WO2007085775A2 - Utilisation d'inhibiteurs de 15-lipoxygenase dans le traitement de l'obesite - Google Patents

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WO2007085775A2
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differentiation
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abdominal
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Sébastien BARRADEAU
Sakina Sayah-Jeanne
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Definitions

  • the present application is directed to the treatment of obesity, including visceral abdominal obesity. More specifically, the present application relates to the use of selective 15-lipoxygenase (LO) inhibitors for the preparation of medicaments useful in the treatment of obesity, or at least visceral abdominal obesity, and its consequences.
  • LO 15-lipoxygenase
  • Obesity is a condition characterized by an excess of adipose mass.
  • the Body Mass Index (BMI), which is defined as weight divided by the square of height, expressed in kg / m2, is an international standard for measuring overweight and obesity.
  • L 1 IMC estimates the degree of obesity and thus makes it possible to assess the risks for the health associated with it (see below).
  • An individual is considered obese when this value is greater than or equal to 30 kg / m2.
  • Beside I 1 BMI the body distribution of Adipose Tissue (TA) should also be measured. Indeed, the increase in fat mass in obese subjects occurs mainly at the level of the trunk in the intra-abdominal and perivisceral regions: this is called visceral abdominal TA.
  • the increase in subcutaneous abdominal BP mass is marginal in obese subjects. An increase in the ratio of visceral abdominal TA to subcutaneous abdominal TA is observed. Even individuals who are not obese but develop insulin resistance show an increase in the ratio of visceral abdominal BP to subcutaneous abdominal BP.
  • NCPEP-ATP III National Cholesterol Education Program-Adult Treatment Panel III
  • a waist circumference greater than 88 cm in women, and 102 cm in men indicates visceral abdominal obesity and a higher risk of developing other clinical problems
  • the International Diabetes Federation (IDF) recently reduced critical waist circumference values: values greater than or equal to 94 cm at 80 cm in women (Alberti KG et al., 2005) .
  • This development of visceral abdominal TA is associated with a dramatic increase in the risk of cardiovascular disease (Larsson B et al., 1984) and (Lapidus L et al., 1984)
  • numerous epidemiological and metabolic studies have confirmed the notion that a significant accumulation of TA in the abdominal region constitutes a major risk factor for the development of the metabolic syndrome, type 2, hypertension, gall bladder disease, certain forms of cancer (colon, breast, endometrium), and respiratory complications such as obstructive sleep apnea and asthma, as well as osteo
  • Adipocyte differentiation is the process by which cells move from pre-adipocytes to adipocytes. This differentiation is done in three stages: the hyperplasia of pre-adipocytes (only cells to multiply), the differentiation of pre-adipocytes into adipocytes and finally the accumulation of triglycerides in mature adipocytes during the process of hypertrophy.
  • the increase in adipose mass in adults is essentially by adipocyte hypertrophy, more rarely by hyperplasia.
  • adipocyte differentiation is most often regulated both positively and negatively by factors present in the medium in which the cells are located, such as hormones, cytokines (or adipokines), growth factors, vitamins, etc.
  • adipocyte differentiation is regulated in a coordinated manner by a network of transcription factors. It is initiated by the exit of the cell cycle and the activation of the C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ (CCAAT / Enhancer-Binding Protein) and SREBP-1 factors that induce the expression of the PPARy nuclear receptor (Peroxisome Proliferator-Activated Gamma Receptors). ) (Fajas L et al., 1998).
  • Lipoxygenases are enzymes, identified in plants and animals, that catalyze the oxidation of polyunsaturated fatty acids, including those found in lipoproteins, to hydroperoxy derivatives (Kuhn H and Bomgraber S, 1999). In humans, there are 6 genes coding for lipoxygenases: e-LOX-3 (Epidermis-type lipoxygenase 3), 5-LO (5-lipoxygenase), 12-LO (12-lipoxygenase), 12 ( R) -LOX (12 (R) -lipoxygenase), 15-LO-1 (reticulocyte-lipoxygenase-1 type) and 15-LO-2 (15-lipoxygenase-2).
  • 12-LO and 15-LO respectively convert arachidonic acid to 12 (S) -hydroxyperoxy-5, 8, 10, 14 (Z 1 Z 1 E 1 Z) eicosatetraenoic acid (12 (S) -HPETE) and to 15 (S) -hydroxyperoxy-5,8,10,14 (Z 1 Z 1 E 1 Z) eicosatetraenoic acid (15 (S) -HPETE).
  • the biochemical reduction of 12 (S) -HPETE and 15 (S) -HPETE respectively leads to the formation of 12 (S) -HETE (12- (S) -hydroxy-eicosatetraenoic acid) and 15 (S) -HETE ( 15- (S) -hydroxy-eicosatetraenoic acid) which is the precursor of a class of compounds known as lipoxins (Kuhn H and Bomgraber S, 1999). While arachidonic acid is the exclusive substrate of 15-LO-2 (Brash AR et al., 1997), 15-LO-1 also metabolizes, and preferentially, linoleic acid to 13 (S) acid.
  • human 15-LO-1 produces, in addition to (S) -HETE, small amounts of 12 (S) -HETE (5 to 10% of the final product).
  • 12/15-LO converts arachidonic acid to 12 (S) -HET and 15- (S) -HETE in a ratio of 3: 1 (Kuhn H and Bomgraber S, 1999).
  • rat 12-LO Wanganabe T et al., 1993. Due to their biochemical characteristics, mouse 12/15-LO and rat 12-LO are generally considered to be the functional equivalents of human 15-LO-1 (hereinafter referred to in the text as 12/15).
  • Mouse-1LO and rat 12-LO under the name 12/15-LO).
  • human 15-LO-1 and 15-LO-2 also differ in their tissue distribution.
  • the 15-LO-1 is constitutively expressed in many cell and tissue types with higher levels of expression in reticulocytes, eosinophils, alveolar macrophages, and tracheobronchial epithelial cells.
  • 15-LO-1 has been detected in polynuclear leukocytes, inflammatory tissues, keratinocytes, corneal epithelial cells, endothelial cells of the vascular system, uterus, placenta and various cell types of the system. reproductive system (Kuhn H and Bomgraber S, 1999).
  • the tissue distribution of 15-LO-2 is more limited since its transcripts are detected only in the prostate, lung, skin, cornea and macrophages (Brash AR, Boeglin WE and Chang MS, 1997) (Rydberg EK et al., 2004).
  • 15-lipoxygenase The involvement of 15-lipoxygenase has already been described in several pathologies including atherosclerosis (Harats D et al., 2000), asthma (Shannon VR et al., 1993), cancer (Shureiqi I et al. , 2000, Shureiqi I et al., 2000), glomerulonephritis (Montera A and Badr KF, 2000) and osteoporosis (WO03 / 066048).
  • 15-LO inhibitors has already been described for the treatment of numerous pathologies, for example in patents US2005070589, US2005070588 and US2005065198 for the treatment of atherosclerosis, certain cancers or inflammatory pathologies.
  • the inventors have identified the highly abundant transcriptional expression of 15-lipoxygenase-1 (15-LO-1) in visceral abdominal TA with respect to subcutaneous abdominal TA.
  • the work carried out by the inventors makes it possible to show the potential role that 15-lipoxygenase plays in the development of obesity and especially in adipocyte differentiation and in the development of visceral abdominal obesity.
  • Inhibitors of 15-LO therefore represent an advantageous therapeutic tool in the treatment of obesity and / or its consequences.
  • the present application thus has for object the treatment of obesity, in particular visceral abdominal obesity, and / or its consequences. More specifically, the present application relates to the use of 15-lipoxygenase (LO) inhibitors for the preparation of medicaments useful in the treatment of obesity and / or at least one of its consequences.
  • LO 15-lipoxygenase
  • An object of the invention relates to the use of at least one agent partially or totally inhibiting the expression and / or the activity of 15-LO for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of obesity and / or at least one of its consequences.
  • Another subject of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutically acceptable carrier, at least one agent which partially or totally inhibits the expression and / or the activity of 15-LO, optionally in combination with one or several therapeutic and / or cosmetic active ingredients.
  • the inventors of the present application have shown the role of 15-LO in the development of obesity, and especially in adipocyte differentiation and in the development of visceral abdominal obesity.
  • An object of the invention therefore relates to the use of at least one agent that partially or totally inhibits the expression and / or the activity of 15-LO for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of obesity , preferably visceral abdominal obesity, and / or at least one of its consequences.
  • 15-LO designates 15-LO-1 and / or 15-LO-2, preferably 15-LO-1.
  • said agent partially or totally inhibiting the expression and / or the activity of the 15- LO is an agent that partially or totally inhibits the expression and / or activity of 15-LO-1.
  • obesity is characterized by a waist circumference greater than or equal to 80 cm in women and 94 cm in men and / or a BMI greater than or equal to 30 kg / m 2 .
  • a BMI greater than or equal to 27 kg / m 2 is the threshold from which there is a marked increase in the risk of cardiovascular disease.
  • the subject of the invention is the use of at least one agent that partially or totally inhibits the expression and / or the activity of 15-LO for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of obesity, preferentially visceral abdominal obesity.
  • the term "consequences of obesity” means type 2 diabetes and / or cardiovascular diseases, hypertension, vesicular bile diseases, certain forms of cancer (colon, breast, endometrium), respiratory complications such as obstructive sleep apnea and asthma as well as osteoarthritis and locomotor problems.
  • the agents that partially or totally inhibit the expression and / or activity of 15-LO can be compounds of various nature, structure and origin, in particular biological compounds, nuclear factors, antibodies, cofactors, chemical compounds of synthetic or natural origin, etc. It can also be banks, including chemical libraries or libraries of proteins, peptides or nucleic acids, etc.
  • the inhibition of enzyme activity refers to a lower measured activity, compared to a control activity measured without treatment with the agent inhibiting the activity of 15-LO.
  • Inhibition of expression refers to a lower measured expression compared to a control expression measured without treatment with the agent inhibiting the activity of 15-LO.
  • the inhibition of the expression and / or activity of 15-LO can be partial or complete.
  • Total inhibition of the expression and / or activity of 15-LO by an inhibitory agent corresponds to expression and / or activity of the
  • 15-LO decreased by at least 80% relative to an expression and / or activity measured without treatment with the inhibitory agent. Partial inhibition by an inhibitory agent corresponds to a decrease in expression and / or activity of 15-LO less than 80% compared to expression and / or activity measured without treatment with the inhibitory agent.
  • the agent partially or totally inhibiting the expression and / or the activity of 15-LO is a compound capable of totally or partially inhibiting the activity of 15-LO. .
  • the subject of the invention is also the use of at least one compound capable of partially or totally inhibiting the activity of 15-LO for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of obesity, preferentially for visceral abdominal obesity, and / or at least one of its consequences. Even more preferably, the invention relates to the use of a compound capable of partially or completely inhibiting the activity of 15-LO to inhibit adipocyte differentiation.
  • the terms "compound capable of inhibiting the activity of 15-LO” or “15-LO inhibitor” preferably denote a 15-LO inhibiting compound with an IC 50 of less than or equal to 1 ⁇ M, preferentially less than or equal to 100 nM.
  • UIC50 represents the concentration of the test compound giving a 50% decrease in the maximal enzyme activity observed. IC50 can be determined by standard methods known to those skilled in the art. In particular, a colorimetric assay allows this measurement: a potential inhibitor of 15-LO is preincubated with 15-LO for 10 minutes before the addition of linoleic acid as substrate and then incubated for another 10 minutes.
  • the formation of the 13 (S) -HPODE product is quantified by coupling the reduction of the hydroperoxidized lipid to the oxidation of N-benzoyl-leucomethylene blue in the presence of hemine at pH 5.
  • the absorbance of oxidized methylene blue is directly proportional to the amount of 13 (S) -HPODE formed by 15-LO (Auerbach BJ et al., 1992).
  • Those skilled in the art may consider other assays, including assays in which the initial enzymatic reaction is determined spectrophotometrically at 234 nm by measuring conjugated diene formation (Gan QF et al., 1996) or a colorimetric assay.
  • the compounds used in the present invention are those which partially or totally inhibit the activity of 15-LO selectively.
  • the term "selectively” refers to a compound that inhibits the activity of 15-LO with a lower IC50 of at least 5-fold, preferably at least 10-fold and even more preferably at least 100-fold, to that observed for other lipoxygenases and cyclooxygenases.
  • the IC50 of a selective inhibitor of 15-LO may be greater than or equal to 1 ⁇ M.
  • the 15-LO inhibitor is selective and has an IC 50 less than or equal to 1 ⁇ M.
  • 15-LO inhibitors include synthetic organic molecules, plant extracts and other natural products as well as antibodies directed against 15-LO or antisense molecules.
  • the literature describes numerous 15-LO inhibitors with an IC50 less than or equal to 1 ⁇ M.
  • the patent literature also describes numerous 15-LO inhibitors such as the fermented Glycine max (L.) extract described in EP1512407, the 15-LO inhibiting compounds described in WO01 / 96336, the compounds of imidazolyl, pyrazolyl, oxazolyl and thiazolyl described respectively in US2005070588, US2005070589 and US2005065198 or the pyrazole compounds described in WO2004080999, especially Examples 8, 14, 23 and 26.
  • 15-LO inhibitors such as the fermented Glycine max (L.) extract described in EP1512407, the 15-LO inhibiting compounds described in WO01 / 96336, the compounds of imidazolyl, pyrazolyl, oxazolyl and thiazolyl described respectively in US2005070588, US2005070589 and US2005065198 or the pyrazole compounds described in WO2004080999, especially Examples 8, 14, 23 and 26.
  • the 15-LO inhibitors used in the context of the present invention have an IC50 of less than or equal to 1 ⁇ M.
  • the inhibitor used in the context of the present application is selective with respect to 15-LO.
  • the subject of the invention is thus the use of the following selective inhibitors for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of obesity, preferentially of visceral abdominal obesity, and / or at least one of its consequences:
  • the selective inhibitor used in the context of the present application is PD146176 or N - ((4-n-pentylbenzene) sulfonyl) -2- (benzofuran-2-yl) tryptamine.
  • These agents partially or completely inhibiting the activity of 15-LO also include antibodies having affinity for 15-LO, or anti-15-LO antibodies.
  • this antibody has a blocking power and totally or partially inhibits the activity of 15-LO.
  • the invention thus relates to the use of at least one antibody that partially or totally inhibits the activity of 15-LO for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of obesity, preferentially visceral abdominal obesity, and / or at least one of its consequences.
  • the antibodies may be monoclonal or polyclonal antibodies obtained by any method known to those skilled in the art.
  • Said antibodies monoclonals can be obtained according to the conventional method of lymphocyte fusion and hybridoma culture or by any other method for the preparation of known monoclonal antibodies.
  • Said polyclonal antibodies may be obtained from serum of an immunized animal, in particular from a vertebrate and preferably from a mammal with any of the identified polypeptide sequences or one of their fragments preserving the immunogenicity of the total protein.
  • the agent partially or totally inhibiting the activity and / or expression of 15-LO is a compound capable of partially or completely inhibiting the expression of 15-LO by inhibiting partially or completely the transcription of the gene encoding 15-LO.
  • the invention thus relates to the use of at least one compound capable of partially or completely inhibiting the expression of 15-LO for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of obesity, preferably visceral abdominal obesity, and / or at least one of its consequences.
  • the agents partially or completely inhibiting the expression of the 15-LO used in the present application are the antisense nucleic acids.
  • Antisense therapy generally employs a vector, such as a viral vector, which carries the antisense sequence of the mRNA encoding the protein whose expression is to be inhibited, the inhibition then being generally stable since the vector is integrate into the genome.
  • Antisense oligonucleotides can also be used, which provide transient inhibition of expression.
  • Ribozyme or interfering RNA (siRNAs) technology which prevents a gene from producing a functional protein by destroying messenger RNA, can also be used.
  • a particular object of the invention relates to the use of at least one agent that partially or totally inhibits the expression and / or activity of the 15-LO of selectively for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of obesity.
  • Another subject of the invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutically acceptable carrier, at least one agent that partially or totally inhibits the expression and / or activity of 15-LO as described above. , optionally in combination with one or more other therapeutic and / or cosmetic active ingredients.
  • compositions for the treatment of obesity preferably visceral abdominal obesity, and / or at least one of these consequences.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can also be used to inhibit adipocyte differentiation.
  • the other therapeutic and / or cosmetic agents may be chosen from:
  • anti-inflammatory agents anti-oxidizing agents
  • corticosteroids used in the treatment of skin pathologies
  • vasodilators and / or anti-ischemic agents are included in the composition according to the invention.
  • these other optional therapeutic agents and / or their quantity, such that the advantageous properties of the composition according to the invention are not, or not substantially impaired.
  • compositions according to the invention advantageously comprise one or more excipients or vehicles, which are pharmaceutically acceptable and are well known to those skilled in the art.
  • the modes and routes of administration and the doses may be adapted by those skilled in the art depending on the patient and the disturbance to be treated.
  • the level of dosage chosen will depend on various factors including the activity of the particular compound used, the mode of administration, the duration of administration, the rate of excretion of the particular compound being used, the duration of the treatment, other drugs, compounds and / or materials used in combination with the agent partially or totally inhibiting the expression and / or activity of the particular 15-LO used, age, sex, weight , state, general health and medical history of the patient being treated and other factors well known in the medical profession.
  • Those skilled in the art can easily determine and prescribe the required amount of the pharmaceutical composition. For example, it may start with doses of agent partially or completely inhibiting the expression and / or activity of 15-LO in the pharmaceutical composition at levels lower than those required to achieve the desired therapeutic effect and increase gradually the dosage until the desired effect is obtained.
  • the invention finally relates to a method of treating obesity, preferably visceral abdominal obesity, comprising administering to a subject, in particular human, an effective amount of at least one compound or a pharmaceutical composition as defined above.
  • an effective amount refers to an amount of the compound sufficient to produce the desired biological result, preferably nontoxic.
  • subject means a mammal and more particularly a human.
  • treatment refers to curative, symptomatic or preventive treatment.
  • Agents partially or completely inhibiting the expression and / or activity of 15-LO used in the present invention can be used in humans with a declared disease, including the early and / or late stages of the disease.
  • Agents partially or completely inhibiting the expression and / or activity of 15-LO used in the present invention do not necessarily cure the patient with the disease, but may delay or slow progression or prevent progression. further ahead of the disease, thereby improving the condition of patients.
  • Agents partially or completely inhibiting the expression and / or activity of 15-LO used in the present invention may also be administered to non-diseased individuals, but who may develop the disease normally, or who have a significant risk of developing disease.
  • Treatment also includes delaying the development of the disease in an individual who develops the disease or is at risk of developing the disease because of age, family history, genetic or chromosomal abnormalities, and / or one or more biological marker (s) of the disease, such as a known genetic mutation, in tissues or fluids.
  • the treatment also includes administering an agent partially or fully inhibiting the expression and / or activity of 15-LO used in the present invention to individuals who are thought to be predisposed to developing obesity, and preferably visceral abdominal obesity.
  • FIGURES Figure 1 is a gel photograph showing the expression of 15-LO-1, by
  • RT-PCR in the visceral and subcutaneous abdominal adipose tissue (TA) of a population of 10 men.
  • SC abdominal CT subcutaneous
  • V TA visceral abdominal.
  • Figure 2A is a graph showing the expression of 5-LO, 12-LO and
  • FIG. 2B is a graph comparing the relative expression of 5-LO, 12-LO and 15-LO-1 in the visceral and subcutaneous abdominal TA of a population of
  • Figure 2C is a graph showing the expression of 15-LO-1 in the visceral and subcutaneous abdominal TA of a population of 83 patients:
  • Figure 3A is a gel photograph showing the expression of 15-LO-1 by RT-PCR on visceral abdominal TA fractions of a patient.
  • PA Pre-Adipocyte
  • fA Mature adipocyte
  • SV Vascular Stroma
  • MC Cellular Matrix.
  • Figure 3B is a graph showing the expression of 15-LO-1 by RT-QPCR on TA fractions of a patient.
  • Figure 4A is a gel photograph showing the expression of 15-LO-1 during the differentiation of promocell human visceral pre-adipocytes (PA)
  • Figure 4B are graphs showing the expression of 15-LO-1 during the differentiation of 3 different cultures of human visceral PA,
  • FIG. 5A is a gel photograph showing the expression of the aP2 marker by RT-PCR on the 3rd day of differentiation of a culture of human visceral PA (PA culture No. 1, passage 7) in the absence or in the presence of increasing doses of a selective 15-LO inhibitor, PD146176.
  • Figure 5B show graphs showing the expression of aP2 marker by RT-QPCR on the 7th day of differentiation of two cultures of human visceral PA (PA culture No. 2, passage 5 and PA culture No. 3, transition 4), in the absence or in the presence of increasing doses of a selective 15-LO inhibitor, PD146176.
  • Figure 6A is a graph showing the secretion of adiponectin during differentiation of visceral abdominal PAs (Culture of PA No. 3, passage 4).
  • Figure 6B is a graph showing the secretion of adiponectin in the 7 th day of differentiation in the presence of PD146176 (Culture of PA 3, passage 4).
  • Figure 7A is a gel photograph showing the tissue expression of 12/15-LO, functional equivalents in rodents of human 15-LO-1, in rats and mice by RT-PCR.
  • 1 perirenal TA
  • 2 epididymal TA
  • 3 liver
  • 4 heart;
  • Figure 7B is a graph showing the expression of 12/15-LO in the different rat TA deposits by RT-QPCR.
  • 1 subcutaneous dorsal TA
  • 2 abdominal subcutaneous TA
  • 3 omental TA
  • 4 mesenteric TA
  • 5 epididymal CT
  • Figure 8A is photographs showing the effect of PD146176 on 3T3-L1 cell morphology during adipocyte differentiation.
  • Figure 8B is a graph showing the effect of PD146176 on lipid accumulation by 3T3-L1 cells during adipocyte differentiation: Adipored measurement.
  • Figure 8C is a graph showing the effect of PD146176 on triglyceride accumulation by 3T3-L1 cells during adipocyte differentiation.
  • Figure 8D is graphs showing the effect of PD146176 on the expression of aP2 and LPL (LipoProtein Lipase) by 3T3-L1 cells during adipocyte differentiation.
  • aP2 and LPL LipoProtein Lipase
  • Figure 9A is photographs showing the effect of caffeic acid on the morphology of rat PA during adipocyte differentiation.
  • Figure 9B is a gel photograph showing the effect of caffeic acid on the expression of aP2 by rat PAs during adipocyte differentiation.
  • Figure 10A is a graph showing the effect of overexpression of human 15-LO-1 on intracellular triglyceride accumulation during adipocyte differentiation of 3T3-L1 cells.
  • FIG. 10B is graphs showing the effect of overexpression of human 15-LO on the expression of aP2, C / EBP ⁇ and adiponectin during adipocyte differentiation of 3T3-L1 cells.
  • Figure 10C is a graph showing the effect of overexpression of human 15-LO on adiponectin secretion during adipocyte differentiation of 3T3-L1 cells.
  • White bars cells transfected with plasmid pBlueScript SKII +; black bars: cells transfected with plasmid aP2-15-LO; *** value p ⁇ 0.001.
  • FIG. 11A is a graph showing the evolution of the weight gain of mice deficient for the 12/15-LO gene (hereinafter referred to as LOKO mice) and C57BI / 6J mice subjected to a standard or hyperlipidic diet which leads to obesity or also called DIO (Diet induced obesity).
  • LOKO mice the 12/15-LO gene
  • DIO Diet induced obesity
  • FIG. 11B is a graph representing the proportion of the fat mass of the LOKO and C57BI / 6J mice subjected to a standard or hyperlipidic diet.
  • Figure 11C shows graphs showing epididymal and perirenal adipose tissue mass of LOKO and C57BI / 6J mice fed a standard or hyperlipidic diet.
  • Figure 11D corresponds to photographs of histological sections of epididymal adipose tissue of LOKO and C57BI / 6J mice subjected to a standard or hyperlipidic diet.
  • Figure 11E shows graphs showing the average adipocyte size of epididymal adipose tissue of LOKO and C57BI / 6J mice fed a standard or hyperlipidic diet.
  • EXAMPLE 1 Demonstration of the specific overexpression of the 15-L0-1 gene in the human visceral abdominal adipose tissue (TA) with respect to the human subcutaneous abdominal TA of a population of 10 men by flea technique to DNA and by RT-PCR.
  • TA visceral abdominal adipose tissue
  • DNA microarrays are performed to compare visceral abdominal TA RNA expression with subcutaneous abdominal TA mRNA expression of 10 men (see Table 1 for clinical data of patients).
  • cDNA double-stranded complementary DNAs
  • SS Superscript
  • SS choice system buffers Invitrogen, Cergy Pontoise, France
  • oligo-T primers - 7 (dt) 24 (MWG Biotech).
  • cRNAs biotinylated complementary RNAs
  • DNA microarray experiments are performed on Affymetrix-U133A and U133B chips: hybridization, washing, tagging and flea scanning are performed according to the instructions in the Affymetrix Technical Manual (P / N 700222 rev.4) .
  • the signals are visualized and quantified with the software "microarray analysis suite v4 software".
  • the predictive statistical analysis model AIC Alkaike Information Criterion
  • predictive statistical analysis BIC Bayesian Information Criterion
  • RNA is reverse-transcribed by incubation for 1 hour at 37 ° C. with 200 ng of random hexanucleotides and 200 units of MMLV enzyme (Sigma) in the presence of 1.5 mM DTT, 187 ⁇ M of dNTP and Rnase inhibitor units.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the cDNA 15-LO-1 is then amplified by PCR on 1 ⁇ l of RT mixtures thus obtained with 0.3 mM of specific primers (see Table 2 for the primers used), 2.5 units of the enzyme.
  • PLATINIUM Pfx DNA polymerase Invitrogen, 11708-039), 1 mM MgSO 4 and 0.3 mM of each dNTP in a final volume of 20 ⁇ l.
  • the amplification conditions are 30 s at 94 ° C. (denaturation), 30 s at the specific hybridization temperature for each pair of primers and 1 min / kb at 68 ° C. for extension.
  • the PCR products obtained are analyzed by agarose gel electrophoresis to confirm the presence of a single amplicon of the right size and sequenced to confirm homology to the amplified gene.
  • results of the RT-PCR analysis confirm the preferential expression of 15-LO-1 in the visceral abdominal TA of the patients with respect to the subcutaneous abdominal TA for each patient studied: indeed , with the exception of patient 41, the expression of 15-LO-1 is virtually undetectable by conventional RT-PCR in the subcutaneous abdominal CT while an amplicon is observed in the visceral abdominal CT of all patients. .
  • Example 2 Confirmation of the specific expression of the 15-LO-1 gene in human visceral abdominal TA versus subcutaneous abdominal TA human, by quantitative PCR on a population of 83 patients, and selectivity of this specific expression compared to other lipoxygenases.
  • Results from the microarray technique were confirmed on visceral and subcutaneous abdominal TA of a population of 83 patients (see Table 4 for clinical data of patients). The tissues were removed and the RNAs extracted as described in Example 1.
  • the QPCRs are made by Sybergreen incorporation according to the supplier's instructions (SyberMix Biorad, Marnes la Coquette, France) and the IQ-Cycler device (Biorad).
  • the use of primers was optimized in terms of specificity and efficiency (> 90%) via the analysis of standard curves and melting curves obtained on serial dilutions of RT samples.
  • the RT-PCR products obtained were analyzed by agarose gel electrophoresis to confirm the presence of a single amplicon of the good size and sequences to confirm homology to the amplified gene.
  • the QPCRs are carried out on 1 ⁇ l of RT as described in Example 1: the relative expression of 5-LO, 12-LO and 15-LO-1 is compared with the expression of the cyclophillin gene, considered as an internal control.
  • AIC and BIC analyzes The AIC predictive model and the BIC predictive analysis show a positive correlation between 15-LO-1 expression and visceral abdominal BP (Table 6).
  • Table 6 Correlation to clinical data - results of AIC and BIC analyzes.
  • This additional validation work is carried out on a larger and more heterogeneous patient population in line with our scientific theme (broader range of BMI, etc.).
  • the evaluation of the quality of the model involves the measurement of a score, the process stops when the addition or the deletion of variables no longer improves the score.
  • Two types of scores are used here, the AIC score (Akaike Information Criterion) which leads to a larger final model given a predictive approach to the data and the BIC score (Bayesian Information Criterion) which proposes a simpler final model of an explanatory approach to the variability contained in the data. Only very significant variables (p-value ⁇ 10-6) were considered in the final models proposed by this advanced statistical approach.
  • the AIC predictive model as well as the BIC predictive analysis show a positive correlation between 15-LO-1 expression and visceral abdominal TA.
  • Example 3 The expression of 15-LO-1 is detected in the various fractions of human TA, including in adipocytes and in pre-adipocytes, and appears as a majority in the stromal-vascular fraction.
  • TA samples were taken as described in Example 1. After removal of the skin and blood vessels, TA pieces for tissue fractionation were immediately rinsed in PBS solution supplemented with a penicillin / streptomycin mixture (100 U). / 100 ⁇ g / ml) at 37 ° C., and then incubated in Falcon tubes in a digestion buffer (Krebs Ringer buffer) 9.5 g / l; 25 mM Hepes; bovine serum albumin 20 mg / ml; 5 mM Glucose (Sigma); collagenase type I 1, 5 mg / ml, (Gibco)), for 45 minutes, at 37 ° C., with stirring, with a mass ratio of TA / digestion buffer of 1 g / 10 ml.
  • a digestion buffer Kerbs Ringer buffer
  • the pellet is resuspended in 5 ml of erythrocyte lysis buffer (131 mM Carlo-Erba NH4Cl, 9 mM NH4CO3, Prolabo Rectapur) and incubated for 15 minutes on ice in this solution.
  • RNAs from the SV fraction The other part of the suspension is incubated on ice for 15-30 minutes, with CD14 magnetic microbeads (CD14 MicroBeads, non-human primate: MicroBeads conjugated to a human anti-CD14 IgG2a monoclonal antibody).
  • the cell suspension is then loaded onto a MACS® column in order to harvest the CD14 + cells corresponding to the monocyte / macrophage fraction of the TA, by using a MACS Separator magnetic column.
  • the CD14 + cells retained magnetically on the column are then eluted according to the protocol of the supplier (Macs, Miltenyi Biotec, Paris, France).
  • the cell fraction not retained by the column is depleted of CD14 + cells and enriched in pre-adipocytes and other cell types and will be considered as the enriched pre-adipocyte (PA) fraction.
  • PA pre-adipocyte
  • RNAs are extracted from the different fractions (MC, fA, SV, CD14 +, PA) by direct homogenization with Trizol according to the supplier's recommendations (Gibco BRL, Life Technologies), then treated with DNAse I and purified on a column according to the procedure. described by Qiagen (Qiagen Rneasy procedure). Analysis of the expression of 15-LO-1 by RT-PCR and RT-QPCR The relative expression of 15-LO-1 is analyzed according to the methods described in Examples 1 and 2. Results
  • results of the analysis of 15-LO-1 expression of a patient show that the expression of 15-LO-1 is found in the visceral abdominal TA pool and this expression is detected in all visceral abdominal TA fractions, with greater expression in the Stroma-Vascular (SV) fraction, which contains PAs and CD4 + cells (macrophages), and lower expression in mature adipocytes (fA).
  • SV Stroma-Vascular
  • fA mature adipocytes
  • EXAMPLE 4 The expression of 15-LO-1 is modulated during the differentiation of human visceral PAs into mature adipocytes.
  • the human visceral abdominal PAs are obtained from Promocell or Cambrex (Human White pre-adipocytes (HWP), Promocell (Heidelberg, Germany), Cambrex (Paris, France)) and grown according to the supplier's protocol.
  • Promocell HWP are maintained in a growth medium for PA (0.4% ECGS / H, 5% FCS, 10 ng / ml EGF, 1 ⁇ g / ml Hydrocortisone, 50 ng / ml Amphotericin B, 50 ⁇ g / ml Gentamicin ) until confluence.
  • the cells are differentiated for 3 days with a differentiation medium for PA (8 ⁇ g / ml d-Biotin, 0.5 ⁇ g / ml recombinant human insulin, 400 ng / ml Dexamethasone, 44 ⁇ g / ml IBMX, 9 ng / ml L-thyroxine, 3 ⁇ g / ml Ciglitazone, 50 ng / ml Amphotericin B, 50 ng / ml Gentamycin), then cultured to the terminal differentiation stage in a fat cell nutrition medium (3% FCS, 8 ⁇ g / ml d -Biotin, 0.5 ⁇ g / ml recombinant human insulin, 400 ng / ml Dexamethasone, 50 ng / ml Amphotericin B, 50 ⁇ g / ml Gentamicin).
  • a differentiation medium for PA 8 ⁇ g / ml d-Biot
  • the Cambrex PAs are maintained in a growth medium for PA (10% FCS, 100 U / ml Penicillin, 100 ⁇ g / ml Streptomycin) until confluence and then the medium is replaced by a differentiation medium (10% FCS, 10 ⁇ g / ml recombinant human insulin, 1 ⁇ M Dexamethasone, 500 ⁇ M IBMX, 200 ⁇ M indomethacin, 100 U / ml Penicillin, 100 ⁇ g / ml Streptomycin) throughout the differentiation process .
  • a growth medium for PA (10% FCS, 100 U / ml Penicillin, 100 ⁇ g / ml Streptomycin) until confluence and then the medium is replaced by a differentiation medium (10% FCS, 10 ⁇ g / ml recombinant human insulin, 1 ⁇ M Dexamethasone, 500 ⁇ M IBMX, 200 ⁇ M indomethacin, 100 U / ml Penicillin, 100
  • the total RNAs are extracted from the cells at different times during the differentiation according to the method described in Example 3 and the expression of 15-LO-1 is analyzed by RT-PCR and RT-QPCR according to the methods described in the examples. 1 and 2.
  • the kinetics of expression of the aP2 gene is used as a positive control of cell differentiation (see Table 7).
  • RT-QPCRs the relative expressions of 15-LO-1 and aP2 are reported relative to the confluence day considered as OJ and normalized to the expression of cyclophillin.
  • the expression of the marker aP2 (adipocyte lipid binding protein) is very low at OJ, increases very strongly at D3 until D7-D14, and then decreases at D21.
  • 15-LO-1 increases on D3, then follows the same kinetics as that of the aP2 gene with an increase in expression during differentiation until D14, then a decrease on D21.
  • 15-LO-1 is always expressed in adipocyte state (J21).
  • Figure 4B shows the expression of 15-LO-1 during the differentiation of 3 different cultures of human visceral abdominal PA: modulation of 15-LO-1 expression during adipocyte differentiation is observed on 3 independent cultures, from 3 different patients (visceral PAs were differentiated from passage 7, 2 or 4 according to PA cultures).
  • the expression of the marker aP2 increases progressively and very strongly during the differentiation until J7, then decreases to J14, J21.
  • the expression of 15-LO-1 increases during the differentiation process but much less.
  • the peak expression of 15-LO-1 at D3 is found in 2 patients.
  • the same kinetics of expression is found for culture No. 1 at passage 4 (FIG. 4A) and at passage 7 (FIG. 4B). In the adipocyte state, 15-LO-1 is always expressed.
  • Example 5 PD146176, a selective inhibitor of 15-LO, inhibits the differentiation of human visceral PA into mature adipocytes.
  • adipocyte lipid-binding protein is, just like adiponectin, a marker of adipocyte differentiation.
  • RNAs are extracted from cells at different times during differentiation (J3, J7) according to the method described in Example 3 and the expression of the aP2 marker is analyzed by RT-PCR or RT-QPCR as described in Examples 1 and 2. The relative expressions are reported with respect to the confluence day considered as OJ and normalized relative to to the expression of cyclophillin. Results
  • FIGS. 5A and 5B show that the expression of the aP2 marker, analyzed by RT-PCR and RT-QPCR during the differentiation of PA cultures, decreases in a dose-dependent manner following the addition. from PD146176.
  • Example 6 PD146176, a selective inhibitor of 15-LO, decreases adiponectin secretion during differentiation of human visceral PAs.
  • Adiponectin is a factor secreted by adipocytes and, like P2, serves as a marker of adipocyte differentiation in our cultures.
  • the concentration of adiponectin is determined in culture supernatants at different times of differentiation, using the Quantikine human adiponectin / ACRP30 kit according to the supplier's protocol (R & D, Minneapolis, USA). Results
  • Figure 6A shows that secretion of adiponectin in the culture supernatant increases during differentiation of human visceral abdominal PAs, with a peak of secretion at J7.
  • Example 7 12/15-LO, functional equivalent of 15-LO-1 in rodents, is mainly expressed in TA in rats and mice, and its expression is stronger in mesenteric, epididymal and perirenal TA only in the abdominal CT subcutaneous.
  • mice and Sprague Dawley rats (Charles River Laboratories) are subjected to a standard day / night cycle and fed ad libitum with rodent feed.
  • Sprague Dawley rats are sacrificed by pentobarbital injection and the mice are sacrificed by cervical dislocation after isoflurane anesthesia
  • the different TA deposits are taken (subcutaneous abdominal TA, dorsal subcutaneous TA, omental TA, mesenteric TA, perirenal TA, epididymal TA and interscapular TA), cut into small pieces and directly transferred into liquid nitrogen.
  • the total RNAs of the tissues other than TA are extracted according to the method described in Example 3.
  • the total RNAs of TA are extracted according to the method described in Example 1.
  • the RTs are carried out as described in Example 1 and the expression of the rodent 12/15-LO (see Table 8) is analyzed by RT-PCR or RT-QPCR as described in Examples 1 and 2.
  • the analysis of the expression of 12 / 15Lox in the different TA deposits in the rat shows, in FIG. 7B, that its expression is confirmed in the TA.
  • the expression is arbitrarily set at 1 in the dorsal subcutaneous abdominal TA. As in humans, the expression is less important in the abdominal TA subcutaneous (abdominal and dorsal) compared with deep BP such as omental TA, mesenteric TA, epididymal BP and perirenal TA. Expression of 12/15-LO is preferential for TA since low expression in brown TA tissue (interscapular TA) is observed compared to other deposits.
  • Example 8 PD146176, an inhibitor of 15-LO, inhibits the differentiation of 3T3-L1 cells into adipocytes.
  • mice PA3T3-L1 (ATCC) cell line Culture of 3T3-L1 cells and differentiation into adipocytes
  • the mouse PA3T3-L1 (ATCC) cell line is maintained in medium
  • the progressive accumulation of intracellular droplets is also used as a functional marker of differentiation into adipocytes.
  • differentiation of 3T3-L1 cells is performed in 96-well plates. On the day of reading, the plates are removed from the incubator to allow a return to ambient temperature. The medium is removed, the cells are carefully rinsed with 200 ⁇ l of PBS, and then 200 ⁇ l of PBS are added to each well. 5 ⁇ l of Adipored reagent (Cambrex, Paris, France) are added to each well and the plates are mixed before reading. The fluorescence is measured with a fluorimeter by excitation at 485 nm and emission at 535 nm. Determination of triglycerides
  • RNA extraction and analysis of LPL and aP2 expression by RT-QPCR are performed in a 24-well plate.
  • the cells are scraped, transferred to a tube and lysed by sonication for 10 seconds at 40 watts.
  • the lysate obtained is filtered on a 0.2 ⁇ M millipore filter.
  • the assay is carried out on 125 ⁇ l of the lysate obtained, using the "Triglyceride L-type" kit (Wako).
  • the assay is normalized with respect to the amount of protein present in the lysates.
  • RNAs are extracted at different times of the differentiation according to the method described in Example 3 and the expressions of the aP2 and LPL (lipoprotein lipase) genes are analyzed by RT-QPCR according to the method described in Example 2 (see FIG. Table 9).
  • FIG. 8A The change in the morphology of 3T3-L1 cells during adipocyte differentiation is presented in FIG. 8A: the acquisition, during the differentiation, of the morphology of adipocytes rich in lipid droplets (with appearance of the droplets J7).
  • the addition of PD146176 to OJ causes a dose-dependent inhibition of lipid accumulation in the cells, the droplets being fewer and smaller.
  • Figure 8B shows that, during differentiation, Adipored labeling progressively increases to 5000 RLU on day 14, corresponding to lipid accumulation by 3T3-L1.
  • Adipored of dose-dependent manner from the 3 rd day of differentiation The inhibition is always observed on day 7 and is even more marked after 14 days of differentiation where the cells having received 10 ⁇ M of PD146176 have an Adipored labeling corresponding to that observed at OJ.
  • FIG. 8C The accumulation of triglycerides by 3T3-L1 cells during adipocyte differentiation is shown in FIG. 8C: during differentiation, 3T3-L1 cells are gradually loaded into triglycerides. This increase follows exactly the same kinetics as observed with Adipored ( Figure 8B). The addition of PD146176 to OJ decreases this accumulation in a dose-dependent manner with a decrease of 80% at D10 compared to control for the highest dose (10 ⁇ M).
  • Example 9 Caffeic acid inhibits the differentiation of primary rat PA into mature adipocytes.
  • the cells of the SV fraction (the isolation technique of the fraction is identical to that described in Example 3) are seeded in 6-well plates at a density of 80,000 cells / cm 2 in the medium. (Gibco) supplemented with 10% FCS and Penicillin / Streptomycin. After 16 hours of incubation for cell adhesion, the wells are gently rinsed with PBS to remove what has not adhered. The cells are cultured until confluence.
  • medium 199 is removed and replaced by ITT medium (DME / Ham's F12, 15mM NaHCO3, 15mM Hepes, 33 ⁇ M biotin, 17 ⁇ M panthotenate, 0.5 ⁇ M human insulin, 0.2nM Triiodothyronine and antibiotics) without addition of serum.
  • ITT medium DME / Ham's F12, 15mM NaHCO3, 15mM Hepes, 33 ⁇ M biotin, 17 ⁇ M panthotenate, 0.5 ⁇ M human insulin, 0.2nM Triiodothyronine and antibiotics
  • the cells are maintained in this medium to allow differentiation.
  • the medium is changed every 2-3 days during the differentiation process. Treatment of cells with caffeic acid
  • the caffeic acid (2.2 ⁇ M) is added when the rat PAs reach confluency (OJ) and is maintained during the process of differentiation into adipocytes.
  • OJ confluency
  • caffeic acid is considered a selective inhibitor of 15-LO (Shureiqi I, Chen D, Lee JJ, Yang P, Newman RA, Brenner DE, Lotan R, Fischer SM and Lippman SM, 2000).
  • DMSO is added at the final 0.1% concentration in the culture medium as a negative control.
  • RNAs are extracted at different times of the differentiation according to the method described in Example 3 and the expressions of the aP2 and LPL genes are analyzed by quantitative RT-PCR according to the method described in Example 2 (see Table 10). .
  • Figure 9A shows the effects of caffeic acid on the morphology of rat PA during adipocyte differentiation: as for 3T3-L1 cells, rat PAs gradually change morphology during the process of adipocyte differentiation to acquire a lipid-rich lipid-rich adipocyte morphology (with the appearance of droplets as early as D5) and the addition of caffeic acid at the dose of 2.2 ⁇ M at OJ causes an inhibition of the accumulation of lipids in the cells (fewer droplets and smaller).
  • Figure 9B shows the effects of caffeic acid on aP2 expression by rat PAs during adipocyte differentiation: as had been observed for human PAs or 3T3-L1 cells, the expression aP2 increases during differentiation of rat PA, this as of J3 (comparison of control points OJ and J3) and the addition of caffeic acid at the dose of 2.2 ⁇ M from OJ decreases the expression of the aP2 to J3, correlating with observations made under a microscope ( Figure 9A).
  • Example 10 Overexpression of human 15-LO in 3T3-L1 cells stimulates adipocyte differentiation.
  • the 3T3-L1 cells are cultured as described in Example 8.
  • 3.10 5 suspended cells / ml are transiently transfected with 2 ⁇ g of plasmid encoding human 15-LO under the control of the aP2 promoter. (plasmid ap2-15-LO) or plasmid pBlueScript SKII + as a negative control using the kit "jetPEl TM" according to the conditions recommended by the supplier (Polyplus transfection).
  • 1 ml of transfected cells are seeded in 12-well plates for the extraction of RNA and 100 ⁇ l in 96-well plates for the determination of intracellular triglycerides. 2 days after transfection, the cells are differentiated into mature adipocytes as described in Example 8. Determination of triglycerides
  • the accumulation of intracellular triglycerides at different times of the adipocyte differentiation process of the transfected 3T3-L1 cells is determined according to an improvement of the protocol of the "TG PAP 10003" kit from bioMérieux SA (France). Briefly, the cells are incubated with 20 ⁇ l of isopropanol for 30 min at room temperature. 100 ⁇ l of triglyceride reagent are added to each well and the plates are incubated for 30 min at 37 ° C. The absorbance is measured using a spectrophotometer at 492 nm. RNA extraction and analysis of the expression of aP2. of C / EBP ⁇ and adiponectin by RT-QPCR
  • RNAs are extracted at different times of differentiation according to the method described in Example 3 and the analysis of the expression of the markers of adipocyte differentiation aP2, C / EBP ⁇ and adiponectin are analyzed by RT-QPCR according to the method described in Example 2 (see Table 11).
  • adiponectin serves as a marker of adipocyte differentiation in cultures.
  • the concentration of adiponectin is determined in the culture supernatants at different times of differentiation using the DuoSet® ELISA mouse adiponectin / ACRP30 kit according to the supplier's protocol (R & D, Minneapolis, USA).
  • FIG. 10A The accumulation of triglycerides by the transfected 3T3-L1 cells during adipocyte differentiation is shown in FIG. 10A: During differentiation, the transfected cells progressively load into triglycerides. From day 7 of differentiation, 15-LO overexpressing cells significantly accumulate about 2-fold more triglycerides than cells transfected with the pBlueScript SKII + control plasmid.
  • Example 11 Mice deficient for 12/15-LO are resistant to obesity induced by a high fat diet.
  • mice deficient for the 12/15-LO gene in a C57BI / 6J genetic background were obtained from the Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA). Mice deficient for the 12/15-LO gene under the name LOKO will be referred to later in the text.
  • C57BI / 6J mice, used as controls, were obtained from Charles River Laboratories (L'ArbresIe, France). The animals are subjected to a 12-hour day / night cycle. For the obesity protocol induced by the hyperlipidic diet, only male mice are used.
  • mice were fed ad libitum by food intended for the breeding of the rodents containing 7% of fats (reference: R0310, supplier: UAR, Villemoisson, France).
  • the animals are subject to these diets for a period of 11 to 12 weeks during which a weekly weight gain is made.
  • the fat mass of 2 mice of each group is determined by densitometry thanks to the Piximus (Lunar Corporation, Madison, United States) whose two beams of X-rays with different energies allows the measurement of fat mass (lipids), lean mass (protein and water) and bone mass.
  • the mice are anesthetized with a ketamine and xylazine mixture. Once, completely asleep, the mice are weighed and measured, and put under X-rays, ventral side down. The measurement of the different parameters obtained excludes the head of the animal.
  • FIG. 11A show that the LOKO mice under a hyperlipid diet for 12 weeks have a body weight gain significantly lower than that observed for the control C57BI / 6J mice. Even under a standard diet, a difference in weight gain is observed between the LOKO mice and the control mice, although this difference is much smaller and does not reach the statistical significance. No difference in weight gain was detected between LOKO mice under hyperlipidic diet and those under standard diet.
  • the analysis of the body composition by densitometry shown in FIG. 11B indicates that the fat mass of the LOKO mice is much lower than that of the C57BI / 6J mice, whatever the diet.
  • FIG. 11 D The histological analysis of epididymal BP of C57BI / 6J and LOKO mice under standard diet or hyperlipidic diet for 12 weeks is shown in FIG. 11 D: the fat cells of LOKO mice under hyperlipidic diet are remarkably smaller than those of C57BI / 6J mice. controls.
  • FIG. 11E The average fat cell size of the LOKO mice is not affected by the hyperlipidic diet while that it increases significantly in the epididymal BP of C57BI / 6J control mice compared to the effect of the standard diet.
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Abstract

La présente demande a pour objet le traitement de l'obésité, notamment l'obésité abdominale viscérale. Plus spécifiquement, la présente demande concerne l'utilisation d'inhibiteurs sélectifs de la 15-LO pour la préparation de médicaments utiles dans le traitement de l'obésité, ou d'au moins l'obésité abdominale viscérale, et/ou de ses conséquences. Préférentiellement, l'inhibiteur est PD146176, un anticorps anti-15-L0, une molécule d'acide nucléique antisens ou une molécule ARN interfèrent

Description

UTILISATION D'INHIBITEURS DE 15-LIPOXYGENASE DANS LE TRAITEMENT DE
L1OBESITE
La présente demande a pour objet le traitement de l'obésité, notamment l'obésité abdominale viscérale. Plus spécifiquement, la présente demande concerne l'utilisation d'inhibiteurs sélectifs de la 15-lipoxygénase (LO) pour la préparation de médicaments utiles dans le traitement de l'obésité, ou d'au moins l'obésité abdominale viscérale, et de ses conséquences.
INTRODUCTION
Maladie chronique en progression rapide, l'obésité est devenue un problème de santé publique majeur dans les pays industrialisés. L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a qualifié l'obésité de première épidémie non infectieuse de l'Histoire. Sa prise en charge est considérée comme une priorité, et ce d'autant plus que l'excès de poids affecte des individus de plus en plus jeunes.
Globalement, l'incidence de l'obésité atteint un taux alarmant. Selon les données rassemblées par l'OMS, près de la moitié des américains est en surpoids, tandis qu'un quart de la population est franchement obèse, proportion qui peut atteindre jusqu'à 70 % de certaines populations. 30 % des adultes sont en surpoids en Europe, l'obésité touchant 12 % des adultes de l'Europe de l'Ouest. En France, la prévalence de l'obésité a augmenté d'environ 45 % entre 1987 et 1996, et le nombre d'individus obèses est estimé à 8 millions environ. L'obésité affecte également la population jeune, puisque le nombre d'enfants obèses a doublé depuis les années 80, et que la prévalence de l'obésité est estimée à 10-12 % chez les enfants âgés de 6 à 12 ans. Certaines études prévoient qu'à ce rythme, la moitié de la population européenne sera concernée par l'obésité d'ici 2030.
L'obésité est un état caractérisé par un excès de masse adipeuse. L'Indice de Masse Corporelle (IMC), qui est défini comme le poids divisé par le carré de la taille, exprimé en kg/m2, est une norme internationale pour mesurer l'excès de poids et l'obésité. L1IMC estime le degré d'obésité et permet ainsi d'évaluer les risques pour la santé qui lui sont associés (voir ci-dessous). Un individu est considéré comme obèse lorsque cette valeur est supérieure ou égale à 30 kg/m2. À côté de I1IMC, il convient de mesurer également la distribution corporelle du Tissu Adipeux (TA). En effet, l'augmentation de la masse adipeuse chez les sujets obèses a lieu principalement au niveau du tronc dans les régions intra-abdominale et péri-viscérale: on parle alors de TA abdominal viscéral. L'augmentation de la masse du TA abdominal sous-cutané est marginale chez les sujets obèses. On observe alors une augmentation du rapport entre le TA abdominal viscéral et le TA abdominal sous-cutané. Même les individus non obèses mais développant une résistance à l'insuline présentent une augmentation du rapport entre le TA abdominal viscéral et le TA abdominal sous- cutané. Ainsi, selon le "National Cholestérol Education Program-Adult Treatment Panel III (NCEP-ATP III), un tour de taille supérieur à 88 cm chez la femme, et 102 cm chez l'homme (variable en fonction des groupes ethniques), indique une obésité abdominale viscérale et un risque plus élevé de développer d'autres problèmes d'ordre clinique. La "International Diabètes Fédération" (IDF) a récemment réduit les valeurs de tour de taille critiques : valeurs supérieures ou égales à 94 cm chez l'homme et à 80 cm chez la femme (Alberti KG et al., 2005). Ce développement du TA abdominal viscéral est associé à une augmentation spectaculaire du risque de maladies cardio-vasculaires (Larsson B et al., 1984) et (Lapidus L et al., 1984). De plus, de nombreuses études épidémiologiques et métaboliques ont confirmé la notion qu'une accumulation importante de TA dans la région abdominale constitue un facteur de risque majeur de développement du syndrome métabolique, du diabète de type 2, d'hypertension, de maladies vésiculaires biliaires, de certaines formes de cancer (côlon, sein, endomètre), et de complications respiratoires telles l'apnée obstructive du sommeil et l'asthme ainsi que de développement d'ostéoarthrite et très vraisemblablement des problèmes locomoteurs.
La diminution de la quantité de TA abdominal viscéral doit constituer un objectif thérapeutique de première importance dans la prise en charge du sujet présentant un syndrome métabolique. En effet, une perte de poids dans la partie abdominale viscérale relativement modeste (5 à 10%) entraîne des effets bénéfiques sur la majorité des facteurs de risque des maladies cardio-vasculaires et du diabète de type 2. On observe une amélioration du profil lipidique, des indices de sensibilité à l'insuline, de l'hypertension artérielle et des variables associées au risque accru de thrombose et d'inflammation. L'approche médicamenteuse pour limiter ou empêcher le développement du TA met en jeu, soit l'effet anorexigène de molécules intervenant au niveau du système nerveux central, soit l'effet de molécules qui augmentent les dépenses énergétiques en augmentant la production de chaleur, soit la séquestration des lipides alimentaires dans la lumière intestinale. Toutefois, les approches médicamenteuses actuelles présentent le désavantage d'être accompagnées d'effets secondaires plus ou moins tolérables.
La nécessité de trouver des stratégies thérapeutiques efficaces de traitement de l'obésité, et notamment de l'obésité abdominale viscérale, et/ou de ses conséquences est donc devenue une urgence mondiale.
La différenciation adipocytaire est le processus par lequel les cellules passent du stade de pré-adipocytes à celui d'adipocytes. Cette différenciation se fait en trois étapes : l'hyperplasie des pré-adipocytes (seules cellules à se multiplier), la différenciation des pré-adipocytes en adipocytes et enfin l'accumulation des triglycérides dans les adipocytes matures lors du processus d'hypertrophie. Ainsi, l'augmentation de la masse adipeuse chez l'adulte se fait essentiellement par hypertrophie adipocytaire, plus rarement par hyperplasie. De manière générale, la différenciation adipocytaire est le plus souvent régulée aussi bien de façon positive que négative par des facteurs présents dans le milieu dans lequel se trouve les cellules, tels que des hormones, des cytokines (ou adipokines), des facteurs de croissance, des vitamines, etc. Certains auteurs ont mentionné le rôle des métabolites de l'acide arachidonique, issus de la voie des cyclooxygénases et des lipoxygénases, dans la différenciation adipocytaire (Shillabeer G et al., 1998). De plus, la différenciation adipocytaire est régulée de manière coordonnée par un réseau de facteurs de transcription. Elle est initiée par la sortie du cycle cellulaire et l'activation des facteurs C/EBPα, C/EBPδ (CCAAT/Enhancer-Binding Protein) et SREBP-1 qui induisent l'expression du récepteur nucléaire PPARy (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors gamma) (Fajas L et al., 1998). Les lipoxygénases sont des enzymes, identifiées chez les plantes et les animaux, qui catalysent l'oxydation des acides gras poly-insaturés, incluant ceux trouvés dans les lipoprotéines, en dérivés hydroperoxy (Kuhn H and Bomgraber S, 1999). Chez l'homme, il existe 6 gènes codant pour des lipoxygénases : la e-LOX-3 (Epidermis-type lipoxygenase 3), la 5-LO (5-lipoxygenase), la 12-LO (12- lipoxygenase), 12(R)-LOX (12(R)-lipoxygenase), la 15-LO-1 (type réticulocyte - 15- lipoxygenase-1 ) et la 15-LO-2 (15-lipoxygenase-2). Ces différentes lipoxygénases sont nommées selon la spécificité de la position d'oxydation de l'acide arachidonique. Les 12-LO et les 15-LO transforment respectivement l'acide arachidonique en acide 12(S)-hydroxypéroxy-5, 8, 10, 14(Z1Z1E1Z) éicosatétraénoïque (12(S)-HPETE) et en acide 15(S)-hydroxypéroxy-5,8,10,14(Z1Z1E1Z) éicosatétraénoïque (15(S)-HPETE). La réduction biochimique de la 12(S)-HPETE et 15(S)-HPETE conduit respectivement à la formation de 12(S)-HETE (acide 12-(S)- hydroxy-éicosatétraenoïque) et 15(S)-HETE (acide 15-(S)-hydroxy- éicosatétraénoïque) qui est le précurseur d'une classe de composés connus sous le nom de lipoxines (Kuhn H and Bomgraber S, 1999). Alors que l'acide arachidonique est le substrat exclusif de la 15-LO-2 (Brash AR et al., 1997), la 15-LO-1 métabolise également, et de manière préférentielle, l'acide linoléique en acide 13(S)- hydroxyperoxy-9Z,11 E-octodécadiénoïque (13(S)-HODE) (Hsi LC et al., 2002). Certaines lipoxygénases peuvent également produire un mélange de produits dont les proportions relatives varient en fonction des espèces. Ainsi, la 15-LO-1 humaine produit, en plus du 15(S)-HETE, de petites quantités de 12(S)-HETE (5 à 10 % du produit final). Chez la souris, la 12/15-LO convertit l'acide arachidonique en 12(S)- HETE et en 15-(S)-HETE avec une proportion de 3 :1 (Kuhn H and Bomgraber S, 1999). Il en est de même pour la 12-LO de rat (Watanabe T et al., 1993). Du fait de leurs caractéristiques biochimiques, les 12/15-LO de souris et la 12-LO de rat sont généralement considérées comme les équivalents fonctionnels de la 15-LO-1 humaine (on désignera par la suite dans le texte la 12/15-LO de souris et la 12-LO de rat sous la dénomination 12/15-LO).
En plus de leur spécificité de substrat, la 15-LO-1 et la 15-LO-2 humaines diffèrent également dans leur distribution tissulaire. La 15-LO-1 est constitutivement exprimée dans de nombreux types cellulaires et tissulaires avec des niveaux d'expression plus élevés dans les réticulocytes, les éosinophiles, les macrophages alvéolaires et les cellules épithéliales trachéo-bronchiques. De plus, la 15-LO-1 a été détectée dans les leucocytes polynucléaires, les tissus inflammés, les kératinocytes, les cellules épithéliales de la cornée, les cellules endothéliales du système vasculaire, l'utérus, le placenta et différents types cellulaires du système reproductif masculin (Kuhn H and Bomgraber S, 1999). La distribution tissulaire de la 15-LO-2 est plus limitée puisque ses transcrits sont détectés uniquement dans la prostate, le poumon, la peau, la cornée ainsi que dans les macrophages (Brash AR, Boeglin WE and Chang MS, 1997) (Rydberg EK et al., 2004).
L'implication de la 15-lipoxygénase a déjà été décrite dans plusieurs pathologies dont l'athérosclérose (Harats D et al., 2000), l'asthme (Shannon VR et al., 1993), le cancer (Shureiqi I et al., 2000, Shureiqi I et al., 2000), la glomérulonéphrite (Montera A and Badr KF, 2000) et l'ostéoporose (WO03/066048). L'utilisation d'inhibiteurs de la 15-LO a déjà été décrite pour le traitement de nombreuses pathologies, par exemple dans les brevets US2005070589, US2005070588 et US2005065198 pour le traitement de l'athérosclérose, de certains cancers ou des pathologies inflammatoires.
Les inventeurs ont identifié l'expression transcriptionnelle très abondante de la 15-lipoxygénase-1 (15-LO-1 ) dans le TA abdominal viscéral par rapport au TA abdominal sous-cutané. Les travaux menés par les inventeurs permettent de montrer le rôle potentiel que la 15-lipoxygénase joue dans le développement de l'obésité et tout particulièrement dans la différenciation adipocytaire et dans le développement de l'obésité abdominale viscérale. Les inhibiteurs des 15-LO représentent donc un outil thérapeutique avantageux dans le traitement de l'obésité et/ou de ses conséquences.
La présente demande a ainsi pour objet le traitement de l'obésité, notamment de l'obésité abdominale viscérale, et/ou de ses conséquences. Plus spécifiquement, la présente demande concerne l'utilisation d'inhibiteurs de la 15-lipoxygénase (LO) pour la préparation de médicaments utiles dans le traitement de l'obésité et/ou d'au moins une de ses conséquences.
RESUME DE L'INVENTION
Un objet de l'invention concerne l'utilisation d'au moins un agent inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'obésité et/ou d'au moins une de ses conséquences.
Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant, dans un support acceptable sur le plan pharmaceutique, au moins un agent inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO éventuellement en association avec un ou plusieurs principes actifs thérapeutiques et/ou cosmétiques.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs de la présente demande ont montré le rôle de la 15-LO dans le développement de l'obésité, et tout particulièrement dans la différenciation adipocytaire et dans le développement de l'obésité abdominale viscérale.
Un objet de l'invention concerne donc l'utilisation d'au moins un agent inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'obésité, de préférence l'obésité abdominale viscérale, et/ou d'au moins une de ses conséquences.
Au sens de la présente invention, la 15-LO désigne la 15-LO-1 et/ou la 15-LO- 2, préférentiel lement la 15-LO-1. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit agent inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15- LO est un agent inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO-1.
Au sens de la présente invention, l'obésité se caractérise par un tour de taille supérieur ou égal à 80 cm chez la femme et 94 cm chez l'homme et/ou par un IMC supérieur ou égal à 30 kg/m2. Un IMC supérieur ou égal à 27 kg/m2 est le seuil à partir duquel on constate une forte augmentation du risque de maladies cardiovasculaires.
Plus spécifiquement, l'invention a pour objet l'utilisation d'au moins un agent inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'obésité, préférentiellement de l'obésité abdominale viscérale.
Au sens de la présente invention, on entend par « conséquences de l'obésité » le diabète de type 2 et/ou les maladies cardiovasculaires, l'hypertension, les maladies vésiculaires biliaires, certaines formes de cancer (côlon, sein, endomètre), les complications respiratoires telles l'apnée obstructive du sommeil et l'asthme ainsi que lOstéoarthrite et les problèmes locomoteurs.
Les agents inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO peuvent être des composés de nature, de structure et d'origine variées, notamment des composés biologiques, des facteurs nucléaires, des anticorps, des cofacteurs, des composés chimiques d'origine synthétique ou naturelle, etc. Il peut s'agir également de banques, notamment de chimiothèques ou de banques de protéines, de peptides ou d'acides nucléiques, etc.
Au sens de la présente invention, l'inhibition de l'activité enzymatique se réfère à une activité mesurée plus faible, comparée à une activité contrôle mesurée sans traitement avec l'agent inhibant l'activité de la 15-LO. L'inhibition de l'expression se réfère quant à elle à une expression mesurée plus faible comparée à une expression contrôle mesurée sans traitement avec l'agent inhibant l'activité de la 15-LO.
Dans la présente invention, l'inhibition de l'expression et/ou de l'activité de la 15-LO peut être partielle ou totale. L'inhibition totale de l'expression et/ou de l'activité de la 15-LO par un agent inhibiteur correspond à une expression et/ou activité de la
15-LO diminuée d'au moins 80% par rapport à une expression et/ou activité mesurée sans traitement par l'agent inhibiteur. L'inhibition partielle par un agent inhibiteur correspond à une diminution de l'expression et/ou de l'activité de la 15-LO inférieure à 80 % comparée à une expression et/ou activité mesurée sans traitement par l'agent inhibiteur.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'agent inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO est un composé capable d'inhiber totalement ou partiellement l'activité de la 15-LO.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'au moins un composé capable d'inhiber partiellement ou totalement l'activité de la 15-LO pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'obésité, préférentiellement de l'obésité abdominale viscérale, et/ou d'au moins une de ses conséquences. Encore plus préférentiellement, l'invention concerne l'utilisation d'un composé capable d'inhiber partiellement ou totalement l'activité de la 15-LO pour inhiber la différenciation adipocytaire.
Les termes « composé capable d'inhiber l'activité de la 15-LO » ou « inhibiteur de la 15-LO » désignent préférentiellement un composé inhibant la 15-LO avec une IC50 inférieure ou égale à 1 μM, préférentiellement inférieure ou égale à 100 nM. UIC50 représente la concentration du composé étudié donnant une diminution de 50% de l'activité enzymatique maximale observée. L'IC50 peut être déterminée par des méthodes standards, connues de l'homme du métier. En particulier, un essai colorimétrique permet cette mesure : un inhibiteur potentiel de la 15-LO est préincubé avec la 15-LO pendant 10 minutes avant l'ajout de l'acide linoléique comme substrat puis incubé pendant 10 minutes supplémentaires. La formation du produit 13(S)-HPODE est quantifiée par couplage de la réduction du lipide hydroperoxydé à l'oxydation du bleu N-benzoyl-leucomethylène en présence d'hemine à pH 5. L'absorbance du bleu de méthylène oxydé est directement proportionnelle à la quantité de 13(S)-HPODE formée par la 15-LO (Auerbach BJ et al., 1992). L'homme du métier peut envisager d'autres essais, notamment des essais dans lesquels la réaction enzymatique initiale est déterminée par spectrophotométrie à 234 nm par la mesure de la formation de diène conjugué (Gan QF et al., 1996) ou un essai colorimétrique dans lequel l'oxydation de Fe2+ couplée à la réduction du lipide hydroperoxydé dans des conditions faiblement acides est détectée grâce à la formation d'un chromophore avec le xylenol orange qui absorbe fortement à 560 nm (Jiang ZY ef a/., 1992).
Préférentiellement, les composés utilisés dans la présente invention sont ceux qui inhibent partiellement ou totalement l'activité de la 15-LO de manière sélective.
Le terme "de manière sélective" désigne un composé qui inhibe l'activité de la 15-LO avec une IC50 plus faible d'au moins 5 fois, préférentiellement d'au moins 10 fois et encore plus préférentiellement d'au moins 100 fois, à celle observée pour les autres lipoxygénases et cyclooxygénases. Au sens de la présente invention, l'IC50 d'un inhibiteur sélectif de la 15-LO peut être supérieure ou égale à 1 μM.
De manière préférée, l'inhibiteur de la 15-LO est sélectif et présente une IC50 inférieure ou égale à 1 μM.
Plusieurs inhibiteurs de la 15-LO connus sont utilisables dans la présente invention. Ces inhibiteurs incluent notamment des molécules organiques synthétiques, des extraits de plantes et d'autres produits naturels ainsi que des anticorps dirigés contre la 15-LO ou des molécules antisens.
La littérature décrit de nombreux inhibiteurs de la 15-LO avec une IC50 inférieure ou égale à 1 μM. On peut citer par exemple les purines décrites dans (Brathe A et al., 2005), les indolizines décrites dans (Gundersen L et al., 2003) et (Teklu S et al., 2005); les terpénoïdes décrits dans (Carroll J et al., 2001 ), dont le jaspaquinol, les inhibiteurs décrits dans (Cornicelli JA and Trivedi BK, 1999) et dans (Weinstein DS et al., 2005), l'anadanthoflavone, l'aspénone, le lupénone, le lupéol, l'alpha-amyrine et l'aspigénine décrite dans (Gutierrez-Lugo MT et al., 2004), les analogues de l'acide caféique, le RG-6866 et l'esculétine décrits dans (Gleason MM et al., 1995), les organobromures décrits dans (Segraves EN et al., 2004), les phtalènes décrits dans (Malterud KE et al., 1999), les flavonoïdes polyméthoxylés décrits dans (Malterud KE and Rydland KM, 2000), l'ebselen, l'acide éicosatetranoïque et le 4-nitrocatechole décrits dans (Walther M et al., 1999), les sérotoninamides de l'acide arachidonique décrits dans (Bezuglov W et al., 1996), les flavonoïdes décrits dans (Lyckander IM and Malterud KE, 1992) dont la sinensétine, la tétraméthylscutellareine et la quercétine ou le butylhydroxyanisole, le nitrocatéchol, le salycil-hydroxamate, le naphtyl-hydroxamate, le 5,8,11 ,14- eicosatetraynoate (ETYA), le 8,11 ,14-eicosatrinoate décrits dans (Kuhn H and Bomgraber S, 1999).
La littérature brevets décrit aussi de nombreux inhibiteurs de la 15-LO tels que l'extrait de Glycine max (L.) fermenté décrit dans EP1512407, les composés inhibiteurs de la 15-LO décrits dans le document brevet WO01/96336, les composés de type imidazolyle, pyrazolyle, oxazolyle et thiazolyle décrits respectivement dans US2005070588, US2005070589 et US2005065198 ou les composés de type pyrazole décrits dans WO2004080999, notamment les exemples 8, 14, 23 et 26.
Préférentiellement, les inhibiteurs de la 15-LO utilisés dans le cadre de la présente invention présentent une IC50 inférieure ou égale à 1 μM. On peut citer notamment les composés de type indole et benzimidazole développés par Warner- Lambert et décrits dans WO01 /96299, les composés de type isothiazolone tels que décrits dans WO96/38144 (notamment les exemples 23, 24, 27 à 30, 33 et 35), les analogues du composé PD148104 développé par Warner-Lambert tels que le composé UK-399276 (IC50=83nM) ainsi que les composés codés CP-65005, UK- 369997 et UK-370607, les composés de type thiourée et benzamide tel que le 3- amino-N-(3,4-dichlorophenyl)-4-methoxy-benzamide (IC50=10nM) décrits dans WO99/32433 et les 280 composés exemplifiés dont les IC50 < 1 μM, les composés inhibiteurs de la 15-LO décrits dans WO03/066048, notamment le 6,11-dihydro-5- thia-11-aza-benzo[a]fluorine (IC50=200nM - composé 2), le 3-amino-N-(3,4- dichlorophényl)-4-methoxybenzamide (IC50=10nM - composé 3), l'isobutylester d'acide [[[5-(5,6-difluoro-1 H-indol-2-yl)-2-methoxyphényl]amino]sulfonyl] carabamique (IC50=14nM - composé 6), les composés de type benzènes 1 ,2,4-trisubstitués développés par Warner-Lambert et décrits dans WO01 /96298 dont l'isobutylester d'acide [[[5-(5,6-difluoro-1 H-indol-2-yl)-2-methoxyphényl]amino]sulfonyl] carabamique (IC50=14nM), les composés de type indole tétracyclique et les benzopyranoindole décrits dans WO97/12613, les composés de type benzimidazole décrits dans WO97/12615, notamment les composés avec des IC50 < 1 μ M tels que les composés des exemples 1 à 3, 5 à 9, 15, 17, 19 à 21 , 27 et 37, les composés inhibiteurs de la 15-LO dérivés de N-sulphonyl-aminophénol mentionnés dans DE4238233, notamment le composé de l'exemple 3 (IC50=0.5 μM).
Préférentiellement, l'inhibiteur utilisé dans le cadre de la présente demande est sélectif par rapport à la 15-LO. L'invention a ainsi pour objet l'utilisation des inhibiteurs sélectifs suivants pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'obésité, préférentiellement de l'obésité abdominale viscérale, et/ou d'au moins une de ses conséquences:
• Le composé PD146176 (6,11-dihydro-5-thia-11-aza-benzo[a]-fluorène) de Parke-Davis (maintenant Pfizer) décrit dans Bocan TM et al., 1998, dans Sendobry SM et al., 1997 et dans les brevets US 3,388,133, WO97/123613 et US 5,972,980 (IC50=0,5-0,8 μM)
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• Les composés RP-27493, RP-64835, RP-64407, RP-65208 décrits dans Gleason MM, Rojas CJ, Learn KS, Perrone MH and Bilder GE, 1995
• L'aspigénine décrite dans Gutierrez-Lugo MT, Deschamps JD, Holman TR, Suarez E and Timmermann BN, 2004 • Les dioxines 4a et 4b décrites dans Segraves EN, Shah RR, Segraves NL, Johnson TA, Whitman S, Sui JK, Kenyon VA, Cichewicz RH, Crews P and Holman TR, 2004
• Les chomaroles A-D, la strongylophorine-2 et la strongylophorine-3 ainsi que les chromanes n°25, 26 et 27 décrits dans Cichewicz RH et al., 2004
• Le 1-éthoxy-4-cyano-5-éthoxycarbonyl-3H-azuléno[1 ,2-c]pyran-3-one décrit dans Lin BB and Lin yS, 2004, Lin BB et al., 2004
• Les composés 26, 37c, 37f, 37h, 37I, 40a et 4Oh décrits dans Weinstein DS, Liu W, Gu Z, Langevine C, Ngu K, Fadnis L, Combs DW, Sitkoff D, Ahmad S, Zhuang S, Chen X, Wang FL, Loughney DA, Atwal KS, Zahler
R, Macor JE, Madsen CS and Murugesan N, 2005, notamment le N-((4- n-pentylbenzène) sulfonyl)-2-(benzofuran-2-yl)tryptamine (composé 371)
• Le squalène décrit dans Lin BB and Lin yS, 1992
• Le trans-phytol décrit dans Lin BB and Lin yS, 1993 • La diéranine décrite dans Comicelli JA and Trivedi BK, 1999.
Encore plus préférentiellement, l'inhibiteur sélectif utilisé dans le cadre de la présente demande est le PD146176 ou le N-((4-n-pentylbenzène)sulfonyl)-2- (benzofuran-2-yl)tryptamine.
Ces agents inhibant partiellement ou totalement l'activité de la 15-LO incluent également les anticorps ayant une affinité pour la 15-LO, ou anticorps anti-15-LO. Préférentiellement, cet anticorps présente un pouvoir bloquant et inhibe totalement ou partiellement l'activité de la 15-LO.
L'invention concerne ainsi l'utilisation d'au moins un anticorps inhibant partiellement ou totalement l'activité de la 15-LO pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'obésité, préférentiellement l'obésité abdominale viscérale, et/ou d'au moins une de ses conséquences.
Les anticorps peuvent être des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, obtenus par toute méthode connue de l'homme du métier. Lesdits anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de fusion lymphocytaire et de culture d'hybridome ou par toute autre méthode de préparation d'anticorps monoclonaux connus. Lesdits anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir de sérum d'un animal immunisé, notamment d'un vertébré et de préférence d'un mammifère avec l'une quelconque des séquences polypeptidiques identifiées ou l'un de leurs fragments conservant l'immunogénicité de la protéine totale.
Selon un autre aspect de l'invention, l'agent inhibant partiellement ou totalement l'activité et/ou l'expression de la 15-LO est un composé capable d'inhiber partiellement ou totalement l'expression de la 15-LO en inhibant partiellement ou totalement la transcription du gène codant la 15-LO. L'invention a ainsi pour objet l'utilisation d'au moins un composé capable d'inhiber partiellement ou totalement l'expression de la 15-LO pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'obésité, de préférence l'obésité abdominale viscérale, et/ou d'au moins une de ses conséquences.
Les différentes techniques d'inhibition de l'expression de gènes sont bien connues de l'homme du métier. Préférentiellement, les agents inhibant partiellement ou totalement l'expression de la 15-LO utilisés dans la présente demande sont les acides nucléiques antisens. Une thérapie antisens met généralement en œuvre un vecteur, tel qu'un vecteur viral, qui porte la séquence antisens de l'ARNm codant la protéine dont l'expression est à inhiber, l'inhibition étant alors généralement stable puisque le vecteur va s'intégrer dans le génome. On peut également utiliser des oligonucléotides antisens, qui procurent une inhibition transitoire de l'expression. On peut également mettre à profit la technologie des ribozymes ou des ARNs interférants (siRNAs), qui empêchent un gène de produire une protéine fonctionnelle en détruisant l'ARN messager.
Ainsi, un objet particulier de l'invention concerne l'utilisation d'au moins un agent inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO de manière sélective pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'obésité.
Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique comprenant, dans un support acceptable sur le plan pharmaceutique, au moins un agent inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO tel que décrit ci-dessus, éventuellement en association avec un ou plusieurs autres principes actifs thérapeutiques et/ou cosmétiques.
II s'agit avantageusement d'une composition pharmaceutique pour le traitement de l'obésité, de préférence l'obésité abdominale viscérale, et/ou d'au moins une de ces conséquences. La composition pharmaceutique selon l'invention peut également être utilisée pour inhiber la différenciation adipocytaire.
A titre d'exemple (et de manière non limitative), les autres agents thérapeutiques et/ou cosmétiques, commercialisés ou en développement, peuvent être choisis parmi:
- des anti-diabétiques,
- l'insuline, - des molécules hypolipémiantes et/ou hypocholestérolémiantes,
- des agents anti-hypertenseurs et les agents hypotenseurs,
- des agents anti-plaquettaires,
- des agents anti-obésité,
- des agents anti-inflammatoires, - des agents anti-oxydants,
- des agents utilisés dans le traitement de l'insuffisance cardiaque,
- des agents utilisés pour le traitement de l'insuffisance coronaire,
- des anticancéreux,
- des anti-asthmatiques, - des corticoïdes utilisés dans le traitement des pathologies de la peau,
- des vasodilatateurs et/ou des agents anti-ischémiques. Bien entendu, l'homme du métier veillera à choisir ce ou ces éventuels autres agents thérapeutiques, et/ou leur quantité, de manière telle que les propriétés avantageuses de la composition selon l'invention ne soient pas, ou substantiellement pas, altérées.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention comprennent avantageusement un ou plusieurs excipients ou véhicules, acceptables sur le plan pharmaceutique et bien connus de l'homme du métier.
Les modes et voies d'administration ainsi que les doses peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du patient et de la perturbation à traiter. Le niveau de dosage choisi dépendra de divers facteurs comprenant l'activité du composé particulier utilisé, du mode d'administration, de la durée de l'administration, du taux d'excrétion du composé particulier qui est utilisé, de la durée du traitement, d'autres médicaments, des composés et/ou des matériaux utilisés en combinaison avec l'agent inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO particulier utilisé, de l'âge, du sexe, du poids, de l'état, de la santé générale et de l'histoire médicale antérieure du patient qui est traité et autres facteurs bien connus dans le métier médical. L'homme du métier peut facilement déterminer et prescrire la quantité requise de la composition pharmaceutique. Par exemple, il peut démarrer avec des doses d'agent inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO dans la composition pharmaceutique à des niveaux inférieurs que ceux requis pour obtenir l'effet thérapeutique désiré et accroître progressivement le dosage jusqu'à ce que l'effet désiré soit obtenu.
L'invention concerne enfin une méthode de traitement de l'obésité, de préférence l'obésité abdominale viscérale, comprenant l'administration à un sujet, notamment humain, d'une quantité efficace d'au moins un composé ou d'une composition pharmaceutique tels que défini ci-avant. Au sens de l'invention le terme «une quantité efficace » se réfère à une quantité du composé suffisante pour produire le résultat biologique désiré, de préférence non toxique. Au sens de la présente invention le terme « sujet » signifie un mammifère et plus particulièrement un humain.
Le terme traitement désigne le traitement curatif, symptomatique ou préventif. Les agents inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15- LO utilisés dans la présente invention peuvent être utilisés chez des humains atteints d'une maladie déclarée, comprenant les stades précoces et/ou tardifs de la maladie. Les agents inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou de l'activité de la 15-LO utilisés dans la présente invention ne permettent pas nécessairement de guérir le patient atteint de la maladie, mais peuvent retarder ou ralentir la progression ou prévenir une progression plus en avant de la maladie, améliorant ainsi la condition des patients. Les agents inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO utilisés dans la présente invention peuvent aussi être administrés aux personnes non malades, mais qui pourraient développer normalement la maladie, ou qui ont un risque important de développer la maladie. Le traitement comprend aussi le retardement du développement de la maladie chez un individu qui développera la maladie ou qui risque de développer la maladie en raison de son âge, de son histoire familiale, d'anomalies génétiques ou chromosomiques, et/ou en raison d'un ou plusieurs marqueur(s) biologique(s) de la maladie, tel qu'une mutation génétique connue, dans des tissus ou fluides. Le traitement comprend aussi l'administration d'un agent inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO utilisé dans la présente invention aux individus dont on pense qu'ils sont prédisposés à développer une obésité, et de préférence une obésité abdominale viscérale.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et des dessins en annexe, fournis à titre illustratif et non limitatif.
LEGENDE DES FIGURES La Figure 1 est une photographie de gel montrant l'expression de la 15-LO-1 , par
RT-PCR, dans le Tissu Adipeux (TA) abdominal viscéral et sous-cutané d'une population de 10 hommes.
SC : TA abdominal sous-cutané ; V : TA abdominal viscéral.
La Figure 2A est un graphe montrant l'expression de la 5-LO, de la 12-LO et de la
15-LO-1 dans le TA abdominal viscéral et sous-cutané d'une population de 83 patients : Résultats de RT-QPCR en moyenne.
SC : TA abdominal sous-cutané ; V : TA abdominal viscéral. La Figure 2B est un graphe comparant l'expression relative de la 5-LO, de la 12-LO et de la 15-LO-1 dans le TA abdominal viscéral et sous-cutané d'une population de
83 patients: Résultats de RT-QPCR en moyenne.
Barres blanches: TA abdominal sous-cutané; barres noires : TA abdominal viscéral
La Figure 2C est un graphe montrant l'expression de la 15-LO-1 dans le TA abdominal viscéral et sous-cutané d'une population de 83 patients : Résultats de RT-
QPCR par individu.
La Figure 3A est une photographie de gel montrant l'expression de la 15-LO-1 par RT-PCR sur les fractions du TA abdominal viscéral d'un patient. PA : Pré-Adipocyte ; fA : Adipocyte Mature ; SV : Stroma Vasculaire ; MC : Matrice Cellulaire.
La Figure 3B est un graphe représentant l'expression de la 15-LO-1 par RT-QPCR sur les fractions de TA d'un patient.
La Figure 4A est une photographie de gel montrant l'expression de la 15-LO-1 au cours de la différenciation des pré-adipocytes (PA) viscéraux humains de Promocell
(culture de PA n°1 , passage 4) par RT-PCR. JO : confluence ; J0-J3 : incubation des cellules avec le milieu de différenciation ; J3-J21 : incubation des cellules avec le milieu de nutrition des adipocytes.
La Figure 4B correspond à des graphes montrant l'expression de la 15-LO-1 au cours de la différenciation de 3 cultures différentes de PA viscéraux humains,
Promocell (culture de PA n°1 , passage 7) et Cambrex (culture de PA n°2, passage 2, et culture de PA n°3, passage 4) par RT-QPCR. La Figure 5A est une photographie de gel montrant l'expression du marqueur aP2 par RT-PCR au 3eme jour de différenciation d'une culture de PA viscéraux humains (culture de PA n°1 , passage 7), en l'absence ou en présence de doses croissantes d'un inhibiteur sélectif de la 15-LO, le PD146176.
La Figure 5B correspond à des graphes représentant l'expression du marqueur aP2 par RT-QPCR au 7eme jour de différenciation de 2 cultures de PA viscéraux humains (culture de PA n°2, passage 5 et culture de PA n°3, passage 4), en l'absence ou en présence de doses croissantes d'un inhibiteur sélectif de la 15-LO, le PD146176.
La Figure 6A est un graphe montrant la sécrétion d'adiponectine au cours de la différenciation des PA abdominaux viscéraux (Culture de PA n°3, passage 4). La Figure 6B est un graphe montrant la sécrétion d'adiponectine au 7eme jour de différenciation en présence du PD146176 (Culture de PA n°3, passage 4).
La Figure 7A est une photographie de gel montrant l'expression tissulaire de la 12/15-LO, équivalents fonctionnels chez les rongeurs de la 15-LO-1 humaine, chez le rat et la souris par RT-PCR. 1 :TA périrénal ; 2 : TA épididymal ; 3 : foie ; 4 : cœur ;
5 : muscle ; 6 : rein ; 7 : cortex ; 8 : cervelet ; 9 : rate ; 10 : testicule ; 11 : duodénum ; 12 : jéjunum ; 13 : iléum ; 14 : poumon.
La Figure 7B est un graphe représentant l'expression de la 12/15-LO dans les différents dépôts de TA chez le rat par RT-QPCR. 1 : TA sous-cutané dorsal ; 2 : TA sous-cutané abdominal ; 3 : TA omental ; 4 : TA mésentérique ; 5 : TA épididymal ;
6 : TA périrénal ; 7 : TA interscapulaire.
La Figure 8A correspond à des photographies montrant l'effet du PD146176 sur la morphologie des cellules 3T3-L1 au cours de la différenciation adipocytaire. La Figure 8B est un graphe montrant l'effet du PD146176 sur l'accumulation de lipides par les cellules 3T3-L1 au cours de la différenciation adipocytaire : mesure Adipored.
La Figure 8C est un graphe montrant l'effet du PD146176 sur l'accumulation de triglycérides par les cellules 3T3-L1 au cours de la différenciation adipocytaire. La Figure 8D correspond à des graphes représentant l'effet du PD146176 sur l'expression de l'aP2 et de la LPL (LipoProtein Lipase) par les cellules 3T3-L1 au cours de la différenciation adipocytaire.
La Figure 9A correspond à des photographies montrant l'effet de l'acide caféique sur la morphologie des PA de rat au cours de la différenciation adipocytaire. La Figure 9B est une photographie de gel montrant l'effet de l'acide caféique sur l'expression de l'aP2 par les PA de rat au cours de la différenciation adipocytaire.
La Figure 10A est un graphe montrant l'effet de la surexpression de la 15-LO-1 humaine sur l'accumulation des triglycérides intracellulaires au cours de la différenciation adipocytaire des cellules 3T3-L1.
Barres blanches : cellules transfectées avec le plasmide pBlueScript SKII+; barres noires: cellules transfectées avec le plasmide aP2-15-LO; *** valeur p<0,001. La Figure 10B correspond à des graphes montrant l'effet de la surexpression de la 15-LO humaine sur l'expression d'aP2, C/EBPα et de l'adiponectine au cours de la différenciation adipocytaire des cellules 3T3-L1.
Barres blanches : cellules transfectées avec le plasmide pBlueScript SKII+; barres noires: cellules transfectées avec le plasmide aP2-15-LO; ** valeur p<0,01 ; *** valeur p<0,001.
La Figure 10C est un graphe montrant l'effet de la surexpression de la 15-LO humaine sur la sécrétion d'adiponectine au cours de la différenciation adipocytaire des cellules 3T3-L1. Barres blanches : cellules transfectées avec le plasmide pBlueScript SKII+; barres noires: cellules transfectées avec le plasmide aP2-15-LO; *** valeur p<0,001.
La Figure 11 A est un graphe montrant l'évolution de la prise de poids des souris déficientes pour le gène 12/15-LO(ci-dessous désignées souris LOKO) et C57BI/6J soumises à un régime standard ou hyperlipidique qui conduit à l'obésité ou encore appelé DIO (Diet induced obesity).
La Figure 11B est un graphe représentant la proportion de la masse adipeuse des souris LOKO et C57BI/6J soumis à un régime standard ou hyperlipidique. La Figure 11C représente des graphes montrant la masse de tissu adipeux épididymal et périrénal des souris LOKO et de C57BI/6J soumis à un régime standard ou hyperlipidique.
* valeur p<0,05; ** valeur p<0,01 ; *** valeur p<0,001 La Figure 11D correspond à des photographies de coupes histologiques de tissu adipeux épididymal de souris LOKO et C57BI/6J soumis à un régime standard ou hyperlipidique.
La Figure 11E représente des graphes montrant la taille moyenne des adipocytes du tissu adipeux épididymal de souris LOKO et C57BI/6J soumis à un régime standard ou hyperlipidique.
EXEMPLES
Exemple 1 : Mise en évidence de la sur-expression spécifique du gène 15-L0-1 dans le tissu adipeux (TA) abdominal viscéral humain par rapport au TA abdominal sous-cutané humain d'une population de 10 hommes par la technique de puces à ADN et par RT-PCR.
Récolte des tissus Conformément à la loi Huriet sur la protection des personnes dans le cadre de la recherche biomédicale, des consentements éclairés signés ont été obtenus pour chaque patient avant la récupération des tissus. Des données démographiques et cliniques des patients ont également été collectées. Pour chaque patient, le TA abdominal viscéral (épiplon) et le TA abdominal sous-cutané sont récupérés lors d'opérations de chirurgie abdominale. La peau et les vaisseaux sanguins sont aussitôt retirés des tissus à l'aide de ciseaux chirurgicaux et les échantillons de TA ainsi obtenus, finement découpés, sont immédiatement congelés dans de l'azote liquide. Extraction des ARN totaux de TA L'extraction des ARN de TA est réalisée selon la méthode modifiée au thiocyanate guanidium. Les ARNs totaux obtenus sont traités par la Dnase I pour éliminer toute trace d'ADN génomique contaminant, puis purifiés sur colonne Qiagen Rneasy comme indiqué par le fournisseur (Qiagen, Courtaboeuf, France). Puces à ADN
Les puces à ADN sont réalisées de manière à comparer l'expression des ARNs du TA abdominal viscéral à l'expression des ARNs du TA abdominal sous- cutané de 10 hommes (voir le tableau 1 pour les données cliniques des patients).
Tableau 1
Figure imgf000022_0001
Les ADN complémentaires (ADNc) double-brins sont synthétisés à partir de 10 μg d'ARN totaux avec la transcriptase inverse Superscript (SS) II, les tampons du système SS choice (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) et des primers oligo-T- 7(dt)24 (MWG Biotech). La synthèse des ARN complémentaires (ARNc) biotinylés est réalisée à l'aide d'un kit de marquage (« RNA transcript labelling kit », Enzo, Farmingdale, NY). Les expériences de puces à ADN sont effectuées sur les puces Affymetrix- U133A et U133B : l'hybridation, le lavage, le marquage et le scan des puces sont réalisés suivant les instructions du Manuel Technique Affymetrix- (P/N 700222 rev.4). Les signaux sont visualisés et quantifiés avec le logiciel « microarray analysis suite v4 software ». Le modèle d 'analyse statistique prédictif AIC (Akaike Information Criterion) ainsi que l'analyse statistique prédictive BIC (Bayesian Information Criterion) montrent une corrélation positive entre l'expression de la 15- LO-1 et le TA abdominal viscéral. RT (Reverse-Transcription)
1 μg d'ARNs est reverse-transcrit par incubation pendant 1 heure à 370C avec 200 ng d'hexanucléotides aléatoires et 200 unités d'enzyme MMLV (Sigma) en présence de 1 ,5 mM DTT, 187 μM de dNTP et 30 unités d'inhibiteurs de Rnase. PCR (Polymerase Chain Reaction)
L' ADNc 15-LO-1 est ensuite amplifié par PCR sur 1 μl des mélanges de RT ainsi obtenus avec 0,3 mM d'amorces spécifiques (voir le tableau 2 pour les amorces utilisées), 2,5 unités de l'enzyme PLATINIUM Pfx DNA polymerase (Invitrogen, 11708-039), 1 mM MgSO4 et 0,3 mM de chaque dNTP dans un volume final de 20 μl. Les conditions d'amplification sont 30s à 940C (dénaturation), 30s à la température d'hybridation spécifique pour chaque paire d'amorces et 1min/kb à 680C pour l'extension. Les produits de PCR obtenus sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose pour confirmer la présence d'un seul amplicon de la bonne taille et séquences pour confirmer l'homologie au gène amplifié.
Tableau 2
Figure imgf000023_0001
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Résultats
Les résultats de l'analyse des puces Affymetrix -, présentés sur le tableau 3, montrent que la 15-LO-1 est préférentiellement exprimée dans le TA abdominal viscéral par rapport au TA abdominal sous-cutané des 10 patients masculins, avec un ratio de 2,2 et une valeur p de 7,25 10"25 issus des analyses statistiques sur les données Affymetrix-.
Tableau 3 : Résultats de puces à ADN
Figure imgf000024_0002
Les résultats de l'analyse RT-PCR, présentés sur la figure 1 , confirment l'expression préférentielle de la 15-LO-1 dans le TA abdominal viscéral des patients par rapport au TA abdominal sous-cutané pour chaque patient étudié : en effet, à l'exception du patient 41 , l'expression de la 15-LO-1 est quasiment indétectable par RT-PCR classique dans le TA abdominal sous-cutané alors qu'un amplicon est observé dans le TA abdominal viscéral de tous les patients.
Exemple 2 : Confirmation de l'expression spécifique du gène 15-LO-1 dans le TA abdominal viscéral humain par rapport au TA abdominal sous-cutané humain, par PCR quantitative sur une population de 83 patients, et sélectivité de cette expression spécifique par rapport aux autres lipoxygénases.
Récolte des tissus et extraction des ARNs
Les résultats obtenus par la technique de puces à ADN ont été confirmés sur des TA abdominaux viscéraux et sous-cutanés d'une population de 83 patients (voir le tableau 4 pour les données cliniques des patients). Les tissus ont été prélevés et les ARNs extraits de la manière décrite dans l'exemple 1.
Tableau 4
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
II faut noter que la population étudiée de 83 patients présente un large spectre d'IMC (de 17,9 à 72). Au sens de la présente invention, l'obésité se caractérise par un IMC supérieur ou égal à 30 kg/m2 et une forte augmentation du risque de maladies cardiovasculaires est constatée avec un IMC supérieur ou égal à 27 kg/m2. PCR quantitative (QPCR)
Les QPCR sont réalisées par incorporation de Sybergreen suivant les instructions du fournisseur (SyberMix Biorad, Marnes la Coquette, France) et de l'appareil IQ-Cycler (Biorad). Pour chaque gène, l'utilisation des amorces (voir le tableau 5) a été optimisée en terme de spécificité et d'efficacité (>90%) via l'analyse des courbes standard et des courbes de fusion obtenues sur des dilutions en série des échantillons de RT. Les produits de RT-PCR obtenus ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose pour confirmer la présence d'un seul amplicon de la bonne taille et séquences pour confirmer l'homologie au gène amplifié. Une fois les optimisations réalisées, les QPCR sont réalisées sur 1 μl de RT de la manière décrite dans l'exemple 1 : l'expression relative de la 5-LO, 12-LO et 15-LO-1 est comparée à l'expression du gène de la cyclophilline, considéré comme témoin interne.
Tableau 5
Figure imgf000028_0001
Analyses AIC et BIC Le modèle prédictif AIC ainsi que l'analyse prédictive BIC montre une corrélation positive entre l'expression de la 15-LO-1 et le TA abdominal viscéral (tableau 6).
Tableau 6 : corrélation aux données cliniques - résultats des analyses AIC et BIC.
Figure imgf000029_0001
*** valeur p<10"6
Résultats
Les résultats des RT-QPCR réalisées sur les ARNs de TA abdominal viscéral et sous-cutané des 83 patients, présentés sur la figure 2A, confirment une expression préférentielle dans le TA abdominal viscéral. En moyenne, l'expression dans le TA abdominal viscéral est 40 fois plus élevée que dans le TA abdominal sous-cutané. Aucune expression préférentielle dans le TA abdominal viscéral n'est observé pour la 5-LO et la 12-LO par rapport au TA abdominal sous-cutané. De plus, les résultats de RT-QPCR présentés dans la figure 2B (Expression relative normalisée par rapport à la moyenne de l'expression de la 15-LO dans le TA abdominal sous-cutané) montrent que la 15-LO est la forme majoritairement exprimée dans le TA des patients. Ainsi, l'expression de la 5-LO représente environ 12% de l'expression de la 15-LO dans le TA abdominale sous-cutané et 0,4% de l'expression de la 15-LO dans le TA abdominal viscéral tandis que l'expression de la 12-LO est négligeable (< 0,4% de l'expression de la 15-LO).
L'analyse des résultats par individu dans la population de 83 patients, présentés sur la figure 2C (Expression relative normalisée par rapport à la moyenne des expressions dans le TA abdominal sous-cutané du patient n°17), montre que, même si le taux basai d'expression de la 15-LO-1 dans le TA abdominal sous-cutané ou dans le TA abdominal viscéral est différent d'un individu à un autre, le différentiel d'expression entre le TA abdominal viscéral et le TA abdominal sous-cutané est observé pour la majorité des individus. Ceci confirme ce qui avait été observé sur la population des 10 hommes. Les données de QPCR mesurées sur un large panel de patients ont été étudiées par une Analyse de la Variance (ANOVA) pas à pas. L'objectif de cette méthode est d'identifier la meilleure combinaison de variables explicatives (facteurs cliniques) qui explique la variabilité présente dans les données d'expression (variable expliquée). Ces travaux de validation complémentaires sont réalisés sur une population de patients plus grande et plus hétérogène en adéquation avec notre thématique scientifique (gamme plus étendue d'IMC, etc.). Au cours du processus, l'évaluation de la qualité du modèle passe par la mesure d'un score, le processus s'arrête lorsque l'ajout ou la suppression de variables n'améliore plus le score. Deux types de scores sont ici utilisés, le score AIC (Akaike Information Criterion) qui aboutit à un modèle final plus large étant donné une approche prédictive sur les données et le score BIC (Bayesian Information Criterion) qui propose un modèle final plus simple de part une approche explicative de la variabilité contenue dans les données. Seules les variables très significatives (valeur p<10-6) ont été considérées dans les modèles finaux proposés par cette approche statistique avancée.
Le modèle prédictif AIC ainsi que l'analyse prédictive BIC montre une corrélation positive entre l'expression de la 15-LO-1 et le TA abdominal viscéral.
L'ensemble de ces résultats montrent que seule la 15-LO, forme majoritaire dans le TA, est différentiellement exprimée dans le TA abdominal viscéral suggérant un rôle spécifique de la 15-LO dans la régionalisation du TA chez l'homme, notamment par rapport aux autres lipoxygénases.
Exemple 3 : L'expression de la 15-LO-1 est détectée dans les différentes fractions du TA humain, y compris dans les adipocytes et dans les pré- adipocytes, et apparaît comme majoritaire dans la fraction stroma-vasculaire.
Isolement des différentes fractions du TA humain
Les échantillons de TA sont prélevés comme décrits dans l'exemple 1. Après avoir retiré la peau et les vaisseaux sanguins, les morceaux de TA destinés au fractionnement tissulaire sont immédiatement rincés dans une solution de PBS supplémentée par un mélange pénicilline/streptomycine (100 U/100 μg/ml) à 370C, puis incubés en tubes Falcon dans un tampon de digestion (tampon Krebs Ringer 9,5 g/1 ; Hepes 25 mM ; sérumalbumine bovine 20 mg/ml ; 5 mM Glucose (Sigma) ; collagénase type I 1 ,5 mg/ml, (Gibco)), pendant 45 minutes, à 370C, sous agitation, avec un ratio masse de TA/ tampon de digestion de 1g/10 ml. Les lysats de digestion sont ensuite passés sur un filtre de nylon (pore de 200μm) afin de retirer les restes de tissus non digérés (= Matrice ou MC) puis la suspension cellulaire obtenue est centrifugée pendant 15 minutes à 800g pour séparer les adipocytes flottants (fA) qui sont récupérés dans le surnageant de la fraction Stroma-Vasculaire (SV) qui se retrouve dans le culot. Afin d'éliminer les globules rouges de la fraction SV, le culot est remis en suspension dans 5ml de tampon de lyse érythrocytaire (NH4CI 131 mM Carlo-Erba; NH4CO3 9 mM, Prolabo Rectapur) et incubé 15 minutes sur glace dans cette solution. La suspension cellulaire est ensuite centrifugée 10 minutes à 800g et le culot est remis en suspension dans une solution de PBS supplémentée par un mélange pénicilline/streptomycine (100 U/100 μg/ml). Une partie de cette suspension est récupérée pour extraire les ARNs (= ARNs de la fraction SV). L'autre partie de la suspension est incubée sur glace pendant 15-30 minutes, avec des microbilles magnétiques CD14 (CD14 MicroBeads, non-human primate : MicroBilles conjuguées à un anticorps monoclonal lgG2a anti-CD14 humain). La suspension cellulaire est ensuite chargée sur une colonne MACS® afin de récolter les cellules CD14+ correspondant à la fraction monocytes/macrophages du TA, par utilisation d'une colonne magnétique MACS Separator. Les cellules CD14+ retenues magnétiquement sur la colonne sont ensuite éluées selon le protocole du fournisseur (Macs, Miltenyi Biotec, Paris, France). La fraction cellulaire non retenue par la colonne est appauvrie en cellules CD14+ et enrichie en pré-adipocytes et autres types cellulaires et sera considérée comme la fraction enrichie en pré-adipocytes (PA).
Extraction des ARNs totaux des fractions tissulaires et des cellules
Les ARNs totaux sont extraits des différentes fractions (MC, fA, SV, CD14+, PA) par homogénéisation directe en Trizol suivant les recommandations du fournisseur (Gibco BRL, Life technologies), puis traités par la DNAse I et purifiés sur colonne selon la procédure décrite par Qiagen (Qiagen Rneasy procédure). Analyse de l'expression de la 15-LO-1 par RT-PCR et RT-QPCR L'expression relative de la 15-LO-1 est analysée selon les méthodes décrites dans les exemples 1 et 2. Résultats
Les résultats de l'analyse de l'expression de la 15-LO-1 d'un patient, présentés sur la figure 3A, montrent que l'expression de la 15-LO-1 est retrouvée dans le pool de TA abdominal viscéral et que cette expression est détectée dans toutes les fractions du TA abdominal viscéral, avec une expression plus importante dans la fraction Stroma-Vasculaire (SV), qui contient les PA et les cellules CD4+ (macrophages), et une expression plus faible dans les adipocytes matures (fA). Ces résultats sont confirmés par l'analyse de l'expression de la 15-LO-1 par RT- QPCR sur les fractions de TA de 3 patients, dont les résultats sont présentés sur la figure 3B.
Exemple 4 : L'expression de la 15-LO-1 est modulée lors de la différenciation des PA viscéraux humains en adipocytes matures.
Différenciation des PA abdominaux viscéraux humains en adipocvtes
Les PA abdominaux viscéraux humains sont obtenus chez Promocell ou Cambrex (Human White pre-adipocytes (HWP), Promocell (Heidelberg, Germany), Cambrex (Paris, France)) et cultivés selon le protocole du fournisseur.
Les HWP de Promocell sont maintenus dans un milieu de croissance pour PA (0,4% ECGS/H, 5% SVF, 10 ng/ml EGF, 1 μg/ml Hydrocortisone, 50 ng/ml Amphotericine B, 50 μg/ml Gentamicine) jusqu'à confluence. A confluence, les cellules sont différenciées pendant 3 jours avec un milieu de différenciation pour PA (8 μg/ml d- Biotine, 0,5μg/ml Insuline humaine recombinante, 400 ng/ml Dexamethasone, 44μg/ml IBMX, 9 ng/ml L-thyroxine, 3 μg/ml Ciglitazone, 50 ng/ml Amphotericine B, 50 ng/ml Gentamycine), puis cultivées jusqu'au stade de différenciation terminale dans un milieu de nutrition d'adipocytes (3% SVF, 8μg/ml d-Biotine, 0,5 μg/ml Insuline humaine recombinante, 400 ng/ml Dexamethasone, 50 ng/ml Amphotericine B, 50 μg/ml Gentamicine).
Les PA de Cambrex sont maintenus dans un milieu de croissance pour PA (10 % SVF, 100 U/ml Pénicilline, 100μg/ml Streptomycine) jusqu'à confluence puis le milieu est remplacé par un milieu de différenciation (10% SVF, 10 μg/ml insuline humaine recombinante, 1 μM Dexamethasone, 500 μM IBMX, 200 μM indométacine, 100 U/ml Pénicilline, 100 μg/ml Streptomycine) pendant tout le processus de différenciation. Extraction des ARNs et analyse de l'expression de la 15-LO-1 et du gène aP2 par RT-PCR et RT-QPCR
Les ARNs totaux sont extraits des cellules à différents temps pendant la différenciation selon la méthode décrite dans l'exemple 3 et l'expression de la 15-LO- 1 est analysée par RT-PCR et RT-QPCR selon les méthodes décrites dans les exemples 1 et 2. La cinétique d'expression du gène aP2 est utilisée comme témoin positif de la différenciation des cellules (voir le tableau 7). Pour les RT-QPCR, les expressions relatives de la 15-LO-1 et de l'aP2 sont rapportées par rapport au jour de confluence considéré comme JO et normalisées par rapport à l'expression de la cyclophilline.
Tableau 7
Figure imgf000033_0001
Comme attendu, l'expression du marqueur aP2 (adipocyte lipid binding protein) est très faible à JO, augmente très fortement à J3 jusqu'à J7-J14, puis diminue à J21. Résultats
L'analyse de l'expression de la 15-LO-1 au cours de la différenciation des PA de Promocell (culture de PA n°1 , passage 4 - Les PA viscéraux ont été multipliés jusqu'au passage 4, puis différenciés à partir du passage 4) par RT-PCR, dont les résultats sont présentés sur la figure 4A, montrent que l'expression du marqueur aP2 (adipocyte lipid binding protein) est très faible à JO, augmente très fortement à J3 jusqu'à J7-J14, puis diminue à J21. Bien que l'état des cellules à JO ne puisse pas être comparé avec la fraction PA isolée à partir du TA, l'expression de la 15-LO-1 est quand même retrouvée à JO. L'expression de la 15-LO-1 augmente à J3, puis suit la même cinétique que celle du gène aP2 avec une augmentation de l'expression pendant la différenciation jusqu'à J14, puis une baisse à J21. A l'état d'adipocyte (J21 ), la 15-LO-1 est toujours exprimée.
De la même manière, la figure 4B montrent l'expression de la 15-LO-1 au cours de la différenciation de 3 cultures différentes de PA abdominaux viscéraux humains : la modulation de l'expression de la 15-LO-1 au cours de la différenciation adipocytaire est observée sur 3 cultures indépendantes, provenant de 3 patients différents (Les PA viscéraux ont été différenciés à partir du passage 7, 2 ou 4 selon les cultures de PA). Pour les 3 cultures, l'expression du marqueur aP2 augmente progressivement et très fortement au cours de la différenciation jusqu'à J7, puis diminue ensuite à J14, J21. L'expression de la 15-LO-1 augmente pendant le processus de différenciation mais de façon beaucoup plus faible. Le pic d'expression de la 15-LO-1 à J3 est retrouvé chez 2 patients. De façon intéressante, la même cinétique d'expression est retrouvée pour la culture n°1 à passage 4 (figure 4A) et à passage 7 (figure 4B). A l'état d'adipocyte, la 15-LO-1 est toujours exprimée.
Exemple 5 : Le PD146176, un inhibiteur sélectif de la 15-LO, inhibe la différenciation des PA viscéraux humains en adipocytes matures.
Traitement des cellules par le PD146176
Des PA abdominaux viscéraux humains provenant de plusieurs donneurs sont différenciés comme indiqué dans l'exemple 4. Le PD146176, dilué dans du DMSO, est ajouté lorsque les PA atteignent la confluence (soit JO) et est maintenu pendant le processus de différenciation des PA en adipocytes. Du DMSO est ajouté à la concentration de 0,1% final dans le milieu de culture comme témoin négatif. Extraction des ARNs et analyse de l'expression du gène aP2 L'aP2 (adipocyte lipid-binding protein) est, au même titre que l'adiponectine, un marqueur de la différenciation adipocytaire. Les ARNs totaux sont extraits des cellules à différents temps pendant la différenciation (J3, J7) selon la méthode décrite dans l'exemple 3 et l'expression du marqueur aP2 est analysée par RT-PCR ou RT-QPCR comme décrit dans les exemples 1 et 2. Les expressions relatives sont rapportées par rapport au jour de confluence considéré comme JO et normalisées par rapport à l'expression de la cyclophilline. Résultats
L'analyse de l'expression du marqueur aP2 par RT-PCR au 3eme jour de différenciation d'une culture de PA (culture de PA n°1 , passage 7), présentée sur la figure 5A, montre que, à JO, l'expression du marqueur aP2 est très faible puis qu'elle est augmentée fortement à J3 pour le contrôle DMSO. L'ajout du PD146176 dès le début de la différenciation (à JO), diminue l'expression du marqueur aP2 de façon dose-dépendante.
L'analyse de l'expression du marqueur aP2 par RT-QPCR au 7eme jour de différenciation de 2 cultures de PA (culture de PA n°2, passage 5 et culture de PA n°3, passage 4) est présentée sur la figure 5B (l'expression du marqueur aP2 au 7eme jour de différenciation est fixée à 1 pour les cellules recevant le contrôle DMSO (culture n°2) ou pour les cellules ne recevant aucun traitement (culture n°3)) : les cellules incubées avec du PD146176 à 3μM dès JO montrent une expression d'aP2 très fortement inhibée par rapport aux cellules qui reçoivent le DMSO ou qui ne reçoivent aucun traitement. Ainsi, pour la culture n°2, le PD146176 abolit quasi- complètement l'expression de la 15-LO-1 et, pour la culture n°3, cette inhibition est de 90%.
Les résultats, présentés sur les figures 5A et 5B, montrent que l'expression du marqueur aP2, analysée par RT-PCR et RT-QPCR au cours de la différenciation de cultures de PA, diminue de façon dose-dépendante suite à l'addition de PD146176.
Exemple 6 : Le PD146176, un inhibiteur sélectif de la 15-LO, diminue la sécrétion d'adiponectine pendant la différenciation des PA viscéraux humains.
Traitement des PA par le PD 146176 Des PA abdominaux viscéraux humains provenant de plusieurs donneurs sont différenciés comme indiqué dans l'exemple 4. Les PA ayant atteint la confluence (JO) sont incubés en présence du PD146176 comme décrit dans l'exemple 5. Analyse de la sécrétion d'adiponectine
L'adiponectine est un facteur sécrété par les adipocytes et sert, au même titre qu'aP2, de marqueur de la différenciation adipocytaire dans nos cultures. La concentration d'adiponectine est déterminée dans les surnageants de culture à différents temps de différenciation, à l'aide du kit Quantikine human adiponectine/ACRP30 selon le protocole du fournisseur (R&D, Minneapolis, USA). Résultats
La figure 6A montre que la sécrétion d'adiponectine dans le surnageant de culture augmente au cours de la différenciation des PA abdominaux viscéraux humains, avec un pic de sécrétion à J7.
Les cellules traitées par le PD146176 depuis JO montrent une sécrétion d'adiponectine dans le milieu de culture très fortement diminuée à J7 comme le montre la figure 6B. Ce résultat confirme l'inhibition du processus de différenciation qui avait été observée par mesure de l'expression du gène aP2 au 7eme jour de différenciation (figure 5).
Exemple 7 : La 12/15-LO, équivalent fonctionnel de la 15-LO-1 chez les rongeurs, est principalement exprimée dans le TA chez le rat et la souris, et son expression est plus forte dans les TA mésentérique, épididymal et périrénal que dans le TA abdominal sous-cutané.
Extraction de tissus de rongeurs
Les souris C57BI6 et les rats Sprague Dawley (Charles River laboratories) sont soumis à un cycle jour/nuit standard et nourris ad libitum par des aliments pour rongeurs. Les rats Sprague Dawley sont sacrifiés par injection de pentobarbital et les souris sont sacrifiées par dislocation cervicale après anesthésie à l'isoflurane
Extraction des TA
Les différents dépôts de TA sont prélevés (TA sous-cutané abdominal, TA sous-cutané dorsal, TA omental, TA mésentérique, TA périrénal, TA épididymal et TA interscapulaire), coupés en petits morceaux et directement transférés dans de l'azote liquide. Extraction des ARNs et analyse de l'expression de la 12/15-LO par RT-PCR et RT- QPCR
Les ARNs totaux des tissus autres que le TA sont extraits selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Les ARNs totaux de TA sont extraits selon la méthode décrite dans l'exemple 1. Les RT sont réalisées comme décrit dans l'exemple 1 et l'expression de la 12/15-LO de rongeur (voir le tableau 8) est analysée par RT-PCR ou RT-QPCR comme décrit dans les exemples 1 et 2.
Tableau 8
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Résultats
Les résultats de l'analyse de l'expression tissulaire de la 12/15-LO chez le rat et la souris par RT-PCR, présentés sur la figure 7A, montrent une distribution tissulaire assez restreinte de la 12/15-LO chez le rat et la souris: l'expression est en effet retrouvée dans les poumons, dans la rate (chez le rat), dans le muscle (chez la souris) et dans le TA.
L'analyse de l'expression de la 12/15Lox dans les différents dépôts de TA chez le rat montre, sur la figure 7B, que son expression est confirmée dans le TA. L'expression est arbitrairement fixée à 1 dans le TA abdominal sous-cutané dorsal. Comme chez l'homme, l'expression est moins importante dans le TA abdominal sous-cutané (abdominal et dorsal) par rapport aux dépôts de TA profonds comme le TA omental, le TA mésentérique, le TA épididymal et le TA périrénal. L'expression de la 12/15-LO est préférentielle du TA puisqu'une faible expression dans le tissu TA brun (TA interscapulaire) est observée comparée aux autre dépôts.
Exemple 8: Le PD146176, un inhibiteur de la 15-LO, inhibe la différenciation des cellules 3T3-L1 en adipocytes.
Culture des cellules 3T3-L1 et différenciation en adipocvtes La lignée cellulaire de PA 3T3-L1 (ATCC) de souris est maintenue en milieu
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's minimal essential Médium) supplémenté par 10% de SVF, de la L-glutamine et un mélange Pénicilline/Streptomycine. A confluence (JO), les cellules 3T3-L1 sont différenciées par un traitement de 2 jours avec un mélange dexamethasone (0,1 μM), isobutylmethylxanthine (0,25 mM) et insuline (0,4 μM), puis les cellules sont maintenues sous insuline pour 14 jours supplémentaires jusqu'à la différenciation complète. Des photographies sont prises à différents jours après la confluence et permettent de suivre visuellement le processus de différenciation. Traitement des cellules par le PD146176 Le PD146176 est ajouté lorsque les cellules 3T3-L1 atteignent la confluence
(JO) et est maintenu pendant tout le processus de différenciation avec un changement tous les deux jours en même temps que l'insuline. Quantification de la différenciation par Adipored
L'accumulation progressive de gouttelettes intracellulaires est également utilisée comme un marqueur fonctionnel de la différentiation en adipocytes. Pour quantifier cette accumulation, la différenciation des cellules 3T3-L1 est réalisée en plaques de 96 puits. Le jour de la lecture, les plaques sont retirées de l'incubateur pour permettre un retour à température ambiante. Le milieu est retiré, les cellules sont rincées avec précaution par 200μl de PBS, puis 200μl de PBS sont ajoutés dans chaque puits. 5μl de réactif Adipored (Cambrex, Paris, France) sont ajoutés dans chaque puits et les plaques sont mélangées avant lecture. La fluorescence est mesurée à l'aide d'un fluorimètre par excitation à 485 nm et émission à 535 nm. Dosage des triglycérides
Pour le dosage des triglycérides intracellulaires, la différenciation des cellules 3T3-L1 est réalisée en plaque de 24 puits. Les cellules sont lavées 3 fois en PBS, puis 500μl d'un tampon d'homogénéisation (150 mM NaCI, Tris HCL pH=8, 0,1% Triton X-100) sont ajoutés dans chaque puits. Les cellules sont grattées, transférées dans un tube et lysées par sonication pendant 10 secondes à 40 watts. Le lysat obtenu est filtré sur filtre millipore 0,2μM. Le dosage est réalisé sur 125μl du lysat obtenu, à l'aide du kit « Triglycéride L-type » (Wako). Le dosage est normalisé par rapport à la quantité de protéines présente dans les lysats. Extraction des ARNs et analyse de l'expression de la LPL et de l'aP2 par RT-QPCR
Les ARNs totaux sont extraits à différents temps de la différenciation selon la méthode décrite dans l'exemple 3 et les expressions des gènes aP2 et LPL (lipoprotéine lipase) sont analysées par RT-QPCR selon la méthode décrite dans l'exemple 2 (voir le tableau 9).
Tableau 9
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Résultats
Le changement de morphologie des cellules 3T3-L1 au cours de la différenciation adipocytaire est présenté sur la figure 8A : on constate l'acquisition, au cours de la différenciation, de la morphologie d'adipocytes riches en gouttelettes lipidiques (avec apparition des gouttelettes dès J7). L'ajout du PD146176 à JO provoque une inhibition dose-dépendante de l'accumulation de lipides dans les cellules, les gouttelettes étant moins nombreuses et de plus petite taille.
La figure 8B montre que, au cours de la différenciation, le marquage Adipored augmente progressivement jusqu'à 5000 RLU à J14, correspondant à l'accumulation de lipides par les 3T3-L1. L'ajout du PD146176 à JO diminue fortement le marquage
Adipored de façon dose-dépendante dès le 3eme jour de différenciation. L'inhibition est toujours observée à J7 et est encore plus marquée après 14 jours de différenciation où les cellules ayant reçu 10μM de PD146176 ont un marquage Adipored correspondant à celui observé à JO.
L'accumulation de triglycérides par les cellules 3T3-L1 au cours de la différenciation adipocytaire est présentée sur la figure 8C : au cours de la différenciation, les cellules 3T3-L1 se chargent progressivement en triglycérides. Cette augmentation suit exactement la même cinétique que celle observée avec l'Adipored (figure 8B). L'ajout du PD146176 à JO diminue cette accumulation de façon dose-dépendante avec une baisse de 80% à J10 par rapport au contrôle pour la dose la plus forte (10μM).
Enfin, on constate sur la figure 8D que l'expression des marqueurs aP2 et LPL augmente progressivement au cours de la différenciation des cellules 3T3-L1 et que l'ajout du PD146176 à JO provoque une diminution de l'expression des ces deux marqueurs de façon dose-dépendante dès le 3eme jour de différenciation.
Tous ces résultats montrent que le PD146176, un inhibiteur de la 15-LO, inhibe la différenciation des cellules 3T3-L1 en adipocytes. Ces résultats indiquent donc que la 15-LO est un facteur pro-adipogénique et que l'inhibition de son activité entraîne une inhibition de la différenciation adipocytaire. Exemple 9 : L'acide caféique inhibe la différenciation de PA primaires de rat en adipocytes matures.
Différenciation des PA de rat Les cellules de la fraction SV (la technique d'isolement de la fraction est identique à celle décrite dans l'exemple 3) sont ensemencées en plaques 6 puits à une densité de 80 000 cellules/cm2 dans le milieu 199 (Gibco) supplémenté par 10% de SVF et par un mélange Pénicilline/Streptomycine. Après 16 heures d'incubation pour l'adhérence des cellules, les puits sont délicatement rincés par du PBS afin de retirer ce qui n'a pas adhéré. Les cellules sont cultivées jusqu'à confluence. A confluence (JO), le milieu 199 est retiré et remplacé par le milieu ITT (DME/Ham's F12, 15mM NaHCO3, 15mM Hepes, 33μM biotine, 17μM panthotenate, 0,5μM insuline humain, 0,2nM Triiodothyronine et antibiotiques) sans ajout de sérum. Les cellules sont maintenues dans ce milieu pour permettre la différenciation. Le milieu est changé tous les 2-3 jours pendant le processus de différenciation. Traitement des cellules par l'acide caféique
L'acide caféique (2,2 μM) est ajouté lorsque les PA de rat atteignent la confluence (JO) et est maintenu pendant le processus de différenciation en adipocytes. A la concentration de 2,2 μM, l'acide caféique est considéré comme un inhibteur sélectif de la 15-LO (Shureiqi I, Chen D, Lee JJ, Yang P, Newman RA, Brenner DE, Lotan R, Fischer SM and Lippman SM, 2000). Du DMSO est ajouté à la concentration de 0,1% final dans le milieu de culture comme témoin négatif. Extraction des ARNs et analyse de l'expression du gène aP2
Les ARNs totaux sont extraits à différents temps de la différenciation selon la méthode décrite dans l'exemple 3 et les expressions des gènes aP2 et LPL sont analysées par RT-PCR quantitative selon la méthode décrite dans l'exemple 2 (voir le tableau 10).
Tableau 10
Gène Séquences des amorces (5' -> 3') Taille du Numéro produit de Genbank
PCR (pb)
Figure imgf000042_0001
Résultats
La figure 9A montre les effets de l'acide caféique sur la morphologie des PA de rat au cours de la différenciation adipocytaire: comme pour les cellules 3T3-L1 , les PA de rat changent progressivement de morphologie au cours du processus de différenciation adipocytaire pour acquérir une morphologie d'adipocytes riches en gouttelettes lipidiques (avec apparition des gouttelettes dès J5) et l'ajout d'acide caféique à la dose de 2,2μM à JO provoque une inhibition de l'accumulation de lipides dans les cellules (gouttelettes moins nombreuses et de plus petite taille).
La figure 9B montre les effets de l'acide caféique sur l'expression de l'aP2 par les PA de rat au cours de la différenciation adipocytaire : comme cela avait été observé pour les PA humains ou les cellules 3T3-L1 , l'expression de aP2 augmente au cours de la différenciation des PA de rat, ceci dès J3 (comparaison des points contrôle JO et J3) et l'ajout de l'acide caféique à la dose de 2,2μM dès JO diminue l'expression de l'aP2 à J3, corrélant avec les observations réalisées au microscope (figure 9A).
Exemple 10 : La surexpression de la 15-LO humaine dans les cellules 3T3-L1 stimule la différenciation adipocytaire.
Transfection transitoire des cellules 3T3-L1
Les cellules 3T3-L1 sont cultivées comme décrit dans l'exemple 8. Au stade fibroblaste, 3.105 cellules en suspension/ml sont transfectées de manière transitoire avec 2μg de plasmide codant la 15-LO humaine sous contrôle du promoteur aP2 (plasmide ap2-15-LO) ou de plasmide pBlueScript SKII+ comme contrôle négatif à l'aide du kit "jetPEl™" selon les conditions préconisées par le fournisseur (Polyplus transfection). 1 ml de cellules transfectées sont ensemencées dans des plaques 12 puits pour l'extraction d'ARN et 100μl dans des plaques 96 puits pour le dosage des triglycérides intracellulaires. 2 jours après la transfection, les cellules sont différenciées en adipocytes matures comme décrit dans l'exemple 8. Dosage des triglycérides
L'accumulation des triglycérides intracellulaires à différents temps du processus de différenciation adipocytaire des cellules 3T3-L1 transfectées est déterminée selon une amélioration du protocole du kit "TG PAP 10003" de bioMérieux SA (France). Brièvement, les cellules sont incubées avec 20μl d'isopropanol pendant 30 min à température ambiante. 100μl de réactif triglycérides sont ajoutés dans chaque puits et les plaques sont incubées pendant 30 min à 370C. L'absorbance est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre à 492 nm. Extraction des ARNs et analyse de l'expression de l'aP2. de C/EBPα et de l'adiponectine par RT-QPCR
Les ARNs totaux sont extraits à différents temps de la différenciation selon la méthode décrite dans l'exemple 3 et l'analyse de l'expression des marqueurs de la différenciation adipocytaire aP2, C/EBPα_et de l'adiponectine sont analysées par RT- QPCR selon la méthode décrite dans l'exemple 2 (voir le tableau 11 ).
Tableau 11
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Sécrétion d'adiponectine
Comme dans le cas des adipocytes primaires humains décrits dans l'exemple 6, l'adiponectine sert de marqueur de la différenciation adipocytaire dans les cultures. La concentration d'adiponectine est déterminée dans les surnageants de culture à différents temps de différenciation à l'aide du kit DuoSet® ELISA mouse Adiponectine/ACRP30 selon le protocole du fournisseur (R&D, Minneapolis, USA).
Résultats
L'accumulation de triglycérides par les cellules 3T3-L1 transfectées au cours de la différenciation adipocytaire est présentée sur la figure 10A : Au cours de la différenciation, les cellules transfectées se chargent progressivement en triglycérides. A partir du jour 7 de différenciation, les cellules surexprimant la 15-LO accumulent de manière significative environ 2 fois plus de triglycérides que les cellules transfectées avec le plasmide contrôle pBlueScript SKII+.
On constate sur la figure 10B que la surexpression de la 15-LO dans les cellules 3T3-L1 provoque une augmentation très significative de l'expression de l'ensemble des marqueurs de la différenciation adipocytaire testés (aP2, C/EBPα et adiponectine) comparée à l'expression de ces gènes dans les cellules transfectées avec la plasmide contrôle. Cette augmentation significative apparaît dès le 3eme jour de différenciation pour l'expression de l'aP2 et de C/EBPα. Enfin, comme le montre la figure 1OC, l'augmentation de l'expression de l'adiponectine est corrélée à une augmentation de sa sécrétion par les cellules surexprimant la 15-LO comparée aux cellules transfectées avec le plasmide contrôle.
L'ensemble des ces résultats montrent que la surexpression de la 15-LO stimule la différenciation des cellules 3T3-L1 en adipocytes matures. Ces résultats, en combinaison avec les résultats d'inhibition pharmacologique de l'activité 15-LO décrits dans les exemples 5, 6, 8 et 9, confirment donc le rôle pro-adipogénique de la
15-LO.
Exemple 11 : Les souris déficientes pour la 12/15-LO sont résistantes à l'obésité induite par un régime riche en graisse.
Elevage des animaux
Les souris déficientes pour le gène 12/15-LO dans un fond génétique C57BI/6J ont été obtenues du Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, États-Unis). On désignera par la suite dans le texte les souris déficientes pour le gène 12/15-LO sous la dénomination LOKO. Les souris C57BI/6J, utilisées comme contrôles, ont été obtenues de Charles River Laboratories (L'ArbresIe, France). Les animaux sont soumis à un cycle jour/nuit de 12 h. Pour le protocole d'obésité induite par le régime hyperlipidique, seules les souris mâles sont utilisées. Du sevrage jusqu'à l'âge de 7 semaines, les souris ont été nourries ad libitum par des aliments destinés à l'élevage des rongeurs contenant 7% de matières grasses (référence: R0310; fournisseur : UAR, Villemoisson, France). A 7 semaines d'âge, les animaux (n=6-7 par groupe) sont nourris ad libitum soit avec un régime standard à faible teneur en graisse (10,5 kcal%; référence : D12329; fournisseur : Research Diets) soit avec un régime riche en acides gras saturés (58 kcal%; référence : D12331 ; fournisseur : Research Diets). Les animaux sont soumis à ces régimes pour une période de 11 à 12 semaines au cours de laquelle une prise de poids hebdomadaire est effectuée. Détermination de la masse grasse Après 12 semaines sous régime, la masse grasse de 2 souris de chaque groupe est déterminée par densitométrie grâce au Piximus (Lunar Corporation, Madison, États-Unis) dont les deux faisceaux de rayons X à énergies différentes permet la mesure de la masse grasse (lipides), de la masse maigre (protéines et eau) et de la masse osseuse. Pour les mesures, les souris sont anesthésiées par un mélange kétamine et xylazine. Une fois, totalement endormies, les souris sont pesées et mesurées, et mises sous les rayons X, face ventrale vers le bas. La mesure des différents paramètres obtenus exclut la tête de l'animal. A la fin de la mesure, les animaux ainsi que les souris restantes (n=2-3) sont sacrifiés par dislocation cervicale et les TA épididymal et périrénal sont prélevés et pesés. Détermination de la taille des adipocvtes
Après 11 semaines de régime, 2 animaux de chaque groupe sont sacrifiés par dislocation cervicale après anesthésie à l'isoflurane. Un échantillon de TA épididymal de chaque souris est prélevé, fixé dans une solution de paraformaldéhyde 4% pH 7,4 puis inclus en Tissue-Tek® OCT. Le TA est ensuite coupé en sections de 7 μm qui sont colorées à l'hématoxyline. La taille des adipocytes (n=1000) est déterminée grâce au Quips Image analysis System (Leica Mikroskopic und System GmbH, Wetzlar, Germany).
Résultats
Les résultats de la figure 11A montrent que les souris LOKO sous régime hyperlipidique pendant 12 semaines ont un gain de poids de corps significativement inférieur à celui observé pour les souris C57BI/6J contrôles. Même sous un régime standard, une différence de gain de poids est observée entre les souris LOKO et les souris contrôles bien que cette différence soit beaucoup plus faible et n'atteigne pas la significativité statistique. Aucune différence dans la gain de poids n'est détectée entre les souris LOKO sous régime hyperlipidique et celles sous régime standard. L'analyse de la composition corporelle par densitométrie montrée dans la figure 11 B indique que la masse grasse des souris LOKO est beaucoup plus faible que celle des souris C57BI/6J quel que soit le régime. De plus, alors que le régime hyperlipidique induit une augmentation de la masse grasse chez les souris C57BI/6J , les souris LOKO sous ce même régime ne développent pas plus de masse grasse que celles sous régime standard. Les poids des TA épididymal et périrénal des souris C57BI/6J et LOKO sous régime standard ou hyperlipidique sont présentés sur la figure 11C : leurs poids corrèlent parfaitement avec les résultats de densitométrie (figure 11 B). Le poids des TA épididymal et périrénal des souris LOKO est plus faible que celui des souris C57B/6J quel que soit le régime et le régime hyperlipidique induit une augmentation significative du poids du TA épididymal et périrénal chez les seules souris C57BI/6J contrôles. Ces résultats indiquent que la différence de poids, ainsi que du gain de poids, des souris LOKO et des souris C57BI/6J est majoritairement attribuable à une réduction du développement du tissu adipeux.
L'analyse histologique du TA épididymal des souris C57BI/6J et LOKO sous régime standard ou régime hyperlipidique pendant 12 semaines est représentée dans la figure 11 D : les adipocytes des souris LOKO sous régime hyperlipidique sont remarquablement plus petits que ceux des souris C57BI/6J contrôles. Afin d'évaluer quantitativement la taille des cellules adipeuses, des analyses morphométriques de sections de tissu adipeux ont été réalisés et les résultats présentés sur la figure 11 E : La taille moyenne des adipocytes des souris LOKO n'est pas affectée par le régime hyperlipidique tandis qu'elle augmente significativement dans le TA épididymal de souris contrôles C57BI/6J comparée à l'effet du régime standard.
L'ensemble de ces résultats montrent que l'absence d'expression de la 12/15- LO, et plus spécifiquement l'absence de l'activité 15-LO, affecte le développement du TA abdominal viscéral et le stockage des triglycérides dans les adipocytes in vivo et empêche le développement de l'obésité induite par un régime hyperlipidique.
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Claims

REVENDICATIONS
1- Utilisation d'au moins un agent inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO de manière sélective pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'obésité.
2- Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que l'obésité correspond à l'obésité abdominale viscérale.
3- Utilisation selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la 15-LO est la 15-LO-1.
4- Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'agent inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO est un composé capable d'inhiber partiellement ou totalement l'activité de la 15-LO.
5- Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'agent inhibant partiellement ou totalement l'expression et/ou l'activité de la 15-LO est un composé capable d'inhiber partiellement ou totalement l'expression de la 15-LO.
6- Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'agent inhibant partiellement ou totalement l'activité de la 15-LO présente une IC50 inférieure ou égale 1 μM.
7- Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'agent inhibant partiellement ou totalement l'activité de la 15-LO est le composé PD146176.
8- Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'agent inhibant partiellement ou totalement l'activité de la 15-LO est un anticorps anti-15-LO. 9- Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'agent inhibant partiellement ou totalement l'expression de la 15-LO est une molécule d'acide nucléique antisens.
10- Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'agent inhibant partiellement ou totalement l'expression de la 15-LO est une molécule d'ARN interfèrent.
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