WO2007097461A1 - Ｃ型肝炎治療用抗体 - Google Patents

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WO2007097461A1
WO2007097461A1 PCT/JP2007/053663 JP2007053663W WO2007097461A1 WO 2007097461 A1 WO2007097461 A1 WO 2007097461A1 JP 2007053663 W JP2007053663 W JP 2007053663W WO 2007097461 A1 WO2007097461 A1 WO 2007097461A1
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WO
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antibody
dhcr24
cells
hepatitis
cell
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PCT/JP2007/053663
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English (en)
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Kyoko Kohara
Chieko Kai
Tomohiro Nishimura
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Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Kumamoto University NUC
Arigen Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Kumamoto University NUC
Arigen Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses

Definitions

  • the present invention relates to an anti-DHCR24 antibody for treating hepatitis C. Furthermore, the present invention relates to an antiviral agent comprising the antibody and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Hepatitis C virus is a major cause of non-A non-B hepatitis after blood transfusion, and hepatitis caused by this virus has a high rate of chronicity.
  • the cDNA of this virus was cloned by Choo et al. In 1989 (Choo, QL et al., Science, 244, 359-362, 1989) and is known to be a single-stranded RNA virus belonging to the Flaviviridae family. (Kato, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9524-9528, 1990).
  • the entire base sequence and amino acid sequence have been elucidated by several groups.
  • DHCR24 (24-dehydrocholesterol reductase) is also called Seladin-1 and is an enzyme that reduces desmosterol to cholesterol, which is the final step in the cholesterol synthesis pathway (Bae, H. et al., Biochem J. 326). : 609—16, 1997).
  • DHCR24 knockout mice are not lethal, cholesterol deficiency is present in the cell membranes of systemic organs. Has been observed (Wechsler et al., Science 302: 2087, 2003).
  • DHCR24 is decreased in Alzheimer's disease and neuronal cells are damaged (Crameri et al., EMBO J. 112, 2006). An association with adrenal tumors has also been reported.
  • DHCR24 knockdown bypasses Ras-induced senescence and transforms cells (Wu et al., Nature 432: 640-645, 2004). This is because DHCR24 binds to p53 and MDM2 (ubiquitin E3 ligase) in human diploid mitose cysts (WI3 8) during tumorigenic stress or oxidative stress, dissociates p53 from MDM2, and activates p53. This is thought to be a trick.
  • MDM2 ubiquitin E3 ligase
  • the present inventors have obtained an antibody that recognizes DHCR24 and disclosed that this antibody is effective for diagnosis and treatment of cancer (WO2005Z019268).
  • An object of the present invention is to provide an antibody effective for the treatment of hepatitis C.
  • the present invention also provides a means for solving the problems aimed at providing an antiviral agent that specifically damages HCV-infected cells.
  • the present invention provides an anti-DHCR24 antibody for treating hepatitis C.
  • the present invention also provides an antiviral agent comprising the antibody and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides a method for treating hepatitis c, comprising administering the antibody in an amount effective for treating hepatitis C.
  • the present invention also provides an anti-DHCR24 antibody in an amount effective for the treatment of hepatitis C and instructions for use A kit for treating hepatitis c is provided.
  • FIG. 1 Luciferase gene and neo gene, and nonstructural protein region of HCV (NS3
  • FIG. 2 is a diagram showing a structure of a unit fused with -NS5b) and an outline of a method for establishing HCV replicon cells.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of analysis of HCV replicon replication inhibitory activity by anti-DHCR24 antibody 2-152 by Luciferase zessey.
  • FIG. 3 shows the results of analysis of HCV replicon cytotoxicity by anti-DHCR24 antibody 2-152 using WST-8.
  • FIG. 5 shows the results of FACS analysis of the expression of DHCR24 present on the surface of HuH-7 cells (left panel) and replicon cells Rep3-1 (right panel).
  • the black area indicates a normal IgG-responsive cell group, and the white area indicates an anti-DHCR24 IgG-responsive cell group.
  • the present invention relates to an anti-DHCR24 antibody for treating hepatitis C.
  • the antibody of the present invention can suppress HCV replication and suppress HCV replicating cells.
  • HCV replicon cells are used (Lohmann et al., Science, 285, 110-113, 1999).
  • the HCV replicon cell is a luciferase gene linked as an indicator gene to a nonstructural protein (NS) region necessary for HCV replication.
  • the anti-HCV replication activity can be clarified by measuring luciferase activity after adding anti-DHCR24 antibody to the cells.
  • the antiviral activity of the anti-DHCR24 antibody can be examined from the inhibitory activity using the HCV infection system (Wakita et al., Nature Medicine, 11, 791-796, 2005).
  • the anti-DHCR24 antibody of the present invention has a binding ability to DHCR! / However, it is not limited by origin or shape.
  • the binding ability to DHCR preferably binds specifically to DHCR.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody! /, But is preferably a monoclonal antibody when used for treatment or diagnosis.
  • the antibody of the present invention may be any animal-derived antibody such as a mouse antibody, a human antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, a goat antibody, or a camel antibody.
  • a modified antibody in which an amino acid sequence is substituted such as a chimeric antibody or a human rabbit antibody, may be used, or an antibody modified product in which various molecules are bound, an antibody fragment, a low molecular weight antibody, or a sugar chain modification. Any antibody may be used, such as an antibody.
  • the anti-DHCR24 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is preferred.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced by hyperpridoma and those produced by a host transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques.
  • Such an antibody can be obtained by, for example, the following methods known to those skilled in the art.
  • Monoclonal antibody-producing hyperpridoma can be prepared basically using a known technique, for example, as follows. That is, DHCR24 protein or DHCR24-expressing cells (for example, hepatocytes, hepatoma cells, etc. into which a gene encoding HCV protein has been introduced) is used as a sensitizing antigen and immunized according to a normal immunization method. It can be prepared by fusing the immunized cells with known parental cells by the usual cell fusion method and screening monoclonal antibody-producing cells by the usual screening method.
  • DHCR24 protein or DHCR24-expressing cells for example, hepatocytes, hepatoma cells, etc. into which a gene encoding HCV protein has been introduced
  • the monoclonal antibody can be prepared as follows.
  • the DHCR24 protein used as a sensitizing antigen for antibody acquisition is expressed by expressing the DHCR24 gene Z amino acid sequence disclosed in GenBank: NM 014762. (Or the sequence described in Am. J. Hum. Genet. 69 (4), 685-694 (2001); J. Neurosci. 20 (19), 7345-7352 (2000)). That is, a gene sequence encoding DHCR24 is inserted into a known expression vector system to transform an appropriate host cell, and then the desired human DHCR24 protein is known from the host cell or culture supernatant. Purify by the method.
  • this purified DHCR24 protein is used as a sensitizing antigen.
  • a partial peptide of DHCR2 4 can be used as a sensitizing antigen.
  • the partial peptide can also be obtained by chemical synthesis from the amino acid sequence of human DHCR24.
  • the epitope on the DHCR24 molecule recognized by the anti-DHCR24 antibody of the present invention is not limited to a specific one, and any epitope may be recognized as long as it exists on the DHCR24 molecule. Therefore, any fragment can be used as the antigen for producing the anti-DHCR24 antibody of the present invention as long as it contains a eptope existing on the DHCR24 molecule.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but it is generally preferable to select in consideration of the compatibility with the parent cell used for cell fusion.
  • Rodent animals such as mice, rats, rats, mustards, rabbits, monkeys, etc. are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected into a mammal intraperitoneally or subcutaneously.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, etc., and then mixed with an appropriate amount of an ordinary adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary.
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • the immune power of the mammal is also collected and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells include In particular, spleen cells.
  • a mammalian myeloma cell is used as the other parent cell to be fused with the immune cell.
  • This myeloma cell is known in various known cell lines such as P3 (P3x63Ag8.653) ( J. Immnol. 123, 1548—1550, 1979), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology 81, 1—7, 1978), NS—l (Kohler. G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol., 6, 511—519, 1976), MPC—11 (Margulies.
  • the cell fusion between the immune cell and myeloma cell is basically performed by a known method, for example, the method of Kohler and Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol., 73, 3 — Can be done according to 46, 1981).
  • the cell fusion is performed in a normal nutrient culture medium in the presence of, for example, a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PE G), Sendai virus (HVJ) or the like is used as a fusion promoter, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency as desired.
  • PE G polyethylene glycol
  • HVJ Sendai virus
  • auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide
  • the use ratio of immune cells and myeloma cells can be arbitrarily set.
  • the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI 1640 culture medium suitable for growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other normal culture liquids used for this kind of cell culture can be used.
  • serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture medium, and pre-warmed to about 37 ° C (for example, an average molecular weight of 1,000 to 6,000). About 30% to 60% (w / v) is added and mixed to form the desired fused cell (hybridoma). Subsequently, cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of high-pridoma are removed by repeating the operation of adding an appropriate culture solution successively and centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma obtained in this way is a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution.
  • human lymphocytes are sensitized to DHCR24 in vitro, and the sensitized lymphocytes are myeloma having a human-derived permanent division ability. It is possible to obtain a desired human antibody having a binding activity to DHCR24 by fusing with cells (see Japanese Patent Publication No. 1-59878). Furthermore, anti-DHCR24 antibody-producing cells were obtained by administering DHCR24 as an antigen to a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes, and human antibodies against DHCR24 were obtained from the immortalized cells. It is also possible (see W094Z25585, W093Z12227, WO92 / 03918, and WO94Z02602).
  • the monoclonal antibody produced in this manner can be subcultured in a normal culture solution, and can be stored for a long time in liquid nitrogen. .
  • the hybridoma can be obtained by culturing the hyperidoma according to a conventional method and obtaining it as a culture supernatant, or administering the hyperidoma to a mammal compatible therewith. Then, it can be proliferated and used as its ascites.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • the antibody gene is cloned into a hybridoma, and incorporated into an appropriate vector, which is introduced into a host and produced using a gene recombination technique.
  • a gene recombination technique See, for example, Vandamme, AM et al., Eur. J. Biochem., 192, 767-775, 1990).
  • mRNA encoding the variable (V) region of the anti-DHCR24 antibody is isolated from the hybridoma producing the anti-DHCR24 antibody. Isolation of mRNA can be accomplished by known methods, such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistrv, 18, 5294-5299). 1979), AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem., 162, 156-159, 1987), etc. to prepare total RNA and use mRNA purification kit (manufactured by Pharmacia) etc. Prepare mRNA. Alternatively, mRNA can be directly prepared by using a QuickPrep mRNA purification kit (manufactured by Pharmacia).
  • cDNA of the antibody V region is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • cDN A is synthesized using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthes is Kit (manufactured by Seikagaku Corporation).
  • Kit manufactured by Seikagaku Corporation.
  • To synthesize and amplify cDNA use 5, 1 Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and PCR 5 — RACE method (Frohman, MA et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res., 17, 2919-2932, 198 9) and the like.
  • the target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated with vector DNA.
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare the desired recombinant vector. Then, the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method such as the dideoxynucleotide chain termination method.
  • the antibody gene is usually incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region such as an enhancer or promoter.
  • an expression control region such as an enhancer or promoter.
  • a host cell is transformed with this expression vector to express an antibody.
  • the expression of the antibody gene may be carried out by co-transforming a host cell by separately incorporating DNAs encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) into an expression vector.
  • DNA encoding the L chain may be incorporated into a single expression vector to transform the host cell (see W094Z11523).
  • Transgenic animals can be used not only for the host cells described above, but also for the production of recombinant antibodies.
  • an antibody gene is inserted in the middle of a gene encoding a protein (such as goat 13 casein) that is uniquely produced in milk to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing a fusion gene into which an antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo and the embryo is introduced into a female goat.
  • the milk power produced by the transgeneic goats that have received the embryo or their offspring will also yield the desired antibody.
  • hormones may be used as appropriate in transgenic guinea pigs (Ebert, KM et al., Bio / Technology 12, 6 99-702, 1994).
  • the antibodies of the present invention include modified antibodies that have been artificially modified for the purpose of reducing heteroantigenicity against humans, such as chimeric antibodies and humanized antibodies. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is produced by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with the DNA encoding the human antibody C region, incorporating it into an expression vector and introducing it into a host. It is obtained from this. Using this known method, chimeric antibodies can be obtained.
  • a humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody, which is a complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal such as a mouse antibody. It has been transplanted to the region, and its general genetic recombination technique is also known! (See EP125023 and WO96Z02576).
  • CDR complementarity determining region
  • a DNA sequence designed to link a CDR of a mouse antibody and a framework region (FR) of a human antibody has a portion that overlaps both CDR and FR terminal regions.
  • synthesis is performed by PCR (see the method described in W098Z13388).
  • the FR region of the human antibody to be ligated via CDR one in which the complementarity determining region forms a favorable antigen binding site is selected. If necessary, the amino acid of the FR region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer Res., 53, 851—856, 1993).
  • human antibodies are used for the C region of chimeric antibodies and humanized antibodies.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4 are used for the H chain
  • C ⁇ is used for the L chain.
  • ⁇ , C ⁇ can be used.
  • the human antibody C region may be modified to improve the stability of the antibody or its production. Yes.
  • a chimeric antibody consists of a variable region of a non-human mammal-derived antibody and a constant region derived from a human antibody.
  • a humanized antibody is composed of a complementarity determining region of an antibody derived from a mammal other than a human and an FR region and a C region derived from a human antibody. Since chimeric antibodies and humanized antibodies have reduced antigenicity in the human body, they are considered useful when administered to humans for therapeutic purposes.
  • the antibody used in the present invention is not limited to the whole antibody molecule, and may be a divalent antibody or a monovalent antibody, as long as it binds to DHCR24.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ')
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to produce antibody fragments, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector, and then an appropriate host cell.
  • an enzyme such as papain or pepsin
  • a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector, and then an appropriate host cell.
  • scFv is obtained by linking the H chain V region and L chain V region of an antibody.
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883). 1988).
  • a linker preferably a peptide linker
  • the H chain V region and the L chain V region in scFv are described herein as antibodies, they may be derived from a deviation.
  • a peptide linker that links the V regions for example, an arbitrary single-chain peptide having about 5 to 20 amino acids is used.
  • the DNA encoding scFv is a DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody, PCR is performed using a primer pair that defines both ends of the DNA encoding the L chain or L chain V region, or the DNA portion encoding the entire desired amino acid sequence or the both ends of the DNA. Amplification is performed by the method, followed by further amplification with a combination of a DNA encoding a part of the peptide linker and a primer pair that defines both ends to be linked to the H chain and L chain, respectively.
  • an expression vector containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method.
  • ScFv can be obtained according to a conventional method.
  • antibody fragments can be produced by the host by obtaining and expressing the gene in the same manner as described above.
  • the “antibody” in the present invention includes fragments of these antibodies.
  • modified antibodies include anti-DHCR24 antibodies bound to various molecules such as cytotoxic substances and polyethylene glycol (PEG).
  • cytotoxic substance include radioisotopes, chemotherapeutic agents, bacterial-derived toxins and the like.
  • the “antibody” in the present invention includes modified antibodies bound to such other substances. Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field.
  • the antibody used in the present invention may be a bispecific antibody.
  • a bispecific antibody may be a bispecific antibody having an antigen binding site that recognizes different epitopes on the DHCR24 molecule, where one antigen binding site recognizes DHCR24 and the other antigen binding site.
  • Cytotoxic substances such as chemotherapeutic agents, cell-derived toxins, and radioactive substances may be recognized. In this case, it is possible to act on the cells expressing DHCR24 directly with a cytotoxic agent to specifically damage the tumor cells and suppress the growth of the tumor cells.
  • Bispecific antibodies can be prepared by combining HL pairs of two types of antibodies, or by producing a bispecific antibody-producing fusion cell by fusing a hybridoma that produces different monoclonal antibodies. You can also. In addition, bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques.
  • the sugar chain of the antibody may be modified.
  • Such sugar chain modification techniques are already known (for example, WOZ0061739, WO02 / 31140, etc.).
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method. In the case of mammalian cells, it can be expressed by functionally binding a useful promoter commonly used, an antibody gene to be expressed, and a poly A signal downstream of the 3 ′ side thereof.
  • the promoter Z Enhansa one
  • the human cytomegalovirus wax Ino-less early promoter Z En'no ⁇ capacitors 1 ⁇ (human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer; can ani gel.
  • promoters that can be used for the expression of the antibodies used in the present invention, such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, and simian virus 40 (SV40), are also included. Examples thereof include promoters derived from mammalian cells such as human fermentation fatter 1 ⁇ (HEF1 ⁇ ).
  • HEF1 ⁇ human fermentation fatter 1 ⁇
  • the gene can be expressed by functionally combining a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • the promoter include lacZ promoter and araB promoter.
  • lacZ promoter use the method of Ward et al. (Nature, 341, 54 4-546, 1998; FASEB J., 6, 2422-2427, 1992). In some cases, it can be expressed by the method of Better et al. (Science, 240, 1041-1043, 1988).
  • a pelB signal sequence (Lei, SP et al., J. Bacteriol., 169, 4379, 1987) may be used in the case of production in the periplasm of E. coli. After isolating the antibody produced in periplasm, the structure of the antibody is Use it by refolding.
  • the vector can include an aminoglycoside transferase (APH) gene, a thymidine kinase (TK) gene, a large S fungus xanthating guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, a dihydrofolate reductase (dhfr) gene, etc. as selectable markers. .
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt large S fungus xanthating guanine phosphoribosyltransferase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • any expression system such as a eukaryotic cell or a prokaryotic cell system
  • eukaryotic cells include established mammalian cell systems, insect cell systems, filamentous fungal cells, and animal cells such as yeast cells.
  • prokaryotic cells include bacterial cells such as E. coli cells. It is done.
  • the transformed host cell is cultured in vitro or in vivo to produce the desired antibody.
  • Host cells are cultured according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI 1640, and IMDM can be used as the culture medium
  • serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • the antibody expressed and produced as described above can be isolated from cells and host animals and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be carried out using an affinity column.
  • an affinity column For example, as a column using a protein A column, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (manufactured by Pharmacia) and the like can be mentioned.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining a chromatography column other than the above-mentioned affinity column, filter 1, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. (Antibodies A Laboratory Manual., Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • ELI SA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescence Antibody methods can be used.
  • an enzyme immunoassay a sample containing anti-DHCR24 antibody, for example, a culture supernatant of an anti-DHCR24 antibody-producing cell or a purified antibody is collected on a plate coated with DHCR24.
  • Add secondary antibody labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase incubate the plate, wash, and then add an enzyme substrate such as p-tropephosphate to measure the antigen binding activity. be able to.
  • the present invention relates to an antiviral agent comprising an anti-DHCR24 antibody and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the antiviral agent of the present invention is effective for HCV-infected cells
  • the present invention also relates to a method for treating hepatitis C, comprising administering an anti-DHCR24 antibody in an amount effective for treating hepatitis C.
  • the effective dose can be selected in the range of 0.001 to 1, 000 mg / kg body weight per administration. There is! /, Tang, per person 0.01
  • Antiviral agents containing CR24 antibody are not limited to these doses.
  • the antiviral agent of the present invention can be administered regardless of before and after the clinical symptoms of the disease occur.
  • the antiviral agent of the present invention can be administered 1 to 3 times a day, 1 to 7 days per week.
  • the antiviral agent of the present invention is usually administered parenterally, for example, as an injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.), but is not particularly limited and is transdermal, It may be administered transmucosally, nasally, pulmonary, orally.
  • parenterally for example, as an injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.), but is not particularly limited and is transdermal, It may be administered transmucosally, nasally, pulmonary, orally.
  • an antiviral agent containing the anti-DHCR24 antibody of the present invention as an active ingredient can be formulated in a conventional manner; 0 (Remington's Pharmaceutical Science ⁇ latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA ) It may contain both pharmaceutically acceptable carriers and additives.
  • Examples of such carriers and pharmaceutical additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polybulal alcohol, polybulurpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, Sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methyl cellulose, ethyl cellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petroleum jelly, paraffin, sugar Examples include teal alcohol, stearic acid, human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, ratatose, and surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • HSA human serum albumin
  • the actual additive is a force selected from the above-mentioned intermediate forces alone or in appropriate combination depending on the dosage form of the antiviral agent of the present invention.
  • the additive is not limited to these.
  • the purified anti DHCR24 antibodies solvent such as physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • an adsorption inhibitor such as T W een80, Tween20, gelatin, human Those with serum albumin or the like
  • it may be lyophilized to obtain a dosage form that is reconstituted before use.
  • excipients for lyophilization include sugar alcohols such as mannitol and glucose. Luna sugars can be used.
  • the present invention also relates to a kit comprising an effective amount of anti-DHCR24 antibody for hepatitis C treatment and instructions for use.
  • HCV replicon cells A and B were used ( Figure 1).
  • HCV replicon cells consist of HuH-7 cells purchased from the American Type Culture Collection (ATCC), a unit in which the luciferase gene and the neo gene are fused, and two types (A, B) of HCV And non-structural protein regions (NS 3-NS 5b) were incorporated and selected with G418.
  • HCV replication activity can be analyzed by measuring luciferase activity using this cell.
  • Replicon cells were transferred to Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Sigma) with GlutaMax.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the epitope of antibody 2-152 exists in 270 amino acids on the C-terminal side of 517 amino acids of DHCR24.
  • Replicon cells treated with the 2-152 antibody were considered to have been induced by the antibody, and were examined for apoptosis using annexin V.
  • phosphatidylserine is expressed and can be observed with annexin V.
  • the 2-152 antibody was reacted with replicon cells at 10 gZml for 24 hours, stained with annexin V-FITC (Apoalart Annexin V; Clontech), and observed with an Olympus phase-contrast fluorescence microscope.
  • annexin V-FITC Apoalart Annexin V; Clontech
  • the nuclei of cells with increased permeability to the cell membrane were counterstained with propidium iodide (PI) to confirm the presence of apoptotic cells stained with annexin V alone.
  • PI propidium iodide
  • annexin was used in cells other than those stained with PI.
  • DHCR24 cells recognized by the 2-152 antibody after reacting hepatoma cells (HuH-7) and levicon cells with normal mouse IgG or 2-152 antibody, and then staining with anti-mouse IgG-Alexa488 (Molecular Probes). The expression on the surface was analyzed with FACS—Caliber (Betaton Dickinson).
  • Unfixed cells were also stained with antibody 2-152 (the staining was stronger, and the reaction curve appeared on the right side of the cells).
  • the surface of the replicon cells clearly showed more DHCR24 than HuH-7 cells.

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Abstract

　Ｃ型肝炎の治療に有効な抗体及び抗ウイルス剤を提供すること。 　抗ＤＨＣＲ２４抗体を用いることにより、細胞に感染したＨＣＶの複製を抑制し、感染細胞を障害することが可能である。したがって、本発明の抗ＤＨＣＲ２４抗体は、Ｃ型肝炎の治療に有効である。

Description

c型肝炎治療用抗体
技術分野
[0001] 本発明は、 C型肝炎を治療するための抗 DHCR24抗体に関する。さらに、本発明 は、前記抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む、抗ウィルス剤に関する。
背景技術
[0002] C型肝炎ウィルス (HCV)は輸血後の非 A非 B肝炎の主な原因ウィルスであり、この ウィルスに起因する肝炎は慢性化率が高い。このウィルスの cDNAは、 1989年に C hooらによりクローユングされ（Choo, Q. L.ら、 Science, 244、 359— 362、 1989 )、フラビウィルス科に属する 1本鎖 RNAウィルスであることが知られている（Kato, N .ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9524— 9528, 1990)。又、幾つ力のグ ループにより全塩基配列およびアミノ酸配列の解明がなされている。
[0003] C型肝炎の治療手段の発見が急がれている力 その理由の 1つとして、 100%有効 な抗ウィルス効果を示す治療薬が確立していないことが挙げられる。現在、最も有効 な治療法は、ぺグ化インターフェロンとリバビリンとの併用療法である。し力しながら、 この療法でも、日本で抗体陽性者が多く且つインターフェロンの効果が低 、遺伝子 型 lbの HCV感染者における著効率は 50%程度にとどまっており、新規抗ウィルス 剤の開発が切望されている。更に、 HCV陽性者は全世界で 1億 7千万人、日本でも 200万人以上存在するといわれ、 C型肝炎から肝癌'肝硬変に移行する確率も高い ことから、早急な治療手段の確立が必要とされている。また、これまでに、 HCVの複 製に関与する非構造タンパク質 (NS3、NS5)のプロテアーゼ活性を阻害すること等 による抗ウィルス薬の開発が試みられている力 ウィルス遺伝子に変異が多いことな ど力 十分な有効性は得られて 、な 、。
[0004] DHCR24 (24-dehydrocholesterol reductase)は Seladin— 1とも呼ばれ、コレステ ロール合成経路の最終段階であるデスモステロール力 コレステロールへの還元を 行う酵素である（Bae, H.ら、 Biochem J. 326 : 609— 16、 1997)。 DHCR24のノ ックアウトマウスは致死性ではないが、全身臓器の細胞膜にコレステロールの欠損が 観察されている（Wechslerら、 Science 302 : 2087、 2003)。一方、 DHCR24は アルツハイマー病で減少し、神経細胞が障害される（Crameriら、 EMBO J. 1 12 、 2006)。副腎腫瘍との関連も報告されている。さらに最近は、 siRNA発現ベクター を用いたランダムスクリーニング系から、 DHCR24のノックダウンが Rasの誘導する老 化（senescence)をバイパスして、細胞を形質転換することが明らかとなっている（Wu ら、 Nature 432 : 640— 645、 2004)。これは、 DHCR24は、ヒト 2倍体糸田胞（WI3 8)において、造腫瘍ストレスや酸化ストレス時に p53及び MDM2 (ュビキチン E3リガ ーゼ）に結合し、 p53を MDM2から解離させ、 p53を活性ィ匕するためであると考えら れている。
[0005] 本発明者らは、 DHCR24を認識する抗体を取得し、この抗体力 がんの診断や治 療に有効であることを開示して 、る（WO2005Z019268号)。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、 C型肝炎の治療に有効な抗体を提供することを目的とする。また、本発 明は、 HCV感染細胞を特異的に傷害する抗ウィルス剤を提供することを目的とする 課題を解決するための手段
[0007] HCVが感染した細胞では、 DHCR24の発現上昇がみられることから、 DHCR24 力 ¾CVの複製に必須の役割を果たす可能性が考えられた。本発明者らは、 DHCR 24に対する抗体が、 HCVの複製を抑制し、 HCV複製細胞 (レブリコン細胞)を傷害 することを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成したものである。
[0008] すなわち、本発明は、 C型肝炎を治療するための抗 DHCR24抗体を提供するもの である。
[0009] また、本発明は、前記抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む、抗ウィルス剤を 提供するものである。
[0010] さらに、本発明は、前記抗体を C型肝炎の治療に有効な量で投与することを含む、 c型肝炎の治療方法を提供する。
[0011] また、本発明は、 C型肝炎の治療に有効な量の抗 DHCR24抗体および使用説明 書を含む、 c型肝炎治療用キットを提供する。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]ルシフェラーゼ遺伝子及び neo遺伝子と、 HCVの非構造タンパク質領域 (NS3
-NS5b)とを融合させたユニットの構造と、 HCVレプリコン細胞の榭立方法の概略 を示す図である。
[図 2]抗 DHCR24抗体 2— 152による HCVレブリコン複製抑制活性を、ルシフェラー ゼアツセィにより解析した結果を示す図である。
[図 3]抗 DHCR24抗体 2— 152による HCVレプリコン細胞障害活性を、 WST—8を 用いて解析した結果を示す図である。
[図 4]抗 DHCR24抗体 2— 152処理によってアポトーシスを起こしたレプリコン細胞を アポトーシスマーカーであるァネキシン Vで染色した結果を示す顕微鏡写真である。 PIは細胞核を染色した写真であり、 Mergeは左 2つの写真を重ね合わせたものであ る。
[図 5]HuH— 7細胞（左パネル）ゃレプリコン細胞 Rep3— 1 (右パネル）の表面に存在 する DHCR24の表出を FACS解析により検出した結果を示す図である。黒い領域 は正常 IgG反応細胞群を示し、白い領域は抗 DHCR24 IgG反応細胞群を示す。 発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明は、 C型肝炎を治療するための抗 DHCR24抗体に関するものである。本発 明の抗体は、 HCVの複製を抑制し、 HCV複製細胞を抑制することができる。
[0014] 抗 DHCR24抗体の HCVに対する効果を判定するには、 HCVレプリコン細胞を使 用する（Lohmannら、 Science, 285、 110—113、 1999)。 HCVレプリコン細胞と は、 HCVの複製に必要な非構造タンパク質 (NS)領域に、インディケ一ター遺伝子 としてルシフェラーゼ遺伝子を連結させたものである。本細胞に抗 DHCR24抗体を 添加後、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、その抗 HCV複製活性を明らかに することができる。また、抗 DHCR24抗体の抗ウィルス活性は、 HCV感染系（Wakit aら、 Nature Medicine, 11、 791— 796、 2005)を用!ヽた阻害活'性【こより検討す ることがでさる。
[0015] 本発明の抗 DHCR24抗体は、 DHCRへの結合能を有して!/、れば、 、かなる抗体 でもよく、由来や形状などで限定されない。なお、 DHCRへの結合能は、 DHCRに 特異的に結合することが好まし 、。
[0016] 本発明の抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよ!/、が、治療や 診断に用いる場合には、モノクローナル抗体であることが好ま 、。
[0017] また、本発明の抗体はマウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ゥサギ抗体、ャギ抗体、ラ クダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよ 、。
[0018] さらに、例えば、キメラ抗体、ヒトイ匕抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でも よいし、又、各種分子を結合させた抗体修飾物、抗体断片、低分子化抗体、糖鎖改 変抗体など、いかなる抗体でもよい。
[0019] 1. 抗 DHCR24抗体
本発明で使用される抗 DHCR24抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル抗体 またはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明の抗 DHCR24抗体として
、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナ ル抗体は、ハイプリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺 伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるもの、などを含む。
[0020] このような抗体は、例えば、以下のような当業者に公知の方法によって得ることが可 能である。
[0021] 2. 抗体産生ハイブリドーマ
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマは、基本的には公知技術を使用し、例えば 以下のようにして作製できる。すなわち、 DHCR24タンパク質又は DHCR24発現細 胞 (例えば、 HCVタンパク質をコードする遺伝子を導入した肝細胞、肝癌細胞、など )を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免 疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニン グ法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製で きる。
[0022] 具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
[0023] まず、抗体取得の感作抗原として使用される DHCR24タンパク質を、 GenBank： NM 014762に開示された DHCR24遺伝子 Zアミノ酸配列を発現させることによつ て得る（又は Am. J. Hum. Genet. 69 (4)、 685— 694 (2001)； J. Neurosci. 20 (19)、 7345— 7352 (2000)に記載の配列）。すなわち、 DHCR24をコードする遺 伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後 、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒト DHCR24タンパク質を公知の方 法で精製する。
[0024] 次に、この精製 DHCR24タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、 DHCR2 4の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒト DHCR24のアミノ酸配列より化学合成により得ることも可能である。
[0025] 本発明の抗 DHCR24抗体の認識する DHCR24分子上のェピトープは特定のも のに限定されず、 DHCR24分子上に存在するェピトープならばどのェピトープを認 識してもよい。従って、本発明の抗 DHCR24抗体を作製するための抗原は、 DHCR 24分子上に存在するェピトープを含む断片ならば、如何なる断片も用いることが可 能である。
[0026] 感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融 合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましぐ一般的にはげつ 歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ノ、ムスター、あるいはゥサギ、サル等が使用され る。
[0027] 感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一 般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行 われる。具体的には、感作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Saline)や生理食塩水等 で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完 全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に 4〜21日毎に数回投与する。また 、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
[0028] このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した 後に、哺乳動物力も免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞 としては、特に脾細胞が挙げられる。
[0029] 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用い る。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、 P3 (P3x63Ag8. 653) ( J. Immnol. 123、 1548— 1550、 1979)、 P3x63Ag8U. 1 (Current Topics i n Microbiology and Immunology 81、 1— 7、 1978)、 NS— l (Kohler. G. 及び Milstein, C. 、 Eur. J. Immunol. 、 6、 511— 519、 1976)、 MPC— 11 (Ma rgulies. D. H.ら、 Cell, 8、 405—415、 1976) , SP2/0 (Shulman, M.ら、 Na ture、 276、 269— 270、 1978)、 FO (deSt. Groth, S. F.ら、 Immunol. Met hods, 35、 1— 21、 1980)、 S 194 (Trowbridge, I. S. , J. Exp. Med. 、 148、 31 3— 323、 1978) , R210 (Galfre, G.ら、 Nature、 277、 131— 133、 1979)等力 S 好適である。
[0030] 前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば 、ケーラーとミルスティンらの方法（Kohler. G.及び Milstein, C. 、 Methods Enz ymol. 、 73、 3— 46、 1981)等に準じて行うこと力 Sできる。
[0031] より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄 養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール (PE G)、センダイウィルス (HVJ)等が使用され、更に所望により融合効率を高めるために ジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
[0032] 免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミ エローマ細胞に対して免疫細胞を 1〜10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用 いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な RPMI 1640 培養液、 MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使 用可能であり、さらに、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもできる。
[0033] 細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混 合し、予め 37°C程度に加温した PEG溶液 (例えば平均分子量 1, 000〜6, 000程 度）を通常 30〜60% (w/v)の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合 細胞 (ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上 清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリドーマの生育に好ましくない細胞融合 剤等を除去する。
[0034] このようにして得られたノヽイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば HAT培養液
(ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより選 択される。上記 HAT培養液での培養は、目的とするハイプリドーマ以外の細胞 (非 融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間)継続する。ついで、通 常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニン グおよび単一クロー-ングを行う。
[0035] また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球 を in vitroで DHCR24に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミ エローマ細胞と融合させ、 DHCR24への結合活性を有する所望のヒト抗体を得るこ ともできる（特公平 1— 59878号公報参照)。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパート リーを有するトランスジエニック動物に抗原となる DHCR24を投与して抗 DHCR24 抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞から DHCR24に対するヒト抗体を 取得してもよい（W094Z25585号公報、 W093Z12227号公報、 WO92/0391 8号公報、 WO94Z02602号公報参照）。
[0036] このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するノ、イブリドーマは、通常の 培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが 可能である。
[0037] 当該ノ、イブリドーマ力 モノクローナル抗体を取得するには、当該ハイプリドーマを 通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイプリドー マをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法など が採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方 法は、抗体の大量生産に適している。
[0038] 3. 組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をノヽイブリドーマ力もクロー- ングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用 いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、 Vandamme, A. M. ら、 Eur. J. Biochem.、 192、 767— 775、 1990参照）。
[0039] 具体的には、抗 DHCR24抗体を産生するハイブリドーマから、抗 DHCR24抗体の 可変 (V)領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、公知の方法、例え ば、グァ-ジン超遠心法（Chirgwin, J. M.ら、 Biochemistrv、 18、 5294— 5299 、 1979)、 AGPC法（Chomczynski, P.ら、 Anal. Biochem. 、 162、 156— 159、 1987)等により行って全 RNAを調製し、 mRNA精製キット (フアルマシア製)等を使 用して目的の mRNAを調製する。また、 QuickPrep mRNA精製キット（フアルマシ ァ製)を用いることにより mRNAを直接調製することもできる。
[0040] 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDN Aの合成は、 AM V Reverse Transcriptase First― strand cDNA Synthes is Kit (生化学工業社製)等を用いて行う。また、 cDNAの合成および増幅を行うに は、 5， 一 Ampli FINDER RACE Kit (クローンテック製）および PCRを用いた 5， — RACE法（Frohman, M. A.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85、 8998— 9 002、 1988 ;Belyavsky, A.ら、 Nucleic Acids Res. 、 17、 2919— 2932、 198 9)等を使用することができる。
[0041] 得られた PCR産物から目的とする DNA断片を精製し、ベクター DNAと連結する。
さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所 望の組換えベクターを調製する。そして、目的とする DNAの塩基配列を公知の方法 、例えば、ジデォキシヌクレオチドチェインターミネーシヨン法等により確認する。
[0042] 目的とする抗 DHCR24抗体の V領域をコードする DNAを得たのち、これを、所望 の抗体定常領域 (C領域)をコードする DNAを含有する発現ベクターへ組み込む。
[0043] 本発明で使用される抗 DHCR24抗体を製造するには、通常、抗体遺伝子を発現 制御領域、例えば、ェンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現べ クタ一に組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を 発現させる。
[0044] 抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖 (H鎖)または軽鎖 (L鎖）をコードする DNAを別々 に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいは H 鎖および L鎖をコードする DNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形 質転換させてもょ 、 (W094Z11523号公報参照)。
[0045] また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなぐトランスジエニック動物 を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパ ク質 (ャギ 13カゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調 製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し 、この胚を雌のャギへ導入する。胚を受容したャギカ 生まれるトランスジエニックャ ギまたはその子孫が産生する乳汁力も所望の抗体を得る。また、トランスジエニックャ ギカも産生される所望の抗体を含む乳汁量を増カロさせるために、適宜ホルモンをトラ ンスジエニックャギに使用してもよい（Ebert, K. M.ら、 Bio/Technology、 12、 6 99— 702、 1994)。
[0046] 4. 改変抗体
本発明の抗体には、上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原性を低下させること 等を目的として人為的に改変した改変抗体、例えば、キメラ抗体、ヒトイ匕 (Humanized) 抗体などを含む。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
[0047] キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体 V領域をコードする DNAをヒト抗体 C領域 をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生さ せること〖こより得られる。この既知の方法を用いて、キメラ抗体を得ることができる。
[0048] ヒト化抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR;complementarity determining region)を ヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法 も知られて！/、る（EP125023号公報、 WO96Z02576号公報参照）。
[0049] 具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域 (FR)とを連結する ように設計した DNA配列を、 CDR及び FR両方の末端領域にオーバーラップする部 分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて PCR法 により合成する (W098Z13388号公報に記載の方法を参照)。
[0050] CDRを介して連結されるヒト抗体の FR領域は、相補性決定領域が良好な抗原結 合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領 域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域における FR領域のァ ミノ酸を置換してもよい（Sato, K.ら、 Cancer Res.、 53、 851— 856、 1993)。
[0051] キメラ抗体及びヒト型化抗体の C領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えば H鎖 では、 C γ 1、 C γ 2、 C γ 3、 C γ 4を、 L鎖では C κ、 C λを使用することができる。ま た、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体 C領域を修飾してもよ い。
[0052] 一般的に、キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来 の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性 決定領域と、ヒト抗体由来の FR領域および C領域とからなる。キメラ抗体やヒト化抗体 はヒト体内における抗原性が低下されているため、治療目的などでヒトに投与する場 合に有用と考えられる。
[0053] 5. 抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず DHCR24に結合する限 り、抗体の断片又はその修飾物であってもよぐ 2価抗体も 1価抗体も含まれる。例え ば、抗体の断片としては、 Fab、 F (ab' )
2、 Fv、 1個の Fabと完全な Fcを有する FabZ c、または H鎖若しくは L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させた 1本鎖 Fv (scFv)、 dia bodyなどが挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処 理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し 、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、 Co, M . S.ら、 Immunol.、 152、 2968— 2976、 1994 ; Better, M. &Horwitz, A. H.、 Methods in Enzymology、 178、 476— 496、 1989 ; Academic Press, I nc.、 Plueckthun、 A. &Skerra, A.、 Methods in Enzymology、 178、 476 —496、 1989 ; Academic Press, Inc.、 Lamoyi, E.、 Methods in Enzymol ogy、 121、 652— 663、 1989 ;Rousseaux, J.ら、 Methods in Enzymology、 121、 663— 669、 1989 ; Bird, R. E.ら、 TIBTECH、 9、 132—137、 1991参照）
[0054] scFvは、抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域とを連結することにより得られる。この scFv において、 H鎖 V領域と L鎖 V領域は、リンカ一、好ましくはペプチドリンカ一を介して 連結される（Huston, J. S.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85、 5879 - 5883 、 1988)。 scFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域は、本明細書に抗体として記 載されたものの 、ずれの由来であってもよ 、。 V領域を連結するペプチドリンカ一とし ては、例えばアミノ酸 5〜20残基程度の任意の 1本鎖ペプチドが用いられる。
[0055] scFvをコードする DNAは、前記抗体の H鎖または H鎖 V領域をコードする DNA、 および L鎖または L鎖 V領域をコードする DNAのうち、それらの配列のうちの全部又 は所望のアミノ酸配列をコードする DNA部分を铸型とし、その両端を規定するプライ マー対を用いて PCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカ一部分をコード する DNA、およびその両端が各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプライマー 対を組み合わせて増幅することにより得られる。
[0056] また、ー且 scFvをコードする DNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター 、および該発現べクタ一により形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、 また、その宿主を用いることにより、常法に従って scFvを得ることができる。
[0057] これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により 産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含され る。
[0058] 抗体の修飾物として、細胞障害性物質やポリエチレングリコール (PEG)等の各種 分子と結合した抗 DHCR24抗体を挙げることができる。細胞障害性物質としては、 例えば、放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等を挙げることができる。 本発明における「抗体」には、このような他の物質と結合している抗体修飾物も包含さ れる。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得 ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
[0059] さらに、本発明で使用される抗体は、 2重特異性抗体 (bispecific antibody)であって もよ 、。 2重特異性抗体は DHCR24分子上の異なるェピトープを認識する抗原結合 部位を有する 2重特異性抗体であってもよ 、し、一方の抗原結合部位が DHCR24を 認識し、他方の抗原結合部位が化学療法剤、細胞由来トキシン、放射性物質等の細 胞障害性物質を認識してもよい。この場合、 DHCR24を発現している細胞に直接細 胞障害性物質を作用させ腫瘍細胞に特異的に傷害を与え、腫瘍細胞の増殖を抑え ることが可能である。 2重特異性抗体は 2種類の抗体の HL対を結合させて作製する こともできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを融合させて 2重 特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法に より 2重特異性抗体を作製することも可能である。
[0060] 又、抗体の細胞障害活性を増強させる目的で、抗体の糖鎖を改変してもよ 、。抗体 の糖鎖改変技術は既に知られている（例えば、 WOZ0061739号、 WO02/3114 0号など)。
[0061] 6. 組換え型抗体または改変抗体の発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することが できる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子 、その 3 '側下流にポリ Aシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例 えばプロモーター Zェンハンサ一としては、ヒトサイトメガロウイノレス前期プロモーター Zェンノヽンサ 1 ~~ (human cytomegalovirus immediate early promoter/ enhancer; 挙 げることができる。
[0062] また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター Zェンノヽン サ一として、レトロウイルス、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、シミアンウィルス 40 (S V40)等のウイノレスプロモーター Zェンハンサー、ある 、はヒトェロンゲーシヨンファタ ター 1 α (HEF1 α )などの哺乳類細胞由来のプロモーター Ζェンハンサ一等が挙げ られる。
[0063] SV40プロモーター Ζェンハンサーを使用する場合は Mulliganらの方法（Nature 、 277、 108、 1979)により、また、 HEF1 αプロモーター Zェンノヽンサ一を使用する 場合は Mizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.、 18、 5322、 1990)により、 容易に遺伝子発現を行うことができる。
[0064] 大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列 及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることがで きる。プロモーターとしては、例えば lacZプロモーター、 araBプロモーターを挙げるこ とができる。 lacZプロモーターを使用する場合は Wardらの方法（Nature、 341、 54 4— 546、 1998 ;FASEB J.、 6、 2422— 2427、 1992)【こより、ある!/ヽ ίま araBプロ モーターを使用する場合は Betterらの方法（Science、 240、 1041— 1043、 1988 )により発現させることができる。
[0065] 抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させる場合 、 pelBシグナル配列（Lei, S. P.ら、 J. Bacteriol.、 169、 4379、 1987)を使用す ればよい。そして、ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切 に組み直して (refold)使用する。
[0066] 複製起源としては、 SV40、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウイ ルス（BPV)等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー 数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラー ゼ (APH)遺伝子、チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、大 S暴菌キサンチングァニンホスホ リボシルトランスフェラーゼ (Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等 を含むことができる。
[0067] 本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は 原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば榭立された哺乳類細 胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、 原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
[0068] 好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えば CHO、 COS,ミエ口 一マ、 BHK、 Vero、 HeLa細胞中で発現される。
[0069] 次に、形質転換された宿主細胞を in vitroまたは in vivoで培養して目的とする抗 体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、 DMEM、 MEM、 RPMI 1640、 IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS) 等の血清補液を併用することもできる。
[0070] 7. 抗体の分離、精製
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製 することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はァフィユティーカラムを用 いて行うことができる。例えば、プロテイン Aカラムを用いたカラムとして、 Hyper D、 POROS、 Sepharose F. F. (フアルマシア製）等が挙げられる。その他、通常のタ ンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ何ら限定されるもので はない。例えば、上記ァフィユティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルタ 一、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精 製することができる (Antibodies A Laboratory Manual.、 Ed Harlow、 Davi d Lane、 Cold Spring Harbor Laboratory、 1988)。
[0071] 8. 抗体の活性の確認 抗体の抗原結合活性（Antibodies A Laboratory Manual.、 Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory、 1988)の測定には公知の手 段を使用することができる。
[0072] 本発明で使用される抗 DHCR24抗体の抗原結合活性を測定する方法として、 ELI SA (酵素結合免疫吸着検定法)、 EIA (酵素免疫測定法)、 RIA (放射免疫測定法） あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、 DHCR24をコーティングしたプレートに、抗 DHCR24抗体を含む試料、例えば、抗 DHCR24抗体産生細胞の培養上清や精製抗体をカ卩える。アルカリフォスファターゼ 等の酵素で標識した 2次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、 p -トロフエ-ルリン酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活 性を評価することができる。
[0073] さらに、本発明は、抗 DHCR24抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む、抗ウイ ルス剤に関するものである。本発明の抗ウィルス剤は、 HCV感染細胞に有効である
[0074] また、本発明は、抗 DHCR24抗体を C型肝炎の治療に有効な量で投与することを 含む、 C型肝炎の治療方法に関するものである。
[0075] 本発明の抗体を抗ウィルス剤として用いる場合、有効投与量は、 1回につき体重 lk gあたり 0. 001〜1, OOOmgの範囲で選ぶこと力できる。ある!/、は、唐、者あたり 0. 01
〜100, OOOmgZbodyの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の抗 DH
CR24抗体を含有する抗ウィルス剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
[0076] また、本発明の抗ウィルス剤の投与時期としては、疾患の臨床症状が生ずる前後を 問わず投与することができる。
[0077] 本発明の抗ウィルス剤は 1日 1〜3回、 1週間に 1〜7日投与することが可能である。
[0078] 本発明の抗ウィルス剤は、通常、非経口投与で、例えば注射剤 (皮下注、静注、筋 注、腹腔内注など)で投与されるが、特に限定されず、経皮、経粘膜、経鼻、経肺、 経口などで投与してもよい。
[0079] し力しながら、本発明の抗ウィルス剤は上記投与量、投与方法などに限定されるも のではない。 [0080] 本発明の抗 DHCR24抗体を有効成分として含有する抗ウィルス剤は、常法にした ¾つて製剤ィ匕すること; 0でき (Remington s Pharmaceutical Science^ latest edition, Mark Publishing Company, Easton、米国）、医薬的に許容される担 体や添加物を共に含むものであってもよ 、。
[0081] このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、 コラーゲン、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビ二ルポリマー、 カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム 、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセル口 ース、ェチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレ ングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ス テアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA)、マン-トール、ソルビ トール、ラタトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
[0082] 実際の添加物は、本発明の抗ウィルス剤の剤型に応じて上記の中力 単独で又は 適宜組み合わせて選ばれる力 もちろんこれらに限定されるものではない。例えば、 注射用製剤として使用する場合、精製された抗 DHCR24抗体を溶剤、例えば生理 食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えば TWeen80、 Tween20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等をカ卩えたものを使用することができる。あ るいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく 、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マン-トール、ブドウ糖等の糖アルコ ールゃ糖類を使用することができる。
[0083] また、本発明は、 C型肝炎の治療に有効な量の抗 DHCR24抗体及び使用説明書 を含む、キットに関するものである。
実施例 1
[0084] 1. 材料と方法
1. 1 レブリコン細朐
本研究では、 HCVレプリコン細胞 A及び Bを用いた（図 1)。 HCVレプリコン細胞は 、 American Type Culture Collection (ATCC)から購入した HuH— 7細胞に 、ルシフェラーゼ遺伝子と neo遺伝子を融合させたユニットと、 2種類 (A、 B)の HCV の非構造タンパク質領域 (NS 3— NS 5b)とを組み込み、 G418で選択することによつ て榭立した。本細胞を用いたルシフェラーゼ活性の測定により、 HCV複製活性を解 析することができる。
[0085] レプリコン細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM；シグマ）に、 GlutaMax
1 (インビトロジェン）、ペニシリン（lOOUZml)、ストレプトマイシン（100 μ g/ml) G
418 (500 μ g/ml)、 10%FCS (シグマ）をカ卩えて培養した。
[0086] 1. 2 モノクローナル抗体
モノクローナノレ抗体【ま、 WO2005/019268号【こ記載のクローン 2— 152を用!ヽた
。 2— 152抗体のェピトープは、 DHCR24の 517アミノ酸のうち C末側 270アミノ酸に 存在する。
[0087] 1. 3 HCVレブリコン複製抑制活件の測定
96ゥエルプレート（ファルコン）に、ゥエルあたり 8 X 103、 6 X 103、又は 4. 5 X 103の レプリコン細胞を捲き、翌日、抗体を 1又は gZmlで添カ卩し、それぞれ 24、 48、 又は 72時間反応させた。培地と等量の Bright— Glo試薬 (プロメガ）を添加後、ルミ ノメーター（AccuFLEX Lumi400、ァロカ）でルシフェラーゼ活性を測定した。抗 体を添カ卩していない細胞、 normal IgGを添カ卩した細胞を対照として用いた。結果を 相対発光量 (RLU)で示す (図 2)。
[0088] 1. 4 レブリコン細朐瞳害活件の測定
上記のようにしてレブリコン細胞を抗体と反応させた後、水溶性テトラゾリゥム塩 WS T— 8を発色試薬として用いる Cell Counting Kit— 8溶液（同仁ィ匕学研究所)を 1 0 μ 1Zゥエルで添加し、 37°Cで 1時間反応後、 OD を測定した (対照波長 650nm)
450
。抗体を添カ卩していない細胞、 normal IgGを添カ卩した細胞を対照として用いた。
[0089] 2. 結果
HCVレブリコン複製抑制活性を測定したところ、図 2に示すように、 normal IgGを 添加した細胞ではレブリコンの複製は全く抑制されないが、 2— 152抗体を 10 g/ mlで添加した場合、レブリコン細胞 A、 Bともに 48時間以降は顕著な複製抑制が認 められた（Studentの t検定で p< 0. 05)。
[0090] 更に、レプリコン細胞障害活性を WST法で解析した結果、図 3に示すように、 norm al IgGを添カ卩したレプリコン細胞は全く障害されないが、 2— 152抗体を 10 /z gZml で添加した場合、レブリコン細胞 Aでは 72時間後に、レブリコン細胞 Bでは 48時間後 に吸光度が著しく低下し (Studentの t検定で p< 0. 05)、細胞が障害されたことが 明らかとなった。
実施例 2
[0091] 1. アポトーシスアツセィ
2— 152抗体で処理したレプリコン細胞は、抗体によりアポトーシスが誘導されてい るのではないかと考え、ァネキシン Vを用いてアポトーシスの検討を行った。アポトー シスの初期段階ではホスファチジルセリンが表出するため、これをァネキシン Vで観 察することができる。 2— 152抗体をレプリコン細胞に 10 gZmlで 24時間反応させ た後、ァネキシン V— FITC (Apoalart Annexin V；クローンテック社）で染色し、ォリン パス位相差蛍光顕微鏡で観察した。また、細胞膜の透過性が上昇している細胞の核 をヨウ化プロビジゥム (PI)で対比染色し、ァネキシン Vだけで染色されるアポトーシス 細胞の存在を確認した。
[0092] 2 152抗体で抗理した細胞では、 PIで染色される細胞以外の細胞でァネキシン
Vによる蛍光が観察された。このことから、 2— 152抗体がアポトーシスを誘導すること が示唆された。
[0093] 2. FACS解析
肝癌細胞 (HuH— 7)とレブリコン細胞を正常マウス IgGまたは 2— 152抗体で反応 させた後、抗マウス IgG— Alexa488 (モレキュラープローブ社）で染色し、 2— 152抗 体が認識する DHCR24の細胞表面での発現を FACS— Caliber (ベタトン'ディツキ ンソン社)で解析した。
[0094] 未固定の細胞でも 2— 152抗体で染色された (染色が強 、細胞ほど右側に反応曲 線が現れる）。特に、レプリコン細胞の表面には HuH— 7細胞よりも DHCR24が多く 表出している事が明ら力となった。
産業上の利用可能性
[0095] 宿主細胞成分である DHCR24に対する抗体を用いることにより、ウィルス遺伝子の 変異等により、これまで有効な治療手段のな力つた C型肝炎の有効な治療が可能と
81
C99CS0/.00Zdf/X3d 19 60/ム00 OAV

Claims

請求の範囲
[1] C型肝炎を治療するための抗 DHCR24抗体。
[2] C型肝炎ウィルス複製を抑制することができる、請求項 1に記載の抗体。
[3] C型肝炎ウィルス複製細胞を障害する、請求項 1に記載の抗体。
[4] 請求項 1〜3の 、ずれか 1項に記載の抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む、 抗ウィルス剤。
[5] C型肝炎ウィルス感染細胞に有効である、請求項 4に記載の抗ウィルス剤。
[6] 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の抗体を C型肝炎の治療に有効な量で投与す ることを含む、 C型肝炎の治療方法。
[7] C型肝炎を治療するための医薬の製造における抗 DHCR24抗体の使用。
[8] C型肝炎の治療に有効な量の抗 DHCR24抗体および使用説明書を含む、 C型肝 炎治療用キット。
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