WO2007085652A1 - Utilisation de l'enantiomere (s) de la mequitazine pour la preparation d'un medicament, tout en limitant la toxicite genomique - Google Patents

Utilisation de l'enantiomere (s) de la mequitazine pour la preparation d'un medicament, tout en limitant la toxicite genomique Download PDF

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WO2007085652A1
WO2007085652A1 PCT/EP2007/050828 EP2007050828W WO2007085652A1 WO 2007085652 A1 WO2007085652 A1 WO 2007085652A1 EP 2007050828 W EP2007050828 W EP 2007050828W WO 2007085652 A1 WO2007085652 A1 WO 2007085652A1
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mequitazine
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Alain Latil
Jacky Tisne-Versailles
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Pierre Fabre Medicament
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Definitions

  • the present invention relates to the use of a mixture of enantiomers of 10- (1-azabicyclo [2.2.2] oct-3-yl-methyl) -10H-phenothiazine (mequitazine) and / or at least one of its metabolites, as well as their pharmaceutically acceptable salts, said mixture being enriched in the enantiomer of absolute configuration (S), for the preparation of an antihistamine drug intended to prevent or treat allergic conditions, while limiting the risks of cellular toxicity , including tissue and / or organic toxicity.
  • Mequitazine is a substituted phenothiazine derivative of the formula:
  • the mequitazine molecule has an asymmetric carbon leading to two different spatial configurations:
  • Mequitazine thus exists in the form of two optically active enantiomers: the levorotatory enantiomer of configuration (S) and the dextrorotatory enantiomer of configuration (R).
  • Mequitazine is an antihistamine H1 used to prevent or treat various manifestations of allergic origin, such as:
  • allergic reactions namely the symptomatic treatment of cutaneous, ocular, ENT and allergic reactions of hypersensitivity reactions during desensitization treatments, "allergic rhinitis, especially hay fever,
  • Mequitazine In France, the racemic mixture of mequitazine is marketed as a tablet (Quitadrill®) or as syrup (Primalan®). Mequitazine is classified as a non-sedating antihistamine H1. Mequitazine has, parallel to its antihistaminic activity H1, an alpha adrenolytic effect and an atropinic effect which may result, for example, in dryness of the mouth or disturbance of accommodation. The pharmacological properties of mequitazine differ from those of sedative antihistamines only at the lowest 5 mg non-sedating dose; at the dose of 10 mg it is sedative.
  • terfenadine The mode of action of terfenadine has been studied.
  • This molecule has a blocking action on potassium channels equivalent to quinidine and this before its transformation during the first passage through the liver, the active substance, terfenadine carboxylate.
  • the latter does not have the same blocking characteristics at the level of the potassium channels.
  • the enzyme responsible for this hepatic biotransformation is CYP3A4 dependent on cytochrome P 450.
  • the activity of this enzyme is very variable in the general population and the difference in potency of activity between the two extremes of the distribution is of the order by a factor of 10, which may explain the differences in concentration of terfenadine and terfenadine carboxylate for the same dose of drug absorbed as a function of the individual and outside of any pathological process.
  • any substance inhibiting this liver enzyme increases the rate of terfenadine and thus the blocking power Potassium channels that lengthen the QT pathologically creating late postpotentials that can trigger a torsade de pointes.
  • spiromycin may have blocked the enzyme that promotes degradation of mequitazine.
  • This enzyme could be CYP2D6 (Janicki et al., Med SCI Monit, 2005; 11 (10): AR 322-328).
  • the present invention relates to the use of a mixture of enantiomers of 10- (1-azabicyclo [2.2.2] oct-3-yl-methyl) -10H-phenothiazine (mequitazine) and / or at least one of its metabolites, as well as their pharmaceutically acceptable salts, said mixture being enriched in the absolute configuration enantiomer (S), for the preparation of an antihistamine drug intended to prevent or treat allergic conditions, while limiting the risks of cellular toxicity, including tissue and / or organic toxicity, in particular the risks of cardiotoxicity.
  • S absolute configuration enantiomer
  • Cellular toxicity is the toxicity to cells, that is, the character of a substance capable of impairing normal cell activity or causing death. cells.
  • the toxicity is tissue or organic if the alteration extends respectively to the tissue or the organ constituted by these cells and to their function.
  • Cardiotoxicity refers to toxicity to cardiac cells. In particular, it leads to alterations in myocardial function that may include necrosis or apoptosis of myocardial cells. These alterations can lead to various cardiac disorders, such as cardiac myocardial ischemia, prolongation of the interval
  • the subject of the present invention is therefore the use of a mixture of enantiomers of 10- (1-azabicyclo [2.2.2] oct-3-yl-methyl) -10H-phenothiazine (mequitazine) and / or from least one of its metabolites, as well as their pharmaceutically acceptable salts, said mixture being enriched in the enantiomer of absolute configuration (S), for the preparation of an antihistamine drug intended to prevent or treat allergic conditions, while limiting the risks myocardial ischemia, prolongation of the QT or QTc interval, cardiac arrhythmia, including torsades de pointes, cardiomyopathy, cardiac hypertrophy or myocardial infarction, diastolic disorder or systolic dysfunction.
  • S enantiomer of absolute configuration
  • the metabolite of mequitazine is defined as one of these two forms.
  • “Pharmaceutically acceptable salt” means all salts which retain the efficacy and properties of an active ingredient and which do not show any side effects.
  • it is a pharmaceutically acceptable mineral or organic acid salt.
  • examples include the halohydrates, such as hydrochloride and hydrobromide, fumarate, maleate, oxalate, citrate, methane sulfonate, glutamate, tartrate, mesylate, and their possible hydrates.
  • the preferred salt of mequitazine is mequitazine hydrochloride.
  • enantiomeric mixture of enantiomerically enriched mequitazine means a mixture of enantiomer (S) and enantiomer (R) of mequitazine in which the mass ratio between the enantiomer (S) and the enantiomer (R) is greater than 1: 1.
  • the mass ratio between the enantiomer (S) and the enantiomer (R) of mequitazine in said mixture is greater than 95: 5 ((S): (R)), preferably greater than 99: 1 even more preferably greater than 99.5: 0.5.
  • said enantiomeric mixture is substantially pure to the (S) enantiomer.
  • the enantiomeric mixture according to the present invention is particularly useful for the preparation of medicaments intended to prevent or treat allergic diseases, chosen in particular from allergic rhinitis, vasomotor rhinitis, spasmodic rhinitis, allergic conjunctivitis, angioedema, urticaria, drug allergies, pruriginous dermatological conditions.
  • the enantiomeric mixture according to the invention preferably the substantially pure (S) enantiomer, is administered to any type of patient requiring such treatment, whether for therapeutic and / or prophylactic purposes.
  • the aim is the eradication or amelioration of the condition to be treated and / or one or more associated symptom (s).
  • it is intended to prevent the appearance of the condition to be treated and / or one or more associated symptom (s).
  • the enantiomeric mixture according to the invention is more particularly suitable for at-risk patient populations that are likely to develop certain undesirable clinical manifestations during or following treatment with mequitazine in racemic form. These include patients with cardiopathy, electrolyte disturbances, bradicardia or congenital long QT syndrome.
  • the compounds tested are mequitazine in racemic form, 1-mequitazine and dmequitazine.
  • each compound was solubilized in DMSO due to their insolubility in water and the impact of ethanol and methylene chloride on the extraction of the RNAs.
  • Loratadine SIGMA Catalog # L9664-10MG was used as a comparator.
  • rat cardiomyocytes H9c2 (2-1) ECACC N °: 88092904 (supplier SIGMA) Description: Rat DBlX heart myoblast
  • the cells are amplified under standard culture conditions (See below).
  • Rat cardiomyocytes (H9c2 line) are treated with 15 ⁇ M mequitazine, L-mequitazine, d-mequitazine and loratadine.
  • RNA is extracted from both vehicle-treated H9c2 cells (DMSO, which serves as control) and compound-treated cells after 6 hours and 24 hours incubation.
  • DMSO vehicle-treated H9c2 cells
  • compound-treated cells after 6 hours and 24 hours incubation.
  • the impact of the treatment on the expression of 97 genes selected as potential toxicity markers is analyzed by quantitative RT-PCR.
  • the molecular signatures induced by the compounds make it possible to define an index of toxicity of the various compounds.
  • the protocols used for cell culture and treatment are as follows:
  • each plate is made in 2 copies to collect the RNAs at two different times (6 hours and 24 hours).
  • the cells are placed at 37 ° C, 5% CO2
  • RNABle® Eurobio
  • RNAs were extracted using RNABle® (Eurobio, Catalog # GEXEXT00-0U). The cells are collected in 1 ml of RNABle in order to dissociate the nucleoprotein complexes, then 100 ⁇ l of chloroform are added to separate the proteins from the nucleic acids. After centrifugation for 20 min at 12500 g, 4 ° C, the upper aqueous phase containing the RNA is recovered. The RNAs are then precipitated by adding 600 ⁇ l of isopropanol.
  • RNA pellet obtained is washed in 700 ⁇ L of ethanol at 75 ° C. and centrifuged. at 12,500 g for 15 minutes at 4 ° C. Finally, the pellets are dried and dissolved in millipore water.
  • Protocol for Reverse Transcription Products SuperscriptTM II Reverse Transcriptase, RT 5X, DTT (Invitrogen Catalog # 18064-014); Random Hexamer (Amersham Catalog # 27-2166-01); dNTP set 100 mM solution (Amersham Catalog # 27-2035-01); RNAsine Ribonuclease Inhibitor (Promega Catalog # N21 IB).
  • Reverse transcription is carried out for 1 ⁇ g of RNA in a final volume of 20 ⁇ l containing 4 ⁇ l of 5X RT buffer, 4 ⁇ l of DTT (dithiotreisol), 1 ⁇ l of dNTP (10 mM), 6 ⁇ l of random hexamers (500 ⁇ l).
  • ng / ⁇ L 0.5 ⁇ L of RNAsin (40 U / ⁇ L) and 0.5 ⁇ L of RTase Superscript (200 U / ⁇ L).
  • the samples are then incubated for 10 minutes at 25 ° C., 50 minutes at 42 ° C. and then 15 minutes at 75 ° C. in order to inactivate the enzyme, and stored at 4 ° C.
  • the total RNAs extracted are assayed and their qualities are determined. analyzed on the Agilent Bio-Analyzer.
  • Theoretical Real-time PCR is an accurate, sensitive and rapid method that allows the relative quantification of the expression level of a target gene relative to that of a ubiquitously expressed reference gene.
  • This technique makes it possible to quantify the messenger RNA.
  • This operation is performed after reverse transcription of the complementary DNA RNAs by extension of two primers located on either side of the target to be amplified by means of a DNA polymerase.
  • the incorporation of a fluorophore (SYBR Green) allows quantification and real-time monitoring of the amount of neoformed amplification product.
  • the quantitative values are obtained from the number of threshold cycles (Ct: cycle threshold) at which the signal increase, associated with an exponential growth of the PCR product, begins to be detected using a Biosystems PE analysis program according to the manufacturer's manual.
  • Ct threshold cycles
  • the greater the amount of cDNA of the target gene at zero time is important the lower the number of Ct is (number of cycles to reach the threshold).
  • reference gene In order to standardize the analyzes carried out in QRT-PCR, it is necessary to quantify in parallel at least one endogenous control called "reference gene". These genes must have constitutive expression independent of the treated or untreated situation of the cells. Several reference genes were tested.
  • L represents the 3 'position of the antisense primer according to the GenBank reference
  • the Ct (Cycle Threshold) corresponds to the number of cycles required to reach, from
  • cDNA rat heart RNA, BD Biosciences Clontech
  • NTC Non Template Control
  • the slope is obtained by successive dilution (4 points) of 10 in 10.
  • a slope at 3.32 is representative of a 100% efficiency of the pair of primers.
  • GAPDH which codes for Glyceraldehyde-3-phosphate and is commonly used as an endogenous control
  • RPLPO which codes for rat ribosomal phosphoprotein PO. It should be noted that RPLPO is also known as 36B4 which is widely used as an endogenous control gene in Northern blot.
  • both RPLPO and GAPDH are quantified in all samples analyzed.
  • the expression values of each gene are also normalized, at first, so that the value of the H9c2 cells treated with the vehicle (control) is equal to 1.
  • the RQ value obtained for each compound at a given time for a given gene represents the relative expression of the gene after treatment with the same dose of compound (15 ⁇ M) compared with the control cells whose RNA was removed at the same time. same time (6 hours or 24 hours).
  • primers were made with the assistance of computer programs including Oligo 4 (National Biosciences, Plymouth, MN).
  • the selection criteria concern the size of the fragment to be amplified (between 80 and 120 nucleotides), the size of the primers (between 21 and 25 nucleotides), the hybridization temperature of the primers (about 65 ° C.) and the position of the primers; indeed, the primers are designed so that one of the two primers is straddling an intron and an exon or that the two primers are in two different exons if the intron separating them is greater than 2KB (except for some gene exceptions without intron).
  • the choice of the specific position of the primers makes it possible to avoid the amplification of genomic DNA in case of contamination of the samples even if no contamination has been observed on the Bio-Analyzer (Agilent). Another important selection criterion is to ensure that the pair of primers chosen does not form a duplex which would interfere nonspecifically with the specific PCR product obtained and thus distort the result (inherent in the SYBR technique). Finally, the primers are chosen so that they do not contain consensus regions and / or polymorphisms.
  • the total specificity of the nucleotide sequences chosen as primers of the target gene is tested by performing a collage (nucleotide-nucleotide blastn) on the entire rat genome (Altschul et al, 1990).
  • the effectiveness of the primers is tested by a 10-fold (4-point) dilution range made on rat heart RNA (BD Biosciences Clontech, Catalog #: 636623). Only pairs of primers with an efficiency of at least 90% (slope between 3.32 and 3.70) are retained.
  • Matrix-free amplification (NTC for Non Template Control) is also performed to ensure that no duplex is formed which can distort the quantitative PCR results obtained by the SYBR Green method.
  • the amplifications are performed on an ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems) by SYBR Green (SYBR Green PCR Core) method. Reagents kit, Applied Biosystems).
  • the amplification consists of a denaturation step (10 min at 95 ° C.) followed by the repetition of 40 cycles of hybridization (15 sec at 95 ° C.) and extension (1 min at 65 ° C. ) which ensure an exponential duplication of each strand.
  • the experiments are performed in duplicate for each data point and the values are retained with a 95% confidence interval.
  • the dissociation curve obtained on the 7900HT apparatus makes it possible to ensure that the amplification product obtained is unique and its specificity is controlled by direct sequencing of the PCR product.
  • the genes selected were used to screen for different metabolic processes induced in response to oxidative or metabolic stress.
  • Table 4 List of genes quantified by quantitative RT-PCR
  • PARP ADPRT ADP-RIBOSYLTRANSFERASE
  • NAD + ADP-RIBOSYLTRANSFERASE
  • POLY ADP-RIBOSYLTRANSFERASE
  • HIF 1 A HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR 1, ALPHA
  • APAP1 Apoptotic protease activating factor 1
  • BCL2L1 Bcl2-Like 1 known under the name of BCL-XL
  • EGR1 Early growth response 1
  • DDIT3 DNA damage-inducible transcript 3
  • GADD45A growth arrest- and DNA damage-inducible gadd45 gene, alpha
  • IL6 Interleukin 6
  • CDK2 0.27 0.58 0.53 0.84
  • TNNB myocardial ischemia
  • the genes directly related to the apoptosis phenomenon are: AHR, BCL2, BCL2C1, BCL2L2, BID, BIRC3, CASP8, DDIT3, EGR1, GADD45A, HMOX1, MGMT, NFKB1, TNFRSF6.
  • the genes that can account for a potential myocardial ischaemia and surely model-dependent is shown in Table 8.
  • the expression of over-expressed genes varies from a factor of 2.06 (CAT by loratadine) to a factor of 10, 16 (CAT with d-mequitazine) compared to untreated cells.
  • the repression varies from a factor 2 (PCNA by d-mequitazine) to an almost total loss of expression (TIMP1 by racemic mequitazine).
  • 1-mequitazine induces the dysregulation of 16 genes, d-mequitazine that of 25 genes, mequitazine racemic 24 genes and loratadine that of 6 genes
  • toxicity index is based on the number of deregulated genes, the following classification may be proposed for the most toxic or least toxic: d-mequitazine> mequitazine> 1-mequitazine »loratadine.
  • Table 6 Toxicity index of the compounds at a dose of 15 ⁇ M.
  • the toxicity index represents the number of genes deregulated by a factor
  • BCL2 (Hockenbery & al., Nature, 348: 334-336, 1997) and BCL2L2 (Gibson et al., Oncogene, 13: 665-675, 1996) which are promoters of survival when the cells are subjected to cytotoxicity conditions, AHR (Puga et al., Biochem, Pharmacol, 199-207, 2005), well known in toxicology for its role in the response to toxicity via the regulation of CYPlA1, HMOX1 (Yoshida et al., J. Biochem., 171: 457). -461, 1998) coding for a Heat Shock Protein (HSP 32) whose increase is directly correlated to oxidative stress.
  • HSP 32 Heat Shock Protein
  • genes involved in proliferation such as CDK2, PCNA, TOP2A, and AGTRAP.
  • genes involved in proliferation such as CDK2, PCNA, TOP2A, and AGTRAP.
  • Such a decrease is consistent with the increased expression of genes involved in cell cycle arrest in order to repair damage to DNA, the main markers DDIT3 and GADD45A are particularly affected in the sense of overexpression.
  • KCNH2 The expression of KCNH2 (HERG) is induced by racemic mequitazine and its enantiomers. KCNH2 is associated with an increase in QT (LQT2 syndrome) and torsades de pointes.
  • TNFRSF6 1.80 1.31 1.37 CHEK2 1,58 1,14 1,38
  • the ratio represents the ratio of expression of mequitazine versus 1-mequitazine
  • KCNH2 is a gene associated with congenital long QT syndrome (De Bruin & al.
  • EDG2 receptor for lysophosphatidic acid is considered as a marker of myocardial infarction (Pastinen et al Human Molec Gen 7: 1453-1462, 1998),
  • ADRB2 whose antagonists (beta-blockers) constitute a class of drugs used in cardioprotection (Baker, Br. J. Pharmacol 317-322, 2005),
  • TNNI3 the cardiac Troponin I gene, as a marker for the risk of developing heart disease (Mogensen et al, J. Am., Cardiol Coll., 44, 12.
  • the ratio represents the expression ratio of d-mequitazine versus 1-mequitazine
  • the dextrorotatory enantiomer affects upward the expression of a majority number of genes and this in a significant extent. This therefore testifies to a cardiac toxicity more marked for the dextrorotatory enantiomer compared to levorotatory and this especially as patients likely to receive treatment with mequitazine have a genetic or physiological determinism representative of a heart sensitivity. It appears that the use of a levorotatory enantiomer-enriched mixture of mequitazine for the manufacture of a medicament for treating allergic diseases in at-risk patient populations, particularly patients presenting or likely to present cardiopathy, electrolyte disturbances, bradycardia or congenital long QT syndrome is of major interest.
  • EXAMPLE 2 EVALUATION OF ACUTE TOXICITY IN THE RAT - DETERMINATION OF LD50
  • Acute toxicity was assessed in male and female rats by oral dosing of increasing dose of mequitazine (racemic, enantiomer d or enantiomer 1) to determine the lethal dose for 50% of the population assessed.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un mélange d'énantiomères du 10-(1- azabicyclo[2.2.2]oct-3-yl-méthyl)-10H-phénothiazine (Méquitazine) et/ou d'au moins un de ses métabolites, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, ledit mélange étant enrichi en l'énantiomère de configuration absolue (S), pour la préparation d'un médicament antihistaminique destiné à prévenir ou traiter des affections allergiques, tout en limitant les risques de toxicité cellulaire, notamment la toxicité tissulaire et/ou organique.

Description

«Utilisation de l'énantiomère (S) de la Méquitazine pour la préparation d'un médicament, tout en limitant la toxicité génomique»
La présente invention concerne l'utilisation d'un mélange d'énantiomères du 10-(l- azabicyclo[2.2.2]oct-3-yl-méthyl)-10H-phénothiazine (Méquitazine) et/ou d'au moins un de ses métabolites, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, ledit mélange étant enrichi en l'énantiomère de configuration absolue (S), pour la préparation d'un médicament antihistaminique destiné à prévenir ou traiter des affections allergiques, tout en limitant les risques de toxicité cellulaire, notamment la toxicité tissulaire et/ou organique.
La méquitazine est un dérivé de phénothiazine substitué de formule :
Figure imgf000002_0001
La molécule de Méquitazine possède un carbone asymétrique conduisant à deux configurations spatiales différentes :
Figure imgf000003_0001
énantiomère (S) lévogyre énantiomère (R) dextrogyre
La Méquitazine existe ainsi sous la forme de deux énantiomères optiquement actifs : l' énantiomère lévogyre de configuration (S) et l' énantiomère dextrogyre de configuration (R).
Les deux énantiomères de la Méquitazine peuvent être séparés et isolés selon des procédés décrits par exemple dans les demandes de brevet EP 0089860 ou EP 0093643.
La Méquitazine est un antihistaminique Hl utilisé pour prévenir ou traiter diverses manifestations d'origine allergique, telles que :
• les réactions allergiques, à savoir le traitement symptomatique des réactions d'hypersensibilité immédiate cutanées, oculaires, ORL et des réactions allergiques au cours des traitements de désensibilisation, « la rhinite allergique, en particulier le rhume des foins,
• la rhinite vasomotrice,
• la conjonctivite allergique,
• le prurit,
• l'urticaire, en particulier l'urticaire aiguë, • l'allergie médicamenteuse.
En France, le mélange racémique de Méquitazine est commercialisé sous forme de comprimé (Quitadrill®) ou bien sous forme de sirop (Primalan®). La méquitazine est classée parmi les antihistaminiques Hl non sédatifs. La méquitazine possède, parallèlement à son activité antihistaminique Hl, un effet adrénolytique alpha et un effet atropinique pouvant se traduire, par exemple, par une sécheresse de la bouche ou un trouble de l'accommodation. Les propriétés pharmacologiques de la méquitazine ne diffèrent de celles des antihistaminiques sédatifs qu'à la dose la plus faible 5 mg qui n'est pas sédative; à la dose de 10 mg elle est sédative.
Dans certaines conditions, notamment en cas de surdosage ou chez des personnes prédisposées, certains antihistaminiques Hl peuvent induire une toxicité cardiaque et provoquer des troubles cardiaques graves, pouvant être parfois mortels. Par exemple, la terfénadine et l'astémizole ont été retirés du commerce parce qu'ils sont, dans certaines conditions, à l'origine de troubles de la conduction cardiaque, comme l'allongement de l'espace QT pouvant conduire à des torsades de pointe. Cet effet indésirable est lié à leur effet sur les canaux potassiques notamment, conduisant à un ralentissement de la vitesse de repolarisation. Par ailleurs, la mizolastine et l'ébastine peuvent aussi, en cas de surdosage, entraîner un allongement de l'espace QT. La prise concomitante de médicaments pouvant ralentir leur catabolisme est à éviter, notamment macrolides et antifongiques imidazolés.
On a étudié le mode d'action de la terfénadine. Cette molécule possède une action bloquante sur les canaux potassiques équivalente à la quinidine et cela avant sa transformation lors du premier passage hépatique, en substance active, la terfénadine carboxylate. Cette dernière, par contre, ne possède pas les mêmes caractéristiques de blocage au niveau des canaux potassiques. L'enzyme responsable de cette biotransformation hépatique est la CYP3A4 dépendante du cytochrome P 450. L'activité de cette enzyme est très variable dans la population générale et la différence de puissance d'activité entre les deux extrêmes de la distribution est de l'ordre d'un facteur 10, ce qui peut expliquer les différences de concentration de terfénadine et de terfénadine carboxylate pour une même dose de médicament absorbée en fonction des individus et en dehors de tout processus pathologique. Ainsi toute substance inhibant cette enzyme hépatique augmente le taux de terfénadine et donc le pouvoir de blocage des canaux potassiques ce qui allonge le QT de manière pathologique créant des postpotentiels tardifs pouvant déclencher une torsade de pointes. Parmi les substances capables de bloquer cette enzyme, on retient justement l'érythromycine, certains imidazolés ainsi que des substances contenues dans les fiavinoïdes (jus de pamplemousse) expliquant ainsi les dangers d'une éventuelle association thérapeutique. S 'agissant de la Méquitazine, on a rapporté le cas d'une jeune femme atteinte du syndrome QT long congénital, ayant présenté des complications soudaines cardiaques (des torsades de pointes) suite à l'administration simultanée de Méquitazine et de spiromycine (F. Verdun et al, Arch Mal Cœur Vaiss. 1997 Jan ; 90(1) : 103-6). La responsabilité de l'association méquitazine-spiromycine dans l'augmentation subite du QT, plutôt que celle de l'un des deux médicaments est fortement privilégiée. En effet, on suppose que la spiromycine a peut-être bloqué l'enzyme qui favorise la dégradation de la méquitazine. Cette enzyme pourrait être la CYP2D6 (Janicki et al, Med SCI Monit, 2005 ; 11(10) : RA 322-328).
Dans un souci de prévenir la survenue de tels accidents potentiellement dangereux pour la vie des patients, les inventeurs ont maintenant découvert de manière surprenante que l'énantiomère (S) de la Méquitazine induit moins de toxicité cellulaire, en particulier moins de toxicité cardiaque, que le mélange racémique ou l'énantiomère (R) de la Méquitazine.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'un mélange d'énantiomères du 10-(l- azabicyclo[2.2.2]oct-3-yl-méthyl)-10H-phénothiazine (Méquitazine) et/ou d'au moins un de ses métabolites, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, ledit mélange étant enrichi en l'énantiomère de configuration absolue (S), pour la préparation d'un médicament antihistaminique destiné à prévenir ou traiter des affections allergiques, tout en limitant les risques de toxicité cellulaire, notamment la toxicité tissulaire et/ou organique, en particulier les risques de cardiotoxicité.
On entend par toxicité cellulaire, la toxicité envers les cellules, c'est-à-dire le caractère d'une substance capable d'altérer l'activité normale des cellules ou d'entraîner la mort des cellules. La toxicité est tissulaire ou organique si l'altération s'étend respectivement au tissu ou à l'organe constitué par ces cellules et à leur fonction.
La cardiotoxicité désigne la toxicité envers les cellules cardiaques. Elle entraîne en particulier des altérations de la fonction du myocarde pouvant aller jusqu'à la nécrose ou l'apoptose des cellules myocardiques. Ces altérations peuvent conduire à divers troubles cardiaques, tels que l'ischémie myo cardiaque, la prolongation de l'intervalle
QT ou QTc, l'arythmie cardiaque, la cardiomyopathie, l'hypertrophie cardiaque, l'infarctus du myocarde, des troubles diastoliques ou une dys fonction systolique (Y.James Kang, Molecular and Cellular Mechanisms of Cardiotoxicity, Environmental
Health Perspectives, Vol. 109, suppl. 1, March 2001).
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un mélange d'énantiomères du 10-(l-azabicyclo[2.2.2]oct-3-yl-méthyl)-10H-phénothiazine (Méquitazine) et/ou d'au moins un de ses métabolites, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, ledit mélange étant enrichi en l'énantiomère de configuration absolue (S), pour la préparation d'un médicament antihistaminique destiné à prévenir ou traiter des affections allergiques, tout en limitant les risques d'ischémie myocardique, de prolongation de l'intervalle QT ou QTc, d'arythmie cardiaque, notamment les torsades de pointes, de cardiomyopathie, d'hypertrophie cardiaque ou d'infarctus du myocarde, de trouble diastolique ou de dysfonction systolique.
La métabolisation de la méquitazine conduit principalement à deux produits : la forme hydroxylée et la forme S-oxydée.
Figure imgf000007_0001
Forme S-oxydée Forme hydroxylée
On entend par « métabolite » de la méquitazine l'une de ces deux formes.
«Sel pharmaceutiquement acceptable» désigne tous les sels qui conservent l'efficacité et les propriétés d'un principe actif et qui ne présentent pas d'effets secondaires. De préférence, il s'agit de sels d'acides minéraux ou organiques pharmaceutiquement acceptables. A titre d'exemples préférés, mais non limitatifs, on mentionnera les halogénohydrates, tels que chlorhydrate et le bromhydrate, le fumarate, le maléate, l'oxalate, le citrate, le méthane sulfonate, le glutamate, le tartrate, le mésylate, et leurs hydrates éventuels.
Selon la présente invention, le sel préféré de la méquitazine est le chlorhydrate de méquitazine.
Dans le cadre de la présente invention, « mélange d'énantiomères de la méquitazine enrichi en énantiomère (S) » signifie un mélange d'énantiomère (S) et d'énantiomère (R) de la méquitazine dans lequel le ratio massique entre l' énantiomère (S) et l' énantiomère (R) est supérieur à 1 : 1.
De préférence, le ratio massique entre l' énantiomère (S) et l' énantiomère (R) de la Méquitazine dans le dit mélange est supérieur à 95 : 5 ((S) : (R)), de préférence supérieur à 99:1, de manière encore plus préférée supérieur à 99,5:0,5. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le dit mélange d'énantiomères est substantiellement pur en l'énantiomère (S). Le mélange d'énantiomères selon la présente invention est particulièrement utile pour la préparation de médicaments destinés à prévenir ou traiter des affections allergiques notamment choisies parmi la rhinite allergique, la rhinite vasomotrice, la rhinite spasmodique, la conjonctivite allergique, l'œdème de Quincke, l'urticaire, les allergies médicamenteuses, les affections dermatologiques prurigineuses.
Le mélange d'énantiomères selon l'invention, de préférence l'énantiomère (S) substantiellement pur, est administré à tout type de patients nécessitant un tel traitement, que ce soit dans un but thérapeutique et/ou prophylactique. Dans un but thérapeutique, on vise l'éradication ou l'amélioration de l'affection à traiter et/ou d'un ou plusieurs symptôme(s) associé(s). Dans un but prophylactique, on vise la prévention de l'apparition de l'affection à traiter et/ou d'un ou plusieurs symptôme(s) associé(s). Néanmoins, le mélange d'énantiomères selon l'invention est plus particulièrement adapté à des populations de patients à risque qui seraient susceptibles de développer certaines manifestations cliniques indésirables au cours ou à la suite d'un traitement par la Méquitazine sous forme racémique. Il s'agit notamment des patients présentant une cardiopathie, des troubles électrolytiques, une bradicardie ou atteints du syndrome du QT long congénital.
EXEMPLE 1 : TEST DE PREDICTIVITE PHARMACO-TOXICO-GENOMIQUE IN VITRO
1. Les composés
Les composés testés sont la méquitazine sous forme racémique, la 1-méquitazine et la d- méquitazine. Pour les besoins de l'étude, chaque composé a été solubilisé dans du DMSO du fait de leur insolubilité dans l'eau et de l'impact de l'éthanol et du chlorure de méthylène sur l'extraction des ARNs.
Les principales caractéristiques de ces composés sont résumées dans le Tableau 1 ci- dessous. La Loratadine (SIGMA Catalogue #L9664-10MG) a été utilisée comme comparateur.
Tableau 1 : Les composés
Figure imgf000009_0001
2. Les cellules
Les cellules testées sont des cardiomyocytes de rat : H9c2 (2-1) ECACC N° : 88092904 (fournisseur SIGMA) Description: Rat DBlX heart myoblast
Les cellules sont amplifiées dans des conditions standard de culture (Voir ci-après).
3. Toxicogénomique
3.1 Méthodologie
Des cardiomyocytes de rat (lignée H9c2) sont traités avec 15 μM de méquitazine, L- méquitazine, d-méquitazine et loratadine.
L'ARN est extrait à la fois des cellules H9c2 traitées avec le véhicule (DMSO, qui sert de contrôle) et des cellules traitées par les composés après une incubation de 6 heures et de 24 heures. L'impact du traitement sur l'expression de 97 gènes sélectionnés comme potentiels marqueurs de toxicité est analysé par RT-PCR quantitative. Les signatures moléculaires induites par les composés permettent de définir un index de toxicité des différents composés.
3.2 Cellules et traitement
Les protocoles utilisés pour la culture et le traitement des cellules sont les suivants :
• Milieu et culture : DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) - high glucose (Cambrex Catalogue # BE 12-614F) ; 2 mM L-Glutamine (Cambrex Catalogue # US 17- 605C) ; 10 % Sérum de veau fétal (Gibco BRL, Invitrogen Catalogue # 10108-157). • Conditions de culture : 37° C ; 5 % CO2
• Procédure : 220 000 cellules sont ensemencées par puit (6 multi-well plate; Corning Catalogue # 734-1596) à JO dans 3 ml de milieu de culture et incubées à 37° C, 5 % CO2 pendant 48 h (NB. Temps de doublement de H9c2 = 39 heures). Le traitement des cellules par les composés à lieu à J2.
La procédure est décrite ci-dessous : • Au jour JO, les cellules H9c2 (Passage 27, 97% de viabilité) sont ensemencées dans des plaques 6 puits à raison de 220 000 cellules par puit dans un volume total de 2,5 ml et placées pendant 48 heures à 37°C, 5% CO2.
• Au jour J2, les cellules sont traitées par les composés alors que la confluence est d'environ 70 %. Pour une "plaque type" le milieu est aspiré et remplacé dans chacun des 6 puits par :
1. par du milieu neuf avec 0,015 % de DMSO (véhicule des différents composés).
2. du milieu neuf avec du méquitazine/D02026 à 15 μM.
3. du milieu neuf avec du 1-méquitazine à 15 μM. 4. du milieu neuf avec du d-méquitazine à 15 μM.
5. du milieu neuf avec du loratadine à 15 μM.
De plus chaque plaque est réalisée en 2 exemplaires afin de prélever les ARNs à deux temps différents (6 heures et 24 heures). Les cellules sont placées à 37°C, 5% CO2
• A J2, 6 heures après le traitement, le milieu est retiré de chacun des 6 puits de trois plaques (une plaque par concentration), les cellules sont lavées au PBS et reprise avec du RNABle® (Eurobio) pour l'extraction de TARN.
• A J3, 24 heures après l'ajout des composés, une deuxième série de 3 plaques est traitée comme précédemment.
3.3. La RT-PCR quantitative en temps réel
3.3.1. Extraction des ARNs totaux et synthèse des ADNc
L'extraction a été réalisée d'après la méthode de Chomczynski et Sacchi (1987). Les protocoles expérimentaux d'extraction des ARN totaux et de la synthèse des ADN complémentaires (ADNc) sont les suivants. • Protocole d'extraction des ARN totaux
Les ARN totaux ont été extraits à l'aide de RNABle® (Eurobio, Catalogue # GEXEXT00-0U). Les cellules sont recueillies dans 1 mL de RNABle afin de dissocier les complexes nucléoprotéiques, puis 100 μL de chloroforme sont rajoutés afin de séparer les protéines des acides nucléiques. Après une centrifugation pendant 20 min à 12500 g, 4° C, la phase aqueuse supérieure contenant les ARN est récupérée. Les ARN sont alors précipités par ajout de 600 μL d'isopropanol.
Après 15 minutes à 4° C, les échantillons sont placés une nuit à -20° C. Après centrifugation de 15 min à 4° C, le culot d'ARN obtenu est lavé dans 700 μL d'éthanol à 75° C et centrifugé à 12 500 g pendant 15 minutes à 4° C. Enfin, les culots sont séchés et dissous dans de l'eau millipore.
• Protocole pour Reverse Transcription Produits : SuperscriptTM II Reverse Transcriptase, RT 5X, DTT (Invitrogen Catalogue # 18064- 014) ; Random Hexamer (Amersham Catalogue # 27-2166-01) ; dNTP set 100 mM solution (Amersham Catalogue # 27-2035-01) ;RNAsine Ribonuclease Inhibitor (Promega Catalogue # N21 IB).
La transcription inverse se réalise pour 1 μg d'ARN dans un volume final de 20 μL contenant 4 μl de tampon RT 5X, 4μl de DTT (dithiotréisol), 1 μL de dNTP (10 mM), 6 μL d'hexamères aléatoires (500 ng/μL), 0,5 μL de RNAsine (40 U/μL) et 0,5 μL de RTase Superscript (200 U/μL). Les échantillons sont ensuite incubés 10 min à 25° C, 50 min à 42° C puis 15 min à 75° C afin d'inactiver l'enzyme, et conservés à 4° C. Les ARN totaux extraits ont été dosés et leurs qualités analysées sur le Bio-analyseur Agilent.
3.3.2. La technique de PCR quantitative
• Théorique La PCR en temps réel est une méthode précise, sensible et rapide qui permet la quantification relative du taux d'expression d'un gène cible par rapport à celui d'un gène de référence exprimé de façon ubiquitaire.
Cette technique permet de quantifier l'ARN messager. Cette opération s'effectue après transcription inverse des ARNs en ADN complémentaires par extension de deux amorces situées de part et d'autre de la cible à amplifier grâce à une ADN polymérase. L'incorporation d'un fluorophore (SYBR Green), lors de l'étape d'hybridation de l'amplification exponentielle, permet la quantification et le suivi en temps réel de la quantité de produit d'amplification néoformé. Les valeurs quantitatives sont obtenues à partir du nombre de cycles seuil (Ct : cycle threshold) auquel l'augmentation du signal, associée à une croissance exponentielle du produit de PCR, commence à être détecté en utilisant un programme d'analyse Biosystems PE selon le manuel du fabriquant. Ainsi, plus la quantité d'ADNc du gène cible à l'instant zéro est importante plus le nombre de Ct est faible (nombre de cycle pour atteindre le seuil).
Afin de standardiser les analyses effectuées en QRT-PCR, il est nécessaire de quantifier en parallèle au moins un contrôle endogène appelé "gène de référence". Ces gènes doivent avoir une expression constitutive indépendante de la situation traitée ou non traitée des cellules. Plusieurs gènes de références ont été testés.
Leurs caractéristiques sont données dans le Tableau 2.
Tableau 2 : Gènes de référence testés pour l'étude
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
U représente la position 5' de l'amorce sens d'après la référence GenBank (NM_...)
L représente la position 3' de l'amorce anti-sens d'après la référence GenBank
(NM_...)
Le Ct (Cycle Threshold) correspond au nombre de cycle nécessaire pour atteindre, à partir de
12,5 ng d'ADNc (ARN de cœur de rat, BD Biosciences Clontech), le seuil de détection
NTC (Non Template Control) est représentatif du bruit de fond du à la formation de "dimer" d'amorces
La pente est obtenue par une dilution successive (4 points) de 10 en 10. Une pente à 3,32 est représentative d'une efficacité de 100% du couple d'amorces
L'efficacité réelle est donnée par la formule E = e2,3026/pente
Les gènes les plus stables après stimulation sont choisis grâce au logiciel Genorm (Vandesompele et al., 2002) qui permet de mesurer le niveau de stabilité d'un gène en fonction de la stimulation. La mesure M obtenue doit être inférieure à 1,5. Tous les gènes testés répondent à ce critère (Tableau 3).
Au vu des résultats, nous avons choisi comme gènes de référence pour cette étude d'utiliser les 2 plus stables: GAPDH qui code pour la Glyceraldehyde-3 -phosphate et est couramment utilisé comme contrôle endogène et RPLPO qui code pour la phosphoprotéine ribosomale de rat PO. Il est à noter que RPLPO est aussi connu sous le nom de 36B4 qui est largement employé comme gène endogène de contrôle en Northern blot.
Dans chaque plaque 384 puits, à la fois RPLPO et GAPDH sont quantifiés dans tous les échantillons analysés.
Dans une plaque type, 10 gènes cible ainsi que les deux gènes de référence sont quantifiés dans un même "run" pour tous les échantillons. L'expression relative des 97 gènes sélectionnés est calculée par la méthode ΔΔCt et le logiciel RQ fournie par le fabricant (Applied Biosystem).
Les valeurs d'expression de chaque gène sont également normalisées, dans un premier temps, de telle manière que la valeur des cellules H9c2 traitées avec le véhicule (contrôle) soit égale à 1.
Ainsi, la valeur RQ obtenue pour chaque composé à un temps donné pour un gène donné, représente l'expression relative du gène après traitement par la même dose de composé (15 μM) par rapport aux cellules contrôles dont l'ARN a été prélevé au même temps (6 heures ou 24 heures).
Tableau 3: Stabilité des gènes de référence
Figure imgf000015_0001
La stabilité des gènes de référence est donnée par le logiciel Genorm (Vandesompele et al, 2002). Un facteur de dispersion M<1,5 indique que le gène peut être considéré comme stable. Les gènes les plus stables dans cette étude sont 1. RPLPO 2. GAPDH 3.HMBS 4. PPIA
• Choix des amorces
Le choix des amorces a été réalisé avec l'assistance de programmes informatiques dont Oligo 4 (National Biosciences, Plymouth, MN). Les critères de sélection concernent la taille du fragment à amplifier (entre 80 et 120 nucléotides), la taille des amorces (entre 21 et 25 nucléotides), la température d'hybridation des amorces (environ 65°C) et la position des amorces; en effet, les amorces sont dessinées de façon à ce que l'une des 2 amorces soit à cheval sur un intron et un exon ou que les 2 amorces soient dans deux exons différents si l'intron les séparant est supérieur à 2KB (sauf pour quelques exceptions de gènes sans intron). Le choix de la position bien spécifique des amorces permet d'éviter l'amplification d'ADN génomique en cas de contamination des échantillons même si aucune contamination n'a été observée sur le Bio-Analyseur (Agilent). Un autre critère de choix important est de s'assurer que le couple d'amorces choisi ne forme pas de duplex qui interférerait de façon non spécifique avec le produit PCR spécifique obtenu et fausserait ainsi le résultat (inhérent à la technique de SYBR). Enfin, les amorces sont choisies de façon à ce qu'elles ne contiennent pas de régions consensus et/ou polymorphismes.
La spécificité totale des séquences nucléotidiques choisies comme amorces du gène cible est testée en réalisant un collage (nucleotide-nucleotide blastn) sur l'ensemble du génome de rat (Altschul et al, 1990).
• Courbe standard d'amplification
L'efficacité des amorces est testée par une gamme de dilutions de 10 en 10 (4 points) réalisé sur de l'ARN de cœur de rat (BD Biosciences Clontech, Catalog #: 636623). Seul les couples d'amorces avec une efficacité d'au moins 90% (pente entre 3,32 et 3,70) sont retenus.
Une amplification sans matrice (NTC pour Non Template Control) est également réalisée afin de s'assurer qu'il ne se forme pas de duplex pouvant fausser les résultats de PCR quantitative obtenus par la méthode de SYBR Green.
• Amplification
Les amplifications sont réalisées sur un appareil ABI Prism 7900 Séquence Détection System (Applied Biosystems) par la méthode de SYBR Green (SYBR Green PCR Core Reagents kit, Applied Biosystems). L'amplification est constituée d'une étape de dénaturation (10 min à 95°C) puis par la répétition de 40 cycles d'hybridation (15 sec. à 95°C) et d'extension (1 min. à 65°C) qui assurent une duplication exponentielle de chaque brin. Les expériences sont effectuées en double pour chaque point de données et les valeurs sont retenues avec un intervalle de confiance de 95%. La courbe de dissociation obtenue sur l'appareil 7900HT permet de s'assurer que le produit d'amplification obtenu est unique et sa spécificité est contrôlée par séquençage direct du produit PCR.
• Choix des Gènes
Les gènes sélectionnés l'ont été afin de cribler différents processus métaboliques induit en réponse à un stress oxydatif ou métabolique.
Pour cela, nous avons sélectionné des enzymes de réparation (MGMT, MLHl ...), des régulateurs du cycle cellulaire (CDK2, GADD45A, PCNA,....), des facteurs impliqués dans les phénomènes inflammatoires (Chemokines, Interleukines....) et bien évidemment les gènes de la mort cellulaire soit par apoptose (Caspases, gènes de la famille de BC12....), soit par nécrose (gènes de la famille du TNF...).
Tous ces gènes ont été sélectionnés d'après la littérature et avec l'aide des Oligo
GEArray® dédiés. La liste des 97 gènes sélectionnés est donnée dans le tableau 4.
4. RESULTATS
4.1 Les cellules H9c2 ont été traitées avec 15 μM de méquitazine, de 1- méquitazine, de d-méquitazine et de loratadine.
Les variations d'expression des 97 gènes sélectionnés ont été étudiées, par RT-PCR quantitative (voir Tableau 4).
L'expression de chacun de ces gènes a été validée sur des ARNs de cœur de rat (BD Biosciences Clontech, Catalog #: 636623). Toutefois, les résultats obtenus sur 16 de ces gènes n'ont pas été retenus du fait de leur faible expression (Ct>33) et par voie de conséquence de la difficulté d'interprétation des résultats. Ces 16 gènes apparaissent en gras dans le tableau.
Tableau 4 : Liste des gènes quantifiés par RT-PCR quantitative
ADRB2 BETA 2 ADRENERGIC RECEPTOR
ADORAI ADENOSIN RECEPTOR
AD0RA3 ADENOSIN RECEPTOR
ADPRT (PARP) ADP-RIBOSYLTRANSFERASE (NAD+; POLY (ADP-
RIBOSE) POLYMERASE
AGTRAP ANGIOTENSIN II RC-ASSOCIATED PROTEIN
AHR ARYL HYDROCARBON RECEPTOR
AKTl AKTl ONCOGENE
ANK3 ANKIRIN G (ASSOCIATED TO NAV 1.5)
ANXA5 ANNEXIN A5
APAFl APOPTOTIC PROTEASE ACTIVATING FACTOR 1
BAX BCL2-ASS0CIATED X PROTEIN
BCL2 APOPTOSIS REGULATOR BCL-2
BCL2L1 BCL2-LIKE 1 (BCL-XL)
BCL2L2 BCL2-LIKE 2 (BCLX)
BDKRB 1 BRADYKININ RECEPTOR B 1
BDKRB2 BRADYKININ RECEPTOR B2
BID BH3 INTERACTING DOMAIN DEATH AGONIST
BIRC3 INHIBITOR OF APOPTOSIS PROTEIN 1
CA2 CARBONIC ANHYDRASE II (CYTOSOLIC)
CA4 CARBONIC ANHYDRASE IV (MEMBRANE)
CAPNl CALPAIN 1 (PTROTEASE )
CAPN2 CALPAIN 2 (PTROTEASE )
CAPN5 CALPAIN 5
CASPl CASPASE 1, APOPTOSIS-RELATED CYSTEINE PROTEASE
CASP3 CASPASE 3, APOPTOSIS-RELATED CYSTEINE PROTEASE
CASP8 CASPASE 8, APOPTOSIS-RELATED CYSTEINE PROTEASE
CASP9 CASPASE 9, APOPTOSIS-RELATED CYSTEINE PROTEASE
CAT CATALASE
CCL2 CHEMOKINE, CC MOTIF, LIGAND 2 CCL4 CHEMOKINE, CC MOTIF, LIGAND 4
CCL5 CHEMOKINE, CC MOTIF, LIGAND 5
CDK2 CYCLIN-DEPENDENT KINASE 2
CHEK2 CHECKPOINT KINASE 2
CKM MUSCLE CREATINE KINASE
CLU CLUSTERIN
COMT CATECHOL-0-METHYLTRANSFERASE
CTFl CARDIOTROPHIN 1
CYCS CYTOCHROME C SOMATIC
DDIT3 DNA DAMAGE-INDUCIBLE TRANSCRIPT 3
EDNl ENDOTHELIN 1
EGRl EARLY GROWTH RESPONSE 1
F2R COAGULATION FACTOR II (THROMBIN) RECEPTOR 1 SEUL
EXON
F3 COAGULATION FACTOR III
FGG FIBRINOGEN, GAMMA POLYPEPTIDE
FM04 OXIDATIVE OR METABOLIC STRESS
GADD45A GROWTH ARREST- AND DNA DAMAGE-INDUCIBLE GENE
GADD45, ALPHA
GDFl 5 GROWTH/DIFFERENTIATION FACTOR 15
GPXl GLUTATHIONE PEROXIDASE
HIF 1 A HYPOXIA-INDUCIBLE FACTOR 1 , ALPHA
HMOXl HEME OXYGENASE (DECYCLING) 1
HSPAlA HEAT-SHOCK 70-KD PROTEIN IA
HSPCA HEAT-SHOCK 90-KD PROTEIN 1, ALPHA
ICAMl EXTRACELLULAR MATRIX & ADHESION MOLECULE
ILlB INTERLEUKIN 1-BETA
IL6 INTERLEUKIN 6
ILlO INTERLEUKIN 10
IL18 INTERLEUKIN 18
ITGA7 EXTRACELLULAR MATRIX & ADHESION MOLECULE
ITGB 1 EXTRACELLULAR MATRIX & ADHESION MOLECULE
KCNA5 POTASSIUM CHANNEL, VOLTAGE-GATED, SHAKER-
RELATED SUBFAMILY, MEMBER 5
KCNBl POTASSIUM CHANNEL, VOLTAGE-GATED, SHAB-RELATED SUBFAMILY, MEMBER 1
KCNEl POTASSIUM CHANNEL, VOLTAGE-GATED, ISK-RELATED
SUBFAMILY, MEMBER 1
KCNH2 POTASSIUM CHANNEL VOLTAGE GATED (HERG)
LPA LYSOPHOSPHATIDIC ACID RECEPTOR EDG-2 (LPA RECEPTOR
1) (LPA-I)
MGMT O-6-METHYLGUANINE-DNA METHYLTRANSFERASE
MIF MACROPHAGE MIGRATION INHIBITORY FACTOR
MKI67 PROLIFERATION-RELATED KI-67 ANTIGEN
MLHl MISMATCH REPAIR PROTEIN 1
MMP9 MATRIX METALLOPROTEINASE 9
MYC MYC ONCOGENE
NOSl ENOS, NITRIC OXYDE SYNTHASE 1 (NEURONAL)
NOS3 ENOS, NITRIC OXYDE SYNTHASE 3 (ENDOTHELIAL)
PCNA PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN
PLAU PLASMINOGEN ACTIVATOR, UROKINASE
PLAUR PLASMINOGEN ACTIVATOR, UROKINASE RECEPTOR
PPARG PEROXISOME PROLIFERATIVE ACTIVATED RECEPTOR,
GAMMA
PRDXl PEROXIREDOXIN 1
PRKAA2 AMP-ACTIVATED PROTEIN KINASE ALPHA 2 CATALYTIC
PRKABl AMP-ACTIVATED PROTEIN KINASE BETA 1
PRKAGl AMP-ACTIVATED PROTEIN KINASE, NONCATAL YTIC
PRKAG2 AMP-ACTIVATED PROTEIN KINASE GAMMA 2
RYR2 RYANODINE RECEPTOR (PARTIAL)
SCN5A (NAV 1.5) PRINCIPAL VOLTAGE-GATED NA CHANNEL
SERPINEl SERINE (OR CYSTEINE) PROTEINASE INHIBITOR, CLADE
SLC8A1 NCXl EXHANGER
SLC9A1 SOLUTE CARRIER FAMILY 9, ISOFORM Al (NHEl)
SODl SUPEROXIDE DISMUTASE 1
S0D2 SUPEROXIDE DISMUTASE 2
TIMPl TISSUE INHIBITOR OF METALLOPROTEINASE 1
TNF TUMOR NECROSIS FACTOR
TNFSF5 TUMOR NECROSIS FACTOR (LIGAND) SUPERFAMILY
TNFSF6 TUMOR NECROSIS FACTOR LIGAND SUPERFAMILY, MEMBER 6
TNFSFlO TUMOR NECROSIS FACTOR LIGAND SUPERF AMIL Y, MEMBER
10 TNFRSFlA TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR SUPERFAMILY,
MEMBER IA
TNFRSFlB TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR SUPERFAMILY
TNFRSF6 TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR SUPERFAMILY
TNNB TROPONIN
TOP2A T0P0IS0MERASE (DNA) 2 ALPHA
TP53 TUMOR PROTEIN P53
TPSBl TRYPTASE ALPHA/BETA 1
TPSGl TRYPTASE GAMMA 1
TRPCl TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL CATION CHANNEL,
SUBFAMILY C, MEMBER 1
VDACl VOLTAGE-DEPENDENT ANION CHANNEL 1
Les gènes en gras n'ont pas été analysés du fait de leurs faibles expressions (Ct > 33) dans le modèle H9c2
Sur les 81 gènes qui ont été analysés, nous nous sommes intéressés, dans un premier temps, à tous les gènes qui sont dérégulés d'un facteur > 2 par rapport à la situation des cellules non- traitées.
Quelques inductions ou répressions sont observées dès 6 heures d'exposition avec les composés, il s'agit des gènes impliqués dans les phénomènes d'apoptose : APAFl (Apoptotic protease activating factor 1), BCL2L1 (Bcl2-Like 1 connu sous le nom de BCL-XL), EGRl (Early growth response 1), des gènes impliqués dans l'arrêt du cycle cellulaire DDIT3 (DNA damage-inducible transcript 3) et GADD45A (growth arrest- and DNA damage-inducible gène gadd45, alpha), de IL6 (Interleukine 6) marqueur de l'inflammation et de l'enzyme de "détoxification" HM0X1 (Heme oxygenase decycling
Ces inductions à 6 heures sont également observées après 24 heures d'exposition avec les composés. Pour plus de clarté dans les résultats, nous avons considéré uniquement les signatures moléculaires induites à 24 heures. Les résultats présentés dans les tableaux sont représentatifs des régulations transcriptionnelles observées après 24 heures d'exposition avec les composés. A la dose de 15 μM, trente gènes sont dérégulés d'un facteur > 2 par au moins un composé. Ces résultats sont résumés dans le Tableau 5 ci-après.
Tableau 5 : Gènes dérégulés d'un facteur >2 par au moins un composé. méquitazine 1-méquitazine d-méquitazine loratadine
AHR 1,30 1,96 2,80 1,40
BCL2 0,89 1,71 2,42 1,28
BCL2L1 4,11 4,11 5,02 1,68
BCL2L2 1,17 1,77 2,26 1,4
BID 1,65 1,67 2,50 0,93
BIRC3 3,80 4,39 5,53 1,55
CASP8 2,14 2,37 2,52 1,62
EGRl 2,78 3,04 3,31 2,44
HMOXl 1,23 1,52 2,38 0,97
TNFRSF6 1,24 1,91 2,82 1,69
DDIT3 3,50 4,00 7,70 1,25
GADD45A 2,30 3,70 5,50 1,06
MGMT 3,59 3,79 4,60 1,55
HSPCA 0,35 0,50 0,50 0,67
IL6 3,31 4,20 3,32 1,35
CDK2 0,27 0,58 0,53 0,84
PCNA 0,25 0,36 0,49 0,64
TOP2A 0,15 0,22 0,25 0,73
EDNl 0,29 0,54 0,30 0,78
ITGA7 0,47 0,85 0,53 1,06
PLAUR 0,44 0,66 0,42 0,74
SERPINEl 0,25 0,27 0,21 0,71
TIMPl 0,06 0,07 0,06 0,6
ADRB2 4,54 4,36 3,95 1,71
AGTRAP 2,43 2,57 3,93 1,89
CAT 3,45 5,27 10,16 2,06
KCNH2 2,99 3,96 4,73 3,61 LPA 0,28 0,52 0,42 0,77
SLC8A1 0,43 0,82 0,72 1,37
TNNB 0,19 0,54 0,76 1,56
Les valeurs d'expression sont données par rapport à une expression = 1 dans les cellules H9c2 traitées avec le véhicule (DMSO)
On trouve des gènes directement ou indirectement liés au phénomène d'apoptose (BCL2, CASP8, GADD45A..), des gènes impliqués dans la prolifération (CDK2, PCNA...), l'invasion (PLAUR, TIMPl ...), l'inflammation (IL6..) ou des protéines de choc thermique (HSPCA,.).
On note également l'impact sur des gènes sélectionnés pour rendre compte d'une potentielle ischémie myocardique (TNNB ....). Les gènes directement liés au phénomène d'apoptose sont : AHR, BCL2, BCL2C1, BCL2L2, BID, BIRC3, CASP8, DDIT3, EGRl, GADD45A, HMOXl, MGMT, NFKBl, TNFRSF6. Les gènes pouvant rendre compte d'une potentielle ischémie myocardique et sûrement modèle-dépendant sont repris dans le tableau 8. L'expression des gènes sur-exprimés varie d'un facteur 2,06 (CAT par la loratadine) à un facteur 10,16 (CAT par la d-méquitazine) par rapport aux cellules non-traitées.
La répression varie, elle, d'un facteur 2 (PCNA par la d-méquitazine) à une perte presque totale d'expression (TIMPl par la Méquitazine racémique).
En considérant une différence d'un facteur > 2 par rapport à la situation "non- traitée", à la dose de 15 μM, la 1-méquitazine induit la dérégulation de 16 gènes, la d-méquitazine celle de 25 gènes, la Méquitazine racémique 24 gènes et la loratadine celle de 6 gènes
(Tableau 5).
Si l'index de toxicité est établi en fonction du nombre de gènes dérégulés, on peut proposer le classement suivant du plus toxique au moins toxique : d-méquitazine > méquitazine > 1-méquitazine» loratadine.
Ces index de toxicité sont représentés dans le Tableau 6 ci-dessous.
Tableau 6: Index de toxicité des composés à la dose de 15 μM. Composé Index de Toxicité méquitazine 24 1-méquitazine 16 d-méquitazine 25 loratadine 6
* L'index de toxicité représente le nombre de gènes dérégulé d'un facteur
>2 par le composé par rapport au contrôle (cellules traitées par le véhicule, DMSO 0,15%)
En considérant en détail les variations d'expression induites par la Méquitazine, on peut noter que bon nombre des gènes impliqués dans l'apoptose sont dérégulés sous l'action des composés et ceci avec une dérégulation maximale pour l'énantiomère dextrogyre. En particulier, tous les gènes sélectionnés sont surexprimés sous l'action de la d- méquitazine et certains ne le sont que sous l'action de ce composé, par exemple : BID (Wang & al, Gènes Dev., 10 : 2859-2869, 1996), inducteur d'apoptose au niveau mitochondrial dans la chaîne signalitique induite par FAS (TNFRSF6), ce dernier étant lui-même surexprimé sous l'action de l'énantiomère dextrogyre,
BCL2 (Hockenbery & al, Nature, 348 : 334-336, 1997) et BCL2L2 (Gibson & al, Oncogene, 13 : 665-675, 1996) qui sont des promoteurs de survie lorsque les cellules sont soumises à des conditions de cytotoxicité, AHR (Puga & al, Biochem. Pharmacol. 199-207, 2005) bien connu en toxicologie pour son rôle dans la réponse à une toxicité via la régulation de CYPlAl, HMOXl (Yoshida & al, Europ. J. Biochem. 171 : 457-461, 1998) codant pour une Heat Shock Protein (HSP 32) dont l'augmentation est directement corrélée à un stress oxydatif.
II est à noter que l'on observe également une sous-expression de gènes impliqués dans la prolifération tels que CDK2, PCNA, TOP2A, et AGTRAP. Une telle diminution est en accord avec l'augmentation de l'expression des gènes impliqués dans l'arrêt du cycle cellulaire afin de réparer les dommages causés à l'ADN, dont les marqueurs principaux DDIT3 et GADD45A sont particulièrement affectés dans le sens de la surexpression.
L'induction d'expression accrue engendrée par la d-méquitazine en ce qui concerne des gènes apoptotiques ou marqueurs de stress oxydatif indique clairement que l'énantiomère dextrogyre est plus toxique que l'énantiomère lévogyre. Ces observations indiquent clairement qu'à la concentration de 15 mM les cellules H9c2 sont soumises à des conditions cytotoxiques. Nous observons une augmentation des gènes bloquant le cycle cellulaire (DDIT3 et GADD45A) ainsi que des gènes impliqués dans la machinerie de mort cellulaire programmée (famille BCL2, Caspases, TNF) et par voie de conséquence une répression des gènes impliqués dans la prolifération (CDK2, PCNA, TOP2A); ex. GADD45A interagit avec PCNA pour arrêter la prolifération cellulaire (Smith et al., 1994).
Le fait que les variations d'expression de ces gènes soient moins marquées lorsque les cellules H9c2 sont traitées avec l'énantiomère 1-méquitazine, indique que ce composé induit un stress moins important aux cellules et de ce fait est moins toxique que la Méquitazine racémique et l'énantiomère d-méquitazine.
L'expression de KCNH2 (HERG) est induite par la Méquitazine racémique et ses énantiomères. KCNH2 est associé à une augmentation du QT (LQT2 syndrome) et aux torsades de pointes.
4.2 Comparaison de l'impact de l'énantiomère 1-méquitazine versus l'énantiomère d-méquitazine sur l'expression de gènes marqueurs de toxicité.
Dans un souhait de discriminer l'action des deux énantiomères au niveau génomique, les résultats ont été également analysés indépendamment du contrôle négatif (cellules H9c2 non- traitées). Pour ce faire nous avons considéré l'impact de la Méquitazine racémique et de ses deux énantiomères sur l'expression des gènes sélectionnés comme marqueurs classiques de toxicité en faisant abstraction du type cellulaire. Nous avons retenu les gènes de l'apoptose/nécrose (gènes de la famille BCL2, des Caspases, du Tumor Necrosis
Factor ), les marqueurs de stress en réponse à un dommage engendré dans l'ADN des cellules (DDIT3, CHEK2, GADD45A...) ou dû à un stress oxidatif (CAT, PDRX2, SOD2...), des enzymes de détoxification (HMOXl, MGMT, PTGS2....), les protéines de choc thermique (HSPCA, HSPBl ....) ou encore les marqueurs de l'inflammation (IL6, MIFl ....). Les résultats sont figurés dans le Tableau 7 où sont représentées les valeurs d'expression des gènes sélectionnés et ceci par rapport à une valeur d'expression de 1 pour les cellules traitées avec le mélange racémique. En outre, est aussi exprimé le rapport d'expression énantiomère dextrogyre / énantiomère lévogyre, ceci mettant en évidence l'impact prépondérant de l' énantiomère dextrogyre sur l'expression de ces gènes lorsque ce rapport est supérieur à 1.
Il ressort que les variations d'expression induites par l'énantiomère dextrogyre sont majoritaires pour près de trois quart (74%) des gènes retenus.
Tableau 7: Expression relative des principaux marqueurs de toxicité d-méquitazine 1-méquitazine Rapport *
ADPRT 2,30 1,55 1,48
AHR 2,27 1,54 1,47
AKTl 1,03 1,15 0,89
ANXA5 1,39 0,94 1,48
APAFl 1,31 1,17 1,12
BAX 1,34 1,22 1,09
BCL2 2,53 1,90 1,34
BCL2L1 1,15 1,00 1,15
BCL2L2 1,81 1,50 1,21
BID 1,43 1,01 1,42
BIRC3 1,38 1,16 1,19
CASPl 1,36 1,07 1,27
CASP3 0,82 0,92 0,89
CASP8 1,21 1,10 1,10
CASP9 0,89 0,90 0,98
CYCS 1,58 1,25 1,26
EGRl 1,22 1,08 1,13
NFKBl 0,91 1,13 0,80
TNFSF5 1,20 1,43 0,84
TNFRSFlA 0,77 1,17 0,66
TNFRSFlB 0,93 0,77 1,21
TNFRSF6 1,80 1,31 1,37 CHEK2 1,58 1,14 1,38
DDIT3 2,17 1,12 1,94
GADD45A 2,41 1,61 1,50
HSPAlA 1,24 1,32 0,94
MLHl 1,04 1,31 0,79
TP53 0,80 0,80 1,00
CCL2 0,91 0,93 0,98
HIFlA 1,45 0,95 1,54
IL6 1,06 1,27 0,84
MIFl 1,33 0,94 1,41
CAT 2,94 1,53 1,92
COMT 1,28 1,24 1,03
FMO4 0,95 0,62 1,53
HMOXl 2,11 1,30 1,63
MGMT 1,42 1,13 1,26
PDRXl 1,91 1,44 1,32
PDRX2 1,01 0,96 1,05
SOD2 2,09 1,35 1,55
Les valeurs d'expression sont données par rapport à une expression = 1 dans les cellules H9c2 traitées avec la Méquitazine racémique..
* Le rapport représente le rapport d'expression d-méquitazine versus 1-méquitazine
Le fait que les variations d'expression de ces gènes soient moins marquées lorsque les cellules sont traitées avec l'énantiomère lévogyre indique que ce composé induit un stress moins important à ces cellules et de ce fait présente une toxicité moindre tant par rapport au racémate que par rapport à l'énantiomère dextrogyre.
4.3 Comparaison de l'impact de l'énantiomère lévogyre versus l'énantiomère dextrogyre sur l'expression de gènes biomarqueurs d'une ischémie myocardiaque.
Dans l'optique de mettre en évidence un effet différentiel spécifique des énantiomères en ce qui concerne une toxicité cardiovasculaire, 6 gènes ont été sélectionnés comme bio-marqueurs d'une ischémie myocardiaque. En particulier, parmi les gènes retenus, on peut citer :
KCNH2 est un gène associé au syndrome du QT long congénital (De Bruin & al.
Pharmacoepidemiol. Drug Saf. 2005),
EDG2 récepteur de l'acide lysophosphatidique est considéré comme marqueur de l'infarctus du myocarde (Pastinen & al. Human Molec. Genêt. 7 : 1453-1462, 1998),
ADRB2 dont les antagonistes (beta-bloquants) constituent une classe de médicaments utilises en cardioprotection (Baker, Br. J. Pharmacol. 317-322, 2005),
TNNI3, gène de le Troponine I cardiaque, en tant que marqueur du risque de développement de maladies cardiaques (Mogensen & al, J. Am. Coll. Cardiol, 44, 12.
2315-2325, 2004).
Selon un modèle identique à l'exemple précédent, on a aussi évalué la variation d'expression de ces gènes en fonction de leur exposition à l'un ou à l'autre des énantiomères. Le Tableau 8 met en évidence la dérégulation des gènes sélectionnés par les composés. Le rapport d'expression dextrogyre/lévogyre est aussi reporté.
Tableau 8 : Gènes biomarqueurs d'une ischémie mvocardique et dérégulés d'un facteur >2 par au moins un composé
Figure imgf000028_0001
* Le rapport représente le rapport d'expression de la d-méquitazine versus la 1-méquitazine
On constate que l'énantiomère dextrogyre affecte à la hausse l'expression d'un nombre majoritaire de gènes et ceci dans une ampleur non négligeable. Ceci témoigne donc d'un toxicité cardiaque plus marquée pour l'énantiomère dextrogyre par rapport au lévogyre et ceci d'autant plus que les patients susceptibles de recevoir un traitement à base de Méquitazine présentent un déterminisme génétique ou physiologique représentatif d'une sensibilité cardiaque. Il ressort que l'utilisation d'un mélange enrichi en énantiomère lévogyre de la méquitazine pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les affections de nature allergique chez des populations de patients à risque, en particulier des patients présentant ou susceptibles de présenter une cardiopathie, des troubles électrolytiques, une bradycardie ou du syndrome du QT long congénital présente un intérêt capital.
EXEMPLE 2 : EVALUATION DE LA TOXICITE AIGUË CHEZ LE RAT - DETERMINATION DE LA DL50
La toxicité aiguë a été évaluée chez des rats mâles et femelles par administration orale de dose croissante de méquitazine (racémique, énantiomère d ou énantiomère 1) afin de déterminer la dose léthale pour 50% de la population évaluée.
Figure imgf000029_0001
II ressort de ce test que la 1-méquitazine présente une toxicité aiguë bien plus faible que la d-méquitazine et que le mélange racémique.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un mélange d'énantiomères du 10-(l-azabicyclo[2.2.2]oct-3-yl- méthyl)-10H-phénothiazine (Méquitazine) et/ou d'au moins un de ses métabolites, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, ledit mélange étant enrichi en l'énantiomère de configuration absolue (S), pour la préparation d'un médicament antihistaminique destiné à prévenir ou traiter des affections allergiques, tout en limitant les risques de toxicité cellulaire, notamment la toxicité tissulaire et/ou organique.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit mélange enrichi en l'énantiomère de configuration absolue (S) permet de prévenir ou traiter des affections allergiques, tout en limitant les risques de cardio toxicité.
3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit mélange enrichi en l'énantiomère de configuration absolue (S) permet de prévenir ou traiter des affections allergiques, tout en limitant les risques d'ischémie myocardique, de prolongation de l'intervalle QT ou QTc, d'arythmie cardiaque, notamment les torsades de pointes, de cardiomyopathie, d'hypertrophie cardiaque ou d'infarctus du myocarde, de trouble diastolique ou de dysfonction systolique.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les métabolites de la Méquitazine sont choisis parmi la forme hydroxylée ou la forme S-oxydée suivante :
Figure imgf000031_0001
Forme S-oxydée Forme hydroxylée
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le sel de la Méquitazine est le chlorhydrate de méquitazine.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le ratio massique entre l'énantiomère (S) et l'énantiomère (R) dans le dit mélange est supérieur à 95 : 5 ((S) : (R)), de préférence supérieur à 99:1, de manière encore plus préférée supérieur à 99,5:0,5.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le dit mélange d'énantiomères est substantiellement pur en l'énantiomère (S).
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les affections allergiques sont choisies parmi la rhinite allergique, la rhinite vasomotrice, la rhinite spasmodique, la conjonctivite allergique, l'œdème de Quincke, l'urticaire, les allergies médicamenteuses, les affections dermatologiques prurigineuses.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, chez des patients choisis parmi des patients présentant une cardiopathie, des troubles électrolytiques, une bradicardie ou atteints du syndrome du QT long congénital.
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