WO2007132917A1 - 非還元マンノース残基を認識するファージ提示型単鎖抗体 - Google Patents

非還元マンノース残基を認識するファージ提示型単鎖抗体 Download PDF

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WO2007132917A1
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acid sequence
antibody
variable region
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Yoko Yamaguchi
Munehiro Nakata
Keiko Sakai
Yoshitaka Shimizu
Ayano Takasaki
Tomoki Chiba
Yu Kusada
Nobuyoshi Shimizu
Atsushi Takayanagi
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Tokai University Educational System
Keio University
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    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
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    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Definitions

  • the present invention relates to a phage-displaying single-chain antibody that recognizes a non-reducing mannose residue. More specifically, the present invention relates to a single chain antibody that recognizes a non-reducing mannose residue obtained by screening a phage-displayed antibody library.
  • Non-Patent Documents It is widely known that immunization with saccharides induces a primary response of IgM. However, since many saccharides are self-antigens, no response may be seen (Non-Patent Documents). 1 and 2). Since the phage display method can produce an antibody against a self-antigen, it is considered to be an optimal method for producing an antibody against a sugar chain moiety. Since it has already been proved that the conventional technique using hyperidoma is not effective in producing monoclonal antibodies against various sugar chain moieties, antibody fragments having high specificity and affinity for sugar chains can be obtained by The possibility of isolation by the phage display method is attracting attention.
  • the phage display method has been mainly used to produce antibodies against proteins, but has rarely been used for sugar chain antigens. Since it is difficult to immobilize a sugar chain antigen on a plastic plate, the methods generally used for protein antigens cannot be applied to sugar chain antigens as they are.
  • anti-glycan single chain antibodies scFv
  • Most of the anti-glycan antibodies produced to date are of the IgM class in the case of monoclonal antibodies and have low affinity even in the case of scFv. It is not suitable for treatment.
  • Non-Patent Document 1 Deng, S "MacKenzie, CR, Sadowaka, J” Michniewicz, J "Young, NM, Bundle, DR, and Narang, SA (1994) J. Biol. Chem. 269, 9533-9538 .
  • Non-Patent Document 2 MacKenzie, C.R., Hirama. T “Deng, S” Bundle, D.R., Narang, S.A “and Young, N.M. (1996) J. Biol. Chem. 271, 1527-1533.
  • Non-Patent Document 3 Babino, A "Pritsch, ⁇ ., Oppezzo, P., Du Pasquier, R., Roseto, A” O sinaga, E., and Alzari, P.M. (1997) Hybridoma 16, 317—324.
  • Patent Document 4 van Kuppevelt, T.H., Dennissen, M.A.B.A., van Venrooij, W.J., Hoet, R.M.A., and Veerkamp, J.H. (1998) J. Biol. Chem. 273, 12960-12966.
  • Non-Patent Document 5 Mao, S., Gao, C, Lo, C.-HL, Wirsching, P., Wong, C.-H., and Jan KD (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6953-6958.
  • Non-Patent Document 6 Lee, KJ, Mao. S., Sun, C, Gao, C, Blixt, O., Arrues, S., Horn. LG., Kauftnann, GF, Hoffinan, TZ, Coyle, AR, Paulson , J., Felding— Habermann, B., and Janda, KD (2002) J. Am. Chem. Soc. 124, 12439-12446.
  • Non-Patent Document 7 Ravn, P., Danielczyk, A., Jensen, KB, Kristensen, P., Christensen, PA, Larsen, M., Karsten, U., and Goletz, S. (2004) J. Mol. Biol. 343, 985—996
  • Non-Patent Document 8 Deng, S., MacKenzie, CR, Hirama, T., Brousseau, R., Lowary, TL, Young, NM, Bundle, DR, and Narang, SA (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9 2, 4992-4996.
  • Non-Patent Document 9 MacKenzie, R. and To, R. (1998) J. Immunol. Mothods 220, 39-49.
  • Non-Patent Document 10 Zhang, J., Tanha, J., Hirama, T "To, NHKR , Tong- Sevinc, H "S tone, E., Brisson, J.-R., and MacKenzie, CR (2004) J. Mol. Biol. 345, 49-56.
  • An object of the present invention is to provide an antibody that recognizes a non-reduced mannose residue and a nucleic acid encoding the antibody.
  • the present inventors improved the phage display method, and developed artificial glycolipids (Stoll, MS, Mizuochi, T., Childs, RA "and Feizi, T. (1988) J. Biochem. 256, 661— 665; Kenjo, A "Takah ashi, M., Matsushita, M., Endo, Y., Nakata, M., Mizuochi, T., and Fujita, T. (2001) J. Biol. Chem. 276, 19959- 19965; and Shimizu, Y. , Nakata, M., Matsunuma, J "and
  • the present inventors have found that in order to establish a method of producing a panel of scFv for various carbohydrate moieties, 10 11 or more phage-displayed library presenting a human scFv (Sblattero, D. and
  • the binding force to RNase B has no binding force to fetuin with complex type oligosaccharide and 0-linked type oligosaccharide.
  • sc Fv non-reducing mannose It has also been shown to have high affinity and specificity for residues, and thus for various sugar chain antigens.
  • bets scFv it was shown that phages display method is effective.
  • the antibody according to any one of (1) to (14) below is provided:
  • amino acid sequence of the variable region of the heavy chain one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 as the amino acid sequence of the variable region of the light chain.
  • An antibody that recognizes a non-reducing mannose residue comprising an amino acid sequence in which one amino acid is deleted, substituted, or added.
  • amino acid sequence of the variable region of the heavy chain one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing are deleted, substituted, or 1 or several amino acids are deleted from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 as the amino acid sequence of the light chain variable region, including the added amino acid sequence
  • amino acid sequence of the variable region of the heavy chain one or several amino acids are deleted or replaced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 in the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the light chain variable region is deleted as an amino acid sequence of the light chain variable region, including an added amino acid sequence, An antibody that recognizes a non-reducing mannose residue comprising a substituted or added amino acid sequence.
  • amino acid sequence of the variable region of the heavy chain one or several amino acids are deleted or replaced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 of the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 of the sequence listing
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 in the sequence listing or the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16 of the light chain variable region is deleted as an amino acid sequence of the light chain variable region, including an added amino acid sequence, An antibody that recognizes a non-reducing mannose residue comprising a substituted or added amino acid sequence.
  • amino acid sequence of the variable region of the heavy chain one or several amino acids are deleted or replaced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 of the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 of the sequence listing
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 in the sequence listing or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20 is deleted as the amino acid sequence of the light chain variable region, including the added amino acid sequence.
  • An antibody that recognizes a non-reducing mannose residue comprising a substituted or added amino acid sequence.
  • amino acid sequence of the variable region of the heavy chain one or several amino acids are missing in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 in the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 includes one or several amino acids as the amino acid sequence of the variable region of the light chain.
  • amino acid sequence of the variable region of the heavy chain one or several amino acids are missing in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 of the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 of the sequence listing. 1 or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 in the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 as the amino acid sequence of the variable region of the light chain.
  • An antibody that recognizes a non-reduced mannose residue comprising a deleted, substituted or added amino acid sequence.
  • amino acid sequence of the variable region of the heavy chain one or several amino acids are missing in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 of the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 of the sequence listing. 1 or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 as the amino acid sequence of the variable region of the light chain, including the amino acid sequence lost, substituted or added.
  • amino acid sequence of the variable region of the heavy chain one or several amino acids are missing in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34 of the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34 of the sequence listing. 1 or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36 as the amino acid sequence of the variable region of the light chain.
  • An antibody that recognizes a non-reduced mannose residue comprising a deleted, substituted or added amino acid sequence.
  • amino acid sequence of the variable region of the heavy chain one or several amino acids are missing in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38 of the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38 of the sequence listing.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 40 in the sequence listing or the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 40 as the amino acid sequence of the variable region of the light chain, including the amino acid sequence deleted, substituted or added An antibody that recognizes a non-reduced mannose residue comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence.
  • amino acid sequence of the variable region of the heavy chain one or several amino acids are missing in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42 of the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42 of the sequence listing. 1 or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 44 in the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 44 as the amino acid sequence of the variable region of the light chain, including the amino acid sequence deleted, substituted or added An antibody that recognizes a non-reduced mannose residue comprising a deleted, substituted or added amino acid sequence.
  • amino acid sequence of the variable region of the heavy chain one or several amino acids are missing in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46 of the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46 of the sequence listing. 1 or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 48 in the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 48 as the amino acid sequence of the variable region of the light chain.
  • An antibody that recognizes a non-reduced mannose residue comprising a deleted, substituted or added amino acid sequence.
  • nucleic acid encoding the above-described antibody of the present invention is provided.
  • any of the following nucleic acids is provided.
  • nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing;
  • nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing;
  • nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing;
  • nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing;
  • nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17 of the sequence listing and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 19 of the sequence listing;
  • nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 25 of the sequence listing and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 27 of the sequence listing;
  • nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 29 of the sequence listing and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 31 of the sequence listing;
  • nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 33 in the sequence listing and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 35 in the sequence listing;
  • nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 37 of the sequence listing and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 39 of the sequence listing;
  • (11) a nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 41 of the sequence listing, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 43 of the sequence listing;
  • nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 45 of the sequence listing and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 47 of the sequence listing;
  • a recombinant antibody that recognizes a non-reduced mannose residue that can be obtained by the above method.
  • the antibody is a single chain antibody.
  • the antibody of the present invention is an antibody that recognizes a non-reduced mannose residue.
  • the antibody of the present invention is prepared by mannotriose (Man3) and dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (DPPE), which is an artificial glycolipid synthesized by reductive amination reaction, Man3-DPPE. It was obtained by screening a human scFv phage display library using it as a model antigen. As a result of analyzing positive phage clones by TLC-overlay method and surface plasmon resonance method, it was demonstrated that the antibody of the present invention binds to an artificial glycolipid having a mannose residue at the non-reducing end.
  • Man3 mannotriose
  • DPPE dipalmitoyl phosphatidylethanolamine
  • a non-reducing end has a matrix. Although it is not particularly limited as long as it is an artificial glycolipid having a nonose residue, oligosaccharide is preferred.
  • each constituent sugar is bound by a 1 ⁇ 2 bond, a 1 ⁇ 3 bond, a 1 ⁇ 4 bond, a 1 ⁇ 6 bond, j8 1 ⁇ 4 bond, or a combination thereof. It is a thing.
  • mannose may form a straight chain by the above bond or may have a branched structure by a combination of ⁇ 1 ⁇ 3 bond and a 1 ⁇ 6 bond.
  • the number of monosaccharides in the oligosaccharide is preferably 2 to 11.
  • Specific oligosaccharides include, for example, mannobiose (Man2), mannotriose (Man3), mannotetraose (Man4), mannopentaose (Man5), mannohexaose (Man 6), mannohepta Ose (Man7).
  • these oligosaccharides have a reducing terminal aldehyde group.
  • this aldehyde group can be used as a means for immobilizing oligosaccharides. That is, a Schiff base is formed by a reaction between the aldehyde group and a lipid having an amino group, and then the Schiff base is reduced according to a conventional method, preferably a chemical reduction, such as NaBH CN.
  • the above lipid having an amino group is preferably a phospholipid having an amino group.
  • a phospholipid having an amino group for example, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (DPPE), distearoyl phosphatidylethanolamine (DSPE) or the like is used. be able to.
  • DPPE dipalmitoyl phosphatidylethanolamine
  • DSPE distearoyl phosphatidylethanolamine
  • a conjugate of oligosaccharide and lipid obtained as described above may be referred to as an artificial glycolipid.
  • the glycolipid used in the present invention is preferably an artificial glycolipid as described above.
  • the solvent for dissolving the artificial glycolipid as an antigen is not particularly limited, but it is dissolved in black mouth form Z methanol Z water (10: 10: 3, volume ratio) and further diluted with methanol, for example, gZml. It is desirable to do.
  • This solution is added to, for example, a 96-well plastic plate (flat bottom) and air-dried to fix the artificial glycolipid to the well. Block this well and wash it.
  • a plate coated with an artificial glycolipid by a forceful operation can be used as an antigen-coated plate.
  • TBS Tris-buffered saline
  • 3% B SAZTBS 3% ushi serum albumin
  • TBS-T TBS containing 0.2% Tween 20
  • the phage-displayed antibody can be prepared by a known method (Marks JD et al., J. Mol. Biol. 222 ⁇ 581-597, 1991; Nissim power EMBO J.13 ⁇ 6 92— 698, 1994; Satoshi Takayanagi, Riyo Okui, Nobuyoshi Shimizu, Super Repertoire Artificial Antibody Library, Application No. 2001-358602 (International Publication No. WO03Z04419)).
  • a phage-displaying antibody library is one that applies a system that displays (displays) an antibody on the surface of a phage by fusing the antibody to a coat protein of a filamentous phage.
  • the antibody gene can be amplified by PCR to prepare a library containing various types of antibody genes, and this can be displayed on a phage to obtain a phage display library. Specific examples of methods for producing phage-displayed single chain antibodies are shown below, but are not limited thereto.
  • a fragment containing the CDR1 and CDR2 regions of the VH or VL region of the immunoglobulin gene and a fragment containing the CDR3 region are each amplified by PCR. . These are mixed to form a saddle type, and the VH or VL region is amplified by PCR. Each of these amplified DNA fragments is integrated into a non-expression type phagemid vector to prepare a VH library and a VL library. These E. coli VH libraries and VL libraries are infected with helper phages and converted to phage libraries.
  • phage-type VH and VL libraries are co-infected with Escherichia coli expressing Cre recombinase, and a recombination reaction is carried out between VH'VL vectors in E. coli.
  • This E. coli can be infected with M13K07 helper phage to generate a phage expressing a full-length single chain antibody.
  • this phage is infected with E. coli so that multiple infections do not occur, and further, a helper phage is superinfected, and ampicillin 'Kana machine chloramphe-coal Incubate at 25 ° C in medium without glucose.
  • a phage expressing the recombinant single chain antibody in the supernatant can be obtained.
  • the phages in the supernatant are precipitated with polyethylene glycol and resuspended to obtain an artificial antibody library having a repertoire of 10 11 or more.
  • the phage-displaying antibody having the target sugar-binding property is a human-made antibody produced by the above method. Can be selectively recovered from a single-stranded phage library using the binding ability to an artificial glycolipid having the sugar chain structure as an index. This operation is sometimes called banning.
  • a sugar chain is immobilized on a 96-well plastic plate and blocked with, for example, a buffer containing 3% BSA in order to eliminate non-specific adsorption of the phage-displayed antibody.
  • a suspension of phage-displayed antibody prepared to an appropriate concentration in a buffer solution, and after sufficient reaction (for example, at 37 ° C for 2 hours), wash with a buffer solution.
  • the labeling substance of the anti-phage antibody is not particularly limited, but it is desirable, for example, in terms of simplicity of labeling power with horse radish peroxidase.
  • the detector used for detection is not particularly limited, but it is desirable to use a plate reader suitable for ELISA, for example.
  • the antibody referred to in the present invention includes at least one antigen-binding site formed by a variable region of an antibody H chain or L chain, or a combination thereof, in addition to an antibody that normally exists in vivo.
  • Peptide containing, 1 pair of H chain fragment and L chain fragment Fab also, 2 pairs of H chain fragment and L chain fragment F (ab '), H chain fragment and L chain fragment are linked to the same peptide in series Single-chain antibody
  • the antibody of the present invention may be a full-length antibody in a form normally existing in a living body composed of a combination of two pairs of a full-length H chain and a full-length L chain.
  • F (ab ') and Fab refer to immunoglobulin as a proteolytic enzyme.
  • IgGl is treated with papain
  • IgG when IgG is treated with pepsin, it is cleaved downstream of the disulfide bond existing between the two H chains in the hinge region, so that the two Fab's are slightly larger than those connected in the hinge region! Can be manufactured.
  • This antibody fragment is called F (ab ').
  • a normal antibody consists of two types of polypeptides, large and small, and the larger subunit is designated as “1” [chain].
  • Each peptide consists of a “variable region” that exists on the N-terminal side to form an antigen-binding site, and a “constant region” that is constant for each antibody class.
  • the variable region is further divided into a complementarity-determining region “CDR” and a “framework” existing between them, particularly involved in the formation of an antigen-binding site. It is known that CDR has three regions called “CDR1”, “CDR2”, and “CDR3J” from the N-terminal side for each of the H and L chains!
  • the single chain antibody of the present invention is prepared by appropriately selecting an inducible vector such as pSE380 plasmid (Invitrogen) or pET24d (+) plasmid (Novagen) and a host cell. can do.
  • an animal cell expression system, an insect cell expression system, and a yeast cell expression system can be used in addition to the above-described method.
  • Those skilled in the art can also appropriately select a linker that binds the H chain and the L chain.
  • SEQ ID Nos. 1 to 48 in the sequence listing show the base sequences and amino acid sequences of the heavy and light chains of the antibody of the present invention as shown below.
  • amino acid sequences as long as an antibody recognizing the non-reduced mannose residue of glycolipid can be obtained, 1 or several (preferably 1-8, more preferably 1-5, still more preferably 1-3)
  • Nucleic acids having the base sequences shown in the sequence listing below may be obtained by the techniques described in the examples of the present specification, or may be chemically synthesized using a DNA synthesizer.
  • the base sequence encodes an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in the following sequence listing
  • ordinary gene recombination techniques including PCR etc.
  • DNA synthesis using a DNA synthesizer it can be easily acquired.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of variable region of heavy chain of antibody M3-2 SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of variable region of heavy chain of antibody M3-2 SEQ ID NO: 3: Base of variable region of light chain of antibody M3-2 SEQ ID NO: 4: Amino acid sequence of the variable region of the light chain of antibody M3-2 SEQ ID NO: 5: Nucleotide sequence of the variable region of the heavy chain of antibody M3-4 SEQ ID NO: 6: Variable region of the heavy chain of antibody M3-4 Amino acid sequence SEQ ID NO: 7: Nucleotide sequence of the variable region of the light chain of antibody M3-4 SEQ ID NO: 8: Amino acid sequence of the variable region of the light chain of antibody M3-4 SEQ ID NO: 9: Variable region of the heavy chain of antibody M3-5 SEQ ID NO: 10: Amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of antibody M3-5 SEQ ID NO: 11: Base sequence of the variable region of the light chain of antibody M3-5 SEQ ID NO
  • SEQ ID NO: 29 base sequence of variable region of heavy chain of antibody M3-10
  • SEQ ID NO: 33 Nucleotide sequence of variable region of heavy chain of antibody M3-11
  • SEQ ID NO: 35 nucleotide sequence of the variable region of the light chain of antibody M3-11
  • SEQ ID NO: 37 nucleotide sequence of variable region of heavy chain of antibody M3-12
  • SEQ ID NO: 39 nucleotide sequence of the variable region of the light chain of antibody M3-12
  • SEQ ID NO: 41 Nucleotide sequence of variable region of heavy chain of antibody M3-13
  • SEQ ID NO: 43 nucleotide sequence of the variable region of the light chain of antibody M3-13
  • SEQ ID NO: 45 base sequence of variable region of heavy chain of antibody M3-14
  • an antibody in a form that is normally in vivo from scFv For example, only the variable regions of the heavy and light chains from the scFv plasmid are amplified by PCR. Each fragment can be recombined into, for example, a human antibody H chain gene and / or a plasmid having the L chain gene to form a normal in vivo antibody having a variable region on the scFv. It is.
  • variable region genes are replaced so that no frame shift occurs.
  • Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells and the like can be used.
  • pCDNA3.1 (+) and pMAMneo (CLONETECH) can be used when expressing an antibody in COS cells or CHO cells.
  • the H chain gene of the antibody obtained by the above method is incorporated into the cloning site of pCDNA3.1 (+), and the L chain gene is incorporated into pMAMneo.
  • an expression unit with the L chain gene is inserted between the promoter and polyA at the appropriate site of the vector containing the H chain.
  • the desired antibody can be produced by introducing this vector into COS cells, CHO-Kl, or CHO DG44 by a genetic engineering method.
  • the DHFR gene expression unit is excised from, for example, pSV2 / DHFR (Nature, 1981. Vol. 294, Lee F. et al.,) Into the vector prepared above and incorporated into a vector that expresses the H and L chains. .
  • This vector is introduced into CHO DG44 using a conventional genetic engineering method. The cells selected in this way can significantly increase antibody productivity by using MTX and using the DHFR gene amplification system.
  • Animal cells such as COS cells and CHO cells are usually cultured at 37 ° C in the presence of 5% CO using Dul becco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% ushi fetal serum (FBS).
  • DMEM Dul becco's Modified Eagle's Medium
  • FBS ushi fetal serum
  • the gene can be introduced into COS cells by the DEAE dextran method or a method using a transfection reagent such as lip ofectin.
  • the antibody of the present invention it is desirable to culture in a serum-free medium in order to avoid contamination with serum-derived ushi antibodies.
  • a serum-free medium For cells that are cultured in COS and CHO serum media that have not been adapted to serum-free media, it is desirable to add serum! /, And culture with DMEM.
  • the antibody of the present invention thus obtained in the culture supernatant can be easily purified by a general IgG antibody purification method using, for example, a protein A column or a protein G column. Can be purified.
  • a suppressor mutant TG1 and a non-suppressor mutant TOP10F ′ of Invitrogen (Carlsbad, Calif.) Were used.
  • Helper phage Ml 3K07 was obtained from Amersham Biotech (UK).
  • Ushi serum albumin (BSA), fetuin, cashew fetuin, RNase A, RNase B, DPPE, and dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
  • Mannose Manl
  • Mannobiose Man2; Man a 1-6Man
  • Mannotriose Man3; Ma ⁇ ⁇ 1-6 (Man 1-3) Man
  • Mannopentaose Man5; Man 1-6 (Man 1-3) Man 1-6 (Man a 1-3) Man
  • di-N-acetylchitobiose GN2; GlcNAc ⁇ 1-4GlcNAc
  • lacto N-tetraose LNT; Gal j8 1-3GlcNAc) j8 1-3Gal j8 1-4Glc
  • Fuc a 1-2Gal FG
  • GlcNAc ⁇ l-2Man a 1-6 (GlcNAc ⁇ 1-2 Man a 1-3) Man Manl-BSA
  • Man3 -BSA was obtained from Dextra Laboratories (Redding, UK).
  • Glueose sp—Biotin
  • Man3 sp—Biotin
  • Lewis b sp—Biotini
  • GlycoTech Sento Merri ⁇ Hun r′J, ⁇ I, Gaithersburg.
  • ABTS / H 0 is Roche Diagnostics (Germany, Man
  • Anti-insulin-like growth factor-1 (IGF-1) receptor scFv phage antibody is a scFv derived from 1H7 mAb (Li, S.-L., Liang, S.-J., uuo, N., Wu, AM, Fujita—Yamaguchi, Y. (2000) Cancer Immunol. Immunother. 49, 243-252) and others, using the Expression Module / Recombinant Phage Antibody System of Amersham Bioscience.
  • Artificial glycolipids in the reaction mixture can be obtained by the method described previously (Shimizu, Y., Nakata, M., Matsunuma, J., and Mizuochi, T. (2001) J. and nromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 754 , 127-133), using HPLC using silica gel column Shim-pack PREP-SIL (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) and cartridge column Bond Elut C18 (Varian, Harbor City, Calif.). Purified by reverse phase chromatography. The purity and structure of each artificial glycolipid were confirmed by TLC and MALDI-TOF mass spectrometry.
  • human spleen cDNA from BioChain (Hayward, Calif.) And human leukocyte cDNA from BD Biosciences (Palo Alto, Calif.) Were purchased and used. Based on information that has already been published (Sbalattero, D. & Bradbury, A. (1998) Im munotechnology 3, 271-278), an appropriate library with sequences common to this gene family. Human immunoglobulin variable regions were amplified by PCR using equimolar mixtures of the reverse and forward primers.
  • VHfl AGCGCGGCCtctagaCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCSG (SEQ ID NO: 49)
  • VHf4 AGCGCGGCCtctagaGAGGTGCAGCTGKTGGAGWCY (SEQ ID NO: 52)
  • VHf7 AGCGCGGCCtctagaCAGGTGCAGCTGGTGSARTCTGG (SEQ ID NO: 55)
  • Vkf2 GAAATTGTRWTGACRCAGTCTCC (SEQ ID NO: 57)
  • Vkf3 GATATTGTGMTGACBCAGWCTCC (SEQ ID NO: 58)
  • Vkf4 GAAACGACACTCACGCAGTCTC (SEQ ID NO: 59)
  • V112 TCCTATGWGCTGACWCAGCCAC (SEQ ID NO: 61)
  • VU3 TCCTATGAGCTGAYRCAGCYACC (SEQ ID NO: 62)
  • Vlf4 CAGCCTGTGCTGACTCARYC (SEQ ID NO: 63)
  • VU6 CAGCCWGKGCTGACTCAGCCMCC SEQ ID NO: 65
  • Vlf7 TCCTCTGAGCTGASTCAGGASCC (SEQ ID NO: 66)
  • V118 CAGTCTGYYCTGAYTCAGCCT (SEQ ID NO: 67)
  • VHrl CATTGAGGAGACRGTGACCAGGGTG (SEQ ID NO: 69)
  • VHr2 CATTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT (SEQ ID NO: 70)
  • VHr3 CATTGAAGAGACGGTGACCATTGT (SEQ ID NO: 71)
  • VHr4 CATTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC SEQ ID NO: 72
  • VHr5 CATGGTTGGGGCGGATGCACTCC SEQ ID NO: 73
  • VHr6 CATSGATGGGCCCTTGGTGGARGC SEQ ID NO: 74
  • VKrl TTTGATTTCCACCTTGGTCC (; SEQ ID NO: 75;)
  • VKr2 TTTGATCTCCASCTTGGTCC (SEQ ID NO: 76)
  • VKr3 TTGATATCCACTTTGGTCC (SEQ ID NO: 77)
  • VKr4 TTTAATCTCCAGTCGTGTCC (SEQ ID NO: 78)
  • Vlrl TAGGACGGTSASCTTGGTCC (SEQ ID NO: 79)
  • Vlr2 GAGGACGGTCAGCTGGGTGC (SEQ ID NO: 80)
  • Vk (FWR) f2 ATCAATWGNSTGSARSCTGARGAT SEQ ID NO: 84
  • Vk (FWR) rl ATCYTCAGSYTSCASNCWRCTGAT SEQ ID NO: 91
  • the reaction mixture (50 ⁇ 1) contained 0.5 ⁇ 1 cDNA solution, 25 pmol each of reverse primer and forward primer, 200 ⁇ M dNTP, lOmM KC1, lOmM (NH) SO, 20 mM Tris—HC1 (
  • PCR conditions were optimized for each primer set.
  • the first PCR product purified by agarose gel electrophoresis was mixed in the same amount as the first round as a template when amplifying the immunoglobulin variable region in the next PCR.
  • the obtained variable region DNA fragment was purified, cleaved with an appropriate restriction enzyme, and inserted into a vector ( P VH-Hyg or pVL-Amp). After ligation, these phagemid DNAs were introduced into the E. coli DH10B strain carrying the F 'plasmid derived from E.
  • coli XL1-Blue by electoporation, and 1% dalcose and hygromycin (50 ⁇ g / ml) or Colonies were cultured at 30 ° C on agar plates containing ampicillin (50 ⁇ g / ml). Colonies were picked and phages with VH gene or VL gene were formed by superinfection with ⁇ helper phage M13K07 at 30 ° C in 2 X YT medium containing 1% glucose. Phages were recovered by centrifugation and polyethylene glycol (PEG) precipitation according to standard protocols.
  • PEG polyethylene glycol
  • the E. coli XLl—Blue strain-derived F ′ plasmid was introduced into the E. coli NS3529 strain that constitutively expresses Cre-recombinase to produce the E. coli NS3529 / F ′ strain.
  • Cre / lox recombination moved the VH fragment force to the vector pVL-Amp in the SNS3529 / F 'cell to form the scFv gene.
  • Cultivated Bacterial Strength The obtained recombinant phage was infected with the XLl-Blue strain in culture at MOI ⁇ 0.1 and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. From bacteria cultured at 25 ° C in 2 X YT medium (without glucose) containing 20 ⁇ g / ml chloramphee-col, 50 ⁇ g / ml ampicillin, and 25 ⁇ g / ml kanamycin. An scFv-displaying phage fused with the coat protein g3p was obtained. Phage concentrated by PEG precipitation was suspended in SM buffer containing 1% gelatin and 6% DMSO and stored at ⁇ 80 ° C.
  • the library performed the banning operation four times.
  • 96 uel plates 50 and 16 uels was coated with Man3-DPPE (2 ⁇ g / well) and used for the first and second bunning, respectively.
  • 5 and 2 wells were coated with Man3-DPPE (2 ⁇ g / well) and used for the third and fourth bunning, respectively.
  • Phage selection has been reported (Marks, JD, Hoogenboom, HR, Bonnet, TP, McCafferty, J., Griffiths, AD, and Winter, G. (19 91) J. Mol. Biol. 222, 581- 597 ) Was partially improved.
  • the eluted phages were infected with 100 ⁇ l of E. coli TGI strain in logarithmic growth phase at 37 ° C. for 1 hour.
  • Infected E. coli was cultured on LB agar plate (medium) (diameter 10 cm) containing ImM NaOH, 0.1% glucose and carbecillin (50 ⁇ g / ml) at 25 ° C for 16 hours, 2 ml per plate Of LB-10 mM Tris-HCl (pH 7.5) (SBS) was collected from the plate using a spreader. Of the 38 ml of this suspension, 1 ml was inoculated into 40 ml of SBS containing carbecillin and cultured at 37 ° C.
  • helperphage 40 1 (3.5 X 10 9 pfo.) And incubating at 37 ° C for 1 hour without stirring, at 37 ° C for 1 hour, kanamycin (25 ⁇ g / ml) Z chloram -Cole (10 ⁇ g / ml) was added and the mixture was incubated for 40 hours at 25 ° C with swirling to collect the phages. Phage particles were concentrated by PEG precipitation, and TBS 400 ⁇ 1, 3% BSA / TBS 400 ⁇ 1, and 10% Tween 20 / TBS 40 ml were added and incubated at 37 ° C. for 1 hour for dissolution.
  • the binding of phage to Man3-DPPE was analyzed by ELISA using bacterial supernatant containing the phage.
  • a 96-well plate was coated with Man3-DPPE (1 ⁇ g / well) according to the above method, and 3% BSA / TBS 150 ⁇ 1 was added, followed by incubation at 4 ° C for blocking.
  • Control plates were prepared by the above method without antigen. Phage suspension 75 1 was added to the well and incubated at 37 ° C for 1 hour. The well was washed 5 times with 200 ⁇ 1 TBS-T.
  • Peroxidase activity is ABTS / H 0
  • the reaction was allowed to react with 2 2 for 30 minutes, and the reaction was stopped with 1% oxalic acid. Thereafter, the absorbance at 415 nm was measured with a plate reader of BIO-RAD.
  • the scFv gene from each colony of E.coli TGI strain infected with the phage was expressed as a primer set (forward primer Cm—f: 5′—TGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCT—3 ′ (SEQ ID NO: 97), reverse primer g3-r: 5, -Amplified by PCR using GCTAAACAACTTTCAACAGTCTAT GCGGCAC-3 '(SEQ ID NO: 98)).
  • forward primer Cm—f 5′—TGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCT—3 ′ (SEQ ID NO: 97)
  • reverse primer g3-r 5, -Amplified by PCR using GCTAAACAACTTTCAACAGTCTAT GCGGCAC-3 '(SEQ ID NO: 98)
  • scFv DNA sequence of the obtained scFv gene was determined.
  • scFv The DNA sequence was determined using a 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystem, Foster City, Calif.).
  • Phage antibody binding to artificial glycolipids was performed using HRP-labeled anti-mouse IgG (MBL, Nagoya, Japan) and chemiluminescence reagent (ECL TM Western Plot detection reagent, Amersham Biosciences, UK, Buckinghamshire) Both were detected according to the manufacturer's instructions.
  • Fetuin, cashew fetuin, RNase A, and RNase (5 ⁇ g / lane) were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (10% gel) and blotted onto a PVDF membrane.
  • the SDS-PAGE gel was stained with Kumashi brilliant blue. According to the above method, the reactivity of the phage antibody to the natural glycoprotein was examined by Western plotting using the phage antibody M3-7 and HRP-labeled anti-M13 phage antibody.
  • Each isolated phage clone was infected with E. coli TO P10F ′ strain having a chaperone Z repressor vector.
  • TO P10F 'cells infected with M3-7 or control anti-FLAG phage were treated with 50 ⁇ g / ml ampicillin, 50 ⁇ g / ml spectinomycin, ImM isopropyl-thio 13-D-galactopyranoside (IPTG) Cultured in 200 ml of 2X YT medium containing 3 hours at 30 ° C. The supernatant of the TOP10F 'cells, the periplasmic fraction, and the whole cell extract were collected by differential centrifugation.
  • the total cell extract collected from 40 ml of the culture solution is 6M guanidine hydrochloride, 5% It was placed in 1 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 8) containing serol, 0.5 mM PMSF and O.lmM DTT, and left on ice for 1 hour to dissolve. After centrifugation (18,800 g, 30 minutes), the supernatant was dialyzed against 10 mM HEPES (pH 7.4) containing 150 mM NaCl. After removing the precipitate by centrifugation, the supernatant was analyzed by SDS-PAGEZ Western blotting.
  • the total protein amount of 18 g / lane was separated by SDS-PAGE (4-20% acrylamide gel) (Daiichi Chemicals, Tokyo, Japan) under reducing conditions, and then transferred to a PVDF membrane. After blocking with 3% BSA / PBS, the expressed scFv protein was detected with an HRP-labeled anti-E-tag antibody (Amersham Bioscience, Japan). This scFv protein sample was used for SPR analysis.
  • the scFv protein was prepared by the following method and used to examine the specificity for various BSA-linked oligosaccharides.
  • TOP10F'-FS2 cells are infected with Man3-specific phage, and 5% SBS containing 1% dalcose, 50 ⁇ g / ml carbesilin, 50 ⁇ g / ml spectinomycin at 25 ° C for 16 hours Cultured. Next, the infected cells were collected by centrifugation, suspended, and cultured in 40 ml of SBS containing carbenicillin and spectinomycin at 30 ° C for 3 hours.
  • ELISA plates were coated with 50 ⁇ l of BSA-conjugated oligosaccharide (10 ⁇ l / ml) under conditions of 4 ° C. and 16 hours.
  • the culture supernatant 50 1 / well was transferred to this well and allowed to stand at 37 ° C for 2 hours.
  • the scFv protein binding to the oligosaccharide was measured using an HRP-labeled anti-E-tag antibody according to the method described above.
  • the surface was washed by injecting 40 mM MEGA9 (Dojinshi, Kumamoto, Japan) and 50% ethanol at a flow rate of 51 / min. Thereafter, DPPC or Man3-DPPE / DPPC (1:10, molar ratio) was injected onto the sensor chip surface at a flow rate of 2 ⁇ l / min. In order to remove the multilamellar structure from the lipid surface, 5 ⁇ l of 10 mM NaOH was injected at a flow rate of 5 ⁇ l / min. A sample of phage antibody dialyzed with HBS was injected at a flow rate of 51 / min onto the chip surface for 10 minutes.
  • HBS HBS-T
  • Tween 20 0.01% Tween 20
  • the activation buffer (1M NaCl containing 50 mM NaOH) was injected three times in a row for 1 minute to activate the SA sensor chip surface.
  • Glucose-sp-Biotin, Man3-sp-Biotin, Lewis b-sp-Biotin (O.lmM) is diluted with HBS-T to 0.05 M, of which 101 is flow rate until 100-150 RU. Injected manually in minutes.
  • these ligands have a spacer (sp) consisting of 0 (CH) NHCO (CH) NH
  • the amounts of immobilized piotinylated sugar chains were estimated to be 0.25 pmol, 0.23 pmol, and 0.13 pmol, respectively.
  • the scFv sample dialyzed with HBS-T was injected onto the chip surface for 4 minutes at a flow rate of 1 ⁇ l / min.
  • the surface of the sensor chip was regenerated by treating it with 10 mM glycine hydrochloride (pHl.5) for 1 minute, and then washed with HBS-T at a constant flow rate before injecting the next sample.
  • the phage-displayed human scFv library was banned against Man3-DPPE four times.
  • the structure of Man3-DPPE is shown in Fig. 1B.
  • banning was performed using Man3-DPPE (2 g / well).
  • 25 positive clones encoding scFv were selected as potential candidates for phage antibodies against the Man3 structure.
  • Table 1 shows the characteristics of the 12 clones.
  • Phage antibody M3-7 has the ability to bind to RNase B, which has a high mannose-type oligosaccharide. It does not bind to RNase A, which has no sugar chain, or fetuine, which has a complex-type oligosaccharide and a 0-linked oligosaccharide. This was clearly shown (Figure 3).
  • the binding rate of the phage antibody was analyzed by SPR. From the sensorgram showing the binding of phage M3-7 to Man3-DPPE (the sensorgram obtained by subtracting the binding of only DPPE from the binding of phage antibody to Man3-DPPE) The binding was confirmed ( Figure 4; sensorgram A). The results show that (i) phage antibody binding was competitively inhibited by mannose (sensorgram C) or a-methyl-D-mannosides, and (ii) human IGF-I receptor-specific scFv Show it! / The control phage antibody is M The ability to bind to an3-DPPE (Sensorgram B) is also supported.
  • the scFv protein was expressed as a soluble protein and analyzed for its sugar chain specificity. Immunoblotting analysis using anti-E-tag antibody was performed after SDS-PAGE, and the contents of scFv protein in the supernatant, periplasmic fraction, and whole cell extract were compared. As a result, it became clear that most of the expressed scFv protein was contained in the fraction of the whole cell extract. Therefore, ELISA and SPR analysis were performed using whole cell extract fractions ( Figure 5). The fraction used was unpurified (Figure 5 left) but contained E-tag reactive scFv protein ( Figure 5 right). The amount of sc Fv protein expressed in E.
  • the scFv protein sample (Fig. 5) was analyzed by SPR using an artificial glycolipid with a fixed binding rate of the Man3-specific scFv protein (Fig. 7).
  • the scFv protein derived from phage clone M3-7 showed that the relative binding rates for Man3-DPPE and Man5-DPPE were equivalent and exceeded that for DPPE.
  • the binding rate for Man2-DPPE was smaller than that for DPPE (Fig. 7).
  • an antibody recognizing a non-reduced mannose residue and a nucleic acid encoding the antibody are provided.
  • the antibody of the present invention can specifically bind with high affinity to various sugar chains including sugar chain antigens that cannot be recognized by individuals.
  • an improved single chain antibody can be produced by genetic manipulation of the single chain antibody of the present invention, and mass production of the single chain antibody is easy.
  • sugar chain-specific delivery of proteins such as toxins and enzymes can be performed by genetic manipulation of the antibodies obtained in the present invention.
  • FIG. 1 shows the synthesis of artificial glycolipid (A) and Man3-DPPE (B). Reductive amination of artificial glycolipids from oligosaccharides such as Manl, Man2, Man3, Man5, GN2, LNT, FG, and GN2Man3 (see Figure 2C for structural formula) and dipalmitoylphosphatidylethanolamine (DPPE) was synthesized.
  • A artificial glycolipid
  • B Man3-DPPE
  • FIG. 2 shows the sugar chain specificity of fuzzy antibodies screened by Banning using Man3-DPPE and ELISA.
  • A Various artificial glycolipids were dot-blotted on TLC plates, and each plate was overlaid with anti-Man3 phage antibody M3-7 or M3-8, and then fuzzy was detected.
  • B The artificial glycolipid used in this experiment is shown.
  • FIG. 3 shows the binding of phage antibodies to natural glycoproteins.
  • the reactivity of the phage antibody M3-7 to natural glycoproteins was examined by Western blotting. The protein band was stained with Kumashi Brilliant Blue. Western plotting using phage antibody M3-7 and HRP-labeled anti-M13 phage antibody! The phage antibody binds! I identified a band.
  • FIG. 4 shows SPR analysis of a Man3-specific scFv-displayed phage antibody. SPR analysis of phage antibody M 3-7 (A) was performed using Man3-DPPE.
  • Anti-IGF-1 receptor scFv phage was used as a negative control (B).
  • a competitive inhibition experiment was performed using phage antibody M3-7 in the presence of lOOmM mannose (C). This is a sensorgram for specific binding to Man3.
  • the sensorgram for DPPE was subtracted from the sensorgram for specific Man3-DPPE.
  • FIG. 5 shows the expression of Man3-specific scFv as a soluble protein.
  • Left SDS-PAGE of scFv protein (M3-7) expressed in E. coli TOP10F 'strain and anti-FLAG scFv protein as a control. The gel was stained with Coomassie brilliant blue.
  • FIG. 6 shows the binding of scFv protein to Man3-BSA (examined by ELISA method).
  • scFv proteins (M3-7 and M3-8) were analyzed by ELISA. The reactivity of each scFv protein to BSA (a), Manl-BSA (b), Man3-BSA (c), and BSA (d) without scFv protein was determined.
  • FIG. 7 shows SPR analysis of Man3-specific scFv protein using Man2-DPPE, Man3-DPPE, or Man5-DPPE immobilized chip.
  • FIG. 8 shows SPR analysis of Man3-specific scFv protein using a chip to which Man3-sp-biotin, Lewis b-sp-biotin, or glucose-sp-biotin is bound.
  • the bold line is Man3-s b- sp-biotin, glucose-sp- biotin.
  • FIG. 9 shows a comparison of the specific binding of scFv protein to the Man3 moiety.
  • a comparison was made between two scFv protein sensorgrams for Man3-DPPE ( Figure 7) and Man3-biotin ( Figure 8). Specific binding was also determined by subtracting the sensorgram for each sensorgram force as well as DPPE ( Figure 9A) or Glucose-biotin ( Figure 9B).

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Abstract

　本発明の目的は、非還元マンノース残基を認識する抗体を提供することである。本発明によれば、マンノトリオースとジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとの還元アミノ化反応で合成した人工糖脂質であるMan3-DPPEを抗原として用いてヒトscFvを提示するファージ提示型ライブラリーをスクリーニングによって得られる、非還元マンノース残基を認識する抗体が提供される。

Description

非還元マンノース残基を認識するファージ提示型単鎖抗体 技術分野
[0001] 本発明は、非還元マンノース残基を認識するファージ提示型単鎖抗体に関する。よ り詳細には、本発明は、ファージ提示型抗体ライブラリーのスクリーニングによって得 られる非還元マンノース残基を認識する単鎖抗体に関する。
背景技術
[0002] 糖類で免疫すると IgMの一次応答が誘発されることが多 、ことは広く知られて 、るが 、糖類の多くは自己抗原であるので応答が見られない場合もある（非特許文献 1及び 2)。ファージディスプレイ法は自己抗原に対する抗体を産生できるので、糖鎖部分に 対する抗体を産生するための最適な方法であると考えられる。各種の糖鎖部分に対 するモノクローナル抗体を産生する際、ハイプリドーマによる従来の手法は有効では ないことが既に証明されていることから、糖鎖に対する高い特異性と親和性を有する 抗体フラグメントを、ファージディスプレイ法により単離できる可能性が注目を集めて いる。ファージディスプレイ法はタンパク質に対する抗体を産生するために主に用い られてきたが、糖鎖抗原にはほとんど利用されたことがない。プラスチックプレート上 に糖鎖抗原を固定ィ匕することは困難なので、タンパク質抗原で一般的に用いられる 方法を糖鎖抗原にそのまま適用することはできない。既報の研究では、糖タンパク質 、ヘテロダリカン、 BSA結合糖鎖を抗原として用いて、ファージディスプレイ法により抗 糖鎖単鎖抗体 (scFv)を作製して ヽる (非特許文献 1及び 3〜7)。現在までに作製さ れた抗糖鎖抗体の大部分は、モノクローナル抗体の場合は IgMクラスであり、 scFvの 場合であっても低親和性であったので、これらの抗体は in vivoの診断法や治療法に は適さない。こ糖鎖抗原に対する低親和性は、糖鎖自体が持つ性質である可能性が 最も高いので、これを克服するのは容易ではない可能性がある。抗体価を高めること によって抗糖鎖抗体の低!、親和性を向上させる試みがなされてきた (非特許文献 7 〜10)。多価の scFvでは糖鎖部分に対する親和性が高まることが示されている（非特 許文献 9〜10)。 [0003] 非特許文献 1 : Deng, S" MacKenzie, C.R., Sadowaka, J" Michniewicz, J" Young, N. M., Bundle, D.R., and Narang, S.A. (1994) J. Biol. Chem. 269, 9533-9538.
非特許文献 2 : MacKenzie, C.R., Hirama. T" Deng, S" Bundle, D.R., Narang, S.A" and Young, N.M. (1996) J. Biol. Chem. 271, 1527-1533.
非特許文献 3 : Babino, A" Pritsch,〇., Oppezzo, P., Du Pasquier, R.， Roseto, A" O sinaga, E., and Alzari, P.M. (1997) Hybridoma 16, 317—324.
特許文献 4 :van Kuppevelt, T.H., Dennissen, M.A.B.A., van Venrooij, W.J., Hoet , R.M.A., and Veerkamp, J.H. (1998) J. Biol. Chem. 273, 12960-12966.
非特許文献 5 : Mao, S., Gao, C, Lo, C.-H. L., Wirsching, P., Wong, C.-H., and Ja nda K.D. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6953-6958.
非特許文献 6 : Lee, K.J., Mao. S., Sun, C, Gao, C, Blixt, O., Arrues, S., Horn. L.G ., Kauftnann, G.F., Hoffinan, T.Z., Coyle, A.R., Paulson, J., Felding— Habermann, B. , and Janda, K.D. (2002) J. Am. Chem. Soc. 124, 12439-12446.
非特許文献 7 : Ravn, P., Danielczyk, A., Jensen, K.B., Kristensen, P., Christensen, P.A., Larsen, M., Karsten, U., and Goletz, S. (2004) J. Mol. Biol. 343, 985—996 非特許文献 8 : Deng, S., MacKenzie, C.R., Hirama, T., Brousseau, R., Lowary, T.L. , Young, N.M., Bundle, D.R., and Narang, S.A. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9 2, 4992-4996.
非特許文献 9 : MacKenzie, R. and To, R. (1998) J. Immunol. Mothods 220, 39-49. 非特許文献 10 : Zhang, J., Tanha, J., Hirama, T" To, N.H.K.R., Tong- Sevinc, H" S tone, E., Brisson, J.-R., and MacKenzie, C.R. (2004) J. Mol. Biol. 345, 49-56. 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、非還元マンノース残基を認識する抗体、並びに当該抗体をコードする 核酸を提供することを解決すべき課題とした。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らはファージディスプレイ法を改良し、人工糖脂質（Stoll, M. S., Mizuochi , T., Childs, R. A" and Feizi, T. (1988) J. Biochem. 256, 661— 665 ; Kenjo, A" Takah ashi, M., Matsushita, M., Endo, Y., Nakata, M., Mizuochi, T., and Fujita, T. (2001) J. Biol. Chem. 276, 19959— 19965 ;及び Shimizu, Y.， Nakata, M., Matsunuma, J" and
Mizuochi, T. (2001) J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 754, 127— 133)を抗原とし て用いてヒト scFvを作製した。脂質アンカーを介して可溶性糖鎖抗原をプラスチック 製タイタープレート上に固定化し、ノ ユングと ELISA法でのスクリーニングによって各 糖鎖抗原に対する有望なファージ抗体を単離することが可能である。本発明は、上 記目的を達成するために、 30種類以上の人工糖脂質を合成した。
[0006] 本発明者らは、各種糖鎖部分に対する一群の scFvを作製する方法を確立するため に、 1011種類以上のヒト scFvを提示するファージ提示型ライブラリー（Sblattero, D. and
Bradbury, A. (2000) Nat. Biotechnol. 18, 76-80)のスクリーニングを行った。本発明 では、マンノトリオース（Man3)とジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン（DPPE )から既報の還元アミノ化反応（Stoll, M. S., Mizuochi, T.， Childs, R. A., and Feizi, T . (1988) J. Biochem. 256, 661-665 ; Kenjo, A" Takahashi, M., Matsushita, M., Endo,
Y" Nakata, M., Mizuochi, T" and Fujita, T. (2001) J. Biol. Chem. 276, 19959-199 65 ;及び Shimizu, Y., Nakata, M., Matsunuma, J" and Mizuochi, T. (2001) J. Chrom atogr. B. Biomed. Sci. Appl. 754, 127-133)に従って合成した人工糖脂質である Man 3-DPPEをモデル抗原として用いた。 TLC- overlay法と表面プラズモン共鳴法による 陽性ファージクローンの解析から、非還元末端にマンノース残基を持つ人工糖脂質 にこれらのファージ抗体クローンが結合することが明らかになった。また、ファージ抗 体は高マンノース型オリゴ糖を持つ RNase Bには結合した力 複合型オリゴ糖と 0-結 合型オリゴ糖を持つフェツインには結合しな力つた。さらに、各ファージが産生する sc Fvの 1回目の解析では、非還元マンノース残基に対して高い親和性と特異性を有す ることも示された。従って、各種糖鎖抗原に対するヒト scFvの作製においては、ファー ジディスプレイ法が有効であることが示された。
[0007] 即ち、本発明によれば、以下の（1)から（14)の何れかに記載の抗体が提供される
(1)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配 列又は配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配 列として、配列表の配列番号 4に記載のアミノ酸配列又は配列番号 4に記載のァミノ 酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配 列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(2)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配 列又は配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配 列として、配列表の配列番号 8に記載のアミノ酸配列又は配列番号 8に記載のァミノ 酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配 列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(3)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 10に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 10に記載のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 12に記載のアミノ酸配列又は配列番号 12に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(4)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 14に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 14に記載のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 16に記載のアミノ酸配列又は配列番号 16に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(5)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 18に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 18に記載のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 20に記載のアミノ酸配列又は配列番号 20に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。 (6)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 22に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 22に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 24に記載のアミノ酸配列又は配列番号 24に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(7)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 26に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 26に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 28に記載のアミノ酸配列又は配列番号 28に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(8)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 30に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 30に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 32に記載のアミノ酸配列又は配列番号 32に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(9)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 34に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 34に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 36に記載のアミノ酸配列又は配列番号 36に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(10)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 38に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 38に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 40に記載のアミノ酸配列又は配列番号 40に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(11)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 42に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 42に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 44に記載のアミノ酸配列又は配列番号 44に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(12)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 46に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 46に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 48に記載のアミノ酸配列又は配列番号 48に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の抗体をコードする核酸が提供され る。
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかの核酸が提供される。
(1)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 3に記載の塩 基配列を含む核酸；
(2)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 7に記載の塩 基配列を含む核酸；
(3)配列表の配列番号 9に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 11に記載の塩 基配列を含む核酸；
(4)配列表の配列番号 13に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 15に記載の 塩基配列を含む核酸；
(5)配列表の配列番号 17に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 19に記載の 塩基配列を含む核酸；
(6)配列表の配列番号 21に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 23に記載の 塩基配列を含む核酸；
(7)配列表の配列番号 25に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 27に記載の 塩基配列を含む核酸；
(8)配列表の配列番号 29に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 31に記載の 塩基配列を含む核酸；
(9)配列表の配列番号 33に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 35に記載の 塩基配列を含む核酸；
(10)配列表の配列番号 37に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 39に記載 の塩基配列を含む核酸；
(11)配列表の配列番号 41に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 43に記載 の塩基配列を含む核酸；及び
(12)配列表の配列番号 45に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 47に記載 の塩基配列を含む核酸；
[0009] 本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の核酸を用いた抗体の生産方 法が提供される。
[0010] 本発明のさらに別の側面によれば、上記方法によって得ることができる、非還元マ ンノース残基を認識する組換え抗体が提供される。好ましくは、抗体は 1本鎖抗体で ある。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 以下、本発明の実施の形態についてより具体的に説明する。
本発明の抗体は、非還元マンノース残基を認識する抗体である。以下の実施例に 記載した通り本発明の抗体は、マンノトリオース (Man3)とジパルミトイルホスファチジ ルエタノールァミン (DPPE)力 還元アミノ化反応で合成した人工糖脂質である Man3 -DPPEをモデル抗原として用いて、ヒト scFvのファージ提示型ライブラリーのスクリー ユングすることによって取得されたものである。陽性ファージクローンを TLC- overlay 法と表面プラズモン共鳴法で解析した結果、本発明の抗体は、非還元末端にマンノ ース残基を持つ人工糖脂質に結合することが実証された。
[0012] 本発明でスクリーニングの際に抗原として用いる糖脂質としては、非還元末端にマ ンノース残基を持つ人工糖脂質であれば特に限定されな 、が、オリゴ糖が好ま 、。
[0013] オリゴ糖中で、各構成糖は、 a 1→2結合、 a 1→3結合、 a 1→4結合、 a 1→6結 合または j8 1→4結合等あるいはこれらの組み合わせにより結合したものである。例え ば、マンノースは上記の結合により直鎖を構成してもよぐ又は α 1→3結合、 a 1→6 結合との組み合わせにより分岐構造をとつてもよい。オリゴ糖中の単糖の数は、好ま しくは 2から 11個である。
[0014] 具体的なオリゴ糖として、例えばマンノビオース（Man2)、マンノトリオース（Man3)、 マンノテトラオース（Man4)、マンノペンタオース（Man5)、マンノへキサオース（Man 6)、マンノヘプタオース（Man7)などを挙げることができる。
[0015] これらのオリゴ糖は、還元末端アルデヒド基を有する。そこで、このアルデヒド基を、 オリゴ糖を固定ィ匕するための手段として使用することができる。すなわち、このアルデ ヒド基とアミノ基を有する脂質との間に反応によりシッフ塩基を形成し、次にこのシッフ 塩基を常法に従って還元、好ましくは化学還元、例えば NaBH CN
3 によりオリゴ糖と 脂質とを結合することができる。
[0016] 上記のアミノ基を有する脂質は、好ましくはアミノ基を有するリン脂質であり、例えば ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン（DPPE)、ジステアロイルホスファチジ ルエタノールァミン (DSPE)等を使用することができる。上記のようにして得られたォ リゴ糖と脂質との結合物を本発明にお ヽては人工糖脂質と称する場合がある。本発 明で用いる糖脂質は、上記したような人工糖脂質が好ま U、。
[0017] 抗原となる人工糖脂質を溶解する溶剤は特に限定しないが、クロ口ホルム Zメタノ ール Z水（10 : 10 : 3、体積比）に溶解後、さらにメタノールで、例えば gZmlに 希釈することが望ましい。この溶液を、例えば 96ゥエルプラスチックプレート（平底）に 加えて風乾させ、人工糖脂質をゥエルに固定ィ匕させる。このゥエルをブロッキングし、 洗浄する。力かる操作で人工糖脂質をコートしたプレートを、抗原コートプレートとし て用いることができる。
[0018] 緩衝液にはトリス緩衝生理食塩水（以下、 TBSという）を用いることが望ましい。また、 ブロッキング用溶液としては例えば 3%ゥシ血清アルブミンを含む TBS (以下、 3%B SAZTBSという）力 洗浄溶液としては例えば 0. 2%Tween20を含む TBS (以下、 TBS— Tという）が望ましい。
[0019] ファージ提示型抗体は、公知の方法により作製することができる（Marks JDほか、 J. Mol. Biol. 222卷 581— 597頁、 1991年； Nissim ま力 EMBO J. 13卷 6 92— 698頁、 1994年;高柳淳'奥井理予 ·清水信義、超レパートリー人工抗体ライブ ラリ、出願番号 特願 2001— 358602 (国際公開番号 WO03Z04419号)）。
[0020] ファージ提示型抗体ライブラリ一は、繊維状ファージのコートタンパク質に抗体を融 合させること〖こより、ファージの表面上に抗体を提示（ディスプレイ）するシステムを応 用したものである。具体的には、抗体遺伝子を PCRで増幅して多種類の抗体遺伝子 を含むライブラリーを作製し、これをファージ上に提示させることによってファージディ スプレイライブラリーとすることができる。以下に、ファージ提示型単鎖抗体の作製方 法の具体例を示すが、これに限定されるものではな 、。
[0021] ヒト末梢血および脾臓 cDNAライブラリーを铸型としてィムノグロブリン遺伝子の VH 又は VL領域の CDR1及び CDR2領域を含む断片と、 CDR3領域を含む断片とをそ れぞれ PCR法により増幅する。それらを混合し铸型として、 PCR法により VH又は VL 領域を増幅する。増幅したこれらの DNA断片をそれぞれ非発現型ファージミドベクタ 一に組込み、 VHライブラリーと VLライブラリーを作製する。これらの大腸菌 VHライ ブラリーと VLライブラリーに、ヘルパーファージを感染させ、ファージライブラリーに 変換する。これらファージ型 VHおよび VLライブラリーを Cre組換え酵素を発現する 大腸菌に共感染させ、大腸菌内で VH'VLベクター間で組換え反応を行う。この大 腸菌に M13K07ヘルパーファージを感染させ、完全長一本鎖抗体を発現するファ ージを生成させることができる。これらのファージに混入している非組換え体を取り除 くため、このファージを多重感染が起こらないように大腸菌に感染させ、さらにへルパ 一ファージを重感染させ、アンピシリン'カナマシン ·クロラムフエ-コールを含みグル コースを含まな 、培地で 25°Cで培養する。これにより上清中に組換え一本鎖抗体を 発現するファージを得ることができる。上清中のファージをポリエチレングリコールで 沈殿し、再懸濁し、 10の 11乗以上のレパートリーを有する人工抗体ライブラリーを得 ることがでさる。
[0022] さらに目的の糖結合性を有するファージ提示型抗体は、上記方法により作製したヒ ト型一本鎖ファージライブラリーから、当該糖鎖構造を有する人工糖脂質に対する結 合能を指標にして選択的に回収することができる。この操作をバニングと称する場合 がある。
[0023] バニングを繰り返して得られたファージ提示型抗体の糖結合性を解析する方法とし ては、例えば以下に述べる ELISA法を応用して解析すること力 多数のファージクロ ーン試料について同時解析できる上で望ましい。すなわち、 96ゥエルプラスチックプ レートに糖鎖を固定ィ匕し、ファージ提示型抗体の非特異的吸着をなくすため、例えば 3%BSAを含む緩衝液でブロッキングする。これに、緩衝液で適切な濃度に調製し たファージ提示型抗体の懸濁液を加え、十分に反応させた後（例えば、 37°Cで 2時 間）、緩衝液で洗浄する。
[0024] 糖鎖に結合したファージ提示型抗体を検出 ·定量するため、検出に適切な物質で 標識されている抗ファージ抗体の水溶液を反応させ、緩衝液で洗浄後、標識物質の 検出に最適な手法で検出'定量する。このとき、抗ファージ抗体の標識物質は特に 制限されないが、例えば、西洋ヮサビペルォキシダーゼでの標識力 簡便さの点で 望ましい。また、検出に用いる検出器も特に制限されないが、例えば ELISAに適し たプレートリーダーを用いることが望ましい。
[0025] 本発明でいう抗体とは、通常生体内に存在する形の抗体の他に、抗体の H鎖もしく は L鎖の可変領域もしくはその組み合わせで形成される抗原結合部位を少なくとも 1 つ含むペプチド、 1組の H鎖断片と L鎖断片力もなる Fab、 2組の H鎖断片と L鎖断片か らなる F(ab')、 H鎖断片と L鎖断片が同一ペプチドに直列に結合した一本鎖抗体 (以
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下「scFv」ということもある）なども含まれる。本発明の抗体は、全長 H鎖と全長 L鎖の 2 対の組み合わせから構成される、通常生体内に存在する形の全長抗体でもよい。
[0026] なお、本発明における F (ab')及び Fabとは、ィムノグロブリンを、蛋白分解酵素で
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あるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の 2本 の H鎖間に存在するジスルフイド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメン トを意味する。例えば、 IgGlをパパインで処理すると、ヒンジ領域中の 2本の H鎖間 に存在するジスルフイド結合の上流で切断されて VL (L鎖可変領域）とじし (L鎖定常 領域)力 なる L鎖、及び VH (H鎖可変領域)と CH y 1 (H鎖定常領域中の γ 1領域） とからなる H鎖フラグメントが C末端領域でジスルフイド結合により結合した相同な 2つ の抗体フラグメントを製造することができる。これら 2つの相同な抗体フラグメントを各 々 Fab'という。また IgGをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の 2本の H鎖間に存在 するジスルフイド結合の下流で切断されて前記 2つの Fab'がヒンジ領域でつながった ものよりやや大き!/、抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントを F (ab')という。
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[0027] 通常の抗体は大小二種類のポリペプチドからなり、大きい方のサブユニットを「1" [鎖」
(重鎖）、小さい方のサブユニットを「L鎖」（軽鎖）という。また、それぞれのペプチドは N末端側に存在して抗原結合部位を形成する「可変領域」と抗体のクラス別に一定の 「定常領域」から構成されている。可変領域はさらに特に抗原結合部位の形成に密 接に関与して 、る相補性決定領域「CDR」とその間に存在する「フレームワーク」に分 けられる。 CDRには H鎖と L鎖のそれぞれについて N末端側から「CDR1」、 「CDR2」、 「 CDR3Jと呼ばれる 3つの領域があることが知られて!/、る。
[0028] 本発明の一本鎖抗体は、 pSE380プラスミド (インビトロジヱン社）や pET24d(+)プラス ミド (ノバジェン社)などの誘導性のベクターと宿主となる菌体を適宜選択することによ つて調製することができる。また、本発明の抗体の生産においては、上述の方法の他 、動物細胞発現系、昆虫細胞発現系、酵母細胞発現系を用いることもできる。 H鎖お よび L鎖を結合するリンカ一も当業者であれば適宜選択することができる。
[0029] 配列表の配列番号 1から 48には、以下に示す通り、本発明の抗体の重鎖と軽鎖の 塩基配列とアミノ酸配列を示した。これらのアミノ酸配列において、糖脂質の非還元 マンノース残基を認識する抗体が得られる限りは、 1もしくは数個（好ましくは 1〜8個 、より好ましくは 1〜5個、さらに好ましくは 1〜3個程度）のアミノ酸が欠失、置換もしく は付加されたアミノ酸配列を含むものも本発明の範囲に含まれる。下記の配列表に 示す塩基配列を有する核酸は、本明細書の実施例に記載した手法により取得しても よいし、あるいは DNA合成装置を用いて化学的に合成することもできる。また、下記 の配列表に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは 付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列にっ 、ても、 PCRなどを含む通常の遺 伝子組み換え技術、又は DNA合成装置を用いたィ匕学合成により当業者であれば容 易に取得することができる。
配列番号 1：抗体 M3— 2の重鎖の可変領域の塩基配列 配列番号 2：抗体 M3— 2の重鎖の可変領域のアミノ酸配列 配列番号 3：抗体 M3— 2の軽鎖の可変領域の塩基配列 配列番号 4：抗体 M3— 2の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列 配列番号 5：抗体 M3— 4の重鎖の可変領域の塩基配列 配列番号 6 :抗体 M3— 4の重鎖の可変領域のアミノ酸配列 配列番号 7：抗体 M3— 4の軽鎖の可変領域の塩基配列 配列番号 8：抗体 M3— 4の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列 配列番号 9：抗体 M3— 5の重鎖の可変領域の塩基配列 配列番号 10：抗体 M3— 5の重鎖の可変領域のアミノ酸配列 配列番号 11：抗体 M3— 5の軽鎖の可変領域の塩基配列 配列番号 12：抗体 M3— 5の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列 配列番号 13：抗体 M3— 6の重鎖の可変領域の塩基配列 配列番号 14：抗体 M3— 6の重鎖の可変領域のアミノ酸配列 配列番号 15：抗体 M3— 6の軽鎖の可変領域の塩基配列 配列番号 16：抗体 M3— 6の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列 配列番号 17：抗体 M3— 7の重鎖の可変領域の塩基配列 配列番号 18：抗体 M3— 7の重鎖の可変領域のアミノ酸配列 配列番号 19：抗体 M3— 7の軽鎖の可変領域の塩基配列 配列番号 20：抗体 M3— 7の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列 配列番号 21：抗体 M3— 8の重鎖の可変領域の塩基配列 配列番号 22：抗体 M3— 8の重鎖の可変領域のアミノ酸配列 配列番号 23：抗体 M3— 8の軽鎖の可変領域の塩基配列 配列番号 24：抗体 M3— 8の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列 配列番号 25：抗体 M3— 9の重鎖の可変領域の塩基配列 配列番号 26：抗体 M3— 9の重鎖の可変領域のアミノ酸配列 配列番号 27：抗体 M3— 9の軽鎖の可変領域の塩基配列 配列番号 28 抗体 M3 - 9の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
[0037] 配列番号 29 抗体 M3 - 10の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号 30 抗体 M3 - 10の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号 31 抗体 M3 - 10の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号 32 抗体 M3 - 10の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
[0038] 配列番号 33 抗体 M3 - 11の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号 34 抗体 M3 - 11の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号 35 抗体 M3 - 11の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号 36 抗体 M3 - 11の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
[0039] 配列番号 37 抗体 M3 - 12の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号 38 抗体 M3 - 12の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号 39 抗体 M3 - 12の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号 40 抗体 M3 - 12の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
[0040] 配列番号 41 抗体 M3 - 13の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号 42 抗体 M3 - 13の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号 43 抗体 M3 - 13の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号 44 抗体 M3 - 13の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
[0041] 配列番号 45 抗体 M3 - 14の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号 46 抗体 M3 - 14の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号 47 抗体 M3 - 14の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号 48 抗体 M3 - 14の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
[0042] さらに、 scFvから通常生体内にある形の抗体を作製することが可能である。一例を 挙げると、 scFvのプラスミドから H鎖および L鎖の可変領域部分のみを PCR法にて増 幅する。それぞれの断片は、例えば、ヒトの抗体の H鎖遺伝子及び/または L鎖遺伝 子を有するプラスミドに組み換えて、上記 scFv上にある可変領域を持つ通常生体内 にある形の抗体にすることが可能である。具体的には、例えば、プラスミドから H鎖お よび L鎖の可変領域を増幅するとき得られる遺伝子断片の両端に、適当な制限酵素 切断部位を入れてぉ 、て、ヒト抗体の H鎖及び/または L鎖を有するプラスミド上の適 当な制限酵素切断部位と組み合わせて、フレームシフトが起こらな 、ように可変領域 の遺伝子を入れ替える。このような方法によりプラスミド上にあった可変領域の配列を そのまま持つ通常生体内にある形の抗体を作ることは可能である。この抗体からさら に、抗体の H鎖もしくは L鎖の可変領域もしくはその組み合わせで形成される抗原結 合部位を少なくとも 1つ含むペプチド、 1組の H鎖断片と L鎖断片力 なる Fab、 2組の H 鎖断片と L鎖断片力もなる (Fab'2)を作ることも可能である。
[0043] 本発明の抗体の発現には、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等を用いることが できる。例えば、 COS細胞や CHO細胞にて抗体を発現させるときには pCDNA3.1(+) や pMAMneo (CLONETECH社)等を使用することが可能である。例えば、上記の手 法で取得した抗体の H鎖の遺伝子を pCDNA3.1(+)のマルチクロー-ングサイトに、 L 鎖の遺伝子を pMAMneoにそれぞれ組み込む。その上で H鎖の組み込まれたベクタ 一の適当なサイトにプロモーターと polyAの間に L鎖の遺伝子がある発現ユニットを組 み込む。このベクターを COS細胞や CHO- Kl、または CHO DG44に遺伝子工学の定 法にて導入することにより目的の抗体の生産を行うことができる。さらに、上記作製し たベクターに例えば pSV2/DHFR(Nature,1981.Vol.294,Lee F. et al.，)から DHFR遺伝 子の発現ユニットを切り出し、 H鎖と L鎖を発現するベクターに組み込む。このべクタ 一を CHO DG44に遺伝子工学の定法にて遺伝子導入する。これにより選択した細胞 は MTXを用 、た DHFR遺伝子増幅系を使用することにより抗体の生産性を大幅に上 昇させることが可會である。
[0044] COS細胞や CHO細胞などの動物細胞は、通常 10%ゥシ胎児血清 (FBS)を加えた Dul becco's Modified Eagle's Medium(DMEM)を用い、 5%CO存在下 37°Cで培養すること
2
ができる。 COS細胞への遺伝子導入法は電気穿孔法の他、 DEAEデキストラン法、 lip ofectin等のトランスフエクシヨン試薬を用いた方法で行うことができる。
[0045] 本発明の抗体の生産時には、血清由来のゥシ抗体の混入を避けるために、無血清 の培地にて培養することが望ましい。無血清培地に馴化していない COSおよび CHO の血清培地で培養して 、る細胞にっ 、ては、血清を入れて!/、な 、DMEMによって培 養することが望ましい。こうして培養上清中に得られた本発明の抗体は、例えばプロ ティン Aカラムやプロテイン Gカラムを用いる一般的な IgG抗体の精製法によって容易 に精製することが可能である。
[0046] 以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する力 本発明は実施例によつ て限定されるものではない。本明細書で使用する略号は次の通りである： Fv、抗体可 変領域； scFv、単鎖抗体可変領域; Ab、抗体; mAb、モノクローナル抗体； BSA、ゥシ 血清アルブミン； IGF、インスリン様増殖因子； Manl、マンノース； Man2、マンノビォー ス（Man α 1— 6Man)； Man3、マンノトリオース [Man α 1—6 (Man α 1—3) Man]； Man5、マ ンノペンタオース [Man a 1—6 (Man a 1—3) Man a 1—6 (Man a 1—3) Man]； GN2Man3、 G lcNAc β l-2Man a 1-6 (GlcNAc β 1- 2Man a 1-3) Man； GN2、ジ- N-ァセチルキトビォ ース（GlcNAc j8 l-4GlcNAc)； FG、 Fuc α 1- 2Gal ; LNT、ラクト -N-テトラオース（Gal j8 1 -3GlcNAc β l-3Gal β l-4Glc)； HRP、西洋ヮサビペルォキシダーゼ
実施例
[0047] (A)材料と方法
(1)材料
Escherichia coli株は、 Invitrogen社（カリフォルニア州、カールズバッド）のサプレツ サー変異株 TG1と非サプレッサー変異株 TOP10F'を使用した。ヘルパーファージ Ml 3K07は Amersham Biotech社（英国）から入手した。ゥシ血清アルブミン（BSA)、フエ ツイン、ァシァ口フェツイン、 RNase A、 RNase B、 DPPE、およびジパルミトイルホスファ チジルコリン（DPPC)は、 Sigma- Aldrich社 (ミズーリ州、セントルイス）から購入した。マ ンノース（Manl)、マンノビオース（Man2 ;Man a 1- 6Man)、マンノトリオース（Man3 ;Ma η α 1-6 (Man 1—3) Man)、マンノぺンタオース (Man5； Man 1—6 (Man 1—3) Man 1-6 (Man a 1-3) Man)、ジ- N-ァセチルキトビオース（GN2； GlcNAc β 1- 4GlcNAc)、ラ クトー N—テトラオース（LNT ; Gal j8 1- 3GlcNAc j8 1- 3Gal j8 1- 4Glc)、 Fuc a 1- 2Gal (F G)、 GlcNAc β l-2Man a 1-6 (GlcNAc β 1- 2Man a 1-3) Man (GN2Man3)、 Manl-BSA 、および Man3- BSAは、 Dextra Laboratories社（英国、レディング）から入手した。 Glue ose— sp— Biotin、 Man3— sp— Biotin、 Lewis b— sp— Biotini 、 GlycoTech千土、メリ ~~フン r 'J、卜 I 、ゲイサーズバーグ）から入手した。 ABTS/H 0は Roche Diagnostics社（ドイツ、マン
2 2
ハイム)から入手した。酒石酸は和光純薬（日本、大阪)から入手した。抗 M13抗体は Amersham Biosciences社ニュ^ ~ンャ^ ~、ン' ~州、ヒスカタウェイ)と Exhalpha Biological s社 (マサチューセッツ州、ウォータータウン)力も購入した。抗インスリン様増殖因子- 1 (IGF- 1)受容体 scFvファージ抗体は、 1H7 mAb由来の scFv (Li, S.-L., Liang, S.-J., uuo, N., Wu, A. M., Fujita— Yamaguchi, Y. (2000) Cancer Immunol. Immunother. 49 , 243-252)力ら、 Amersham Bioscience社の Expression Module/Recombinant Phage Antibody Systemを用いて調製した。
[0048] (2)人工糖脂質の調製
人工糖脂質は、糖類（Manl、 Man2、 Man3、 Man5、 GN2、 LNT、 FG、または GN2Man 3)と DPPE力ら、既報の方法（Stoll, M. S., Mizuochi, T., Childs, R. A., and Feizi, T. ( 1988) J. Biochem. 256, 661-665 ; Kenjo, A., Takahashi, M., Matsushita, M., Endo, Y., Nakata, M., Mizuochi, T., and Fujita, T. (2001) J. Biol. Chem. 276, 19959—1996 5 ;及び Shimizu, Y., Nakata, M., Matsunuma, J., and Mizuochi, T. (2001) J. Chromat ogr. B. Biomed. Sci. Appl. 754, 127-133)に従って還元アミノ化反応により合成した。 反応図を図 1Aに示す。各糖類（l〜2mg)を含む水溶液 60 1に DPPE 9.4mgを含むク ロロホルム Zメタノール（1： 1、体積比）溶液 940 μ 1、水素化シァノホウ素ナトリウム 4mg を含むメタノール溶液 200 1をカ卩えて混合した。時々超音波を当てながら 80°Cで 5時 間反応させた。反応混合物中の人工糖脂質は、既報の方法 (Shimizu, Y., Nakata, M ., Matsunuma, J., and Mizuochi, T. (2001) J.し nromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 754 , 127- 133)に従って、シリカゲルカラム Shim- pack PREP- SIL (島津製作所製、 日本、 京都）を用いた HPLCと、カートリッジカラム Bond Elut C18 (Varian社製、カリフオル- ァ州、ハーバーシティ)を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製した。各人工糖脂 質の純度と構造は、 TLCと MALDI-TOF質量分析法で確認した。
[0049] (3)ファージライブラリーの構築
一次ファージライブラリーの構築に使用した cDNA、 PCR增幅、並びに VH及び VL遣 伝子レパートリーのクローニング
PCRの铸型としては、 BioChain社 (カリフォルニア州、ヘイワード）のヒト脾臓 cDNAと BD Biosciences社 (カリフォルニア州、パロアルト）のヒト白血球 cDNAを購入して使用 した。既に発表されている情報に基づいて（Sbalattero, D. & Bradbury, A. (1998) Im munotechnology 3, 271- 278)、この遺伝子ファミリーに共通の配列を有する適切なリ バースプライマーとフォワードプライマーの等モル混合物を用いて、ヒト免疫グロブリ ン可変領域を PCRで増幅した。
5'-プライマー：
VHfl AGCGCGGCCtctagaCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCSG (配列番号 49)
VH12 AGCGCGGCCtctagaCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA (配列番号 50)
VH13 AGCGCGGCCtctagaCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGG (配列番号 51)
VHf4 AGCGCGGCCtctagaGAGGTGCAGCTGKTGGAGWCY (配列番号 52)
VH15 AGCGCGGCCtctagaCAGGTCCAGCTKGTRGAGTCTGG (配列番号 53)
VH16 AGCGCGGCCtctagaCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTG (配列番号 54)
VHf7 AGCGCGGCCtctagaCAGGTGCAGCTGGTGSARTCTGG (配列番号 55)
Vkfl GACATCCRGDTGACCCAGTCTCC (配列番号 56)
Vkf2 GAAATTGTRWTGACRCAGTCTCC (配列番号 57)
Vkf3 GATATTGTGMTGACBCAGWCTCC (配列番号 58)
Vkf4 GAAACGACACTCACGCAGTCTC (配列番号 59)
VIA CAGTCTGTSBTGACGCAGCCGCC (配列番号 60)
V112 TCCTATGWGCTGACWCAGCCAC (配列番号 61)
VU3 TCCTATGAGCTGAYRCAGCYACC (配列番号 62)
Vlf4 CAGCCTGTGCTGACTCARYC (配列番号 63)
V115 CAGDCTGTGGTGACYCAGGAGCC (配列番号 64)
VU6 CAGCCWGKGCTGACTCAGCCMCC (配列番号 65)
Vlf7 TCCTCTGAGCTGASTCAGGASCC (配列番号 66)
V118 CAGTCTGYYCTGAYTCAGCCT (配列番号 67)
V119 AATTTTATGCTGACTCAGCCCC (配列番号 68)
3'-プライマー：
VHrl CATTGAGGAGACRGTGACCAGGGTG (配列番号 69)
VHr2 CATTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT (配列番号 70)
VHr3 CATTGAAGAGACGGTGACCATTGT (配列番号 71)
VHr4 CATTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC (配列番号 72) VHr5 CATGGTTGGGGCGGATGCACTCC (配列番号 73)
VHr6 CATSGATGGGCCCTTGGTGGARGC (配列番号 74)
VKrl TTTGATTTCCACCTTGGTCC (；配列番号 75；)
VKr2 TTTGATCTCCASCTTGGTCC (配列番号 76)
VKr3 TTGATATCCACTTTGGTCC (配列番号 77)
VKr4 TTTAATCTCCAGTCGTGTCC (配列番号 78)
Vlrl TAGGACGGTSASCTTGGTCC (配列番号 79)
Vlr2 GAGGACGGTCAGCTGGGTGC (配列番号 80)
CDRシャッフリング用プライマー
VH(FWR)fl GGACACGGCCGTRTATTACTGT (配列番号 8
VH(FWR)12 GGACAYGGCCATGTATTACTGT (配列番号 82)
Vk(FWR)fl ATCAGYWGNSTGSARSCTGARGAT (配列番号 83)
Vk(FWR)f2 ATCAATWGNSTGSARSCTGARGAT (配列番号 84)
Vl(FWR)fl GAYGAGGCTGACTATTACTGT (配列番号 85)
V1(FWR)12 GATGAATCTGATTATTACTGT (配列番号 86)
V1(FWR)13 GATGAGGCTGAGTATCATTGT (配列番号 87)
Vl(FWR)f4 GATGAGAGTGACTACCACTGT (配列番号 88)
VH(FWR)rl ACAGTAATAYACGGCCGTGTCC (配列番号 89)
VH(FWR)r2 ACAGTAATACATGGCCRTGTCC (配列番号 90)
Vk(FWR)rl ATCYTCAGSYTSCASNCWRCTGAT (配列番号 91)
Vk(FWR)r2 ATCYTCAGSYTSCASNCWATTGAT (配列番号 92)
Vl(FWR)rl ACAGTAATAGTCAGCCTCRTC (配列番号 93)
Vl(FWR)r2 ACAGTAATAATCAGATTCATC (配列番号 94)
Vl(FWR)r3 ACAATGATACTCAGCCTCATC (配列番号 95)
Vl(FWR)r4 ACAGTGGTAGTCACTCTCATC (配列番号 96)
反応混合物（50 μ 1)には、 cDNA溶液 0.5 μ 1、リバースプライマーおよびフォワードプ ライマー各 25pmol、 200 μ M dNTP、 lOmM KC1、 lOmM (NH ) SO、 20mM Tris— HC1 (
4 2 4
pH 8.8)、 2mM MgCl、 100 μ g/ml BSA、および KOD plus DNA polymerase (東洋紡、 日本、大阪） lunitを含む。プライマーセットごとに、 PCR条件を最適化した。ァガロー スゲル電気泳動により精製した 1回目の PCR産物は、次回の PCRで免疫グロブリン可 変領域を増幅する際の铸型として、 1回目と同量で混合した。得られた可変領域の D NA断片を精製して適切な制限酵素で切断した後、ベクター (PVH- Hygまたは pVL-A mp)に挿入した。ライゲーシヨン後、 E. coli XL1- Blue由来 F'プラスミドを持つ E. coli D H10B株にこれらのファージミド DNAをエレクト口ポレーシヨンにより導入し、 1%ダルコ ースとハイグロマイシン（50 μ g/ml)またはアンピシリン（50 μ g/ml)を含む寒天プレー ト上にて 30°Cでコロニーを培養した。コロニーを採取し、 1%グルコースを含む 2 X YT 培地にて 30°Cでー晚ヘルパーファージ M13K07を重感染させることにより、 VH遺伝 子または VL遺伝子を持つファージを形成させた。標準プロトコールに従 、遠心分離 とポリエチレングリコール (PEG)沈殿によりファージを回収した。
[0052] 組み椽ぇ及び二次ファージ scFvライブラリーの作製
E. coli XLl— Blue株由来 F'プラスミドを Cre-リコンビナーゼを構成的に発現してい る E. coli NS3529株に導入して、 E. coli NS3529/F'株を作製した。 VHファージと VLフ ァージを MOI = 50で NS3529/F'に感染させ、攪拌せずに 37°Cで 1時間静置した。その 後、 M13K07ヘルパーファージを MOI = 20で重感染させた。 37°Cで 1時間インキュべ ーシヨンした後、アンピシリンとカナマイシンをそれぞれ 50 μ g/mlと 25 μ g/mlになるよ うに添カ卩した。 37°Cでー晚培養する間に、 Cre/loxの組み換えによって VHフラグメント 力 SNS3529/F'細胞内のベクター pVL-Ampに移動し、 scFv遺伝子を形成させた。培養 した菌力 得られた組み換えファージを培養中の XLl-Blue株に MOI < 0.1で感染さ せ、 37°Cで 1時間静置した。 20 μ g/mlクロラムフエ-コール、 50 μ g/mlアンピシリン、 2 5 μ g/mlカナマイシンを含む 2 X YT培地（グルコース無添加）中にお 、て 25°Cでー晚 培養した菌から、コートタンパク質 g3pと融合した scFv提示ファージが得られた。 PEG 沈殿により濃縮したファージを 1%ゼラチンと 6%DMSOを含む SMバッファーで懸濁し 、 -80°Cで保存した。
[0053] (4)ファージの選別方法
ノ ユング法
ライブラリ一は、バニング操作を 4回行った。 96ゥエルプレートの 50ゥエルと 16ゥエル を Man3-DPPE (2 μ g/ゥエル）でコーティングし、それぞれ 1回目と 2回目のバニングで 使用した。 5ゥエルと 2ゥエルを Man3-DPPE (2 μ g/ゥエル）でコーティングし、それぞれ 3回目と 4回目のバニングで使用した。ファージの選別は既報の方法 (Marks, J.D., H oogenboom, H.R., Bonnet, T.P., McCafferty, J., Griffiths, A.D., and Winter, G. (19 91) J. Mol. Biol. 222, 581- 597)を一部改良して行った。 Man3- DPPEによるゥエルの コーティングを簡単に説明する。ゥエルに Μ&η3-ΟΡΡΕ (40 /ζ g/mlメタノール溶液） 50 1を加えて 37°Cで溶媒を蒸発させた後、 0.15M NaClと 3%BSA (ブロッキング液）を含 む Tris- HC1バッファー（pH7.4) 150 μ 1をカ卩えて 4°Cでー晚インキュベーションした。ゥ エルの洗浄は、 0.2%Tween 20/TBS (TBS- T) 50 μ 1で 2回、 TBS200 μ 1で 1回行った。 0.1%Tween 20と 1.4%BSAを含むファージ懸濁 TBS溶液 50 μ 1をゥエルに加え、攪拌 しながら 37°Cで 60分間インキュベーションした。ゥエルを TBS-T 200 1で 3回、 TBS 20 0 μ 1で 2回洗浄した後、 lOOmMトリェチルァミン 50 μ 1を添カ卩して 25°Cで 10分間インキ ュベーシヨンして、結合したファージを溶出させた。その後、ブロッキング液で処理済 みのコントロール用プレートのゥエル中で中和液（1M Tris-HCl[pH7.4]： 3%BSA/TBS =2:1、体積比） 100 μ 1と混合して中和した。 lOOmMトリェチルァミン 50 μ 1を添カ卩して 25 °Cで 20分間インキュベーションすることによって結合したファージをさらに溶出させ、 上記の方法に従って中和液中に回収した。溶出させたファージは、対数増殖期の E. coli TGI株 100 μ 1に 37°Cで 1時間感染させた。感染した大腸菌は ImM NaOH、 0.1% グルコース、カルべ-シリン (50 μ g/ml)を含む LB寒天プレート（培地）（直径 10cm)に て 25°Cで 16時間培養し、プレート 1枚当たり 2mlの LB- 10mM Tris- HCl (pH7.5) (SBS) をカ卩えた後、スプレッダ一を使ってプレートから回収した。この懸濁液 38mlのうち lml をカルべ-シリンを含む SBS 40mlに植菌し、 37°Cで 2時間攪拌しながら培養した。へ ルパーファージ 40 1 (3.5 X 109pfo.)を添カ卩して 37°Cで 1時間、攪拌せずに 37°Cで 1 時間インキュベーションした後、カナマイシン (25 μ g/ml)Zクロラムフエ-コール (10 μ g/ml)を添加して旋回攪拌しながら 25°Cで 40時間インキュベーションし、ファージを採 取した。 PEG沈殿によりファージ粒子を濃縮し、 TBS 400 μ 1、 3%BSA/TBS 400 μ 1、 1 0%Tween 20/TBS 40mlをカ卩えて 37°Cで 1時間インキュベーションして溶解させた。遠 心分離（18,000g、 4°C、 5分間）後、ファージ懸濁液 800 1を回収し、 2回目のバニング に用いた。 2、 3、 4回目のバニングは、洗浄条件以外は 1回目のパンユングと同様の 方法で行った。 4回目のバニング後の単一コロニー力も採取した菌を、 SBSZカルべ ニシリン 50 μ 1を入れた 96ゥエルプレート中で旋回攪拌しながら 37°Cで 1時間培養した 。ヘルパーファージ 50 1をさらに添カ卩し、旋回攪拌しながら 37°Cで 1時間インキュべ ーシヨンした。 SBSZカナマイシン Zクロラムフエ-コール混合物を 50 μ 1/ゥエルずつ 添加した後、旋回攪拌しながら 25°Cで 16時間インキュベーションし、遠心分離 (200g、 4°C、 15分間）してファージ懸濁液を回収した。 3%BSA/TBS 100 1を入れたゥエルに 上清 50 μ 1を移し、 37°Cで 1時間インキュベーションして 4°Cで保存した。
[0054] Man3-DPPEに対する抗体を発現するファージクローンのスクリーニング（ELISA法)
Man3-DPPEへのファージの結合を、ファージを含む細菌の上清を用いて ELISA法 で解析した。 96ゥエルプレートを上記方法に従って Man3-DPPE (1 μ g/ゥエル）でコー ティングし、 3%BSA/TBS 150 μ 1を加えて 4°Cでー晚インキュベーションしてブロッキ ングした。コントロール用プレートは、抗原なしで上記方法で調製した。ファージ懸濁 液 75 1をゥエルに添カ卩し、 37°Cで 1時間インキュベーションした。ゥエルの洗浄は 200 μ 1の TBS-Tで 5回行った。西洋ヮサビペルォキシダーゼ（HRP)標識抗 Ml 3抗体をカロ えて 37°Cで 1時間インキュベーションした後、 TBS- T 200 μ 1で 10回、 TBS 200 μ 1で 1 回洗浄し、結合したファージ抗体を検出した。ペルォキシダーゼ活性は ABTS/H 0
2 2 と 30分間反応させ、 1%シユウ酸で反応を停止させて検出した。その後、 BIO-RAD社 のプレートリーダーで 415nmの吸光度を測定した。
[0055] (5)ファージ抗体の解析
コロニー PCRと DNA配列の決定
ファージを感染させた E.coli TGI株の各コロニーから scFv遺伝子は、プライマーセ ット（フォワードプライマー Cm— f: 5'— TGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCT— 3 ' (配列番号 97)、リバースプライマー g3- r: 5，- GCTAAACAACTTTCAACAGTCTAT GCGGCAC-3' (配列番号 98) )を使用して PCRで増幅した。 94°Cで 2分間プレヒートし た後、熱変性力 ¾4°Cで 20秒間、アニーリングが 53°Cで 20秒間、伸長反応が 68°Cで 1 分間と 、う条件で 35サイクルの PCRを行った。精製して 2%ァガロースゲル電気泳動 で PCR産物の長さを確認した後、得られた scFv遺伝子の DNA配列を決定した。 scFv の DNA配列は、 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystem社製、カリフォルニア州、フォ スターシティ）を用いて決定した。
[0056] TLCプレート上での結合実験
クロ口ホルム Zメタノール/水（50： 55： 18、体積比）に溶解した人工糖脂質 400pmol を TLCプレート上にドットブロットした。または、アルミニウム製シリカゲル 60高速 TLC プレート (長さ 10cm ; Merck社製、ドイツ、ダルムシュタット）に、人工糖脂質各 1 μ gを 含む混合物をスポットし、クロ口ホルム Zメタノール Z水（60 : 35 : 8、体積比）溶媒で展 開した。これらのプレートは乾燥後、 0.1 % (重量体積比） Plexigum P28 (Sigma- Aldric h社製）を含む n-へキサンに 30秒間浸し、 3%BSA/TBSで室温で 1時間ブロッキングし 、その後、 TBSで洗浄した。次に、プレートを 4°Cでー晚ファージ抗体（1013 cfo/ml)で オーバーレイし、その後、室温で 1時間、マウス抗 M13ファージコートタンパク質 (p8) I gG (5,000倍希釈)でオーバーレイした。人工糖脂質へのファージ抗体の結合は、 HR P標識抗マウス IgG (MBL社製、 日本、名古屋)と化学発光試薬 (ECL™ウェスタンプロ ット検出試薬、 Amersham Biosciences社製、英国、バッキンガムシヤー）の両方を使い 、メーカーの説明書に従って検出した。
[0057] 天然の糖タンパク皙 の ]^件の檢討による、ファージ杭体糖鎖特虽件の決定
フェツイン、ァシァ口フェツイン、 RNase A、および RNase (5 μ g/レーン）を SDS-ポ リアクリルアミドゲル電気泳動（10%ゲル）により分離し、 PVDFメンブレンにブロットし た。 SDS-PAGEゲルはクマシ一ブリリアントブルーで染色した。上記の方法に従い、 天然の糖タンパク質に対するファージ抗体の反応性を、ファージ抗体 M3-7と HRP標 識抗 M13ファージ抗体を用いて、ウェスタンプロット法により検討した。
[0058] scFvタンパク質の発現と部分精製
単離した各ファージクローンを、シャペロン Zリプレッサーベクターを持つ E.coli TO P10F'株に感染させた。 M3-7またはコントロールの抗 FLAGファージを感染させた TO P10F'細胞を、 50 μ g/mlアンピシリン、 50 μ g/mlスぺクチノマイシン、 ImMイソプロピル -チォ 13 -D-ガラクトピラノシド（IPTG)を含む 2 X YT培地 200ml中にて 30°Cで 3時間培 養した。 TOP10F'細胞の上清、ペリブラズム画分、全細胞抽出物を、分画遠心法によ り回収した。培養液 40mlから回収した全細胞抽出物は、 6M塩酸グァ-ジン、 5%ダリ セロール、 0.5mM PMSF及び O.lmM DTTを含む 50mM Tris- HCl (pH 8) 1mlに入れ、 氷上に 1時間放置して可溶ィ匕した。遠心分離（18,800g、 30分間）後、上清を 150mM N aClを含む 10mM HEPES (pH 7.4)で透析した。遠心分離して沈殿を除去した後、上 清を SDS-PAGEZウェスタンブロット法で解析した。還元条件の SDS-PAGE (4〜20% アクリルアミドゲル）（第一化学薬品、 日本、東京)で総タンパク量 18 g/レーンを分 離した後、 PVDFメンブレンに転写した。 3% BSA/PBSでブロッキングした後、発現し た scFvタンパク質を HRP標識抗 E- tag抗体（Amersham Bioscience社製、 日本）で検出 した。この scFvタンパク質サンプルを SPR解析に使用した。
[0059] 合成糖タンパク質への scFvタンパク質の結合（ELISA法)
scFvタンパク質を以下の方法で作製し、各種 BSA結合オリゴ糖に対する特異性の 検討に用いた。 TOP10F'-FS2細胞に Man3特異的ファージを感染させ、 1%ダルコ一 ス、 50 μ g/mlカルべ-シリン、 50 μ g/mlスぺクチノマイシンを含む SBS 5mlにて 25°Cで 16時間培養した。次に、感染させた細胞を遠心分離により回収し、懸濁し、カルべ二 シリンとスぺクチノマイシンを含む SBS 40mlにて 30°Cで 3時間培養した。 ImM IPTGを 添加後、 30°Cで 16時間培養して scFvタンパク質を誘導し、上清を回収した。ニトロセ ルロース上にドットブロット後に、 HRP標識抗 E-tag抗体を添カ卩して、 scFvタンパク質の 発現を確認した。
[0060] ELISAプレートは、 4°C、 16時間の条件のもと、 BSA結合オリゴ糖（10 μ 1/ml) 50 μ 1で コーティングした。培養液の上清 (50 1/ゥエル)をこのゥエルに移し、 37°Cで 2時間放 置した。オリゴ糖への scFvタンパク質の結合は、上記の方法に従い、 HRP標識抗 E-ta g抗体を用いて測定した。
[0061] ファージ抗体と scFvタンパク質の解析（表面プラズモン共鳴法、 SPR)
SPR解析は 25°Cで行った。溶液は新しく調製し、脱気して孔サイズ 0.22 mのフィル ターで濾過した。 BIAcore X (Pharmacia Biosensor社製）を用いた SPRにより、ファージ 抗体の結合特性を決定した。この解析では、金膜表面に脂肪族鎖を共有結合させた HPAセンサーチップと、泳動バッファ一として 150mM NaClを含む 10mM HEPES (pH7. 4) (HBS)を用いた。 HPAセンサーチップ表面への人工糖脂質の固定ィ匕は、メーカー のプロトコールに従って行った。人工糖脂質被覆リボソームを添加し、糖鎖を表面に 提示している脂質単分子膜を HPAセンサーチップ上に形成させた。固定化する前に 、非イオン性界面活性剤である 40mM MEGA9 (同仁ィ匕学、 日本、熊本）と 50%ェタノ ールを流速 5 1/分で注入して表面を洗浄した。その後、 DPPCまたは Man3-DPPE/ DPPC (1： 10、モル比）を流速 2 μ 1/分でセンサーチップ表面に注入した。脂質表面か ら多重膜構造を除去するため、 10 mM NaOH 5 μ 1を流速 5 μ 1/分で注入した。 HBSで 透析したファージ抗体のサンプルを流速 5 1/分でチップ表面に 10分間注入した。 SP Rでの競合的阻害作用を検討するため、ファージ抗体サンプルを 10mMまたは lOOmM の D-マンノース、あるいは α -メチル- D-マンノピラノシド（ナカライテスタ、 日本、京都 )と混合した後、 4°Cで 1時間インキュベーションした。
[0062] HPAセンサーチップまたは SA (ストレプトアビジン）センサーチップを用いて、 scFvタ ンパク質サンプルの SPR解析を流速 5 μ 1/分で BIAcore 3000により行った。 DPPC、 Ma n3— DPPE/DPPC (1： 10、モル比）、 Man2— DPPE/DPPC (1： 10、モル比）、 Man5— DPPE /DPPC (1： 10、モル比）は、上記の方法に従って HPAセンサーチップに固定化した。 脂質膜に含まれる DPPE結合体のモル比を基に固定化リガンド量を算出したところ、 D PPCゝ Man2— DPPEゝ Man3— DPPEゝ Man5— DPPEがそれぞれ 0.43pmol、 0.31pmol、 0.48 pmol、 0.30pmol含まれていた。 SAセンサーチップを使用する場合は、 0.01% Tween 20を含む HBS (HBS-T)を泳動バッファ一として用いた。ピオチン化リガンド固定ィ匕の 前に、活性化バッファー（50mM NaOHを含む 1M NaCl)を 1分間ずつ計 3回連続して 注入し、 SAセンサーチップ表面を活性化した。 Glucose- sp-Biotin、 Man3- sp- Biotin、 Lewis b-sp-Biotin (O.lmM)を HBS- Tで希釈して 0.05 Mとし、そのうち 10 1を 100〜 150 RUとなるまで流速 1 1/分で手動で注入した。先に用いた人工糖脂質とは異なり 、これらのリガンドには 0 (CH ) NHCO (CH ) NHという構造からなるスぺーサー（sp)
2 3 2 5
が含まれる。固定化されたピオチン化糖鎖の量はそれぞれ 0.25pmol、 0.23pmol、 0.13 pmolであると推定された。 HBS-Tで透析した scFvサンプルを流速 1 μ 1/分で 4分間チ ップ表面に注入した。 1サンプルの測定が終了したらセンサーチップの表面を 10mM 塩酸グリシン (pHl.5)で 1分間処理して再生し、その後、次のサンプルを注入する前 に一定流速の HBS-Tで洗浄した。
[0063] (B)結果 (l)Man3-DPPEに対する scFv提示ファージのスクリーニング
ファージ提示型ヒト scFvライブラリーには、 Man3-DPPEに対するバニングを 4回行つ た。 Man3-DPPEの構造を図 1Bに示す。上記した方法に従い、 Man3- DPPE (2 g/ゥ エル）を用いてバニングを行った。 Man3- DPPE(1 μ g/ゥエル）を抗原として ELISA法で スクリーニングした 672クローン中、 40クローン以上で S/N比が 2を上回り、 ELISA陽性 を示した。その中から、 scFvをコードしている 25個の陽性クローンを Man3構造に対す るファージ抗体の有力候補として選択した。これらのファージクローンの scFv領域の D NA配列を決定したところ、解析したクローン全てで配列が異なっていた。 12クローン の特徴を表 1に記す。
[表 1] 表 1 ： Man3特異的単鎖抗体
ク π ― VH鎖 CDR3領域の配列 v„
ン ファミリ ファミリ
M3-2 DISKAHDY νΗπ VKIII
M3-4 GGGKEVTVLGLPVGWDYYGMDI νΗιν VKI
M3-5 0RWSNFDY νΗπ VKIII
M3-6 SGLYGTTPSTFDH VHIV 1I
M3-7 ADPGYMIFNWFDP ν„ιν ΥλΙ
AIKADSGFYLLDV vHi Υλϊ
M3-9 DWLGSGSTDQ vHin V/ IV
M3-10 QFQEHTISANEQPEDGHGSVL v„in V/cIV
M3-11 DY PRSFDH vHn VII
M3-12 NAPPYTHYFDQ VHIII VKIV
M3-13 DTGTYAMSGMDV v„in V/cI
M3-14 DAGNRGSYDWFDP ν,,ιν VcI [0065] (2)ファージクローンの糖鎖特異性
使用した抗原に対する特異性と高親和性を有するファージ抗体を迅速に識別する ためには、ファージ抗体としての scFv提示ファージ解析に適した方法を確立すること が必要である。最終的には scFvタンパク質の発現、単離および解析が必要となるが、 scFvタンパク質の発現と単離には手間と時間を要するので、詳細な解析に使用する 有望なクローンを選択するためには、ファージクローンに関する基礎的な情報が不可 欠であろう。この目的のために、一群の人工糖脂質を TLCプレート上に個別にスポッ トし（図 2A)、その後、ファージ抗体をプレートにオーバーレイして人工糖脂質と結合 させた。この実験から、ファージ抗体は、 Man3に対して特異性を有しているだけでな く、 Man3ほどではないものの Man2と Man5に対しても特異性を有していることが示され た（図 2A)。また、 GN2Man3と DPPEへの結合は観察されなかったので、検討したファ ージ抗体は人工糖脂質の脂質部分ではなぐ非還元マンノース残基に結合して 、る ことが示された。この実験で使用した人工糖脂質の構造を図 2Bに示す。
[0066] (3)天然の糖タンパク質へのファージ抗体の結合
Man3_DPPEを標的抗原として単離したファージ抗体は、人工糖脂質の非還元マン ノース残基に対する特異性を有することが示された。そこで、これらのファージ抗体に おける糖タンパク質の非還元マンノース残基への結合能を検討した。ファージ抗体 M 3-7は高マンノース型オリゴ糖を持つ RNase Bには結合する力 糖鎖を持たない RNas e Aや複合型オリゴ糖と 0-結合型オリゴ糖を持つフェツインには結合しなカゝつたことが 明確に示された（図 3)。
[0067] (4) Man3特異的 scFv提示ファージ抗体の SPR解析
ファージ抗体の Man3に対する特異性を ELISA法と TLC-overlay法で確認した後、 S PRによりファージ抗体の結合速度を解析した。ファージ M3-7の Man3-DPPEへの結 合を示すセンサーグラム（Man3-DPPEへのファージ抗体の結合から、 DPPEのみへの 結合を差し引 、たセンサーグラム)より、検討したファージ抗体の Man3に対する結合 性を確認した（図 4 ;センサーグラム A)。この結果は、（i)ファージ抗体の結合がマンノ ース (センサーグラム C)または a -メチル -D-マンノシドによって競合的に阻害された こと、 (ii)ヒト IGF-I受容体特異的 scFvを提示して!/、るコントロールのファージ抗体が M an3-DPPEに結合しなかった（センサーグラム B)こと力 も裏付けられる。
[0068] (5)可溶性タンパク質としての Man3特異的 scFvの発現と解析
scFvタンパク質を可溶性タンパク質として発現させ、その糖鎖特異性にっ ヽて解析 した。 SDS-PAGE後に抗 E-tag抗体を用いたィムノブロット解析を行い、上清、ペリブラ ズム画分、全細胞抽出物での scFvタンパク質の含有量を比較した。その結果、発現 した scFvタンパク質の大部分は、全細胞抽出物の画分に含まれることが明ら力となつ た。そこで、 ELISA法と SPR解析は全細胞抽出物の画分を用いて行った（図 5)。使用 した画分は未精製であつたが（図 5左）、 E-tag反応性の scFvタンパク質が含まれてい た（図 5右)。この実験と同様の条件下でファージ感染させた E. coli細胞で発現した sc Fvタンパク質量も、これと類似の範囲であると考えられる（図 5右)。 scFvタンパク質 M3 -7および M3-8のマンノース残基への結合能は、合成糖タンパク質を用いて ELISA法 で確認した（図 6)。
[0069] (6)可溶性タンパク質としての Man3特異的 scFvの SPR解析
scFvタンパク質サンプル（図 5)を用いて、 Man3特異的 scFvタンパク質の結合速度 を固定ィ匕した人工糖脂質を用いた SPRにより解析した（図 7)。その結果、ファージクロ ーン M3-7由来の scFvタンパク質では、 Man3-DPPEおよび Man5-DPPEに対する相対 的結合速度は同等であり、 DPPEに対する同速度を上回ることが示された。一方、 Ma n2-DPPEに対する結合速度は DPPEに対する同速度よりも小さ力つた（図 7)。
[0070] ビォチン化糖鎖の SPR解析も行った。 Man3- sp- biotin、 Lewis b- sp- biotin、および gl ucose-sp-biotinへの scFvタンパク質サンプルの結合速度から、 scFvタンパク質 M3-7 は、構造的に無関連な Lewis b (Lewis bへの scFvタンパク質 M3-7の親和性は、非常 に低 、が有意である）よりも Man3とははるかに高 、親和性で結合した（図 8)。一方、 コントロールとして用いたグルコースには、これらの scFvタンパク質は結合しないと考 えられた。抗 FLAG scFvタンパク質のセンサーグラムは、コントロールとみなすべきで ある。
[0071] Man3-DPPE (図 7)と Man3-biotinへの（図 8)への scFvタンパク質の結合のセンサー グラムから、 DPPE (図 9A)と glucose-biotin (図 9B)のセンサーグラムをそれぞれ差し 引き、 Man3に対する特異的結合をこれら 2種類の方法での結果により比較した（図 9) 。検討した scFvタンパク質間での相対的親和性に関して、このデータが示すことがい くつかある。例えば、 M3-7から得た scFvタンパク質は、 Man3構造に親和性を有する。 産業上の利用可能性
[0072] 本発明によれば、非還元マンノース残基を認識する抗体、並びに該抗体をコード する核酸が提供される。本発明の抗体は、個体が認識できない糖鎖抗原を含む各種 糖鎖に特異的かつ高親和性で結合することができる。さらに本発明の単鎖抗体を遺 伝子操作することにより、改良型の単鎖抗体を作製することも可能であり、単鎖抗体 の量産も容易である。また、本発明で得られた抗体の遺伝子操作によりトキシンゃ酵 素などのタンパク質の糖鎖特異的デリバリーも可能である。
図面の簡単な説明
[0073] [図 1]図 1は、人工糖脂質 (A)と Man3-DPPE (B)の合成を示す。 Manl、 Man2、 Man3、 Man5、 GN2、 LNT、 FG、および GN2Man3などのオリゴ糖 (構造式は図 2Cを参照）とジ パルミトイルホスファチジルエタノールァミン（DPPE)から、還元アミノ化反応により人 工糖脂質を合成した。
[図 2]図 2は、 Man3-DPPEを用いたバニングと ELISA法によりスクリーニングした、ファ ージ抗体の糖鎖特異性を示す。 (A) TLCプレート上に各種人工糖脂質をドットブロッ トし、各プレートを抗 Man3ファージ抗体 M3-7、または M3-8をオーバーレイした後、フ ァージを検出した。（B)この実験で用いた人工糖脂質を示す。 Manl、マンノース; Ma n2、マンノビオース（Man a 1— 6Man)； Man3、マンノトリオース [Man a 1—6 (Man a 1—3) Man]； Man5、マンノぺンタオース [Man a 1—6 (Man a 1—3) Man a 1—6 (Man a 1—3) Man ]； GN2Man3、 GlcNAc β 1- 2Man a 1-6 (GlcNAc β 1- 2Man a 1-3) Man； GN2、ジ- N-ァ セチルキトビォース（GlcNAc J8 1-4GlcNAc)； FG、 Fuc a l-2Gal； LNT、ラクト -N-テト ラオース（Gal β l-3GlcNAc β 1- 3Gal β 1- 4Glc)
[図 3]図 3は、天然の糖タンパク質へのファージ抗体の結合を示す。天然の糖タンパ ク質（フェツイン、ァシァ口フェツイン、 RNase A、および RNase B)に対するファージ抗 体 M3-7の反応性をウェスタンブロット法により検討した。タンパク質のバンドはクマシ 一ブリリアントブルーで染色した。ファージ抗体 M3- 7と HRP標識抗 M13ファージ抗体 を用いたウェスタンプロットを行！、、ファージ抗体が結合して！/、るバンドを同定した。 [図 4]図 4は、 Man3特異的 scFv提示ファージ抗体の SPR解析を示す。ファージ抗体 M 3-7 (A)の SPR解析を Man3- DPPEを用いて行った。抗 IGF- 1受容体 scFvファージを陰 性コントロールとして用いた（B)。 lOOmMマンノースの存在下、ファージ抗体 M3-7を 用いて競合阻害実験を行った (C)。これは Man3に対する特異的結合に関するセン サーグラムである。特異的な Man3-DPPEに関するセンサーグラムから、 DPPEに関す るセンサーグラムを差し引 、て求めた。
[図 5]図 5は、可溶性タンパク質としての Man3特異的 scFvの発現を示す。左： E. coli T OP10F'株で発現させた scFvタンパク質（M3- 7)と、コントロールである抗 FLAG scFv タンパク質の SDS-PAGEを行った。ゲルはクマシ一ブリリアントブルーで染色した。右 ：抗 E- tag抗体を用いて scFvタンパク質のウェスタンブロットを行った。
[図 6]図 6は、 Man3-BSAへの scFvタンパク質の結合を示す（ELISA法で検討)。 scFv タンパク質（M3- 7、および M3- 8)を ELISA法で解析した。 BSA(a)、 Manl- BSA(b)、 M an3-BSA (c)、および scFvタンパク質を含まない BSA (d)に対する各 scFvタンパク質の 反応性を決定した。
[図 7]図 7は、 Man2- DPPE、 Man3- DPPE、または Man5-DPPE固定化チップを用いた、 Man3特異的 scFvタンパク質の SPR解析を示す。
[図 8]図 8は、 Man3- sp- biotin、 Lewis b- sp- biotin、または glucose- sp- biotinを結合さ せたチップを用いた、 Man3特異的 scFvタンパク質の SPR解析を示す。太線は Man3-s
Figure imgf000030_0001
b— sp— biotinを し、糸田線 ίま glucose— sp— biotin 不す。
[図 9]図 9は、 Man3部分に対する scFvタンパク質の特異的結合の比較を示す。 Man3- DPPE (図 7)と Man3-biotin (図 8)とに対する、 2種類の scFvタンパク質センサーグラム 間で比較した。特異的結合は、それぞれのセンサーグラム力も DPPE (図 9A)または G lucose-biotin (図 9B)に対するセンサーグラムを差し引くことにより求めた。

Claims

請求の範囲 以下の（1)から（14)の何れかに記載の抗体。
(1)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配 列又は配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配 列として、配列表の配列番号 4に記載のアミノ酸配列又は配列番号 4に記載のァミノ 酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配 列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(2)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配 列又は配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配 列として、配列表の配列番号 8に記載のアミノ酸配列又は配列番号 8に記載のァミノ 酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配 列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(3)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 10に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 10に記載のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 12に記載のアミノ酸配列又は配列番号 12に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(4)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 14に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 14に記載のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 16に記載のアミノ酸配列又は配列番号 16に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(5)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 18に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 18に記載のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 20に記載のアミノ酸配列又は配列番号 20に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(6)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 22に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 22に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 24に記載のアミノ酸配列又は配列番号 24に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(7)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 26に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 26に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 28に記載のアミノ酸配列又は配列番号 28に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(8)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 30に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 30に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 32に記載のアミノ酸配列又は配列番号 32に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(9)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 34に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 34に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 36に記載のアミノ酸配列又は配列番号 36に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。 (10)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 38に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 38に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 40に記載のアミノ酸配列又は配列番号 40に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(11)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 42に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 42に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 44に記載のアミノ酸配列又は配列番号 44に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
(12)重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号 46に記載のアミノ酸 配列又は配列表の配列番号 46に記載のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸 配列として、配列表の配列番号 48に記載のアミノ酸配列又は配列番号 48に記載の アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
[2] 請求項 1に記載の抗体をコードする核酸。
[3] 以下の何れかの核酸。
(1)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 3に記載の塩 基配列を含む核酸；
(2)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 7に記載の塩 基配列を含む核酸；
(3)配列表の配列番号 9に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 11に記載の塩 基配列を含む核酸；
(4)配列表の配列番号 13に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 15に記載の 塩基配列を含む核酸； (5)配列表の配列番号 17に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 19に記載の 塩基配列を含む核酸；
(6)配列表の配列番号 21に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 23に記載の 塩基配列を含む核酸；
(7)配列表の配列番号 25に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 27に記載の 塩基配列を含む核酸；
(8)配列表の配列番号 29に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 31に記載の 塩基配列を含む核酸；
(9)配列表の配列番号 33に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 35に記載の 塩基配列を含む核酸；
(10)配列表の配列番号 37に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 39に記載 の塩基配列を含む核酸；
(11)配列表の配列番号 41に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 43に記載 の塩基配列を含む核酸；及び
(12)配列表の配列番号 45に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号 47に記載 の塩基配列を含む核酸；
[4] 請求項 3に記載の核酸を用いた抗体の生産方法。
[5] 請求項 4に記載の方法によって得ることができる、非還元マンノース残基を認識する 組換え抗体。
[6] 抗体が 1本鎖抗体である請求項 5に記載の組換え抗体。
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