WO2007114239A1 - DGKα阻害剤を含有する抗癌剤 - Google Patents

DGKα阻害剤を含有する抗癌剤 Download PDF

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Fumio Sakane
Kenji Yanagisawa
Hideo Kanoh
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to an anticancer agent, particularly a therapeutic agent for melanoma. More specifically, the present invention relates to a method for inducing apoptosis of cancer cells such as melanoma and an apoptosis inducer.
  • melanoma is known to have the highest malignancy and high mortality among all cancers.
  • NF nuclear factor
  • - ⁇ B is always activated along with breast cancer, colon cancer, spleen cancer and ovarian cancer.
  • Ivanov VN Ivanov VN, et al, Oncogene. 2003; 22: 3152-3161: Soengas MS, and Lowe SW. Oncogen e. 2003; 22: 3138-3151.
  • NF- ⁇ B is one of the apoptosis inhibitors, this increase in activity results in reduced effectiveness of chemotherapy. Therefore, there is currently no very effective chemotherapy for melanoma, and in principle the treatment relies on surgical excision.
  • TNF-a Tumor necrosis factor-a
  • its receptor activity are key apoptotic pathways that ultimately activate caspase-8 to cause cell death (Morgan M, et al., J Cell Biol. 2002; 157: 975- 984),-, but after activation of TNF- ⁇ receptor, activation of NF- ⁇ B occurs and is also known to exhibit an anti-apoptotic effect (Chen G, et al, Science. 2002; 296: 1634-1635). Therefore, in the signal transduction system after TNF- ⁇ receptor activation, TNF-a-dependent cell death is controlled by the balance between apoptosis and anti-apoptotic signals!
  • NF- ⁇ B was originally identified as a transcription factor specific for B cells that binds to the DNA sequence GGGG ACTTTCC (SEQ ID NO: 1) present in the ⁇ enhancer of immunoglobulins.
  • SEQ ID NO: 1 DNA sequence GGGG ACTTTCC
  • NF- ⁇ B is a homo- or heterodimer formed by molecular forces such as p65 (RelA) and p50 (NF-K Bl) belonging to the Rel family, and is an inhibitor in unstimulated cells. It is inactivated by forming a complex with the I ⁇ B molecule in the cytoplasm and blocking its nuclear translocation (Baldwin AS. J Clin Invest. 200 1; 107: 241-246).
  • Various stimuli including TNF- ⁇ phosphorylate ⁇ B.
  • I ⁇ B is degraded by the proteasome, and NF- ⁇ is translocated to the nucleus and is thought to regulate the expression of various genes. It has been.
  • NF- ⁇ B has been shown to be associated with cell apoptosis and canceration, and has attracted attention from medical aspects such as immune function, inflammation and viral infection, and its role in onset (Ivanov VN, et al , Oncogene. 2003; 22: 3152-3161; Baeuerle PA, and Henkel TF Annu Rev Immunol. 1994; 12: 141-179; Verma IM, et al., Genes Dev. 1995; 9: 2723-2735).
  • Diacylglycerol kinase is an enzyme that phosphorylates diacylglycerol to produce phosphatidic acid.
  • the substrate diacylglycerol has already been established as an activator of conventional protein kinase C and nobel protein kinase C.
  • protein kinase C chimaerin, Unc-1 3
  • Ras Ras It is known to bind to and activate the CI (zinc finger) domain of guar nucleotide releasing proteins (Hurley JH, et al "Protein Sci. 1997; 6: 477-480; Kazanietz MG. Mol Pharmacol.
  • reaction product phosphatidic acid has also been reported to regulate the activity of various signal transduction enzymes, including phosphatidylinositol 5 kinase N Raf-1 (English D. Cell Signal. 1996; 8: 341-347; Exton JH. Biochim Biophys Acta. 1994; 1212: 26-4 2).
  • DGK is not present in unicellular yeast, and only a few limited isoforms have been found in relatively simple multicellular organisms such as nematodes and fruit flies. . Therefore, many of the DGK isoforms are thought to be involved in the unique functions of multicellular organisms such as cell carcinogenesis, development 'differentiation, immune system, and nervous system construction.
  • type I DGK has two EF-node motifs (with Ca 2+ binding ability) in the molecule.
  • Sakane F et al., J Biol Chem. 1991; 266: 7096-7100
  • Sakane F et al., Nature. 1990; 344: 345-348
  • Yamada K et al "Biochem J. 1997; 321: 59 -64
  • type I isozymes research on DGK o; is the most advanced, and several physiological functions have recently been revealed (Kanoh H, et al "J Biochem.
  • this lysozyme suppresses the release of Fas ligand by inhibiting carbachol-induced apoptosis in T lymphocytes expressing muscarinic receptors by experiments using non-specific DGK inhibitors (R59949) and overexpression systems. (Alonso R, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 28439-28450).
  • Non-patent literature l Amiri KI, and Richmond A. Cancer Metastasis Rev. 2005; 24:
  • Non-Patent Document 2 Ivanov VN, et al, Oncogene. 2003; 22: 3152-3161
  • Non-Patent Document 3 Soengas MS, and Lowe SW. Oncogene. 2003; 22: 3138-3151
  • Non-Patent Document 4 Morgan M, et al., J Cell Biol. 2002; 157: 975-984
  • Non-Patent Document 5 Chen G, et al., Science. 2002; 296: 1634-1635
  • Non-Patent Document 6 Baeuerle PA, and Henkel T. F. Annu Rev Immunol. 1994; 12
  • Non-Patent Document 7 Verma IM, et al., Genes Dev. 1995; 9: 2723-2735
  • Non-Patent Document 8 Baldwin AS. J Clin Invest. 2001; 107: 241-246
  • Non-Patent Document 9 Hurley JH, et al "Protein Sci. 1997; 6: 477-480
  • Non-Patent Document 10 Kazanietz MG. Mol Pharmacol. 2002; 61: 759-767
  • Non-Patent Document 11 English D. Cell Signal. 1996; 8: 341-347
  • Non-patent document 12 Exton JH. Biochim Biophys Acta. 1994; 1212: 26-42
  • Non-patent document 13 Imai S, et al "J Biol Chem. 2005; 280: 39870-39881
  • Non-patent document 14 Kanoh H, et al., J Biochem. 2002; 131: 629-633
  • Non-Patent Document 15 Sakane F, and Kanoh H. Int J Biochem Cell Biol. 1997; 29:
  • Non-Patent Document 16 Topham MK, and Prescott SM. J Biol Chem. 1999; 274: 11 447-11450
  • Non-Patent Document 17 van Blitterswijk WJ, and Houssa B. Chem Phys Lipids. 1999;
  • Non-patent literature 18 Ito T, et al., J Biol Chem. 2004; 279: 23317-23326
  • Non-patent literature 19 Sakane F, et al "J Biol Chem. 1991; 266: 7096-7100
  • Non-Patent Document 20 Sakane F, et al., Nature. 1990; 344: 345-348
  • Non-Patent Document 21 Yamada K, et al, Biochem J. 1997; 321: 59-64
  • Non-patent literature 22 Alonso R, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 28439-28450
  • Non-patent literature 23 Cutrupi S, et al, EMBO J. 2000; 19: 4614-4622
  • Non-Patent Document 24 Outram SV, et al., Immunology. 2002; 105: 391-398 Disclosure of the Invention
  • the present invention provides a therapeutic agent and a therapeutic method for melanoma and other cancers, particularly a cancer cell apoptosis inducer, and a method for screening candidate substances for such therapeutic agents.
  • the purpose is to do.
  • the present inventor found that the ⁇ -isozyme of DGK is expressed in all examined melanoma cells, but not detected in non-cancerous melanocytes. It was also clarified that apoptosis of melanoma cells induced by DGKa force TNF-a is suppressed and that its control is performed via the NF- ⁇ pathway.
  • the present invention provides an anticancer agent containing a DGKa inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a cancer cell apoptosis-inducing agent comprising a DGKa inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides an apoptosis inducer for melanoma cells, which contains a DGKa inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides an inhibitor of NF- ⁇ B expression comprising a DGKa inhibitor as an active ingredient.
  • the DGKa inhibitor is an anti-DGKa antibody, an antisense oligonucleotide against the DGKa gene, a ribozyme and siRNA, and 3- [2- [4- [bis- (4-fluorophenol- L) methylene]-1-piberidyl-l] ethyl] -2,3-dihydro-2-thioxo-4 (1H) quinazolinone (R59949) and 6- [2- [4-[(4-fluorophenyl) phenyl] Methylene] -1-pyberidinyl] ethyl] -7-methyl-5H-thiazolo (3,2-a) pyrimidin-5-one (R59022) selected from the group consisting of
  • the present invention provides a candidate substance for an anticancer agent, an apoptosis inducer for cancer cells, an apoptosis inducer for melanoma cells, or an inhibitor of NF- ⁇ B expression.
  • a method comprising: contacting a test substance with a cell expressing DGK a and determining whether the test substance force inhibits the expression and Z or function of SDGK a.
  • the present invention provides a method for treating cancer and a method for inducing apoptosis of cancer cells by inhibiting DGKo ;.
  • the present invention provides a method for inducing apoptosis of melanoma cells by inhibiting DGK.
  • the present invention is, by a child inhibit DGK a, NF-? Provides a method for inhibiting the expression of K B.
  • Fig. 1 shows the expression of DGKO in ⁇ melanoma cells and melanocytes.
  • Figure 2 shows the effect of overexpression of type I DGK on apoptosis.
  • Figure 3 shows the effect of DGKa knockdown on apoptosis.
  • Fig. 4 shows the effect of DGKa overexpression or knockdown on the nuclear localization of NF- ⁇ B.
  • Figure 5 shows the effect of DGKa overexpression or knockdown on NF- ⁇ B activity
  • Figure 6 shows the effect of NF- ⁇ - inhibitor (MG-132) on NF- ⁇ activity and apoptosis.
  • DGKa plays a role of strongly suppressing apoptosis in melanoma cells.
  • DGKo is known to be expressed less in normal cells except for T lymphocytes and oligodendrocytes.
  • DGKo highly expressed in T lymphocytes by experiments using non-specific DGK inhibitors (R59949, inhibits all type I DGK) and overexpression systems; AICD is a phenomenon specific to T lymphocytes (Alonso R, et al, J Biol Chem. 2005; 280: 28439— 28450; Outram SV, et al., Immunology.
  • DGK a There is no report that is involved in the control of apoptosis.
  • the present invention is the first to elucidate the involvement of DGK in apoptosis of cancer cells including melanoma.
  • a specific knockdown (reduction in expression level) of DGKo could be directly shown to be involved in apoptosis.
  • DGKo In T lymphocytes stably expressing muscarinic receptors, it has been suggested that DGKo; inhibits apoptosis induced by carbazole through suppression of Fas ligand release (Alonso R, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 28439-28450).
  • Fas ligand release is the main pathway in apoptosis of melanoma cells. It was strongly suggested that it worked.
  • DGK ⁇ the NF- ⁇ pathway is required for the inhibition of apoptosis by DGK ⁇ in melanoma cells. Since there has been no report on the relationship between the inhibition of Fas ligand release and the activation of NF- ⁇ B so far, DGKa regulates apoptosis through different signaling pathways in different cells. It is thought that there is.
  • DGKa As shown in the Examples below, the endogenous DGKa of AKI cells was mainly localized in the nucleus. In addition, DGKa overexpressed in AKI cells was also observed to be markedly localized in the nucleus, but the localization of DGK j8 and DGK y in the nucleus was limited (data not shown). Therefore, it is suggested that localization to DGKa force S nucleus is important in controlling apoptosis. In T lymphocytes, DGK a is present in the cytoplasm during apoptosis induced by carbachol (even when unstimulated) (Alonso R, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 28439-2845 0).
  • melanoma cells differ greatly in that DGKa is localized in the nucleus during TNF- a stimulation (even when unstimulated).
  • the difference in localization between T lymphocytes (cytoplasm) and melanoma cells (in the nucleus) may be a major cause of the different signaling pathways that DGKa uses to inhibit apoptosis.
  • the anticancer agent according to the present invention is characterized by containing a DGKa inhibitor as an active ingredient.
  • DGK a inhibitor means a substance that reduces significantly the DGK Hino expression level or enzymatic activity.
  • the DGKa inhibitor may be an inhibitor specific to DGKa or an inhibitor that can also inhibit other DGK isozymes.
  • Inhibitors that can inhibit DGK include, for example, 3- [2- [4- [bis- (4-fluorophenyl) methylene] -1-piveridyl] ethyl] -2,3-dihydro-2- Thioxo-4 (1H) quinazolinone (also referred to as R59949) and 6- [2- [4-[(4-fluorophenyl) phenylmethylene] -1-pyberidinyl] ethyl] -7-methyl-5H-thiazolo ( 3,2-a) pyrimidin-5-one (also referred to as R59022) is known. Any of these can be used in the present invention.
  • the anticancer agent of the present invention can induce apoptosis of cancer cells in cancers in which DGKa expression is enhanced, and in particular, NF- ⁇ is active in breast cancer, colon cancer, spleen cancer, ovarian cancer, etc. It is thought that it is useful for the treatment of cancer.
  • DGKa inhibitor of the present invention is an anti-DGKa antibody.
  • anti-DGK o; antibody means an antibody that can bind to DGK o; by an antigen-antibody reaction.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • Polyclonal antibodies that bind to DGKo can be used to immunize animals using DGKo; as a sensitizing antigen according to a method well known in the art, and to obtain the serum strength thereof.
  • Monoclonal antibodies that bind to DGK o are immunized with DGK a as a sensitizing antigen according to methods well known in the art, and the resulting immune cells are removed and fused with myeloma cells. It can be obtained by cloning a hyperpridoma that produces lysozyme and culturing this hyperidoma.
  • the monoclonal antibody of the present invention includes a gene recombinant antibody, a chimeric antibody, a CDR graft produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene in addition to an antibody produced by a hyperidoma. Antibodies, and fragments of these antibodies are included.
  • Recombinant antibodies are anti-DGKo; the ability to produce anti-DGKo antibodies, clone the cDNA encoding the antibody, and insert this into an expression vector to transform animal cells, plant cells, etc. It can be produced by culturing this transformant.
  • a chimeric antibody is an antibody composed of a heavy chain variable region and a light chain variable region of an antibody derived from one animal, and a heavy chain constant region and a light chain constant region of an antibody derived from another animal. Examples of antibody fragments that can bind to DGKa include Fab, F (ab ′) 2, Fab ′, scFv, and diabody.
  • DGK o which is an antigen
  • Human DGK o can be produced recombinantly by conventional methods according to the nucleotide sequence of the gene described in GenBank accession number X62535 and the amino acid sequence encoded by it. The nucleotide sequence and amino acid sequence of the human DGKa gene are shown in SEQ ID NOs: 8 and 9, respectively.
  • the thus produced DGK o is administered as an antigen subcutaneously, intravenously or intraperitoneally to the animal.
  • mammals such as mice, rats, hamsters, rabbits and goats can be used.
  • the antigen is administered together with an appropriate adjuvant such as the ability to bind the antigen to the carrier protein and Freund's complete adjuvant.
  • a partial peptide of DGKa may be used as the antigen.
  • the antigen is administered several times every 13 weeks.
  • the antibody titer is monitored by measuring the amount of immunoglobulin in the serum by ELISA. After the antibody titer has risen sufficiently, immune cells are removed from the animal. Spleen cells are preferably used as immune cells.
  • a hybridoma is produced by fusing antibody-producing immune cells with myeloma cells derived from a mammal of the same species. Various myeloma cell lines suitable for producing hybridomas are commercially available. Fusion is performed according to methods well known in the art, eg, in the presence of PEG, and the fused cells are selected in HAT medium.
  • the culture supernatant is assayed by ELISA, etc., and a hyperidoma producing an antibody that binds to the antigen is selected.
  • the hybridoma producing the target antibody can be cloned by limiting dilution.
  • Monoclonal antibodies can be produced from the supernatant of a culture solution obtained by culturing monoclonal antibody-producing cells, or in mice pretreated with 2, 4, 10, 14-tetramethylpentadecane.
  • the cells can be produced by intraperitoneal administration, collecting mouse ascites from day 7 to day 10 after inoculation, centrifuging, and collecting the supernatant.
  • Monoclonal antibodies can be purified using conventional protein purification methods such as salting out, ultrafiltration, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and HPLC. Preferably, affinity chromatography on a protein A column is performed.
  • the subclass of the purified monoclonal antibody can be determined by typing using a commercially available mouse monoclonal antibody isotyping kit.
  • the nucleotide sequence of the antibody gene encoding the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by analyzing the gene of the obtained monoclonal antibody-producing cell. Extract the total RNA from the monoclonal antibody-producing cell strength, and use this as a cage to prepare a cDNA fragment using reverse transcriptase. Next, the V region of the antibody gene is amplified by PCR using appropriately designed primers, and the base sequence of the cDNA in this region is determined.
  • the gene encoding the antibody of the present invention is incorporated into an appropriate expression vector and introduced into a host cell.
  • host cells Escherichia coli, yeast, mammalian cells, insect cells, plant cells, and the like can be used.
  • mammalian cells such as CHO, COS, and BHK are preferably used.
  • Vectors can be introduced into host cells by, for example, the salt calcium method, the calcium phosphate method, the DEAE dextran method, the method using the cationic ribosome DOT AP (Boehringer Mannheim), the electopore method, the ribofusion method, etc. It can be carried out.
  • Recombinant antibodies can be produced by culturing the resulting transformed host cells and expressing the antibodies.
  • a chimeric antibody is a heavy chain variable region and light chain variable region of an antibody derived from a certain animal (eg, mouse), and a heavy chain constant region and light chain constant of an antibody derived from another animal (eg, human).
  • Chimeric antibodies are obtained by cloning cDNA encoding the heavy chain variable region and light chain variable region of an antibody from a hybridoma producing a monoclonal antibody that binds to DGKa, while determining the heavy chain of an antibody derived from another animal.
  • a cDNA encoding the normal region and the light chain constant region can be cloned, inserted into an appropriate expression vector in combination, and expressed in a host cell for recombinant production.
  • a CDR-grafted antibody is an antibody in which the complementarity determining region (CDR) of an antibody of one animal (eg, mouse) is transplanted to the complementarity determining region of an antibody of another animal (eg, human).
  • the gene encoding the CDR-grafted antibody is CDR1, 2 based on the gene sequences of the heavy and light chain variable regions of the hybridoma-cloned antibody that produces monoclonal antibodies that bind to DGKo; , 3 is designed and replaced with the corresponding CDR1, 2 and 3 sequences in the vector containing the genes encoding heavy and light chain variable regions of antibodies from other animals. Can be obtained.
  • the CDR-grafted antibody can be produced recombinantly.
  • Antibody fragments such as Fab, F (ab ') 2, Fab', scFv, and diabody that can bind to DGKa are obtained by using the anti-DGKa monoclonal antibody of the present invention described above with an enzyme such as papain or trypsin. It can be produced by treating or introducing an expression vector incorporating a gene encoding them into a host cell to obtain a transformant.
  • DGKa inhibitors include expression of DGKa genes (transcription and Z, such as antisense oligonucleotides, ribozymes, molecules that cause RNA interference (RNAi) (eg, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA). Or translation) inhibitors.
  • RNAi RNA interference
  • nucleic acids can bind to and inhibit the expression of the DGKa gene or mRNA encoding DGKa.
  • General methods for controlling gene expression using antisense, ribozyme technology and RNAi technology, or gene therapy methods for expressing exogenous genes in this manner are well known in the art.
  • Antisense oligonucleotide refers to a nucleic acid molecule having a sequence complementary to mRNA encoding DGKa or a derivative thereof. Antisense oligonucleotides specifically bind to mRNA and inhibit protein expression by inhibiting transcription and Z or translation. Coupling may be by Watson's Click or Houdsteen-type base pair complementarity, or by triplex formation.
  • a ribozyme refers to the RNA structure of one or more RNAs that have catalytic properties. Ribozymes generally exhibit endonuclease, ligase or polymerase activity. Various secondary structure ribozymes are known, such as hammerhead and hairpin type ribozymes.
  • RNA interference is a method of silencing a target gene using a double-stranded RNA molecule.
  • DGKa inhibitors can be administered as is, but are usually formulated using pharmaceutical carriers. Any carrier commonly used in the pharmaceutical field can be used as the carrier for the formulation, for example, sterile water, physiological saline, excipients, stabilizers, antioxidants, buffers, surface active agents. Agents, binders and the like are preferably used. In addition, DGKa inhibitors can be encapsulated in microcapsules and polymer gels to provide sustained-release preparations. [0039]
  • the administration route of the anticancer agent of the present invention includes oral administration, intravenous administration, intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intracavity administration, and the like. Preferably, it may be administered directly or percutaneously to the disease site, or may be directly injected using a catheter or the like. When the anticancer agent of the present invention is used for melanoma treatment, it can be administered directly or by subcutaneous injection.
  • the dose is appropriately selected according to the type of DGKa inhibitor, the route of administration, the degree of disease, etc., but when administered directly to the disease site, it is usually lO / zg lOmg, preferably 500 g ⁇ 500mg.
  • the dose is usually 1 / z g lmg / Kg, preferably 20 ⁇ g to 20 mg / Kg.
  • the present invention screens candidate substances for anticancer agents, cancer cell apoptosis inducers, melanoma cell apoptosis inducers, or inhibitors of NF- ⁇ B expression from various test substances.
  • Screening can be performed by contacting a test substance with DGKa and determining whether the test substance strength 3 ⁇ 4 GKa expression or enzyme activity is inhibited.
  • the ability of a test substance to inhibit DGKa expression can be assessed by measuring the amount of DGKa mRNA or protein by known methods.
  • Test substance ability 3 ⁇ 4 The ability to inhibit the enzyme activity of GKa can be evaluated by measuring diacylglycerol kinase activity by a known method.
  • Substances identified by these assays as inhibiting DGKo expression or enzyme activity are anti-cancer agents, cancer cell apoptosis inducers, melanoma cell apoptosis inducers, or suppression of NF- ⁇ B expression. It is considered to be a candidate substance for the drug.
  • Test substances can also be obtained from various libraries such as various synthetic or natural compound libraries, combinatorial libraries, oligonucleotide libraries, peptide libraries and the like.
  • extracts from natural products such as bacteria, fungi, algae, plants, animals, and partially purified products may be used as test substances.
  • NHEM human epidermal melanocytes
  • Wild-type (WT) pig DGK a (Sakane F, et al., Nature. 1990; 344: 345-348), Kinase-dead type (KD) -porcine DGK a (G435D) (Yamada K , et al., Bio chem Biophys Res Commun. 2003; 305: 101-107), wild type rat DGK jS (Goto K, and Kondo H. Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90: 7598-7602), and wild Type human DGKY (Kai M, et al, J Biol Chem.
  • GFP sense 5'-ACGGCAUCAAGGUGAACUUCAAGAU-AG-3 '(SEQ ID NO: 2), GFP antisense; 3'-UA-UCCCGUAGUUCCACUUGAAGUUCUA-5' (SEQ ID NO: 3),
  • lysis buffer 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.2), 1 mM EDTA, 1 mM fluorinated methylmethylsulfol, protease inhibitor cocktail (1 tablet / 50 ml) , Roche Diagnostics)
  • lysis buffer 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.2), 1 mM EDTA, 1 mM fluorinated methylmethylsulfol, protease inhibitor cocktail (1 tablet / 50 ml) , Roche Diagnostics
  • sonication 4 ° C
  • centrifuged at 4 ° C for 5 minutes at 3000 rpm centrifuged at 4 ° C for 5 minutes at 3000 rpm, and the supernatant (lysate) was recovered.
  • a portion of this lysate was used and the amount of protein was quantified by BCA protein assay (Pierce Biotechnology, USA).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • sample buffer 125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 10% SDS, 50% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 0.005% bromophenol blue
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis PAGE. After SDS-PAGE, transfer was performed (400 mA, 1 hour) onto a polyvinylidene difluoride membrane (Bio-Rad Laboratories, USA), and the transfer membrane was blocked with Block Ace (Dainippon Pharmaceutical).
  • Anti-DGKa antibody (Kanoh H, et al., J Biol Chem. 1986; 261: 5597-5602), anti-actin antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) or anti-GFP antibody (Sa nta Cruz Biotechnology) was diluted with Block Ace and allowed to react for 1 hour. After washing, each was reacted with a peroxidase-labeled secondary antibody (Jackson Immunoresearch Laboratories, USA) corresponding to each primary antibody. After washing, ECL Western blotting detection cisam (Amersham Biosciences, UK) was used to emit light, and then exposed to Hyperfilm (Amersham Biosciences) to detect bands. Band intensity was quantified using Image J software (National Institute of Health, USA).
  • RT Reverse transcriptase
  • PCR polymerase chain reaction
  • Superscript First—3 ⁇ 4trana synthesis System (Invitrogen, USAj) was used to synthesize cDNA using 5 g total RNA.
  • This first strand cDNA (equivalent to 500 ng total RNA) was added to Ex Taq polymerase (Takara Bio) and human.
  • DGK ⁇ -specific primer (Yamada K, et al., Biochem Biophys Res Commun.
  • TNF-a (Strathmann Biotec AG, Ger many) is apoptotic. Induced. After further incubation for 24 hours, the cells were fixed with 3.7% formaldehyde. After increasing permeability with 0.1% Triton ⁇ -100, In
  • TdT-mediated dUTP nick end label TUNEL
  • the cells were encapsulated using Vectashield (Vector Laboratories, U.S.A.), and more than 1,000 cells were observed with a confocal laser microscope (Zeiss LSM 510), and positive cells were counted.
  • Cells were seeded on a cover glass coated with poly-L-lysine, and various expression vectors or siRNA were introduced. After 24 hours, 50 ng / ml TNF- ⁇ was added to induce apoptosis. Further After 24 hours of incubation, the cells were fixed with 3.7% formaldehyde. Increased permeability with 0.1% Triton X-100, then reacted with anti-DGKa antibody or anti-NF- ⁇ antibody (Santa Cruz Biotechnology) diluted with 2% ushi serum albumin / PBS for 1 hour . After washing, each antibody was reacted with a secondary antibody (Eugene, USA) conjugated with Alexa Fluor 488 or Alexa Fluor 594 corresponding to each primary antibody. The cells were encapsulated using Vectashield, and subcellular localization was observed with a confocal laser microscope (Zeiss LSM 510).
  • PNF- ⁇ B-Luc Vector (Takara Bio-Clontech), which incorporates the NF- ⁇ B promoter sequence and luciferase cDNA downstream as a reporter, is introduced into AKI melanoma cells along with various expression vectors or siRNA. 24 hours after introduction, 50 ng / ml TNF- ⁇ was induced to induce apoptosis. After an additional 12 hours, the cells were thawed with Glo Lysis Buffer (Promega, U.S.A.), and the luciferase substrate (Steady-Glo, Promega) was added and reacted.
  • Glo Lysis Buffer Promega, U.S.A.
  • Luminescence by luciferase was measured using a Wallac 1420 ARVOsx multilabel plate reader (PerkinElmer, U.S.A.). The luciferase activity was corrected by coexpression of pSV-j8-galactosidase control vector (Promega), measuring ⁇ -galatatosidase activity, and determining the expression efficiency.
  • DGK a protein was detected in all melanoma cells examined. However, the other type I isozymes DGK ⁇ and DGK ⁇ mRNA and protein were undetectable under the same conditions as those detected for DGK a. Therefore, it was revealed that only ⁇ -isozyme was expressed in melanoma cells as far as examined.
  • DGKa-expressing cells the results of Western blot and RT-PCR obtained using AKI cells are shown in Figures 1A and 1B, respectively. In Western blotting, a band is also observed at a molecular weight of 60K in addition to 80K, which matches the calculated molecular weight of the cloned DGK a cDNA (Fig. 1A). It is considered to be an alternative splice product of
  • DGKa has a function specific to melanoma cells, so we tried to clarify its function.
  • Melanoma cells are known to be highly resistant to apoptosis induced by various stimuli and drugs. Therefore, we next examined the role of this isozyme in apoptosis of melanoma cells by overexpressing DGKa using AKI cells, or conversely reducing the expression level of endogenous DGKa.
  • FIG. 1 AKI melanoma cells were transfected with a control vector (pEGFP alone), pEGFP-DGK ⁇ -WT, pEGFP-DGKa-KD, pEGFP-DGK j8-WT or pEGFP-DGKy-WT, and TNF- 24 hours after introduction.
  • ⁇ 50 ng / ml was added and incubated for another 24 hours.
  • cell lysates (10 g) were separated by SDS-PAGE and Western blotting was performed using anti-GFP antibodies to confirm the expression of each protein (Fig.
  • FIG. 2A As a result, it was found that overexpression of DGK a -WT (FIG. 2A) markedly inhibits apoptosis induced by TNF-a in AKI cells (FIG. 2B).
  • FIG. 2B In the case of DGK a-KD, which is inactive to the kinase, even though almost the same level of expression was observed (Fig. 2A), this effect was not observed (Fig. 2B). This result indicates that the catalytic activity of DGKa is essential for the inhibition of apoptosis by DGKa.
  • DGKa protein both 80K and 60K bands
  • apoptosis induced by TNF- ⁇ was significantly enhanced by DGKa knockdown (Fig. 3B).
  • DGKy siRNA did not have this effect. This result further supports the specific involvement of a-isozymes in inhibiting apoptosis.
  • control vector pEGFP alone
  • pEGFP-DGK a -WT pEGFP-DGK a -KD
  • TNF-a 50 ng / ml
  • anti-NF- ⁇ B p65
  • the cells were stained (red), and the intracellular localization of NF- ⁇ B (p65) in cells expressing the GFP fusion protein was observed with a confocal laser microscope (Fig. 4A). Bar: 10 ⁇ m.
  • control GFP
  • DGK a DGK y siRNA
  • TNF-a 50 ng / ml
  • Fig. 4C confocal laser microscope
  • Fig. 4D Image J software was used to analyze the fluorescence intensity ratio of NF- ⁇ B (p65) present in the nuclear Z cytoplasm under each condition. The results are shown as the average standard deviation obtained in three independent experiments (each analyzing 20 or more cells).
  • NF- ⁇ B transcriptional activity of NF- ⁇ B actually increased was examined by one luciferase reporter.
  • AKI melanoma cells were transfected with a control vector (pEGFP alone), pEGFP-DGK a-WT, or pEGFP-DGK ⁇ -KD, and TNF- ⁇ (50 ng / ml) was obtained 24 hours after the introduction. After further incubation for 12 hours, cells were collected and luciferase activity was measured (Fig. 5A). The activity was expressed as a relative value with 100% of control cells. The results are expressed as the mean average standard deviation obtained by three independent experiments.
  • GFP control
  • DGKa siRNA was introduced into AKI melanoma cells, and TNF- ⁇ (50 ng / ml) was collected 24 hours after introduction. After further incubation for 12 hours, cells were collected and luciferase activity was measured (Fig. 5B). The activity was expressed as a relative value with control cells taken as 100%. The results are shown as the average standard deviation obtained from three independent experiments. In the DGKa siRNA knockdown, conversely, when combined with the results above the decrease in NF- ⁇ B activity, DGKa positively regulates the transcriptional activity of NF- ⁇ through its catalytic activity. It became clear. It also suggests that there is a close relationship between the suppression of apoptosis by DGKa and the increased activity of NF- ⁇ .
  • the activity was expressed as a relative value with 100% of control cells.
  • the results are expressed as the average standard deviation obtained by three independent experiments.
  • MG-132 an NF- ⁇ B inhibitor
  • TUNEL staining was performed after 24 hours of incubation. Using a confocal laser microscope, cells expressing GFP fusion protein and positive for TUNEL staining were counted, and the percentage (%) of the total number of GFP positive cells was determined (Fig. 6B). The degree of apoptosis induced was expressed as a relative value with control cells taken as 100%. In experiments that were repeated twice independently, almost the same results were obtained. As a result, it is recognized in FIG.
  • the effect of the DGKa inhibitor of the present invention to suppress cancer is known in the literature (for example, Y. Takei, et al, Cancer Res., 64, 3365 (2004); Y. Minakuchi, et al, Nucleic Acids Res. , 32, el09 (2004); F. Takeshita, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 102, 1 2177 (2005)).
  • Mouse B16F1 melanoma cells are used as skin cancer cells.
  • female C5 7BL / 6J mice (4 weeks old, 10 gm) are used.
  • To form a cancer subcutaneous injection of 0.1 ml phosphate-buffered I ⁇ saline about LxlO 5 amino B16F1 melanoma cells suspended in the left flank of C57BL / 6J mice. The volume of the cancer that forms after 7-10 days is measured.
  • DGKa-specific siRNA The effect of DGKa-specific siRNA is measured as follows. 48 hours after subcutaneous injection of B16F1 melanoma cells, DGKa specific siRNA mixed with atelocollagen (AteloGene TM; Koken) is administered locally (subcutaneously) or systemically (intravenously). Various conditions can be set for the mixing ratio and concentration of DGKa-specific siRNA and AteloGene, and the administration period of DGKa-specific siRNA. Measure the volume of cancer that formed after 5 to 8 days and test the effect of DGK o; specific siRNA.
  • the anticancer agent of the present invention is useful for the treatment of cancer, particularly melanoma.
  • the present invention is also useful for screening candidate substances for anticancer agents.

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Abstract

【課題】　新規な抗癌剤を提供すること。 【解決手段】　DGKα阻害剤を有効成分として含有する抗癌剤，癌細胞のアポトーシス誘 導剤メラノーマ細胞のアポトーシス誘導剤およびNF-κBの発現の抑制剤が開示される。DGKα阻害剤としては，抗DGKα抗体，DGKα遺伝子に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド，リボザイムおよびｓｉＲＮＡが挙げられる。また，抗癌剤，癌細胞のアポトーシス誘導剤，メラノーマ細胞のアポトーシス誘導剤またはNF-κBの発現の抑制剤の候補物質を同定する方法であって，試験物質をDGKαを発現する細胞と接触させ，前記試験物質がDGKαの発現および／または機能を阻害するか否かを判定することを含む方法も開示される。

Description

明 細 書
DGK a阻害剤を含有する抗癌剤
技術分野
[0001] 本発明は，抗癌剤，特にメラノーマの治療剤に関する。より詳細には，本発明は，メ ラノーマ等の癌細胞のアポトーシスを誘導する方法ならびにアポトーシス誘導剤に関 する。
背景技術
[0002] メラノーマ（黒色腫）は，あらゆる癌のなかでも最も悪性度が高く，致死率が高いこと が知られている。メラノーマの生化学的特徴の一つは，乳癌，大腸癌，脾臓癌や卵巣 癌と並び， NF(nuclear factor )- κ Bが常時活性化されていることである（Amiri KI, and Richmond A. Cancer Metastasis Rev. 2005; 24: 301-313 ; Ivanov VN, e t al, Oncogene. 2003; 22: 3152— 3161 : Soengas MS, and Lowe SW. Oncogen e. 2003; 22: 3138- 3151)。 NF- κ Bはアポトーシス抑制因子の一つなので，この活 性の上昇は化学療法の有効性を減じる結果となる。したがって，現在のところメラノ一 マに対するきわめて有効な化学療法は存在しておらず，原則的に治療は外科的切 除に頼ったものになっている。
[0003] 腫瘍壊死因子- a (TNF- a )とその受容体活性ィ匕は，主要なアポトーシス経路であ り，最終的にカスペース- 8を活性化して細胞死を引き起こすが（Morgan M, et al., J Cell Biol. 2002; 157: 975- 984) ,—方， TNF- α受容体活性化後， NF- κ Bの 活性化が起こり，アポトーシス阻止効果を示すことも知られている（Chen G, et al, Science. 2002; 296: 1634-1635)。したがって， TNF- α受容体活性化以降のシ グナル伝達系にお 、て生ずるアポトーシスと抗アポトーシスシグナルのバランスにより TNF- a依存性の細胞死が制御されて!、る。
[0004] NF- κ Bは当初，免疫グロブリンの κェンハンサー内に存在する DNA配列， GGGG ACTTTCC (配列番号 1)に結合する B細胞に特異的な転写因子として同定された。し かし，その後の解析によりこの転写因子は B細胞だけではなく，他の細胞にも広く分 布しており， 150種を超える数多くの遺伝子発現を制御していることが明らかになった (Ivanov VN, et al, Oncogene. 2003; 22: 3152-3161 ; Baeuerle PA, and Hen kel T. F. Annu Rev Immunol. 1994; 12: 141-179 ;Verma IM, et al., Genes Dev. 1995; 9: 2723- 2735)。 NF- κ Bは， Relファミリーに属する p65 (RelA)や p50 ( NF- K Bl)などの分子力 形成されるホモまたはへテロ二量体であり，未刺激の細胞 においては，そのインヒビターである I κ B分子と細胞質中で複合体を形成し,その核 移行が阻止されることにより不活性化されている（Baldwin AS. J Clin Invest. 200 1; 107: 241-246)。 TNF- αをはじめとする様々な刺激によって Ι κ Bがリン酸化され ,その結果 I κ Bはプロテアソームにより分解され， NF- κ Βは核に移行し，種々の遺 伝子発現を制御すると考えられている。 NF- κ Bは細胞のアポトーシスや癌化との関 連が示されるとともに，免疫機能や炎症およびウィルス感染，発症時における役割な ど，医学的側面からも注目されている（Ivanov VN, et al, Oncogene. 2003; 22: 3152- 3161 ; Baeuerle PA, and Henkel T. F. Annu Rev Immunol. 1994; 12: 141-179 ;Verma IM, et al., Genes Dev. 1995; 9: 2723—2735)。
[0005] ジァシルグリセロールキナーゼ （DGK)はジァシルグリセロールをリン酸化してホス ファチジン酸を生成する酵素である。基質のジァシルグリセロールはコンベンショナ ルプロテインキナーゼ Cおよびノーベルプロテインキナーゼ Cの活性化因子として既 に確立しており，更に，プロテインキナーゼ C以外にも，カイメリン（chimaerin) , Unc-1 3, Ras グァ-ルヌクレオチド放出タンパク質の CI (亜鉛フィンガー）ドメインに結合し て活性化することが知られている（Hurley JH, et al" Protein Sci. 1997; 6: 477 -480 ; Kazanietz MG. Mol Pharmacol. 2002; 61: 759- 767)。一方，反応産物の ホスファチジン酸もホスファチジルイノシトール 5キナーゼゃ Raf-1をはじめとする種 々のシグナル伝達酵素の活性を制御することが報告されている（English D. Cell Si gnal. 1996; 8: 341-347 ; Exton JH. Biochim Biophys Acta. 1994; 1212: 26—4 2)。
[0006] 哺乳類の DGKには 10種のアイソザィムが存在し，その構造上の特徴から I型（ a , β , ）， 11型（3 , η , κ ) , ΠΙ型（ ε ) , IV型（ζ , t ) , V型（ θ )に分類される（Imai S, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 39870— 39881 ; Kanoh H, et al" J Bio chem. 2002; 131: 629-633 ; Sakane F, and Kanoh H. Int J Biochem Cell Bi ol. 1997; 29: 1139— 1143 ; Topham MK, and Prescott SM. J Biol Chem. 199 9; 274: 11447-11450 ; van Blitterswijk WJ, and Houssa B. Chem Phys Lipid s. 1999; 98: 95- 108)。更に， β -, γ -, δ - , η -, ζ - , t -アイソザィムには選択 的スプライス産物が存在し，それぞれ発現パターンや細胞内局在性などの性質が異 なる（Kanoh H, et al, J Biochem. 2002; 131 : 629-633.18 ; Ito T, et al, J Biol Chem. 2004; 279: 23317-23326)。したがって，哺乳類の DGKには少なくとも 16種のアイソフォームが存在することになる。一方，興味深いことに，単細胞生物の 酵母には DGKは存在せず，また，線虫やショウジヨウバエなどの比較的単純な多細 胞生物には数種類の限定されたァイソフォームしか見つかっていない。したがって， DGKァイソフォームの多くは，細胞の癌化，発生'分化，免疫系，神経系構築など高 等な多細胞生物独自の機能に関与すると考えられている。
[0007] I型 DGKは，全てのアイソザィムに共通して存在する触媒領域と 2個の亜鉛フィンガ 一ドメイン以外に，分子内に 2個の EFノヽンドモチーフ（Ca2+結合能をもつ）をもってい る（Sakane F, et al., J Biol Chem. 1991 ; 266: 7096— 7100 ; Sakane F, et al., Nature. 1990; 344: 345-348 ;Yamada K, et al" Biochem J. 1997; 321 : 59 -64)。 I型ァイソザィムの中では， DGK o;の研究が最も進んでおり，最近，その生理機 能が幾つか明らかになってきている（Kanoh H, et al" J Biochem. 2002; 131 : 629-633 ; Sakane F, and Kanoh H. Int J Biochem Cell Biol. 1997; 29: 113 9-1143 ; Topham MK, and Prescott SM. J Biol Chem. 1999; 274: 11447-11 450 ; van Blitterswijk WJ, and Houssa B. Chem Phys Lipids. 1999; 98: 95— 108)。例えば，本ァイソザィムは，ムスカリン受容体を発現させた Tリンパ球において ,非特異的 DGK阻害剤（R59949)や過剰発現系を用いた実験により，カルバコール によって誘導されるアポトーシスを Fasリガンドの遊離抑制を介して阻害することが示 唆されている（Alonso R, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 28439-28450)。
[0008] また，血管内皮細胞が肝細胞増殖因子刺激によって移動する際に，本ァイソザィム が c-Srcによりリン酸ィ匕され，活性ィ匕されることも報告されている（Cutrupi S, et al, EMBO J. 2000; 19: 4614-4622)。しかし，これまでに， DGK αを含め DGKァイソ ザィムのメラノーマ細胞における発現の有無や，その役割は全く明らかにされていな い。
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載 される内容はすべて本明細書の一部としてここに引用する。これらの文献のいずれか 力 本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
非特許文献 l:Amiri KI, and Richmond A. Cancer Metastasis Rev. 2005; 24:
301-313
非特許文献 2:Ivanov VN, et al, Oncogene. 2003; 22: 3152-3161
非特許文献 3:Soengas MS, and Lowe SW. Oncogene. 2003; 22: 3138-3151 非特許文献 4: Morgan M, et al., J Cell Biol. 2002; 157: 975-984
非特許文献 5: Chen G, et al., Science. 2002; 296: 1634-1635
非特許文献 6:Baeuerle PA, and Henkel T. F. Annu Rev Immunol. 1994; 12
： 141-179
非特許文献 7:Verma IM, et al., Genes Dev. 1995; 9: 2723-2735
非特許文献 8: Baldwin AS. J Clin Invest. 2001; 107: 241-246
非特許文献 9: Hurley JH, et al" Protein Sci. 1997; 6: 477-480
非特許文献 10:Kazanietz MG. Mol Pharmacol. 2002; 61: 759-767
非特許文献 11: English D. Cell Signal. 1996; 8: 341-347
非特許文献 12:Exton JH. Biochim Biophys Acta. 1994; 1212: 26-42 非特許文献 13:Imai S, et al" J Biol Chem. 2005; 280: 39870-39881 非特許文献 14:Kanoh H, et al., J Biochem. 2002; 131: 629-633
非特許文献 15:Sakane F, and Kanoh H. Int J Biochem Cell Biol. 1997; 29:
1139-1143
非特許文献 16:Topham MK, and Prescott SM. J Biol Chem. 1999; 274: 11 447-11450
非特許文献 17: van Blitterswijk WJ, and Houssa B. Chem Phys Lipids. 1999;
98: 95-108
非特許文献 18:Ito T, et al., J Biol Chem. 2004; 279: 23317-23326 非特許文献 19:Sakane F, et al" J Biol Chem. 1991; 266: 7096-7100 非特許文献 20 : Sakane F, et al.， Nature. 1990; 344: 345-348
非特許文献 21 :Yamada K, et al, Biochem J. 1997; 321: 59-64
非特許文献 22 :Alonso R, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 28439-28450 非特許文献 23 : Cutrupi S, et al, EMBO J. 2000; 19: 4614-4622
非特許文献 24 : Outram SV, et al., Immunology. 2002; 105: 391-398 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明は，メラノーマをはじめとする癌の治療剤および治療方法，特に癌細胞のァ ポトーシス誘導剤を提供すること，ならびにそのような治療剤の候補物質をスクリー- ングする方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明者は， DGKの α -アイソザィムが，調べたメラノーマ細胞全てに発現している のに対して，癌化していないメラノサイトには検出されないことを見出した。そして， D GK a力TNF- aによって誘導されるメラノーマ細胞のアポトーシスを抑制して 、ること ,ならびに，その制御は NF- κ Β経路を介して行われていることを明らかにした。
[0012] すなわち，本発明は， DGK a阻害剤を有効成分として含有する抗癌剤を提供する 。別の観点においては，本発明は， DGK a阻害剤を有効成分として含有する，癌細 胞のアポトーシス誘導剤を提供する。また別の観点においては，本発明は， DGK a 阻害剤を有効成分として含有する，メラノーマ細胞のアポトーシス誘導剤を提供する 。また別の観点においては，本発明は， DGK a阻害剤を有効成分として含有する， N F- κ Bの発現の抑制剤を提供する。本発明において好ましくは， DGK a阻害剤は， 抗 DGK a抗体， DGK a遺伝子に対するアンチセンス ·ォリゴヌクレオチド，リボザィム および siRNA,および， 3- [2- [4- [ビス- (4-フルオロフェ -ル)メチレン]- 1-ピベリジ- ル]ェチル ]- 2,3-ジヒドロ- 2-チォキソ- 4(1H)キナゾリノン（R59949)および 6- [2- [4- [(4- フルオロフェニル)フエニルメチレン]- 1-ピベリジニル]ェチル ]-7-メチル -5H-チアゾロ (3,2-a)ピリミジン- 5-オン（R59022)力 なる群より選択される。
[0013] さらに別の観点においては，本発明は，抗癌剤，癌細胞のアポトーシス誘導剤，メ ラノーマ細胞のアポトーシス誘導剤または NF- κ Bの発現の抑制剤の候補物質を同 定する方法であって，試験物質を DGK aを発現する細胞と接触させ，前記試験物質 力 SDGK aの発現および Zまたは機能を阻害する力否かを判定することを含む方法を 提供する。
[0014] さらに別の観点においては，本発明は， DGK o;を阻害することにより、癌を治療す る方法および癌細胞のアポトーシスを誘導する方法を提供する。また別の観点にお いては，本発明は， DGKひを阻害することにより，メラノーマ細胞のアポトーシスを誘 導する方法を提供する。また別の観点においては，本発明は， DGK aを阻害するこ とにより， NF- K Bの発現を抑制する方法を提供する。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]図 1は， ΑΚΙメラノーマ細胞とメラノサイトにおける DGK o;の発現を示す。
[図 2]図 2は， I型 DGKの過剰発現のアポトーシスへの影響を示す。
[図 3]図 3は， DGK aのノックダウンによるアポトーシスへの影響を示す。
[図 4]図 4は， DGK aの過剰発現，またはノックダウンによる NF- κ Bの核内局在への 影響を示す。
[図 5]図 5は， DGK aの過剰発現，またはノックダウンの NF- κ B活性への影響を示す
[図 6]図 6は， NF- κ Β阻害剤（MG- 132)の NF- κ Β活性とアポトーシスへの影響を示 す。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明においては，下記の実施例に示されるように，メラノーマ細胞において DGK aがアポトーシスを強く抑制する役割を担っていることが明らかになった。 DGK o;は， 正常細胞では Tリンパ球とオリゴデンドロサイト以外ではあまり発現して ヽな 、ことが 知られており，本発明により初めてメラノーマにぉ ヽて発現が亢進されて!ヽることが見 いだされた。非特異的 DGK阻害剤 (R59949, I型 DGK全てを阻害)や過剰発現系を 用いた実験により， Tリンパ球において高度に発現している DGK o;力 Tリンパ球特異 的な現象である AICD (activation-induced cell death)に関与することが示唆されて いる（Alonso R, et al, J Biol Chem. 2005; 280: 28439— 28450 ; Outram SV, et al., Immunology. 2002; 105: 391- 398)。しかし，他の細胞種において DGK a がアポトーシスの制御に関与しているという報告はなされていない。本発明は，メラノ 一マを含め癌細胞のアポトーシスへの DGKの関与について初めて明らかにするもの であり， siRNAによる DGK o;の特異的ノックダウン (発現量低下）法を用いることにより , DGK o;のアポトーシスへの関与を直接的に示すことができた。ムスカリン受容体を 安定発現させた Tリンパ球では， Fasリガンドの遊離抑制を介して DGK o;がカルバコ ールによって誘導されるアポトーシスを阻害することが示唆されている（Alonso R, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 28439- 28450)。しかし，高濃度の Fasリガンドの 添カ卩によっても AKI細胞のアポトーシス亢進は観察されない（データ示さず)ことから， T細胞とは異なり，メラノーマ細胞のアポトーシスでは Fasリガンドの遊離は主な経路と して機能して 、な 、ことが強く示唆された。
[0017] さらに，本発明においては，メラノーマ細胞において， DGK αによるアポトーシス抑 制には NF- κ Β経路が必要であることが見出された。なお，これまでに Fasリガンドの 遊離抑制と NF- κ Bの活性化との関連についての報告はないので， DGK aは異なつ た細胞ではそれぞれ別の情報伝達経路を介してアポトーシスを制御しているものと考 えられる。
[0018] 下記の実施例で示されるように， AKI細胞の内在性 DGK aは主に核に局在してい た。また， AKI細胞で過剰発現した DGK aも顕著な核内への局在が観察されたが， D GK j8と DGK yの核への局在は限られていた（データ示さず）。したがって， DGK a力 S 核へ局在することがアポトーシスを制御する上で重要であることが示唆される。 Tリン パ球では，カルバコール刺激によるアポトーシス誘導時 (未刺激時でも）に， DGK a は細胞質に存在する（Alonso R, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 28439-2845 0)。一方，メラノーマ細胞では， TNF- a刺激時 (未刺激時も）に， DGK aが核内に 局在している点で大きく異なる。 Tリンパ球 (細胞質）とメラノーマ細胞 (核内）での局在 性の違 、が， DGK aがアポトーシスを抑制するために使用するシグナル経路が異な る大きな原因なのかもしれな 、。
[0019] 現在のところメラノーマに対するきわめて有効な化学療法は存在しておらず，原則 的に治療は外科的切除に頼ったものになっている。本発明においては， DGK aの si RNA力 Sメラノーマ細胞の NF- κ B活性を低下させ，アポトーシスを促進することが明ら カゝになった。 NF- κ Β活性亢進はメラノーマ細胞の化学療法に対する抵抗性の主な 原因であることが示されて 、るので， DGK aの siRNAは化学療法に対しても感受性を 高めると考えられる。さらに，本発明にしたがって， DGKひの活性の阻害を指標として ,メラノーマをはじめとする癌の治療薬の有力な候補物質をスクリーニングすることも 可能である。
[0020] DGK a阻害剤
本発明にしたがう抗癌剤は， DGK a阻害剤を有効成分として含有することを特徴と する。ここで， 「DGK a阻害剤」とは， DGKひの発現量または酵素活性を有意に減少 させる物質を意味する。 DGK a阻害剤としては， DGK aに特異的な阻害剤でもよく， 他の DGKアイソザィムをも阻害しうる阻害剤でもよ ヽ。 DGKを阻害しうる阻害剤として は，例えば， 3- [2- [4- [ビス- (4-フルオロフェ -ル)メチレン]- 1-ピベリジ-ル]ェチル] - 2, 3-ジヒドロ- 2-チォキソ -4(1H)キナゾリノン（R59949とも称される）および 6-[2-[4-[(4- フルオロフェニル)フエニルメチレン]- 1-ピベリジニル]ェチル ]-7-メチル -5H-チアゾロ (3,2-a)ピリミジン- 5-オン（R59022とも称される）が知られている。これらのいずれも本 発明において用いることができる。本発明の抗癌剤は， DGK aの発現が亢進されて いる癌において，癌細胞のアポトーシスを誘導することができ，特に，乳癌，大腸癌， 脾臓癌，卵巣癌などの， NF- κ Βが活性ィ匕されている癌の治療に有用であると考えら れる。
[0021] 杭 DGK a杭体
本発明の DGK a阻害剤として好ましいものの 1っは抗 DGK a抗体である。本明細 書において， 「抗 DGK o;抗体」とは， DGK o;と抗原抗体反応により結合しうる抗体を 意味する。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよ 、。
[0022] DGK o;に結合するポリクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知られる方法 にしたがって， DGK o;を感作抗原として用いて動物を免疫し，その血清力も得ること ができる。 DGK o;に結合するモノクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知ら れる方法にしたがって， DGK aを感作抗原として用いて動物を免疫し，得られる免疫 細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイプリドーマをクロー二 ングし，このハイプリドーマを培養することにより得ることができる。 [0023] 本発明のモノクローナル抗体には，ハイプリドーマにより産生される抗体にカ卩えて， 抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子 組換え抗体，キメラ抗体， CDR移植抗体，およびこれらの抗体の断片等が含まれる。
[0024] 遺伝子組み換え抗体は，抗 DGK o;抗体を生産するハイプリドーマ力も抗体をコード する cDNAをクローユングし，これを発現ベクター中に挿入して，動物細胞，植物細 胞などを形質転換し，この形質転換体を培養することにより製造することができる。キ メラ抗体とは，ある動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と，他 の動物に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域から構成される抗体で ある。 DGK aに結合しうる抗体断片としては， Fab, F(ab')2, Fab', scFv,ディアボディ 一等が挙げられる。
[0025] DGK aに結合する抗体を産生する細胞は，当該技術分野においてよく知られる方 法により取得することができる。 DGK aを感作抗原として用いて動物を免疫し，得ら れる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイブリドーマを クロー-ングする。より詳細には，まず，抗原となる DGK o;を製造する。ヒトの DGK o; は， GenBank受託番号 X62535に記載される遺伝子の塩基配列及びそれがコードす るアミノ酸配列にしたがって，通常の方法により組換え的に生成することができる。ヒト の DGK aの遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 8および 9に示 す。
[0026] 次に，このようにして製造した DGK o;を抗原として，動物の皮下，静脈内または腹 腔内に投与する。免疫動物としては，マウス，ラット，ハムスター，ゥサギ，ャギ等の哺 乳動物を用いることができる。好ましくは，抗原をキャリアタンパク質に結合させる力， フロインド完全アジュバント等の適当なアジュバントとともに抗原を投与する。あるいは ,抗原として DGK aの部分ペプチドを用いてもよい。 DGK αと他の DGKアイソザィム とのアミノ酸配列を比較することにより， DGK o;に対して特異性の高い抗体を作製す るための抗原ペプチドを選択する方法は，当該技術分野においてよく知られている。
[0027] 抗原の投与は， 1 3週間毎に数回行う。血清中の免疫グロブリンの量を ELISA法 などにより測定することにより，抗体価をモニターする。十分に抗体価が上昇した後， この動物から免疫細胞を取り出す。免疫細胞としては好ましくは脾臓細胞を用いる。 抗体産生免疫細胞と，同種の哺乳動物に由来する骨髄腫細胞とを融合させてハイ プリドーマを作製する。ノ、イブリドーマを作製するのに適した各種の骨髄腫細胞株が 市販されている。融合は， 当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，例 えば PEGの存在下で行い， HAT培地で融合細胞を選択する。培養上清を ELISA 法などによりアツセィして，抗原と結合する抗体を産生するハイプリドーマを選択する 。次に，限界希釈法により目的とする抗体を産生するハイブリドーマをクローユングす ることがでさる。
[0028] モノクローナル抗体は，モノクローナル抗体産生細胞を培養して得られる培養液の 上清から，またはあら力じめ 2, 4, 10, 14ーテトラメチルペンタデカンで前処理したマ ウスにモノクローナル抗体産生細胞を腹腔内投与し，接種後 7日から 10日目にマウ スの腹水を採取し，遠心分離し，上清を分取することにより製造することができる。モ ノクローナル抗体の精製は，通常のタンパク質精製方法，例えば，塩析，限外濾過， ゲル濾過，イオン交換クロマトグラフィー，ァフィ-ティークロマトグラフィー， HPLC等 の方法を用いて行うことができる。好ましくは，プロテイン Aカラムによるァフィユティー クロマトグラフィーを行う。精製したモノクローナル抗体のサブクラスは，市販のマウス モノクローナル抗体ァイソタイピングキットを用いてタイピングすることにより決定するこ とがでさる。
[0029] 本発明のモノクローナル抗体をコードする抗体遺伝子の塩基配列は，得られたモノ クローナル抗体産生細胞の遺伝子を解析することにより得ることができる。モノクロ一 ナル抗体産生細胞力ゝら全 RNAを抽出し，これを铸型としてリバーストランスクリプター ゼを用いて cDNA断片を調整する。次に，適切に設計されたプライマーを用いて PC Rにより抗体遺伝子の V領域を増幅し，この領域の cDNAの塩基配列を決定する。
[0030] 本発明のモノクローナル抗体の結合の特異性は， ELISA, RIA,免疫薄層クロマト グラフィー， BIAcore,蛍光抗体法等の当該技術分野において知られる方法を用いて 確認することができる。例えば， DGK o;を固定ィ匕したマイクロプレートに， 2倍希釈系 列の本発明のモノクローナル抗体を加えてインキュベートした後，酵素標識二次抗体 を加え，基質を加えて発色させ，マイクロプレートリーダーで吸光度を測定する。
[0031] 本発明の抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を利用して，遺伝子組換え技術を 用いて組換え型の抗体を製造することができる。組換え型の抗 DGK aモノクローナ ル抗体を製造するためには，本発明の抗体をコードする遺伝子を適当な発現べクタ 一に組み込み，宿主細胞に導入する。宿主細胞としては，大腸菌，酵母，哺乳動物 細胞，昆虫細胞，植物細胞などを用いることができ，特に哺乳類細胞，例えば， CHO , COS, BHKを用いることが好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は，例えば塩ィ匕 カルシウム法，リン酸カルシウム法， DEAEデキストラン法，カチオン性リボソーム DOT AP (ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法，エレクト口ポーレーシヨン法，リボフ ェクシヨンなどの方法により行うことができる。得られた形質転換宿主細胞を培養し， 抗体を発現させることにより，組換え型の抗体を製造することができる。
[0032] キメラ抗体とは，ある動物（例えばマウス）に由来する抗体の重鎖可変領域および軽 鎖可変領域と，他の動物 (例えばヒト）に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定 常領域力も構成される抗体である。キメラ抗体は， DGK aに結合するモノクローナル 抗体を生産するハイブリドーマから，抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコ ードする cDNAをクローニングし，一方，他の動物に由来する抗体の重鎖定常領域 および軽鎖定常領域をコードする cDNAをクローユングし，これらを組み合わせて適 当な発現ベクター中に挿入して，宿主細胞中で発現させることにより，組換え的に製 造することができる。
[0033] CDR移植抗体は，ある動物（例えばマウス）の抗体の相補性決定領域 (CDR)を別 の動物（例えばヒト）の抗体の相補性決定領域に移植した抗体である。 CDR移植抗 体をコードする遺伝子は， DGK o;に結合するモノクローナル抗体を生産するハイプリ ドーマ力 クローユングされた抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配 列に基づいて，それぞれ CDR1 , 2, 3をコードする遺伝子配列を設計し，他の動物 に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むベ クタ一中の対応する CDR1, 2, 3の配列と置き換えることにより得ることができる。例 えば，マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域とを連結するように設計した 数個のプライマーを用いて， PCR法により合成することができる。あるいは，合成 DN Aを用いて全配列を構築してもよい。この発現ベクターを適当な宿主細胞中で発現さ せることにより， CDR移植抗体を組換え的に製造することができる。 [0034] DGK aに結合しうる Fab, F(ab')2, Fab', scFv,ディアボディー等の抗体断片は，上 述の本発明の抗 DGK aモノクローナル抗体をパパイン，トリプシン等の酵素で処理 するか，またはこれらをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導 入して形質転換体を得ることにより，製造することができる。
[0035] DGK a遣伝子の発現抑制剤
DGK a阻害剤の他の例としては，アンチセンスオリゴヌクレオチド，リボザィム， RN A干渉（RNAi)を引き起こす分子（例えば， dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA)等 の， DGK a遺伝子の発現 (転写および Zまたは翻訳）の抑制剤を挙げることができる 。このような核酸は， DGK a遺伝子または DGK aをコードする mRNAに結合しその 発現を阻害することができる。アンチセンス，リボザィム技術および RNAi技術を用い て遺伝子発現を制御する一般的方法，またはこのようにして外因性遺伝子を発現さ せる遺伝子治療方法は当該技術分野にぉ 、てよく知られて 、る。
[0036] アンチセンスオリゴヌクレオチドとは， DGK aをコードする mRNAと相補的な配列を 有する核酸分子またはその誘導体を表す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは， mRN Aと特異的に結合し，転写および Zまたは翻訳を阻害することによりタンパク質の発 現を阻害する。結合はワトソン 'クリックまたはフーダスティーン型の塩基対相補性に よるものでもよく，トリプレックス形成によるものでもよ ヽ。
[0037] リボザィムとは，触媒的特性を有する 1またはそれ以上の RNAの RNA構造を表す 。リボザィムは，一般に，エンドヌクレアーゼ，リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す 。種々の二次構造のリボザィム，例えばハンマーヘッドタイプおよびヘアピンタイプの リボザィムが知られている。 RN A干渉 (RNAi)とは，二本鎖 RN A分子を用いて標的 遺伝子をサイレンシングする手法を 、う。
[0038] 医蓉製剤および投与
DGK a阻害剤は，そのまま投与することも可能であるが，通常，医薬で用いられる 担体を用いて製剤される。製剤に用いる担体としては，製剤分野で常用されるいず れのものをも用いることができ，例えば，滅菌水，生理食塩水，賦形剤，安定剤，酸 化防止剤，緩衝剤，界面活性剤，結合剤等が好ましく用いられる。さらに， DGK a阻 害剤をマイクロカプセルや高分子ゲル中に封入して，徐放性製剤としてもょ ヽ。 [0039] 本発明の抗癌剤の投与経路は，経口投与，静脈内投与，皮内投与，皮下投与，筋 肉内投与，体腔内投与等が挙げられる。好ましくは，疾患部位に直接または経皮的 に投与するか，あるいは，カテーテル等を用いて直接注入してもよい。本発明の抗癌 剤をメラノーマ治療に用いる場合には，直接あるいは，皮下注射により投与すること ができる。
[0040] 投与量は， DGK a阻害剤の種類や投与経路，疾患の程度等に応じて適宜選択さ れるが，疾患部位に直接投与する場合，通常， lO /z g lOmg,好ましくは， 500 g〜 500mgである。非経口投与，例えば静脈注射等では，通常， l /z g lmg/Kg,好ましく 20 μ g〜20mg/Kgである。
[0041] スクリーニング方法
別の観点においては，本発明は，多様な試験物質から，抗癌剤，癌細胞のアポト 一シス誘導剤，メラノーマ細胞のアポトーシス誘導剤，または NF- κ Bの発現の抑制 剤の候補物質をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニングは，試験物質を D GK aと接触させ，この試験物質力 ¾GK aの発現または酵素活性を阻害するか否か を判定することにより行うことができる。試験物質が DGK aの発現を阻害する能力は， 既知の方法により DGK aの mRNA量またはタンパク質量を測定することにより評価す ることができる。試験物質力 ¾GK aの酵素活性を阻害する能力は，既知の方法により ジァシルグリセロールキナーゼ活性を測定することにより評価することができる。これ らのアツセィにより， DGK o;の発現または酵素活性を阻害するものとして同定された 物質は，抗癌剤，癌細胞のアポトーシス誘導剤，メラノーマ細胞のアポトーシス誘導 剤，または NF- κ Bの発現の抑制剤の候補物質であると考えられる。
[0042] 試験物質は，種々の合成又は天然の化合物ライブラリー，コンビナトリアルライブラ リー，オリゴヌクレオチドライブラリー，ペプチドライブラリ一等のライブラリ一力も得るこ とができる。また，細菌，真菌類，藻類，植物，動物等の天然物からの抽出物やその 部分精製物を試験物質として用いてもょ ヽ。
[0043] 本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て 本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎とな る出願である日本特許出願 2006— 095258号の明細書および図面に記載の内容 は全て本明細書の一部としてここに引用する。
実施例
[0044] 以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例によ り限定されるものではない。
[0045] ^r
ΐ ·雄
ヒトメラノーマ由来細胞株 AKIと MMAcは北海道大学遺伝子病制御研究所，守内哲 也，濱田淳一両博士より， 70W, G361, SK-mel-23, SK- mel- 118は Sloan Kettering Cancer Center, Houghton博士より供与された。正常ヒト表皮メラノサイト（NHEM)は クラボウより購入した。メラノーマ由来細胞は， 10%ゥシ胎仔血清（Roche Diagnostics , Germany) ,ペニシリン Gナトリウム（100 U/ml)および硫酸ストレプトマイシン（100 μ g/ml)を添カ卩したダルベッコ改変イーグル培地（Sigma- Aldrich, U.S.A.)中で， CO インキュベーター（5% CO , 37°C)を用いて培養した。 NHEMの培養は，ゥシ脳下
2 2
垂体抽出液 (0.2%V/V) ,ゥシ胎仔血清 (0.5%V/V) ,ヒト組換え型塩基性繊維芽細 胞増殖因子（3 ng/ml) ,ハイド口コーチゾン（5 X 10- 7 M) ,インスリン（5 g/ml) ,ト ランスフェリン（5 g/ml) ,ホルボールミリステートアセテート（10 ng/ml) ,へパリン（
3 g/ml)を添カ卩した Medium 254 (Cascade Biologies, U.S.A.)中で， COインキュ
2 ベータ一（5% CO , 37 °C)を用いて行った。
2
[0046] 2.発現ベクター
野生型（WT)ブタ DGK a (Sakane F, et al.， Nature. 1990; 344: 345- 348) ,キ ナーゼ不活性（kinase- dead)型 (KD)-ブタ DGK a (G435D) (Yamada K, et al.， Bio chem Biophys Res Commun. 2003; 305: 101- 107) ,野生型ラット DGK jS (Goto K, and Kondo H. Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90: 7598-7602) ,および 野生型ヒト DGK y (Kai M, et al, J Biol Chem. 1994; 269: 18492- 18498)を， pEGFP- C3 Vector (タカラバイオ-クロンテック）に組み込み，グリーン蛍光タンパク質 (GFP)との融合タンパク質として発現させた。発現ベクターの導入は， Effectene tran sfection reagent (Qiagen, Germany)を用 ヽ。添付のフ—口トコ ~~ノレ【こ従 ヽ行つ 7こ。
[0047] 3.短 ^f^RNA siRNA) GFP (コントロール）， DGK a , DGK yをノックダウンする siRNAは，以下の配列を有す るように設計した：
GFP センス ; 5'-ACGGCAUCAAGGUGAACUUCAAGAU-AG-3' (配列番号 2) , GFP アンチセンス； 3'- UA- UGCCGUAGUUCCACUUGAAGUUCUA- 5' (配列番号 3) ,
DGK a アンチセンス ; 5'-CAAAGAUCCUCAAGGAUUUAGAGAU-AG-3' (配列番 号 4) ,
DGK a アンチセンス ; 3'-UA-GUUUCUAGGAGUUCCUAAAUCUCUA-5' (配列番 号 5) ,
DGK γ センス； 5 -CCAAAGAACUGAAAUUCUGCGUUCA-AG-3' (配列番号 6) , DGK γ アンチセンス； 3 -GGUUUCUUGACUUUAAGACGCAGU-5' (配列番号 7) siRNAの導入は， HiPerFect transfection reagent (Qiagen)を用い，添付のプロトコ ールに従い行った。
4.ウェスタンブロット法
各種発現ベクターまたは siRNAを導入した細胞をリシスバッファ（150 mM NaCl, 2 0 mM Tris-HCl (pH 7.2), 1 mM EDTA, 1 mM フッ化フエ-ルメチルスルホ- ル，プロテアーゼインヒビターカクテル（1 錠 /50ml, Roche Diagnostics) )にて融解し ,超音波処理 (4 °C)により破砕後， 4 °C, 5分， 3000 rpmで遠心分離し，上清 (溶 解物）を回収した。この溶解物の一部を用い，蛋白量を BCA プロテインアツセィ（Pie rce Biotechnology, U.S.A.)により定量した。残りに 5分の 1容量のドデシル硫酸ナト リウム（SDS) -サンプルバッファ（125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 10% SDS, 50% グ リセロール， 10% 2-メルカプトエタノール， 0.005% ブロモフエノールブルー）をカロえ , 100 °C, 5分煮沸し，これを SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE)用試料と した。 SDS- PAGEを行った後，ポリビ-リデンジフルオリド膜（Bio- Rad Laboratories, U.S.A.)へ転写 (400 mA, 1時間）し，転写膜をブロックエース（大日本製薬)でブロッ キングした。抗 DGK a抗体（Kanoh H, et al.， J Biol Chem. 1986; 261: 5597- 5602) ,抗ァクチン抗体（Santa Cruz Biotechnology, U.S.A.)または抗 GFP抗体（Sa nta Cruz Biotechnology)をブロックエースで希釈し， 1時間反応させた。洗浄後，そ れぞれの一次抗体に応じたペルォキシダーゼ標識二次抗体（Jackson Immunoresea rch Laboratories, U.S.A.)と反応させた。洗浄後， ECLウェスタンブロッテイング検 出シスアム (Amersham Biosciences, U.K.)を用 ヽて発光 せ, Hyperfilm (Amersha m Biosciences)に露光させてバンドを検出した。バンドの濃さは Image Jソフトウェア（ National Institute of Health, U.S.A.)を用いて定量した。
[0049] 5.リバーストランスクリプターゼ (RT)-ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)
各細胞から ISOGEN (二ツボンジーン）を用いて総 RNAを抽出した。 5 gの総 R NA り Superscript First— ¾trana synthesis System (Invitrogen, U.S.Ajを用 ヽて c DNAを合成した。この第 1鎖 cDNA (500 ng 総 RNA相当）に Ex Taq ポリメラーゼ（タ カラバイオ）とヒト DGK α特異的プライマー（Yamada K, et al.， Biochem Biophys Res Commun. 2003; 305: 101- 107)を加え， 94°C, 4分の初期変性に続いて， 94 °C, 30秒（変性）， 60°C, 30秒（アニーリング）， 72°C, 2分（伸長）のサイクルを 30回繰り 返す遺伝子増幅を行った。コントロールとして，ダリセルアルデヒド- 3-リン酸 デヒドロ ゲナーゼ cDNAを 25サイクルの PCRで増幅した。 PCR産物はァガロースゲル電気泳動 を行い分離し，臭化工チジゥム染色により検出した。
[0050] 6.アポトーシスの檢出
ポリ- L-リジンでコートしたカバーグラスに細胞を播種し，各種発現ベクターまたは si RNAを導入し，導入 24時間後に 50 ng/ml TNF- a (Strathmann Biotec AG, Ger many)をカ卩ぇアポトーシスを誘導した。更に 24時間インキュベーション後， 3.7% ホル ムアルデヒドを用いて固定した。 0.1% Triton Χ-100を用いて透過性を高めた後， In
Situ Cell Death Detection Kit (Roche Diagnostics)を用いて， TdT 媒介 dUTP ニック末端ラベル（TUNEL)法に基づく染色を行った。 Vectashield (Vector Laborat ories, U.S.A.)を用いて封入し，共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss LSM 510)にて 1,00 0個以上の細胞を観察し，陽性細胞をカウントした。
[0051] 7.
ポリ- L-リジンにてコートしたカバーグラスに細胞を播種し，各種発現ベクターまたは siRNAを導入し， 24時間後に 50 ng/ml TNF- αを加えアポトーシスを誘導した。更 に 24時間インキュベーション後， 3.7% ホルムアルデヒドを用いて固定した。 0.1 % T riton X-100を用いて透過性を高めた後， 2% ゥシ血清アルブミン/ PBSで希釈した 抗 DGK a抗体または抗 NF- κ Β抗体（Santa Cruz Biotechnology)と 1時間反応させ た。洗浄後，それぞれの一次抗体に応じた Alexa Fluor 488または Alexa Fluor 59 4を結合した二次抗体（Eugene, U.S.A.)と反応させた。 Vectashieldを用いて封入し， 共焦点レーザー顕微鏡 (Zeiss LSM 510)にて細胞内局在を観察した。
[0052] 8. NF- κ B活性の測定
NF- κ Bのプロモーター配列と，その下流にルシフェラーゼ cDNAがレポーターとし て組み込まれて 、る pNF- κ B-Luc Vector (タカラバイオ-クロンテック）を各種発現 ベクターまたは siRNAと共に AKIメラノーマ細胞に導入し，導入後 24時間後に 50 ng/ ml TNF- αをカ卩ぇアポトーシスを誘導した。更に 12時間後，細胞を Glo Lysis Buffer (Promega, U.S.A.)にて融解し，ルシフェラーゼの基質（Steady- Glo, Promega)をカロ えて反応させた。ルシフェラーゼによる発光は Wallac 1420 ARVOsxマルチラベル プレートリーダー（PerkinElmer, U.S.A.)を用いて測定した。なお，ルシフェラーゼ活 性は， pSV- j8 - Galactosidase Control Vector (Promega)をコトランスフエクシヨンして β -ガラタトシダーゼ活性を測定し，発現効率を求めて補正した。
[0053] 睡菓
1 . Τ型 DGKのメラノーマ細胞 ΊΗ常メラノサイトにおける 現
これまでに， DGKアイソザィムのメラノーマ細胞における発現の有無は全く明らかに なって ヽな 、。そこで，まず I型 DGK ( α -, β -, γ -ァイソザィム）の mRNAとタンパク 質の発現を， RT-PCR法とウェスタンブロット法により調べた。その結果， 6種のメラノ一 マ細胞の全てで， DGK a mRNAが検出された（表 1)。
[0054] [表 1] 表 1 メラノーマ細胞における I型 DGKの発現
Figure imgf000020_0001
[0055] 各種メラノーマ細胞の溶解物（15 /z gタンパク質）を用い， SDS-PAGEで分離後， I 型 DGK , β , γ )のタンパク質の発現を各ァイソザィムに特異的な抗体を用いた ウェスタンブロット法 (WB)により解析した。また， I型 DGK の mRNAの発現は， 500 ngの総 RNAを用い，各ァイソザィム特異的プライマーを用いた RT-PCR後のァガロー ス電機泳動/臭化工チジゥム染色により解析した。 + :検出される; N.D.: 検出されな い。
[0056] DGK aタンパク質は，調べた全てのメラノーマ細胞で検出された。しかし，他の I型 アイソザィムである DGK βと DGK γの mRNAとタンパク質は， DGK aのそれらを検出 したものと同様の条件下では検出できな力つた。したがって，調べた限りのメラノーマ 細胞では α -アイソザィムのみが発現していることが明らかになった。 DGK a発現細 胞の代表例として， AKI細胞を用いて得られたウェスタンブロット法および RT-PCR法 の結果を，それぞれ図 1Aおよび図 1Bに示す。ウェスタンブロット法では，クローンィ匕さ れた DGK a cDNAの計算分子量と一致する 80K以外に分子量 60Kの位置にもバンド が認められる（図 1A)が，これはタンパク質分解酵素による分解産物，もしくは未同定 の選択的スプライス産物であると考えられる。
[0057] 次に，共焦点レーザー顕微鏡を用い，抗 DGK a抗体を用いた間接免疫蛍光法に より， AKI細胞の内在性 DGK aの細胞内局在を確認したところ，主に核内に局在する ことが明らかになった（図 1C)。コントロールとしては，抗 DGK o;抗体の代りに正常家 兎 IgGを用いた。バー： 10 ^ mo
[0058] 一方，正常メラノサイトでの DGK aの発現を検討したところ，興味あることに，メラノ サイトには本ァイソザィムの mRNA,タンパク質共に検出されなかった（図 1Aおよび B) 。この結果は， DGK a が色素細胞系ではメラノーマ細胞特異的に発現しており，そ の発現は主に転写レベルで調節されて 、ることを示して 、る。
[0059] 2. AKIメラノーマ細胞のアポトーシスに対する DGK aの渦剰発現またはノックダウン の影響
DGK aがメラノーマ細胞に特ィ匕した機能をもっていることが示唆されたので，その 機能を明らかにすることを試みた。メラノーマ細胞は種々の刺激や薬剤によって誘導 されるアポトーシスに高い抵抗性を示すことが知られている。そこで，次に， AKI細胞 を用いて DGK a を過剰発現，または逆に内在性の DGK a の発現量を低下させ ることによって，メラノーマ細胞のアポトーシスにおける本ァイソザィムの寄与'役割を 検討した。
[0060] まず， DGK a の過剰発現のアポトーシスに及ぼす影響を調べた。結果を図 2に示 す。 AKIメラノーマ細胞にコントロールベクター（pEGFP alone) , pEGFP- DGK α - WT , pEGFP-DGK a -KD, pEGFP- DGK j8 - WTまたは pEGFP- DGK y - WTを遺伝子導 入し，導入 24時間後に TNF- α (50 ng/ml)をカ卩え，更に 24時間インキュベーションし た。 24 hインキュベーション終了後，細胞溶解物（10 g)を SDS-PAGEにより分離し ,抗 GFP抗体を用いてウェスタンブロットを行い，各タンパク質の発現を確認した（図 2 A)。分子量 (M.W.)マーカーの位置を左側に示した。次に，インキュベーション終了 後， TUNEL染色を行い，共焦点レーザー顕微鏡にて観察した（図 2B)。 GFP融合タン パク質が発現し且つ TUNEL染色陽性の細胞をカウントし， GFP陽性細胞数全体に占 める割合 (％)を求めた。結果は独立した 3回の実験から得られた平均士標準偏差で 示した。
[0061] その結果， DGK a -WTの過剰発現（図 2A)によって， AKI細胞の TNF- aによって 誘導されるアポトーシスが顕著に阻害されることを見出した（図 2B)。しかし，キナーゼ 不活性型である DGK a - KDでは，ほぼ同レベルの発現が認められるにもかかわら ず（図 2A) ,この様な効果は観察されな力つた（図 2B)。この結果は， DGK aによるァ ポトーシス抑制には DGK aの触媒活性が必須であることを示している。他の I型ァイソ ザィムである DGK β -WTと DGK y -WTの過剰発現ではアポトーシスの阻害は観察さ れず，かえって上昇させる傾向が認められた。したがって，この AKIメラノーマ細胞に おけるアポトーシス抑制には DGK aアイソザィムのみが関与することが強く示唆され た。
[0062] 次に，過剰発現系とは逆に， siRNAによる DGK aタンパク質のノックダウン (発現量 低下）実験を行った。 AKIメラノーマ細胞にコントロール（GFP) , DGK a ,または DGK γの siRNAを導入し，導入 24時間後に TNF- a (50 ng/ml)を加え，更に 24時間イン キュベーシヨンした。インキュベーション終了後，細胞溶解物（10 μ g)を SDS-PAGE により分離し， DGK a抗体にてウェスタンブロットを行い， DGK αタンパク質の発現量 低下を確認した（図 3A)。 DGK a (80Kと 60K)の各バンドの濃さを定量し，コントロー ルと比較した相対値を下段に示した。次に，インキュベーション終了後， TUNEL染色 を行い，共焦点レーザー顕微鏡にてアポトーシス細胞をカウントし，全体の細胞数に 占める割合 (％)を求めた。結果は独立した 3回の実験から得られた平均士標準偏差 で示した（図 3B)。
[0063] 図 3Aに示すように，特異的 siRNAの導入により DGK aタンパク質（80Kと 60Kバンド の両者)の発現量が著しく低下 (約 70%阻害)することが確認された。そして，コント口 ールに比べ， DGK aのノックダウンにより， TNF- αによって誘導されるアポトーシスが 顕著に亢進することが明らかになった（図 3B)。しかし， DGK yの siRNAではこのような 効果は認められな力つた。この結果は， a -アイソザィムが特異的にアポトーシス抑制 に関与することを更に支持するものである。
[0064] 3. AKIメラノーマ細胞の NF- κ Β活件に針する DGK aの渦剰発現またはノックダウン の影響
メラノーマ細胞が TNF- aによって刺激されると，最終的にはアポトーシスが誘導さ れるが，他方，抗アポトーシス効果として， p65を含む NF- κ Bが核内へ移行し，アポト 一シス抑制因子をはじめとする様々なタンパク質の転写が促進される。したがって， D GK aの過剰発現，またはノックダウンによる NF- κ Bの核内局在への影響を調べた。 結果を図 4に示す。
[0065] AKIメラノーマ細胞にコントロールベクター（pEGFP alone) , pEGFP-DGK a -WT, または pEGFP- DGK a - KDを導入し，導入 24時間後に TNF- a (50 ng/ml)を加え， 更に 12時間インキュベーションした。インキュベーション終了後，抗 NF- κ B (p65)抗 体を用いて染色 (赤色）し，共焦点レーザー顕微鏡にて， GFP融合タンパク質が発現 した細胞における NF- κ B (p65)の細胞内局在性を観察した（図 4A)。バー：10 ^ m 。次に， Image J ソフトを使用し，各条件下での核 Z細胞質に存在する NF- κ B (p65 )の蛍光強度比を解析した（図 4B)。結果は独立した 3回の実験 (それぞれ 20個以上 の細胞を解析)カゝら得られた平均士標準偏差で示した。
[0066] さらに， AKIメラノーマ細胞にコントロール（GFP) , DGK a ,または DGK yの siRNA を導入し，導入 24時間後に TNF- a (50 ng/ml)を加え，更に 12時間インキュベーショ ンした。インキュベーション終了後，抗 NF- K B (P65)抗体を用いて染色し，共焦点レ 一ザ一顕微鏡にて NF- K B (P65)の細胞内局在性を検討した（図 4C)。バー： 10 m 。次に， Image Jソフトを使用し，各条件下での核 Z細胞質に存在する NF- κ B (p65) の蛍光強度比を解析した（図 4D)。結果は独立した 3回の実験 (それぞれ 20個以上の 細胞を解析)力 得られた平均士標準偏差で示した。
[0067] TNF- a刺激時の AKI細胞の細胞質中と核内に存在する p65の割合を測定したとこ ろ， DGK a -WTの過剰発現により，その核内局在の割合が顕著に上昇した（図 4Aお よび B)。なお，この際， p65の発現量には殆ど変化がないことを確認している（データ 示さず)。しかし， DGK a - KDではこの様な効果は観察されなかった。この結果は， D GK o;によるアポトーシス抑制現象は核内局在 NF- κ Bの比率上昇と関連しており， 両者共に酵素の触媒活性が必須であることを示している。一方， DGK o;の siRNAによ るノックダウンによっては，逆に核内に存在する p65の割合がコントロールに比べ下降 した（図 4Cおよび D)。更に， DGK yの siRNAではこのような効果は認められないこと を確認した。
[0068] 次に，実際に NF- κ Bの転写活性が上昇して 、るか否かをルシフェラーゼレポータ 一アツセィによって検討した。 AKIメラノーマ細胞にコントロールベクター（pEGFP alo ne) , pEGFP-DGK a -WT,または pEGFP- DGK α - KDを遺伝子導入し，導入 24時間 後に TNF- α (50 ng/ml)をカ卩えた。更に 12時間インキュベーションし，細胞を回収し ,ルシフェラーゼ活性を測定した（図 5A)。活性はコントロール細胞を 100%とした相 対値で表した。結果は独立した 3回の実験力 得られた平均士標準偏差で示した。
[0069] DGK a -WTの過剰発現により， TNF- α存在，非存在下いずれにおいても， NF- κ Bの転写活性が明らかに上昇した。しかし，不活性型 DGK o;ではこの様な効果は観 察されなかった。したがって， DGK aによる NF- κ Β活性上昇には，やはり DGK aの 触媒活性が必須であることが明らかになった。この事実は NF- κ Bの核内移行促進の ためには DGK aの活性が必須であること（図 4)と良く一致している。
[0070] 次に AKIメラノーマ細胞に GFP (コントロール），または DGK aの siRNAを導入し，導 入 24時間後に TNF- α (50 ng/ml)をカ卩えた。更に 12時間インキュベーションし，細胞 を回収し，ルシフェラーゼ活性を測定した（図 5B)。活性はコントロール細胞を 100%と した相対値で表した。結果は独立した 3回の実験力 得られた平均士標準偏差で示 した。 DGK aの siRNAによるノックダウンでは，逆に NF- κ B活性が下降した以上の結 果を総合すると， DGK aはその触媒活性を介して NF- κ Βの転写活性を正に制御し ていることが明らかになった。また， DGK aによるアポトーシスの抑制と NF- κ Βの活 性亢進が密接な関係があることを示唆して 、る。
[0071] さらに， DGK a依存性のアポトーシス抑制と NF- κ Βの活性亢進との関係を確かめ るために， DGK a -WTの過剰発現によって引き起こされたアポトーシス抑制に及ぼ す NF- κ B阻害剤の影響を検討した。まず， AKIメラノーマ細胞にコントロールベクタ 一（pEGFP alone) ,または pEGFP-DGK α -WTを遺伝子導入し，導入 23時間後に M G-132 (5 μ Μ)をカ卩ぇ 1時間インキュベーションした。更に TNF- a (50 ng/ml)をカロ えてインキュベーションした。 12時間のインキュベーション後，細胞を回収し，ルシフエ ラーゼ活性を測定した（図 6A)。活性はコントロール細胞を 100%とした相対値で表し た。結果は独立した 3回の実験力も得られた平均士標準偏差で示した。その結果， N F- κ B阻害剤（MG-132)の添カ卩により， DGK a -WTの過剰発現によって上昇した TN F- a依存性の NF- κ B活性がほぼコントロールレベルまで阻害されることが確認され た。
[0072] 次に， 24時間のインキュベーション後， TUNEL染色を行った。共焦点レーザー顕微 鏡にて， GFP融合タンパク質が発現し且つ TUNEL染色陽性の細胞をカウントし， GFP 陽性細胞数全体に占める割合（％)を求めた（図 6B)。誘導されたアポトーシスの程度 は，コントロール細胞を 100%とした相対値で表した。独立に 2回繰り返した実験でほ ぼ同様の結果が得られ，そのうちの代表的なものを示した。その結果，図 2Bで認めら れたように DGK a -WTの過剰発現によって TNF- a -誘導アポトーシスが顕著に抑制 されたが， MG-132はこの DGK aの抗アポトーシス効果を完全に無効化することが明 らかになつた。以上の結果は， DGK aによるアポトーシスの抑制は確かに NF- κ Βの 活性亢進を介して 、ることを示して！/、る。
[0073] 5.動物実験
本発明の DGK a阻害剤が癌を抑制する効果は、公知の文献 (例えば、 Y.Takei, et al, Cancer Res., 64, 3365 (2004) ;Y.Minakuchi, et al, Nucleic Acids Res. , 32, el09 (2004) ; F.Takeshita, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 102, 1 2177 (2005))に記載の方法にしたがって、動物で実験することができる。
[0074] 皮膚癌細胞としては、 Mouse B16F1 メラノーマ細胞を用いる。動物としては、雌 C5 7BL/6J マウス （4週齢， 10 gm)を用いる。癌を形成させるためには、 0.1 ml リン 酸緩衝ィ匕食塩水に懸濁した約 lxlO5個の B16F1 メラノーマ細胞を C57BL/6J マウス の左脇腹に皮下注射する。 7〜10日後に形成した癌の体積を測定する。
[0075] DGK a特異的 siRNAの効果は、以下のようにして測定する。 B16F1 メラノーマ細胞 の皮下注射 48時間後に，ァテロコラーゲン (AteloGene (商標）；株式会社 高研）と混 合した DGK a特異的 siRNAを局所 (皮下)または全身 (静注)投与する。 DGK a特異 的 siRNAと AteloGeneの混合比および濃度、ならびに DGK a特異的 siRNAの投与時 期について、種々の条件を設定することができる。 5〜8日後に形成した癌の体積を 測定し， DGK o;特異的 siRNAの効果を検定する。
産業上の利用可能性
[0076] 本発明の抗癌剤は，癌，特にメラノーマの治療に有用である。また，本発明は，抗 癌剤の候補物質のスクリーニングにも有用である。

Claims

請求の範囲
[1] DGK a阻害剤を有効成分として含有する抗癌剤。
[2] 前記 DGK a阻害剤が，抗 DGK a抗体， DGK a遺伝子に対するアンチセンス'オリゴ ヌクレオチド，リボザィムおよび siRNA,および， 3- [2- [4- [ビス- (4-フルオロフェ -ル） メチレン]- 1-ピベリジ-ル]ェチル ]-2,3-ジヒドロ- 2-チォキソ -4(1H)キナゾリノンおよび 6-[2-[4-[(4-フルオロフェ -ル)フエ-ルメチレン]- 1-ピベリジ-ル]ェチル ]-7-メチル- 5H-チアゾロ (3,2-a)ピリミジン- 5-オン力もなる群より選択される，請求項 1記載の抗癌 剤。
[3] DGK a阻害剤を有効成分として含有する，癌細胞のアポトーシス誘導剤。
[4] 前記 DGK a阻害剤が，抗 DGK a抗体， DGK a遺伝子に対するアンチセンス'オリゴ ヌクレオチド，リボザィムおよび siRNA,および， 3- [2- [4- [ビス- (4-フルオロフェ -ル） メチレン]- 1-ピベリジ-ル]ェチル ]-2,3-ジヒドロ- 2-チォキソ -4(1H)キナゾリノンおよび 6-[2-[4-[(4-フルオロフェ -ル)フエ-ルメチレン]- 1-ピベリジ-ル]ェチル ]-7-メチル- 5H-チアゾロ (3,2-a)ピリミジン- 5-オン力もなる群より選択される，請求項 3記載の癌細 胞のアポトーシス誘導剤。
[5] DGK a阻害剤を有効成分として含有する，メラノーマ細胞のアポトーシス誘導剤。
[6] 前記 DGK a阻害剤が，抗 DGK a抗体， DGK a遺伝子に対するアンチセンス'オリゴ ヌクレオチド，リボザィムおよび siRNA,および， 3- [2- [4- [ビス- (4-フルオロフェ -ル） メチレン]- 1-ピベリジ-ル]ェチル ]-2,3-ジヒドロ- 2-チォキソ -4(1H)キナゾリノンおよび 6-[2-[4-[(4-フルオロフェ -ル)フエ-ルメチレン]- 1-ピベリジ-ル]ェチル ]-7-メチル- 5H-チアゾロ (3,2-a)ピリミジン- 5-オン力もなる群より選択される，請求項 5記載のメラノ 一マ細胞のアポトーシス誘導剤。
[7] DGK a阻害剤を有効成分として含有する， NF- κ Βの発現の抑制剤。
[8] 前記 DGK a阻害剤が，抗 DGK a抗体， DGK a遺伝子に対するアンチセンス'オリゴ ヌクレオチド，リボザィムおよび siRNA,および， 3- [2- [4- [ビス- (4-フルオロフェ -ル） メチレン]- 1-ピベリジ-ル]ェチル ]-2,3-ジヒドロ- 2-チォキソ -4(1H)キナゾリノンおよび 6-[2-[4-[(4-フルオロフェ -ル)フエ-ルメチレン]- 1-ピベリジ-ル]ェチル ]-7-メチル- 5H-チアゾロ (3,2-a)ピリミジン- 5-オン力もなる群より選択される，請求項 7記載の NF- κ Bの発現の抑制剤。
抗癌剤，癌細胞のアポトーシス誘導剤，メラノーマ細胞のアポトーシス誘導剤または N F- κ Bの発現の抑制剤の候補物質を同定する方法であって，試験物質を DGK aを 発現する細胞と接触させ，前記試験物質が DGK aの発現および Zまたは機能を阻 害するカゝ否かを判定することを含む方法。
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