2-deoxyphosphatidylcholines, plasmalogens, or phosphatidic acids can be used, but the fatty acid residues in these phospholipids are There is no particular limitation.
  • phospholipids having one or two saturated or unsaturated fatty acid residues having about 12 to 20 carbon atoms can be used.
  • lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid can be used.
  • Phospholipids having one or two acyl groups derived from fatty acids such as oleic acid and linoleic acid can be used.
  • phosphatidylethanolamines are preferred, such as dimyristoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE), dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE). ) Etc. But distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE) and dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE) are preferred!
  • the phospholipid residue means a group obtained by removing the above phospholipid or chemically modified phospholipid force from an appropriate atom such as a hydrogen atom or an appropriate functional group such as a hydroxyl group or a halogen atom.
  • an appropriate atom such as a hydrogen atom or an appropriate functional group such as a hydroxyl group or a halogen atom.
  • it means a monovalent group.
  • the residue obtained by removing the hydrogen atom of the phospholipid's phosphate moiety, the residue obtained by removing the hydroxyl group of the phosphate moiety of the phospholipid, and the hydrogen atom bonded to the carbon atom of the phospholipid are excluded.
  • Residues obtained by introducing a functional group containing a carboxyl group into the phosphoric acid part of the phospholipid, and the ability of the oxyl group, removing the hydroxyl group or hydrogen atom, and the like can be exemplified. None happen.
  • the peptide contained between the residue of the alcoholic compound and the residue of the phospholipid contains at least one substrate peptide that can be a substrate of the matrix metaprotease.
  • Matrix meta-oral protease is known to contain, for example, MMP-1 (interstitial collagenase), MM P-2 (gelatinase A), MMP-3, MMP-7, MMP_9 (gelatinase B), etc.
  • a substrate peptide that can serve as a substrate for one or more of these matrix metaproteases can be used.
  • Takaru Tsuruo “Molecular mechanism of cancer metastasis”, pp.92-107, Medical View, Inc., published in 1993 can be referred to.
  • Non-Patent Document 1 a specific type of matrix metaprotease described in Non-Patent Document 1 (Nature Biotechnology, 19, pp.661-667, 2001), The substrate peptides that are specifically recognized are described.
  • MMP-9! /, Va ⁇ Pro- Leu- Ser- Leu- Tyr- Ser- Gly is known as a specific substrate, and the above-mentioned octapeptides can be used as substrates for MMP-9. It is preferable to use.
  • the entire disclosure of Non-Patent Document 1 is incorporated herein by reference.
  • the peptide contained between the residue of the alcoholic compound and the residue of the phospholipid is used for binding to the residue of the alcohol compound and Z or phospholipid in addition to the substrate peptide.
  • the linker involved may include a linker having one amino acid force or a linker composed of an oligopeptide containing 2 to 8 amino acids.
  • the amino acid or oligopeptide that is a linker may be bound to both ends of the substrate peptide, or may be bound to only one end. When the linker is bonded to both ends of the substrate peptide, the two linkers may be the same or different.
  • the substrate peptide may be directly bonded to the alcohol compound residue and Z or phospholipid residue without using a linker.
  • a linker is present. It is more preferable that the same or different linker is present at both ends of the substrate peptide. 2 to 8 of the two linkers are more preferable. More preferably, they are the same or different linkers composed of oligopeptides containing the amino acids.
  • the type of one amino acid that can be used as a linker or the amino acid that constitutes the oligopeptide that can be used as a linker is not particularly limited, and any one type of amino acid or any type of 2 amino acids can be used. Any oligopeptide containing from 8 to 8 identical or different amino acids can be used.
  • the method for producing the above phospholipid derivative (1) is not particularly limited, but in general, an alcohol compound, which is a partial structure of the above phospholipid derivative, and a peptide compound are bound to each other, and the resulting peptide-bonded alcoholic alcohol is obtained.
  • a phospholipid compound can be bound to the peptide end of the compound to produce it.
  • the bond between the alcoholic compound and the peptide compound is generally the reactive functional group (for example, hydroxyl group, peptide group amino acid or carboxyl group of the peptide compound and the alcoholic compound).
  • Carboxyl group, ester group, etc. are reacted by using a hydroxyl group already present in the alcohol compound as a reactive functional group.
  • a carboxyl group is introduced into an alcohol compound by a method such as oxidizing a hydroxyl group of an alcohol compound to a carboxyl group or introducing a functional group containing a carboxyl group into an alcohol compound, and further, if necessary, It can be used as a reactive functional group by a method such as esterification of a carboxyl group.
  • a reactive functional group such as a carboxyl group or an ester group of an alcohol compound is reacted with an amino group of a peptide compound to form an amide bond, thereby forming a peptide bond alcohol.
  • a compound can be produced.
  • a method such as an acid halide method, an active ester method, or an acid anhydride can be used as this reaction.
  • an alcohol compound having a carboxyl group in an inert solvent is treated with a rogenating agent to form an acid halide, and then the resulting acid halide and the amino group of the peptide compound
  • the desired product can be obtained by reacting.
  • the kind of the solvent used in the reaction for producing the acid halide is not particularly limited, and any solvent may be used as long as it dissolves the starting material without inhibiting the reaction.
  • ethers such as jetyl ether, tetrahydrofuran and dioxane, amides such as dimethylformamide, dimethylacetamide, hexamethylphosphoric triamide, halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, and acetonitrile.
  • -Tolyls such as propionitryl, esters such as ethyl formate and ethyl acetate, or a mixed solvent thereof are preferred.
  • halogenating agent examples include thiol halides such as thionyl chloride, thiobromide, and thioiodide, sulfuryl chlorides such as sulfuryl bromide, sulfuryl bromide and sulfuryl iodide, phosphorus trichloride, and phosphorus tribromide.
  • the reaction temperature can be 0 ° C to the reflux temperature of the solvent, preferably room temperature, and the reflux temperature of the solvent.
  • the solvent used in the reaction of the obtained acid halide with the amino group of the peptide compound is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction and dissolves the starting material, but is not limited to jetyl ether, tetrahydrofuran, Ethers such as dioxane, dimethylformamide, dimethylacetamide, amides such as hexamethylphosphoric triamide, esters such as ethyl formate and ethyl acetate, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, or a mixed solvent thereof Can be mentioned.
  • an organic base such as triethylamine or pyridine can be added as necessary.
  • the active esterification method is carried out by reacting a carboxyl group of an alcohol compound with an active esterifying agent in a solvent to produce an active ester and then reacting with an amino group of a peptide compound.
  • the solvent include halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, ethers such as ether and tetrahydrofuran, amides such as dimethylformamide and dimethylacetamide, benzene, toluene and xylene.
  • aromatic hydrocarbons esters such as ethyl acetate, and mixed solvents thereof.
  • the active esterifying agent examples include N-hydroxy compounds such as N-hydroxysuccinimide, 1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide; Diimidazole compounds such as 1'-oxalyldiimidazole, ⁇ , ⁇ '-carbodidimidazole; disulfide compounds such as 2,2'-dipyridyldisulfide; ⁇ , ⁇ '-disuccini Succinic acid compounds such as midyl carbonate; phosphinic chloride compounds such as ⁇ , ⁇ '-bis (2-oxo-3-oxazolidyl) phosphinic chloride; ⁇ , ⁇ '-disuccini Midyloxalate (DSO), ⁇ , ⁇ '-diphthalimidooxalate (DPO), ⁇ , ⁇ bis (norbornene-succinimidyl) oxalate ( ⁇ ), 1,1 Benzotri
  • reaction of the amino group of the peptide compound with an active ester is, for example, a diazoalkyl dilower alkyl triphenylphosphine such as diazodiphenyltriphosphine, N-ethyl-5-phenyl.
  • N-lower alkyl-5-arylisoxazolium-3'-sulphonates such as soxazolium-3 and sulphonate
  • oxydiformates such as decyloxydiformate (DEPC), ⁇ ', ⁇ '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) -like ⁇ ', ⁇ '-dicycloalkylcarbodiimides, diheteroaryl diselenides like di-2-pyridyl diselide, triphenylphosphine Triaryl phosphines such as allylsulfol triazolides such as trobenzenesulfol triazolide, 2-chloro-1-methylpyridi Of 2-halo-1-lower alkylpyridi-umhalides, such as -mu-mudaide, diarylphosphoryl azides such as diphenylphosphoryl azide (DPPA), ⁇ , ⁇ '-carbodiimid
  • the mixed acid anhydride method is carried out by producing a mixed acid anhydride of a carboxyl group of an alcohol compound and then reacting the amino group of the peptide compound.
  • the reaction for producing a mixed acid anhydride is carried out in an inert solvent (for example, ethers such as ether and tetrahydrofuran, amides such as dimethylformamide and dimethylacetamide), ketyl carbonate and isobutyl carbonate.
  • an inert solvent for example, ethers such as ether and tetrahydrofuran, amides such as dimethylformamide and dimethylacetamide
  • ketyl carbonate and isobutyl carbonate for example, a carbonic acid lower alkyl halide, di-lower alkyl cyanophosphoric acid such as jetyl cyanophosphoric acid, and the like can be used.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of an organic amine such as triethylamine or N-methylmorpholine, the reaction temperature is ⁇ 10 ° C. to room temperature, and the reaction time is about 30 minutes to 5 hours.
  • the reaction of the mixed acid anhydride with the amino group of the peptide compound is preferably carried out in an inert solvent (eg ethers, ethers such as tetrahydrofuran, amides such as dimethylformamide, dimethylacetamide).
  • the reaction is carried out in the presence of the organic amine, and the reaction temperature is 0 ° C. to room temperature, and the reaction time is about 1 to 24 hours.
  • the condensation can also be carried out by directly reacting a carboxylic acid and an amine compound in the presence of the condensing agent. This reaction is performed in the same manner as the reaction for producing the active ester.
  • the reactive functional group (for example, carboxyl group or hydroxyl group) of the obtained peptide-bonded alcohol compound and the reactive functional group (for example, carboxyl group or amino group) of the phospholipid compound can be obtained by reacting with.
  • the amino group of the phospholipid compound is reacted with the force-loxyl group at the peptide end of the peptide bond alcohol compound.
  • the above phospholipid derivative can be produced.
  • This reaction can be performed in the same manner as the reaction described above.
  • the reaction can be performed in the presence of a condensing agent. It is preferable to carry out by the reactive ester method.
  • the target reaction may be efficiently performed by introducing a protecting group.
  • protecting groups for example, “Protective Dulps in Organic Synthesis” (P. G. M. Wuts and T. Green, 3rd edition, 1999, Wiley, John & Sons) can be referred to.
  • the ability to isolate and purify the target product by a conventional method used in the art, for example, purification by high performance liquid chromatography is suitable.
  • the above phospholipid derivatives include substances in the form of salts.
  • salts there are no particular limitations on the type of salt, but mineral salts such as hydrochloride and sulfate, organic acid salts such as oxalate and acetate, metal salts such as sodium and potassium salts, ammonium salts, and methylamine salts. And organic amine salts thereof.
  • the phospholipid derivative (2) can also be easily produced according to the above production method.
  • various types are commercially available including the following, and these can also be used.
  • the type of lipid membrane structure provided by the present invention is not particularly limited.
  • a form in which the lipid membrane structure is dispersed in an aqueous solvent for example, a single membrane ribosome, a multilayer liposome, W type emulsion, W / 0 / W type emulsion, spherical micelle, string micelle, indefinite
  • a layered structure of a mold Of these, ribosomes are preferred.
  • the size of the lipid membrane structure in the dispersed state is not particularly limited.
  • the particle diameter is 50 nm force and 5 ⁇ m, and in the case of spherical micelle, the particle diameter is 5 nm. To 100 nm. In the case of string-like micelles or irregular layered structures, the thickness per layer is 5 nm to 10 nm, and these preferably form layers.
  • the lipid membrane structure provided by the present invention includes generally used phospholipids, sterols such as cholesterol and cholestanol, carbon number of 8 to It may contain an acid-depleting agent such as 22 fatty acids having a saturated or unsaturated acyl group and ex-tocofurol.
  • phospholipids examples include phosphatidylethanolamines, phosphatidylcholines, phosphatidylserines, phosphatidylinositols, phosphatidylglycerols, cardiolipins, sphingomyelins, ceramide phosphorylethanolamines, ceramide phosphorylglycerols Ceramide phosphorylglycerol phosphates, 1,2-dimyristoyl-1,2-deoxyphosphatidylcholines, plasmarogens, phosphatidic acids, etc., and these include one or more. They can be used in combination.
  • the fatty acid residue in these phospholipids is not particularly limited, and examples thereof include saturated or unsaturated fatty acid residues having 12 to 20 carbon atoms. Specific examples include lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearin. Examples include acyl groups derived from fatty acids such as acids, oleic acid, and linoleic acid.
  • phospholipids derived from natural products such as egg yolk lecithin and soybean lecithin can also be used for the preparation of the lipid membrane structure of the present invention.
  • 1,2-bis (oleoyloxy) -3- (trimethylammo-o) propane DOTAP
  • 1- ⁇ , ⁇ -dimethylaminodiole oilpropane DO DAP
  • 1-oleoyl-2 -Hydroxy-3- ⁇ , ⁇ -dimethylaminopropane 1,2-diacyl-3- ⁇ , ⁇ -dimethylaminopropane, 1,2-didecanyl-1-- ⁇ , ⁇ -dimethylaminopropane, 3- j8- [ ⁇ -[( ⁇ ', ⁇ '-dimethylamino) ethane] power rubermoyl] cholesterol (DC-Chol), 1,2-dimyristoxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammo-umbromide (DMRIE), And 1,2-dioloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammo-bromide (DORI) can also be used.
  • DC-Chol 1,2-dim
  • the ratio of the above phospholipid derivatives (1) and (2) is particularly Although not limited, for example, the molar ratio of phospholipid derivative (1): phospholipid derivative (2) is preferably in the range of 10: 1 to 1:10, and is preferably in the range of 4: 1 to 1: 4. More preferably, the molar ratio is about 1: 1.
  • the ratio of the phospholipid derivative (1) and the phospholipid derivative (2) (total amount) to the total lipid amount of the lipid membrane structure is not particularly limited! For example, the ratio is about 5 to 40 mol%. Preferably, it is about 10-30 mol%, and more preferably about 20 monole%.
  • the lipid membrane structure of the present invention can contain, for example, a lipid derivative having a blood retention function, a temperature change sensitivity function, a pH sensitivity function, and the like as the membrane constituent lipid.
  • a lipid derivative having a blood retention function, a temperature change sensitivity function, a pH sensitivity function, and the like as the membrane constituent lipid.
  • One or more of these functions can be imparted, and by adding these functions, for example, retention of lipid membrane structures containing drugs and Z or genes in the blood It is possible to improve the property and reduce the capture rate by reticuloendothelial tissue such as liver or spleen, or to increase the release of drugs and Z or genes.
  • Examples of the blood-retaining lipid derivative capable of imparting a blood-retaining function include glycophorin, gandarioside GM1, phosphatidylinositol, gandarioside GM3, a glucuronic acid derivative, and a glutamic acid derivative.
  • Examples of the temperature change sensitive lipid derivative capable of imparting a temperature change sensitive function include dipalmitoyl phosphatidylcholine and the like.
  • Examples of pH-sensitive lipid derivatives that can impart a pH-sensitive function include dioleoyl phosphatidylethanolamine and the like.
  • the form of the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited.
  • the phospholipid derivatives (1) and (2) described above together with the phospholipid that is a membrane component of the lipid membrane structure are used.
  • a form in which a lipid membrane structure is formed is preferred. More specifically, for example, a form in which the above phospholipid derivatives (1) and (2) become a membrane constituent together with other phospholipids and the like to form a lipid membrane structure, for example, a liposome. .
  • the form of the lipid membrane structure of the present invention and the production method thereof are not particularly limited! However, the form may be, for example, the form of a dried mixture, the form dispersed in an aqueous solvent or the like. A dried form or a frozen form can be exemplified. Below this Although the method for producing the lipid membrane structure of these forms will be described, the form of the lipid membrane structure of the present invention and the production method thereof are not limited to the above-described form or the production method described below.
  • the method for producing the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited.
  • the lipid membrane structure in the form of a dried mixture is, for example, once all the components of the lipid membrane structure are cloned. It can be produced by dissolving in an organic solvent such as oral form, and then drying under reduced pressure with an evaporator or spray drying with a spray dryer.
  • the form in which the lipid membrane structure is dispersed in an aqueous solvent is produced by adding the above-mentioned dried mixture to the aqueous solvent and further emulsifying with an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, a high-pressure jet emulsifier or the like. be able to. It can also be produced by a method well known as a method for producing ribosomes, such as a reverse phase evaporation method. If the size of the lipid membrane structure is controlled, use a membrane filter with a uniform pore size, etc., and perform extrusion (extrusion filtration) under high pressure.
  • the composition of the aqueous solvent is not particularly limited.
  • a buffer solution such as phosphate buffer solution, kenate buffer solution, phosphate buffered saline solution, physiological saline solution, etc.
  • a medium for cell culture such as phosphate buffer solution, kenate buffer solution, phosphate buffered saline solution, physiological saline solution, etc.
  • aqueous solvents have the ability to stably disperse lipid membrane structures.Furthermore, glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose sugar monosaccharides, lactose, sucrose, cellopiouse, Disaccharides such as trehalose and maltose, trisaccharides such as raffinose and merezinose, polysaccharides such as cyclodextrin, sugars (aqueous solutions) such as sugar alcohols such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, maltitol, glycerin, Diglycerin, polyglycerin, propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol monoalkyl ether, diethylene glycol monoalkyl Add poly
  • the pH of the aqueous solvent (dispersion medium) is changed from weakly acidic to near neutral. It is desirable to remove dissolved oxygen by setting (pH 3.0 to 8.0) or by nitrogen publishing.
  • the form obtained by drying or freezing the form in which the lipid membrane structure is dispersed in the aqueous solvent is a method of drying or freezing the lipid membrane structure dispersed in the aqueous solvent by ordinary freeze drying or spray drying. Etc. can be manufactured. Once a lipid membrane structure in a form dispersed in an aqueous solvent is manufactured and then dried, the lipid membrane structure can be stored for a long period of time. An aqueous solution containing a medicinal component is added to the dried lipid membrane structure. Then, since the lipid mixture is efficiently hydrated, there is an advantage that the medicinal component can be efficiently retained in the lipid membrane structure.
  • sugars aqueous solutions
  • trisaccharides such as melezinose
  • polysaccharides such as cyclodextrin
  • sugar alcohols such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol and maltitol.
  • the above-mentioned sugar is glycerin, diglycerin, polyglycerin, propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol mono
  • a polyhydric alcohol aqueous solution
  • alkyl ether, diethylene glycol monoalkyl ether, or 1,3-butylene glycol it can be stably stored for a long time.
  • a combination of sugar and polyhydric alcohol is glycerin, diglycerin, polyglycerin, propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol mono
  • the concentration of the sugar or polyhydric alcohol in the form in which the lipid membrane structure is dispersed in the aqueous solvent is not particularly limited, but in the state in which the lipid membrane structure is dispersed in the aqueous solvent, for example, sugar (aqueous solution) is 2 to 20% (W / V) is preferred 5-10% (W / V) is more preferred.
  • the polyhydric alcohol (aqueous solution) is preferably 1 to 5% (W / V), more preferably 2 to 2.5% (W / V) force S.
  • the concentration of the buffer is preferably 5 to 50 mM, more preferably 10 to 20 mM.
  • the concentration of the lipid membrane structure in the aqueous solvent (dispersion medium) is not particularly limited, but the concentration of the total amount of lipid in the lipid membrane structure is preferably 0.1 mM to 500 mM, more preferably 1 mM to 100 mM.
  • the lipid membrane structure of the present invention can retain a drug effective for a disease associated with matrix meta-oral protease and a gene for Z or gene therapy. “Retained” means that the drug and Z or gene are present in the lipid membrane of the lipid membrane structure, on the surface, inside, in the lipid layer, and on the surface of the Z or lipid layer.
  • the drug and z or gene can be encapsulated inside the microparticle.
  • the amount of drug and Z or gene to be retained in the lipid membrane structure is not particularly limited as long as it is an amount sufficient to exert their medicinal effects effectively in a living body (cell).
  • the type of drug and Z or gene is not particularly limited, and may be appropriately determined depending on the type of target tissue or disease and the form of the lipid membrane structure.
  • Diseases related to matrix meta-oral protease include malignant tumor, emphysema, pulmonary fibrosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, periodontitis, corneal ulcer, uveitis, diabetic retinopathy, proliferative vitreous Age-related macular degeneration, blistering disease, chronic skin ulcer, multiple sclerosis, glomerulonephritis, lupus nephritis, chronic hepatitis, cirrhosis, heart failure, etc.
  • an antitumor agent can be mentioned as an example.
  • Antitumor agents include, for example, irinotecan hydrochloride, nogitane hydrochloride, exatecan, RFS-2000, Lurtotecan, BNP-1350, Bay-38344 41, PNU-166148, IDEC-132, BN-80915, DB-38, DB- 81, DB-90, DB-91, CKD-6 20, T-0128, ST-1480, ST-1481, DRF-1042, DE-310 and other camptothecin derivatives, docetaxel hydrate, paclitaxel, IND-5109 , BMS-184476, BMS-188797, T-3782, TAX-1011, SB-RA-31012, SBT-1514, DJ-927 and other taxane derivatives, ifosfamide, hydrochloric acid-mustine, carbocon, cyclophosphamide, dacarbazine, thiotepa , Busulfan, melphalan, ramustine, est
  • the gene represents a nucleic acid, and may be any of oligonucleotide, DNA, or RNA, and is not particularly limited as long as it is a gene that is effective in a disease associated with matrix metaloprotease when expressed in vivo. It shouldn't be.
  • a gene having an anti-malignant tumor action or a gene having an angiogenesis-inhibiting action specifically, a gene for gene therapy such as malignant tumor age-related macular degeneration can be mentioned.
  • Genes for gene therapy include antisense oligonucleotides, antisense DNA, antisense RNA, shRNA, siRNA, enzymes, and site force-in related to angiogenesis and cell proliferation in malignant tumors, age-related macular degeneration, etc. Examples include bioactive substances, antisense RNA, shRNA, and genes encoding siRNA.
  • lipid membrane structure contains a gene
  • a compound having a gene introduction function as a component of the lipid membrane structure in order to efficiently introduce the gene into the target cell.
  • examples of such compounds include ⁇ , ⁇ '- ⁇ -didodecanol- (-( ⁇ -trimethylammo-oacetyl) -diethanolamine mouthlid, ⁇ , ⁇ '- ⁇ -ditetradecanol- ⁇ - ( ⁇ -trimethyl Ammo-oacetyl) -diethanolamine, ⁇ , ⁇ '- ⁇ -dihexadecanol- ⁇ - ( ⁇ -trimethylammo-oacetyl) monoethanolamine, 0,0 Cenoyl ⁇ - ( ⁇ -trimethylammo-oacetyl) diethanolamine chloride, ⁇ , ⁇ ', ⁇ "-tridecanol- ⁇ - ( ⁇ trimethylammo-odecanol) aminomethanone bromide and Naru [
  • the lipid membrane structure may contain an antibody that specifically recognizes a target cell or matrix meta-oral protease.
  • an antibody a monoclonal antibody is preferable.
  • the antibody for example, one type of monoclonal antibody against a single epitope may be used, or two or more types of monoclonal antibodies having specificity for various types of epitopes may be used in combination.
  • Either a monovalent antibody or a multivalent antibody may be used.
  • Natural molecules or fragments or derivatives thereof may be used. For example, F (ab ')
  • the lipid membrane structure of the present invention retaining a drug effective for a disease associated with matrix meta-oral protease and a gene for Z or gene therapy is used for the prevention and Z or treatment of a disease associated with matrix meta-oral protease.
  • It can be used as a pharmaceutical thread composition for
  • the existence form of the pharmaceutical composition of the present invention and the production method thereof are not particularly limited, and it can be prepared in the same form as the above lipid membrane structure.
  • examples of the form include a mixed dried form, a form dispersed in an aqueous solvent, a dried form, and a frozen form.
  • the mixed dry product form includes a component of the lipid membrane structure and a drug effective for a disease associated with matrix metaprotease and a gene for Z or gene therapy, and an organic substance such as chloroform. It can be produced by dissolving in a solvent to obtain a mixture, and then subjecting this to vacuum drying with an evaporator or spray drying with a spray dryer.
  • Fat Several methods are known for producing pharmaceutical compositions in a form dispersed in an aqueous solvent containing a membranous membrane structure, drug, and z or gene, and diseases involving matrix meta-mouth protease in lipid membrane structures. An appropriate production method can be selected as described below according to the retention method of the drug effective for the gene and the gene for z or gene therapy, the properties of the mixture, and the like.
  • an aqueous solvent is added to the above-mentioned mixed and dried product, and further emulsified by an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, a high-pressure jet emulsifier or the like.
  • an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, a high-pressure jet emulsifier or the like.
  • a membrane filter having a uniform pore size may be used to perform extrusion (extrusion filtration) under high pressure.
  • a lipid membrane structure is prepared in order to prepare a mixed dried product of a lipid membrane structure component and a drug effective for a disease involving matrix meta-oral protease and a gene for Z or gene therapy.
  • An aqueous system containing a drug and / or a gene for gene therapy that is effective for diseases related to matrix meta-oral protease after the components of the lipid membrane structure are once dissolved in an organic solvent, and then the organic solvent is distilled off.
  • This is a method for producing by emulsifying by adding a solvent.
  • a membrane filter with a further uniform pore size may be used to perform extrusion (extrusion filtration) under high pressure. It is difficult to dissolve in organic solvents, but it can be dissolved in aqueous solvents.
  • the inner aqueous phase portion has the advantage that it can hold drugs effective for diseases involving matrix meta-oral proteases and genes for Z or gene therapy.
  • An aqueous solvent containing a lipid membrane structure such as ribosome, emulsion, micelle, or layered structure, already dispersed in an aqueous solvent, and a drug effective for diseases involving matrix meta-oral protease and a gene for Z or gene therapy It is a method of manufacturing by adding.
  • Water-soluble drugs can be used as drugs effective for diseases related to the matrix meta-oral protease of interest and genes for Z or gene therapy. This is a method of adding drugs and Z or genes for gene therapy that are effective for diseases involving matrix meta-oral proteases to external lipid membrane structures, and therefore effective for diseases involving Matrix meta-oral proteases.
  • the drug and the gene for z or gene therapy are macromolecules, the drug effective for the disease involving matrix meta-oral protease and the gene for Z or gene therapy cannot enter the lipid membrane structure. , There is a possibility that it exists in the presence (bonded) on the surface of the lipid membrane structure.
  • ribosome is used as the lipid membrane structure, using this production method 3, drugs effective for diseases involving matrix meta-protease and z or genes for gene therapy are sandwiched between liposome particles. It is known to form a sandwich structure (generally called a complex or complex).
  • an aqueous dispersion of a lipid membrane structure alone is produced in an aggressive manner, so that drugs effective for diseases involving matrix metalloproteases during emulsification and degradation of genes for gene therapy or the like. It is also easy to control the size (particle diameter) that does not need to be considered. Therefore, it can be manufactured relatively easily as compared with manufacturing method 1 and manufacturing method 2.
  • Aqueous solvent containing drugs and / or genes for gene therapy effective for diseases involving matrix meta-oral proteases in the dried product obtained by producing and drying lipid membrane structures dispersed in aqueous solvents It is the method of manufacturing by adding. Drugs that are effective for diseases related to the target matrix meta-oral protease and Z as in production method 3. Alternatively, a water-soluble gene can be used as a gene for gene therapy. The difference from production method 3 is the existence pattern of drugs effective for diseases involving lipid membrane structures and matrix meta-oral proteases and genes for Z or gene therapy. In this production method 4, aqueous solvent is used.
  • the lipid membrane structure exists in the solid state as a fragment of the lipid membrane, since the dried lipid membrane structure is first produced and then dried.
  • a solvent in which sugar (aqueous solution), preferably sucrose (aqueous solution) or lactose (aqueous solution) is further added to an aqueous solvent is used.
  • sugar aqueous solution
  • sucrose aqueous solution
  • lactose aqueous solution
  • the lipid membrane fragments that existed in a solid state are rapidly removed with the invasion of water. It can begin to hydrate and reconstitute the lipid membrane structure.
  • the drug and Z or gene for gene therapy are effective for a disease related to matrix meta-oral protease
  • the drug and Z or gene effective for the disease related to matrix meta-protease are used.
  • Genes for treatment do not enter the lipid membrane structure, but are present on the surface of the lipid membrane structure, but the production method 4 differs greatly in this respect. That is, a drug effective for a disease involving matrix meta-oral protease and a part or all of a gene for Z or gene therapy are incorporated into the lipid membrane structure.
  • a dispersion of a lipid membrane structure alone is produced in advance, so that the drug effective for diseases involving matrix meta-oral protease during emulsification and the degradation of Z or gene for gene therapy are considered. It is easy to control the size (particle diameter) that does not need to be adjusted. Therefore, it is relatively easy to manufacture compared to manufacturing method 1 and manufacturing method 2.
  • a dry preparation that easily guarantees the storage stability as a preparation (pharmaceutical composition) is selected from drugs effective for diseases involving matrix meta-oral protease and Z or It can be restored to its original size (particle size) by rehydration with an aqueous gene solution for gene therapy, and even if it is a macromolecular antitumor agent and Z or gene, the matrix Effective for diseases involving oral proteases Advantages include easy retention of drugs and genes for z or gene therapy.
  • Another method for producing a form in which a mixture of a lipid membrane structure and a drug effective for a disease involving matrix meta-protease and Z or a gene for gene therapy is dispersed in an aqueous solvent includes ribosome A method well known as a method for producing can be employed, such as a reverse phase evaporation method. In order to control the size (particle diameter), extrusion (extrusion filtration) may be performed under a high pressure using a membrane filter having a uniform pore diameter.
  • freezing can be performed.
  • aqueous solvent As the aqueous solvent at this time, the aforementioned sugar (aqueous solution), preferably sucrose (aqueous solution) is used.
  • lactose (aqueous solution) is preferred.
  • a method of further freezing a dispersion in which a mixture of a lipid membrane structure and a drug effective for a disease associated with matrix metabolite protease and a gene for gene therapy or a gene therapy is dispersed in an aqueous solvent a normal freezing method is used.
  • the lipid membrane structure in which the antibody is held on the surface of the lipid membrane structure is a drug and Z or gene effective for diseases involving lipid membrane components and matrix metaloproteinases according to the above production methods 1 to 4.
  • a lipid membrane structure is produced using a gene for treatment, and an antibody is added at the next stage V to obtain a composition in which the antibody is present (bound) on the membrane surface of the lipid membrane structure. Can be manufactured.
  • the lipid membrane structure in which the antibody is held on the surface of the lipid membrane structure is a drug and Z or gene effective for diseases involving lipid membrane components and matrix metaloproteinases according to the above production methods 1 to 4.
  • the lipid membrane structure is manufactured using the gene for treatment, and then the antibody is added to the lipid derivative capable of reacting with the mercapto group in the antibody, thereby allowing the antibody to adhere to the surface of the membrane of the lipid membrane structure. It is possible to produce a composition that is present (bound) in [0063]
  • Lipids that can be blended in the preparation of the lipid membrane structure of the present invention are appropriately selected according to the type of drug effective for diseases related to the matrix metalloprotease to be used and the gene for Z or gene therapy.
  • an antitumor agent when used as a drug, 0.1 to 1000 parts by mass as total lipid is preferable with respect to 1 part by mass of the antitumor agent, and 0.5 to 200 parts by mass is more preferable.
  • a gene when used, 1 to 500 nmol is preferable as the total lipid per 1 g of the gene, more preferably 10 to 200 nmol.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprising a drug effective for a disease involving matrix meta-oral protease and a lipid membrane structure retaining a gene for Z or gene therapy is used for the prevention and prevention of a disease involving matrix meta-oral protease.
  • Diseases that can be prevented and Z or treated by the pharmaceutical composition of the present invention should not be limited.
  • the type of malignant tumor is not particularly limited. Malignant tumors are preferred.
  • malignant tumor cells include fibrosarcoma, squamous cell carcinoma, neuroblastoma, breast cancer, gastric cancer, hepatocellular carcinoma, bladder cancer, thyroid tumor, urothelial carcinoma, glioblastoma, acute myeloid leukemia Examples include cells such as splenic cancer and prostate cancer, but are not limited to these cells.
  • an antitumor agent and Z as an effective drug for diseases involving matrix meta-oral protease at the angiogenic tip site inside the tumor.
  • the gene can be delivered efficiently.
  • the angiogenic tip in the tumor is not limited to the force that can include endothelial cells at the ruffling edge.
  • the blood has superior blood due to the presence of modifying sites such as polyalkylene glycol.
  • modifying sites such as polyalkylene glycol.
  • the modified site is eliminated, so that the matrix meta-oral protease contained in the pharmaceutical composition of the present invention is obtained.
  • the drug and Z or gene therapy gene effective for a disease associated with the drug is released, or the pharmaceutical composition is easily taken up by the target cell, so that the effect of the drug and Z or gene on the cell is improved. Can be demonstrated.
  • some modification sites do not leave the lipid membrane It remains on the surface of the structure to give appropriate retention in blood.
  • the administration method of the pharmaceutical composition containing the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited, and either oral administration or parenteral administration can be selected.
  • the dosage form for oral administration include tablets, powders, granules, syrups, capsules, liquids for internal use and the like
  • dosage forms for parenteral administration include injections, drops, Eye drops, ointments, suppositories, suspensions, poultices, lotions, aerosols, plasters and the like can be mentioned.
  • the preferred administration methods for injections or infusions include intravenous injections, arterial injections, subcutaneous injections, intradermal injections, and local injections into target cells and organs. it can.
  • the dosage and administration period of the pharmaceutical composition of the present invention are not particularly limited, and it is effective for diseases involving matrix meta-oral protease acting as an active ingredient, and the type and amount of gene for Z or gene therapy.
  • an appropriate dose and administration period can be appropriately selected according to various conditions such as the type of lipid membrane structure, the type of target disease, the weight and age of the patient, and the like.
  • a lipid membrane structure using the above phospholipid derivative (1) is disclosed in Japanese Patent Application No. 2006-049567. The entire disclosure of the above specification is incorporated herein by reference.
  • NHS was purchased from Wako Pure Chemical.
  • DCC was purchased from Kanto Chemical.
  • GPC used Tosoh8120 (Tosoh Corporation), detector Tosoh HLC-8120 (RI), column TSK-Gel SuperHZ3000, 2500, carrier was set to THF, flow rate was 0.35 mL / min, and temperature was set to 40 ° C.
  • 'H-NMR was measured using JEOL EX-400 (400 MHz).
  • TOF-MS was measured using Bruker MALDI-TOF-MS Reflex II.
  • Dialysis membrane Spectra / Por Membren MWCO 1,000 was purchased from Spectrum.
  • Peptides were purchased from Grainer Japan. The sequence was Gly-Gly-Gly-Va-Pro-Leu-Ser-Leu-Tyr-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly and the molecular weight was 1178.9.
  • the number average molecular weight (Mn) was 1,678, and the weight average molecular weight (Mw) was 1,825.
  • the polydispersity obtained by Mw / Mn was as low as 1.078, and a monodisperse peak was obtained with GPC. Therefore, it was judged that the polymerization of PEG was sufficiently advanced.
  • the ratio was approximately 1: 1, confirming the introduction of carboxylic acid at the ends.
  • the interval between the peaks was 44, which was confirmed to be the molecular weight of each unit of PEG.
  • Table 1 shows the theoretical and measured molecular weight for each n number. The measurement error for each n is within 2 mass, indicating that the target compound was obtained.
  • the ⁇ -NMR ⁇ vector was measured, and the NHS group introduction rate (the integration ratio of the peak derived from the 3.37 ppm methoxy group and the peak derived from the 2.84 ppm NHS group) was 97.3%, almost 100% It was confirmed that NHS groups were introduced at a ratio of
  • ⁇ -NMRCCDCl ⁇ (ppm) 2.78 (t, 2H), 2.84 (s, 4H), 2.95 (t, 2H), 3.37 (s, 3H), 3.
  • MEND modified only with PEG using PEG-modified lipid PEG-DSPE
  • PEG-peptide-DOPE PEG-MEND
  • PEG-MEND PEG-peptide-DOPE
  • PEG-MEND MEND modified only with PEG-peptide
  • PEG / PPD-MEND MEND modified with PEG and PEG-peptide
  • the lipid composition of the lipid membrane was adjusted to 100% by adding a 1 mM ethanol solution DOTAP, DOPE, and Choles terol to a glass test tube at a ratio of 3: 4: 3, respectively.
  • PEG-DS as a 1 mM ethanol solution for PEG and P EG-peptide modification at a 1: 1 ratio PE and PPD were added in half amounts so that the total modification concentration was 5, 15, or 20 mol%. Thereafter, an equal amount of black mouth form and ethanol solution were added, and the mixture was stirred and mixed with a vortex, and then the solvent was distilled off with a desiccator to prepare a lipid membrane.
  • [ 3 H] labeling [ 3 H] labeling, [ 3 H] -Cholesteryl hexadecyl ether (CHE) was added to the lipid membrane solution.
  • MEND was prepared by adding a compacted body to a lipid membrane and subjecting it to lysis. Prepared MEND particle size ⁇ or dynamic light scattering (DLS)
  • HT1080 (derived from human fibroblastoma) is seeded, and after 24 hours, DMEM is recovered from each well of a 24 well-plate (4 X 10 4 cells / 500 ul DMEM / well), and 1000 rpm, 4 to remove cells. Centrifugation was performed at ° C for 5 minutes, and the supernatant was used as a conditioned medium for the experiment.
  • Reporter Lysis Buffer 75 ⁇ L / well was added and frozen at ⁇ 80 ° C. After 30 minutes, thaw the frozen plate at room temperature and use CELL SCRAPER on the cells on ice. After removing the lysate and recovering the Lysis solution, the supernatant was recovered by centrifugation (4 ° C, 15,000 rpm, 5 minutes). The luciferase activity (RLU) per 20 / zL of the supernatant was measured, the supernatant was diluted 5-fold with DDW, protein quantification was performed by the BCA method, and RLU / mg protein was calculated.
  • RLU luciferase activity
  • MMP-2 MMP-2 low expressing cells.
  • MMP-2 Matrix Metalloproteinase-2
  • HOS 28.7 people 4.52 ng / ml
  • PC-3 7.09 people 3.06 ng / ml
  • HT1080 cells (1 X 10 6 cells) were transplanted subcutaneously in the back of B ALB / c nude mice (male: 5 weeks old), and the tumor size (major axis) was determined. Cancer-bearing mice having a size of 12-18 mm were used.
  • MEND kinetic experiments [3 H] labeled MEND (7.5 ⁇ g pDNA / 125 L in HBG, 0.5 m M lipid) was administered from the tail vein, collected blood and tumor tissue in the time course, it respectively 3 H count was measured, and blood concentration and tumor migration were calculated as% ID / ml and% ID / g tumor.
  • MEND 25 ⁇ g pDNA / 420 ⁇ L HBG, 0.5 mM lipid
  • Tumor tissue was homogenized in Lysis buffer (0.1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 0.1 M Tris-HC1, pH 7.8) 4.
  • C centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, the luciferase activity was measured for the supernatant, and the gene expression level was calculated as RLU / g tumor.
  • the expression activity of 5% PPD-MEND was about 4 to 5 times higher than that of 5% PEG-MEND (FIG. 1, white bar).
  • the expression activity of 5% PPD-MEND when using Conditioned medium is 14.3 times higher than that of 5% PEG-MEND. Yes (gray bar), when medium containing MMP-2 was used, the expression activity was 24.8 times (black bar), and in all cases, the value was significantly higher than usual. Under these conditions, there was no change in the expression activity in the PEG-unmodified group. Based on the above results, the expression activity of 5% PPD-MEND is considered to have increased due to cleavage of PEG in the medium containing MMP.
  • the blood concentration of PPD-MEND was inferior to that of PEG-MEND, but it was suggested that the PPD modification, which is significantly higher than that of MEND, provides some retention in blood (Fig. 3 (a )).
  • the gene expression activity in tumors of PEG-MEND and PPD-MEND showed an increase or decrease trend similar to the amount of tumor migration, but the expression level in 20% PEG-MEND and 20% PEG / PPD-MEND was 60%. A large difference more than doubled was observed (Fig. 4 (c)). Furthermore, the expression activity per unit transfer amount obtained by dividing the expression level by the transfer amount increased 90 times or more. This result shows that when the ratio of PEG: PEG-peptide modification is 1: 1 at a PEG concentration of 20%, the combined effect of increased transition to tumor and increased MEND activation due to peptide cleavage was demonstrated synergistically. it is conceivable that.
  • the lipid membrane structure of the present invention exhibits excellent retention in the blood due to the presence of modified sites such as polyalkylene glycol in the blood, while separating the matrix metaprotease.
  • modified sites such as polyalkylene glycol
  • the drug can be released by the removal of the modified site, or it can be easily taken up by the target cell, so that the drug can be removed from the cell. The effect by can be exhibited.

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Abstract

　アルコール化合物の残基とリン脂質類の残基とを含み、該アルコール化合物の残基とリン脂質の残基との間にペプチドを含むリン脂質誘導体(1)、及び該ペプチドの介在のない上記リン脂質誘導体(2)を含む脂質膜構造体（ただし(a)該アルコール化合物はポリアルキレングリコール類などのアルコール化合物であり、(b)該リン脂質はホスファチジルエタノールアミン類、ホスファリジルコリン類、又はホスファチジルセリン類などのリン脂質であり、及び(c)該ペプチドはマトリックスメタロプロテアーゼの基質となりうる基質ペプチドを含むペプチドである）であって、抗腫瘍剤を担持した例えばリポソーム形態である脂質膜構造体。

Description

明 細 書
腫瘍組織で選択的に分解性を示す血中滞留性素子
技術分野
[0001] 本発明は、ペプチドを介してポリアルキレングリコールなどが結合されており、リポソ ームなどの脂質膜構造体の構成脂質として有用なリン脂質誘導体、及び該リン脂質 誘導体を含み、腫瘍組織等で選択的に分解性を示す血中滞留性素子に関する。 背景技術
[0002] 薬剤を患部に特異的に輸送する手段としてリボソームに薬剤を封入する方法が提 案されている。特に、悪性腫瘍の治療分野において抗腫瘍剤を封入したリボソーム の有効性が数多く報告されている。また、多機能性エンベロープ型ナノ構造体 (MEN D: Multilunctional envelope-type nano device ;以下、本明細書において「MEND」と 略す場合がある。）が提案されており、この構造体は、遺伝子などを特定の細胞内に 選択的に送達するためのドラッグデリバリーシステムとして用いることができ、例えば、 腫瘍の遺伝子治療などに有用であることが知られている。
[0003] もっとも、リボソームや上記の MENDなどの微粒子キャリア一は静脈内に投与した場 合に血液中での滞留性が悪ぐ肝臓や脾臓などの細網内皮系組織に捕捉され易い という問題を有している。また、これらの微粒子キャリアーでは、封入物の漏出が起き たり、微粒子が凝集するという問題もある。これらの問題は、薬剤を封入したリポソ一 ムゃ遺伝子を封入した上記の MENDを用いて標的臓器や標的細胞に薬剤や遺伝子 を送達させるターゲッティング療法を行うに際して大きな障害となって 、た。
[0004] 上記の問題を回避するための手段として、リボソームなどの微粒子キャリアーの表 面をポリアルキレングリコール（PEG:ポリエチレングリコールなど）で修飾する手段が 提案されている（Biochim. Biophys. Acta, 1066, pp.29- 36, 1991; FEBS Lett., 268, p p.235-237, 1990; Biochim. Biophys. Acta, 1029, pp.91- 97, 1990)。この手段は、 PE Gによる水和層がリボソームなどの微粒子キャリアを覆うと血清タンパク吸着などォプ ソニンィ匕が抑制され、その結果、マクロファージによる貪食と細網内皮系組織による 取り込みを回避できることに基づく。この目的のために、ポリアルキレングリコールを結 合したリン脂質が提案されており、このリン脂質を用いてリボソームの表面をポリアル キレングリコールで修飾できることが知られている。また、粒子径を 100〜200 nmに制 御した PEG修飾リボソームは EPR (Enhanced Permeability and Retention)効果により 固形腫瘍にほぼ選択的に集積し、血中に再び回収されることなく長時間にわたり腫 瘍内に維持される（EPR効果について Cancer Res., 46, pp.6387- 6392, 1986を参照 のこと)。
[0005] しかしながら、リボソームなどの微粒子キャリアーの表面をポリアルキレングリコール で修飾した場合には、血中滞留性は改善するものの、標的細胞の内部に微粒子キヤ リア一が取り込まれに《なるという新たな問題が生じることが知られている。この問題 は、特に、薬剤封入リボソームや遺伝子封入 MENDを用いて標的細胞に特異的に抗 腫瘍剤や遺伝子を送達するターゲッティング治療にぉ ヽて、期待したほどの治療効 果を達成できず、また標的細胞に送達されなかった抗腫瘍剤や遺伝子による副作用 も十分に回避できないという深刻な問題を引き起こしている。
[0006] 一方、腫瘍細胞は増殖や浸潤 '転移の過程で細胞外マトリックス (ECM)を分解-再 構築するが、マトリックスメタ口プロテアーゼ (MMP)が重要な役割を果たしていること が知られている（Cell. 91, pp.439- 442, 1997; APMIS, 107, pp.137- 143, 1999)。 MM Pには 20以上のファミリーが同定されており、分泌型と細胞膜上に存在する膜型に分 類されている。 MMPはコラーゲンなどの ECMを分解する機能を有している力 最近の 研究で MMPにより特異的に分解 '切断されるペプチド配列が明らかとなつて!/、る (Nat ure Biotechnology, 19, pp.661- 667, 2001)。
[0007] また、リボソームの構成脂質として利用可能なペプチド結合リン脂質が知られている (特表 2003-513009号公報)。上記公報には、このリン脂質のペプチドは PEG (ポリェチ レンダリコール)などで修飾されて 、てもよ 、との説明がある（上記公報 [0016]段落)。 このリン脂質のペプチドがぺプチダーゼにより開裂されると、この脂質を構成脂質とし て含むリボソームが不安定ィ匕して含有物がその部位で放出されるので、ぺプチダー ゼ分泌細胞に対して特異的に含有物を送達することができる。また、上記べプチダ ーゼとしてはマトリックスメタ口プロテアーゼを利用でき、腫瘍細胞をターゲットとしてリ ポソームを利用できることが教示されて!、る（上記公報 [0021]段落及び [0042]段落)。 もっとも、このリン脂質を用いたリボソームによる薬剤又は遺伝子の送達効率は十分と は言えない。
非特許文献 l :Nature Biotechnology, 19, pp.661, 2001
特許文献 1：特表 2003-513009号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明の課題は、表面をポリアルキレングリコールなどで修飾したリボソームや MEN Dなどの脂質膜構造体を微粒子キャリア一として用いて、マトリックスメタ口プロテア一 ゼの関わる疾患 (悪性腫瘍、肺気腫、肺線維症、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、 歯周炎、角膜潰瘍、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体、加齢黄斑変性症 、水泡性疾患、慢性皮膚潰瘍、多発性硬化症、糸球体腎炎、ループス腎炎、慢性肝 炎、肝硬変、心不全など)の予防'治療に関する手段を提供することにある。より具体 的には、マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる悪性腫瘍などの疾患部位や新生血 管の近傍に抗腫瘍剤などの薬物や悪性腫瘍等の遺伝子治療のための遺伝子を送 達し、引いては標的細胞内に送達するにあたり、標的細胞の内部に抗腫瘍剤などの 薬物や遺伝子を効率的に取り込ませる手段を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、ポリアルキレング リコールなどで修飾した特定のリン脂質にぉ 、て、ポリアルキレングリコールなどの修 飾部分とリン脂質部分との間にマトリックスメタ口プロテアーゼにより加水分解可能な オリゴペプチドを介在させ、その脂質を用いてリボソームや MENDなどの脂質膜構造 体を調製して抗腫瘍剤や遺伝子などの微粒子キャリア一として用いると、血中にお!ヽ てはポリアルキレングリコールなどの修飾部位の存在により該リボソームや MENDの 高 ヽ血中滞留性が保たれる一方で、標的組織に到達した該リボソームや MENDでは 、マトリックスメタ口プロテアーゼにより該オリゴペプチド部分が加水分解されてポリア ルキレングリコールなどの修飾部位が脱離することになる。その結果、一つは、ポリア ルキレングリコールなどの修飾部位が脱離したリボソームや MENDの安定性が低下し てその構造を保つことができずに、脂質膜構造体に保持された抗腫瘍剤等を標的細 胞の外部にて放出する方法によって、またもう一つは、ポリアルキレングリコールなど による修飾が脱離したリボソームや MENDに変化してこれらの脂質膜構造体がそのま ま標的細胞に効率的に取り込まれる方法によって、あるいはこれら二つの方法が合 わさること〖こよって、高い導入率で抗腫瘍剤や遺伝子を標的細胞内に送達できること を見出した。また、このようにして効率的に抗腫瘍剤や遺伝子を標的細胞に送達する ことにより、極めて高い抗腫瘍効果を達成できることを見出した (特願 2006— 049567 号明細書)。
[0010] 本発明者らは、さらに研究を重ねるうち、ポリアルキレングリコールなどの修飾部分 とリン脂質部分との間にマトリックスメタ口プロテアーゼにより加水分解可能なオリゴぺ プチドを介在させた脂質、及び該オリゴペプチドの介在のな 、ポリアルギレングリコー ルなどの修飾リン脂質とを組み合わせて MENDなどの脂質膜構造体を調製して抗腫 瘍剤ゃ遺伝子を標的細胞として悪性腫瘍細胞に送達すると、極めて高！ヽ導入率で 送達できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
[0011] すなわち、本発明により、少なくとも下記の 2種類のリン脂質誘導体：
(1)アルコールィ匕合物の残基とリン脂質類の残基とを含み、該アルコールィ匕合物の残 基とリン脂質の残基との間にペプチドを含むリン脂質誘導体であって、
(a)該アルコール化合物が、ポリアルキレングリコール類、グリセリン類、及びポリグリセ リン類カゝらなる群カゝら選ばれるアルコールィ匕合物であり、
(b)該リン脂質力 ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファリジルコリン類、ホスファ チジルセリン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファチジルグリセロール類、カル ジォリピン類、スフインゴミエリン類、セラミドホスホリルエタノールアミン類、セラミドホス ホリルグリセロール類、セラミドホスホリルグリセロールホスファート類、 1,2-ジミリストイ ル- 1,2-デォキシホスファチジルコリン類、プラスマロゲン類、及びホスファチジン酸類 力 なる群力 選ばれるリン脂質であり、及び
(c)該ペプチドがマトリックスメタ口プロテア一ゼの基質となりうる基質ペプチドを含むぺ プチドである（ただし、該基質ペプチドの両端又は片端には 1個のアミノ酸又は 2ない し 8個のアミノ酸を含むオリゴペプチドが結合して 、てもよ 、）
リン脂質誘導体、及び (2)アルコールィ匕合物の残基とリン脂質類の残基とを含み、該アルコールィ匕合物の残 基とリン脂質の残基との間にペプチドを含有しないリン脂質誘導体であって、
(a)該アルコール化合物が、ポリアルキレングリコール類、グリセリン類、及びポリグリセ リン類カゝらなる群カゝら選ばれるアルコールィ匕合物であり、
(b)該リン脂質力 ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファリジルコリン類、ホスファ チジルセリン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファチジルグリセロール類、カル ジォリピン類、スフインゴミエリン類、セラミドホスホリルエタノールアミン類、セラミドホス ホリルグリセロール類、セラミドホスホリルグリセロールホスファート類、 1,2-ジミリストイ ル- 1,2-デォキシホスファチジルコリン類、プラスマロゲン類、及びホスファチジン酸類 力 なる群力 選ばれるリン脂質である
リン脂質誘導体
を構成脂質として含む脂質膜構造体が本発明により提供される。
[0012] この発明の好ましい態様によれば、マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に 有効な薬物や遺伝子治療のための遺伝子を保持した上記脂質膜構造体;及び、リポ ソームである上記脂質膜構造体が提供される。
さらに好ましい態様によれば、リン脂質誘導体 (1)及び (2)において、該アルコール化 合物がポリアルキレングリコール類であり、該リン脂質がホスファチジルエタノールアミ ン類であり、リン脂質誘導体 (1)において、該ペプチドが Va卜 Pro- Leu- Ser- Leu- Tyr- S er-Glyを含むペプチドである上記の脂質膜構造体；リン脂質誘導体 (1)及び (2)にお ヽ て、該アルコール化合物がポリエチレングリコールであり、該リン脂質がジォレイルホ スファチジルエタノールァミン又はジステアロイルホスファチジルエタノールァミンであ り、リン脂質誘導体 (1)において、該ペプチドが Gly-Gly-Glyをリンカ一として含む上記 の脂質膜構造体;及び、リン脂質誘導体 (1)において、該ペプチドが Gly- Gly- Gly- Val - Pro- Leu- Ser- Leu- Tyr- Ser- Gly- Gly- Gly- Glyである上記の脂質膜構造体が提供さ れる。特に好ましい態様によれば、リン脂質誘導体 (1)とリン脂質誘導体 (2)の脂質膜 構造体の全脂質量に対する割合が約 20モル %である上記の脂質膜構造体が提供さ れる。
[0013] 別の観点からは、マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物や遺伝 子治療のための遺伝子を保持した上記脂質膜構造体を含むマトリックスメタ口プロテ ァーゼの関わる疾患の予防及び z又は治療のための医薬組成物が提供される。 これらにカ卩えて、マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患の治療方法であって、 マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物や遺伝子治療のための遺 伝子を保持した上記脂質膜構造体をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む 方法が本発明により提供される。
発明の効果
[0014] 本発明の脂質膜構造体は、マトリックスメタ口プロテアーゼにより上記のリン脂質誘 導体 (1)のペプチド部分が切断されてポリアルキレングリコールなどの修飾部位を脱 離する一方、リン脂質誘導体 (2)に由来するポリアルキレングリコールが脂質膜構造 体表面に残留する特性を有している。本発明の脂質膜構造体は、血中においては 該修飾部位の存在により安定であり、マトリックスメタ口プロテアーゼを分泌する悪性 腫瘍細胞や新生血管などの近傍では、該修飾部位が脱離することにより脂質膜構造 体の安定性が低下して、その構造を保つことができずに、脂質膜構造体に保持され た抗腫瘍剤や遺伝子等を標的細胞の外部で放出し、あるいは脂質膜構造体が標的 細胞中に効率的に取り込まれることによって、標的細胞中に薬剤や遺伝子を効率的 に導入することができる。さらに、本発明の脂質膜構造体ではポリアルキレングリコー ルなどの修飾部位の一部が悪性腫瘍細胞や新生血管などの近傍においても残留し 、十分な血中滞留性を維持することができるという特徴がある。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]PPD- MENDと PEG- MENDの HEK293細胞における遺伝子発現活性への MMP- 2添加の影響を示した図である。
[図 2]各種細胞系における PPD-MENDの遺伝子発現活性を示した図である。
[図 3]PPD- MENDと PEG- MENDを用いたインビボ実験の結果を示した図である。
[図 4]PEG/PPD- MENDを用いたインビボ実験の結果を示した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明の脂質膜構造体の製造に用いられるリン脂質誘導体のうち、少なくとも 1種 のリン脂質誘導体は、アルコールィ匕合物の残基とリン脂質類の残基とを含み、該アル コールィ匕合物の残基とリン脂質の残基との間にペプチドを含むリン脂質誘導体であ つて、
(a)該アルコール化合物が、ポリアルキレングリコール類、グリセリン類、及びポリグリセ リン類カゝらなる群カゝら選ばれるアルコールィ匕合物であり、
(b)該リン脂質力 ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファリジルコリン類、ホスファ チジルセリン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファチジルグリセロール類、カル ジォリピン類、スフインゴミエリン類、セラミドホスホリルエタノールアミン類、セラミドホス ホリルグリセロール類、セラミドホスホリルグリセロールホスファート類、 1,2-ジミリストイ ル- 1,2-デォキシホスファチジルコリン類、プラスマロゲン類、及びホスファチジン酸類 力 なる群力 選ばれるリン脂質であり、及び
(c)該ペプチドがマトリックスメタ口プロテア一ゼの基質となりうる基質ペプチドを含むぺ プチドである（ただし、該基質ペプチドの両端又は片端には 1個のアミノ酸又は 2ない し 8個のアミノ酸を含むオリゴペプチドが結合して 、てもよ 、）
ことを特徴として 、る (本明細書にぉ 、てリン脂質誘導体 (1)と呼ぶ場合がある)。
[0017] また、本発明の脂質膜構造体の製造に用いられるリン脂質誘導体のうち、他の 1種 のリン脂質誘導体は、アルコールィ匕合物の残基とリン脂質類の残基とを含み、該アル コール化合物の残基とリン脂質の残基との間にペプチドを含有しないリン脂質誘導 体であって、
(a)該アルコール化合物が、ポリアルキレングリコール類、グリセリン類、及びポリグリセ リン類カゝらなる群カゝら選ばれるアルコールィ匕合物であり、
(b)該リン脂質力 ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファリジルコリン類、ホスファ チジルセリン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファチジルグリセロール類、カル ジォリピン類、スフインゴミエリン類、セラミドホスホリルエタノールアミン類、セラミドホス ホリルグリセロール類、セラミドホスホリルグリセロールホスファート類、 1,2-ジミリストイ ル- 1,2-デォキシホスファチジルコリン類、プラスマロゲン類、及びホスファチジン酸類 力 なる群力 選ばれるリン脂質である
ことを特徴として 、る (本明細書にぉ 、てリン脂質誘導体 (2)と呼ぶ場合がある)。
[0018] アルコール化合物としては、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールな どのポリアルキレングリコール類、グリセリン又はグリセリンエステルなどのグリセリン類 、あるいはジグリセリン、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、へキサグリセ リン、ヘプタグリセリン、又はオタタグリセリンなどのポリグリセリン類を用いることができ る。これらのうち、ポリアルキレングリコールが好ましぐ特に好ましいのはポリエチレン グリコールである。ポリエチレングリコールを用いる場合、分子量は特に限定されず、 脂質膜構造体に血中滞留性などの所望の特性を付与するために当業者が適宜選 択可能である。
[0019] アルコール化合物の残基とは、アルコール化合物又は化学修飾されたアルコール 化合物から水素原子などの適宜の原子又は水酸基やハロゲン原子などの適宜の官 能基を除いて得られる基を意味しており、好ましくは 1価の基を意味している。例えば
、アルコールィ匕合物の水酸基力 水素原子を除いて得られる残基、アルコール化合 物の炭素原子に結合する水素原子を除 、て得られる残基、ある 、はアルコール化合 物の末端にカルボキシル基を含む官能基を導入し、そのカルボキシル基カゝら水酸基 又は水素原子を除いて得られる残基などを例示できるが、これらに限定されることは ない。
[0020] リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファリジルコリン類、ホス ファチジルセリン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファチジルグリセロール類、 カルジォリピン類、スフインゴミエリン類、セラミドホスホリルエタノールアミン類、セラミ ドホスホリルグリセロール類、セラミドホスホリルグリセロールホスファート類、 1,2-ジミリ ストィル- 1,2-デォキシホスファチジルコリン類、プラスマロゲン類、またはホスファチジ ン酸類を用いることができるが、これらのリン脂質における脂肪酸残基は特に限定さ れない。例えば、炭素数 12〜20個程度の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を 1個又は 2個有するリン脂質を用いることができ、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミ チン酸、ステアリン酸、ォレイン酸、リノール酸等の脂肪酸由来のァシル基を 1個又は 2個有するリン脂質を用いることができる。これらのうち、ホスファチジルエタノールアミ ン類が好ましぐ具体的にはジミリストイルホスファチジルエタノールァミン、ジパルミト ィルホスファチジルエタノールァミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ DSPE)、ジォレイルホスファチジルエタノールァミン (DOPE)等を挙げることができ、中 でもジステアロイルホスファチジルエタノールァミン (DSPE)、ジォレイルホスファチジル エタノールァミン (DOPE)が好まし!/、。
[0021] リン脂質の残基とは、上記のリン脂質又は化学修飾されたリン脂質力も水素原子な どの適宜の原子又は水酸基やハロゲン原子などの適宜の官能基を除いて得られる 基を意味しており、好ましくは 1価の基を意味している。例えば、リン脂質のリン酸部 分の水酸基力も水素原子を除いて得られる残基、リン脂質のリン酸部分の水酸基を 除いて得られる残基、リン脂質の炭素原子に結合する水素原子を除いて得られる残 基、あるいはリン脂質のリン酸部分にカルボキシル基を含む官能基を導入し、その力 ルポキシル基力 水酸基又は水素原子を除いて得られる残基などを例示できるが、 これらに限定されることはない。
[0022] アルコールィ匕合物の残基とリン脂質の残基との間に含まれるペプチドは、マトリック スメタ口プロテア一ゼの基質となりうる基質ペプチドを少なくとも 1個含んでいる。マトリ ックスメタ口プロテアーゼ (MMP)には、例えば、 MMP-1 (間質型コラーゲナーゼ）、 MM P- 2 (ゼラチナーゼ A)、 MMP-3、 MMP-7, MMP_9 (ゼラチナーゼ B)などの存在が知ら れており、これらのうちの 1種又は 2種以上のマトリックスメタ口プロテア一ゼの基質と なりうる基質ペプチドを用いることができる。マトリックスメタ口プロテアーゼについては 、例えば、鶴尾隆編「癌転移の分子機構」、 pp.92-107、メジカルビユー社、 1993年発 行などを参照することができる。
[0023] マトリックスメタ口プロテア一ゼの基質となりうる基質ペプチドについては、例えば、 上記非特許文献 1 (Nature Biotechnology, 19, pp.661- 667, 2001)に特定の種類の マトリックスメタ口プロテアーゼと、それに特異的に認識される基質ペプチドが説明さ れているので、この刊行物を参照することにより、特定の種類のマトリックスメタ口プロ テアーゼにより特異的に切断される基質ペプチドを選択することが可能である。例え ば、 MMP- 9につ!/、て Va卜 Pro- Leu- Ser- Leu- Tyr- Ser- Glyが特異的基質として知られ ており、 MMP-9の基質となりうる基質ペプチドとして上記のォクタペプチドを用いるこ とが好ましい。上記非特許文献 1の開示の全てを参照により本明細書の開示として含 める。
具体的には、マトリックスメタ口プロテア一ゼの基質となりうる基質ペプチドとして、 G1 y- Pro- Gin- Gly- lie- Ala- Gly- Ginゝ Gly- Pro- Gin- Gly- lie- Ala- Gly- Ginゝ Val-Pro-Met — Ser— Met— Arg— Gly— Gly、 lie— Pro— Vaト Ser— Leu— Arg— Ser— Gly、 Arg— Pro— Phe— Ser— Me t— lie— Met— Gly、 Vaト Pro— Leu— Ser— Leu— Thr— Met— Gly、 He— Pro— Glu— Ser— Leu— Arg— Al a— Gly、 Arg— His— Asp、 Arg— Pro— Lys— Pro— Vaト Glu— Nva— Trp— Arg— Lys、 Arg— Pro— Lys— Pro— Tyr— Ala— Nva— Trp— Met— Lys、 Pro— Gin— Gly— lie— Ala— Gly— Gin— Argゝ Pro— Leu— Gly - lie- Ala- Gly- Arg、 Gly- Pro- Leu- Gly- Pro、 Gly- Pro- Leu- Gly- Pro等を挙げることが できる。
[0024] アルコールィ匕合物の残基とリン脂質の残基との間に含まれるペプチドは、基質ぺプ チドのほか、アルコール化合物の残基及び Z又はリン脂質の残基との結合に関与す るリンカ一として、 1個のアミノ酸力 なるリンカ一、又は 2ないし 8個のアミノ酸を含むォ リゴペプチドからなるリンカ一を含んでいてもよい。リンカ一である該アミノ酸又は該ォ リゴペプチドは、該基質ペプチドの両端に結合していてもよいが、片端のみに結合し ていてもよい。該基質ペプチドの両端に該リンカ一が結合している場合には、 2つのリ ンカ一は同一でも異なっていてもよい。リンカ一を介さずに、基質ペプチドが直接ァ ルコール化合物の残基及び Z又はリン脂質の残基と結合して 、てもよ ヽ。上記のリン 脂質誘導体ではリンカ一が存在することが好ましぐ該基質ペプチドの両端に同一又 は異なるリンカ一が存在していることがさらに好ましぐ該 2個のリンカ一が 2ないし 8個 のアミノ酸を含むオリゴペプチドからなる同一又は異なるリンカ一であることがより好ま しい。
[0025] リンカ一として利用可能な 1個のアミノ酸の種類、又はリンカ一として利用可能なオリ ゴペプチドを構成するアミノ酸は特に限定されず、任意の種類の 1個のアミノ酸、又は 任意の種類の 2個ないし 8個の同一又は異なるアミノ酸を含む任意のオリゴペプチド を用いることができる。リンカ一として利用可能なオリゴペプチドとしては、例えば、 - L eu- Gly -、 -Tyr- Gly -、 -Phe- Gly -、 -Gly- Phe- Gly -、 -Gly- Gly- Phe- Gly -、 - Gly- Phe- Gly- Gly -、 -Phe- Gly- Gly- Gly -、 -Phe- Phe- Gly- Gly -、 -Gly- Gly- Gly- Phe- Gly -、 - Gl y- Gly- Phe- Phe -、 -Gly- Gly- Gly- Gly- Gly- Gly -、 -Phe- Phe -、 -Ala- Gly -、 -Pro- Gly- 、 -Gly- Gly- Gly- Phe -、 -Gly -、 -D- Phe- Gly -、 -Gly- Phe -、 -Ser- Gly -、 -Gly- Gly -、 - Gly— Gly— Gly―、 _Gly— Gly— Gly— Gly―、 _Gly— Gly— Leu_Gly―、
Figure imgf000011_0001
一 Gl y— Gly— Vaト Leu―、— Gly— Gly— Leu— Leu―、— Gly— Gly— Phe— Leu―、— Gly— Gly— Tyr— Leu―、 -Gly-Gly-Val-Gln-, -Gly- Gly- Leu- Gin -、 -Gly- Gly- He- Gin -、 -Gly- Gly- Phe- Gin- 、—Gly— Gly— Tyr— Gin―、—Gly— Gly— Trp— Gin―、—Gly— Gly— Leu— Ser―、—Gly— Gly— Phe— Se r -、 -Gly- Gly- Tyr- Ser -、 - Gly- Gly- Vaト Thr -、 -Gly- Gly- Leu- Thr -、 -Gly- Gly- Phe- Thr―、—Gly— Gly— Tyr— Thr―、—Gly— Gly— TYp— Thr―、—Gly— Gly— Vaト Met―、—Gly— Gly— L eu— Met―、—Gly— Gly— He— Met―、—Gly— Gly— Phe— Met―、—Gly— Gly— Tyr— Met―、— Gly— Gl y-Val-Cit-, -Gly- Gly- Leu- Cit -、 -Gly- Gly- Phe- Cit -、 -Gly- Gly- Tyr- Cit -、 - Gly- G ly— Trp— Cit―、—Gly— Gly— Gly— Asn―、—Gly— Gly— Ala— Asn―、— Gly— Gly— Vaト Asn―、—Gly - Gly- Leu- Asn -、 -Gly- Gly- lie- Asn -、 -Gly- Gly- Gin- Asn -、 -Gly- Gly- Thr- Asn -、 - Gly— Gly— Phe— Asn―、—Gly— Gly— Tyr— Asn―、—Gly— Gly— Met— Asn―、—Gly— Gly— Pro— Asn -、 -Gly- Gly- Cit- Asn -、 -Gly- Gly- Trp- Gly -、 -Gly- Gly- Ser- Asn -、 -Gly- Gly- Pro- A la -、 - Gly- Gly- Pro- Val-、 -Gly- Gly- Pro- Leu -、 -Gly- Gly- Pro- lie -、 -Gly- Gly- Pro- Gin―、—Gly— Gly— Pro— Ser―、—Gly— Gly— Pro— Tyr―、—Gly— Gly— Pro— Met―、—Gly— Gly— M et— Pro—、—Gly— Gly— Pro— Pro—、—Gly— Gly— Pro— Cit―、—Gly— Gly— He— Leu―、—Gly— Gly— I le- Cit-などを例示することができる力 これらに限定されることはない。これらのうち、 -Gly- Gly-又は- Gly- Gly- Gly-がリンカ一として好まし!/ヽ。
上記のリン脂質誘導体 (1)の製造方法は特に限定されないが、一般的には、上記リ ン脂質誘導体の部分構造であるアルコール化合物とペプチド化合物とを結合させ、 得られたペプチド結合アルコールィヒ合物のペプチド末端にリン脂質ィヒ合物を結合さ せること〖こより製造することができる。
アルコールィ匕合物とペプチドィ匕合物との結合は、一般的にはペプチドィ匕合物のぺ プチド末端のアミノ基又はカルボキシル基とアルコールィ匕合物の反応性官能基 (例 えば、水酸基、カルボキシル基、エステル基など）とを反応させることにより行なわれる oアルコール化合物にすでに存在する水酸基を反応性官能基として用いてもよいが
、例えば、アルコール化合物の水酸基をカルボキシル基に酸化し、あるいはアルコー ルイ匕合物にカルボキシル基を含む官能基を導入するなどの手法により、アルコール 化合物にカルボキシル基を導入し、さらに必要に応じて該カルボキシル基をエステル 化するなどの方法により、反応性官能基として用いることができる。 [0027] 典型的には、アルコール化合物のカルボキシル基又はエステル基などの反応性官 能基とペプチドィ匕合物のアミノ基とを反応させてアミド結合を形成することにより、ぺ プチド結合アルコールィ匕合物を製造することができる。この反応として、一般的には、 酸ハライド法、活性エステル法、又は酸無水物などの方法を用いることができる。
[0028] 酸ノヽライド法では、不活性溶媒中でカルボキシル基を有するアルコール化合物を ノ、ロゲン化剤で処理して酸ハライドとした後に、得られた酸ハライドとペプチドィ匕合物 のァミノ基とを反応させることによって目的物を得ることができる。酸ハライドを生成す るための反応で使用される溶媒の種類は特に限定されず、反応を阻害せずに出発 物質を溶解するものであればいかなる溶媒を用いてもよい。例えば、ジェチルエーテ ル、テトラヒドロフラン、ジォキサンのようなエーテル類、ジメチルホルムアミド、ジメチ ルァセトアミド、へキサメチルリン酸トリアミドのようなアミド類、ジクロロメタン、クロロホ ルム、 1, 2—ジクロロェタンのようなハロゲン化炭化水素類、ァセトニトリル、プロピオ 二トリルのような-トリル類、ギ酸ェチル、酢酸ェチルのようなエステル類、又はこれら の混合溶媒が好適である。ハロゲン化剤としては、例えば、チォニルクロリド、チォ- ルブロミド、チォ-ルアイオダイドのようなチォ-ルハライド類、スルフリルクロリド、ス ルフリルブロミド、スルフリルアイオダイドのようなスルフリルハライド類、三塩化燐、三 臭化燐、三沃化燐のような三ハロゲン化燐類、五塩化燐、五臭化燐、五沃化燐のよう な五ハロゲンィ匕燐類、ォキシ塩化燐、ォキシ臭化燐、ォキシ沃化燐のようなォキシノヽ ロゲン化燐類、塩ィ匕ォキザリル、臭化ォキザリルのようなハロゲンィ匕ォキザリル類など を挙げることができる。反応温度は、 0°Cないし溶媒の還流温度で行うことができ、好 適には室温な 、し溶媒の還流温度である。
[0029] 得られた酸ハライドとペプチド化合物のァミノ基との反応で使用される溶媒は、反応 を阻害せず、出発物質を溶解するものであれば特に限定はないが、ジェチルエーテ ル、テトラヒドロフラン、ジォキサンのようなエーテル類、ジメチルホルムアミド、ジメチ ルァセトアミド、へキサメチルリン酸トリアミドのようなアミド類、ギ酸ェチル、酢酸ェチ ルのようなエステル類、ジメチルスルホキシドのようなスルホキシド類、またはそれらの 混合溶媒を挙げることができる。酸ノヽライドとペプチドィ匕合物のアミノ基との反応では 、必要に応じてトリェチルァミン、ピリジンのような有機塩基を添加することもできる。 [0030] 活性エステル化法は、溶媒中、アルコール化合物のカルボキシル基を活性エステ ル化剤と反応させて活性エステルを製造した後、ペプチド化合物のァミノ基と反応さ せることによって行われる。溶媒としては、例えば、メチレンクロリド、クロ口ホルムのよう なハロゲンィ匕炭化水素類、エーテル、テトラヒドロフランのようなエーテル類、ジメチル ホルムアミド、ジメチルァセトアミドのようなアミド類、ベンゼン、トルエン、キシレンのよ うな芳香族炭化水素類、酢酸ェチルのようなエステル類、又はこれらの混合溶媒を挙 げることができる。活性エステル化剤としては、例えば、 N-ヒドロキシサクシイミド、 1-ヒ ドロキシベンゾトリァゾール、 N-ヒドロキシ- 5-ノルボルネン -2, 3-ジカルボキシイミドの ような N-ヒドロキシ化合物類； 1,1'-ォキザリルジイミダゾール、 Ν,Ν'-カルボ-ルジィ ミダゾールのようなジイミダゾール化合物類； 2,2'-ジピリジルジサルファイドのようなジ サルファイド化合物類； Ν,Ν'-ジサクシンィミジルカーボネートのようなコハク酸化合物 類； Ν,Ν'-ビス (2-ォキソ -3-ォキサゾリジ-ル）ホスフィニッククロライドのようなホスフ ィニッククロライド化合物類； Ν,Ν'-ジサクシンィミジルォキザレート (DSO)、 Ν,Ν'-ジフタ ルイミドォキザレート (DPO)、 Ν,Νしビス（ノルボルネ-ルサクシンィミジル）ォキザレー ト (ΒΝΟ)、 1,1しビス（ベンゾトリアゾリル）ォキザレート (ΒΒΤΟ)、 1,1しビス (6-クロ口べ ンゾトリァゾリル）ォキザレート (BCTO)、 1,1しビス (6-トリフルォロメチルベンゾトリアゾ リル)ォキザレート (BTBO)のようなォキザレートイ匕合物類などを挙げることができる。
[0031] ペプチドィ匕合物のアミノ基と活性エステルとの反応は、例えば、ァゾジカルボン酸ジ ェチルートリフエ-ルホスフィンのようなァゾジカルボン酸ジ低級アルキル トリフエ- ルホスフィン類、 N-ェチル -5-フエ-ルイソォキサゾリゥム- 3しスルホナートのような N- 低級アルキル- 5-ァリールイソォキサゾリゥム- 3'-スルホナート類、ジェチルォキシジ フオルメート (DEPC)のようなォキシジフオルメート類、 Ν',Ν'-ジシクロへキシルカルボ ジイミド (DCC)のような Ν' ,Ν'-ジシクロアルキルカルボジイミド類、ジ- 2-ピリジルジセレ -ドのようなジヘテロァリールジセレニド類、トリフエ-ルホスフィンのようなトリアリール ホスフィン類、 トロベンゼンスルホ -ルトリアゾリドのようなァリールスルホ -ルトリア ゾリド類、 2-クロル- 1-メチルピリジ-ゥム ョーダイドのような 2-ハロ -1-低級アルキ ルピリジ -ゥムハライド、ジフエ-ルホスホリルアジド (DPPA)のようなジァリールホスホリ ルアジド類、 Ν,Ν'-カルボジイミダゾール (CDI)のようなイミダゾール誘導体、 1-ヒドロ キシベンゾトリアゾール (HOBT)のようなべンゾトリアゾール誘導体、 N-ヒドロキシ -5-ノ ールボルネン -2,3-ジカルボキシイミド (HONB)のようなジカルボキシイミド誘導体、 1- ェチル -3-(3-ジメチルァミノプロピル）カルボジイミド (WSC)のようなカルボジイミド誘 導体、 1-プロパンホスホン酸環状無水物（T3P)のようなホスホン酸環状無水物などの 縮合剤の存在下に好適に行われる。活性エステルの調製のための反応温度は- 10 °Cな!、し室温であり、活性エステルイ匕合物とペプチド化合物のァミノ基との反応は室 温付近であり、反応時間は両反応共に 30分な 、し 10時間程度である。
[0032] 混合酸無水物法は、アルコール化合物のカルボキシル基の混合酸無水物を製造 した後、ペプチド化合物のアミノ基を反応させることにより行われる。混合酸無水物を 製造する反応は、不活性溶媒 (例えば、エーテル、テトラヒドロフランのようなエーテル 類、ジメチルホルムアミド、ジメチルァセトアミドのようなアミド類）中、クロ口炭酸ェチル 、クロ口炭酸イソブチルのような炭酸低級アルキルハライド、ジェチルシアノリン酸のよ うなジ低級アルキルシアノリン酸などを用いて行なうことができる。反応は、好適にはト リエチルァミン、 N-メチルモルホリンのような有機ァミンの存在下に行われ、反応温度 は- 10°Cないし室温であり、反応時間は 30分ないし 5時間程度である。混合酸無水物 とペプチドィ匕合物のアミノ基との反応は、好適には不活性溶媒 (例えば、エーテル、 テトラヒドロフランのようなエーテル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルァセトアミドのよ うなアミド類）中で前記の有機ァミンの存在下に行われ、反応温度は 0°Cないし室温 であり、反応時間は 1時間ないし 24時間程度である。また、カルボン酸とアミンィ匕合物 とを前記の縮合剤の存在下で直接反応させることによって縮合を行なうこともできる。 この反応は前記の活性エステルを製造する反応と同様にして行われる。
[0033] 続、て、得られたペプチド結合アルコール化合物の反応性官能基 (例えばカルボ キシル基や水酸基など）とリン脂質ィ匕合物の反応性官能基 (例えば、カルボキシル基 ゃァミノ基など)とを反応させることにより、上記のリン脂質誘導体を得ることができる。 例えば、リン脂質ィ匕合物としてホスファチジルエタノールアミン類を用いる場合には、 該リン脂質ィ匕合物のアミノ基と、ペプチド結合アルコールィ匕合物のペプチド末端の力 ルポキシル基とを反応させることにより、上記のリン脂質誘導体を製造できる。この反 応は上記に説明した反応と同様に行なうことができ、例えば、縮合剤の存在下で活 性エステル法などにより行なうことが好ましい。
[0034] 上記の各反応において、保護基を導入することにより目的の反応を効率的に行なう ことができる場合がある。保護基の導入については、例えば、「プロテクティブ ダル ープス イン オーガニック シンセシス」 (P. G. M. Wuts and T. Green,第 3版、 1999 年、 Wiley, John & Sons)などを参照することができる。 目的物の単離及び精製は当 業界で用いられる通常の方法により行なうことができる力 例えば、高速液体クロマト グラフィーなどによる精製が好適である。なお、上記のリン脂質誘導体には、塩の形 態の物質も包含される。塩の種類としては、特に限定されないが、塩酸塩や硫酸塩な どの鉱酸塩、シユウ酸塩や酢酸塩などの有機酸塩、ナトリウム塩やカリウム塩などの 金属塩、アンモニゥム塩、メチルァミン塩などの有機アミン塩などを例示できる。
[0035] リン脂質誘導体 (2)も上記の製造方法に準じて容易に製造することができる。また、 以下のものをはじめとして種々市販されており、これらも用いることができる。
1, 2 ジミリストイル sn—グリセ口一 3 ホスフォエタノールァミン一 N - [メトキシ（ ポリエチレングリコール）— 350]、 1, 2 ジパルミトイル— sn—グリセ口 3 ホスフォ エタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコール）一 350]、 1, 2 ジステア口 ィル一 sn—グリセ口一 3—ホスフォエタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリ コール） 350]、 1, 2 ジォレオイル一 sn—グリセ口一 3 ホスフォエタノールァミン —N— [メトキシ（ポリエチレングリコール）— 350]、 1, 2 ジミリストイル— sn—グリセ 口一 3 ホスフォエタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコール） 550]、 1 , 2 -ジパルミトイル sn グリセ口一 3 ホスフォエタノールァミン N [メトキシ（ポ リエチレングリコール） 550]、 1, 2 ジステアロイルー sn—グリセ口一 3 ホスフォ エタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコール）一 550]、 1, 2 ジォレオイ ル一 sn—グリセ口一 3—ホスフォエタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコ ール） 550]、 1, 2 ジミリストイル一 sn—グリセ口一 3 ホスフォエタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコール）— 750]、 1, 2 ジパルミトイル— sn—グリセ口 —3 ホスフォエタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコール） 750]、 1, 2 ジステアロイル sn—グリセロー 3 ホスフォエタノールァミン N [メトキシ（ポ リエチレングリコール） 750]、 1, 2 ジォレオイル一 sn—グリセ口一 3 ホスフォェ タノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコール）一 750]、 1, 2 ジミリストイル — sn—グリセ口一 3—ホスフォエタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコー ル） 1000]、 1, 2 ジパルミトイルー sn—グリセ口一 3 ホスフォエタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコール）— 1000]、 1, 2—ジステアロイル— sn—グリセ 口一 3 ホスフォエタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコール）一 1000]、 1, 2 ジォレオイル sn グリセ口一 3 ホスフォエタノールァミン N [メトキシ（ ポリエチレングリコール）一 1000]、 1, 2 ジミリストイル一 sn—グリセ口一 3 ホスフ ォエタノールァミン N—[メトキシ（ポリエチレングリコール）一2000]、 1, 2—ジパル ミトィル一 sn—グリセ口一 3—ホスフォエタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレング リコール） 2000]、 1, 2 ジステアロイル一 sn—グリセ口一 3 ホスフォエタノール ァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコール）一 2000]、 1, 2—ジォレオイル一 sn —グリセ口一 3—ホスフォエタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコール） 2000]、 1, 2 ジミリストイル一 sn—グリセ口一 3 ホスフォエタノールァミン一 N— [メ トキシ（ポリエチレングリコール）— 3000]、 1, 2 ジパルミトイル— sn—グリセ口 3 —ホスフォエタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコール）一 3000]、 1, 2 -ジステアロイル sn—グリセ口一 3—ホスフォエタノールァミン一 N - [メトキシ（ポリ エチレングリコール） 3000]、 1, 2 ジォレオイル一 sn—グリセ口一 3 ホスフォェ タノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコール）一 3000]、 1, 2 ジミリストイ ル一 sn—グリセ口一 3—ホスフォエタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコ ール） 5000]、 1, 2 ジパルミトイルー sn—グリセ口一 3 ホスフォエタノールァミン —N— [メトキシ（ポリエチレングリコール）— 5000]、 1, 2 ジステアロイル— sn—グ リセ口一 3 ホスフォエタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコール） 500 0]、および 1, 2 ジォレオイル一 sn—グリセ口一 3 ホスフォエタノールァミン一 N— [メトキシ（ポリエチレングリコール）一5000]等のジァシルホスフォエタノールアミンポ リエチレングリコール。
本発明により提供される脂質膜構造体の種類は特に限定されな!ヽが、脂質膜構造 体が水系溶媒に分散した形態としては、例えば、一枚膜リボソーム、多重層リポソ一 ム、 0/W型エマルシヨン、 W/0/W型エマルシヨン、球状ミセル、ひも状ミセル、不定 型の層状構造物などを挙げることができる。これらのうちリボソームが好ましい。分散 した状態の脂質膜構造体の大きさは特に限定されないが、例えば、リボソームやエマ ルシヨンの場合には粒子径が 50 nm力ら 5 μ mであり、球状ミセルの場合、粒子径が 5 nmから 100 nmである。ひも状ミセルや不定型の層状構造物の場合は、その 1層あたり の厚みが 5 nmから 10 nmであり、これらが層を形成しているものが好ましい。
[0037] 本発明により提供される脂質膜構造体は、上記のリン脂質誘導体 (1)及び (2)のほか 、通常用いられるリン脂質類、コレステロール、コレスタノール等のステロール類、炭 素数 8〜22の飽和又は不飽和のァシル基を有する脂肪酸類、 ex トコフ ロール等 の酸ィ匕防止剤を含んでいてもよい。リン脂質類としては、例えば、ホスファチジルエタ ノールアミン類、ホスファリジルコリン類、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルイノ シトール類、ホスファチジルグリセロール類、カルジォリピン類、スフインゴミエリン類、 セラミドホスホリルエタノールアミン類、セラミドホスホリルグリセロール類、セラミドホス ホリルグリセロールホスファート類、 1 ,2-ジミリストイル- 1 ,2-デォキシホスファチジルコリ ン類、プラスマロゲン類、又はホスファチジン酸類等を挙げることができ、これらは 1種 又は 2種以上を組み合わせて用いることができる。これらリン脂質における脂肪酸残 基は特に限定されないが、例えば、炭素数 12〜20の飽和又は不飽和の脂肪酸残基 を挙げることができ、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン 酸、ォレイン酸、リノール酸等の脂肪酸由来のァシル基を挙げることができる。また、 本発明の脂質膜構造体の調製には、卵黄レシチン、大豆レシチン等の天然物由来 のリン脂質を用いることもできる。また、例えば、 1 ,2-ビス (ォレオイルォキシ ) -3- (トリメ チルアンモ -ォ）プロパン (DOTAP)、 1-Ν,Ν-ジメチルァミノジォレオイルプロパン (DO DAP), 1-ォレオイル- 2-ヒドロキシ- 3- Ν,Ν-ジメチルァミノプロパン、 1 ,2-ジァシル- 3- Ν,Ν-ジメチルァミノプロパン、 1 ,2-ジデカノィル- 1-Ν,Ν-ジメチルァミノプロパン、 3- j8 - [η- [(Ν',Ν'-ジメチルァミノ）ェタン]力ルバモイル]コレステロール (DC- Chol)、 1 ,2-ジ ミリストォキシプロピル- 3-ジメチルヒドロキシェチルアンモ -ゥムブロマイド (DMRIE)、 および 1 ,2-ジオールォェォォキシプロピル- 3-ジメチルヒドロキシェチルアンモ -ゥム ブロマイド (DORI)などを用いることもできる。
[0038] 本発明の脂質膜構造体において、上記のリン脂質誘導体 (1)及び (2)の比率は特に 限定されないが、例えば、リン脂質誘導体 (1) :リン脂質誘導体 (2)のモル比として 10:1 〜1:10の範囲であることが好ましぐ 4:1〜1:4の範囲であることがさらに好ましぐ特に 好ましくはモル比として 1:1程度の場合である。リン脂質誘導体 (1)及びリン脂質誘導 体 (2) (合計量)の脂質膜構造体の全脂質量に対する割合は特に限定されな!、が、例 えば、該割合は 5〜40モル %程度であり、好ましくは 10〜30モル %程度であり、より好ま しくは約 20モノレ％である。
[0039] 本発明の脂質膜構造体には、膜構成脂質として、例えば、血中滞留性機能、温度 変化感受性機能、及び pH感受性機能などを有する脂質誘導体を含有させることが でき、それによりこれらの機能のいずれか 1つ又は 2つ以上を付与することができ、こ（ れら)の機能を付加することによって、例えば、薬物及び Z又は遺伝子を含む脂質膜 構造体の血液中での滞留性を向上させ、肝臓又は脾臓などの細網内皮系組織によ る捕捉率を低下させることができ、あるいは薬物及び Z又は遺伝子の放出性を高め ることがでさる。
[0040] 血中滞留性機能を付与することができる血中滞留性脂質誘導体としては、例えば、 グリコフォリン、ガンダリオシド GM1、ホスファチジルイノシトール、ガンダリオシド GM3、 グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体等を挙げることができる。
[0041] 温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体としては 、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン等を挙げることができる。また、 pH感受 性機能を付与することができる pH感受性脂質誘導体としては、例えば、ジォレオイル ホスファチジルエタノールアミン等を挙げることができる。
[0042] 本発明の脂質膜構造体の形態は特に限定されな!ヽが、例えば、脂質膜構造体の 膜構成成分であるリン脂質等とともに上記のリン脂質誘導体 (1)及び (2)が脂質膜構造 体を形成している形態が好ましい。より具体的には、例えば、上記のリン脂質誘導体 ( 1)及び (2)がその他のリン脂質等とともに膜構成成分となって脂質膜構造体、例えばリ ポソームを形成した形態を挙げることができる。
[0043] 本発明の脂質膜構造体の形態及びその製造方法は特に限定されな!、が、形態と しては、例えば、乾燥した混合物の形態、あるいは水系溶媒に分散された形態又は これを乾燥させた形態若しくは凍結させた形態等を挙げることができる。以下に、これ らの形態の脂質膜構造体を製造する方法を説明するが、本発明の脂質膜構造体の 形態及びその製造方法は上記の形態又は下記に説明する製造方法に限定されるこ とはない。
[0044] 本発明の脂質膜構造体の製造方法は特に限定されな!ヽが、例えば、乾燥した混合 物の形態の脂質膜構造体は、例えば、脂質膜構造体の構成成分全てを一旦クロ口 ホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いでエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機 による噴霧乾燥を行うことによって製造することができる。
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、上記の乾燥した混合物を水系溶媒 に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等に より乳化することで製造することができる。また、リボソームを製造する方法としてよく 知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質膜 構造体の大きさを制御した 、場合には、孔径のそろったメンブランフィルタ一等を用 V、て、高圧下でイクストルージョン (押し出し濾過）を行えばょ 、。
[0045] 水系溶媒 (分散媒)の組成は特に限定されるべきものではなぐ例えば、リン酸塩緩 衝液、クェン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細 胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒 (分散媒)は脂質膜構造 体を安定に分散させることができる力 さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、 フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロピオ ース、トレハロース、マルトース等の二糖類、ラフイノース、メレジノース等の三糖類、 シクロデキストリン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マン-トー ル、マルチトール等の糖アルコールなどの糖 (水溶液)や、グリセリン、ジグリセリン、 ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、 ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリ コールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、 1,3-ブ チレングリコールなどの多価アルコール (水溶液)等を加えてもょ 、。この水系溶媒（ 分散媒)に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理 的安定性の面から、水系溶媒 (分散媒）中の電解質を極力なくすことが望ましい。ま た、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒 (分散媒)の pHを弱酸性から中性付近 (pH3.0から 8.0)に設定することや窒素パブリングにより溶存酸素を除去することが望 ましい。
[0046] さらに脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態を乾燥又は凍結させた形態は、上 記の水系溶媒に分散した脂質膜構造体を通常の凍結乾燥や噴霧乾燥による乾燥又 は凍結方法等により製造することができる。水系溶媒に分散した形態の脂質膜構造 体を一旦製造した上でさらに乾燥すると、脂質膜構造体の長期保存が可能となるほ カゝ、この乾燥した脂質膜構造体に薬効成分含有水溶液を添加すると、効率よく脂質 混合物が水和されるために薬効成分を効率よく脂質膜構造体に保持させることがで きる長所がある。
[0047] 凍結乾燥や噴霧乾燥する場合には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース 、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビ オース、トレハロース、マルトース等の二糖類、ラフイノース、メレジノース等の三糖類 、シクロデキストリン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マン-ト ール、マルチトール等の糖アルコールなどの糖 (水溶液)を用いると安定に長期間保 存することができる。また、凍結する場合には、例えば、前記した糖 (水溶液)ゃグリセ リン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ェ チレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコ ール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキル エーテル、 1,3-ブチレングリコール等の多価アルコール（水溶液）をそれぞれ用いると 安定に長期間保存することができる。糖と多価アルコールとを組み合わせて用いても ょ 、。脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態における糖又は多価アルコールの 濃度は特に限定されないが、脂質膜構造体が水系溶媒に分散した状態において、 例えば、糖 (水溶液）は、 2〜20% (W/V)が好ましぐ 5〜10% (W/V)がさらに好まし い。また、多価アルコール（水溶液）は、 1〜5% (W/V)が好ましぐ 2〜2.5% (W/V) 力 Sさらに好ましい。水系溶媒 (分散媒)として、緩衝液を用いる場合には、緩衝剤の濃 度が 5〜50 mMが好ましぐ 10〜20 mMがさらに好ましい。水系溶媒 (分散媒）におけ る脂質膜構造体の濃度は特に限定されないが、脂質膜構造体における脂質総量の 濃度は、 0.1 mM〜500 mMが好ましぐ 1 mM〜100 mMがさらに好ましい。 [0048] 本発明の脂質膜構造体にはマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な 薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子などを保持させることができる。「保持」 とは、薬物及び Z又は遺伝子が脂質膜構造体の脂質膜の中、表面、内部、脂質層 中、及び Z又は脂質層の表面に存在することを意味する。脂質膜構造体が、例えば リボソームなどの微粒子である場合には、微粒子内部に薬物及び z又は遺伝子を封 入することもできる。脂質膜構造体に保持させるべき薬物及び Z又は遺伝子の量は 特に限定されず、そ (れら）の薬効を生体 (細胞）内で有効に発揮させるのに充分な 量であればよい。薬物及び Z又は遺伝子の種類も特に限定されず、標的とする組織 や疾患の種類、および脂質膜構造体の形態などにより適宜決定すればょ 、。
[0049] マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患としては、悪性腫瘍、肺気腫、肺線維症 、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、歯周炎、角膜潰瘍、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜 症、増殖性硝子体、加齢黄斑変性症、水泡性疾患、慢性皮膚潰瘍、多発性硬化症 、糸球体腎炎、ループス腎炎、慢性肝炎、肝硬変、心不全などを挙げることができ、 マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患が悪性腫瘍の場合、有効な薬物としては 抗腫瘍剤を一例として挙げることができる。抗腫瘍剤としては、例えば、塩酸イリノテ カン、塩酸ノギテカン、ェキサテカン、 RFS-2000, Lurtotecan、 BNP-1350、 Bay-3834 41、 PNU- 166148、 IDEC- 132、 BN- 80915、 DB- 38、 DB- 81、 DB- 90、 DB- 91、 CKD- 6 20、 T-0128、 ST-1480、 ST-1481、 DRF-1042, DE-310等のカンプトテシン誘導体、ド セタキセル水和物、パクリタキセル、 IND-5109、 BMS-184476, BMS-188797, T-3782 、 TAX-1011、 SB-RA-31012, SBT-1514、 DJ-927等のタキサン誘導体、ィホスフアミド 、塩酸-ムスチン、カルボコン、シクロホスフアミド、ダカルバジン、チォテパ、ブスルフ アン、メルファラン、ラ-ムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、 6—メルカプトプリ ンリボシド、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、カルモフール、シタラビン、シタラビンォ クホスフアート、テガフール、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルォロウラシル 、メトトレキサート、メルカプトプリン、リン酸フルダラビン、ァクチノマイシン D、塩酸ァク ラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸ェビルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソ ルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸ブレオマイシン、ジノスタチンスチマラマー、ネオ力 ルチノスタチン、マイトマイシン C、硫酸ブレオマイシン、硫酸ぺプロマイシン、エトポシ ド、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン、 塩酸アムルビシン、ゲフィ-チブ、ェキセメスタン、力ぺシタビン、 TNP-470, TAK-165 、 KW- 2401、 KW-2170, KW- 2871、 KT- 5555、 KT- 8391、 TZT- 1027、 S- 3304、 CS- 6 82、 YM- 511、 YM- 598、 TAT- 59、 TAS- 101、 TAS- 102、 TA- 106、 FK- 228、 FK- 317、 E7070, E7389、 KRN— 700、 KRN— 5500、 J— 107088、 HMN— 214、 SM— 11355、 ZD— 0473 等を挙げることができる。
[0050] 遺伝子とは、核酸をあらわし、オリゴヌクレオチド、 DNA、又は RNAの 、ずれでもよく 、イン'ビボで発現することによりマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な 遺伝子であれば、特に限定されるべきものではない。例えば、抗悪性腫瘍作用を有 する遺伝子や血管新生抑制作用を有する遺伝子、具体的には、悪性腫瘍 '加齢黄 斑変性症等の遺伝子治療用の遺伝子等を挙げることができる。上記遺伝子治療用 遺伝子としては、悪性腫瘍 ·加齢黄斑変性症等における血管新生や細胞増殖に関 わるアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンス DNA、アンチセンス RNA、 shRNA、 siRNAや酵素、サイト力イン等の生理活性物質、アンチセンス RNA、 shRNA、 siRNAを コードする遺伝子等を挙げることができる。
[0051] 脂質膜構造体が遺伝子を含む場合、標的細胞内へ遺伝子を効率的に導入するた めに、脂質膜構造体の構成成分として遺伝子導入機能を有する化合物を加えること が好ましい。このような化合物としては、 Ο,Ο'-Ν-ジドデカノィル- Ν- ( α トリメチルァ ンモ-オアセチル）-ジエタノールァミンク口リド、 Ο,Ο'- Ν-ジテトラデカノィル- Ν- ( α トリメチルアンモ-オアセチル）ージエタノールァミンク口リド、 Ο,Ο'-Ν-ジへキサデ カノィル- Ν- ( α—トリメチルアンモ-オアセチル）一ジエタノールァミンク口リド、 0,0し Ν-ジォクタデセノィル- Ν- ( α—トリメチルアンモ-オアセチル）一ジエタノールァミン クロリド、 Ο,Ο',Ο"-トリデカノィル- Ν- ( ω トリメチルアンモ -ォデカノィル）ァミノメタ ンブロミド及びのる [ α—トリメチルアンモ-オアセチル]—ジドデシル- D-グルタメート 、ジメチルジォクタデシルアンモ-ゥムブロミド、 2,3-ジォレイルォキシ- Ν-[2- (スペル ミンカルボキサミド）ェチル] -Ν,Ν-ジメチル- 1-プロパンアンモ-ゥムトリフルォロアセ テート、 1,2-ジミリスチルォキシプロピル- 3-ジメチルーヒドロキシェチルアンモ -ゥム ブロミド、 3- β -[η-(Ν',Ν'-ジメチルアミノエタン）力ルバモイル]コレステロール等を挙 げることができる。これらの遺伝子導入機能を有する化合物は、脂質膜構造体の膜 の中、表面、内部、脂質層中及び Z又は脂質層の表面に存在 (結合)している形態 が好ましい。
[0052] また、脂質膜構造体には、標的細胞やマトリックスメタ口プロテアーゼを特異的に認 識する抗体を保持させてぉ ヽてもよ ヽ。抗体としてはモノクローナル抗体が好ま 、。 抗体は、例えば、単一のェピトープに対する 1種類のモノクローナル抗体を用いても よいが、各種のェピトープに対する特異性を持つ 2種以上のモノクローナル抗体を組 み合わせて用いてもよい。 1価抗体又は多価抗体のいずれを用いてもよい。天然型 (i ntact)分子又はそのフラグメント若しくは誘導体を用いてもよい。例えば、 F(ab')
2、 Fab
'及び Fabなどのフラグメントを用いてもよぐ少なくとも二つの抗原又はェピトープ（epi tope)結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又はクヮドローム (quadrome),ト リオーム (triome)などの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディォタイプ抗 体、さらには化学的に修飾あるいは加工などがされた誘導体を用いることもできる。 公知の細胞融合又はハイプリドーマ技術や抗体工学を適用し、合成あるいは半合成 技術を使用して得られた抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用し、 DNA組換え技術を用いて調製される抗体、あるいは標的ェピトープに関して中和特 性を有する抗体や結合特性を有する抗体を用いてもょ ヽ。
[0053] マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療 のための遺伝子を保持する本発明の脂質膜構造体は、マトリックスメタ口プロテア一 ゼの関わる疾患の予防及び Z又は治療のための医薬糸且成物として用いることができ る。本発明の医薬組成物の存在形態及びその製造方法は特に限定されず、上記の 脂質膜構造体と同様の形態として調製することが可能である。例えば、形態としては 、混合乾燥物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結 させた形態を挙げることができる。
[0054] 混合乾燥物形態は、例えば、脂質膜構造体の構成成分とマトリックスメタ口プロテア ーゼの関わる疾患に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子とをー且ク ロロホルム等の有機溶媒で溶解させて混合物を得て、次にこれをエバポレータによる 減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥に付することにより製造することができる。脂 質膜構造体と薬物及び z又は遺伝子とを含む水系溶媒に分散した形態の医薬組成 物の製造方法としてはいくつかの方法が知られており、脂質膜構造体におけるマトリ ックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び z又は遺伝子治療のため の遺伝子の保持様式や混合物の性状などに応じて、下記のように適宜の製造方法 を選択することができる。
[0055] 製造方法 1
上述の混合乾燥物に水系溶媒を添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音 波乳化機、高圧噴射乳化機等による乳化を行い製造する方法である。大きさ (粒子 径)を制御する場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧 力下でイクストルージョン (押し出し濾過）を行えばよい。この方法の場合、まず、脂質 膜構造体の構成成分とマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及 び Z又は遺伝子治療のための遺伝子との混合乾燥物を作るために、脂質膜構造体 、マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療 のための遺伝子を有機溶媒に溶解する必要がある力 マトリックスメタ口プロテアーゼ の関わる疾患に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子と脂質膜構造 体の構成成分との相互作用を最大限に利用できる長所がある。すなわち、脂質膜構 造体が層状構造を有する場合にも、マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有 効な薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子は多重層の内部にまで入り込むこ とが可能であり、この製造方法を用いるとマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患 に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子の脂質膜構造体への保持率 を高くできる長所がある。
[0056] 製造方法 2
脂質膜構造体の構成成分を有機溶媒で一旦溶解後、有機溶媒を留去した乾燥物 に、さらにマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び/又は遺伝 子治療のための遺伝子を含む水系溶媒を添加して乳化を行い製造する方法である 。大きさ (粒子径)を制御する場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを 用いて、高圧力下でイクストルージョン (押し出し濾過）を行えばよい。有機溶媒には 溶解しにくいが、水系溶媒には溶解し得るマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾 患に有効な薬物及び z又は遺伝子治療のための遺伝子に適用できる。脂質膜構造 体がリボソームの場合、内水相部分にもマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患 に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子を保持できる長所がある。
[0057] 製造方法 3
水系溶媒に既に分散したリボソーム、エマルシヨン、ミセル、又は層状構造物などの 脂質膜構造体に、さらにマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及 び Z又は遺伝子治療のための遺伝子を含む水系溶媒を添加して製造する方法であ る。対象となるマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び Z又は 遺伝子治療のための遺伝子としては、水溶性のものを利用できる。既にでき上がって いる脂質膜構造体に外部力もマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な 薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子を添加する方法であることから、マトリツ タスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び z又は遺伝子治療のための 遺伝子が高分子の場合には、マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な 薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子は脂質膜構造体の内部には入り込め ず、脂質膜構造体の表面に存在 (結合)した存在様式をとる可能性がある。脂質膜構 造体としてリボソームを用いた場合、この製造方法 3を用いると、マトリックスメタ口プロ テアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び z又は遺伝子治療のための遺伝子がリポ ソーム粒子同士の間に挟まったサンドイッチ構造 (一般的には複合体あるいはコンプ レックスと呼ばれている。）を形成することが知られている。この製造方法では、脂質 膜構造体単独の水分散液をあら力じめ製造するため、乳化時におけるマトリックスメ タロプロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び z又は遺伝子治療のための遺伝 子の分解等を考慮する必要がなぐ大きさ (粒子径)の制御もし易い。したがって、製 造方法 1や製造方法 2に比べて比較的容易に製造することができる。
[0058] 製造方法 4
水系溶媒に分散した脂質膜構造体を製造して乾燥することにより得られた乾燥物 に、さらにマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び/又は遺伝 子治療のための遺伝子を含む水系溶媒を添加して製造する方法である。製造方法 3 と同様に対象となるマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び Z 又は遺伝子治療のための遺伝子としては、水溶性のものを利用できる。製造方法 3と の相違点は、脂質膜構造体とマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な 薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子との存在様式にあり、この製造方法 4で は、水系溶媒に分散した脂質膜構造体を一旦製造した上でさらに乾燥させた乾燥物 を製造することから、この段階で脂質膜構造体は脂質膜の断片として固体状態で存 在する。この脂質膜の断片を固体状態に存在させるためには、前記したように水系溶 媒に、さらに糖 (水溶液)、好ましくはショ糖 (水溶液)や乳糖 (水溶液)を添加した溶 媒を用いることが好ましい。ここで、マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有 効な薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子を含む水系溶媒を添加すると、固 体状態で存在していた脂質膜の断片は水の侵入とともに速やかに水和し始め、脂質 膜構造体を再構築することができる。この時、マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる 疾患に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子が脂質膜構造体内部に 保持された形態の構造体が製造できる。
製造方法 3では、マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び Z 又は遺伝子治療のための遺伝子が高分子の場合には、マトリックスメタ口プロテア一 ゼの関わる疾患に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子は脂質膜構 造体内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に結合した存在様式をとるが、製造 方法 4はこの点で大きく異なる。すなわち、マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾 患に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子の一部又は全部は脂質膜 構造体内部に取り込まれる。この製造方法 4は、脂質膜構造体単独の分散液をあら 力じめ製造するため、乳化時のマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な 薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子の分解を考慮する必要がなぐ大きさ（ 粒子径)の制御もし易い。従って、製造方法 1や製造方法 2に比べて比較的製造が 容易である。また、この他に、一旦凍結乾燥又は噴霧乾燥を行うため、製剤（医薬組 成物）としての保存安定性を保証し易ぐ乾燥製剤をマトリックスメタ口プロテアーゼの 関わる疾患に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子の水溶液で再水 和しても大きさ (粒子径)を元に戻せること、高分子の抗腫瘍剤及び Z又は遺伝子で あっても、脂質膜構造体内部にマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な 薬物及び z又は遺伝子治療のための遺伝子を保持させ易いことなどの長所がある。
[0060] 脂質膜構造体とマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び Z 又は遺伝子治療のための遺伝子との混合物が水系溶媒に分散した形態を製造する ための他の方法としては、リボソームを製造する方法としてよく知られた方法、例えば 逆相蒸発法などを採用できる。大きさ (粒子径)を制御する場合には、孔径のそろつ たメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン (押し出し濾過）を行 えばよい。また、上記の脂質膜構造体とマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患 に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子との混合物が水系溶媒に分 散した分散液をさらに乾燥させる方法としては、凍結乾燥や噴霧乾燥等を挙げること ができる。この時の水系溶媒としては、上述の糖 (水溶液）、好ましくはショ糖 (水溶液
)や乳糖 (水溶液)を添加した溶媒を用いることが好ま ヽ。脂質膜構造体とマトリック スメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び z又は遺伝子治療のための遺 伝子との混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに凍結させる方法としては、通 常の凍結方法が挙げられるが、この場合の水系溶媒としては、糖 (水溶液)や多価ァ ルコール (水溶液)を添加した溶媒を用いるのが好まし 、。
[0061] 製造方法 5
抗体を脂質膜構造体の表面に保持させた脂質膜構造体は、上記の製造方法 1〜4 に準じて、脂質膜の構成成分とマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な 薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子とを用いて脂質膜構造体を製造し、次 Vヽで抗体を添加することで、抗体が脂質膜構造体の膜の表面に存在 (結合)する形 態の組成物を製造することができる。
[0062] 製造方法 6
抗体を脂質膜構造体の表面に保持させた脂質膜構造体は、上記の製造方法 1〜4 に準じて、脂質膜の構成成分とマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な 薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子とを用いて脂質膜構造体を製造し、次 いで、抗体及び抗体中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体を添加することで、抗 体が脂質膜構造体の膜の表面に存在 (結合)する形態の組成物を製造することがで きる。 [0063] 本発明の脂質膜構造体の調製において配合し得る脂質は、使用するマトリックスメ タロプロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝 子の種類などに応じて適宜選択すればよいが、例えば、薬物として抗腫瘍剤を用い る場合には、抗腫瘍剤 1質量部に対して、総脂質として 0.1〜1000質量部が好ましぐ 0.5〜200質量部がより好ましい。また、遺伝子を用いる場合には、遺伝子 1 gに対し て、総脂質として 1から 500 nmolが好ましぐ 10から 200 nmolがより好ましい。
[0064] マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療 のための遺伝子を保持した脂質膜構造体を含む本発明の医薬組成物は、マトリック スメタ口プロテアーゼの関わる疾患の予防及び Z又は治療に有用である。本発明の 医薬組成物により予防及び Z又は治療可能な疾患は限定されるべきものではなぐ また疾患が悪性腫瘍の場合、悪性腫瘍としての種類は特に限定されないが、特にマ トリックスメタ口プロテアーゼの発現が多 、悪性腫瘍が好適である。悪性腫瘍細胞とし ては、例えば、線維肉腫、扁平上皮癌、神経芽細胞腫、乳癌、胃癌、肝細胞癌、膀 胱癌、甲状腺腫瘍、尿路上皮癌、グリア芽細胞腫、急性骨髄性白血病、脾管癌及び 前立腺癌等の細胞を挙げることができるが、これらの細胞に限定されることはない。ま た、本発明の医薬組成物をヒト等の動物や実験用細胞に投与すると、腫瘍内部にお ける血管新生先端部位にマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物 としての抗腫瘍剤及び Z又は遺伝子を効率的に送達することができる。腫瘍内部に おける血管新生先端部位としては、 ruffling edgeの内皮細胞（endothelial cells)などを 挙げることができる力 これに限定されることはない。
[0065] いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の医薬組成物をヒトを含 む哺乳類動物に投与すると、血中においてはポリアルキレングリコールなどの修飾部 位の存在により優れた血中滞留性が得られ、一方、マトリックスメタ口プロテアーゼを 分泌する悪性腫瘍細胞や新生血管の近傍などで、該修飾部位が脱離することにより 、本発明の医薬組成物に含まれるマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効 な薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子が放出され、あるいは該医薬組成物 が標的細胞により取り込まれ易くなることにより、該細胞に対して薬物及び Z又は遺 伝子の効果を発揮させることができる。また、一部の修飾部位は脱離せずに脂質膜 構造体表面に残留して適度な血中滞留性を与える。
[0066] 本発明の脂質膜構造体を含む医薬組成物の投与方法は特に限定されず、経口投 与又は非経口投与のいずれも選択可能である。経口投与の剤形としては、例えば、 錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、カプセル剤、内服液剤等を挙げることができ、非経 口投与の剤形としては、例えば、注射剤、点滴剤、点眼剤、軟膏剤、坐剤、懸濁剤、 パップ剤、ローション剤、エアゾール剤、プラスター剤等を挙げることができる。これら のうち注射剤又は点滴剤が好ましぐ投与方法としては、静脈注射、動脈注射、皮下 注射、皮内注射などのほか、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射を挙げるこ とができる。本発明の医薬組成物の投与量及び投与期間などは特に限定されず、有 効成分として作用するマトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療のための遺伝子の種類や保持量、脂質膜構造体の種類、対象疾 患の種類や患者の体重、年齢など、種々の条件に応じて適切な投与量及び投与期 間を適宜選択可能である。
なお、上記リン脂質誘導体 (1)を用いた脂質膜構造体は特願 2006— 049567号明細 書に開示されている。上記明細書の全ての開示を参照により本明細書の開示として 含める。
実施例
[0067] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の 実施例に限定されることはない。
例 1
NHSは和光純薬より購入した。 DCCは関東化学より購入した。 GPCは Tosoh8120 ( 東ソー株式会社）、検出器 Tosoh HLC- 8120(RI)、カラム TSK- Gel SuperHZ3000,2500 を使用し、キャリアを THF、流速を 0.35 mL/min,温度を 40°Cに設定した。 'H-NMRは JEOL EX- 400 (400MHz)使用し測定した。 TOF- MSは Bruker MALDI- TOF- MS Refl ex IIを使用し測定した。透析膜 Spectra/Por Membren MWCO: 1,000は Spectrumより 購入した。ペプチドはグライナ一ジャパンより購入した。配列は Gly-Gly-Gly-Va卜 Pro - Leu- Ser- Leu- Tyr-Ser-Gly-Gly-Gly-Glyであり分子量は 1178.9であった。
[0068] (1)ポリエチレングリコール (PEG)の合成 アルゴン下、ナスフラスコにテトラヒドロフラン (THF、 20mL)を添カ卩し、スターラーで撹 拌しながら、重合開始剤として 2-メトキシエタノールを 80 L添加した。続いてカリウム ナフタレ-ド（0.342 mol/L)を 2.9 mL添加した。次にエチレンオキサイド (EO)を 2.3 mL (45 mmol)を添加した。常圧下、常温で撹拌しながら 48時間反応した。 48時間後、反 応溶液の一部 (約 2 mL)を取りゲル浸透クロマトグラフィー（GPC)により分子量を測定 した。数平均分子量 (Mn)は 1,678であり、重量平均分子量 (Mw)は 1,825であった。ま た、 Mw/Mnで求められる多分散度は 1.078と小さぐ GPCで単分散のピークが得られ たことから、 PEGの重合が十分に進んでいると判断した。
[0069] (2) PEG末端のカルボキシルイ匕
上記 (1)で得た反応液のうち半量の 12.5 mLをアルゴン下でナスフラスコに添カロし、 無水コハク酸（0.727 mol/L)を 3.5 mL添加し、常温で 24時間、スターラーで撹拌しな 力 PEG重合の停止反応を行なった。 24時間後、反応液をジェチルエーテル（1 L) で沈殿させた。沈殿物を濾取してビーカーに取り、メタノールで溶解した。再びジェ チルエーテル（1 L)で沈殿させ、沈殿物を濾取してメタノールに溶解し、蒸留水で透 祈した。透析後、ナスフラスコに移して凍結乾燥を行ない、淡黄色の粉末 (0.904 g)を 得た。 GPCにより分子量を測定したところ、 Mnは 1,773、 Mwは 1,903であった。多分散 度は 1.073であり、単分散のピークが得られたことから、副反応なく反応が進行してい ることが確認できた。また、 ^-NMR ^ベクトルを測定したところ、 3.4 ppm付近のメトキ シ基（OMe)由来のピークと 2.6 ppm付近の - CO-CH CH -CO-由来のピークの積分
2 2
比はほぼ 1： 1であり、末端にカルボン酸を導入したことが確認された。
1H-NMR(CDC1 )： δ (ppm) 2.62 (s, COCH CH CO, 4H), 3.38 (s, 3H), 3.65 (s, 176
3 2 2
H), 4.26 (t, 2H).
[0070] (3) PEG末端のカルボキシル基の活性エステル化（MeO-PEG- NHSの合成）
上記 (2)で得た化合物 0.2 gを 50 mL用スクリュー管に添カ卩した。 NHS 57.6 mg、 DCC 41.26 mg、及びクロ口ホルム 10 mLをスクリュー管に添カ卩し、スターラーで撹拌しなが ら常温で 24時間反応した。反応終了後、固体を除くためにろ過を行ない、ろ液を 300 mLのジェチルエーテルで沈殿させた。沈殿物を濾取して乾燥し、得られた固体をビ 一力一に取り、クロ口ホルムに溶解した。ジェチルエーテルでの沈殿及び濾取を 2度 繰り返し、得られた固体をクロ口ホルムに溶解して 100 mLナスフラスコに入れ、溶媒を 留去した後にベンゼンを添加して凍結乾燥し、淡褐色粉末 (104 mg)を得た。 TOF-M Sによる Mnは 2192.12であり多分散度は 1.02であった。
[0071] TOF-MSスペクトルから各ピークの間隔は 44でありこれは PEGのそれぞれのユニット の分子量であることが確認できた。 TOF-MSスペクトルでの各ピークの測定値と理論 値を比較することにより、末端に目的の官能基が導入できたかを確認することができ る。表 1に各 n数に対する分子量の理論値と測定値を示した。各 nに対する測定誤差 は 2mass以内であり、 目的とする化合物が得られたことを示している。また、 ^-NMR^ ベクトルを測定したところ、 NHS基の導入率 (3.37 ppmのメトキシ基に由来するピーク と 2.84 ppmの NHS基に由来するピークの積分比）は 97.3%であり、ほぼ 100%の割合で NHS基が導入されたことが確認できた。
^-NMRCCDCl )： δ (ppm) 2.78 (t, 2H), 2.84 (s, 4H), 2.95 (t, 2H), 3.37 (s, 3H), 3.
3
64 (s, 176H), 4.26 (t, 2H)
[0072] [表 1] ri数 理論値 測定値 誤差
36 1927. 35 1. 19
37 1970. 21 1971. 73 1. 52
38 2014. 27 2015. 71 1. 44
39 2058. 32 2060. 20 1. 88
40 2102. 37 2103. 94 1. 57
41 2146. 42 2148. 02 1. 60
[0073] (4) PEG-ペプチドの合成
ペプチド 24.6 mgにジメチルスルホキシド (DMSO) 1 mL、上記 (3)で得た化合物 41. 17 mg、及びトリェチルァミン 5 Lを添カ卩し、常温で 3時間振とうして反応させた。 HPL Cにより反応終了を確認し、凍結乾燥して白色粉末 (66.76 mg)を得た。 TOF-MSを測 定したところ Mnは 3223.82であり、理論値のである 3255.93とは 32mass違っていたが、 分子量の分布をもっていること力も PEG由来の化合物であり、 PEG-ペプチドであると 推定された。また、多分散度は 1.01で、単分散のピークであることから反応は定量的 に進行していることを確認した。 NMR ^ベクトルを測定したところ、 6.6-7.4 ppmに ペプチド中のチロシンのベンゼン環由来のピークを確認した。 3.38 ppm付近のメトキ シ基に由来するピークとチロシンのベンゼン環由来のピークの積分比がモル比で 1： 1 であることから、 PEG末端へペプチドが 100%導入されて!、ることが確認できた。
[0074] (5) PEG-ペプチド- DOPEの合成
例 (4)で得た PEG-ペプチド 54.7 mgをクロ口ホルム 4 mLに溶解し、 DOPE 24.7 mg、 DCC 6.85 mg、 NHS 3.82 mg、及びトリェチルァミン 4.63 μ 1を添カ卩し、常温で 48時間 振とう反応させた。反応終了後、デシケーターによりクロ口ホルムを除き、再びクロロホ ルム 1.5 mLに溶解した。スターラーで撹拌しながらジェチルエーテル 100 mLに上 記のクロ口ホルム溶液をゆっくり滴下し、 PEG由来化合物を析出させた。常温で個体 が沈殿するまで静置し、上清を除いた。ジェチルエーテル 50 mLを添加しスターラー で撹拌後、沈殿するまで静置して上清を取り除いた。沈殿物を水で溶解し、 HPLCに て分離精製し、分取した画分を透析して凍結乾燥した。 TOF-MSより求められた Mn は 3955.15、多分散度は 1.00であった。ピークが分子量分布をもっていることから PEG 由来のものであり、理論値 3949.86との誤差は 5.3massと近いことから PEG-ペプチド- DOPEであることが示された。 H-NMRスペクトルを測定したところ、 3.35ppmの PEG末 端メトキシ基由来のピークと、 6.6-7. lppmのペプチドのチロシンのベンゼン環由来の ピークとの積分比は 3 :4.3とモル比がほぼ 1： 1であり、 PEG-ペプチドと比較して大きな 変化はなかった。
[0075] 例 2
(1)方法
(a)MENDの調製
PEG修飾脂質 (PEG- DSPE)及び PEG-ペプチド- DOPE(PPD)を用いて PEGのみで修 飾された MEND (PEG-MEND)、 PEG-ペプチドのみで修飾された MEND (PPD- MEN D)、並びに PEG及び PEG-ペプチドで修飾された MEND (PEG/PPD- MEND)をそれ ぞれ調製した。コンパクション体をルシフェラーゼをコードしたプラスミド DNAとプロタミ ンの N/Pを 1として HEPES buffered glucose (10mM HEPES, pH7.4, 5% glucose;HBG) 中で調製した。脂質膜の脂質組成は 1 mMのエタノール溶液 DOTAP、 DOPE, Choles terolをそれぞれ 3 :4: 3の割合でガラス試験管に添カ卩しこれを 100%とした。 PEG及び P EG-ペプチドの修飾を 1： 1の割合で行うために 1 mMのエタノール溶液として PEG- DS PE及び PPDを全修飾濃度が 5、 15、又は 20 mol%となるように半量ずつ添カ卩した。その 後、クロ口ホルムをエタノール溶液と等量添加し、ボルテックスで攪拌混合した後、デ シケーターで溶媒を留去して脂質膜を調製した。 [3H]標識する場合は脂質膜溶液中 に [3H]- Cholesteryl hexadecyl ether (CHE)を添カ卩した。 MENDはコンパクション体を 脂質膜に添加し、ソ-ケーシヨン処理することにより調製した。調製した MENDの粒子 径 ίま dynamic light scattering (DLS)によつ飞孭 U定し 7こ。
(b)インビトロ実験
HT1080 (ヒト繊維芽肉腫由来）を播種し、 24時間後に 24 well-plate (4 X 104 cells/50 0 ul DMEM/well)の各 wellから DMEMを回収し、細胞などを除くため 1000rpm、 4°Cで 5分間遠心し、上清を Conditioned mediumとして実験に用いた。 0.4 μ g DNA MEND /250 L in conditioned medium/wellで MENDを HEK293 (ヒト腎臓内皮様由来）（4 X 10' cells/well)に添カ卩して 3時間インキュベーション後、 Fresh DMEMと conditioned m ediumを 1： 1で 750 μ L/well追加して 45時間インキュベーションし、ルシフェラーゼ活 性を測定した。
MMP- 2を 14 nMの濃度で含む DMEMで MENDを 0.4 μ g DNA /250 μ Lに調整し、 HEK293細胞（4 X 104 cells/well)に対して 0.4 μ g/wellで MENDを添カ卩し、 3時間後に f resh DMEMを 250 μ 1/wellの割合で添カ卩して 45時間インキュベーションした後、ルシ フェラーゼ活性を測定した。
また、他の細胞系 MG-63 (ヒト骨肉種由来）、 HOS (ヒト骨肉種由来）、 PC-3 (ヒト前立 腺がん由来）におけるトランスフエクシヨン実験は、トランスフエクシヨン実験前日に各 細胞を 24wellプレートに 4 X 104cells/wellで培地 0.5 mL中に播種した。 0.4 g DNA相 当に調製したサンプルを無血清培地の場合には FBS'抗生物質非含有 D'MEM (以 下、「D'MEM( -)」と略記する。）で 250 Lとなるように希釈し、血清含有培地の場合は D'MEMで同様に希釈した。各 wellを PBSで洗い、 250 L/wellの割合でサンプルを添 加し、 5%CO下に 37°Cで 3時間インキュベートした後、 D'MEMを 0.75 mL/well添カロし、
2
5%CO下に 37°Cで 45時間インキュベートした。 45時間後、各 wellの培地を除去して PB
2
Sで洗浄した後、 Reporter Lysis Buffer (75 μ L/well)を添カ卩して- 80°Cで凍結した。 30 分後、凍結したプレートを室温で融解させ、氷上にて CELL SCRAPERを用いて細胞 を剥がしとり、 Lysis溶液を回収した後、遠心 (4°C、 15,000rpm、 5分)して上清を回収し た。上清 20 /z Lあたりのルシフェラーゼ活性 (RLU)を測定し、上清を DDWで 5倍希釈 して BCA法によりタンパク定量を行い、 RLU/mg proteinを算出した。
メディウム中の MMP- 2発現量の測定から、 MG- 63 (68.7士 2.85 ng/ml)、 HOS (28. 7士 4.52 ng/ml)を MMP- 2高発現細胞、 PC- 3 (7.09士 3.06 ng/ml)を MMP- 2低発 現細胞とした。メディウム中の MMP- 2発現量に関しては、 Matrix Metalloproteinase- 2 (MMP- 2), Human, Biotrak ELISA System (Amersham Bioscience)を用いて測定した 。サンプルの調製はキットのプロトコルに従って行なった。
[0077] (c)動物実験
血中濃度の経時変化の測定は DDYマウス (雄性: 5週齢)を用いて行なった。腫瘍 移行量の測定及び腫瘍における発現量の測定には、 HT1080細胞（1 X 106 cells)を B ALB/cヌードマウス (雄性: 5週齢)の背部皮下に移植し腫瘍サイズ (長径）が 12-18 m mとなった担癌マウスを用いた。
MENDの動態実験では [3H]標識 MENDを（7.5 μ g pDNA/125 L in HBG、 0.5 m M lipid)を尾静脈より投与し、タイムコースにおける血液や腫瘍組織を回収し、それぞ れ 3Hカウントを測定し、血中濃度および腫瘍移行量を %ID/mlおよび %ID/g tumorとし て算出した。
遺伝子発現実験では MEND (25 μ g pDNA/420 μ L HBG、 0.5 mM lipid)を尾静 脈より投与し、 48時間後に腫瘍組織を採取し重量を測定した。腫瘍組織を Lysis buffe r(0.1% Triton X- 100, 2mM EDTA, 0.1M Tris- HC1, pH7.8)中でホモジュナイズし、 4 。C、 15,000 rpmで 10分間遠心し、上清についてルシフェラーゼ活性を測定し、遺伝 子発現量を RLU/g tumorとして算出した。
[0078] (2)結果
(a)インビトロ実験
•PPD- MENDの HEK293細胞における遺伝子発現活性への MMP-2添カ卩の影響
MMP-2低発現細胞である HEK293において、 5% PPD- MENDの発現活性は 5% PEG -MENDと比較して 4〜5倍高い程度であった（図 1、白色バー）。一方、 Conditioned m ediumを用いた際の 5% PPD- MENDの発現活性は 5% PEG- MENDと比較して 14.3倍で あり（灰色バー）、 MMP- 2を含むメディウムを用いた際は 24.8倍 (黒色バー）の発現活 性を示し、いずれの場合も、通常の場合と比べて優位に高い値を示していた。これら の条件下において、 PEG未修飾群での発現活性には変化が認められな力つた。以 上の結果より、 5% PPD- MENDの発現活性は、 MMPを含むメディウム中で PEGの切断 を受けて上昇したものと考えられる。
•他の細胞系における PPD-MENDの遺伝子発現活性
MG-63、 HOS、及び PC-3細胞において、 5% PPD- MENDの発現活性は 5% PEG-M ENDと比較してそれぞれ 20.9倍、 12.7倍、 5.21倍上昇していた。これらの発現活性の 上昇は MMP-2発現量に依存しており、 PPD- MENDの発現活性上昇は MMPによる PE Gの切断の結果であることが示唆された（図 2)。
[0079] (b)インビボ実験 (1)
•血中濃度推移
PPD- MENDの血中濃度推移は PEG- MENDと比較して劣るものの、 MENDと比較し て有意に高ぐ PPDの修飾によって血中滞留性がある程度得られることが示唆された (図 3(a))。
'腫瘍移行量
血中濃度依存的な腫瘍への移行が認められた (図 3(b))。
•腫瘍遺伝子発現 (c,d)
腫瘍における発現量は MENDおよび 5% PPD- MENDでは見られなかった。また、同 等の腫瘍移行量を示した 5% PEG- MENDと 15% PPD-MENDを比較すると遺伝子発現 活性は 15% PPD- MENDにおいて 55倍上昇していた。この結果は PPD- MENDの腫瘍 到達後に MMPにより PEGが切断され、その結果、発現活性が上昇したものと考えられ る。また 15% PEG- MENDと 15% PPD- MENDは同等の発現活性を示していた（図 3(c)) 。発現量（RLU/g tumor)を移行量 (％ID/g tumor)で除した specific activity of particles を算出すると、 PPD- MENDは PEG- MENDと比較して約 3倍高かった。以上の結果は 、腫瘍到達後に MMPによる PEGが切断され、 PPD- MENDが PEG- MENDと比較して 標的細胞への移行や発現活性が促進されて ヽることを示唆して ヽる（図 3(d))。
[0080] (c)インビボ実験 (2) 以上の結果から、 PPDを用いた PEG-ペプチドによる修飾は血中滞留性及び腫瘍 移行量を上昇させることが明らかになった。 PEG-ペプチドによる修飾を利用してさら に高 ヽ血中滞留性及び腫瘍移行量を達成すべく、 PEG-ペプチドと PEGとを組み合 わせた修飾の効果を判定した。 PEG-ペプチドと PEGとの組み合わせの比率は 1： 1と して試験を行なった。表 2は各濃度における PEG/PPD-MENDの粒子径を示す（単位 は nm
[表 2]
5% 15% 20%
PEG-MEND 156 137 112
PEG/PPD-MEND 174 139 121
[0081] 血中滞留性は PEG- MENDでは 15%で一番高い値を示し（図 4(a)、白色バー）、腫瘍 移行量も同様の傾向を示した（図 4(b)、白色バー）。一方、 PEG/PPD-MENDでは血 中濃度は Total PEG濃度 20%まで上昇しており（図 4(a)、黒色バー）、腫瘍移行量も同 様の傾向であった（図 4(b)、黒色バー）。 PEG濃度 20%では、 PEG- MENDと PEG/PP D- MENDの腫瘍移行量はほぼ同等であった。 PEG- MEND及び PPD- MENDの腫瘍 における遺伝子発現活性は、腫瘍移行量と同様な上昇'減少傾向を示したが、 20% P EG- MENDと 20% PEG/PPD- MENDにおける発現量には 60倍以上の大きな差が見ら れた（図 4(c))。さらに、発現量を移行量で除した単位移行量あたりの発現活性では 9 0倍以上の上昇が見られた。この結果は、 PEG濃度 20%において PEG : PEG-ペプチド 修飾の比率が 1:1のときに腫瘍への移行性の上昇とペプチド切断による MEND活性 化上昇の組み合わせ効果が相乗的に発揮されたものと考えられる。
産業上の利用可能性
[0082] 本発明の脂質膜構造体は、血中にお!ヽてはポリアルキレングリコールなどの修飾部 位の存在により優れた血中滞留性を示し、一方、マトリックスメタ口プロテア一ゼを分 泌する悪性腫瘍細胞や新生血管の近傍などで、該修飾部位が脱離することにより薬 物などを放出することができ、あるいは標的細胞により取り込まれ易くなることにより、 該細胞に対して薬物などによる効果を発揮させることができる。

Claims

請求の範囲 少なくとも下記の 2種類のリン脂質誘導体：
(1)アルコールィ匕合物の残基とリン脂質類の残基とを含み、該アルコールィ匕合物の残 基とリン脂質の残基との間にペプチドを含むリン脂質誘導体であって、
(a)該アルコール化合物が、ポリアルキレングリコール類、グリセリン類、及びポリグリセ リン類カゝらなる群カゝら選ばれるアルコールィ匕合物であり、
(b)該リン脂質力 ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファリジルコリン類、ホスファ チジルセリン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファチジルグリセロール類、カル ジォリピン類、スフインゴミエリン類、セラミドホスホリルエタノールアミン類、セラミドホス ホリルグリセロール類、セラミドホスホリルグリセロールホスファート類、 1,2-ジミリストイ ル- 1,2-デォキシホスファチジルコリン類、プラスマロゲン類、及びホスファチジン酸類 力 なる群力 選ばれるリン脂質であり、及び
(c)該ペプチドがマトリックスメタ口プロテア一ゼの基質となりうる基質ペプチドを含むぺ プチドである（ただし、該基質ペプチドの両端又は片端には 1個のアミノ酸又は 2ない し 8個のアミノ酸を含むオリゴペプチドが結合して 、てもよ 、）
リン脂質誘導体、及び
(2)アルコールィ匕合物の残基とリン脂質類の残基とを含み、該アルコールィ匕合物の残 基とリン脂質の残基との間にペプチドを含有しないリン脂質誘導体であって、
(a)該アルコール化合物が、ポリアルキレングリコール類、グリセリン類、及びポリグリセ リン類カゝらなる群カゝら選ばれるアルコールィ匕合物であり、
(b)該リン脂質力 ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファリジルコリン類、ホスファ チジルセリン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファチジルグリセロール類、カル ジォリピン類、スフインゴミエリン類、セラミドホスホリルエタノールアミン類、セラミドホス ホリルグリセロール類、セラミドホスホリルグリセロールホスファート類、 1,2-ジミリストイ ル- 1,2-デォキシホスファチジルコリン類、プラスマロゲン類、及びホスファチジン酸類 力 なる群力 選ばれるリン脂質である
リン脂質誘導体
を構成脂質として含む脂質膜構造体。 [2] マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療の ための遺伝子を保持した請求項 1に記載の脂質膜構造体。
[3] リボソームである請求項 1又は 2に記載の脂質膜構造体。
[4] リン脂質誘導体 (1)及び (2)において、該アルコールィ匕合物がポリアルキレングリコー ル類であり、該リン脂質がホスファチジルエタノールアミン類であり、リン脂質誘導体 (1 )にお!/、て、該ペプチドが Va卜 Pro- Leu- Ser- Leu- Tyr- Ser- Glyを含むペプチドである 請求項 1な!、し 3の 、ずれか 1項に記載の脂質膜構造体。
[5] リン脂質誘導体 (1)及び (2)において、該アルコール化合物がポリエチレングリコール であり、該リン脂質がジォレイルホスファチジルエタノールァミンまたはジステアロイル ホスファチジルエタノールァミンであり、リン脂質誘導体 (1)において、該ペプチドが G1 y-Gly-Glyをリンカ一として含む請求項 1な 、し 3の 、ずれか 1項に記載の脂質膜構 造体。
[6] リン脂質誘導体 (1)において、該ペプチドが
uly-uly-uly-Val-Pro-Leu-ber-Leu-Tyr-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly
である請求項 1な 、し 3の 、ずれか 1項に記載の脂質膜構造体。
[7] リン脂質誘導体 (1)とリン脂質誘導体 (2)との比がモル比として、 10:1〜1:10である請求 項 1な 、し 6の 、ずれか 1項に記載の脂質膜構造体。
[8] リン脂質誘導体 (1)及びリン脂質誘導体 (2)の脂質膜構造体の全脂質量に対する割合 力^〜 40モル %である請求項 1な 、し 7の 、ずれか 1項に記載の脂質膜構造体。
[9] マトリックスメタ口プロテアーゼの関わる疾患に有効な薬物及び Z又は遺伝子治療の ための遺伝子を保持した請求項 2な 、し 8の 、ずれか 1項に記載の脂質膜構造体を 含む医薬組成物。
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