ES2328435B1

ES2328435B1 - Mejora de la patente peptidos derivados de una proteina lactea con actividad inhibidora de la enzima conversora de angiotensina i.

Info

Publication number: ES2328435B1
Application number: ES200700684A
Authority: ES
Inventors: Paloma Manzanares Mir; Jose Fco. Marcos Lopez; Maria Enrique Lopez; Salvador Valles Alventosa; Jose Maria Centeno Guil; Joan Bta. Salom Salvanero; German Torregrosa Bernabe; Enrique Alborch Dominguez; Pedro Ruiz Gimenez
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universitat de Valencia; Fundacion para la Investigacion del Hospital Universitario y Politecnico La Fe de La Comunidad Valenciana
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universitat de Valencia; Fundacion para la Investigacion del Hospital Universitario y Politecnico La Fe de La Comunidad Valenciana
Priority date: 2006-04-05
Filing date: 2007-03-15
Publication date: 2010-10-13
Anticipated expiration: 2027-03-15
Also published as: WO2007113365A1; ES2328435A1; ES2321358A1; ES2321358B1; WO2007113365B1

Abstract

Mejora de la patente péptidos derivados de una proteína láctea con actividad inhibidora de la enzima conversora de angiotensina I.

La invención consiste en la utilización de un hidrolizado de lactoferrina que contiene los productos bioactivos derivados de las proteínas lácteas. Se trata de un péptido de quince residuos de aminoácidos (llamado LfcinB17 31), y de otro que es una versión reducida del mismo (llamado LfcinB20 25), derivados de la lactoferrina bovina como inhibidores efectivos de la enzima conversora de la angiotensina (ECA). Los péptidos objetos de la patente obtienen enzimáticamente y dan lugar a péptidos con actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina in vitro y/o ex vivo, midiendo la disminución de la contracción de arterias carótidas de conejo inducida por exposición a angiotensina I. Estos productos nutracéuticos, ya sea como péptido biactivos, son tanto útiles para la industria alimentaría como para la farmacéutica.

Description

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Sector de la técnica

Industria agroalimentaria; Alimentos funcionales; Ingredientes bioactivos; Farmacología de la hipertensión.

Estado de la técnica

La hipertensión, que consiste en un aumento de la presión sanguínea superior a la deseable para la salud, es un problema sanitario bastante serio ya que está relacionada con un alto riesgo de complicaciones cardio- y cerebro-vasculares. El accidente cerebrovascular agudo, también denominado ictus, constituye, después de las enfermedades isquémicas cardíacas y del cáncer, la tercera causa de mortalidad y la primera de discapacidad permanente en las sociedades occidentales avanzadas. La mayoría de accidentes cerebrovasculares agudos (85%) son de tipo "isquémico", y tienen su origen en la oclusión aguda por un trombo ("trombosis") o un émbolo ("embolia") de una de las principales arterias cerebrales, lo que origina un descenso en la perfusión sanguínea ("isquemia") y consiguiente necrosis ("infarto") de la región cerebral irrigada por dicha arteria. El resto de accidentes cerebrovasculares (15%) son de tipo "hemorrágico", originados por la rotura de un vaso sanguíneo en el propio parénquima cerebral ("hemorragia intracerebral") o en la superficie cerebral ("hemorragia subaracnoidea").

De lo dicho anteriormente se desprende que en el desarrollo de estas enfermedades falla la correcta regulación de la presión arterial sistémica, en la que interviene un complejo sistema regulador llamado sistema renina-angiotensina (SRA), y del que forman parte la renina, la enzima conversora de la angiotensina (ECA), la aldosterona, y las angiotensinas I y II.

Este SRA es un sistema hormonal circulante, y concretamente la renina y la ECA son dos peptidasas que forman parte del mismo y que actúan secuencialmente sobre una serie de pequeños péptidos, reguladores en última instancia de la presión sanguínea. En los seres humanos, la renina se libera en el riñón y la ECA se encuentra presente principalmente en las células endoteliales vasculares, en los pulmones, en los riñones y en el cerebro.

Este sistema renina-angiotensina se activa en determinadas situaciones mediante la actuación de la renina sobre un péptido precursor denominado angiotensinógeno (de procedencia hepática), el cual se convierte en el decapéptido angiotensina I. Esta angiotensina I, inactiva desde el punto de vista biológico, se transforma a su vez por acción de la ECA en angiotensina II al separarse el dipéptido a partir de su extremo C-terminal. La angiotensina II generada es un potente vasoconstrictor que ejerce su acción tras la unión a sus receptores específicos denominados "receptores AT_{1}". Dicha acción se traduce en la contracción de los vasos sanguíneos que como consecuencia produce un aumento de la presión sanguínea. Además de contribuir a la formación de la angiotensina II, la ECA también actúa sobre otro péptido circulante, el nonapéptido llamado bradiquinina, potente agente vasodilatador que pierde esta característica al ser hidrolizado.

Por todo lo expuesto anteriormente, la interferencia farmacológica con el SRA podría tener efectos beneficiosos en el tratamiento de los desórdenes vasculares asociados con la hipertensión. La inhibición de la actividad ECA permitiría disminuir la formación de angiotensina II además de reducir la pérdida de funcionalidad de la bradiquinina, evitando de esta manera la acción vasoconstrictora de la primera y potenciando la acción vasodilatadora de la segunda. A este respecto se ha puesto de manifiesto en numerosos estudios la eficacia de los inhibidores de ECA reduciendo la morbilidad y la mortalidad en pacientes con fallo cardíaco, síndrome cardio-metabólico y diabetes.

A pesar de su demostrada eficacia en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares asociadas a la hipertensión, los fármacos inhibidores del ECA disponibles en la actualidad no pueden considerarse la opción definitiva. Por su falta de especificidad estos fármacos no son bien tolerados por algunos pacientes en los que se presentan efectos secundarios indeseables como tos seca y angioedema; además, no bloquean completamente la síntesis de angiotensina II ya que ésta sigue otras vías de síntesis que no dependen del ECA. Es necesario, por lo tanto, encontrar nuevos inhibidores del ECA con mayor especificidad y que puedan ser co-administrados con otros fármacos, como por ejemplo los "bloqueadores del receptor de angiotensina", para el tratamiento óptimo de los desórdenes vasculares de origen hipertensivo ligados al SRA a la vez que se minimizan los efectos secundarios antes citados. Incluso y según las características de los inhibidores seleccionados, podría conseguirse una aproximación mas natural del tratamiento al añadir dichos inhibidores a los alimentos, lo cual produciría un efecto positivo tanto sobre dicho tratamiento como sobre la prevención de los síntomas inherentes a la hipertensión.

Hasta la fecha se han publicado numerosos trabajos bibliográficos relacionados con la inhibición de ECA mediante el empleo de pequeños péptidos sintéticos como principales responsables de dicha inhibición. Estos péptidos presentan una gran variabilidad pues tienen diferentes longitudes y estructuralmente difieren en las secuencias de los aminoácidos que los constituyen [Patchett, A.A., Harris, E., Tristram, E.W., Wyvratt, M.J., Wu, M.T., Taub, D., Peterson, E.R., Ikeler, T.J., Broeke, J.Ten., Payne, L.G., Ondeyka, D.L., Thorsett, E.D., Greenlee, W.J., Lohr, N.S., Hoffsommer, R.D., Joshua, H., Ruyle, W.V., Rothrock, J.W., Aster, S.D., Maycock, A.L., Robinson, F.M., Hirschmann, R., Sweet, C.S., Ulm, E.H., Gross, D.M., Vassil, T.C. y Stone, C.A. (1980). A new class of angiotensin-converting enzyme inhibitors. Nature 288, 280-283; Ondetti, M.A., Rubin, B. y Cushman, D.W. (1977). Design of specific Inhibitors of angiotensin-converting enzyme: New class of orally active antihypertensive agents. Science 196, 441-444; Cushman, D.W., Cheung, H.S., Sabo, E.F. y Ondetti, M.A. (1977). Design of potent competitive inhibitors of angiotensin-converting enzyme. carboxyalkanoyl and mercaptoalkanoyl amino acids. Biochemistry 16 (25), 5484-5491; Cushman, D.W., Cheung, H.S., Sabo, E.F. y Ondetti, M.A. (1981). Angiotensin converting enzyme inhibitors. evolution of a new class of antihypertensive drugs. En: Angiotensin converting enzyme inhibitors. Mechanisms of action and clinical implications. Section I, pp3-25. Ed. Horovitz, Z.P., Urban & Schwarzenberg (Baltimor-Munich); Edling, O., Bao, G., Feelisch, M., Unger, T. y Gohlke, P. (1995). Moexipril, a new angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitor: Pharmacological characterization and comparison with enalapril. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 275 (2), 854-863; Gómez-Ruiz, J.A., Recio, I. y Belloque, J. (2004). ACE-Inhibitory activity and structural properties of peptide Asp-Lys-Ile-His-Pro [\beta-CN f(47-51)]. Study of the peptide forms synthesized by different methods. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52 (20), 6315-6319; Cotton, J., Hayashi, M.A.F., Cuniasse, P., Vazeux, G., Lanzer, D., De Camargo, A.C.M. y Dive, V. (2002). Selective inhibition of the c-domain of angiotensin i converting enzyme by bradykinin potentiating peptides. Biochemistry 41 (19), 6065-6071; Lau, C-P., Tse, H-F., Ng, W., Chan, K-K., Li, S-K., Keung, K-K., Lau, Y-K., Chen, W-H., Tang, Y-W. y Leung, S-K. (2002). Comparison of Perindopril Versus Captopril for Treatment of Acute Myocardial Infarction. American Journal of Cardiology 89 (15), 150-154; Smith, A.I., Lew, R.A., Shrimpton, C.N., Evans, R.G. y Abbenante, G. (2000). A Novel Stable Inhibitor of Endopeptidases EC 3.4.24.15 and 3.4.24.16 Potentiates Bradykinin-Induced Hypotension. Hypertension 35, 626-630; Azizi, M., Massien, C., Michaud, A. y Corvol, P. (2000). In vitro and in vivo inhibition of the 2 active sites of ace by omapatrilat, a vasopeptidase inhibitor. Hypertension 35, 1226-1231; Hou, W-C., Chen, H-J. y Lin, Y-H. (2004). Antioxidant peptides with angiotensin converting enzyme inhibitory activities and applications for angiotensin converting enzyme purification. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51 (6), 1706-1709, ES200600881 Hexapeptidos inhibidores de la enzima conversora de angiotensina i].

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Así mismo, también se han llevado a cabo estudios con el fin de aislar e identificar inhibidores de carácter natural presentes en los alimentos. En numerosos casos se ha llegado a identificar como responsables ciertos péptidos naturales llegando incluso a la determinación de su secuencia. De esta manera se han podido sintetizar la mayoría de ellos con el fin de confirmar su actividad. Como materia prima, se emplean proteínas tanto de origen animal como vegetal [WO2005012355 Bioactive peptides derived from the proteins of egg white by means of enzymatic hydrolysis; Li, G-H., Le, G-W., Shi, Y-H. y Shrestha S. (2004). Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins and their physiological and pharmacological effects. Nutrition Research 24, 469-486; Pripp, A.H., Isaksson, T., Stepaniak, L. y Sorhaug, T. (2004). Quantitative structure-activity relationship modelling of ACE-inhibitory peptides derived from milk proteins. European Food Research and Technology. 219, 579-583; Robert, M-C., Razaname, A., Mutter, M. y Juillerat, M.A. (2004). Identification of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from sodium caseinate hydrolysates produced by Lactobacillus helveticus NCC 2765. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52 (23), 6923-6931; Chen, T-L., Lo, Y-C., Hu, W-T., Wu, M-C., Chen, S-T. y Chang, H-M. (2003). Microencapsulation and Modification of synthetic peptides of food proteins reduces the blood pressure of spontaneously hypertensive rats. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51 (6), 1671-1675; Fujita, H. y Yoshikawa, M. (1999). LKPNM: a prodrug-type ACE-inhibitory peptide derived from fish protein. Immunopharmacology 44, 123-127; Pihlanto-Leppälä, A. (2001). Bioactive peptides derived from bovine whey proteins: opioid and Ace-inhibitory peptides. Trends in Food Science & Technology 11, 347-356; Suetsuna, K. y Nakano, T. (2000). Identification of an antihypertensive peptide from peptic digest of wakame (Undaria pinnatifida). Journal of Nutritional Biochemistry 11, 450-454; Yokoyama, K., Chiba, H. y Yoshikawa, M. (1992). Peptide inhibitors for angiotensin I-converting enzyme from thermolysin digest of dried bonito. Bioscience Biotechechnology and Biochemistry 56 (10), 1541-1545; Yano, S., Suzuki, K. y Funatsu, G. (1996). Isolation from \alpha-zein of thermolysin peptides with angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity. Bioscience Biotechechnology and Biochemistry 60 (4), 661-663; Wako, Y., Ishikawa, S. y Muramoto, K. (1996). Angiotensin I-converting enzyme inhibitors in autolysates of squid liver and mantle muscle. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 60 (8), 1353-1355; Suetsuna, K. (1998). Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitor dipeptides derived from Allium sativum L (garlic). Journal of Nutritional Biochemistry 9, 415-419; Pihlanto-LeppÄIä, A., Rokka, T. y Coronen, H. (1998). Angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides derived from bovine milk proteins. International Dairy Journal 8, 325-331; Kohama, Y., Matsumoto, S., Oka, H., Teramoto, T., Okabe, M. y Mimura, T. (1988). Isolation of angiotensin-converting enzyme inhibitor from tuna muscle. Biochemical and Biophysical Research Communications 155 (1), 332-337. Maruyama, S., Miyoshi, S. y Tanaka, H. (1989). Angiotensin I-converting enzyme inhibitors derived from Ficus carica. Agric. Biol. Chem. 53 (10), 2763-2767; Ariyoshi, Y. (1993). Angiotensin-converting enzyme inhibitors derived from food proteins. Trends in Food Science & Technology 4, 139-144; Takayanagi, T. y Yokotsuka, K. (1999). Angiotensin I converting enzyme-inhibitory peptides from wine. Am. J. Enol. Vitic. 50 (1), 65-68; Fuglsang, A., Nilsson, D. y Nyborg, N.C.B. (2003). Characterization of new milk-derived inhibitors of angiotensin converting enzyme in vitro and in vivo. Journal of Enzyme Inhibition and Medical Chemistry 18 (5), 407-412].

Por otra parte, las Lactoferrinas (LF) son glicoproteínas abundantes en la leche materna de mamíferos y tienen múltiples funciones biológicas, entre las que destacan sus propiedades antimicrobianas [Farnaud, S. y Evans, R. W. (2003). Lactoferrin - a multifunctional protein with antimicrobial properties. Molecular Immunology 40, 395-405; Orsi, N. (2004). The antimicrobial activity of lactoferrin: Current status and perspectives. BioMetals 17, 189-196]. LF recombinantes de origen humano o vacuno han sido producidas en hongos, plantas y animales mediante la tecnología del DNA recombinante, con vistas a obtener efectos terapéuticos o para su utilización en alimentos funcionales [Nandi, S., Suzuki, Y. A., Huang, J. M., Yalda, D., Pham, P., Wu, L. Y., Bartley, G., Huang, N., y Lonnerdal, B. (2002). Expression of human lactoferrin in transgenic rice grains for the application in infant formula. Plant Science 163, 713-722; van Berkel, P. H. C., Welling, M. M., Geerts, M., van Veen, H. A., Ravensbergen, B., Salaheddine, M., Pauwels, E. K. J., Pieper, F., Nuijens, J. H., y Nibbering, P. H. (2002). Large scale production of recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic cows. Nature Biotechnology 20, 484-487; Ward, P. P., Piddington, C. S., Cunningham, G. A., Zhou, X. D., Wyatt, R. D., y Conneely, O. M. (1995). A system for production of commercial quantities of human Lactoferrin - A broad-spectrum natural antibiotic. Bio-Technology 13, 498-503; Zhang, Z. Y., Coyne, D. P., Vidaver, A. K., y Mitra, A. (1998). Expression of human lactoferrin cDNA confers resistance to Ralstonia solanacearum in transgenic tobacco plants. Phytopathology 88, 730-734; Chong, D. K. y Langridge, W. H. (2000). Expression of full-length bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants. Transgenic Research 9, 71-78]. En la actualidad existen ejemplos de péptidos derivados de LF en fase avanzada de desarrollo para su utilización como fármacos [Zasloff, M. (2002). Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395]. En concreto, las Lactoferricinas (Lfcin) son péptidos aislados de la región N-terminal de LF por digestión con pepsina, los cuales presentan propiedades antimicrobianas [Bellamy, W., Takase, M., Yamauchi, K., Wakabayashi, H., Kawase, K., y Tomita, M. (1992). Identification of the bactericidal domain of lactoferrin. Biochimica et Biophysica Acta 1121, 130-136; WO2004/089986, Antimicrobial peptide from transferrin family]. La estructura primaria de la lactoferricina bovina (LfcinB) corresponde a los residuos 17-41 de LF y tiene potente actividad antimicrobiana [Bellamy, W., Takase, M., Yamauchi, K., Wakabayashi, H., Kawase, K., y Tomita, M. (1992). Identification of the bactericidal domain of lactoferrin. Biochimica et Biophysica Acta 1121, 130-136; Tomita, M., Wakabayashi, H., Yamauchi, K., Teraguchi, S., y Hayasawa, H. (2002). Bovine lactoferrin and lactoferricin derived from milk: production and applications. Biochemistry and Cell Biology 80, 109-112].

La hidrólisis enzimática de las LF, también da lugar a una mezcla de péptidos con diferentes propiedades biológicas tales como capacidad antimicrobiana [Min, S. y Krochta, J.M. (2005). Inhibition of Penicillium commune by edible whey protein films incorporating lactoferrin, lactoferrin hydrolysate, and lactoperoxidase systems. Journal of Food Science 70, M87-M94; Murdock, C.A. y Matthews, K.R. (2002). Antibacterial activity of pepsin-digested lactoferrin on foodborne pathogens in buffered broth systems and ultra-hig temperature milk with EDTA. Journal of Applied Microbiology 93, 850-856; Masschalck, B., van Houdt, R. y Michiels, C.V. (2001). High pressure increases bactericidal activity and spectrum of lactoferrin, lactoferricin and nisin. International Journal of Food Microbiology 64, 325-332;Yamauchi, K., Takase, M. y Kawase, K. (1992). Antibacterial activity of bovine lactoferrin and hydrolysate of bovine lactoferrin. Japanese Journal of Dairy and Food Science 41, A195-A200; Ulvatne, H. y Vorland, L.H. (2001). Bactericidal Kinetics of 3 Lactoferricins Against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Scandinavian Journal of Infectious Diseases 33, 507-511; Bellamy, W., Wakabayashi, H., Takase, M., Kawase,K., Shimamura, S. y Tomita, M. (1993). Killing of Candida albicans by lactoferricin B, a potent antimicrobial peptide derived from the N-terminal region of bovine lactoferrin. Medical Microbiology and Immunology 182, 97-105.], efecto inmunomodulador [Miyauchi, H., Kaino, A., Shinoda, I., Fukuwatari, Y. y Hayasawa, H. (1997). Immunomodulatory effect of bovine lactoferrin pepsin hydrolysate on murine splenocytes and Peyer's Patch cells. Journal of Dairy Science 80, 2330-2339; Samuelsen, Ø., Haukland, H.H., Ulvatne, H. y Vorland, L.H. (2004). Anti-complement effects of lactoferrin-derived peptides. FEMS Immunology and Medical Microbiology 41, 141-148; Mercier, A., Gauthier, S.F. y Fliss, I. (2004). Immunomodulating effects of whey proteins and their enzymatic digests. International Dairy Journal 14, 175-183] y actividad antitumoral [Yang, N., Rekdal, Ø., Stensen, W. y Svendsen, J. S. (2002). Enhanced antitumor activity and selectivity of lactoferrin-derived peptides. Journal of Peptide Research 60, 187-197; Wang, W.P., ligo, M., Sato, J., Sekine, K., Adachi, I. y Tsuda, H. (2000). Activation of Intestinal Mucosal Immunity in Tumor-bearing Mice by Lactoferrin. Cancer Science 91, 1022-1027; ligo, M., Shimamura, M., Matsuda, E., Fujita, K., Nomoto, H., Satoh, J., Kojima, S., Alexander, D.B., Moore, M.A. y Tsuda, H. (2004). Orally administered bovine lactoferrin induces caspase-1 and interleukin-18 in the mouse intestinal mucosa: a possible explanation for inhibition of carcinogenesis and metastasis. Cytokine 25, 36-44; ligo, M., Kuhara, T., Ushida, Y., Sekine, K., Moore, M.A. y Tsuda, H. (1999). Inhibitory effects of bovine lactoferrin on colon carcinoma 26 lung metastasis in mice. Clinical and Experimental Metastasis 17, 43-49; Yang, N., Strøm, M.B., Mekonnen, S.M., Svendsen, J.S. y Rekdal, Ø. (2004). The effects of shortening lactoferrin derived peptides against tumour cells, bacteria and normal human cells. Journal of Peptide Science 10, 37-46; Eliassen, L.T., Haug, B.E., Berge, G. y Rekdal, Ø. (2003). Enhanced antitumour activity of 15-residue bovine lactoferricin derivatives containing bulky aromatic amino acids and lipophilic N-terminal modifications. Journal of Peptide Science 9, 510-517] entre otras.

En la presente invención se describe la aplicación de un hidrolizado enzimático de LF, obtenido mediante digestión con pepsina, previamente descrito como antimicrobiano [Murdock, C.A. y Matthews, K.R. (2002). Antibacterial activity of pepsin-digested lactoferrin on foodborne pathogens in buffered broth systems and ultra-hig temperature milk with EDTA. Journal of Applied Microbiology 93, 850-856], inmunomodulador [Miyauchi, H., Kaino, A., Shinoda, I., Fukuwatari, Y. y Hayasawa, H. (1997). Immunomodulatory effect of bovine lactoferrin pepsin hydrolysate on murine splenocytes and Peyer's Patch cells. Journal of Dairy Science 80, 2330-2339] o antitumoral [Yang, N., Rekdal, Ø., Stensen, W. y Svendsen, J. S. (2002). Enhanced antitumor activity and selectivity of lactoferrin-derived peptides. Journal of Peptide Research 60, 187-197] y ahora caracterizado en la presente invención por tener actividad inhibidora de ECA.

Como cualquier experto en el tema puede apreciar, dicho hidrolizado de LF contiene necesariamente o bien los péptidos SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO2, descritos en la PATENTE ES200600881 o bien péptidos que contengan secuencias de dichos péptidos.

La inhibición de la actividad ECA se manifiesta en ensayos realizados in vitro, midiendo la inhibición de la conversión de un sustrato artificial (HHL, Hipuril-Histidil-Leucina), y en ensayos realizados ex vivo, midiendo la disminución de la contracción de arterias carótidas de conejo inducida por exposición a angiotensina I.

Breve descripción de la invención

La presente invención está relacionada con los sectores farmacológico y de la industria agroalimentaria y consiste en la aplicación de un hidrolizado enzimático de LF obtenido con pepsina como inhibidor efectivo de la enzima conversora de la angiotensina (ECA) que se halla implicada en la formación del compuesto angiotensina II que es un vasoconstrictor responsable, entre otras causas/mecanismos, de la hipertensión. La actividad inhibidora se manifiesta por una reducción de la actividad ECA determinada en ensayos in vitro, así como por una reducción de la contracción ECA dependiente ex vivo empleando segmentos de arterias. Se describe la potencial utilización del hidrolizado inhibidor de ECA, o de péptidos inhibidores derivados del mismo, como compuestos bioactivos para el control de la hipertensión. En el apartado de ejemplos particulares, se describe la actividad inhibidora de ECA tanto del hidrolizado como de dichos péptidos cuando se emplean como sustratos Hipuril-Histidil-Leucina (HHL) y angiotensina I. La actividad inhibidora se ha demostrado en condiciones in vitro empleando ECA purificada a partir de riñón de cerdo y ex vivo empleando segmentos de arteria carótida de conejo.

Descripción detallada de la invención

En la presente invención se describe la aplicación de un hidrolizado enzimático de LF obtenido con pepsina con actividad de inhibición de la enzima conversora de angiotensina (ECA), implicada en los mecanismos de control de la presión arterial. En sendos ejemplos particulares, se describe su utilización como inhibidor de ECA mediante el empleo de sustratos artificiales como el Hipuril-Histidil-Leucina (HHL) o naturales como la angiotensina I, así como su efecto inhibidor sobre la contracción ECA-dependiente de segmentos de arterias de conejo.

Los inhibidores descritos en la presente invención son el hidrolizado enzimático de LF obtenido con pepsina así como los péptidos bioactivos derivados del mismo, entre los cuales podrían encontrarse la secuencia de quince aminoácidos SEQ ID NO 1 y la de seis aminoácidos SEQ ID NO 2 descritos en el documento de patente de invención ES200600881 y distinta de los péptidos inhibidores de ECA conocidos anteriormente [Guan-Hong Li, Guo-Wei Le, Yong-Hui Shi y Sundar Shrestha (2004). Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins and their physiological and pharmacological effects. Nutrition Research 24, 469-486; Dziuba, J., Minkiewicz, P., Nalecz, D. y Iwaniak, A. (1999). Database of biologically active peptide sequences. Nahrung 43, 190-195; Fujita, H., Yokoyama, K. y Yoshikawa, M. Classification and antihypertensive activity of angiotensin i-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins. Jounal of Food Science 65, 564-569; Reed, J. D., Edwards, D. L., y Gonzalez, C. F. (1997)].

En la presente invención se describen ensayos experimentales que ilustran la actividad del hidrolizado en condiciones experimentales in vitro, utilizando ECA purificada de riñón de cerdo y un sustrato artificial denominado HHL El primero de los sustratos permite llevar a cabo una serie de ensayos encaminados a conocer la capacidad inhibidora, mientras que el segundo permite contrastar los resultados obtenidos con el anterior y además comprobar dicha capacidad inhibidora de ECA en el caso de utilizar sustratos naturales. Como prueba de la especificidad de la inhibición, en la presente invención también se describe la ausencia de actividad inhibidora in vitro con LF sin hidrolizar y pepsina de secuencia relacionada, pero distinta a la de los dos inhibidores descritos.

La actividad inhibidora del hidrolizado descrito en la presente invención se manifiesta con una reducción de la actividad de la ECA al llevar a cabo los ensayos in vitro en las condiciones establecidas, como queda demostrado mediante los ensayos experimentales descritos en la presente invención.

La actividad inhibidora del hidrolizado descrito en la presente invención también se manifiesta con una reducción de la contracción ECA-dependiente de arteria carótida de conejo, inducida mediante la adición de angiotensina I en ensayos ex vivo.

Considerando las propiedades del hidrolizado descrito en la presente invención, es obvio para todo aquel experto en el tema su potencial utilización como aditivo alimentario, compuesto o fármaco de utilidad en la prevención o frente a enfermedades que tengan como causa o sintomatología la hipertensión arterial.

Breve descripción de la figuras

Figura 1. Efecto de la concentración del hidrolizado de LF (en \mug/ml) sobre la actividad in vitro de la ECA (medida como actividad residual o porcentaje de la actividad de la reacción control sin inhibidor añadido) cuando utiliza como sustrato HHL. Cada punto representa la media de actividad residual \pm desviación estándar de un número variable de, al menos tres determinaciones independientes, para cada concentración del hidrolizado. La curva representa el mejor ajuste a una curva sigmoidal de cuatro parámetros (coeficiente de regresión, r=0,98) que permitió calcular un EC_{50} de 161\pm9 \mug/ml (p<0,0001) (Programa informático SigmaPlot v 8.0). ECA res: Actividad ECA Residual (%); HFL. Hidrolizado lactoferrina.

Figura 2. Registro de tensión isométrica de un experimento representativo en el que se muestra el efecto inhibidor del hidrolizado de LF (a una concentración de 760 \mug/ml) sobre la contracción ECA-dependiente inducida por angiotensina I (1 \muM) en un segmento de arteria carótida de conejo. El experimento va precedido por una contracción con solución despolarizante (KCl) para comprobar la viabilidad de la preparación. T-I Tensión Isométrica. L. lavado. T. tiempo.

Ejemplo de realización de la invención

1. Obtención del hidrolizado de lactoferrina. Para la obtención del hidrolizado de lactoferrina se ha utilizado como enzima la pepsina siguiendo el protocolo descrito por Tomita et al. (1991) (Potent Antibacterial Peptides Generated by Pepsin Digestion of Bovine Lactoferrin. J. Dairy Science. 74 (12), 4137-4142). Dicho método consiste en preparar una solución de lactoferrina al 5% (peso/volumen) en agua destilada, ajustando el pH de la misma a 3 con HCI. A esta solución se le añade la pepsina a una concentración final del 3% en peso y la mezcla se incuba a 37ºC durante 4 horas en agitación (200 rpm.). La reacción se detiene calentando a 80ºC durante 15 minutos y se alcaliniza llevándola a pH 7 con NaOH. Posteriormente se centrifuga a 4000 rpm durante 30 minutos recuperándose en el sobrenadante los péptidos solubilizados. El hidrolizado así obtenido contenía 7.6 mg de proteína/ml.

2. Ensayos in vitro de inhibición de la actividad ECA sobre el sustrato artificial HHL. En estos ensayos, la capacidad inhibidora del hidrolizado se determinó midiendo por HPLC (del inglés high performance liquid chromatography) el ácido hipúrico resultante de la hidrólisis del sustrato artificial HHL (Hipuril-Histidil-Leucina) basándose en el método propuesto en la literatura [Wu, J. P., Aluko, R. E., y Muir, A. D. (2002). Improved method for direct high-performance liquid chromatography assay of angiotensin-converting enzyme-catalyzed reactions. Journal of Chromatography A 950, 125-130]. La mezcla de reacción tiene un volumen de 225 \mul y está constituida por 50 \mul de HHL 25 mM en tampón Tris HCl 200 mM pH 8.3 con NaCl 600 mM y ZnCl_{2} 10 \muM, 75 \mul de una solución de ACE en el mismo tampón que corresponden a 1.5 mU de actividad, y un volumen hasta 100 \mul de hidrolizado según la concentración final deseada en el ensayo. El enzima y el inhibidor se preincuban durante 15 minutos a 37ºC y a continuación se añade el sustrato incubándose el conjunto 30 minutos a dicha temperatura. La reacción se detiene añadiendo 25 \mul de HCl 6M. Para la determinación cromatográfica del ácido hipúrico liberado se utiliza una columna de fase inversa C18, la elución se lleva a cabo empleando un gradiente de acetonitrilo en agua con TFA 0.05% y se determina el ácido hipúrico midiendo la absorbancia a 228 nm. Los resultados aparecen en la Tabla 1 como actividad residual de las determinaciones de actividad ACE en presencia del hidrolizado mostrando una inhibición significativa para el mismo pero no para los controles negativos (LF sin hidrolizar y pepsina).

3. Ensayos in vitro de inhibición de la actividad ECA sobre el sustrato HHL para el cálculo del IC_{50}. El protocolo experimental descrito en el apartado anterior se repitió empleando diferentes concentraciones de hidrolizado expresadas como \mug/ml. Se efectuaron al menos tres series de experimentos completos e independientes con todas las concentraciones, calculando para cada una de ellas la media y su desviación. La representación gráfica del valor medio correspondiente a la actividad residual para cada una de las concentraciones de péptido ensayadas se muestra en la Figura 1. A partir de estos resultados se calculó la concentración de hidrolizado que inhibe al 50% la actividad ECA sobre angiotensina I (IC_{50}), siendo el valor obtenido 161\pm9 \mug/ml (media aritmética t desviación estándar de la media).

4. Ensayos ex vivo de inhibición de la contracción de arterias aisladas. Para los ensayos ex vivo se utilizó el hidrolizado de LF a las concentraciones de 76, 228 y 760 lag de proteína/ml en el ensayo. La preparación experimental consistió en obtener segmentos cilíndricos (3 mm) de arterias aisladas (arteria carótida de conejo blanco New Zealand), los cuales se dispusieron en un baño de órganos diseñado para registrar los cambios de tensión isométrica en la pared vascular [Salom, J. B., Burguete, M. C., Pérez-Asensio, F. J., Centeno, J. M., Torregrosa, G., y Alborch, E. (2002). Acute relaxant effects of 17-\beta-estradiol through non-genomic mechanisms in rabbit carotid artery. Steroids 67, 339-346]. El medio (solución Ringer-Locke) en el que se hallan inmersos los segmentos arteriales se mantiene termostatizado a 37ºC y continuamente burbujeado con una mezcla gaseosa de 95% O_{2} y 5% CO_{2} que le confiere un pH de 7,3-7,4. Los experimentos comienzan tras un periodo de 30-60 minutos necesario para alcanzar la estabilización en el tono pasivo de 2g. Tras comprobar la viabilidad de los segmentos arteriales mediante contracción con una solución despolarizante (Ringer-Locke 50 mM KCl), cada segmento arterial se somete a una primera contracción ECA-dependiente con Angiotensina I (1 \muM). Tras preincubar los segmentos durante 20 minutos con el hidrolizado objeto de estudio, se indujo una segunda contracción con Angiotensina I. La Figura 2 refleja el registro de uno de estos experimentos. Como control, se dejaron algunos segmentos sin preincubar con inhibidor alguno. La Tabla 2 muestra el resumen estadístico de todos los experimentos realizados y pone de manifiesto un efecto inhibitorio significativo del hidrolizado sobre la contracción de arteria carótida inducida por el tratamiento con angiotensinal así como el nulo efecto de la pepsina y la lactoferrina sin hidrolizar.

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TABLA 1

Efecto del hidrolizado de LF, pepsina y LF, sobre la actividad in vitro de ECA empleando el sustrato artificial HHL. Se indican los porcentajes de actividad residual de la ECA -con respecto al control sin inhibidor (valor 100)- para una concentración de hidrolizado en el ensayo de 760 \mug/ml, expresándose estos valores como la media \pm desviación estándar de un número de repeticiones independientes (indicado entre paréntesis). Los tres valores difieren entre sí con una confianza del 99% (Test de separación de medias HSD de Tukey).

1

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TABLA 2

Efecto inhibidor del hidrolizado de LF, pepsina y LF sobre la contracción ECA-dependiente con angiotensina I en arterias aisladas de conejo. Los resultados indican la contracción de la arteria en respuesta al tratamiento con angiotensina I (1 \muM), en porcentaje respecto a una respuesta previa en el mismo segmento arterial, y se expresan como la media ± desviación estándar de la determinación sobre (n) segmentos arteriales. El control se realizó sin adición de inhibidor.

Los asteriscos indican diferencias significativas con respecto al control (Test de Dunnet) con una confianza del 95% (* p<0,05) y del 99% (** p<0,01).

2

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<110> Consejo Superior de Investigaciones Científicas

\hskip1cm

Universidad de Valencia

\hskip1cm

Fundación para la Investigación del Hospital de la Fé de Valencia

\hskip1cm

Manzanares Mir, Paloma

\hskip1cm

Marcos López, José Francisco

\hskip1cm

Enrique López, María

\hskip1cm

Vallés Alventosa, Salvador

\hskip1cm

Centeno Guil, José María

\hskip1cm

Salom Salvanero, Joan Bta

\hskip1cm

Torregrosa Bernabé, Germán

\hskip1cm

Alborch Domínguez, Enrique

\hskip1cm

Ruiz Gimenez, Pedro

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<120> MEJORA DE LA PATENTE PÉPTIDOS DERIVADOS DE UNA PROTEÍNA LÁCTEA CON ACTIVIDAD INHIBIDORA DE LA ENZIMA CONVERSORA DE LA ANGIOTENSINA I

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<130> mejLfcinB

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<160> 2

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<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 1

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\sa{Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala}

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<210> 2

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 2

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\sa{Arg Arg Trp Gln Trp Arg}

Claims

1. Uso de un hidrolizado enzimático de lactoferrina que comprende un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o ambas, como inhibidor de la enzima conversora de angiotensina I (ECA) in vitro y/o como inhibidor de la vasoconstricción ECA-dependiente ex vivo.

2. Uso de un hidrolizado enzimático de lactoferrina según la reivindicación anterior, para la elaboración de una formulación para controlar o disminuir la presión arterial, o para la prevención o el tratamiento de la hipertensión arterial.

3. Uso de un hidrolizado enzimático de lactoferrina según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde las secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o ambas, presenta cambios conservativos.

4. Uso de un hidrolizado enzimático de lactoferrina según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el hidrolizado de lactoferrina se ha obtenido por un procedimiento que comprende:

a.: preparar una solución de lactoferrina a aproximadamente un 5% (peso/volumen) en agua destilada,

b.: ajustar el pH de la solución de lactoferrina de (a) a alrededor de un pH=3,

c.: añadir pepsina a una concentración final de aproximadamente 3% en peso a la solución de (b),

d.: incubar a una temperatura de alrededor de 37ºC durante aproximadamente 4 horas en agitación (\approx 200 rpm),

e.: detener la reacción calentando a aproximadamente 80ºC durante alrededor de 15 minutos, y alcalinizar la solución añadiendo NaOH hasta un pH de aproximadamente 7,

f.: Centrifugar la solución durante aproximadamente 30 minutos (= 4000 rpm).

5. Uso de un hidrolizado enzimático de lactoferrina según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, donde la formulación es un producto funcional.

6. Uso de un hidrolizado enzimático de lactoferrina según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, donde la formulación es un aditivo, ingrediente o suplemento alimentario funcional.

7. Uso de un hidrolizado enzimático de lactoferrina según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, donde la formulación es una composición farmacéutica.

8. Uso de un hidrolizado enzimático de lactoferrina según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, donde la formulación es un medicamento.

9. Uso de un hidrolizado enzimático de lactoferrina según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, donde la formulación es un nutracéutico.

10. Uso de un hidrolizado enzimático de lactoferrina según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, donde la formulación es un nuevo alimento.