WO2007113365A1 - Uso de péptidos derivados de la lactoferrina en la preparación de medicamentos inhibidores de la enzima conversora de angiotensina i - Google Patents

Uso de péptidos derivados de la lactoferrina en la preparación de medicamentos inhibidores de la enzima conversora de angiotensina i Download PDF

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    • A61P9/12—Antihypertensives

Definitions

  • lactoferrin-derived peptides in the preparation of angiotensin I converting enzyme inhibitor medications
  • Hypertension which consists of an increase in blood pressure higher than that desirable for health, is a very serious health problem since it is related to a high risk of cardio- and cerebrovascular complications.
  • the acute stroke also called stroke, constitutes, after ischemic heart disease and cancer, Ia
  • renin-angiotensin system intervenes, and of which the renin, Ia converting enzyme of angiotensin (ACE), aldosterone, and angiotensins I and II.
  • SRA is a circulating hormonal system, and specifically the renin and the RCT are two peptidases that are part of it and that act sequentially on a series of small peptides, ultimately regulators of blood pressure.
  • renin is released in the kidney and ACE is mainly present in vascular endothelial cells, in the lungs, in the kidneys and in the brain.
  • This renin-angiotensin system is activated in certain situations by means of the action of the renin on a precursor peptide called angiotensinogen (of hepatic origin), which becomes the angiotensin I decapeptide.
  • angiotensinogen of hepatic origin
  • This angiotensin I inactive from the biological point of view, is in turn transformed by the action of the RCT into angiotensin Il when the dipeptide is separated from its C-terminal end.
  • the angiotensin Il generated is a potent vasoconstrictor that exerts its action after binding to its specific receptors called “ATY receptors.” This action translates into the contraction of blood vessels that consequently produces an increase in blood pressure.
  • the ECA also acts on another circulating peptide, the nonapeptide called bradykinin, a potent vasodilator agent that loses this characteristic when hydrolyzed.
  • SRA could have beneficial effects in the treatment of vascular disorders associated with hypertension.
  • the inhibition of the ECA activity would allow to reduce the formation of angiotensin II in addition to reducing the loss of functionality of the bradykinin, thus avoiding the vasoconstrictor action of the first and enhancing the vasodilator action of the second.
  • the efficacy of ACE inhibitors in reducing morbidity and mortality in patients with heart failure, cardio-metabolic syndrome and diabetes has been shown in numerous studies.
  • ACE inhibitor drugs Despite its proven efficacy in the treatment of cardiovascular diseases associated with hypertension, the currently available ACE inhibitor drugs cannot be considered as definitive option Due to their lack of specificity, these drugs are not well tolerated by some patients in whom undesirable side effects such as dry cough and angioedema occur; In addition, they do not completely block the synthesis of angiotensin Il since it follows other synthetic routes that do not depend on the RCT. Therefore, it is necessary to find new ACE inhibitors with greater specificity and that can be co-administered with other drugs, such as "angiotensin receptor blockers", for the optimal treatment of vascular disorders of hypertensive origin linked to ARS. while minimizing the aforementioned side effects. Even and depending on the characteristics of the selected inhibitors, a more natural approach to treatment could be achieved by adding said inhibitors to food, which would produce a positive effect both on said treatment and on the prevention of symptoms inherent in hypertension.
  • LKPNM a prodrug-type ACE-inhibitory peptide derived from fish protein. Immunopharmacology 44, 123-127; Pihlanto-Leppálá, A. (2001).
  • Lactoferrins are abundant glycoproteins in mammalian breast milk and have multiple biological functions, among which their antimicrobial properties stand out [Farnaud, S. and Evans, RW (2003). Lactoferrin - a multifunctional protein with antimicrobial properties. Molecular Immunology 40, 395-405; Orsi, N. (2004). The antimicrobial activity of lactoferrin: Current status and perspectives. BioMetals 17, 189-196].
  • Recombinant lactoferrins of human or cattle origin have been produced in fungi, plants and animals by means of recombinant DNA technology, with a view to obtaining therapeutic effects or for use in functional foods [Nandi, S., Suzuki, YA, Huang, JM, Yalda, D., Pham, P., Wu, LY, Bartley, G., Huang, N., and Lonnerdal, B. (2002). Expression of human lactoferrin in transgenic rice grains for the application in infant formula.
  • Lactoferricins are peptides isolated from the N-terminal region of LF by pepsin digestion, which have antimicrobial properties [Bellamy, W., Takase, M., Yamauchi, K., Wakabayashi, H., Kawase, K., and Tomita, M. (1992). Identification of the bactericidal domain of lactoferrin. Biochimica et Biophysica Acta 1121, 130-136; WO2004 / 089986, Antimicrobial peptide from transferrin family].
  • Bovine lactoferricin corresponds to residues 17-41 of LF and has potent antimicrobial activity [Bellamy, W., Takase, M., Yamauchi, K., Wakabayashi, H., Kawase, K., and Tomita, M. (1992). Identification of the bactericidal domain of lactoferrin. Biochimica et Biophysica Acta 1121, 130-136; Tomita, M., Wakabayashi, H., Yamauchi, K., Teraguchi, S., and Hayasawa, H. (2002). Bovine lactoferrin and lactoferricin derived from milk: production and applications. Biochemistry and CeII Biology 80, 109-112].
  • the present invention describes the amino acid sequence of a peptide of fifteen amino acid residues derived from bovine Lactoferricin, different from those mentioned above, previously described as antimicrobial [Strom, MB, Rekdal, O., and Svendsen, JS (2000) . Antibacterial activity of 15-residue lactoferricin derivatives. Journal of Peptide Research 56, 265-274; Strom, M. B., Haug, B. E., Rekdal, O., Skar, M. L., Stensen, W., and Svendsen, J. S. (2002). Important structural features of 15- residue lactoferricin derivatives and methods for improvement of antimicrobial activity. Biochemistry and CeII Biology 80, 65-74] and now characterized in the present invention for having ACE inhibitory activity.
  • the enzymatic hydrolysis of the LF also results in a mixture of peptides with different biological properties such as capacity antimicrobial [Min, S. and Krochta, JM (2005). Inhibition of Penicillium commune by edible whey protein films incorporating lactoferrin, lactoferrin hydrolysate, and lactoperoxidase systems. Journal of Food Science 70, M87- M94; Murdock, CA. and Matthews, KR (2002). Antibacterial activity of pepsin-digested lactoferrin on foodborne pathogens in buffered broth systems and ultra-hig temperature milk with EDTA. Journal of Applied Microbiology 93, 850-856; Masschalck, B., van Houdt, R.
  • the present invention describes the application of an enzymatic hydrolyzate of LF, obtained by digestion with pepsin, previously described as antimicrobial [Murdock, CA. and Matthews, K. R. (2002). Antibacterial activity of pepsin-digested lactoferrin on foodborne pathogens in buffered broth systems and ultra-hig temperature milk with EDTA.
  • LF necessarily contains either the SEQ ID NO 1 or SEQ ID NO2 peptides, or peptides containing sequences of said peptides.
  • the inhibition of the ECA activity is manifested in tests performed in vitro, measuring the inhibition of the conversion of artificial (HHL, Hipuril-Histidyl-Leucine) and natural (angiotensin I) mediated substrate substrates, and in ex vivo tests, measuring The decrease in the contraction of rabbit carotid arteries induced by exposure to angiotensin I.
  • the present invention is related to the pharmacological and agri-food industry sectors and consists in the identification and characterization of a peptide of fifteen amino acid residues (called LfcinB17-31; SEQ ID NO 1), and another that is a reduced fragment. thereof (called LfcinB20-25, SEQ ID NO 2) and in the application of an enzymatic LF hydrolyzate obtained with pepsin containing them, as effective inhibitors of the angiotensin converting enzyme (RCT) that is involved in Ia formation of the angiotensin compound Il which is a vasoconstrictor responsible, among other causes / mechanisms, for hypertension.
  • RCT angiotensin converting enzyme
  • Said peptide SEQ ID NO 1 is derived from the sequence of the bovine LF protein, of natural origin.
  • the inhibitory activity is manifested by a reduction of the ACE activity determined in in vitro assays, as well as by a reduction of the ECA contraction dependent ex vivo using artery segments. It is demonstrated that the peptide inhibitory activity corresponds to a characteristic amino acid sequence, since other small peptides do not have said activity.
  • the potential use of the ACE inhibitor peptides, the ACE inhibitor hydrolyzate, or inhibitor peptides derived therefrom, as bioactive compounds for the control of hypertension is described.
  • the ACE inhibitory activity of said peptides is described when Hipuril-Histidyl-Leucine (HHL) and angiotensin I are used as substrates.
  • HHL Hipuril-Histidyl-Leucine
  • angiotensin I angiotensin I
  • angiotensin converting enzyme involved in the mechanisms of control of blood pressure, as well as the application of an enzymatic hydrolyzate of LF obtained with pepsin is described which contains said peptides.
  • RCT angiotensin converting enzyme
  • its use as an ACE inhibitor through the use of artificial substrates such as Hipuril-Histidyl-Leucine (HHL) or natural such as angiotensin I, as well as its inhibitory effect on the ECA-dependent contraction of rabbit artery segments.
  • HHL Hipuril-Histidyl-Leucine
  • angiotensin I angiotensin I
  • the inhibitors described in the present invention are peptides with a sequence of fifteen characteristic amino acids: the first of fifteen amino acids SEQ ID NO 1 and the second of six amino acids SEQ ID NO 2 different from the previously known ACE inhibitor peptides, [Guan-Hong Li, Guo-Wei Le, Yong-Hui Shi and Sundar Shrestha (2004). Angiotensin I- converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins and their physiological and pharmacological effects. Nutrition Research 24, 469-486; Dziuba, J., Minkiewicz, P., Nalecz, D. and Iwaniak, A. (1999). Date of biologically active peptide sequences.
  • said peptide was chemically synthesized with the L-natural stereoisomers of the amino acids and then purified, following usual procedures for all those skilled in the area of knowledge of the present invention [Fields, GB and Noble, RL (1990). SoNd phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids. International Journal of Peptide and Protein Research 34, 161-214]
  • the present invention describes experimental tests that illustrate the activity of both hydrolyzate and SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO
  • the present invention also describes the absence of inhibitory activity in vitro with non-hydrolyzed LF and pepsin and other three peptides (SEQ ID N03 peptide P20D; SEQ ID N04, peptide P26D; and SEQ ID N05, P36D peptide; Figure 1)
  • the inhibitory activity of the hydrolyzate and the peptides described in the present invention is manifested with a reduction in the activity of the RCT when carrying out the in vitro tests under the established conditions, as is demonstrated by the experimental tests described in the present invention. .
  • the inhibitory activity of the hydrolyzate and the peptide described in the present invention is also manifested by a reduction in the contraction ECA-dependent rabbit carotid artery, induced by the addition of angiotensin I in ex vivo assays.
  • FIG. 1 Amino acid sequence of the peptides used in the description of the present invention, including the peptides LfcinB20-25 SEQ ID NO 2 and LfcinB17-31 SEQ ID NO 1 described in the present invention as inhibitors of the angiotensin I converting enzyme.
  • the amino acids are represented by their three letter codes, and in the upper part their numbering is shown.
  • the chemically synthesized peptides had their ends protected by acetylation (Ac-) in the case of the amino terminal end and amidation (Am-) in the case of the carboxy terminal end, following usual procedures for all those skilled in the area of knowledge of Ia present invention
  • Figure 2 Effect of the concentration of the LfcinB17-31 SEQ ID NO 1 peptide (in micromolar units, ⁇ M) on the in vitro activity of the angiotensin I converting enzyme (measured as residual activity or percentage of the activity of the control reaction without added peptide) when using its natural substrate angiotensiona I.
  • Each point represents the mean residual activity ⁇ standard deviation of four independent determinations, for each peptide concentration.
  • FIG. 5 Isometric tension recording of a representative experiment in which the inhibitory effect of LF hydrolyzate (at a concentration of 760 ⁇ g / ml) on the ECA-dependent contraction induced by angiotensin I (1 ⁇ M) in a segment is shown. of carotid rabbit artery. The experiment is preceded by a contraction with depolarizing solution (KCI) to verify the viability of the preparation.
  • KCI depolarizing solution
  • the N-terminal end of the peptides is acetylated (Ac) and the C-terminal end amidated (Am), as a consequence of the synthesis procedure.
  • the peptides were purified by RP-HPLC (in English, reversed phase-high performance liquid chromatography) and their identity was confirmed by MALDI-TOF mass spectrometry (from English, matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight). It is also possible to produce the peptides described in the present invention through strategies derived from biotechnology.
  • the reaction mixture has a volume of 225 ⁇ l and is constituted by 50 ⁇ l of 25 mM HHL in 200 mM Tris buffer pH 8.3 with 600 mM NaCI and 10 ⁇ M ZnC, 75 ⁇ l of an ACE solution in the same buffer as correspond to 1.5 thousand activity, and 100 ⁇ l of peptide
  • the LfcinB17-31 SEQ ID NO 1 peptide was used because it had the highest inhibitory activity in the in vitro assays performed previously.
  • the experimental preparation consisted of obtaining cylindrical segments (3 mm) of isolated arteries (New Zealand white rabbit carotid artery), which were placed in an organ bath designed to record the changes of isometric tension in the vascular wall [Salom, JB , Burguete, M. C, Pérez-Asensio, FJ, Centeno, JM, Torregrosa, G., and Alborch, E. (2002). Acute relaxant effects of 17- ⁇ -estradiol through non-genomic mechanisms in rabbit carotid artery.
  • Figure 3 reflects the record of one of these experiments. As a control, some segments were left unincubated with any peptide. Table 3 shows the statistical summary of all experiments performed and shows a significant inhibitory effect of SEQ ID NO 1 on the contraction of the carotid artery induced by treatment with angiotensin I.
  • Peptide inhibitor effect SEQ ID NO 1 described in the present invention as an ACE inhibitor on the ECA-dependent contraction with angiotensin I in isolated rabbit arteries.
  • the results indicate the contraction of the artery in response to treatment with angiotensin I (1 ⁇ M), in% with respect to a previous response in the same arterial segment, and are expressed as the mean ⁇ standard deviation of the determination on (n) segments arterial
  • the control was performed without peptide addition.
  • the asterisks indicate a significant difference with respect to the control (t-Student Test) with a confidence of 99% ( ** p ⁇ 0.01).
  • lactoferrin hydrolyzate To obtain the lactoferrin hydrolyzate, pepsin has been used as an enzyme following the protocol described by Facón and Skura (1996) (Antibacterial activity of Lactoferricin, Lysozyme and EDTA against Salmonella enteritidis. Int. Dairy Journal 6, 303-313). The hydrolyzate obtained contained 7.6 mg of protein / ml.
  • LF hydrolyzate was used at concentrations of 76, 228 and 760 ⁇ g of protein / ml in the assay.
  • the experimental preparation consisted of obtaining cylindrical segments (3mm) of isolated arteries (New Zealand white rabbit carotid artery), which were arranged in an organ bath designed to record the changes of isometric tension in the vascular wall [Salom, JB, Burguete, M. C, Pérez-Asensio, FJ, Centeno, JM, Torregrosa, G., and Alborch, E. (2002). Acute relaxant effects of 17- ⁇ -estradiol through non-genomic mechanisms in rabbit carotid artery. Steroids 67, 339-346]. The middle
  • FIG. 1 Angiotensin I.
  • Figure 2 reflects the record of one of these experiments. As a control, some segments were left unincubated with any inhibitor.
  • Table 5 shows the statistical summary of all experiments performed and shows a significant inhibitory effect of hydrolyzate on the contraction of the carotid artery induced by angiotensinal treatment as well as the null effect of pepsin and unhydrolyzed lactoferrin

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Abstract

La invención consiste en la utilización de productos bioactivos derivados de la proteínas láctea lactoferrina y el hidrolizado de lactoferrina que contiene dichos productos. Se trata de un péptido de quince residuos de aminoácidos (llamado LfcinB 17-31), y de otro que es una versión reducida del mismo (llamado LfcinB20-25), derivados de la lactoferrina bovina como inhibidores efectivos de la enzima conversora de la angiotensina (ECA). Los péptidos objeto de la patente se pueden obtener químicamente, enzimáticamente o biotecnológicamente y dan lugar a péptidos con actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina in vitro y/o ex vivo, medida como la disminución de la contracción de arterias carótidas de conejo inducida por exposición a angiotensina I. Estos productos nutracéuticos, ya sea como péptido biactivos, son tanto útiles para la industria alimentaria como para la farmacéutica.

Description

Título
Uso de péptidos derivados de la lactoferrina en la preparación de medicamentos inhibidores de la enzima conversora de angiotensina I
5 Sector de Ia Técnica
Industria agroalimentaria; Alimentos funcionales; Ingredientes bioactivos; Farmacología de Ia hipertensión
Estado de Ia Técnica
10 La hipertensión, que consiste en un aumento de Ia presión sanguínea superior a Ia deseable para Ia salud, es un problema sanitario bastante serio ya que está relacionada con un alto riesgo de complicaciones cardio- y cerebro- vasculares. El accidente cerebrovascular agudo, también denominado ictus, constituye, después de las enfermedades isquémicas cardíacas y del cáncer, Ia
15 tercera causa de mortalidad y Ia primera de discapacidad permanente en las sociedades occidentales avanzadas. La mayoría de accidentes cerebrovasculares agudos (85%) son de tipo "isquémico", y tienen su origen en Ia oclusión aguda por un trombo ("trombosis") o un émbolo ("embolia") de una de las principales arterias cerebrales, Io que origina un descenso en Ia
20 perfusión sanguínea ("isquemia") y consiguiente necrosis ("infarto") de Ia región cerebral irrigada por dicha arteria. El resto de accidentes cerebrovasculares (15%) son de tipo "hemorrágico", originados por Ia rotura de un vaso sanguíneo en el propio parénquima cerebral ("hemorragia intracerebral") o en Ia superficie cerebral ("hemorragia subaracnoidea").
25 De Io dicho anteriormente se desprende que en el desarrollo de estas enfermedades falla Ia correcta regulación de Ia presión arterial sistémica, en Ia que interviene un complejo sistema regulador llamado sistema renina- angiotensina (SRA), y del que forman parte Ia renina, Ia enzima conversora de Ia angiotensina (ECA), Ia aldosterona, y las angiotensinas I y II. Este SRA es un sistema hormonal circulante, y concretamente Ia renina y Ia ECA son dos peptidasas que forman parte del mismo y que actúan secuencialmente sobre una serie de pequeños péptidos, reguladores en última instancia de Ia presión sanguínea. En los seres humanos, Ia renina se libera en el riñon y Ia ECA se encuentra presente principalmente en las células endoteliales vasculares, en los pulmones, en los ríñones y en el cerebro.
Este sistema renina-angiotensina se activa en determinadas situaciones mediante Ia actuación de Ia renina sobre un péptido precursor denominado angiotensinógeno (de procedencia hepática), el cual se convierte en el decapéptido angiotensina I . Esta angiotensina I, inactiva desde el punto de vista biológico, se transforma a su vez por acción de Ia ECA en angiotensina Il al separarse el dipéptido a partir de su extremo C-terminal. La angiotensina Il generada es un potente vasoconstrictor que ejerce su acción tras Ia unión a sus receptores específicos denominados "receptores ATY'. Dicha acción se traduce en Ia contracción de los vasos sanguíneos que como consecuencia produce un aumento de Ia presión sanguínea. Además de contribuir a Ia formación de Ia angiotensina II, Ia ECA también actúa sobre otro péptido circulante, el nonapéptido llamado bradiquinina, potente agente vasodilatador que pierde esta característica al ser hidrolizado.
Por todo Io expuesto anteriormente, Ia interferencia farmacológica con el
SRA podría tener efectos beneficiosos en el tratamiento de los desórdenes vasculares asociados con Ia hipertensión. La inhibición de Ia actividad ECA permitiría disminuir Ia formación de angiotensina Il además de reducir Ia pérdida de funcionalidad de Ia bradiquinina, evitando de esta manera Ia acción vasoconstrictora de Ia primera y potenciando Ia acción vasodilatadora de Ia segunda. A este respecto se ha puesto de manifiesto en numerosos estudios Ia eficacia de los inhibidores de ECA reduciendo Ia morbilidad y Ia mortalidad en pacientes con fallo cardíaco, síndrome cardio-metabólico y diabetes.
A pesar de su demostrada eficacia en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares asociadas a Ia hipertensión, los fármacos inhibidores del ECA disponibles en Ia actualidad no pueden considerarse Ia opción definitiva. Por su falta de especificidad estos fármacos no son bien tolerados por algunos pacientes en los que se presentan efectos secundarios indeseables como tos seca y angioedema; además, no bloquean completamente Ia síntesis de angiotensina Il ya que ésta sigue otras vías de síntesis que no dependen del ECA. Es necesario, por Io tanto, encontrar nuevos inhibidores del ECA con mayor especificidad y que puedan ser coadministrados con otros fármacos, como por ejemplo los "bloqueadores del receptor de angiotensina", para el tratamiento óptimo de los desórdenes vasculares de origen hipertensivo ligados al SRA a Ia vez que se minimizan los efectos secundarios antes citados. Incluso y según las características de los inhibidores seleccionados, podría conseguirse una aproximación mas natural del tratamiento al añadir dichos inhibidores a los alimentos, Io cual produciría un efecto positivo tanto sobre dicho tratamiento como sobre Ia prevención de los síntomas inherentes a Ia hipertensión.
Hasta Ia fecha se han publicado numerosos trabajos bibliográficos relacionados con Ia inhibición de ECA mediante el empleo de pequeños péptidos sintéticos como principales responsables de dicha inhibición. Estos péptidos presentan una gran variabilidad pues tienen diferentes longitudes y estructuralmente difieren en las secuencias de los aminoácidos que los constituyen [Patchett, A.A., Harris, E., Tristram, E.W., Wyvratt, MJ. , Wu, M.T., Taub, D., Peterson, E. R., Ikeler, TJ. , Broeke, J.Ten., Payne, L. G., Ondeyka, D. L., Thorsett, E. D., Greenlee, WJ., Lohr, N.S., Hoffsommer, R.D., Joshua, H., Ruyle, W.V., Rothrock, J.W., Áster, S. D., Maycock, A.L., Robinson, F. M., Hirschmann, R., Sweet, CS. , UIm, E. H., Gross, D. M., Vassil, T.C. y Stone, CA. (1980). A new class of angiotensin-converting enzyme inhibitors. Nature 288, 280-283; Ondetti, M.A., Rubin, B. y Cushman, D.W. (1977). Design of specific Inhibitors of angiotensin-converting enzyme: New class of orally active antihypertensive agents. Science 196, 441-444; Cushman, D. W., Cheung, H. S., Sabo, E. F. y Ondetti, M.A. (1977). Design of potent competitive inhibitors of angiotensin-converting enzyme. carboxyalkanoyl and mercaptoalkanoyl amino acids. Biochemistry 16 (25), 5484-5491 ; Cushman, D.W., Cheung, H. S., Sabo, E. F. y Ondetti, M.A. (1981 ). Angiotensin converting enzyme inhibitors. evolution of a new class of antihypertensive drugs. En: Angiotensin converting enzyme inhibitors. Mechanisms of action and clinical implications. Section I, pp3-25. Ed. Horovitz, ZP. , Urban & Schwarzenberg (Baltimor-Munich); Edling, O., Bao, G., Feelisch, M., Unger, T. y Gohlke, P. (1995). Moexipril, a new angiotensin- converting enzyme (ACE) inhibitor: Pharmacological characterization and comparison with enalapril. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 275 (2), 854-863; Gómez-Ruiz, J.A., Recio, I. y Belloque, J. (2004). ACE-Inhibitory activity and structural properties of peptide Asp-Lys-lle- His-Pro [β-CN f(47-51)]. Study of the peptide forms synthesized by different methods. Journal of Agricultura! and Food Chemistry 52 (20), 6315-6319; Cotton, J., Hayashi, M.A.F., Cuniasse, P., Vazeux, G., Lanzer, D., De Camargo, A. C. M. y Dive, V. (2002). Selective inhibition of the c-domain of angiotensin i converting enzyme by bradykinin potentiating peptides. Biochemistry 41 (19), 6065-6071 ; Lau, C-P., Tse, H-F., Ng, W., Chan, K-K., Li, S-K., Keung, K-K., Lau, Y-K., Chen, W-H., Tang, Y-W. y Leung, S-K. (2002). Comparison of Perindopril Versus Captopril for Treatment of Acute Myocardial Infarction. American Journal of Cardiology 89 (15), 150-154; Smith, A.I., Lew, R.A., Shrimpton, C. N., Evans, R.G. y Abbenante, G. (2000). A Novel Stable Inhibitor of Endopeptidases EC 3.4.24.15 and 3.4.24.16 Potentiates Bradykinin-lnduced Hypotension. Hypertension 35, 626-630; Azizi, M., Massien, C, Michaud, A. y Corvol, P. (2000). In vitro and in vivo inhibition of the 2 active sites of ace by omapatrilat, a vasopeptidase inhibitor. Hypertension 35, 1226-1231 ; Hou, W-C, Chen, H-J. y Lin, Y-H. (2004). Antioxidant peptides with angiotensin converting enzyme inhibitory activities and applications for angiotensin converting enzyme purif ¡catión. Journal of Agricultura! and Food Chemistry 51 (6), 1706-1709].
Así mismo, también se han llevado a cabo estudios con el fin de aislar e identificar inhibidores de carácter natural presentes en los alimentos. En numerosos casos se ha llegado a identificar como responsables ciertos péptidos naturales llegando incluso a Ia determinación de su secuencia. De esta manera se han podido sintetizar Ia mayoría de ellos con el fin de confirmar su actividad. Como materia prima, se emplean proteínas tanto de origen animal como vegetal [WO2005012355 Bioactive peptides derived from the proteins of egg white by means of enzymatic hydrolysis; Li, G-H., Le, G-W., Shi, Y-H. y Shrestha S. (2004). Angiotensin l-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins and their physiological and pharmacological effects. Nutrítion Research 24, 469-486; Pripp, A.H., Isaksson, T., Stepaniak, L. y Sorhaug, T. (2004). Quantitative structure-activity relationship modelling of ACE-inhibitory peptides derived from milk proteins. European Food Research and Technology. 219, 579-583; Robert, M-C, Razaname, A., Mutter, M. y Juillerat, M.A. (2004). Identification of angiotensin l-converting enzyme inhibitory peptides derived from sodium caseinate hydrolysates produced by Lactobacillus helveticus NCC 2765. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52 (23), 6923-6931 ; Chen, T- L., Lo, Y-C, Hu, W-T., Wu, M-C, Chen, S-T. y Chang, H-M. (2003). Microencapsulation and Modification of synthetic peptides of food proteins reduces the blood pressure of spontaneously hypertensive rats. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51 (6), 1671 -1675; Fujita, H. y Yoshikawa, M. (1999). LKPNM: a prodrug-type ACE-inhibitory peptide derived from fish protein. Immunopharmacology 44, 123-127; Pihlanto-Leppálá, A. (2001 ). Bioactive peptides derived from bovine whey proteins: opioid and Ace-inhibitory peptides. Trends in Food Science & Technology 11 , 347-356; Suetsuna, K. y Nakano, T. (2000). Identification of an antihypertensive peptide from peptic digest of wakame (Undaria pinnatifida). Journal of Nutritional Biochemistry 11 , 450-454; Yokoyama, K., Chiba, H. y Yoshikawa, M. (1992). Peptide inhibitors for angiotensin i-converting enzyme from thermolysin digest of dried bonito. Bioscience Biotechechnology and Biochemistry 56 (10), 1541 -1545; Yano, S., Suzuki, K. y Funatsu, G. (1996). Isolation from α-zein of thermolysin peptides with angiotensin i-converting enzyme inhibitory activity. Bioscience Biotechechnology and Biochemistry 60 (4), 661 -663; Wako, Y., Ishikawa, S. y Muramoto, K. (1996). Angiotensin l-converting enzyme inhibitors in autolysates of squid liver and mantle muscle. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 60 (8), 1353-1355; Suetsuna, K. (1998). Isolation and characterization of angiotensin l-converting enzyme inhibitor dipeptides derived from Allium sativum L (garlic). Journal of Nutritional Biochemistry 9, 415-419; Pihlanto- Leppálá, A., Rokka, T. y Coronen, H. (1998). Angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides derived from bovine milk proteins. International Dairy Journal 8, 325-331 ; Kohama, Y., Matsumoto, S., Oka, H., Teramoto, T., Okabe, M. y Mimura, T. (1988). Isolation of angiotensin-converting enzyme inhibitor from tuna muscle. Biochemical and Biophysical Research Communications 155 (1 ), 332-337. Maruyama, S., Miyoshi, S. y Tanaka, H. (1989). Angiotensin I- converting enzyme inhibitors derived from Ficus carica. Agrie. Biol. Chem. 53 (10), 2763-2767; Ariyoshi, Y. (1993). Angiotensin-converting enzyme inhibitors derived from food proteins. Trends in Food Science & Technology 4, 139-144; Takayanagi, T. y Yokotsuka, K. (1999). Angiotensin I converting enzyme- inhibitory peptides from wine. Am.J.Enol.Vitic. 50 (1 ), 65-68; Fuglsang, A., Nilsson, D. y Nyborg, N. C. B. (2003). Characterization of new milk-derived inhibitors of angiotensin converting enzyme in vitro and in vivo. Journal of Enzyme Inhibition and Medical Chemistry 18 (5), 407-412 ].
Por otra parte, las Lactoferrinas (LF) son glicoproteínas abundantes en Ia leche materna de mamíferos y tienen múltiples funciones biológicas, entre las que destacan sus propiedades antimicrobianas [Farnaud, S. y Evans, R. W. (2003). Lactoferrin - a multifunctional protein with antimicrobial properties. Molecular Immunology 40, 395-405; Orsi, N. (2004). The antimicrobial activity of lactoferrin: Current status and perspectives. BioMetals 17, 189-196]. Lactoferrinas recombinantes de origen humano o vacuno han sido producidas en hongos, plantas y animales mediante Ia tecnología del DNA recombinante, con vistas a obtener efectos terapéuticos o para su utilización en alimentos funcionales [Nandi, S., Suzuki, Y. A., Huang, J. M., Yalda, D., Pham, P., Wu, L. Y., Bartley, G., Huang, N., y Lonnerdal, B. (2002). Expression of human lactoferrin in transgenic rice grains for the application in infant formula. Plant Science 163, 713-722; van Berkel, P. H. C, Welling, M. M., Geerts, M., van Veen, H. A., Ravensbergen, B., Salaheddine, M., Pauwels, E. K. J., Pieper, F., Nuijens, J. H., y Nibbering, P. H. (2002). Large scale production of recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic cows. Nature Biotechnology 20, 484- 487; Ward, P. P., Piddington, C. S., Cunningham, G. A., Zhou, X. D., Wyatt, R. D., y Conneely, O. M. (1995). A system for production of commercial quantities of human Lactoferrin - A broad-spectrum natural antibiotic. Bio-Technology 13, 498-503; Zhang, Z. Y., Coyne, D. P., Vidaver, A. K., y Mitra, A. (1998). Expression of human lactoferrin cDNA confers resistance to Ralstonia solanacearum in transgenic tobáceo plants. Phytopathology 88, 730-734; Chong, D. K. y Langridge, W. H. (2000). Expression of full-length bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants. Transgenic Research 9, 71 -78]. En Ia actualidad existen ejemplos de péptidos derivados de LF en fase avanzada de desarrollo para su utilización como fármacos [Zasloff, M. (2002). Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395]. En concreto, las Lactoferricinas (Lfcin) son péptidos aislados de Ia región N-terminal de LF por digestión con pepsina, los cuales presentan propiedades antimicrobianas [Bellamy, W., Takase, M., Yamauchi, K., Wakabayashi, H., Kawase, K., y Tomita, M. (1992). Identification of the bactericidal domain of lactoferrin. Biochimica et Biophysica Acta 1121 , 130-136; WO2004/089986, Antimicrobial peptide from transferrin family]. La estructura primaria de Ia lactoferricina bovina (LfcinB) corresponde a los residuos 17-41 de LF y tiene potente actividad antimicrobiana [Bellamy, W., Takase, M., Yamauchi, K., Wakabayashi, H., Kawase, K., y Tomita, M. (1992). Identification of the bactericidal domain of lactoferrin. Biochimica et Biophysica Acta 1121 , 130-136; Tomita, M., Wakabayashi, H., Yamauchi, K., Teraguchi, S., y Hayasawa, H. (2002). Bovine lactoferrin and lactoferricin derived from milk: production and applications. Biochemistry and CeII Biology 80, 109-112].
En Ia presente invención se describe Ia secuencia de aminoácidos de un péptido de quince residuos de aminoácidos derivado de Lactoferricina bovina, distinto de los mencionados anteriormente, previamente descrito como antimicrobiano [Strom, M. B., Rekdal, O., y Svendsen, J. S. (2000). Antibacterial activity of 15-residue lactoferricin derivatives. Journal of Peptide Research 56, 265-274; Strom, M. B., Haug, B. E., Rekdal, O., Skar, M. L., Stensen, W., y Svendsen, J. S. (2002). Important structural features of 15- residue lactoferricin derivatives and methods for improvement of antimicrobial activity. Biochemistry and CeII Biology 80, 65-74] y ahora caracterizado en Ia presente invención por tener actividad inhibidora de Ia ECA.
La hidrólisis enzimática de las LF, también da lugar a una mezcla de péptidos con diferentes propiedades biológicas tales como capacidad antimicrobiana [Min, S. y Krochta, J. M. (2005). Inhibition of Penicillium commune by edible whey protein films incorporating lactoferrin, lactoferrin hydrolysate, and lactoperoxidase systems. Journal of Food Science 70, M87- M94; Murdock, CA. y Matthews, K.R. (2002). Antibacterial activity of pepsin- digested lactoferrin on foodborne pathogens in buffered broth systems and ultra-hig temperature milk with EDTA. Journal of Applied Microbiology 93, 850- 856; Masschalck, B., van Houdt, R. y Michiels, CV. (2001 ). High pressure increases bactericidal activity and spectrum of lactoferrin, lactoferricin and nisin. International Journal of Food Microbiology 64, 325-332;Yamauchi, K., Takase, M. y Kawase, K. (1992). Antibacterial activity of bovine lactoferrin and hydrolysate of bovine lactoferrin. Japanese Journal of Dairy and Food Science 41, A195-A200; Ulvatne, H. y Vorland, L. H. (2001 ). Bactericidal Kinetics of 3 Lactoferricins Against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Scandinavian Journal of Infectious Diseases 33, 507-511 ; Bellamy, W., Wakabayashi, H., Takase, M., Kawase, K., Shimamura, S. y Tomita, M. (1993). Killing of Candida albicans by lactoferricin B, a potent antimicrobial peptide derived from the N-terminal región of bovine lactoferrin. Medical Microbiology and Immunology 182, 97-105.], efecto inmunomodulador [Miyauchi, H., Kaino, A., Shinoda, I., Fukuwatari, Y. y Hayasawa, H. (1997). Immunomodulatory effect of bovine lactoferrin pepsin hydrolysate on murine splenocytes and Peyer's Patch cells. Journal of Dairy Science 80, 2330-2339; Samuelsen, 0., Haukland, H. H., Ulvatne, H. y Vorland, L. H. (2004). Anti-complement effects of lactoferrin-derived peptides. FEMS Immunology and Medical Microbiology 41 , 141-148; Mercier, A., Gauthier, S. F. y Fliss, I. (2004). Immunomodulating effects of whey proteins and their enzymatic digests. International Dairy Journal 14, 175-183] y actividad antitumoral [Yang, N., Rekdal, 0., Stensen, W. y Svendsen, J. S. (2002). Enhanced antitumor activity and selectivity of lactoferrin-derived peptides. Journal of Peptide Research 60, 187-197; Wang, W.P., ligo, M., Sato, J., Sekine, K., Adachi, I. y Tsuda, H. (2000). Activation of Intestinal Mucosal Immunity in Tumor-bearing Mice by Lactoferrin. Cáncer Science 91 , 1022-1027; ligo, M., Shimamura, M., Matsuda, E., Fujita, K., Nomoto, H., Satoh, J., Kojima, S., Alexander, D. B., Moore, M.A. y Tsuda, H. (2004). Orally administered bovine lactoferrin induces caspase-1 and interleukin-18 in the mouse intestinal mucosa: a possible explanation for inhibition of carcinogenesis and metástasis. Cytokine 25, 36-44; ligo, M., Kuhara, T., Ushida, Y., Sekine, K., Moore, M.A. y Tsuda, H. (1999). Inhibitory effects of bovine lactoferrin on colon carcinoma 26 lung metástasis in mice. Clinical and Experimental Metástasis 17, 43-49; Yang, N., Stram, M. B., Mekonnen, S. M., Svendsen, J. S. y Rekdal, 0. (2004). The effects of shortening lactoferrin derived peptides against tumour cells, bacteria and normal human cells. Journal of Peptide Science 10, 37-46; Eliassen, LT. , Haug, B. E., Berge, G. y Rekdal, 0. (2003). Enhanced antitumour activity of 15-residue bovine lactoferricin derivatives containing bulky aromatic amino acids and lipophilic N- terminal modifications. Journal of Peptide Science 9, 510-517] entre otras.
Por tanto, en Ia presente invención se describe Ia aplicación de un hidrolizado enzimático de LF, obtenido mediante digestión con pepsina, previamente descrito como antimicrobiano [Murdock, CA. y Matthews, K. R. (2002). Antibacterial activity of pepsin-digested lactoferrin on foodborne pathogens in buffered broth systems and ultra-hig temperature milk with EDTA.
Journal of Applied Microbiology 93, 850-856], inmunomodulador [Miyauchi, H.,
Kaino, A., Shinoda, I., Fukuwatari, Y. y Hayasawa, H. (1997).
Immunomodulatory effect of bovine lactoferrin pepsin hydrolysate on murine splenocytes and Peyer's Patch cells. Journal of Dairy Science 80, 2330-2339] o antitumoral [Yang, N., Rekdal, 0., Stensen, W. y Svendsen, J. S. (2002).
Enhanced antitumor activity and selectivity of lactoferrin-derived peptides.
Journal of Peptide Research 60, 187-197] y ahora caracterizado en Ia presente invención por tener actividad inhibidora de ECA.
Como cualquier experto en el tema puede apreciar, dicho hidrolizado de
LF contiene necesariamente o bien los péptidos SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO2, o bien péptidos que contengan secuencias de dichos péptidos.
La inhibición de Ia actividad ECA se manifiesta en ensayos realizados in vitro, midiendo Ia inhibición de Ia conversión de sustratos artificiales (HHL, Hipuril-Histidil-Leucina) y naturales (angiotensina I) mediada por ECA, y en ensayos realizados ex vivo, midiendo Ia disminución de Ia contracción de arterias carótidas de conejo inducida por exposición a angiotensina I. Breve descripción de Ia invención
La presente invención está relacionada con los sectores farmacológico y de Ia industria agroalimentaria y consiste en Ia identificación y caracterización de un péptido de quince residuos de aminoácidos (llamado LfcinB17-31 ; SEQ ID NO 1 ), y de otro que es un fragmento reducid o del mismo (llamado LfcinB20-25, SEQ ID NO 2) y en Ia aplicación de un hidrolizado enzimático de LF obtenido con pepsina que los contiene, como inhibidores efectivo s de Ia enzima conversora de Ia angiotensina (ECA) que se halla implicada en Ia formación del compuesto angiotensina Il que es un vasoconstrictor responsable, entre otras causas/mecanismos, de Ia hipertensión. Dicho péptido SEQ ID NO 1 deriva de Ia secuencia de Ia proteína LF bovina, de origen natural. La actividad inhibidora se manifiesta por una reducción de Ia actividad ECA determinada en ensayos in vitro, así como por una reducción de Ia contracción ECA dependiente ex vivo empleando segmentos de arterias. Se demuestra que Ia actividad inhibidora del péptido se corresponde con una secuencia de aminoácidos característica, ya que otros pequeños péptidos no presentan dicha actividad. Se describe Ia potencial utilización de los péptidos inhibidores de ECA, del hidrolizado inhibidor de ECA, o de péptidos inhibidores derivados del mismo, como compuestos bioactivos para el control de Ia hipertensión. En un ejemplo particular, se describe Ia actividad inhibidora de ECA de dichos péptidos cuando se emplean como sustratos Hipuril-Histidil- Leucina (HHL) y angiotensina I. La actividad inhibidora se ha demostrado en condiciones in vitro empleando ECA purificada a partir de riñon de cerdo y ex vivo empleando segmentos de arteria carótida de conejo.
Descripción detallada de Ia invención
En Ia presente invención se describe Ia identificación y caracterización de dos péptidos con actividad de inhibición de Ia enzima conversora de angiotensina (ECA) implicada en los mecanismos de control de Ia presión arterial, así como Ia aplicación de un hidrolizado enzimático de LF obtenido con pepsina que contiene dichos péptidos. En un ejemplo particular, se describe su utilización como inhibidor de ECA mediante el empleo de sustratos artificiales como el Hipuril-Histidil-Leucina (HHL) o naturales como Ia angiotensina I, así como su efecto inhibidor sobre Ia contracción ECA-dependiente de segmentos de arterias de conejo.
Los inhibidores descritos en Ia presente invención son péptidos con una secuencia de quince aminoácidos característica: el primero de quince aminoácidos SEQ ID NO 1 y el segundo de seis aminoácidos SEQ ID NO 2 distinta de los péptidos inhibidores de ECA conocidos anteriormente, [Guan- Hong Li, Guo-Wei Le, Yong-Hui Shi y Sundar Shrestha (2004). Angiotensin I- converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins and their physiological and pharmacological effects. Nutrition Research 24, 469-486; Dziuba, J., Minkiewicz, P., Nalecz, D. y Iwaniak, A. (1999). Datábase of biologically active peptide sequences. Nahrung 43, 190-195; Fujita, H., Yokoyama, K. y Yoshikawa, M. Classification and antihypertensive activity of angiotensin i-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins. Jounal of Food Science 65, 564-569; Reed, J. D., Edwards, D. L., y González, C. F. (1997)]., así como el hidrolizado enzimático de LF obtenido con pepsina que contiene los péptidos bioactivos derivados del mismo, entre los cuales se encuentrra Ia SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2
En un ejemplo particular de realización de Ia invención, dicho péptido se sintetizó químicamente con los estereoisómeros L- naturales de los aminoácidos y seguidamente se purificó, siguiendo procedimientos habituales para toda aquella persona experta en el área de conocimiento de Ia presente invención [Fields, G. B. y Noble, R. L. (1990). SoNd phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids. International Journal of Peptide and Protein Research 34, 161-214]
En Ia presente invención se describen ensayos experimentales que ilustran Ia actividad tanto del hidrolizado como de SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO
2, en condiciones experimentales in vitro, utilizando ECA purificada de riñon de cerdo y un sustrato artificial denominado HHL, en ambos casos, y otro natural como es Ia angiotensina I en el caso de SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2. El primero de los sustratos permite llevar a cabo una serie de ensayos encaminados a conocer Ia capacidad inhibidora, mientras que el segundo permite contrastar los resultados obtenidos con el anterior y además comprobar dicha capacidad inhibidora de ECA en el caso de utilizar sustratos naturales. Como prueba de Ia especificidad de Ia inhibición, en Ia presente invención también se describe Ia ausencia de actividad inhibidora in vitro con LF sin hidrolizar y pepsina y de otros tres péptidos (SEQ ID N03 péptido P20D; SEQ ID N04, péptido P26D; y SEQ ID N05, péptido P36D; Figura 1 )
La actividad inhibidora del hidrolizado y de los péptidos descritos en Ia presente invención se manifiesta con una reducción de Ia actividad de Ia ECA al llevar a cabo los ensayos in vitro en las condiciones establecidas, como queda demostrado mediante los ensayos experimentales descritos en Ia presente invención.
La actividad inhibidora del hidrolizado y del péptido descrito en Ia presente invención también se manifiesta con una reducción de Ia contracción ECA- dependiente de arteria carótida de conejo, inducida mediante Ia adición de angiotensina I en ensayos ex vivo.
Considerando las propiedades del hidrolizado y del péptido descrito en Ia presente invención, es obvio para todo aquel experto en el tema su potencial utilización como aditivo alimentario, compuesto o fármaco de utilidad en Ia prevención o frente a enfermedades que tengan como causa o sintomatología
Ia hipertensión arterial.
Es obvio para todo aquel experto en el área de Ia presente invención el interés, diseño y desarrollo de estrategias derivadas de Ia biotecnología, que incluyen Ia metodología del ADN recombinante y de Ia transformación genética de organismos, que pueden ser utilizadas para Ia producción y utilización del péptido descrito en Ia presente invención y sus derivados para los fines descritos. Breve descripción de Ia figuras
Figura 1. Secuencia de aminoácidos de los péptidos utilizados en Ia descripción de Ia presente invención, incluyendo los péptidos LfcinB20-25 SEQ ID NO 2y LfcinB17-31 SEQ ID NO 1 descritos en Ia presente invención como inhibidores de Ia enzima conversora de angiotensina I. Los aminoácidos se representan por sus códigos de tres letras, y en Ia parte superior se muestra su numeración. Los péptidos sintetizados químicamente tenían sus extremos protegidos mediante acetilación (Ac-) en el caso del extremo amino terminal y amidación (Am-) en el caso del extremo carboxi terminal, siguiendo procedimientos habituales para toda aquella persona experta en el área de conocimiento de Ia presente invención.
Figura 2. Efecto de Ia concentración del péptido LfcinB17-31 SEQ ID NO 1 (en unidades micromolar, μM) sobre Ia actividad in vitro de Ia enzima conversora de angiotensina I (medida como actividad residual o porcentaje de Ia actividad de Ia reacción control sin péptido añadido) cuando utiliza su sustrato natural angiotensiona I. Cada punto representa Ia media de actividad residual ± desviación estándar de cuatro determinaciones independientes, para cada concentración de péptido. La curva representa el mejor ajuste a una curva sigmoidal de cuatro parámetros (coeficiente de regresión, r = 0,9749) que permitió calcular un EC5O de 25,5 ± 4,5 μM (p<0,0001 ) (Programa informático SigmaPlot v 8.0).
Figura 3. Registro de tensión isométrica de un experimento representativo en el que se muestra el efecto inhibidor del péptido LfcinB17-31 SEQ ID
NO 1 (a una concentración de 20 μM) sobre Ia contracción ECA - dependiente inducida por angiotensina I (1 μM) en un segmento de arteria carótida de conejo. El experimento va precedido por una contracción con solución despolarizante (KCI) para comprobar Ia viabilidad de Ia preparación. Figura 4. Efecto de Ia concentración del hidrolizado de LF (en μg/ml) sobre Ia actividad in vitro de Ia ECA (medida como actividad residual o porcentaje de Ia actividad de Ia reacción control sin inhibidor añadido) cuando utiliza como sustrato HHL. Cada punto representa Ia media de actividad residual ± desviación estándar de un número variable de, al menos tres determinaciones independientes, para cada concentración del hidrolizado. La curva representa el mejor ajuste a una curva sigmoidal de cuatro parámetros (coeficiente de regresión, r=0,98) que permitió calcular un EC5O de 161 ±9 μg/ml (p<0,0001 ) (Programa informático SigmaPlot v 8.0).
Figura 5. Registro de tensión isométrica de un experimento representativo en el que se muestra el efecto inhibidor del hidrolizado de LF (a una concentración de 760 μg/ml) sobre Ia contracción ECA-dependiente inducida por angiotensina I (1 μM) en un segmento de arteria carótida de conejo. El experimento va precedido por una contracción con solución despolarizante (KCI) para comprobar Ia viabilidad de Ia preparación.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN EJEMPLO 1.
1. Síntesis de péptidos. Los péptidos descritos y analizados en Ia presente invención (Figura 1 ) se sintetizaron químicamente sobre fase sólida siguiendo procedimientos habituales que utilizan el grupo N-(9-fluorenyl) methoxycarbonyl (Fmoc) para Ia protección del grupo α-amino de los aminoácidos constituyentes [Fields, G. B. y Noble, R. L. (1990). SoNd phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids. International Journal of Peptide and Protein Research 34, 161 -214]. Los péptidos P20D SEQ ID NO 3, P26D SEQ ID NO 4 y P36D SEQ ID NO 5 se diseñaron y utilizaron como controles negativos en los ensayos descritos a continuación. El extremo N-terminal de los péptidos se encuentra acetilado (Ac) y el extremo C-terminal amidado (Am), como consecuencia del procedimiento de síntesis. Después de Ia síntesis, los péptidos se purificaron mediante RP-HPLC (del inglés, reversed phase- high performance liquid chromatography, cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa) y su identidad se confirmó mediante espectrometría de masas MALDI-TOF (del inglés, matrix-assisted láser desorption/ionization time-of-flight). También es posible Ia Producción de los péptidos descritos en Ia presente invención mediante estrategias derivadas de Ia biotecnología. Es obvio, para toda aquella persona experta en el área de conocimiento, que Ia producción de los péptidos mediante procedimientos biotecnológicos, que incluyen las metodologías del ADN recombinante y de Ia transformación genética de organismos, supondría una mejora en los costes de producción, y que por tanto dicha producción es un aspecto importante en el contexto de Ia aplicabilidad industrial de Ia presente invención. En el supuesto de Ia producción mediante biotecnología, Ia secuencia del péptido producido por un organismo modificado genéticamente sería codificada por un fragmento de ADN de acuerdo a las leyes del código genético [Sambrook, J., Fritsch,
E. F., y Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edition. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY.], Todos estos procedimientos son habituales para toda aquella persona experta en el área de conocimiento de Ia presente invención.
2. Ensayos in vitro de inhibición de Ia actividad ECA sobre el sustrato artificial HHL. En estos ensayos, Ia capacidad inhibidora de los péptidos se determinó midiendo por HPLC (del inglés high performance liquid chromatography) el ácido hipúrico resultante de Ia hidrólisis del sustrato artificial HHL (Hipuril-Histidil-Leucina) basándose en el método propuesto en Ia literatura [Wu, J. P., Aluko, R. E., y Muir, A. D. (2002). Improved method for direct high-performance liquid chromatography assay of angiotensin- converting enzyme-catalyzed reactions. Journal of Chromatography A 950, 125-130]. La mezcla de reacción tiene un volumen de 225 μl y está constituida por 50 μl de HHL 25 mM en tampón Tris HCI 200 mM pH 8.3 con NaCI 600 mM y ZnC^ 10 μM, 75 μl de una solución de ACE en el mismo tampón que corresponden a 1.5 mil de actividad, y 100 μl de péptido
(disuelto en tampón MOPS 10 mM pH 7) a diferentes concentraciones según Ia concentración final deseada en el ensayo. El enzima y el inhibidor se preincuban durante 15 minutos a 37°C y a continuación se añade el sustrato incubándose el conjunto 30 minutos a dicha temperatura. La reacción se detiene añadiendo 25 μl de HCI 6M. Para Ia determinación cromatográfica del ácido hipúrico liberado se utiliza una columna de fase inversa C18, Ia elución se lleva a cabo empleando un gradiente de acetonitrilo en agua con TFA 0.05% y se determina el ácido hipúrico midiendo Ia absorbancia a 228 nm. Los resultados aparecen en Ia Tabla 1 como actividad residual de las determinaciones de actividad ACE en presencia de cada uno de los péptidos, pudiéndose observar una inhibición significativa para los péptidos LfcinB20-25 SEQ ID NO 2 y LfcinB17-31 SEQ ID NO 1 pero no para los controles negativos. 3. Ensayos in vitro de inhibición de Ia actividad ECA sobre el sustrato natural angiotensina I. El protocolo experimental descrito en el apartado 2 se repitió empleando como sustrato Ia angiotensina I (cantidad final en el ensayo 20 μg). La determinación del producto de reacción resultante, angiotensina II, se llevó a cabo cromatográficamente utilizando una columna de fase inversa C18, un gradiente de acetonitrilo en agua con TFA 0.1 % y midiendo Ia absorbancia a 214 nm. Los resultados obtenidos se muestran en Ia Tabla 2 como actividad residual de las determinaciones de actividad ACE en presencia de cada uno de los péptidos, y ponen de manifiesto una mayor inhibición en el caso de los péptidos LfcinB20-25 SEQ ID NO 2 y LfcinB17-31 SEQ ID NO 1.
4. Ensayos in vitro de inhibición de Ia actividad ECA sobre el sustrato natural angiotensina I para el cálculo del ICs0. El protocolo experimental descrito en el apartado anterior se repitió empleando diferentes concentraciones de péptido LfcinB17-31 ; SEQ ID NO 1 : 0,1 ; 2,5; 5; 10 ; 20; 40 y 80 μM. Se efectuaron cuatro series de experimentos completos con todas las concentraciones, calculando para cada una de ellas Ia media y su desviación. La representación gráfica del valor medio correspondiente a Ia actividad residual para cada una de las concentraciones de péptido ensayadas se muestra en Ia figura 2.
A partir de estos resultados se calculó Ia concentración de LfcinB17-31 que inhibe al 50% Ia actividad ECA sobre angiotensina I (IC5o), siendo el valor obtenido 25,5 ± 4,5 μM (media aritmética ± desviación estándar de Ia media).
5. Ensayos ex vivo de inhibición de Ia contracción de arterias aisladas.
Para los ensayos ex vivo se utilizó el péptido LfcinB17-31 SEQ ID NO 1 por ser el que había presentado mayor actividad inhibitoria en los ensayos in vitro realizados anteriormente. La preparación experimental consistió en obtener segmentos cilindricos (3 mm) de arterias aisladas (arteria carótida de conejo blanco New Zealand), los cuales se dispusieron en un baño de órganos diseñado para registrar los cambios de tensión isométrica en Ia pared vascular [Salom, J. B., Burguete, M. C, Pérez-Asensio, F. J., Centeno, J. M., Torregrosa, G., y Alborch, E. (2002). Acute relaxant effects of 17-β-estradiol through non-genomic mechanisms in rabbit carotid artery. Steroids 67, 339-346]. El medio (solución Ringer-Locke) en el que se hallan inmersos los segmentos arteriales se mantiene termostatizado a 370C y continuamente burbujeado con una mezcla gaseosa de 95% O2 y 5% CO2 que Ie confiere un pH de 7,3-7,4. Los experimentos comienzan tras un periodo de 30-60 minutos necesario para alcanzar Ia estabilización en el tono pasivo de 2 g. Tras comprobar Ia viabilidad de los segmentos arteriales mediante contracción con una solución despolarizante (Ringer- Locke 50 mM KCI), cada segmento arterial se somete a una primera contracción ECA-dependiente con Angiotensina I (1 μM). Tras preincubar los segmentos durante 20 minutos con el péptido SEQ ID NO 1 (20 μM) objeto de estudio, se indujo una segunda contracción con Angiotensina I. La
Figura 3 refleja el registro de uno de estos experimentos. Como control, se dejaron algunos segmentos sin preincubar con péptido alguno. La Tabla 3 muestra el resumen estadístico de todos los experimentos realizados y pone de manifiesto un efecto inhibitorio significativo de SEQ ID NO 1 sobre Ia contracción de arteria carótida inducida por el tratamiento con angiotensina I.
Tabla 1.
Efecto de distintos péptidos sobre Ia actividad in vitro de ECA sobre el sustrato artificial HHL. Se indican los porcentajes de actividad residual de Ia ECA -con respecto al control sin péptido añadido (valor 100)- para una concentración de péptido en el ensayo de 20 μM, expresándose estos valores como Ia media ± desviación estándar de un número de repeticiones independientes (indicado entre paréntesis). Los valores seguidos de Ia misma letra minúscula no difieren entre sí con una confianza del 99% (Test de separación de medias HSD de Tukey). Los asteriscos indican diferencias significativas con respecto a Ia actividad del control sin péptido (Test de Ia t-Student) con una confianza del 99% (* p<0,01 ) o del 99,9% (** p<0,001 ).
Péptido Actividad Residual (%)
LfcinB17-31 (20 μM)
62 ± 6 (4) (C) * SEQ ID NO 1
LfcinB20-25 (20 μM)
71 ± 8 (6) (C) ** SEQ ID NO 2
P20D (20 μM)
133 ± 19 (3) (a) SEQ ID NO 3
P26D (20 μM)
101 ± 7 (4) (b) SEQ ID NO 4
P36D (20 μM)
103 ± 14 (7) (b) SEQ ID NO 5 Tabla 2.
Efecto de distintos péptidos sobre Ia actividad in vitro de ECA sobre el sustrato natural angiotensina I. Se indican los porcentajes de actividad residual de Ia ECA -con respecto al control sin péptido añadido (valor 100)- para una concentración de péptido en el ensayo de 20 μM, expresándose estos valores como Ia media ± desviación estándar de un número de repeticiones independientes (indicado entre paréntesis). Los valores seguidos de Ia misma letra minúscula no difieren entre sí con una confianza del 99% (Test de separación de medias HSD de Tukey). Los asteriscos indican diferencias significativas con respecto a Ia actividad del control sin péptido (Test de Ia t-Student) con una confianza del 99% (* p<0,01 ) o del 99,9% (** p<0,001 ).
Figure imgf000022_0001
Tabla 3.
Efecto inhibidor del péptido SEQ ID NO 1 descr ito en Ia presente invención como inhibidor de ECA sobre Ia contracción ECA-dependiente con angiotensina I en arterias aisladas de conejo. Los resultados indican Ia contracción de Ia arteria en respuesta al tratamiento con angiotensina I (1 μM), en % respecto a una respuesta previa en el mismo segmento arterial, y se expresan como Ia media ± desviación estándar de Ia determinación sobre (n) segmentos arteriales. El control se realizó sin adición de péptido. Los asteriscos indican diferencia significativa con respecto al control (Test de Ia t-Student) con una confianza del 99% (** p<0,01 ).
Figure imgf000023_0001
EJEMPLO 2.
1. Obtención del hidrolizado de lactoferrina. Para Ia obtención del hidrolizado de lactoferrina se ha utilizado como enzima Ia pepsina siguiendo el protocolo descrito por Facón y Skura (1996) (Antibacterial activity of Lactoferricin, Lysozyme and EDTA Against Salmonella enteritidis. Int. Dairy Journal 6, 303-313). El hidrolizado obtenido contenía 7.6 mg de proteína/ml.
2. Ensayos in vitro de inhibición de Ia actividad ECA sobre el sustrato artificial HHL. Como ejemplo 1. Los resultados aparecen en Ia Tabla 4 como actividad residual de las determinaciones de actividad ACE en presencia del hidrolizado mostrando una inhibición significativa para el mismo pero no para los controles negativos (LF sin hidrolizar y pepsina).
3. Ensayos in vitro de inhibición de Ia actividad ECA sobre el sustrato HHL para el cálculo del IC50. El protocolo experimental descrito en el apartado anterior se repitió empleando diferentes concentraciones de hidrolizado expresadas como μg/ml. Se efectuaron al menos tres series de experimentos completos e independientes con todas las concentraciones, calculando para cada una de ellas Ia media y su desviación. La representación gráfica del valor medio correspondiente a Ia actividad residual para cada una de las concentraciones de péptido ensayadas se muestra en Ia Figura 4. A partir de estos resultados se calculó Ia concentración de hidrolizado que inhibe al 50% Ia actividad ECA sobre angiotensina I (IC5o), siendo el valor obtenido 161 ±9 μg/ml (media aritmética ± desviación estándar de Ia media).
4. Ensayos ex vivo de inhibición de Ia contracción de arterias aisladas.
Para los ensayos ex vivo se utilizó el hidrolizado de LF a las concentraciones de 76, 228 y 760 μg de proteína/ml en el ensayo. La preparación experimental consistió en obtener segmentos cilindricos (3mm) de arterias aisladas (arteria carótida de conejo blanco New Zealand), los cuales se dispusieron en un baño de órganos diseñado para registrar los cambios de tensión isométrica en Ia pared vascular [Salom, J. B., Burguete, M. C, Pérez-Asensio, F. J., Centeno, J. M., Torregrosa, G., y Alborch, E. (2002). Acute relaxant effects of 17-β-estradiol through non-genomic mechanisms in rabbit carotid artery. Steroids 67, 339-346]. El medio
(solución Ringer-Locke) en el que se hallan inmersos los segmentos arteriales se mantiene termostatizado a 370C y continuamente burbujeado con una mezcla gaseosa de 95% O2 y 5% CO2 que Ie confiere un pH de 7,3-7,4. Los experimentos comienzan tras un periodo de 30-60 minutos necesario para alcanzar Ia estabilización en el tono pasivo de 2g. Tras comprobar Ia viabilidad de los segmentos arteriales mediante contracción con una solución despolarizante (Ringer-Locke 50 mM KCI), cada segmento arterial se somete a una primera contracción ECA-dependiente con Angiotensina I (1 μM). Tras preincubar los segmentos durante 20 minutos con el hidrolizado objeto de estudio, se indujo una segunda contracción con
Angiotensina I. La Figura 2 refleja el registro de uno de estos experimentos. Como control, se dejaron algunos segmentos sin preincubar con inhibidor alguno. La Tabla 5 muestra el resumen estadístico de todos los experimentos realizados y pone de manifiesto un efecto inhibitorio significativo del hidrolizado sobre Ia contracción de arteria carótida inducida por el tratamiento con angiotensinal así como el nulo efecto de Ia pepsina y Ia lactoferrina sin hidrolizar
Tabla 4
Efecto del hidrolizado de LF, pepsina y LF, sobre Ia actividad in vitro de ECA empleando el sustrato artificial HHL. Se indican los porcentajes de actividad residual de Ia ECA -con respecto al control sin inhibidor (valor 100)- para una concentración de hidrolizado en el ensayo de 760 μg/ml, expresándose estos valores como Ia media ± desviación estándar de un número de repeticiones independientes (indicado entre paréntesis). Los tres valores difieren entre sí con una confianza del 99% (Test de separación de medias HSD de Tukey)
Figure imgf000025_0001
Tabla 5
Efecto inhibidor del hidrolizado de LF, pepsina y LF sobre Ia contracción ECA- dependiente con angiotensina I en arterias aisladas de conejo. Los resultados indican Ia contracción de Ia arteria en respuesta al tratamiento con angiotensina I (1 μM), en porcentaje respecto a una respuesta previa en el mismo segmento arterial, y se expresan como Ia media ± desviación estándar de Ia determinación sobre (n) segmentos arteriales. El control se realizó sin adición de inhibidor.
Los asteriscos indican diferencias significativas con respecto al control (Test de Dunnet) con una confianza del 95% (* p<0,05) y del 99% (** p<0,01).
Figure imgf000026_0001

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso del péptido bioactivo derivado de lactoferrina como inhibidor de Ia enzima conversora de angiotensina I (ECA) in vitro y/o como inhibidores de Ia vasoconstricción ECA- dependiente ex vivo, caracterizado por Ia secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 1 o un fragmento activo de Ia misma.
2. Uso del péptido biactivo derivado de lactoferrina como inhibidor de Ia enzima conversora de angiotensina (ECA) in vitro y/o como inhibidores de Ia vasoconstricción ECA- dependiente ex vivo según Ia reivindicación 1 caracterizado por Ia secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2 que es un fragmento activo de SEQ ID NO 1
3. Uso de un péptido bioactivo como inhibidor de Ia enzima conversora de angiotensina I (ECA) in vitro y/o como inhibidores de Ia vasoconstricción ECA- dependiente ex vivo caracterizado porque su secuencia de aminoácidos sólo difiere de SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 según las reivindicaciones 1 y 2 por cambios conservativos
4. Uso de un péptido bioactivo como inhibidor de Ia enzima conversora de angiotensina I (ECA) in vitro y/o como inhibidores de Ia vasoconstricción ECA- dependiente ex vivo caracterizado porque su secuencia de aminoácidos contiene las SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 según las reivindicaciones 1 y 2 o cambios conservativos en las mismas según Ia reivindicación 3
5. Uso de péptidos, hidrolizado de lactoferrina con pepsina o sus fracciones peptídicas procedentes de este hidrolizado , en particular aquellos que contuvieran las secuencias de aminoácidos de los péptidos de SEQ ID NO
1 y SEQ ID NO 2 descritos en las reivindicaciones 1 a 4 d como inhibidores de Ia enzima conversora de angiotensina I (ECA) in vitro y/o como inhibidores de Ia vasoconstricción ECA- dependiente ex vivo,
6. Procedimiento para producir productos funcionales de secuencia SEQ ID N0 1 y SEQ ID N0 2 según Ia reivindicaciones 1 y 2 caracterizado por i. obtenerse por hidrólisis del material de partida, que sería cualquier sustrato apropiado que contenga una o más proteínas o péptidos, de origen animal, vegetal o procedentes de microoganismos, preferiblemente lactoferrina o sus fragmentos cuya secuencia de aminoácidos comprendiese Ia secuencia de aminoácidos de alguno de los péptidos bioactivos de interés indicados en Ia reivindicaciones 1 y 2 ii. disolverse o dispersarse dicho material de partida, a una concentración apropiada, en agua o en una disolución tampón, a un pH adecuado para Ia actuación de las enzimas proteolíticas, iii. emplearse como combinación de enzimas proteolíticas capaces de romper Ia proteína presente en el material de partida y proporcionar los péptidos de interés, Ia pepsina a pH 2.0-3.0 iv. el tiempo de reacción estaría comprendido entre 10 min y 24 horas, pero, preferiblemente durante un tiempo aproximado de
4 horas.
7. Producto funcional caracterizado porque para su obtención se emplean los procedimientos indicados en Ia reivindicación 6,
8. Producto funcional según Ia reivindicación 7, caracterizado porque se trata del hidrolizado enzimático (iii), cualquiera de sus fracciones, o una purificación de los mismos que contenga al menos alguno de los péptidos SEQ ID N0 I y SEQ ID N0 2
9. Aditivo, ingrediente o suplemento alimentario funcional caracterizada por comprender al menos alguno de los productos bioactivos con actividad inhibidora ECA in vitro y/o como inhibidores de Ia vasoconstricción ECA- dependiente ex vivo indicados en las reivindicaciones 1 a 5, 7 y 8
10. Producto alimentario funcional caracterizada por comprender al menos alguno de los productos bioactivos con actividad IECA in vitro y/o como inhibidores de Ia vasoconstricción ECA- dependiente ex vivo indicados en las reivindicaciones 1 a 5, 7 y 8.
11. Composición farmacéutica caracterizada por comprender al menos alguno de los productos bioactivos con actividad IECA in vitro y/o ex vivo indicados en las reivindicaciones 1 a 5, 7 y 8
12. Uso de aditivo, ingrediente, o producto alimentario funcional según Ia reivindicaciones 9 y 10 en Ia elaboración de un producto alimentario funcional favorable para reducir Ia hipertensión.
13. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 11 para su uso en Ia elaboración de un medicamento destinado al tratamiento de Ia hipertensión.
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