WO2007102230A1 - ヒト化抗ｃｄ２０モノクローナル抗体 - Google Patents

ヒト化抗ｃｄ２０モノクローナル抗体 Download PDF

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Susumu Uchiyama
Kiichi Fukui
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to an anti-CD20 monoclonal antibody.
  • CD20 is expressed on the surface of human B lymphocytes and is a sugar-free protein that is expressed on many malignant tumor B cells in addition to normal B cells in peripheral blood, spleen, tonsils and bone marrow. Yes.
  • the epitope to which the CD20 monoclonal antibody binds has been reported to have a very diverse biological response, and many monoclonal antibodies that recognize CD20 have been reported.
  • rituximab is a chimeric mouse Z human monoclonal antibody (C2B8) derived from mouse antibody 2B8 obtained by immunizing an SB cell line which is a human B cell (see Patent Documents 1 and 2), It has been put into practical use as a therapeutic agent for low-grade non-Hodgkin lymphoma (NHL) under the registered trademark Rituxan. Furthermore, Rituxan has been shown to be effective against many immune diseases involving B cells, such as malignant tumors such as chronic lymphocytic leukemia (CLL), autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenia purpura.
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • idiopathic thrombocytopenia purpura idiopathic thrombocytopenia purpura.
  • Pathogenic autoantibodies such as disease (ITP) have been reported to be effective against autoimmune diseases, inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis (RA) and multiple sclerosis (MS). !, R (see Non-Patent Documents 1 to 4).
  • Non-Patent Document 5 It has been reported that human complement binds to rituximab bound to lymphoid B cells and lyses the lymphoid B cell line by complement-dependent cytotoxicity (CDC) (see Non-Patent Document 5). Have been reported to be active in antibody-dependent cytotoxicity (ADCC) assays, and in anti-proliferative effects and apoptosis induction in tritiated thymidine-introduced assemblies (see Non-Patent Document 6).
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • chimeric molecules with heterologous animals are not generally preferred as therapeutic agents because of their antigenicity, but anti-CD20 antibodies, including rituximab, have the property of targeting and removing all B cells including normal cells. It was thought that there was no sex. However, a few percent have been reported to induce neutralizing antibodies during the treatment period, as well as the amount and period of administration. Depending on the situation, the possibility of the disease will increase further, and the problem of treatment will expand from B-cell lymphoma to RA, IT, and MS, and antigenicity issues will be highlighted. There is now a need for humanized or human antibodies having sequences!
  • the chimeric antibody has a problem that the half-life in blood is relatively short, and the beta half-life ( ⁇ 1/2) of the mouse Z human chimeric antibody including rituximab is only 3 to 4 days.
  • the response rate of clinical trials for low-grade NHL has been reported to be less than 50% (see Non-Patent Document 7).
  • the dissociation constant (Kd value) of rituximab for the CD20 antigen is 5.2 nM, and there is a problem that the dose is increased in NHL treatment where the binding affinity is too high (see Non-Patent Document 8).
  • Patent Document 1 International Publication No. 94Z11026 Pamphlet
  • Patent Document 2 U.S. Patent No. 5736137
  • Non-patent document 2 Edward JC et al., Rheumatology (Oxford) 2001; 40: 205-11
  • Non-patent document 3 Zaja F et al, Heamatologica 2002; 87: 189-95
  • Non-Patent Document 4 Perrotta S et al., Br J Haematol 2002; 116: 465-7
  • Non-Patent Document 5 Reff et al., Blood 1994; 83: 435-445
  • Non-Patent Document 6 Maloney et al., Blood 1996; 88: 637a
  • Non-Patent Document 7 IDEC Pharmaceuticals Corporation News Release, December 8, 1998
  • Non-Patent Document 8 Mitchell ER et al., Blood 1994; 82: 435-445
  • the main object of the present invention is to provide an anti-CD20 monoclonal antibody exhibiting a biological activity more suitable as a pharmaceutical.
  • the present inventors have produced a monoclonal antibody having a high binding affinity for a human CD20 molecule in a natural state to obtain an anti-CD20 monoclonal antibody having an excellent function.
  • Researched earnestly.
  • SB cells and Raji cells which are B cell lines with a high density of CD20 antigen as an immunogen, and CD on the cell membrane by genetic recombination. It has been found that by using a combination of non-human animal cells expressing 20 in a large amount, a high-affinity monoclonal antibody that exhibits excellent biological activity can be obtained.
  • the present invention has been completed.
  • the present inventors have succeeded in finding a new method for selecting effective anti-human CD20 humanized antibodies. By using this selection method, it was possible to select those that can be used effectively as pharmaceuticals from the strength of the human anti-CD20 monoclonal antibody of the present invention.
  • the present invention provides the following:
  • Human CD20 antigen which is derived from a human B cell line expressing human CD20 antigen and a cell line derived from a non-human animal that is transformed with human CD20 DNA and is different from the immunized animal.
  • a humanized anti-CD20 monoclonal antibody having growth inhibitory activity against cells having the following selection criteria:
  • the human B20 cell line expressing human CD20 antigen! And the non-human animal cell line transformed with human CD20 DNA different from the immunized animal are used as immunogens.
  • the Kd value for human CD20 antigen is in the range of about 9.5 nM to about 13 nM, and the sum of apoptotic activity and CDC activity on B cells is equal to or less than that of 2B8 antibody.
  • the human B20 cell line that expresses human CD20 antigen! And a cell line derived from a non-human animal that is transformed with human CD20 DNA and is different from the immunized animal are used as immunogens.
  • a therapeutic agent for a B cell-related disease comprising the human baboon anti-CD20 monoclonal antibody according to any one of (1) to (7) as an active ingredient.
  • a human anti-CD20 monoclonal antibody that exhibits a strong binding affinity for the extracellular epitope of CD20 antigen and has a high cytotoxic activity such as CDC is obtained. It is extremely effective as a therapeutic agent for diseases involving B cells.
  • FIG. 1 is a restriction map showing the structure of a recombinant antibody expression vector pNOW-Ab.
  • FIG. 2 is a restriction map showing the structure of a protein expression vector pNOW.
  • FIG. 3a is a graph showing the results of an apoptosis test.
  • FIG. 3b is a graph showing the results of an apoptosis test.
  • FIG. 3c is a graph showing the results of an apoptosis test.
  • FIG. 3d is a graph showing the results of an apoptosis test.
  • FIG. 4a is a graph showing the relationship between antibody concentration and ADCC.
  • FIG. 4b is a graph showing the relationship between antibody concentration and ADCC.
  • FIG. 4c is a graph showing the relationship between antibody concentration and ADCC.
  • FIG. 4d is a graph showing the relationship between antibody concentration and ADCC.
  • FIG. 5a A graph showing the relationship between T ratio and ADCC.
  • FIG. 5b is a graph showing the relationship between E: T ratio and ADCC.
  • FIG. 5c is a graph showing the relationship between E: T ratio and ADCC.
  • FIG. 5d is a graph showing the relationship between E: T ratio and ADCC.
  • FIG. 6a is a graph showing the results of a CDC test.
  • FIG. 6b is a graph showing the results of the CDC test.
  • FIG. 6c is a graph showing the results of the CDC test.
  • FIG. 6d is a graph showing the results of a CDC test.
  • FIG. 7a is a graph showing the results of an apoptosis test using a mouse antibody.
  • FIG. 7b is a graph showing the results of an apoptosis test using a mouse antibody.
  • FIG. 7c is a graph showing the results of an apoptosis test using a mouse antibody.
  • FIG. 7d is a graph showing the results of an apoptosis test using a mouse antibody.
  • FIG. 8a is a graph showing the results of an apoptosis test using a humanized antibody.
  • FIG. 8b is a graph showing the results of apoptosis experiments using humanized antibodies.
  • FIG. 8c is a graph showing the results of an apoptosis test using a humanized antibody.
  • FIG. 8d is a graph showing the results of an apoptosis test using a humanized antibody.
  • FIG. 9a is a graph showing the ratio of humanized antibody to early apoptosis.
  • FIG.% Is a graph showing the ratio of early apoptosis with a humanized antibody.
  • FIG. 9c is a graph showing the ratio of early apoptosis with a humanized antibody.
  • FIG. 9d is a graph showing a ratio of early apoptosis with a humanized antibody.
  • [10d] is a graph showing the relationship between the dissociation constant and the cytotoxic activity (apoptosis-inducing activity and CDC activity) of the humanized antibody.
  • the cell used is RC-K8.
  • White squares indicate CDC activity (%) and black circles indicate apoptotic activity (%).
  • FIG. 11a is a graph showing CDC activity of humanized antibody and chimeric antibody.
  • the cells used are Raj i cells.
  • FIG. Lib is a graph showing CDC activity of humanized antibody and chimeric antibody.
  • the cells used are SU DHL4 cells.
  • FIG. 11c is a graph showing CDC activity of humanized antibody and chimeric antibody.
  • the cells used are Wi L2 cells.
  • FIG. Lid is a graph showing CDC activity of humanized antibody and chimeric antibody.
  • the cell used is RC K8.
  • FIG. 12a is a graph showing the relationship between humanized antibody concentration and ADCC.
  • the cells used are Raji cells.
  • FIG. 12b is a graph showing the relationship between humanized antibody concentration and ADCC.
  • the cells used are SU-DHL 4 cells.
  • FIG. 12c is a graph showing the relationship between humanized antibody concentration and ADCC.
  • the cells used are WiL2 cells.
  • FIG. 12d is a graph showing the relationship between humanized antibody concentration and ADCC.
  • the cells used are RC-K8 cells.
  • FIG. 13a is a graph showing the relationship between the E: T ratio of humanized antibody and ADCC.
  • the cells used are Raji cells.
  • FIG. 13b is a graph showing the relationship between the E: T ratio of humanized antibody and ADCC.
  • Use cells are SU- DHL4 cells.
  • FIG. 13c is a graph showing the relationship between the E: T ratio of human rabbit antibody and ADCC.
  • the cells used are WiL2 cells.
  • FIG. 13d is a graph showing the relationship between the E: T ratio of humanized antibody and ADCC.
  • the cells used are RC-K8 cells.
  • PAbgh Ushi growth hormone gene poly A addition signal
  • DHFR mouse dihydrofolate reductase cDNA
  • PAsv Simian virus 40 poly A with signal
  • PBR322ori Origin of replication in E. coli
  • Amp Selectable marker in E. coli (ampicillin resistance)
  • Neo r Selectable marker in mammalian cells (G418 resistance)
  • VL Antibody light chain variable region cDNA
  • Vh Antibody light chain variable region cDNA
  • antibody includes not only the whole antibody but also a fragment that exhibits the same binding affinity for an antigen as the whole antibody, for example, a fragment containing the variable region of the whole whole antibody (eg, Fab, F (ab ′), etc.).
  • the monoclonal antibody of the present invention is a monoclonal antibody having high affinity for human CD20 antigen and exhibiting excellent biological activity, and includes mouse-derived monoclonal antibodies, chimerized antibodies, and humanized antibodies. .
  • the first preferred embodiment has a growth inhibitory activity against cells having human CD20 antigen, and the dissociation constant (Kd value) for human CD20 antigen is 1Z2 or less of 2B8 which is a mouse antibody derived from rituximab.
  • Kd value dissociation constant
  • a monoclonal antibody having a high affinity for human CD20 antigen preferably 1.70 to 3.39 nM.
  • the method for measuring the dissociation constant is not particularly limited as long as it can measure the Kd value for the antigen expressed on the cell, but in this specification, the method described in the examples below. Is the dissociation constant.
  • the growth inhibitory activity against cells having human CD20 antigen is greater than 2B8.
  • the growth inhibitory activity is preferably a growth inhibitory activity against in vitro culture of cells having human CD20 antigen in the absence of peripheral blood mononuclear cells, and more preferably, the growth inhibitory activity is due to apoptosis induction.
  • Several of the anti-CD20 antibodies have been reported to increase the calcium ion (Ca 2+ ) concentration in B cells and induce apoptosis involving Src kinase upon binding to CD20. .
  • the above growth inhibitory activity can be measured, for example, by the method described in Miyamoto T, Min W, Lillehoj HS. Avian D. 2002 Jan-Mar; 46 (l): 10-6.
  • the L chain variable region amino acid sequence and the H chain variable region amino acid sequence are SEQ ID NOS: 1 and 9, SEQ ID NOS: 2 and 10, respectively.
  • monoclonal antibodies derived from mice having SEQ ID NOs: 3 and 11 and those obtained by chimerizing or humanizing these antibodies can be mentioned.
  • Chimerization is carried out according to a known method as described in, for example, Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho Vol 60, No 3, 2002-3: 439-444 and the variable region amino acid sequence of a mouse-derived monoclonal antibody. It can be carried out by fusing human immunoglobulin constant region amino acid sequences.
  • variable region CDR amino acid sequence of the mouse-derived monoclonal antibody This can be done using the sequence and the amino acid sequence of human immunoglobulin.
  • the amino acid sequences of the L chain variable regions and the amino acid sequences of the H chain variable regions of a plurality of mouse monoclonal antibodies may be arbitrarily combined.
  • an L chain obtained by chimerizing the mouse monoclonal antibody variable region amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 and an H chain obtained by chimerizing the mouse derived monoclonal antibody variable region amino acid sequences of SEQ ID NOs: 9 to 11 were combined.
  • the chimeric anti-CD20 monoclonal antibody, the mouse-derived monoclonal antibody variable region of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 The L chain obtained by humanizing the amino acid sequence of CDR and SEQ ID NOs: 9 to 11 !, any mouse-derived monoclonal antibody variable region
  • a humanized anti-CD20 monoclonal antibody combined with a heavy chain obtained by humanizing a CDR sequence can be mentioned.
  • the antibody of the second preferred embodiment of the present invention is a monoclonal antibody obtained by chimerizing or humanizing a mouse-derived monoclonal antibody having a dissociation constant (Kd value) force of B8 of 1Z8 or less against human CD20 antigen.
  • Kd value dissociation constant
  • Antibodies with high affinity for human CD20 antigen especially human IgGl or IgG3, or antibodies with human Fc sequences modified from them (including mouse-derived monoclonal antibodies that are chimeric or humanized) It is well known that binding to the above CD20 induces effector cell activity via Fc ⁇ RIII (CD 16) on NK cells, causing antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). It has been.
  • antibodies having high affinity for human CD20 antigen particularly antibodies having human HcG or IgM, or modified human Fc sequences (including those obtained by chimerizing or humanizing mouse-derived monoclonal antibodies) It is also well known that when it binds to CD20 on the cell surface, it induces complement activation and causes complement-dependent cytotoxicity (CDC)! /
  • the antibody of the second aspect of the present invention can be expected to exhibit ADCC or CDC.
  • Specific examples of the antibody of the second aspect include an L chain variable region amino acid sequence and an H chain variable region. Examples include amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 and 12, SEQ ID NOs: 5 and 13, SEQ ID NOs: 6 and 14, SEQ ID NOs: 7 and 15, or SEQ ID NOs: 8 and 16, respectively.
  • Chimerization or humanization can be performed in the same manner as the antibody of the first aspect, in which case a plurality of The amino acid sequence of the L chain variable region of the mouse monoclonal antibody may be arbitrarily combined with the amino acid sequence of the H chain variable region.
  • the antibody of the preferred third aspect of the present invention is not limited to a specific dissociation constant for 2B8, including a humanized monoclonal antibody that is also effective against cells for which rituximab has no effect. It is a humanized antibody.
  • Examples of these antibodies include the L chain of SEQ ID NO: 18 and the H chain of SEQ ID NO: 24, the L chain of SEQ ID NO: 18 and the H chain of SEQ ID NO: 22, the L chain of SEQ ID NO: 19 and the H chain of SEQ ID NO: 22 or And a humanized CD20 monoclonal antibody comprising a combination of the L chain of SEQ ID NO: 19 and the H chain of SEQ ID NO: 23.
  • the inventors of the present invention for the humanized anti-CD20 monoclonal antibody obtained by the present invention, based on the correlation between the affinity of the antibody for human CD20 antigen, CDC activity, and apoptosis-inducing activity, Based on the classification, monoclonal antibodies useful as antibody drugs could be selected (see Example 4).
  • affinity for human CD20 antigen is high and CDC activity is also high.
  • V it is preferable to select one (the lower the Kd value, the higher the CDC activity and the tendency).
  • apoptosis induction alone does not occur, but it has an advantage of high affinity, and cell death can be promoted by high CDC activity.
  • the present inventors have found that many antibodies that meet the former selection criteria have a dissociation constant (Kd value) for human CD20 antigen of less than about 9.5 nM.
  • each of the above selection criteria can be expressed as follows:
  • equivalent means a value in the range of about 10% of the value to be compared.
  • the present inventors conducted further experiments and found that it is preferable to apply the above selection criteria according to the type of B cells. Specifically, based on the results obtained in Example 4 below, the selection criteria (i) are expressed in more detail as (a) and (ii) as (b), respectively. be able to:
  • the dissociation constant (Kd value) for human CD20 antigen is less than about 9.5 nM, Cysts (suspension cells) or SU—DHL4 cells with CDC activity equal to or greater than 2B8 antibody; or
  • equivalent means a value in the range of about 10% of the value to be compared.
  • an antibody having a Kd value of less than about 9.5 nM against human CD20 antigen and having a Kd value as low as possible and a high CDC activity is selected. It is preferable to do.
  • an antibody having a CDC activity against Raji cells (floating cells) or DHL4 cells that is equal to or higher than 2B8 antibody is selected.
  • the Kd value V the higher the CDC activity, and the more the antibody tends to be, the lower the Kd value! /, Just by selecting the antibody (with high affinity for the CD20 antigen).
  • An antibody that satisfies the selection criteria (i) or (a) has an extremely high affinity for the CD20 antigen and an extremely high CDC activity, and therefore can exhibit an excellent anticancer effect.
  • an antibody that meets the selection criteria (i) or (a) alone does not induce apoptosis, and a secondary antibody is required to induce apoptosis.
  • the Kd value for human CD20 antigen is in the range of about 9.5 nM to about 13 nM, and the sum of apoptotic activity and CDC activity is as large as possible. It is preferable to select an antibody having a small Kd value. Preferably, those having a sum of CDC activity and apoptosis activity against WiL2 cells or RCK8 cells equivalent to or higher than those of 2B8 antibody are selected.
  • An antibody that meets the selection criteria of (ii) or (b) can induce apoptosis by itself with a certain degree of affinity for the CD20 antigen, and exhibits an excellent anticancer effect due to the synergistic effect of apoptosis and CDC. it can.
  • those having a sum of apoptotic activity and CDC activity equal to or higher than those of 2B8 antibody are selected.
  • the humanized anti-CD20 monoclonal antibody obtained by the present invention which satisfies the above selection criteria (i) or (a), is a combination of the L chain of SEQ ID NO: 18 and the H chain of SEQ ID NO: 22. Examples are the combined human anti-CD20 monoclonal antibody and the human anti-CD20 monoclonal antibody in which the L chain of SEQ ID NO: 18 and the H chain of SEQ ID NO: 24 are combined.
  • a humanized anti-CD20 monoclonal antibody obtained by the present invention that satisfies the above selection criteria (ii) or (b) is a combination of the L chain of SEQ ID NO: 19 and the H chain of SEQ ID NO: 22. Humanized anti-CD20 monoclonal antibodies are exemplified.
  • the present invention provides, in a further aspect, an antibody that does not induce apoptosis by the following selection criteria alone, but has an extremely high affinity for an antigen and can exert an anticancer effect by CD C;
  • the present invention also relates to a method for selecting an anti-cancer antibody, which comprises using the above, and an antibody selected by the method.
  • measurement of affinity for antigen, apoptotic activity and CDC activity may be any of those known in the art. You may carry out using the method of.
  • the affinity for an antigen is determined by measuring the dissociation constant with the antigen and using this as an index. Measurement of the dissociation constant of a humanized antibody against human CD20 antigen is generally performed using cells expressing human CD20 antigen as targets. At that time, it is preferable to use cells that do not express human CD20 antigen as a control.
  • a technique such as attaching a detectable label to the humanized antibody or using a labeled antibody specific to the humanized antibody can be used.
  • the affinity (or dissociation constant, Kd value) for human CD20 antigen may be measured as described in Example 2 of this specification! /.
  • a mouse-derived monoclonal antibody that can be used for the production of the human anti-CD20 monoclonal antibody of the present invention produces, for example, a monoclonal antibody having a desired property from a clone of a hybrid obtained by screening according to the following method. This can be obtained by selecting the clone to be used.
  • sensitizing antigen for example, SB cells or Raji cells, which are cells expressing CD20, and, for example, CD20 DNA that is commercially available by genetic recombination (or an equivalent effect) CHO cells (CHOZCD20) that have been transformed with CD20 expression on the cell surface after being transformed with such fragments.
  • the initial immunization, booster immunization, and final immunization are expressed as the sensitizing antigen at least once.
  • Immunization using a cell line derived from an animal belonging to another eye, and at least one immunization is the same as that of an immunized animal in which the antigen is expressed on the cell membrane surface by genetic recombination as a sensitizing antigen.
  • One of the immunizations using a cell line derived from an animal belonging to the eye and the final immunization should be the other.
  • Hybridomas that produce monoclonal antibodies are in accordance with known methods: (1) immunization of immunized animals, (2) preparation of lymphocytes from immunized animals, (3) preparation of parental cells, (4) lymphocytes and Produced by parental cell fusion, (5) screening and clawing (see, for example, Ailsa M. Campbell (Author), Toshiaki Osawa (translation) Biochemical Monoclonal Antibody, Tokyo Chemical Dojin, 1989. ).
  • a method for producing a monoclonal antibody using a high-pridoma using the obtained clone is a normal method for producing a monoclonal antibody, except that the hybridoma produced by the method of producing the hybridoma of the present invention is used. Same as above. In the case of mass production, methods such as cell culture and mouse ascites can be mentioned. In the case of producing a chimeric or humanized antibody, a gene encoding a chimerized or humanized antibody is prepared, incorporated into an expression vector, and the expression vector is expressed in appropriate cells. Can be produced.
  • variable region genes for L and H chains can be transferred to human immunoglobulin L and H chains ( ⁇ ) Chimerized with constant region gene and incorporated into high expression vector for CHO cells.
  • Vector systems for producing recombinant antibodies may be commercially available, but based on the mammalian cell high expression vector pNOW (Patent No. 3582965), both L-chain and H-chain multicloning sites ( The one constructed in the high expression vector pNOW-ab for dimers having MCS) can be used.
  • a restriction map showing the composition of each vector is shown in Figs.
  • An expression vector incorporating the chimeric antibody gene is transferred into CHO cells, and clones are selected with high productivity.
  • An antibody is produced by the usual method of its clonal power.
  • the antibody of the first aspect of the present invention has a relatively high binding affinity compared to rituximab and has a growth inhibitory activity, preferably an activity induced by apoptosis. It can be used as an active ingredient in therapeutic agents for B cell malignancies and immune diseases involving B cells.
  • the antibodies of the second and third aspects of the present invention are considered to exhibit antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC) against cells having human CD20 antigen. Therefore, it can be used as an active ingredient of a therapeutic agent for B cell malignant tumors and immune diseases involving B cells. Therefore, the present invention also provides a therapeutic agent for a B cell-related disease containing these chimerized or humanized antibodies as active ingredients.
  • the humanized anti-CD20 monoclonal antibody of the present invention can be selected using the selection criteria of (i) or (a), or (ii) or (b), and those satisfying these selection criteria Highly effective against B cell malignancies and immune diseases involving B cells, especially for pharmaceutical use. Accordingly, there is provided a therapeutic agent for a B cell-related disease comprising a humanized anti-CD20 monoclonal antibody satisfying the selection criteria of (i) or (a), or (ii) or (b) as an active ingredient.
  • two or more of the antibodies of the present invention may be used in combination.
  • B cell related diseases include, but are not limited to, non-Hodgkin lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, acute lymphocytic leukemia, rheumatoid arthritis, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenia Examples include purpura, systemic lupus erythematosus, antiphospholipid antibody symptoms, Siedalen syndrome, Crohn's disease, scleroderma, and multiple sclerosis.
  • the therapeutic agent can be produced according to known pharmaceutical techniques, and other ingredients are particularly limited. The dosage and the like can also be determined with reference to known Rituxan.
  • SB cells and Raji cells which are B cell lines expressing CD20! /, Were cultured in vitro.
  • DNA encoding all molecules of CD20 obtained from Multiple Choice cDNA human spleen, Origene Technologies, Inc. 6 Taft Court, Suite 100, Rockville, MD 20850, specific primer hCD20- Cloning using S-GK-Not aatgcggccgccaccatgacaacacccagaa attc (SEQ ID NO: 25) and hCD20- E- Xba gctctagattaaggagagctgtcattttc (SEQ ID NO: 26) and incorporating it into pNOW (Fig.
  • SB cells or Raji cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS.
  • CD20ZCHO cells were cultured using CHO-S-SFM II medium (GIBCO, Cat. No. 12052-098) supplemented with 800 / z gZml of G418. These cultures were centrifuged at lOOrpm for 5 minutes, then Dulbecco's PBS (-) was added to the cells, suspended, and centrifuged again. This washing operation was repeated once more, and a suspension prepared by adding physiological saline to the cells (cell number: 1 to 3 ⁇ 10 7 / ml) was used for immunization.
  • All of the immunogen preparations were intraperitoneally administered to 7-11 week old Balb / c female mice. Either the same cells of SB cells or CD20ZCHO cells were repeatedly administered 2 to 3 times at various days intervals, and then different cells (CD20ZCHO cells or Raji cells) were administered for the final immunization. The number of cells administered was 1 to 3 ⁇ 10 7 cells per mouse. Table 1 shows the immunogen combinations used.
  • spleen cells were prepared from two mice and Oi.VT and LA Immunb erg, 1980, in: Selected Methods in Cellular Immunology, eds.B. isnell and SM Sni igi (Freeman and Co. San. According to Francisco, CA) p.351, fusion reaction with mouse myeloma (NS-1) was performed in the presence of PEG-1500.
  • Cell ELISA was performed using 96 well plates to which CD20ZCHO cells or CHO cells (parent strain) were attached, and wells producing antibodies that specifically react with CD20 were selected. Furthermore, a 96-well plate to which the same CD20ZCHO cells were attached was used to perform a competitive reaction with rituximab (C2B8), and an antibody (well) that reacts in a similar manner to the C2B8 epitope was selected.
  • C2B8 rituximab
  • Table 1 shows the results of screening.
  • CD20ZCHO cells or CHO cells (parent strain) attached to Poly-L-Lysine-coated 96-well plates (Asahi Techno Glass, Cat. No. ll-023-018) were used for Cell ELISA.
  • Each well was filled with 150 1 blocking solution (0.2% gelatin, 0.5% BSA in PBS) and allowed to stand at 37 ° C for 1 hour. After washing the plate 5 times with 150 mM—NaCl, 0.05% —Tween20 aqueous solution, add 100 1 sample (diluted culture supernatant) to each well and perform the primary reaction at 37 ° C for 1 hour. I did it.
  • the absorbance of m was measured.
  • the limiting dilution method was used.
  • the cells were plated on a 96-well plate and cultured, and cell ELISA was performed on the culture supernatant of one colony well to select a clone producing a specific antibody.
  • Specific antibody-producing clones were cultured in RPMI1640 medium supplemented with 10% FCS, and when the cell density reached around 5 ⁇ 10 5 Zml, the medium was changed to serum-free medium ASF-104N (Ajinomoto) and cultured. After 2 to 4 days, the culture solution was centrifuged to collect the culture supernatant, and purified using a protein G column. The eluted monoclonal antibody solution was dialyzed against 150 mM NaCl. The solution was sterilized by filtration with a 0.2 m filter to obtain a test antibody (anti-human CD20 mouse monoclonal antibody).
  • CD20 / CHO cells 3 times Raji cells ⁇ Number of selected wells— A: Responds to CD20 / CHO cells. Produces rods that do not respond to CHO cells.
  • Number of selected wells B Among the selected number of wells A, the monoclonal antibodies produced by the 8 representative clones that produced antibodies that exhibited a competitive anti-K against the control antibody.
  • the amino acid sequence (SEQ ID NOs: 1 to 8) and the amino acid sequence of the H chain V region (SEQ ID NOs: 9 to 16) are as follows.
  • H chain V region sequence of lkl422 (SEQ ID NO: 9) MDYWGQGTSVTVSL
  • the base sequence of the variable region of the monoclonal antibody gene was determined, and the antibody binding affinity and the biological property test were performed as follows for the monoclonals produced by them. .
  • the number of cells was measured using a Burker-Turk hemocytometer (catalog No. 03-303-1, Kuruma Sales Co., Ltd.).
  • the culture medium of confluent cells 3 to 4 days after the passage was centrifuged at 3000 rpm for 3 minutes at room temperature and 3000 rpm using a multi-centrifuge cooling centrifuge LX-120 (TOMY), and the supernatant was removed to collect the cells.
  • the number of rotations and time used here are the conditions under which the number of cells does not change even after repeated centrifugation and supernatant removal.
  • Na HPO Wako, Cat. No. 197-02865, Lot ASF2635
  • KCl Wako, Cat.
  • the washed cells were suspended in 1% BSA (Wako Cat No. 013-07492 Lot PKH3483) —PBS solution, and the cell density was adjusted to 5 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • test antibody or positive control antibody As the primary antibody, test antibody or positive control antibody (2B8) 15, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 200 ng (l. 5 to 5 1) each 1.5 ml tube (BM equipment, BM phosphor) Dispense into Glock tubes Cat. No. BM-15) and prepare 4 tubes without antibody at the same time. Three samples were prepared for each test antibody.
  • 1% BSA Wang Cat No.013-07492 Lot PKH3483
  • centrifuge in a micro high-speed cooling centrifuge MX-100 (T0MY) at 3000 rpm for 3 minutes at room temperature collect the cells, and then suspend in 200 1 PBS to remove unreacted primary antibody remaining on the cell surface.
  • the operation of centrifuging at 3000 rpm for 3 minutes and removing the supernatant was performed twice.
  • the cells thus obtained were suspended in 100 ⁇ l PBS and transferred to 96-well flat bottom plates (Sumitomo Bakelite ELISA PLATE Cat. No. 8496F).
  • the amount of fluorescence of the secondary antibody was measured under the detection conditions of Fluorescense mode, 600 V ⁇ 526 SP / g reen (532 nm), Focus: bottom surface + 3 mm using Typhoon9210 image Nafisa ( ⁇ Amersnam Bioscience).
  • PBS solution 100 / z 1 added with 0, 12.5, 25, 50, 75, 100, 125, 150 ng of FITC-labeled secondary antibody was used as a control for preparing a calibration curve.
  • a calibration curve is created by measuring the amount of fluorescence at each concentration of FITC-labeled secondary antibody used as a control, and the amount (mole number or weight) of secondary antibody bound to the cell is determined. It was. Assuming that each primary antibody and FITC-labeled secondary antibody reacted at a ratio of 1: 2, the amount of bound primary antibody was calculated. The amount of free primary antibody was also determined by subtracting the amount of binding from the amount of added antibody. When the antibody concentration was converted to molar concentration, the molecular weight of the monoclonal antibody was set to 150,000.
  • Flow cytometry (Annexin V / PI staining) was used to measure the apoptosis-inducing ability of the test antibody. Positive control (2B8) and negative control [Anti-CD3 monoclonal antibody (BD PharMingen)] were used. The test was performed using MEBCYTOApoptosis Kit (MBL, Cat. No. 4700, Lot. 20).
  • Raji cells are centrifuged and suspended in fresh medium RPMI1640 (Sigma, Cat. No. R8758, Lot. 44K2416) containing 10% FBS (non-immobilized) (ICN, Cat. No. 2916754, Lot. 8005C).
  • Nigoshi were placed lml each Ueru of 12 ⁇ E Le plates at a density of 5xl0 5 cells ZML.
  • each antibody was added to a final concentration of 2 gZml or 4 gZml (3 wells x 2 species concentration x 2 time points, total 12 wells).
  • Fig. 3a to Fig. 3d show the measurement results of the monoclonal antibody produced by 6 representative clones and the positive control (2B8) and negative control (Anti-CD3).
  • 2B8 the ability to induce apoptosis of 2B8 is considered to be high.
  • Clone lkl791 obtained from cell fusion of 1K17 series (immunized with CD20ZCHO and Raji cells) and cell fusion power of 1K14 series (immunized with SB cells and CD20Z CHO)
  • the monoclonal antibody produced by the obtained clone lkl422 was highly induced to induce apoptosis.
  • a suspension of 5 ⁇ 10 4 cells / ml of Raji cells was prepared in RPMI1640 medium supplemented with 10% FCS, and cultured in 100 1Z wells in 96 well plates. After 24 hours, each antibody solution was added to 50 1Z wells so that the antibody concentration was 1 gZml, and the culture was continued. 72 hours after the addition of the antibody, a cell-coloring dye Cell Counting Kit-8 (Dojindo Cat. No. 343-07623, Lot. SG076) was further cultured for 4 hours after being incubated with 101 Zwell, and the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured.
  • Table 2 shows the measurement results of the absorbance of the monoclonal antibody, positive control (2B8), and negative control of the above 6 clones, and Table 3 shows their characteristics.
  • ADCC Antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • the effector cells were activated through the Fc site of the anti-CD20 chimeric antibody and the ability to lyse the lymphoma cell line was measured.
  • each of the cells were washed with 10% FCS containing RPMI1640, a force Rusein by reaction for 15 minutes in 37 ° C after incorporated into live cells, the number of cells 4 X 10 5 cells Zml It was adjusted. Forced lucein can be used to stain only living cells because the cell membrane is maintained normally and is maintained only in the cells.
  • anti-CD20 chimeric antibody rituximab C2B 8
  • 6 kinds of chimeric antibodies (lk0924, lkl402, lkl422, lkl712, lkl736, lkl791) at 20 ⁇ g / ml, 4 ⁇ g / ml with RPMI1640 containing 10% FCS , Adjusted to 0.8 g / ml. Effector cells were collected from a healthy person, immediately after collecting the centrifuged lymphocyte fraction was layered onto Ficoll, 5 X 10 6 cells / ml, 1 X 10 6 cells / ml, 0. 2 X 10 6 cells / adjusted to ml.
  • Concentrated cells 25 ⁇ 1, anti-CD20 chimeric antibody solution 25 1 (final concentrations of 5 ⁇ g / m 1 ⁇ gZml, 0.2 ⁇ g / ml, respectively) 50 1 (E: T ratios 25: 1, 5: 1, 1: 1 respectively), mix 100 1 in a 96-well plate and react for 4 hours in an incubator at 37 ° C and 5% CO concentration I let you.
  • E T ratios 25: 1, 5: 1, 1: 1 respectively
  • the lysed cells break the cell membrane and force lucein comes out of the cell.
  • Use quencher to eliminate the fluorescence of force lucein released in the reaction solution, and then measure the amount of fluorescence using a fluorescence analyzer. did.
  • Dissolution rate [%] ((natural dissolution) (sample)) / ⁇ (natural dissolution) (maximum dissolution)) X I 0 0
  • Figures 4a to 4d show the relationship between antibody concentration and cytotoxic activity in each cell when the ratio of the number of effector cells such as NK cells to the number of target cells (E: T ratio) is 25: 1.
  • E: T ratio the ratio of the number of effector cells such as NK cells to the number of target cells
  • FIGS. 5a to 5d show the relationship between E: T ratio and cytotoxic activity in each cell when the antibody concentration is 5 gZml.
  • the cytotoxic activity is shown by adding antibody to any cell under the condition of E: T ratio of 25: 1. That is, the antibody is involved in cell injury.
  • W Cell lines other than iL2—NS already showed activity similar to 1 ⁇ g / mU 5 ⁇ g / ml at 0.2 ⁇ gZml antibody concentration (saturated at 0.2 ⁇ gZml) and active Has reached its maximum value and is flat, suggesting that it acts with less antibody than is required for complement-dependent cytotoxic activity.
  • each cell was washed with 10% FCS-containing RPMI 1640 and the number of cells was adjusted to 2 to 3 ⁇ 10 6 Zml.
  • C2B8 rituximab
  • an anti-CD20 chimeric antibody rituximab
  • 6 types of chimeric antibodies lk0924, lkl402, lkl422, lkl712, lkl736, lkl791 in RPMI1640 containing 10% FCS at 20 ⁇ g / ml, 4 ⁇ g / ml , Adjusted to 0.8 gZml.
  • Concentrated cells 55 ⁇ 1, anti-CD20 chimeric antibody solution 25 1 (each final concentration is 5 ⁇ g / m 1 ⁇ g / 0.2 ⁇ g / ml), pooled serum collected from 5 healthy individuals Alternatively, the inactivated 20 1, a total of 100 1, were mixed by a vortex mixer and reacted in an incubator at 37 ° C. and 5% CO concentration for 2 hours. Background calculation sun
  • Pulls were prepared by replacing 25 ⁇ 1 of the antibody solution with 25 ⁇ 1 of RPMI1640 medium containing 10% FCS.
  • dead cells were stained with ⁇ (Providium iodide) solution and analyzed by FACS (Becton Dickinson). The numbers are taken from the population of dead cells as they are, and the values of samples with knock ground and inactivated serum are subtracted.
  • FIGS. 6a to 6d The relationship between antibody concentration and cytotoxic activity in each cell is shown in FIGS. 6a to 6d.
  • Raji, WiL2—NS, SU—DHL4 all six antibodies Indicates activity.
  • lkl791 shows particularly high activity compared to other antibodies when compared at a concentration of 5 / z gZml, which can confirm concentration dependence.
  • RC-K8 for which rituximab is not effective, showed a significant difference for each antibody.
  • Rituximab, lkl402 and lkl712 have little or no activity.
  • lkl791 shows very high activity, and at a concentration of 5 / z gZml, it shows about 50% damage activity.
  • Lk0924 force 25 0/0 approximately, shows a lkl422, lkl736 force 10 0/0 of about cytotoxicity, Ru.
  • Raji cells derived from human B cell line are cultured in a 10% FCS supplemented medium deactivated to RPMI1640 in a CO incubator at 37 ° C and 5% CO concentration, and maintained by passage twice a week.
  • Cell culture medium 3-4 days after passage (approximately lxlO 6 Zml) is centrifuged at room temperature at lOOOrpm for 5 minutes, and the cells are collected, suspended in PBS (—), and centrifuged at lOOOrpm for 5 minutes. Washing was performed by removing the supernatant twice.
  • Anti-CD20 antibody (positive control antibody: mouse antibody 2B8, chimeric antibody and humanized antibody C2B8) was mixed with Raji cells and reacted at room temperature for 1 hour to carry out the primary antibody reaction.
  • the final concentration of each of the anti-CD20 antibodies is 1.33, 2.67, 4.00, 5.33, 6.67, 8.00, 9.33, 10.67, 12.00, 13.
  • Thirteen points of 33, 14.67, and 16.00 nM were used, and the number of cells was 5xl0, 6 % 1% BSA-PBS solution was used as a reaction solution and dispensed to a volume of 100 1.
  • Three samples were prepared for the same test antibody, and four tubes were prepared with no antibody added as a background calculation sample.
  • GOAT Anti Mouse IgG H & D-FITC was used as the FITC-labeled secondary antibody
  • GOAT F ab ′ 2F Fragment Anti Human IgG (Fcy) -FI TC was used as the chimeric antibody and humanized antibody.
  • the mixture was centrifuged at 3000 rpm for 3 minutes at room temperature, the unreacted FITC-labeled secondary antibody was removed, the cells were collected, suspended in 200 1 PBS, centrifuged again, and washed.
  • the cells were suspended in 100 ⁇ l PBS and transferred to 96-well flat bottom plates.
  • the fluorescence of the secondary antibody was measured using a Typhoon9210 image analyzer (Amersham Bioscience).
  • the cell culture solution on the 3rd to 4th day after passage (about lxlO 6 Zml) was centrifuged at room temperature at lOOOrpm for 5 minutes to collect the cells.
  • Anti-CD20 antibody positive control antibody: mouse antibody 2B8, chimeric antibody and humanized antibody C2B8; negative control: Anti-CD3 monoclonal antibody
  • cells suspended in fresh culture medium are mixed for 1.5 hours at 37 ° C. Reacted in a 5% CO incubator.
  • the final concentration of each of the anti-CD20 antibodies is 0.2, 1, 5 / z gZml, cell density lxlO 6 cells Zm 1, and culture medium is used as a reaction solution to a volume of 250 1. 1. Reaction in a 5ml tube I went. Three samples were prepared for the same test antibody.
  • the mixture was centrifuged at 1200 rpm for 3 minutes at room temperature to remove unreacted antibodies and collect the cells.
  • nti mouse IgG and Fc y Fragment were used, and Gome Anti human Ig and vcy Fragment specific were used for the Kimefu body and the human antibody.
  • the mixture was centrifuged at 1200 rpm for 3 minutes at room temperature, the unreacted secondary antibody was removed, and the cells were collected. Suspended with 250 1 PBS, washed again by centrifugation
  • MEBCYTO apoptosis kit- Annexin V-FITC, ⁇ - (MBL, Cat. No. 4700, Lot. 21) was used as a detection reagent. After suspending 85 ⁇ 1 of Binding buffer, add Annexin V-FITC 5 ⁇ 1 and propidium iodide (PI) 5 1 (final concentration 0.5 mg / ml) and mix well. The reaction was allowed to proceed for 15 minutes at temperature.
  • a DNA whose codon was optimized for CHO cells based on the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 17 to 24 was designed and synthesized by a conventional method.
  • the humanized 1K1791 expression construct was introduced into CHO DG44cd B cells using a transfection reagent. 1 ⁇ 10 6 CHO DG44cdB cells into which each gene was introduced were suspended in 100 ml of selective medium and spread on 5 96-well plates (200 1Z well). The cells were cultured at 37 ° C for 3-4 weeks in the presence of 5% carbon dioxide.
  • Transfusion reagent Qiagen, Effectene Transfection Reagent, Cat. No 301427
  • Selection medium IS CHO-CD w / Hydrolysate / 4 mM GlutaMAX / 0.8 mg / ml G418
  • Clones with high antibody production were transferred to a 24-well plate, cultured for about 5 days, and the supernatant was taken and antibody production was measured by sandwich ELISA.
  • Two clones selected for each of the 16 constructs were cultured in T75 flasks containing 30 ml of selective medium.
  • An antibody-producing cell line (genetically modified CHO-DG44 cells) containing Hydrolysate CHO—CD / with Hydrolysate (Irvine Scientific, Cat. No. 91119) was supplemented with 4 mM GlutaMax (Invitrogen, Cat 35050—061) and 200 ⁇ g / ml G418 (Sigma, Cat. No. A1720—5G). Culture in a medium incubator at 37 ° C and CO concentration of 5%.
  • the cell culture medium was centrifuged at room temperature and 3500 rpm for 5 minutes, and the culture supernatant was collected and filtered through a 0.45 ⁇ syringe filter. Equilibrated with 50 mM Tris—HC1, pH 7.0
  • the culture supernatant was added to a Hi Trap Protein A HP (GE Healthcare, Cat No. 17-0402-01) column, and then washed with 50 mM Tris—HC1, pH 7.0. Elution was performed with 0.1 M citrate, pH 4.0, and 400 ⁇ l was collected and neutralized with 10 ⁇ l of 40 ⁇ 1 1M Tris—HC1, pH 9.0. Dialysis was carried out against 100 volumes of PBS using a M. W. 3500 dialysis cup (Bio-Tech Cat. No. 2 12932) for 2.5 hours twice and then for 15 to 18 hours.
  • the antibody-producing strains used were CHO cells hzl791-! V10, hzl791-ffi34, hzl791-sf43 and hzl791-ss32, which were under the Budapest Treaty from March 1, 2006 in Japan Ibaraki Tsukuba 1-chome 1 1 Central 6th National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center, FERM BP—10543, FERM BP—105 44, FERM BP—10545 and FERM, respectively
  • the amino acid sequences (SEQ ID NOs: 17-24) of the H chain V region and L chain V region of the human baboon anti-CD20 monoclonal antibody obtained from these cell lines deposited under the accession number BP-10546 are as follows: (Underlined part is different from the corresponding mouse antibody).
  • H chain V region sequence (SEQ ID NO: 24) WMG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTSTYFCTR RT NYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
  • sdr 1791 STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSNSNDVA WYQQKPGQSPKVL IY FASNRYS GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAG TKLEIK
  • anti-CD20 antibody alone showed sufficient apoptosis-inducing ability, but the apoptosis-inducing ability of group A and anti-CD20 antibody alone, which is almost the same even under cross-linking conditions with secondary antibodies, is not sufficiently shown.
  • Is Group B which increases significantly under cross-link conditions.
  • the antibodies included in Group A have the same affinity as 2B8, and the antibodies included in Group B include those having higher affinity than 2B8.
  • Group A which does not require the presence of a secondary antibody to induce apoptosis and can induce apoptosis alone, is more convenient as a medicine.
  • Gnolepe A 1V, ff
  • Kd value (nM), apoptosis-inducing activity (%) and CDC activity against human CD20 antigen (%) was investigated.
  • the Kd value was measured as described in Example 2.
  • the CDC activity was measured as described in Example 2 (however, in the experiment for examining the relationship between the antibody amount and the CDC activity, an antibody-generated product was used as described later).
  • ADCC activity was measured as described in Example 2.
  • Apoptotic activity was measured as described in Example 3.
  • the B cells used were Raji, SU-DHL4, WiL-2, and RCK8. Data for four clones fv, ff, sf, and ss for each cell are shown in FIGS. 10a-10d.
  • Antibodies that have apoptosis-inducing activity alone and can exert an anticancer effect by apoptosis and CDC have high affinity for CD20 antigen.
  • the former selection criteria it is preferable to select those having high affinity for CD20 antigen and high CDC activity (the lower the Kd value, the higher the CDC activity tends to be observed). In this case, since only antibodies that do not induce apoptosis by themselves are selected, attention should be paid only to the value of CDC activity. In the case of a clone that satisfies the former selection criteria, apoptosis induction alone is not caused, but cell affinity can be promoted due to extremely high affinity and CDC activity.
  • the Kd value that gives the midpoint of the apoptotic activity of the four types of cells was determined by plotting (in the graphs of Figs. 10a to 10d). dotted line Indicated by). From these four graphs, there is no significant difference in the Kd value that gives the midpoint of apoptotic activity About 9.5 nM for Raji cells, about 8.5 nM for SU-DHL4 cells, and WiL2 cells was about 9.5 nM and about R ⁇ for RCK8 cells. Based on these results, a Kd value of approximately 9.5 nM was used as the boundary point for the above two selection criteria.
  • the upper limit of the Kd value of the latter selection criteria is considered in the case of WiL2 cells and RCK8 cells, in which the maximum value of CDC activity is observed (Fig. 10c and Fig. 10d).
  • the upper limit of the Kd value was set to about 13 nM because the sum is as large as possible and the force is also in the range of high affinity (small Kd value).
  • the antibody-producing cell line (genetically modified CHO—DG44 cells) can be obtained from IS C HO-CD / w (Irvine Scientific, Cat. No. 91119) containing Hydrolysate, 4 mM GlutaMax (Invitrogen, Cat 3 5050-061), 200 ⁇ g. It was cultured in a medium supplemented with / ml G418 (Sigma, Cat. No. A1720-5G) at 37 ° C. in a CO incubator with a CO concentration of 5% and maintained by passage twice a week. Successor
  • the cell culture solution was centrifuged at room temperature and 3500 rpm for 5 minutes, and the culture supernatant was collected and filtered through a 0.45 ⁇ m syringe filter. Equilibrium was performed with 50 mM Tris-HCl, pH 7.0. The culture supernatant was added to a Hi Trap Protein A HP (GE Healthcare, Cat No. 17-0402-01) column, and then washed with 50 mM Tris-HCl, pH 7.0. Elution was carried out with 0.1 M citrate, pH 4.0, and 400 ⁇ 1 was collected and neutralized with 40 ⁇ 1 1M Tris-HCl, pH 9.0, equivalent to 10 to 1 volume.
  • Hi Trap Protein A HP GE Healthcare, Cat No. 17-0402-01
  • Dialysis was carried out against 100 volumes of PBS using Slyde-A-Lyzer 10K Dialysis Cassetes (PIERC E CatNo. 66453) twice after 2.5 hours and once for 15 to 18 hours.
  • the dialyzed sample was concentrated using VIVA SPIN 50,000 MWCO PES (VIVASCIENCE CatNo. VS0231). This sample was loaded onto a HiLoad 16/60 superdex 200 prep grade (GE Healthcare Cat No. 17-1069-01) column equilibrated with PBS.
  • the purified sample was filtered through a 0.22 ⁇ m syringe filter and then concentrated using VIVA SPIN 50,000 MWCO PES (VIVASCI ENCE CatNo. VS0231).
  • the antibody concentration was calculated from the value of A280 using BECKMAN COULTER DU530.
  • FIG. 11a The relationship between the concentration and CDC activity of humanized antibodies fv, ff, sf, ss, and chimeric antibody clkl79 against Raji, SU-DHL4, WiL-2, and RCK8 cells is shown in FIG. 11a to FIG.
  • the CDC activity of human rabbit antibodies fv, ff, sf, and ss is similar to or exceeds that of Rituxan (C2B8) at concentrations of 5 / z gZml or higher. It was.
  • Clones fv and ff (clones expected to have CDC activity) selected as antibodies with high CDC activity and Kd value of less than about 9.5 nM against Raji cells (floating cells) Shows higher CDC activity than rituximab at any concentration of 5 gZml and higher CDC activity against SU-LDHL4 cells, especially against Raji and RCK8 cells I understood.
  • the Kd value for Raji cells is in the range of about 9.5 nM to about 13 nM, and the antibody is selected as an antibody having the smallest sum of apoptotic activity and CDC activity as much as possible.
  • the clone sf (which is expected to have both CDC activity and apoptosis) has a cytolytic activity similar to or higher than that of rituximab for any cell at a concentration of 5 gZml or more, and in particular, has a lytic activity for SU-LDHL4 cells.
  • the lytic activity against high Wil2 cells and RCK8 cells was higher than that of other antibodies.
  • clone sf has apoptosis induction activity comparable to or stronger than rituximab, and does not require a secondary antibody to induce apoptosis, and has sufficient apoptosis activity alone. I was able to demonstrate it.
  • the total apoptotic and CDC activity of clone sf was higher than that of rituximab in all cells tested, especially in WiL2 and SU-DHL4 cells (Table 6, Figure 11a to lld and Table 7).
  • the human rabbit monoclonal antibody of the present invention selected as described above exhibits a cytolytic activity that is much higher than that of Rituxan. Therefore, it was considered that the humanized antibody selected according to the selection criteria of the present invention has a B cell-related disease therapeutic effect that can be sufficiently used as a medicine.
  • a humanized anti-human CD20 monoclonal antibody having a high binding affinity for a human CD20 molecule in a natural state and exhibiting a biological activity suitable as a pharmaceutical, and a method for selection thereof. Those having a therapeutic effect on B cell-related diseases that can be sufficiently used as pharmaceuticals can be obtained.
  • SEQ ID NO: 17 L chain V region sequence of humanized antibody abb 1791
  • SEQ ID NO: 18 L chain V region sequence of humanized antibody fra 1791
  • SEQ ID NO: 19 L chain V region sequence of humanized antibody sdr 1791
  • SEQ ID NO: 20 L chain V region sequence of humanized antibody Ven 1791
  • SEQ ID NO: 21 H chain V region sequence of humanized antibody abb 1791
  • SEQ ID NO: 22 H chain V region sequence of humanized antibody fra 1791
  • SEQ ID NO: 23 H chain V region sequence of humanized antibody sdr 1791
  • SEQ ID NO: 24 H chain V region sequence of humanized antibody Ven 1791 SEQ ID NO: 25: primer
  • SEQ ID NO: 26 primer

Abstract

　ヒト化抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体、それらの選別基準、ならびにそれにより選別された、医薬として好適な生物学的活性を示すヒト化抗体を提供する。

Description

明 細 書
ヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体
技術分野
[0001] 本発明は、抗 CD20モノクローナル抗体に関する。
背景技術
[0002] CD20はヒト Bリンパ細胞表面に発現して 、る糖鎖不含タンパク質で、末梢血、脾臓 、扁桃、骨髄中の正常 B細胞に加えて、多くの悪性腫瘍 B細胞に発現している。 CD2 0のモノクローナル抗体が結合するェピトープは多様性が非常に高ぐ多様な生物学 的応答が報告され、また、 CD20を認識するモノクローナル抗体が多数報告されてい る。とりわけ、リツキシマブ (rituximab)は、ヒト B細胞である SB細胞株を免疫して得ら れるマウス抗体 2B8から由来するキメラマウス Zヒトモノクローナル抗体（C2B8)であ り（特許文献 1および 2参照）、登録商標リツキサン (Rituxan)の名称で低悪性度非ホ ジキンリンパ腫 (NHL)の治療薬として実用化されている。さらにその後、リツキサン は B細胞が関与する多くの免疫疾患に対して有効であること、例えば、慢性リンパ性 白血病 (CLL)などの悪性腫瘍、自己免疫溶血性貧血症、特発性血小板減少症紫 斑病 (ITP)などの病原性自己抗体が関与して 、る自己免疫疾患、関節リウマチ (RA )や多発性硬化症 (MS)のような炎症性疾患に対して有効であることが報告されて!、 る (非特許文献 1〜4参照)。
リンパ系 B細胞に結合したリツキシマブにヒト補体が結合し、補体依存性細胞障害（ CDC)によりリンパ系 B細胞系を溶解することが報告されており（非特許文献 5参照） 、またリツキシマブは抗体依存性細胞障害 (ADCC)のアツセィでは活性を示し、トリ チウム化チミジン導入アツセィでは抗増殖効果と、アポトーシス誘発が報告されて ヽ る (非特許文献 6参照)。
一方、異種動物とのキメラ分子は抗原性を有するため治療薬として一般には好まれ ないが、リツキシマブを含め、抗 CD20抗体は正常細胞を含む全ての B細胞を標的し 除去する性質を有するため抗原性はないと考えられた。しかし、数パーセントではあ るが治療期間中に中和抗体を誘起する事例が報告されていること、投与する量や期 間によつてはさらにその可能性が高まることや、治療対象疾患が B細胞リンパ腫から 、 RA、 IT、 MSに拡大していくなかで抗原性の問題がクローズアップされ、最近、より ヒトに近 、配列を有するヒト化抗体またはヒト抗体が要望されるようになって!/、る。 さらに、キメラ抗体は、血中半減期が比較的短い問題を有し、リツキシマブを含めマ ウス Zヒトのキメラ抗体のベータ半減期 ( β 1/2)は 3〜4日に過ぎず、リツキシマブの 低悪性度 NHLに対する臨床試験の奏効率は 50%弱であったことが報告されている (非特許文献 7参照)。また、リツキシマブの CD20抗原に対する解離定数 (Kd値）は 5. 2nMであり、結合親和性があまり高くなぐ NHL治療において投与量が多くなる 問題もある (非特許文献 8参照)。
特許文献 1：国際公開第 94Z11026号パンフレット
特許文献 2 :米国特許第 5736137号明細書
非特許文献 l : Coiffier B et al.， Blood 1998; 92: 1297-32
非特許文献 2 : Edward JC et al.， Rheumatology (Oxford) 2001 ; 40:205-11 非特許文献 3 : Zaja F et al , Heamatologica 2002; 87: 189-95
非特許文献 4 : Perrotta S et al. , Br J Haematol 2002; 116:465-7
非特許文献 5 : Reff et al., Blood 1994; 83: 435-445
非特許文献 6 : Maloney et al., Blood 1996; 88: 637a
非特許文献 7 : IDEC Pharmaceuticals Corporation News Release, December 8, 1998 非特許文献 8 : Mitchell ER et al., Blood 1994; 82:435-445
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 上記のような事情に鑑み、本発明は、医薬としてさらに適した生物学的活性を示す 抗 CD20モノクローナル抗体を提供することを主な目的とする。
課題を解決するための手段
[0004] 本発明者らは、上記目的を達成するため、自然の状態のヒト CD20分子に対する結 合親和性の高 ヽモノクローナル抗体を作製し、優れた機能を有する抗 CD20モノクロ ーナル抗体を得るべく鋭意研究を重ねた。その結果、免疫原として CD20抗原が高 密度とされる B細胞株である SB細胞や Raji細胞と、遺伝子組換により細胞膜上に CD 20を多量に発現させた非ヒト動物細胞を組み合わせて用いることにより、高親和性の モノクローナル抗体であって、優れた生物学活性を示すものが得られることを見出し
、本発明を完成するに至った。
[0005] さらに本発明者らは、有効な抗ヒト CD20ヒト化抗体の新たな選抜方法を見出すこと に成功した。この選抜方法を用いることにより、本発明のヒトイ匕抗 CD20モノクローナ ル抗体のな力から医薬品として有効に使用できるものを選抜することができた。
[0006] すなわち、本発明は、以下のものを提供する：
(1)ヒト CD20抗原を発現しているヒト B細胞株と、ヒト CD20の DNAで形質転換さ れた非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒト CD20 抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗 CD20モノクローナル抗 体であって、下記選抜基準：
(i)ヒト CD20抗原に対する解離定数 (Kd値）が約 9. 5nM未満であって、 B細胞 に対する CDC活性が 2B8抗体と同等またはそれ以上の抗体
を満たすヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体、
(2)ヒト CD20抗原を発現して!/、るヒト B細胞株と、ヒト CD20の DNAで形質転換さ れた非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒト CD20 抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗 CD20モノクローナル抗 体であって、下記選抜基準：
(a)ヒト CD20抗原に対する解離定数 (Kd値）が約 9. 5nM未満であって、 Raji細 胞 (浮遊細胞)または SU— DHL4細胞に対する CDC活性が 2B8抗体と同等または それ以上の抗体
を満たすヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体、
(3)ヒト CD20抗原を発現して!/、るヒト B細胞株と、ヒト CD20の DNAで形質転換さ れた非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒト CD20 抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗 CD20モノクローナル抗 体であって、下記選抜基準：
(ii)ヒト CD20抗原に対する Kd値が約 9. 5nMから約 13nMの範囲であって、 B 細胞に対するアポトーシス活性と CDC活性の総和が 2B8抗体と同等またはそれ以 上の抗体
を満たすヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体、
(4)ヒト CD20抗原を発現して!/、るヒト B細胞株と、ヒト CD20の DNAで形質転換さ れた非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒト CD20 抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗 CD20モノクローナル抗 体であって、下記選抜基準：
(b)ヒト CD20抗原に対する Kd値が約 9. 5nMから約 13nMの範囲であって、 Wi L2細胞または RCK8細胞に対するアポトーシス活性と CDC活性の総和が 2B8抗体 と同等またはそれ以上の抗体
を満たすヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体、
(5)配列番号 18の L鎖と配列番号 22の H鎖を組み合わせた（1)または（2)記載の ヒト化抗 CD20モノクローナル抗体、
(6)配列番号 18の L鎖と配列番号 24の H鎖を組み合わせた（1)または（2)記載の ヒト化抗 CD20モノクローナル抗体、
(7)配列番号 19の L鎖と配列番号 22の H鎖を組み合わせた（3)または (4)記載の ヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体、ならびに
(8) (1)〜（7)の!、ずれかに記載のヒトイヒ抗 CD20モノクローナル抗体を有効成分 として含む B細胞関連疾患治療剤。
発明の効果
[0007] 本発明により、 CD20抗原の細胞外ェピトープに対して強い結合親和性を示し、か つ CDCなどの細胞傷害活性が高 、ヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体が得られ、こ れらの抗体は、 B細胞が関与する疾患の治療剤として極めて有効である。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]組換抗体発現用ベクター pNOW-Abの構造を示す制限地図である。
[図 2]タンパク発現用ベクター pNOWの構造を示す制限地図である。
[図 3a]アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
[図 3b]アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
[図 3c]アポトーシス試験の結果を示すグラフである。 [図 3d]アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
[図 4a]抗体濃度と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 4b]抗体濃度と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 4c]抗体濃度と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 4d]抗体濃度と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 5a]E： T比と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 5b]E :T比と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 5c]E :T比と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 5d]E :T比と ADCCの関係を示すグラフである。
[図 6a]CDC試験の結果を示すグラフである。
[図 6b]CDC試験の結果を示すグラフである。
[図 6c]CDC試験の結果を示すグラフである。
[図 6d]CDC試験の結果を示すグラフである。
[図 7a]マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 7b]マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 7c]マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 7d]マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 8a]ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 8b]ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 8c]ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 8d]ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
[図 9a]ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。
[図％]ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。
[図 9c]ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。
[図 9d]ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。
圆 10a]ヒト化抗体の解離定数および細胞障害活性 (アポトーシス誘導活性および C
DC活性)の関係を示すグラフである。使用細胞は Raji細胞である。白四角は CDC 活性 (％)、黒丸はアポトーシス活性 (％)を示す。 圆 10b]ヒト化抗体の解離定数および細胞障害活性 (アポトーシス誘導活性および c
DC活性)の関係を示すグラフである。使用細胞は SU— DHL4細胞である。白四角 は CDC活性 (%)、黒丸はアポトーシス活性 (%)を示す。
圆 10c]ヒト化抗体の解離定数および細胞障害活性 (アポトーシス誘導活性および C DC活性)の関係を示すグラフである。使用細胞は WiL2細胞である。白四角は CDC 活性 (%)、黒丸はアポトーシス活性 (%)を示す。
圆 10d]ヒト化抗体の解離定数および細胞障害活性 (アポトーシス誘導活性および C DC活性)の関係を示すグラフである。使用細胞は RC— K8である。白四角は CDC 活性 (%)、黒丸はアポトーシス活性 (%)を示す。
[図 11a]ヒト化抗体およびキメラ抗体の CDC活性を示すグラフである。使用細胞は Raj i細胞である。
[図 lib]ヒト化抗体およびキメラ抗体の CDC活性を示すグラフである。使用細胞は SU DHL4細胞である。
[図 11c]ヒト化抗体およびキメラ抗体の CDC活性を示すグラフである。使用細胞は Wi L2細胞である。
[図 lid]ヒト化抗体およびキメラ抗体の CDC活性を示すグラフである。使用細胞は RC K8である。
[図 12a]ヒト化抗体濃度と ADCCの関係を示すグラフである。使用細胞は Raji細胞で ある。
[図 12b]ヒト化抗体濃度と ADCCの関係を示すグラフである。使用細胞は SU - DHL 4細胞である。
[図 12c]ヒト化抗体濃度と ADCCの関係を示すグラフである。使用細胞は WiL2細胞 である。
[図 12d]ヒト化抗体濃度と ADCCの関係を示すグラフである。使用細胞は RC— K8細 胞である。
[図 13a]ヒト化抗体の E :T比と ADCCの関係を示すグラフである。使用細胞は Raji細 胞である。
[図 13b]ヒト化抗体の E： T比と ADCCの関係を示すグラフである。使用細胞は SU - DHL4細胞である。
[図 13c]ヒトイ匕抗体の E :T比と ADCCの関係を示すグラフである。使用細胞は WiL2 細胞である。
[図 13d]ヒト化抗体の E： T比と ADCCの関係を示すグラフである。使用細胞は RC - K8細胞である。
符号の説明
[0009] Pcmv:サイトメガロウィルスプロモーター
PAbgh:ゥシ成長ホルモン遺伝子ポリ A付加シグナル
Psvd:ェンハンサーを欠失させたシミアンウィルス 40プロモーター
DHFR:マウスジヒドロ葉酸還元酵素 cDNA
PAsv:シミアンウィルス 40ポリ A付カ卩シグナル
PBR322ori:大腸菌中での複製起点
Amp： 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）
Neor: 哺乳動物細胞中での選択マーカー（G418耐性）
INrbg:ゥサギ 13グロビンイントロン
SP1:抗体軽鎖シグナルペプチド
VL:抗体軽鎖可変領域 cDNA
C κ 抗体 κ軽鎖定常領域 cDNA
SPh:抗体軽鎖シグナルペプチド
Vh:抗体軽鎖可変領域 cDNA
C γ 1:抗体 γ 1重鎖定常領域 cDNA
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本明細書において、「抗体」には、抗体全体のみならず、抗体全体と同等の、抗原 に対する結合親和性を示すフラグメント、例えば、元の抗体全体の可変領域を含む フラグメント (例、 Fab、 F(ab')など)も包含する。
2
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト CD20抗原に対し高い親和性を有し、かつ、 優れた生物学的活性を示すモノクローナル抗体であり、マウス由来のモノクローナル 抗体、そのキメラ化、ヒト化抗体を包含する。 その好ましい第 1の態様は、ヒト CD20抗原を有する細胞に対して増殖阻害活性を 有し、ヒト CD20抗原に対する解離定数 (Kd値）が、リツキシマブの由来するマウス抗 体である 2B8の 1Z2以下の、好ましくは 1. 70〜3. 39nMの、ヒト CD20抗原に対し て高 、親和性を有するモノクローナル抗体である。
解離定数 (Kd値)の測定方法は、細胞上に発現する抗原に対する Kd値を測定で きる方法であれば特に限定するものではないが、本明細書においては、後の実施例 に記載する方法による解離定数とする。
[0011] ヒト CD20抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性は 2B8よりも大きいことが好ま しい。増殖阻害活性は、好ましくは、末梢血単核細胞非存在下でのヒト CD20抗原を 有する細胞の in vitro培養に対する増殖阻害活性であり、さらに好ましくは、増殖阻害 活性はアポトーシス誘導によるものである。抗 CD20抗体のうちいくつかの抗体では、 CD20への結合に伴 、B細胞内のカルシウムイオン (Ca2+)濃度を上昇させ Srcキナ ーゼが関与するアポトーシスを誘導することが報告されている。
上記の増殖阻害活性の測定は、例えば、 Miyamoto T, Min W, Lillehoj HS.Avian D is. 2002 Jan- Mar;46(l):10- 6に記載の方法により測定できる。
[0012] 本発明の第 1の態様のモノクローナル抗体の具体的な例としては、 L鎖可変領域ァ ミノ酸配列と H鎖可変領域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号 1及び 9、配列番号 2及 び 10、又は、配列番号 3及び 11であるマウスを由来とするモノクローナル抗体と、そ れらの抗体をキメラ化又はヒト化したものが挙げられる。
キメラ化は、例えば、 Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho Vol 60, No 3, 2002-3:439-44 4に記載されるような公知の方法に従って、マウス由来モノクローナル抗体の可変領 域アミノ酸配列とヒトイムノグロブリン定常領域アミノ酸配列を融合させることにより行う ことができる。
ヒト化は、例えば、上記 Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho Vol 60, No 3, 2002-3:439- 444や、 Eduardo A.Padlan, Molecular Immunology, Vol. 28—4/5, pp489— 498, 1991； Eduardo A.Padlan et.al, The FASEB Journal,vol.9, ppl33- 139;および Tai te Wu, El vin A. Kabat, Molecular Immunology, Vol.29- 9, ppl 141- 1146, 1992に記載されるよ うな公知の方法に従って、マウス由来モノクローナル抗体の可変領域 CDRアミノ酸配 列とヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列を用いて行うことができる。
キメラ化又はヒト化を行う場合には、複数のマウスモノクローナル抗体の L鎖可変領 域のアミノ酸配列と、 H鎖可変領域のアミノ酸配列を任意に組み合わせてもよい。例 えば、配列番号 1〜3のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸 配列をキメラ化した L鎖と配列番号 9〜 11のマウス由来モノクローナル抗体可変領域 アミノ酸配列をキメラ化した H鎖を組み合わせたキメラ抗 CD20モノクローナル抗体、 配列番号 1〜3のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域 CDRのァミノ 酸配列をヒトイヒした L鎖と配列番号 9〜 11の!、ずれかのマウス由来モノクローナル抗 体可変領域 CDR配列をヒト化した H鎖を組み合わせたヒト化抗 CD20モノクローナル 抗体が挙げられる。
本発明の好ましい第 2の態様の抗体は、ヒト CD20抗原に対する解離定数 (Kd値） 力^ B8の 1Z8以下であるマウス由来モノクローナル抗体をキメラ化またはヒト化した モノクローナル抗体である。
ヒト CD20抗原に対し高い親和性を有する抗体で、特にヒト IgGl又は IgG3、又は それらを改変したヒト Fc配列を有する抗体 (マウス由来モノクローナル抗体をキメラィ匕 又はヒト化したものを含む）は、細胞表面上の CD20に結合した場合、 NK細胞上の F c γ RIII (CD 16)を介したエフェクター細胞の活性ィ匕を誘発し、抗体依存性細胞性細 胞傷害 (ADCC)を起こすことがよく知られている。また、ヒト CD20抗原に対し高い親 和性を有する抗体で、特にヒ HgG又は IgM、又はそれらを改変したヒト Fc配列を有 する抗体 (マウス由来モノクローナル抗体をキメラ化又はヒト化したものを含む）は、細 胞表面上の CD20に結合した場合、補体の活性化を誘発し、補体依存性細胞傷害（ CDC)を起こすこともよく知られて！/、る。
力べして、本発明の第 2の態様の抗体は、 ADCC又は CDCを示すことが期待できる 第 2の態様の抗体の具体的な例としては、 L鎖可変領域アミノ酸配列と H鎖可変領 域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号 4及び 12、配列番号 5及び 13、配列番号 6及び 14、配列番号 7及び 15、又は、配列番号 8及び 16であるものが挙げられる。
キメラ化又はヒト化は、第 1の態様の抗体と同様に行うことができ、その場合、複数の マウスモノクローナル抗体の L鎖可変領域のアミノ酸配列と、 H鎖可変領域のアミノ酸 配列を任意に組み合わせてもよい。例えば、配列番号 4〜8のいずれかのマウス由来 モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化した L鎖と配列番号 12〜16のい ずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化した H鎖を 組み合わせたキメラ抗 CD20モノクローナル抗体、配列番号 4〜8の!、ずれかのマウ ス由来モノクローナル抗体可変領域 CDRのアミノ酸配列をヒトイ匕した L鎖と配列番号 12〜 16の!、ずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域 CDR配列をヒト化し た H鎖を組み合わせたヒト化抗 CD20モノクローナル抗体が挙げられる。
[0014] 本発明の好ましい第 3の態様の抗体は、リツキシマブが効果を示さない細胞に対し ても有効なヒト化したモノクローナル抗体を包含する、 2B8に対する特定の解離定数 に限定されな 、一群のヒト化抗体である。
これらの抗体の例としては、配列番号 18の L鎖と配列番号 24の H鎖、配列番号 18 の L鎖と配列番号 22の H鎖、配列番号 19の L鎖と配列番号 22の H鎖または配列番 号 19の L鎖と配列番号 23の H鎖を組み合わせたヒト化 CD20モノクローナル抗体が 挙げられる。
[0015] さらに本発明者らは、本発明により得られたヒト化抗 CD20モノクローナル抗体につ いて、抗体のヒト CD20抗原に対する親和性と CDC活性、アポトーシス誘導活性との 相関に基づいて抗体のタイプを分類し、その分類に基づいて抗体医薬品として有用 なモノクローナル抗体を選抜することができた (実施例 4参照)。
[0016] すなわち、親和性が高い抗体は、それ自身でアポトーシスを誘導することができず 、アポトーシスの誘導に二次抗体によるクロスリンクが必要であること、一方、親和性 が低い抗体は、それ自身でアポトーシス誘導活性を発揮することがわ力つた。さらに 、親和性が高い抗体ほど CDC活性も高いケースが多いこともわ力つた。それゆえ、親 和性の低い抗体は、二次抗体が存在しなくてもアポトーシスを誘導できる力 CDC活 性が低い傾向を有する。したがって、これらの知見から、医薬品として有効な候補抗 体を見出すことができる、 2つの選抜基準を設定することができた：
—単独ではアポトーシスを誘導しないが、ヒト CD20抗原に対する親和性が極め て高ぐ CDCにより抗ガン効果を発揮しうる抗体;あるいは —単独でアポトーシス誘導活性を持ち、アポトーシスと CDCにより抗ガン効果を 発揮しうる抗体のうち、ヒト CD20抗原に対する親和性が高 、もの。
[0017] 前者の選抜基準では、ヒト CD20抗原に対する親和性が高ぐかつ CDC活性も高
V、ものを選抜することが好まし 、 (Kd値が低 、ほど CDC活性が高 、傾向が見られる )。前者の選抜基準を満たすクローンの場合には、単独でアポトーシス誘導は引き起 こさないが、親和性が高いという利点を有し、高い CDC活性により細胞枯渴を促すこ とができる。本発明者らは、前者の選抜基準を満たす抗体は、約 9. 5nM未満のヒト CD20抗原に対する解離定数 (Kd値)を有するものが多いことを見出した。
[0018] 後者の選抜基準では、抗体によるアポトーシスと CDCの総和が大きぐかつ、ヒト C D20抗原に対する親和性が高いものを選抜することが好ましい。したがって、後者の 選抜基準を満たすクローンの場合には、親和性は高くないが、アポトーシス活性が高
V、と 、う利点を有し、アポトーシス誘導と CDCの相乗効果により細胞枯渴を促すこと ができる。本発明者らは、後者の選抜基準を満たす抗体は、約 9. 5nM力も約 13η Μの範囲のヒト CD20抗原に対する解離定数 (Kd値)を有するものが多 、ことを見出 した。
[0019] 上記選抜基準を数値的に表現することが好ましい。したがって、上記選抜基準は各 々次のように表現することができる：
(i)ヒト CD20抗原に対する解離定数 (Kd値）が約 9. 5nM未満であって、 B細胞 に対する CDC活性が 2B8抗体と同等またはそれ以上の抗体;あるいは
(ii)ヒト CD20抗原に対する Kd値が約 9. 5nMから約 13nMの範囲であって、 B 細胞に対するアポトーシス活性と CDC活性の総和が 2B8抗体と同等またはそれ以 上の抗体。
ここに、同等とは、比較すべき値の士約 10%の範囲の値を意味する。
[0020] 本発明者らはさらに実験を行って、 B細胞の種類に応じて上記選抜基準を適用す ることが好ま U、ことを見出した。具体的には後記実施例 4で得られた結果をふまえ て、上記選抜基準 (i)を (a)のように、（ii)を (b)のように、各々、さらに詳細に表現す ることができる：
(a)ヒト CD20抗原に対する解離定数 (Kd値）が約 9. 5nM未満であって、 Raji細 胞 (浮遊細胞)または SU— DHL4細胞に対する CDC活性が 2B8抗体と同等または それ以上の抗体;あるいは
(b)ヒト CD20抗原に対する Kd値が約 9. 5nMから約 13nMの範囲であって、 Wi L2細胞または RCK8細胞に対するアポトーシス活性と CDC活性の総和が 2B8抗体 と同等またはそれ以上の抗体。
ここに、同等とは、比較すべき値の士約 10%の範囲の値を意味する。
[0021] 上記 (i)または (a)の選抜基準に従う場合には、ヒト CD20抗原に対する Kd値が約 9. 5nM未満であって、できるだけ Kd値が低ぐかつ、 CDC活性の高い抗体を選抜 することが好ましい。好ましくは、 Raji細胞 (浮遊細胞)または DHL4細胞に対する C DC活性が 2B8抗体と同等またはそれ以上の抗体を選択する。通常は、 Kd値の小さ V、抗体ほど CDC活性が高!、傾向があるので、単に Kd値の小さ!/、（CD20抗原に対 する親和性が高 、)抗体を選抜すればょ 、。 (i)または (a)の選抜基準を満たす抗体 は、 CD20抗原に対する親和性が極めて高ぐ CDC活性も極めて高いので、優れた 抗ガン効果を発揮することができる。ただし、（i)または (a)の選抜基準を満たす抗体 は、単独ではアポトーシスを誘導せず、アポトーシスの誘導には二次抗体を必要とす る。
[0022] 上記 (ii)または (b)の選抜基準に従う場合には、ヒト CD20抗原に対する Kd値が約 9. 5nMから約 13nMの範囲であって、できるだけアポトーシス活性と CDC活性の総 和が大きぐかつ、 Kd値が小さい抗体を選抜することが好ましい。好ましくは、 WiL2 細胞または RCK8細胞に対する CDC活性とアポトーシス活性の総和が 2B8抗体と 同等またはそれ以上のものを選抜する。 (ii)または (b)の選抜基準を満たす抗体は、 CD20抗原に対する親和性がある程度高ぐ単独でアポトーシスを誘導でき、アポト 一シスと CDCの相乗効果により優れた抗ガン効果を発揮することができる。好ましく は、アポトーシス活性と CDC活性の総和が 2B8抗体と同等またはそれ以上のものを 選抜する。
[0023] 換言すれば、（i)または（a)の選抜基準は、抗体が極めて高 、CDC活性を有するこ とを期待する場合に適用することができ、（ii)または (b)の選抜基準は、抗体が CDC 活性とアポトーシス活性の両方を有することを期待する場合に適用することができる。 [0024] 本発明により得られたヒト化抗 CD20モノクローナル抗体であって、上記選抜基準 (i )または (a)を満たす抗体としては、配列番号 18の L鎖と配列番号 22の H鎖を組み 合わせたヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体、ならびに配列番号 18の L鎖と配列番号 24の H鎖を組み合わせたヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体が例示される。
本発明により得られたヒト化抗 CD20モノクローナル抗体であって、上記選抜基準 (i i)または (b)を満たす抗体としては、配列番号 19の L鎖と配列番号 22の H鎖を^ &み 合わせたヒト化抗 CD20モノクローナル抗体が例示される。
[0025] また、本発明の抗体とは異なるェピトープを認識する抗体、例えば、本発明以外の 方法により得られた抗体についても、本発明の選抜に関する考え方を適用し、選抜 することが可能である。したがって、本発明は、さらなる態様において、下記選抜基準 単独ではアポトーシスを誘導しないが、抗原に対する親和性が極めて高ぐ CD Cにより抗ガン効果を発揮しうる抗体；ある!/ヽは
—単独でアポトーシス誘導活性を持ち、アポトーシスと CDCにより抗ガン効果を 発揮しうる抗体のうち、抗原に対する親和性が高いもの
を用いることを特徴とする抗ガン抗体の選抜方法、ならびに該方法により選抜された 抗体にも関する。
[0026] 選抜基準 (i)または (a)、あるいは (ii)または (b)を適用する際の、抗原に対する親 和性、アポトーシス活性および CDC活性の測定は、当該分野で知られているいずれ の手法を用いて行ってもよい。抗原に対する親和性に関しては、抗原との解離定数 を測定し、これを指標とするのが一般的である。ヒト CD20抗原に対するヒト化抗体の 解離定数の測定は、ヒト CD20抗原を発現している細胞を標的として使用して行うの が一般的である。その際、ヒト CD20抗原を発現していない細胞をコントロールとして 用いることが好ましい。細胞に結合したヒト化抗体の検出には、ヒト化抗体に検出可 能な標識を付す、あるいはヒト化抗体に対する標識ィ匕特異的抗体を用いる等の手法 を用いることができる。例えば、本明細書の実施例 2に記載のごとくヒト CD20抗原に 対する親和性 (あるいは解離定数、 Kd値)を測定してもよ！/、。
[0027] 以下に、本発明のヒト化抗 CD20モノクローナル抗体の取得および選抜について説 明する。
本発明のヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体の作製に使用できるマウス由来モノクロ ーナル抗体は、例えば、つぎのような方法によるスクリーニングで得られたノヽイブリド 一マのクローンから目的の性質を有するモノクローナル抗体を産生するクローンを選 択すること〖こより得ることができる。
感作抗原 (免疫原）として、例えば、 CD20を発現している細胞である SB細胞又は R aji細胞と、例えば、遺伝子組換えにより商業的に入手可能な CD20の DNA (又は、 同等の効果を有するそのフラグメント等)で形質転換して細胞表面上に CD20を発現 させた CHO細胞 (CHOZCD20)を用いる。そして、初回免疫、追加免疫、及び、最 終免疫を行う際に、初回免疫及び追加免疫が、免疫の少なくとも 1回は、感作抗原と して、該抗原を発現する、被免疫動物とは他の目に属する動物に由来する細胞株を 用いる免疫、及び、免疫の少なくとも 1回は、感作抗原として、遺伝子組換により細胞 膜表面上に該抗原を発現させた、被免疫動物と同目に属する動物に由来する細胞 株を用いる免疫の 、ずれか一方であり、最終免疫が他方であるようにする。
この他の条件は、通常のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマの作製法と 同様でよい。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、公知の方法に従って 、 （1)被免疫動物の免疫、（2)免疫された動物からのリンパ球の調製、（3)親細胞の 調製、（4)リンパ球と親細胞の細胞融合、（5)スクリーニング及びクローユングによつ て作製される（例えば、 Ailsa M. Campbell (著)、大沢利昭（訳） 生化学実験法 モノ クローナル抗体、東京化学同人、 1989年参照)。
得られたクローンを用いてハイプリドーマを用いてモノクローナル抗体を作製する方 法は、本発明のノ、イブリドーマ作製法で作製されたハイブリドーマを用いることの他 は、通常の、モノクローナル抗体の作製の方法と同様でよい。大量作製の場合には、 細胞培養による方法、マウスの腹水として作製する方法などが挙げられる。また、キメ ラ化又はヒト化抗体を作製する場合には、キメラ化又はヒト化抗体をコードする遺伝子 を作製し、それを発現ベクターに組み込み、発現ベクターを適当な細胞で発現させ ること〖こより作製することができる。
例えば、 L鎖および H鎖の可変領域遺伝子を、ヒトイムノグロブリン L鎖および H鎖（ κ )定常域遺伝子とでキメラ化し、 CHO細胞用高発現ベクターに組み込む。組換抗 体生産用のベクターシステムは市販されているものでよいが、哺乳動物細胞高発現 ベクター pNOW (特許第 3582965号公報）を基に、 L鎖、 H鎖両方のマルチクロー- ングサイト（MCS)を有するダイマー用高発現ベクター pNOW-abに構築したものを使 用できる。各ベクターの構成を示す制限地図を図 1および図 2に示す。キメラ抗体遺 伝子が組み込まれた発現ベクターを CHO細胞にトランスフエタトし、それぞれ生産性 の高 、クローンを選別する。そのクローン力も通常の方法で抗体を作製する。
[0029] 本発明の第 1の態様の抗体は、結合親和性がリツキシマブに比べて相対的に高く かつ増殖阻害活性、好ましくはアポトーシス誘導による活性が高いので、キメラ化又 はヒト化した抗体は B細胞悪性腫瘍及び B細胞が関与する免疫疾患に対する治療剤 の有効成分として使用できる。また、本発明の第 2、第 3の態様の抗体は、ヒト CD20 抗原を有する細胞に対して抗体依存性細胞性細胞傷害 (ADCC)又は補体依存性 細胞傷害 (CDC)を示すと考えられるので、 B細胞悪性腫瘍及び B細胞が関与する 免疫疾患に対する治療剤の有効成分として使用できる。したがって、本発明は、これ らキメラ化又はヒト化した抗体を有効成分とする B細胞関連疾患に対する治療剤も提 供する。
また、本発明のヒト化抗 CD20モノクローナル抗体は、上記 (i)または (a)、あるいは (ii)または (b)の選抜基準を用いて選抜することができ、これらの選抜基準を満たす ものは B細胞悪性腫瘍及び B細胞が関与する免疫疾患に対して有効性が高ぐ特に 医薬用として好都合である。したがって、上記 (i)または (a)、あるいは (ii)または (b) の選抜基準を満たすヒト化抗 CD20モノクローナル抗体を有効成分として含有する B 細胞関連疾患治療剤を提供する。
[0030] さらに、本発明においては、本発明の抗体を 2種以上併用してもよい。
B細胞関連疾患としては、以下に限定するものではないが、例えば、非ホジキンリン パ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、関節リウマチ、自己免疫溶血性貧 血症、特発性血小板減少症紫斑病、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候 群、シエーダレン症候群、クローン病、強皮症、多発性硬化症などが挙げられる。 該治療剤は、公知の製剤技術に従って製造でき、他の配合成分は特に限定するも のではなぐ公知のリツキサンを参考にして、投与量等も決定することができる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定さ れるものではない。
実施例 1
[0031] (1)マウス感作用免疫原の準備
CD20を発現して!/、る B細胞株である SB細胞と Raji細胞を in vitroで培養した。 ま 7こ、另I途、 Multiple Choice cDNA human spleen, Origene Technologies, Inc. 6 Ta ft Court, Suite 100, Rockville, MD 20850から入手した CD20の全分子をコードする DNAを、特異的なプライマー hCD20- S- GK- Not aatgcggccgccaccatgacaacacccagaa attc (配列番号 25)、及び hCD20- E- Xba gctctagattaaggagagctgtcattttc (配列番号 2 6)を用いてクローユングし、それを哺乳動物細胞用高発現ベクターである pNOW (図 1)に組み込み、構築されたベクターを CHO細胞にトランスフエタトした。 FACS分析 により、細胞表面に CD20分子を高発現している組換 CHO細胞（CD20ZCHO細 胞）を榭立した。ここにおいて、 FITC標識抗 CD20モノクローナル抗体で染色した際 に、 SB細胞に比べて蛍光強度が 5倍以上のものを高発現しているものとした。
[0032] (2)免疫原の調製
SB細胞または Raji細胞は 10%FCS添加 RPMI 1640培地を用 Vヽて培養を行つた。 CD20ZCHO細胞は、 G418を 800 /z gZml添カ卩した CHO— S— SFM II培地（G IBCO、 Cat. No. 12052- 098)を用いて培養を行った。これらの培養液を l lOOrpmで 、 5分遠心分離した後、細胞に Dulbecco's PBS (-)を加えて懸濁させ再度遠心分離し た。この洗浄操作をもう一度繰り返し、細胞に生理食塩水を加えて調製した懸濁液（ 細胞数： l〜3 X 107/ml)を免疫に用いた。
[0033] (3)免疫
7〜11週令の Balb/c系雌性マウスへ、免疫原の調製液をいずれも腹腔内投与した 。 SB細胞又は CD20ZCHO細胞のうち、いずれか同じ細胞をさまざまな日数間隔 で 2〜3回繰り返して投与した後、最終免疫には異なった細胞 (CD20ZCHO細胞 又は Raji細胞）を投与した。投与した細胞数はいずれもマウス 1匹当たり 1〜3 X 107 個であった。 使用した免疫原の組み合わせを表 1に示す。
[0034] (4)細胞融合
最終免疫の 3日後、 2匹のマウスから脾臓細胞を調製し、 Oi.V.T. and L.A. Herzenb erg, 1980, in:Selected Methods in Cellular Immunology, eds. B. isnell and S.M. Sni igi(Freeman and Co.San Francisco, CA) p.351に従って、マウスミエローマ（NS— 1) との融合反応を PEG— 1500の存在下で行なった。
[0035] (5) 1次、 2次スクリーニング
CD20ZCHO細胞または CHO細胞 (親株）を付着させた 96ゥエルプレートを用い て Cell ELISAを行い、 CD20に特異的に反応する抗体を産生しているゥエルを選択 した。さらに、同じ CD20ZCHO細胞を付着させた 96ゥエルプレートを用い、リツキ シマブ (C2B8)との競合反応を行って、 C2B8のェピトープと類似したところに反応 する抗体 (ゥエル)を選択した。
表 1にスクリ一ユング結果を示す。
[0036] (6) Cell ELISA
Poly- L- Lysineコート 96ゥエルプレート（旭テクノグラス、 Cat.No.ll- 023- 018)に付 着させた CD20ZCHO細胞または CHO細胞 (親株）を Cell ELISAに用いた。その各 ゥエルにブロッキング液（0. 2%—ゼラチン、 0. 5%BSAの PBS溶液）を 150 1入 れて 37°Cで 1時間静置した。 150mM—NaCl、 0. 05%—Tween20水溶液を用い てプレートを 5回洗浄した後、サンプル (培養上清の希釈液）を各ゥエルに 100 1入 れて 1次反応を 37°Cで 1時間行なった。洗浄後、標識抗体の希釈液〔HRP標識抗マ ウス IgG (H + L)ゥサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 315- 035- 003)、または HRP標 識抗マウス IgG (Fe y )ゥサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 315- 035- 008)〕を各ゥェ ルに 100 /z l入れて 2次反応を 37°Cで 1時間行なった。 1次、 2次の反応液の調製に は、ブロッキング液と同じものを用いた。洗浄後、発色液 (OPD)を各ゥエルに 100 1 入れ 30分後に 4N— H SOを 50 1カ卩えて反応を停止し、 492nmの吸光度を測定
2 4
した。
[0037] (7) Cell ELISAでの競合反応
サンプル (培養上清の希釈液)とキメラ抗体（ 10〜40ngZml)の混合溶液を調製し た。
上記の Cell ELISAと同様にブロッキング反応をしたあと、この混合溶液を各ゥエル に 100 /z l入れて 1次反応を 37°Cで 1時間行なった。洗浄後、標識抗体の希釈液〔H RP標識抗ヒト IgG (H+L)ゥサギ抗体 (Jackson Lab. Code No. 309- 035- 082)〕を各 ゥエルに lOOul入れて 2次反応を 37°Cで 1時間行なった。洗浄後、発色液 (OPD)を 各ゥエルに 100 1入れ 30分後に 4N—H SOを 50 1カ卩えて反応を停止し、 492η
2 4
mの吸光度を測定した。
標識抗体はキメラ抗体のみに反応するので、 1次反応で添加したサンプル中の抗 体がキメラ抗体と競合すれば、測定値の低下が認められた。
[0038] (8)クローニング
限界希釈法で行った。細胞を 96ゥエルプレートに撒いて培養後、 1コロニーのゥェ ルの培養上清について Cell ELISAを行い、特異抗体の産生クローンを選択した。
[0039] (9)精製抗体の調製
特異抗体の産生クローンを 10%FCS添加 RPMI1640培地で培養し、細胞密度が 5 X 105Zml前後になった時点で無血清培地 ASF— 104N (味の素）に培地を交換 して培養を行った。その 2〜4日後に培養液を遠心分離して培養上清を回収したあと 、プロテイン Gカラムを用いて精製を行い、溶出されたモノクローナル抗体溶液を 150 mM— NaClに対して透析した。 0. 2 mのフィルターでろ過滅菌を行ない、試験抗 体 (抗ヒト CD20マウスモノクローナル抗体）とした。
[0040] [表 1]
1次、 2次スクリーニング
免疫方法
細胞融合 CE)20/CHO細胞の CD20に対する特異性 シリーズ
初^、追加免疫、回数 選^ゥ ル数
最終免疫 免疫マウス数 測定ゥ ル赘
A B
1K 18 SB細胞、 3回 Raii細胞 2 7 2 576
I 20 Ra細胞、 3 SB細跑 2 7 0 576
SB細胞、 z CD20/CHO細胞 1
IK 14 20 9 576
SB細胞、 3回 CD20/CHO細胞 1
CD2Q/CHO細胞、 2回 Raji細胞 1
1K 17 21 > 10 576
CD20/CHO細胞、 3回 Raji細胞 Ϊ 選択ゥエル数— A： C D 2 0/ C H O細胞に反応し. C H O細胞には反応しない钪体を産生したゥ工ル
選択ゥエル数一 B：選択ゥエル数一 Aのうち、 対照抗体 との競合反 Kが認められる抗体を産生したゥエル 代表的な 8クローンの産生するモノクローナル抗体にっレ、て、 L鎖 V領域のアミノ酸 配列（配列番号 1〜8)及び H鎖 V領域のアミノ酸配列 (配列番号 9〜16)は以下のと おりである。
1K0924の H鎖 V領域配列（配列番号 11)
Figure imgf000020_0001
GQGTTLTVSS
1K1228の H鎖 V領域配列（配列番号 16)
Figure imgf000020_0002
GQGTSVTVSS
lkl422の H鎖 V領域配列（配列番号 9) MDYWGQGTSVTVSL
lkl791の H鎖 V領域配列（配列番号 10)
Figure imgf000021_0001
AMDYWGQGTSVTVSS
lkl712の H鎖 V領域配列（配列番号 12)
Figure imgf000021_0002
DYWGQGTTLTVSS
lkl402の H鎖 V領域配列（配列番号 13)
Figure imgf000021_0003
MDYWGQGTSVTVSS
lkl736の H鎖 V領域配列（配列番号 14)
Figure imgf000021_0004
LDYWGQGTSVTVSS
lkl782の H鎖 V領域配列（配列番号 15)
Figure imgf000021_0005
GTTVTVSS
1K0924の L鎖 V領域配列（配列番号 3)
1K1228の L鎖 V領域配列（配列番号 8) lkl422の L鎖 V領域配列（配列番号 1)
Figure imgf000022_0001
lkl791の L鎖 V領域配列（配列番号 2)
Figure imgf000022_0002
lkl712の L鎖 V領域配列（配列番号 4)
Figure imgf000022_0003
lkl402の L鎖 V領域配列（配列番号 5)
Figure imgf000022_0004
lkl736の L鎖 V領域配列（配列番号 6)
Figure imgf000022_0005
lkl782の L鎖 V領域配列（配列番号 7)
DILLTQSPAILFVSPGERVSLSCRASQN SRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPFTFGSGTKLEIK
実施例 2
得られたクローンの一部に関し、モノクローナル抗体遺伝子の可変領域について塩 基配列の決定を行うとともに、それらが産生するモノクローナルについて抗体結合親 和性の測定及び生物学的特性試験を以下のとおり行った。
(1)結合親和性測定
目的とする抗原を細胞表面で発現して!/ヽるヒト B細胞株由来の浮遊細胞 Raji及び、 CD20抗原を発現して!/、な!/、細胞としてヒト T細胞株由来の浮遊細胞 Jurkatを用いた 。共に RPMI1640 (ナカライ、 Cat.No.30264- 85、 Lot L4K2844)に 10%ゥシ胎仔血 清 FCS(BIOLOGICAL IND. Cat.No.04- 001- 1Aゝ Lot 815242、補体成分を非働化す るためあらかじめ 56°C30分加温したもの）を添カ卩した培地で 37°CCO濃度 5%の C
2
Oインキュベーター（SANYO MCO-175M)で培養、週 2回の継代により維持した。
2
細胞数の測定は、 Burker-Turk血球計算盤 (ヱルマ販売 (株) Cat.No.03-303-1)を用 いて行った。
継代後 3〜4日目のコンフルェントな細胞の培養液を多本架冷却遠心機 LX— 120 (TOMY)で室温、 3000rpmで 3分間遠心し、上清を除き、細胞を回収した。ここで用 いた回転数と時間は遠心分離と上清除去を繰り返し行っても細胞数が変化しない条 件である。細胞の表面に残った培地及び FCSを除くため（洗浄）、回収した細胞を Dul becco's Phosphate Buffered Saline (-)〔Caゝ Mgフリー、 PBS (-)、（NaCl:Wako、 Cat.N 0.191—01665、 Na HPO： Wako、 Cat.No.197—02865、 Lot ASF2635、 KCl:Wako、 Cat.
2 4
No.163— 0334T、 Lot CEQ7122、 KH PO： Wako、 Cat.No.169—0425、 Lot ELG7616) ]
2 4
で懸濁後、 3000rpmで 3分間遠心して上清を除く操作を 2回行った。洗浄を終えた 細胞を 1%BSA (Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483)— PBS溶液で懸濁し、細 胞密度を 5xl06個/ mlに調整した。
1次抗体として、試験抗体又は陽性コントロール抗体（2B8) 15、 30、 50、 75、 100 、 125、 150、 200ng (l. 5〜5 1)を各々、 1. 5mlチューブ（ビーェム機器、 BMリン グロックチューブ Cat.No.BM-15)に分注し、同時に抗体を入れないチューブも 4本用 意した。また、各々の試験抗体あたり 3点のサンプルを準備した。そこに、 1%BSA( Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483)— PBS溶液で懸濁液を 100 1 (細胞数 5x 105個）ずつ加えて混和し、室温で 1時間振とう反応させた。
反応後、微量高速冷却遠心機 MX— 100 (T0MY)で室温、 3000rpm3分間遠心 分離し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応の一次抗体を除くため 200 1 の PBSで懸濁し、 3000rpmで 3分間遠心し上清を除く操作を 2回行った。
次に、細胞と結合した 1次抗体に対して過剰量（500ng)の FITC標識抗マウス IgG (H&L) 2次饥体 LGOAT Anti-mouse IgG(H&L) Fluorescein conjugated, affinity pu rifled Secondary antibody, Chemiconゝ Cat.No.AP124Fゝ Lot 24021014〕および 1%B SA-PBS^¾100 μ 1 (500ng/100 μ 1) ' 遮光、室温のもと 1時間 振とう反応させて細胞に結合した 1次抗体を検出した。反応後、 3000rpmで 3分間 遠心し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応の FITC標識抗マウス IgG (H& L)抗体を除くため、 200 1の PBSで懸濁し、 3000rpmで 3分間遠心し上清を除く操 作を 2回行った。
こうして得た細胞を 100 μ 1PBSで懸濁し、 96ゥエル平底プレート（住友ベークライト ELISA PLATE Cat.No.8496F)へ移した。 2次抗体の蛍光量を Typhoon9210イメージ ナフィサ ~~ (Amersnam Bioscience) 用 ヽて、 Fluorescense mode, 600V ^ 526SP/g reen(532nm)、 Focus :底面 + 3mmの検出条件で測定した。この際、 FITC標識 2次抗 体を 0、 12. 5、 25、 50、 75、 100、 125、 150ng添加した PBS溶液 100 /z 1を検量線 作成用のコントロールとして用いた。
[0044] 検出後、画像を画像解析ソフト Image Quant (Amersham Bioscience)を使用し、数 値化を行った後、 Excel (Microsoft)で解析を行った。この際、プレート、 PBS溶液、お よび細胞に非特異的に結合した FITC標識 2次抗体に由来するバックグラウンド値と して、細胞と FITC標識 2次抗体のみを反応させたものの測定値を求め、その 4点の 平均値を各サンプルの蛍光強度の値から差し引いた。こうして、細胞に結合した FIT C標識 2次抗体の蛍光量を得た。更に、コントロールとして用いた各濃度の FITC標 識二次抗体での蛍光量を測定することで検量線を作成し、細胞に結合して 、る 2次 抗体の量 (モル数または重量)を求めた。各 1次抗体と FITC標識 2次抗体が 1： 2の 割合で反応していると仮定し、結合している 1次抗体量を算出した。また遊離の 1次 抗体量は添加量力も結合量を差し引いて求めた。抗体濃度をモル濃度に換算する 際、モノクローナル抗体の分子量を 150000とした。
[0045] 添加する 1次抗体の増加に伴い結合反応が飽和して蛍光強度が一定量に達する ことを確認するとともに、細胞表面の抗原数及び解離定数 (Kd値)を算出するため、 スキャッチヤード解析（Scatchard,G.; Ann.N.Y.Acad.Sci.,51: 660-672,1949、分子生 物学研究のための新培養細胞実験法;羊土社、実験医学別冊バイオマニュアル UP シリーズ改訂第 2版、 212-217参照）を行った。このとき、数値は各サンプルについて 3点の値の平均値を用いた。
代表的な 8クローンが産生するモノクローナル抗体と陽性コントロール抗体（2B8) の測定結果を後の表 3に示す。 [0046] (2)生物学的特性試験
(a)アポトーシス誘導試験
フローサイトメトリー（Annexin V/ PI staining)を用いて試験抗体のアポトーシス誘導 能を測定した。陽性コントロール（2B8)、陰性コントロール [Anti-CD3モノクローナル 抗体 (BD PharMingen社)]を用いた。試験は MEBCYTOApoptosis Kit (MBL, Cat.No. 4700, Lot.20)を用いて行った。
Raji細胞を遠心後、 10%FBS (非動化済）（ICN, Cat.No.2916754, Lot.8005C)を含 む新鮮な培地 RPMI1640(Sigma, Cat.No.R8758, Lot.44K2416)で懸濁し、 12ゥェ ルプレートの各ゥエルに 5xl05細胞 Zmlの密度で lmlを入れた。各抗体あたり 12ゥ エルを用い、各抗体を終濃度 2 gZml又は 4 gZmlになるよう添加した（3ゥエル X 2種濃度 X 2時点、計 12ゥエル)。培養開始 1日後及び 2日後に、 2xl05個程度分 の細胞を含む培養液を回収し、遠心後 PBSで 1回洗浄した。次に 85 μ 1 Binding buf ferをカ卩ぇ懸濁した。さらに、 Annexin V- FITC10 μ 1と ΡΙ5 μ 1をカ卩えてよく混和した後 、遮光、室温で 15分間反応させた。フローサイトメトリー (FACS Calibur, Becton Dicki nson)を用いて測定し、 CellQuest (Becton Dickinson)で解析を行った。
代表的な 6クローンが産生するモノクローナル抗体と陽性コントロール（2B8)、陰性 コントロール (Anti- CD3)の測定結果を図 3a〜図 3dに示した。一般に 2B8のアポトー シスの誘導能は高いとされる力 1K17シリーズ（CD20ZCHOと Raji細胞で免疫）の 細胞融合から得られたクローン lkl791、および 1K14シリーズ（SB細胞と CD20Z CHOで免疫）の細胞融合力も得られたクローン lkl422の産生するモノクローナル 抗体は 2B8との比較にぉ 、て高 、アポトーシス誘導がみられた。
[0047] (b)細胞増殖阻害試験
5 X 104個/ mlの Raji細胞懸濁液を 10%FCS添加 RPMI1640培地で調製して 96 ゥエルプレートに 100 1Zゥエルずつ入れて培養した。 24時間後、抗体濃度が 1 gZmlになるように各抗体溶液を 50 1Zゥエル添加して培養を継続した。抗体添加 72時間後に発色色素 Cell Counting Kit- 8(同仁化学 Cat.No.343- 07623, Lot. SG0 76)を 10 1Zゥェルカ卩ぇ、さらに 4時間培養した後で波長 492nmにおける吸光度を 測定した。 上記 6クローンのモノクローナル抗体と陽性コントロール（2B8)、および陰性コント口 一ルの吸光度の測定結果を表 2に、また、それらの特性を表 3に示す。
細胞増殖阻害試験
[表 2]
Figure imgf000026_0001
[0049] モノクローナル抗体の特性
[表 3]
Figure imgf000026_0002
[0050] (c)抗体依存性細胞性細胞傷害 (ADCC)
この実験では抗 CD20キメラ抗体の Fc部位を介してエフェクター細胞が活性ィ匕し、 それに伴ってリンパ腫細胞系を溶解する能力につ 、て測定を行った。
ヒト B細胞由来の Raji、 WiL2— NS、 SU— DHL4、 RC—K8の 4種類の細胞を非 働化処理した 10%FCS添加 RPMI1640に培地（培養培地）で 37°C、 CO濃度 5%
2 のインキュベーター内で培養、維持した。
実験に際しては、各々の細胞を 10%FCS含 RPMI1640で洗浄し、 37°C中で 15 分間の反応により力ルセインを生細胞に取り込ませた後、細胞数を 4 X 105個 Zmlに 調整した。力ルセインは細胞膜が正常に保たれて 、る細胞にのみ維持されるので生 細胞のみを染色することができる。また抗 CD20キメラ抗体であるリツキシマブ (C2B 8)と 6種類のキメラ抗体（lk0924、 lkl402、 lkl422、 lkl712、 lkl736、 lkl7 91)を 10%FCS含 RPMI1640で 20 μ g/ml、 4 μ g/ml、 0. 8 g/mlに調整し た。エフェクター細胞は健常者より採血し、直ちに Ficollに重層して遠心しリンパ球画 分を採取した後、 5 X 106個/ ml、 1 X 106個/ ml、 0. 2 X 106個/ mlに調整した。 濃度調整をした細胞 25 μ 1、各抗 CD20キメラ抗体溶液 25 1 (それぞれ終濃度が 5 μ g/m 1 μ gZml、 0. 2 μ g/ml)、各抗体濃度にお!、てエフェクター細胞 50 1 (それぞれ E :T比が 25 : 1、 5 : 1、 1 : 1)、計 100 1を 96穴プレート内で混合し、 3 7°C、 CO濃度 5%のインキュベーター内で 4時間反応させた。また、自然な細胞の
2
溶解を算出するために抗体溶液およびエフェクター細胞を 10%FCS含 RPMI1640 で置き換えたサンプル、抗体に依存しな 、エフェクター細胞のみの活性を算出する サンプルとして抗体溶液を 10%FCS含 RPMI1640で置き換えたサンプル、最大溶 解を算出するサンプルとして抗体溶液を 20%TritonX— 100で置き換えたサンプル を用意した。
反応後、溶解した細胞は細胞膜が壊れて力ルセインが細胞外に出るため、 Quench erを用いて反応溶液中に遊離した力ルセインの蛍光を消失させた後、蛍光アナライ ザ一により蛍光量を測定した。
検出後、画像解析ソフト (Amersham Bioscience)を使用し、数値化を行った後、以 下の式を用いて各サンプルの溶解率を算出した。
[数 1]
溶解率 〔％〕 = ( (自然溶解） （サンプル）） / { (自然溶解） （最大溶解）） X I 0 0
NK細胞などのエフェクター細胞数とターゲットとなる細胞数の割合（E :T比）が 25： 1のときの各細胞における抗体濃度と細胞傷害活性の関係を図 4a〜図 4dに示す。ま た、抗体濃度が 5 gZmlのときの各細胞における E :T比と細胞傷害活性の関係図 5a〜図 5dに示す。
図 4a〜図 4dに示すごとぐ E :T比が 25 : 1の条件ではどの細胞でも抗体を加えるこ とにより細胞傷害活性を示している。つまり抗体が細胞傷害に関与している。また、 W iL2— NS以外の細胞株では 0. 2 μ gZmlの抗体濃度で既に 1 μ g/mU 5 μ g/ml と同程度の活性を示し (0. 2 μ gZmlで飽和して ヽる）、活性は最大値まで達してフ ラットとなっており、補体依存性細胞傷害活性に必要とされる抗体量よりも少ない抗 体量で作用することを示唆して ヽる。
図 5a〜図 5dに示すごとぐ抗体濃度が 5 gZmlのときの細胞傷害活性の E :T比 による影響を見ると、細胞傷害活性が E :T比濃度に依存して上昇しているのがわか る。このことからエフェクター細胞が作用して細胞傷害が起こっていると判断される。
(d)補体依存性細胞傷害 (CDC)
この実験では抗 CD20キメラ抗体が補体を含む血清の存在下でリンパ腫細胞系を 溶解する能力につ!、て測定を行った。
ヒト B細胞由来の Raji、 WiL2— NS、 SU— DHL4、 RC—K8の 4種類の細胞を非 働化処理した 10%FCS添加 RPMI1640に培地（培養培地）で 37°C、 CO濃度 5%
2 のインキュベーター内で培養、維持した。
実験に際しては各々の細胞を 10%FCS含 RPMI1640で洗浄し細胞数を 2〜3 X 106個 Zmlに調整した。また、抗 CD20キメラ抗体である C2B8 (リツキシマブ）と 6種 類のキメラ抗体（lk0924、 lkl402、 lkl422、 lkl712、 lkl736、 lkl791)を 10 %FCS含 RPMI1640で 20 μ g/ml, 4 μ g/ml, 0. 8 gZmlに調整した。
濃度調整をした細胞 55 μ 1、各抗 CD20キメラ抗体溶液 25 1 (それぞれ終濃度が 5 μ g/m 1 μ g/ 0. 2 μ g/ml)、 5人の健常者より採取したプール血清又は それを非働化したもの 20 1、計 100 1をボルテックスミキサーにより混合し、 37°C、 CO濃度 5%のインキュベーター内で 2時間反応させた。バックグラウンドの算出サン
2
プルとしては抗体溶液 25 μ 1を 10%FCS含 RPMI1640培地 25 μ 1に置き換えたも のを用意した。
反応後、 ΡΙ (ヨウ化プロビジゥム）溶液で死細胞を染色し、 FACS (Becton Dickinson )により解析を行った。数値は死細胞のポピュレーションをそのまま採用し、ノックグラ ゥンド及び非働化血清を加えたサンプルの値を差し引 ヽてある。
各細胞においての抗体濃度と細胞傷害活性の関係を図 6a〜図 6dに示す。
図 6a〜図 6dに示すごとぐ Raji、 WiL2— NS、 SU— DHL4では 6種類全ての抗体 が活性を示している。また、濃度依存性も確認できる力 5 /z gZmlの濃度で比較す ると lkl791は他の抗体に itベて特に高!/、活'性を示し、つ ヽで、 lkl736、 lkl422 、 lkl712力高!/、活'性を示して!/ヽる。この濃度で ίま Raji、 WiL2— NSにお!/、て lkl79 1は他の抗体のおよそ 2倍近 、細胞傷害を誘導して!/、ることが確認できる。しかしな がら、他の抗体もリツキシマブと同程度、もしくはそれ以上の活性を示している。
一方、リツキシマブが効かないとされる RC—K8では、抗体ごとの差異が顕著に現 れた。リツキシマブ、 lkl402および lkl712ではほとんどもしくは全く活性がない。 それに対し、 lkl791は非常に高い活性を示し、 5 /z gZmlの濃度では約 50%の傷 害活' 14を示して ヽる。これに続き、 lk0924力 250/0程度、 lkl422、 lkl736力 100/0 程度の傷害活性を示して 、る。
以上から、今回試験対象とした 6種類のキメラ抗体はリツキシマブと同程度あるいは より強 、CDC活性を有して 、ることが確認された。
実施例 3
(1)結合親和性測定
ヒト B細胞株由来の Raji細胞を、 RPMI1640に非働化処理した 10%FCS添加培地 で 37°C、 CO濃度 5%の COインキュベーター内で培養、週 2回の継代により維持し
2 2
た。
継代後 3〜4日目（約 lxlO6個 Zml)の細胞培養液を室温、 lOOOrpmで 5分間遠 心分離し、細胞を回収後、 PBS (—）で懸濁、 lOOOrpmで 5分間遠心分離を行い、 上清を除く操作を 2回行うことで洗浄した。
抗 CD20抗体（陽性コントロール抗体:マウス抗体 2B8、キメラ抗体及びヒト化抗体 C2B8)と Raji細胞を混和し、室温で 1時間反応することで 1次抗体反応を行った。ここ で、抗 CD20抗体の各々の終濃度は 1. 33、 2. 67、 4. 00、 5. 33、 6. 67、 8. 00、 9. 33、 10. 67、 12. 00、 13. 33、 14. 67、 16. 00nMの 12点とし、細胞数 5xl06 個、 1%BSA— PBS溶液を反応溶液とし液量 100 1になるよう 1. 5mlチューブに分 注した。同一試験抗体あたり 3点のサンプルを準備し、バックグラウンド算出サンプル として抗体を加えな 、チューブも 4本用意した。
反応後、室温、 3000rpmにて 3分間遠心分離し、未反応の 1次抗体を除き、細胞 を回収した。
[0054] 細胞と結合した 1次抗体に対して過剰量となるよう 1%BSA— PBS溶液で 5ugZml に調製した FITC標識二次抗体を 100 1づっ添加し、懸濁後、遮光、室温のもと 1 時間反応させた。
ここで FITC標識 2次抗体はマウス抗体では GOAT Anti Mouse IgG (H&D-FITCを キメラ抗体及びヒト化抗体では GOAT F(ab') 2F ragment Anti Human IgG (Fc y )- FI TCを用いた。
反応後、室温、 3000rpmにて 3分間遠心分離し、未反応の FITC標識 2次抗体を 除き、細胞を回収し、 200 1の PBSで懸濁し再度遠心し洗浄を行った。
この細胞を 100 μ 1PBSで懸濁し、 96ゥエル平底プレートへ移した。 2次抗体の蛍 光量を Typhoon9210イメージアナライザー（Amersham Bioscience)を用いて測定し た。
検出後、画像解析ソフト Image Quant (Amersham Bioscience)を使用し、数値化を 行った後、 Excel (Microsoft)で解析を行った。同一試験抗体の平均値を求め、バック グラウンド算出サンプル (細胞と FITC標識 2次抗体のみを反応させたもの）の値を各 試験抗体の値力 差し引くことで、プレート、 PBS溶液および細胞に非特異的に結合 した FITC標識 2次抗体に由来するバックグラウンド値を除いた。同時に 100 1当り、 0、 12. 5、 25、 50、 75、 100、 125、 150ngの FITC標識 2次抗体単独の蛍光量を 測定することで検量線を作成し、細胞に結合している 2次抗体のモル数を求めた。各 1次抗体と FITC標識 2次抗体が 1： 5の割合で反応して 、ると仮定し、結合して 、る 1 次抗体量を算出した。遊離の 1次抗体量は添加量から結合量を差し引いて求めた。 これらの値を用いて、スキャッチヤード解析を行い、解離定数 Kd値を得た。
結果を以下の表 4に示す。
[0055] (2)アポトーシス誘導試験
ヒト B細胞株由来細胞に対する抗 CD20抗体によるアポトーシス誘導を単独で見る 条件 (クロスリンク無)及びさらに抗 CD20抗体の Fc領域を認識する 2次抗体を添カロ することによるアポトーシス誘導を見る条件 (クロスリンク有)の 2条件で反応し、 Annexi n V-FITC apoptosis kitを用いて初期アポトーシスの検出を行った。 ヒト B細胞株由来の Raji、 WIL2— NS、 SU— DHL4、 RCK8の 4種類の細胞を、 R PMI1640に非働化処理した 10%FCS添加培地（培養培地）で 37°C、 CO濃度 5%
2 の COインキュベーター内で培養、週 2回の継代により維持した。
2
継代後 3〜4日目（約 lxlO6個 Zml)の細胞培養液を室温、 lOOOrpmで 5分間遠 心分離し、細胞を回収した。
抗 CD20抗体（陽性コントロール抗体:マウス抗体 2B8、キメラ抗体及びヒト化抗体 C2B8；陰性コントロール: Anti— CD3モノクローナル抗体）と新鮮な培養培地で懸 濁した細胞を混和し、 1. 5時間 37°C、 5%COインキュベータ内で反応した。ここで、
2
抗 CD20抗体各々の終濃度は 0. 2、 1、 5 /z gZmlの 3点、細胞密度 lxlO6細胞 Zm 1、培養培地を反応溶液として液量 250 1になるよう 1. 5mlチューブ内で反応を行つ た。同一試験抗体あたり 3点のサンプルを準備した。
反応後、室温、 1200rpmにて 3分間遠心分離し、未反応の抗体を除き、細胞を回 収した。
クロスリンク無の条件では新鮮な培養培地、クロスリンク有条件では抗 CD20抗体の 5倍量の Fc領域を認識する 2次抗体を 250 1づっ添カ卩し、混和後、さらに 3時間、 3 7°C、 5%COインキュベータ内で反応した。ここで 2次抗体はマウス抗体では Goat A
2
nti mouse IgG, Fc y Fragmentを、キメフ饥'体及びヒトイ匕抗体では Goat Anti human Ig , vc y Fragment specificを用 ヽた。
反応後、室温、 1200rpmにて 3分間遠心分離し、未反応の 2次抗体を除き、細胞 を回収した。 250 1の PBSで懸濁し再度遠心し洗浄を行った
検出試薬として MEBCYTO apoptosis kit- AnnexinV- FITC ,ΡΙ- (MBL, Cat.No.470 0, Lot. 21)を使用した。 85 μ 1の Binding bufferをカ卩え懸濁した後、 Annexin V- FITC 5 μ 1と propidium iodide (PI)5 1 (終濃度 0. 5mg/ml)をカ卩えてよく混和し、遮光、室 温で 15分間反応させた。
フローサイトメトリー（EPICS ALTRA： BECKMAN COULTER)を用いて total count2 0, 000の細胞を測定し、解析（Expo32: BECKMAN COULTER)を行った。
結果を図 7a〜図 9dに示す。
(3)ヒト化抗体産生株の調製 (a) DNA合成
配列番号 17〜 24のアミノ酸配列を元にしてコドンを CHO細胞に最適化した DNA を、定法によりデザインし、合成した。
(b)コンストラクトの作成
pNOWを発現ベクターとして 16種類のヒト化 1K1791発現コンストラクトを構築した。 ヒト化 1K1791発現コンストラクトを作製した。
pNOW— aal791kgl、 pNOW— afl791kgl、 pNOW— asl791kgl、 pNOW— avl791kgl、 pN OW— fal791kgl、 pNOW— ffl791kgl、 pNOW— fsl791kgl、 pNOW— !V1791kgl、 pNOW— s al791kgl、 pNOW— sfl791kgl、 pNOW— ssl791kgl、 pNOW— svl791kgl、 pNOW— val7 91kgl、 pNOW— vH791kgl、 pNOW— vsl791kgl、 pNOW— wl791kgl
(c)トランスフエクシヨンと薬剤による選択
トランスフエクシヨン試薬を用いてヒト化 1K1791発現コンストラクトを CHO DG44cd B細胞に導入した。それぞれの遺伝子を導入した CHO DG44cdB細胞 1 X 106個を 100mlの選択培地に懸濁し、 96ゥエルプレート 5枚に撒いた（200 1Zゥエル）。 5 %炭酸ガス存在下に 37°C、 3〜4週間培養した。
トランスフエクシヨン試薬： Qiagen, Effectene Transfection Reagent, Cat. No 301427 選択培地： IS CHO- CD w/Hydrolysate/4mM GlutaMAX/0.8 mg/ml G418
(d)高発現細胞株の選択
1)コロニーが出現しているゥエルの上清をとり、ドット 'プロット'アツセィ（Dot Blot as say)で抗体産生量を測定した。
2)抗体産生量の多いクローンを 24ゥエルプレートに移し、約 5日間培養後、上清を とり、サンドイッチ ELISAで抗体産生量を測定した。
3)発現量が多 、クローンを 2つ選択し、 T75フラスコに移した。
(e)小規模培養
16種類のコンストラクトそれぞれに対して選択した 2種のクローンを 30mlの選択培 地を含む T75フラスコ中で培養を行った。
(4)ヒト化抗体産生株の培養及び精製
抗体産生細胞株（遺伝子組み換え CHO— DG44細胞）を、 Hydrolysateを含む IS CHO— CD/with Hydrolysate (Irvine Scientific, Cat. No.91119)に、 4mM GlutaMax( Invitrogen, Cat 35050—061)、 200 μ g/mlG418 (Sigma,Cat.No.A1720— 5G)を添カロし た培地で 37°C、 CO濃度 5%の COインキュベーター内で培養、週 2回の継代〖こより
2 2
維持した。
継代後約 2週間経過した細胞培養液を室温、 3500rpmで 5分間遠心分離し、培養 上清を回収し、 0. 45 μ ηι syringe filterで濾過した。 50mM Tris— HC1、 pH7. 0で 平衡化した
Hi Trap Protein A HP(GE Healthcare, Cat No. 17- 0402- 01)カラムに、培養上清を 添加後、 50mM Tris— HC1、 pH7. 0で洗浄した。 0. 1Mクェン酸、 pH4. 0で溶出 し、 400 μ 1づっ採取し、その 10/1量にあたる 40 μ 1 1M Tris— HC1、 pH9. 0で 中和した。 100倍量の PBSに対して、 M. W. 3500透析カップ（Bio- Tech Cat. No.2 12932)を用いて 2. 5時間を 2回後、 15〜18時間 1回の透析を行った。
使用した抗体生産株は、 CHO細胞 hzl791-!V10、 hzl791-ffi34、 hzl791-sf43および hzl791- ss32であり、これらは、ブタペスト条約の下、平成 18年（2006年） 3月 1日より 、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6の独立行政法人産業技術総合研 究所、特許生物寄託センターに、各々、 FERM BP— 10543、 FERM BP— 105 44、FERM BP— 10545および FERM BP— 10546の受託番号で寄託してある これらの細胞株から得られたヒトイヒ抗 CD20モノクローナル抗体の H鎖 V領域およ び L鎖 V領域のアミノ酸配列 (配列番号 17〜 24)は以下のとおりである（アンダーライ ン部分が対応するマウス抗体と異なる)。
ヒト化 lkl791の配列
L鎖 V領域配列 (配列番号 20)
Ven 1791： STVMTQSPDSLAVSLGERVTINC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKVL IY FASNRYT GVPDRFSGSGYGTDFTFTISSVQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAG TKLELK
H鎖 V領域配列 (配列番号 24) WMG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTSTYFCTR RT NYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
L鎖 V領域配列 (配列番号 17)
abb 1791： STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVSNDVA WYQQKPGQSPKVLl
Y FASNRYS GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGT KLEIK
H鎖 V領域配列 (配列番号 21)
WMG WINTYTGEPSYAQGFTG RFVFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTATYFCTR R TNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
L鎖 V領域配列 (配列番号 19)
sdr 1791： STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSNSNDVA WYQQKPGQSPKVL IY FASNRYS GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAG TKLEIK
H鎖 V領域配列 (配列番号 23)
WMG WINTYTGEPSYAQGFTG RFAFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTATYFCTR R TNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
L鎖 V領域配列 (配列番号 18)
fra 1791： STVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKVLl
Y FASNRYT GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGT KLEIK
H鎖 V領域配列 (配列番号 22)
MG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASASTAY LQISSLKAEDMATYFCTR RTN YYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
この実験では、 AbbL、 FraL、 SdrL、 VenLの 4種類 X AbbH、 FraH、 SdrH、 VenHの 4種類を組み合わせた合計 16種類の配列組合わせ力も各 2クローンづっについて 実験を行ない平均値を求めた。以上の結果より、 Kd値を基に表 4に示すように 4ダル ープに分類できる。それぞれのグループより 1種類を選抜し以降の実験で使用した。 コントロール： c2B8
グループ I : Kd = 20 nM<
グループ II： Kd = 10- 20 nM
グループ III： Kd = 8-10 nM
グループ IV： Kd = < 8 nM
表 4 ヒト化抗体結合解離定数
[表 4]
Hz l791 clone No. Kd (nM) C2B8 Kd (nM)
Aa008 1 1.68 6.61
Aa012 9.96 4.68
Fa007 1 1.34 5.63
Fa008 8.83 4.91
Sa023 14.66 6.13
Va016 13.09 6.67
Va024 7.50 6.47
Af021 6.84 5.56
Af025 8.67 4.29
Ff019 8.50 5.70
Ff034 7.81 4.00
Sf043 1 1.60 4.34
Sf056 13.79 6.01
Vf029 7.78 3.32
Vf031 7.79 4.54
AsOOl 1 1.89 5.74
As002 1 1.47 8.7
Fs007 6.33 5.63
Fs024 1 1.09 3.97
Ss020 24.39 4.10
Ss032 21.79 7.25
Vs006 8.8 4.23
VsO ll 1 1.9 6.09
Av004 10.71 5.76
Av006 9.17 4.86
FvOlO 7.17 4.39
Fv028 7.25 4.74
Sv015 14.31 6.30
Sv020 10.85 5.36
Vv018 7.14 5.04
Vv023 7.01 4.86 表 5 ヒト化抗体結合解離定数
[表 5] グループ Hz 179 1 cl one Kd (nM)
I (20 nM< ) ss 23. 09
Π (10-20 ηΜ) sa 14. 66
sf 12. 70
sv 12. 58
as 11. 68
aa 10. 82
vs 10. 35
va
fa 10. 09
ΠΙ (8- 10 ηΜ) av 9. 94
fs 8. 71
ff 8. 15
IV «8nM) vf 7. 78
af 7. 76
fv 7. 21
vv 7. 07
コントロール c2B8 5. 35 ± 1. 13 さらに、マウス抗体 8種類でのアポトーシス実験結果を図 7a〜図 7dに示す。 4種類 全ての細胞においてマウス抗体 8種類および既知の CD20 o抗体 2B8、 2H7について o
2つのタイプに分けることができた (但し一部例外を除く）。
グループ A:m0924 , ml422 , ml791 , m2B8
グループ B :ml228 , ml402 , ml712 , ml736 , ml782 , m2H7
(但し、 m0924は SU— DHL4細胞ではグループ Bに含まれる）
すなわち、抗 CD20抗体単独で十分なアポトーシス誘導能が示され、 2次抗体によ るクロスリンク条件下でもほぼ同程度であるグループ Aと抗 CD20抗体単独でのアポ トーシス誘導能は十分に示されないがクロスリンク条件下で大きく増加するグループ Bである。またグループ Aに含まれる抗体は親和性が 2B8と同程度であり、グループ Bに含まれる抗体は 2B8より高い親和性であるものが含まれる。アポトーシス誘導に 2 次抗体の存在を必要とせず、単体でアポトーシス誘導が可能なグループ Aの方が医 薬としては都合よいといえる。
細胞別にみるとアポトーシスの割合が RAJI、 WIL2-NS, RCK8では高いもので も 30〜40%であるのに対し、 SU— DHL4では高いもので 80%以上を示す結果とな つた o [0063] ヒトイ匕抗体 4種類での結果を図 8a〜図 9dに示す。
マウス抗体同様、 4種類全ての細胞においてヒトイ匕 1791抗体 4種類について 2つの タイプに分けることができた。
グノレープ A :1V, ff
グループ B : sf, ss, C2B8
C2B8と同等の親和性を示すグループ Aの IV、 ίφϊ体はクロスリンク無しではアポト 一シス活性をほとんど発揮せず、クロスリンク条件下で明らかに活性を持つ。グルー プ Βの sf、 ss抗体はグループ Aの抗体より、解離定数が大きく親和性は弱いが、これら の抗体単独で C2B8より高いアポトーシス活性を示した。
抗 CD20抗体による B細胞に対するアポトーシス誘導能について、単独で十分なァ ポトーシス誘導能を示す場合、クロスリンク条件下でもその割合はほぼ同等であるが 、抗体の種類、未飽和条件などで抗 CD20抗体単独では十分なアポトーシス誘導能 が示されない場合、クロスリンク条件下でアポトーシス活性は増加すると考えられる。 なお、図 9a〜図 9dは、実験日の抗体をカ卩えない条件での早期アポトーシス（％)を 1とするグラフである。
実施例 4
[0064] ヒト化抗体の結合解離定数 (Kd値)と細胞増殖阻害活性との関連性
実施例 3でヒトイ匕抗体をグループ Aとグループ Bに分けた結果をふまえて、表 5に示 す各 hzl791クローンについて、ヒト CD20抗原に対する Kd値（nM)とアポトーシス 誘導活性 (%)および CDC活性 (%)との関係を調べた。 Kd値の測定は実施例 2に 記載のごとく行った。 CDC活性の測定は実施例 2に記載のごとく行った (ただし、抗 体量と CDC活性の関係を調べる実験においては後述のごとく抗体を生成したものを 用いた)。 ADCC活性の測定は実施例 2に記載のごとく行った。アポトーシス活性の 測定は実施例 3に記載のごとく行った。使用した B細胞は Raji、 SU— DHL4、 WiL —2、および RCK8であった。それぞれの細胞につき、 4種のクローン fv、 ff、 sf、およ び ssに関するデータを図 10a〜図 10dに示す。
[0065] アポトーシス活性に関しては、いずれの細胞を用いて試験した場合においても同様 の傾向が見られた。すなわち、親和性が高い (Kd値が小さい)抗体ほどアポトーシス 誘導活性が低く、親和性が低！、 (Kd値が大き ヽ)抗体ほどアポトーシス誘導活性が 高いことがわかった。また、 Kd値が約 13nMを超えると、アポトーシス活性は一定とな る傾向を示した。親和性が高い抗体は、それ自体ではアポトーシス活性を発揮でき ず、アポトーシスの誘導には二次抗体によるクロスリンクが必要であった。そして、親 和性が低 、抗体は、それ自身でアポトーシス誘導活性を発揮することがわ力つた。
[0066] CDC活性に関しては、 Raji細胞および SU— DHL4細胞を用いた場合には、親和 性が高い (Kd値が小さい)抗体ほど CDC活性が高い傾向がみられた。一方、 WiL— 2細胞および RCK8細胞を用いた場合には、 Kd値が 13nM付近に極大値を有する 傾向が見られた。
[0067] これらの知見から、医薬品として有効な候補抗体を見出すことができる、 2つの選抜 基準を設定した：
単独ではアポトーシスを誘導しないが、 CD20抗原に対する親和性が極めて高 ぐ CDCにより抗ガン効果を発揮しうる抗体；
—単独でアポトーシス誘導活性を持ち、アポトーシスと CDCにより抗ガン効果を 発揮しうる抗体のうち、 CD20抗原に対する親和性が高 、もの。
[0068] 前者の選抜基準では、 CD20抗原に対する親和性が高ぐかつ CDC活性も高いも のを選抜することが好まし ヽ (Kd値が低 、ほど CDC活性が高 、傾向が見られる)。こ の場合、単独ではアポトーシスを誘導しない抗体の選抜なので、 CDC活性の値のみ に注目してよい。前者の選抜基準を満たすクローンの場合には、単独でアポトーシス 誘導は引き起こさないが、親和性および CDC活性か極めて高いことから、細胞枯渴 を促すことができる。
[0069] 後者の選抜基準では、抗体のアポトーシスと CDCの総和が大きぐかつ、 CD20抗 原に対する親和性が高いものを選抜することが好ましい。したがって、後者の選抜基 準を満たすクローンの場合には、親和性は高くないが、アポトーシス活性が高いとい う利点を有し、アポトーシス誘導と CDCの相乗効果により細胞枯渴を促すことができ る。
[0070] さらに、上の 2つの選抜基準の境界点を決定するために、 4種の細胞のアポトーシ ス活性の中点を与える Kd値を作図により求めた（図 10a〜図 10dのグラフ中に点線 で示す)。これら 4つのグラフから、アポトーシス活性の中点を与える Kd値に大きな相 違はなぐ Raji細胞の場合には約 9. 5nM、 SU— DHL4細胞の場合には約 8. 5n M、 WiL2細胞の場合には約 9. 5nM、 RCK8細胞の場合には約 ΙΟηΜであった。こ れらの結果から、約 9. 5nMの Kd値を上の 2つの選抜基準の境界点とした。
また、後者の選別基準の Kd値の上限は、 WiL2細胞および RCK8細胞の場合に C DC活性の極大値が見られることを考慮して（図 10cおよび図 10d)、アポトーシス活 性と CDC活性の総和ができるだけ大きぐし力も親和性が高い (Kd値が小さい)範囲 ということ力ら、 Kd値の上限を約 13nMとした。
[0071] したがって、前者の選抜基準に従って、ヒト CD20抗原に対する Kd値が約 9. 5nM 未満であって、できるだけ Kd値が低ぐかつ、 CDC活性の高い抗体を選抜すると、ク ローン ffと fvが該当する（図 10a、図 10b)。また、後者の選抜基準に従って、ヒト CD2 0抗原に対する Kd値が約 9. 5nMないし約 13nMであって、できるだけアポトーシス 活性と CDC活性の総和が大きぐかつ、 Kd値が小さい抗体を選抜すると、クローン sf が該当する（図 10c、図 10d)。
[0072] 次に、上記 4種のヒト化クローンから fv、 ff、 sf、および ssを選択し、 Raji、 SU— DH L4、 WiL— 2、および RCK8細胞を用いて CDC活性およびアポトーシス活性を測定 した。結果を、それぞれ表 6および表 7に示す。リツキシマブ (c2B8)およびクローン 1 791 (cl791)は、それぞれ対照である。
[0073] 表 6 本発明のヒト化抗体の CDC活性
[表 6]
Figure imgf000040_0001
表 6の結果から、クローン ffおよび fvは、リツキシマブと同程度あるいはそれよりも強 い CDC活性を発揮することがわかった。また、 sfは WiL2細胞および RCK8細胞に お 、て極めて高 、CDC活性を示した。
[0075] 抗体濃度と CDC活性の関係を調べるための実験も行った。抗体は実施例 2に記載 のごとく調製したものよりも精製が進んだものを使用した。精製は下記の手順にて行 つた o
抗体産生細胞株（遺伝子組み換え CHO— DG44細胞）は Hydrolysateを含む IS C HO-CD/w (Irvine Scientific, Cat. No.91119)に、 4mM GlutaMax (Invitrogen, Cat 3 5050-061)、 200 μ g/ml G418 (Sigma,Cat.No.A1720-5G)を添カ卩した培地で 37°C で CO濃度 5%の COインキュベーター内で培養、週 2回の継代により維持した。継
2 2
代後約 2週間経過した細胞培養液を室温、 3500r.p.m.で 5分間遠心分離し、培養上 清を回収し、 0. 45 μ mシリンジフィルターで濾過した。 50mM Tris-HCl,pH7.0で平 衡ィ匕した。 Hi Trap Protein A HP(GE Healthcare, Cat No. 17- 0402- 01)カラムに、培 養上清を添加後、 50mM Tris-HCl,pH7.0で洗浄した。 0. 1Mクェン酸， pH4. 0で 溶出し、 400 μ 1づっ採取し、その 10Ζ1量にあたる 40 μ 1 1M Tris- HCl,pH9.0で 中和した。 100倍量の PBSに対して、 Slyde- A- Lyzer 10K Dialysis Cassetes (PIERC E CatNo.66453)を用いて 2. 5時間を 2回後、 15〜18時間 1回の透析を行った。 透析後のサンプルを VIVA SPIN 50,000MWCO PES (VIVASCIENCE CatNo.VS023 1)を用いて濃縮した。このサンプルを PBSで平衡化した HiLoad 16/60 superdex 200 prep grade (GE Healthcare CatNo.17-1069-01)カラムに添カ卩した。精製サンプルを 0 . 22 μ mシリンジフィルターで濾過した後、 VIVA SPIN 50,000MWCO PES (VIVASCI ENCE CatNo. VS0231)を用いて濃縮を行った。抗体濃度は BECKMAN COULTER DU530を用いて A280の値より算出した。
[0076] Raji、 SU— DHL4、 WiL— 2、および RCK8細胞に対するヒト化抗体 fv、 ff、 sf、 ss 、およびキメラ抗体 clkl79の、濃度と CDC活性の関係を図 11a〜図 l idに示す。 いずれの実験系においても、濃度 5 /z gZml以上においてヒトイ匕抗体 fv、 ff、 sf、およ び ssの CDC活性はリツキサン (C2B8)の活性と同程度であるかあるいはそれを上回 つていた。
[0077] Raji細胞（浮遊細胞）に対する Kd値が約 9. 5nM未満であって、し力も CDC活性 の高い抗体として選別されたクローン fvおよび ff (CDC活性が期待されるクローン） は、濃度 5 gZml以上においていずれの細胞に対してもリツキシマブよりも高い CD C活性を示し、特に SU— LDHL4細胞に対する CDC活性が高ぐ Raji細胞および R CK8細胞に対しても CDC活性が高いことがわかった。
[0078] Raji細胞（浮遊細胞）に対する Kd値が約 9. 5nMから約 13nMの範囲であって、で きるだけアポトーシス活性と CDC活性の総和が大きぐかつ、 Kd値が小さい抗体とし て選別されたクローン sf (CDC活性とアポトーシスの両方が期待される）は、濃度 5 gZml以上においていずれの細胞に対してもリツキシマブと同程度または高い細胞 溶解活性を示し、特に SU— LDHL4細胞に対する溶解活性が高ぐ Wil2細胞およ び RCK8細胞に対する溶解活性が他の抗体よりも高いことがわ力つた。
[0079] Raji, SU— DHL4、 WiL— 2、および RCK8細胞に対する fv、 ff、 sf、および ssの アポトーシス活性にっ 、ても調べた。表 7に結果を示す。
[0080] 表 7 本発明のヒトイ匕抗体のアポトーシス活性
[表 7]
Figure imgf000042_0001
[0081] 表 7の結果から、クローン sfは、リツキシマブと同程度あるいはそれよりも強いアポト 一シス誘導活性を有すること、アポトーシス誘導に二次抗体を必要とせず、単独で十 分なアポトーシス活性を発揮することがわ力つた。さらに、クローン sfのアポトーシス活 性と CDC活性の総和も、試験したすべての細胞にお!、てリツキシマブを上回ってお り、特に WiL2細胞および SU— DHL4細胞において大きな値であった（表 6、図 11a 〜図 l ld、および表 7参照）。
[0082] Raji, SU— DHL4、 WiL— 2、および RCK8細胞に対する fv、 ff、 sf、および ssの ADCC活性についても調べた。抗体濃度と ADCCとの関係を調べた結果を図 12a 〜図 12dに示す (E： T比は 25)。 E： T比と ADCCとの関係を調べた結果を図 13a〜 図 13dに示す (抗体濃度は 1 μ g/ml) 0いずれの実験系においても、 fv、 ff、 sf、お よび ssの ADCC活性はリツキサン（C2B8)の活性と同程度であるかあるいはそれを 上回っていた。 ADCC活性の結果カゝらも、この実験で選抜された fv、 ff、 sf、および s sの有効性が示された。
[0083] これらの結果から、上記のようにして選別された本発明のヒトイ匕モノクローナル抗体 は 、ずれもリツキサンの細胞溶解活性を上回る高 、細胞溶解活性を示すことがわか つた。したがって、本発明の選抜基準により選抜されたヒト化抗体は、医薬として十分 に使用可能な B細胞関連疾患治療効果を有するものと考えられた。
産業上の利用可能性
[0084] 本発明によれば、自然の状態のヒト CD20分子に対する結合親和性の高い、医薬 として好適な生物学的活性を示すヒト化抗ヒト CD20モノクローナル抗体、ならびにそ の選抜方法が提供され、医薬として十分に使用可能な B細胞関連疾患治療効果を 有するものを得ることができる。
配列表フリーテキスト
[0085] SEQ ID NO: 17: L chain V region sequence of humanized antibody abb 1791
SEQ ID NO: 18: L chain V region sequence of humanized antibody fra 1791 SEQ ID NO: 19: L chain V region sequence of humanized antibody sdr 1791 SEQ ID NO: 20: L chain V region sequence of humanized antibody Ven 1791 SEQ ID NO: 21: H chain V region sequence of humanized antibody abb 1791 SEQ ID NO: 22: H chain V region sequence of humanized antibody fra 1791 SEQ ID NO: 23: H chain V region sequence of humanized antibody sdr 1791 SEQ ID NO: 24: H chain V region sequence of humanized antibody Ven 1791 SEQ ID NO: 25: primer
SEQ ID NO: 26: primer

Claims

請求の範囲
[1] ヒト CD20抗原を発現しているヒト B細胞株と、ヒト CD20の DNAで形質転換された 非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒト CD20抗原 を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗 CD20モノクローナル抗体で あって、下記選抜基準：
(i)ヒト CD20抗原に対する解離定数 (Kd値）が約 9. 5nM未満であって、 B細胞 に対する CDC活性が 2B8抗体と同等またはそれ以上の抗体
を満たすヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体。
[2] ヒト CD20抗原を発現しているヒト B細胞株と、ヒト CD20の DNAで形質転換された 非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒト CD20抗原 を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗 CD20モノクローナル抗体で あって、下記選抜基準：
(a)ヒト CD20抗原に対する解離定数 (Kd値）が約 9. 5nM未満であって、 Raji細 胞 (浮遊細胞)または SU— DHL4細胞に対する CDC活性が 2B8抗体と同等または それ以上の抗体
を満たすヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体。
[3] ヒト CD20抗原を発現しているヒト B細胞株と、ヒト CD20の DNAで形質転換された 非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒト CD20抗原 を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗 CD20モノクローナル抗体で あって、下記選抜基準：
(ii)ヒト CD20抗原に対する Kd値が約 9. 5nMから約 13nMの範囲であって、 B 細胞に対するアポトーシス活性と CDC活性の総和が 2B8抗体と同等またはそれ以 上の抗体
を満たすヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体。
[4] ヒト CD20抗原を発現しているヒト B細胞株と、ヒト CD20の DNAで形質転換された 非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒト CD20抗原 を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗 CD20モノクローナル抗体で あって、下記選抜基準： (b)ヒト CD20抗原に対する Kd値が約 9. 5nMから約 13nMの範囲であって、 Wi
L2細胞または RCK8細胞に対するアポトーシス活性と CDC活性の総和が 2B8抗体 と同等またはそれ以上の抗体
を満たすヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体。
[5] 配列番号 18の L鎖と配列番号 22の H鎖を組み合わせた請求項 1または 2記載のヒ ト化抗 CD20モノクローナル抗体。
[6] 配列番号 18の L鎖と配列番号 24の H鎖を組み合わせた請求項 1または 2記載のヒ ト化抗 CD20モノクローナル抗体。
[7] 配列番号 19の L鎖と配列番号 22の H鎖を組み合わせた請求項 3または 4記載のヒ ト化抗 CD20モノクローナル抗体。
[8] 請求項 1〜7のいずれか 1項記載のヒトイ匕抗 CD20モノクローナル抗体を有効成分 として含む B細胞関連疾患治療剤。
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