WO2007083006A2 - Utilisation d'un extrait insaponifiable de pulpe vegetale dans le traitement du vieillissement cutane - Google Patents

Utilisation d'un extrait insaponifiable de pulpe vegetale dans le traitement du vieillissement cutane Download PDF

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WO2007083006A2
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René Belle
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Definitions

  • the field of the present invention relates to the use of an unsaponifiable extract of vegetable pulp for the preparation of a cosmetic, pharmaceutical or nutraceutical product for treating and / or preventing skin disorders associated with aging.
  • Aging is an inevitable phenomenon, slowly evolving and irreversible leading to anatomical and histological changes responsible for functional abnormalities of the organs.
  • the first visible signs are manifested in the skin tissue by changes in texture, color, transparency and the appearance of wrinkles. These manifestations can be potentiated by extrinsic factors such as the sun, tobacco ...
  • ROS oxygen free radicals
  • RLOs are described as early mediators of inflammatory diseases and aging (Kress M. et al., 1995: 62: 87-94).
  • the fundamental alterations predominate in the dermis and it is the fibroblasts and the extracellular matrix that are the main targets and the main actors.
  • Fibroblasts are able to enter senescence. As a result, their number decreases, their function is slowed down and their phenotype is changed. They then participate actively in the degradation of the dermal extracellular matrix. Moreover, during senescence, the fibroblasts lose their reactivity and see their regulation modulated.
  • the leaf crown is somewhat variable, and can be erect or weeping.
  • the twigs very thorny, bear very small lanceolate leaves, alternate, narrow, short (about 2 cm), often grouped into fascicles.
  • the foliage of the Argan tree is generally persistent, but it happens that in times of great drought, it becomes obsolete.
  • the fruit is a yellow and oval sessile berry 4 to 5 cm long. It is formed of a fleshy pericarp (also called pulp), containing a kind of "false core” very hard brown.
  • This element consists in fact of 2 to 3 flattened seeds welded together and each containing an oleaginous kernel. The most valued applications originate from the kernel of the seed. This one provides an oil then in a second time a cake.
  • Seed oil has been the subject of several invention patents: solvent-based oil (FR 2 553 788) and unsaponifiable enriched argan oil (FR 2 724 663). Substances other than oil have also been patented. This is the case of peptides derived from seed cakes obtained after extraction of the oil: combination of oil and cake peptides for the treatment of disorders related to skin aging (FR 2 756 183).
  • the leaf of the Argan tree, the proteins and the saponins of cakes have also been the subject of patents: EP 1 213 025 relates to leaf extracts, EP 1 213 024 processes meal proteins and EP 1 430 900 saponins from oilcakes.
  • the fruit pulp of the Argan tree has more recently been the subject of patent application WO2005 / 039610.
  • the fruit of the Argan tree is a false drupe. It consists of a fleshy pericarp called pulp (55 to 75% of the fruit) and a core with a very hard shell containing one to three almonds. From these is extracted the oil.
  • the pulp of the fruit has been the subject of chemical studies. It consists of carbohydrates including cellulose, glucose, fructose and sucrose (Charrouf Z.
  • the patent application WO2005 / 039610 generally relates to the use of a composition based on argan fruit pulp for the preparation of cosmetic products.
  • the fruit pulp extract has been more or less purified. Indeed, the inventors tested the extract at different stages of the process. Thus, it is preferentially the use of an extract of fruit pulp obtained following a hexane extraction is described (page 15). Then following a conventional saponification step known to those skilled in the art, the authors tested the Emponifibal fraction thus collected. Finally, the authors also considered a step of fractionation of unsaponifiable by chromatography, taking care to remove the triterpene compound erythrodiol.
  • an unsaponifiable extract of argan fruit pulp rich in erythrodiol said extract being obtainable by an acetone extraction followed by a conventional saponification step.
  • the benefits of the present invention can be extended to any unsaponifiable extract of vegetable pulp having a triterpenic fraction whose composition in its majority compounds is close to that resulting from the pulp of argan fruit.
  • the present invention relates to the use of an unsaponifiable extract of vegetable pulp comprising a triterpene fraction, characterized in that said triterpene fraction comprises erythrodiol, ⁇ -amyrin, ⁇ -amyrin and lupeol, for the preparation of a cosmetic, pharmaceutical or nutraceutical product for preventing and / or treating cutaneous disorders associated with skin aging.
  • said extract is obtained by an acetone extraction followed by a conventional saponification step.
  • This unsaponifiable extract also called initial unsaponifiable, can be solubilized in a carrier to facilitate its formulation.
  • said extract is obtained from a plant selected from the family Sapotaceae; and even more preferably said extract is obtained from argan fruit pulp.
  • An advantage of the acetone extraction lies in the fact that one can get rid of the latex, which represents the vast majority of the lipid fraction, and thus be more concentrated in unsaponifiable substances in the lipid fraction.
  • the composition of the unsaponifiable material according to the present invention is differentiated both qualitatively and quantitatively from that described preferentially in the patent application WO2005 / 039610.
  • the extracts according to the present invention are characterized by their content of triterpenic substances.
  • the latter can be analyzed by gas chromatography according to a conventional appropriate method which makes it possible to identify ⁇ -amyrin, erythrodiol.
  • ⁇ -amyrin and lupeol are not separated by this method, these molecules can then be dosed commonly.
  • the triterpene fraction of said extract is composed of erythrodiol whose mass fraction is between about 7% and about 40% of the initial unsaponifiable ⁇ -amyrin whose mass fraction is between about 5% and about 30% of the initial unsaponifiable, ⁇ -amyrine and lupeol, the sum of these two mass fractions is between about 10% and about 50% of the initial unsaponifiable.
  • said mass fraction of erythrodiol is between about 10% and about 20% of the initial unsaponifiable; and even more advantageously is about 15% of the initial unsaponifiable.
  • said mass fraction of ⁇ -amyrin is between about 7% and about 20% of the initial unsaponifiable; and even more advantageously is about 10% of the initial unsaponifiable.
  • the sum of said mass fractions of ⁇ -amyrin and lupeol is between about 15% and about 30% of the initial unsaponifiable; and even more advantageously is about 20% of the initial unsaponifiable.
  • a remarkable point of the present invention is the important contribution of erythrodiol in the anti-aging properties of the unsaponifiable extract according to the present invention.
  • RLOs play an important role in the skin aging process
  • antiradical effect (anti-RLO) of erythrodiol was evaluated in comparison with the unsaponifiable argan fruit pulp according to the present invention.
  • the damage created by the RLO within the cells is reflected in the alteration of lipid components of the plasma membrane (lipoperoxidation), proteins (denaturation and degradation) and genetic material or DNA (mutations).
  • the tests carried out in vitro concerned the determination of the protective efficacy by erythrodiol and the unsaponifiable extract against the oxidation of membrane lipids (Example 3); and the protective power of erythrodiol and other triterpene molecules (lupeol, ⁇ and ⁇ -amyrin) with respect to the alteration of genomic DNA (Example 4). These tests made it possible to demonstrate that erythrodiol is a molecule that has an important antioxidant potential.
  • the extraction can be carried out as follows: the dried Argan fruit pulp is crushed and then extracted with acetone. It is also possible to use an acetone-water mixture.
  • the extraction is carried out with stirring or in a static manner, in a plant / solvent ratio which may vary from 1/2 to 1/20, at temperatures ranging from room temperature to the boiling point of the solvent and over a period of time go from 30 minutes to 24 hours.
  • the solid plant residue is separated from the extractive solution by filtration or centrifugation.
  • the solution can be more or less concentrated until a dry extract is obtained.
  • the dry matter can be solubilized in an alcohol to allow saponification.
  • a metal hydroxide in particular sodium hydroxide or potassium hydroxide at concentrations ranging from 0.1 to 10 N.
  • the saponification is carried out at temperatures ranging from room temperature to boiling, with stirring and on a duration varying from 15 minutes to 48 hours depending on the temperature. Purification is conducted by liquid / liquid extraction.
  • An immiscible solvent is then added to the hydrolysis medium, which may be saturated or non-saturated with salts [NaCl, (NH 4 ) 2 SO 4 ] and adjusted to pH values ranging from 3 to 9.
  • This solvent may be an ether oxide, an ester, an alkane, a halogenated hydrocarbon, or a mixture of these solvents.
  • One, two or three successive liquid / liquid extractions are carried out. The organic phases are combined and then washed with water saturated or not with salts and at pH values ranging from 3 to 9. This washing phase can be repeated several times.
  • an excipient that can be an animal wax (bee for example) or vegetable wax (Carnauba, Candelilla or Jojoba wax) a vegetable oil (corn, safflower, sesame, argan ...) glycerin synthetic origin such as liquid petrolatum, polyols (such as propylene glycol, butylene glycol, glycerol, etc.) esterified triglycerides (such as miglyol 812, myritol 318, neobee MJ) oxypropylene polymers of formula H (OCH 2 -CHCH 3 ) n OH or oxyethylenated polymers of the formula H (OCH 2 -CH 2 ) n OH, fatty alcohol
  • the proportions of the initial unsaponifiable Argan fruit pulp and the excipient may vary from 1/99 to 99/1.
  • the present invention makes it possible to valorize fruit pulps in the anti-aging treatment, at a reasonable cost price. Unsaponifiable extract is used without additional purification step, which is very expensive.
  • the composition according to the present invention can therefore be obtained using a method involving conventional extraction and saponification steps known to those skilled in the art.
  • an unsaponifiable extract of vegetable pulp makes it possible to prevent and / or treat skin disorders that are manifested by alterations in texture, color, transparency of the skin and by the appearance of wrinkles. .
  • the skin disorders are consecutive to a reduction or a loss of response to environmental stress, particularly caused by the sun or tobacco.
  • the cutaneous disorders are consecutive to a reduction or loss of inducibility of the HSP72 proteins.
  • HSP proteins for "Heat Shock Protein” are constitutively expressed in many cells and have essential functions in the maintenance of proteins, hence their name “chaperone” proteins. Indeed, they inhibit aggregation of denatured proteins, prevent inappropriate protein associations, and are involved in intracellular transport and inactive maintenance of certain proteins (Morris SD Clin, Exp Dermatol 2002; 220-224). HSPs also play a critical role in stress response and especially in cellular protection processes involving adaptive response (Maytin E. V. J. Invest Dermatol, 1995; 104: 448-55). Unexpectedly, the use of an extract according to the present invention makes it possible to restore the induction of HSP72 proteins in senescent fibroblasts.
  • the cosmetic, pharmaceutical or nutraceutical product containing an extract according to the invention is administered orally or topically, and preferably topically.
  • the dosage form is selected from the group consisting of creams, gels, ointments and sprays.
  • the oral form is chosen from the group comprising tablets, capsules and powders for oral suspensions.
  • the amount of said extract in the final cosmetic product is between about 0.001% and about 50%, preferably between about 0.01% and about 10%; and even more preferably between about 0.1% and about 2% by weight of the total weight of the preparation.
  • the preparation may further contain other active agents well known to those skilled in the art for the treatment and / or prevention of cutaneous disorders associated with skin aging.
  • said preparation contains other substances from the argan known for their "anti-aging" action such as the oil obtained from the seed kernel and the cake peptides for example.
  • the example below of a composition according to the invention is given for information only and is not limiting. The percentages are given by weight relative to the total weight of the composition.
  • EXAMPLE 1 facial anti-slackening treatment - Unsaponifiable extract of argan tree fruit pulp 0.1 to 2%
  • This extract which corresponds to the initial unsaponifiable, is determined for its content of triterpene substances. It contains 10% of ⁇ amyrin, 15% of erythrodiol and 20% of the lupeol- ⁇ amyrin mixture.
  • the plasma membrane is the main and first target of RLOs and, being rich in lipids, is the site of increased peroxidation (Girotti A.W. J. Free Radie.
  • TBARS lipid peroxidation
  • the fibroblast line L929 was treated with a complex composed of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and iron (Fe 2+ / Fe 3+ ), thus reconstituting the reaction of Fenton, source of RLO and more particularly of hydroxyl radical (OH 0 ) (Vessey DA et al J. Invest Dermatol 1992: 99: 859-63):
  • the products were evaluated on the murine fibroblast line L929.
  • the cells are pretreated with the different product concentrations (Table I) for 16 hours and are then stimulated with the H 2 O 2 -Fe + / Fe 3+ complex for 1 hour.
  • the lot LK0304 of unsaponifiable extract of argan fruit pulp was prepared according to Example 2.
  • Peroxidation of membrane lipids is analyzed by measuring TBARS (according to P. Morlière et al Biochem Biophys Acta 1991, 1084: 261-268). O Principle of the test: In an acidic medium, at 95 ° C., complexes, noted TBARS for Thio Barbituric Acid Reactive Substance, are formed between the lipid oxidation products (malondialdehyde or MDA) and the thiobarbituric acid (TBA) which can to be measured in fluorescence with respect to a standard range with MDA. The TBARS assay is then expressed in pmol / ⁇ g of proteins. Proteins and TBARS are assayed in the intracellular medium. O Calculation of the percentage of protection of cell membranes:
  • Vitamin E constituting the anti-free radical reference molecule, reduces the lipid peroxidation induced by the H 2 O 2 -Fe 24 VFe 3+ complex, and very effectively protects cell membranes (approximately 56%).
  • the unsaponifiable extract of argan fruit pulp prepared according to Example 2 has an anti-radical activity at concentrations of 1 and 3 ⁇ g / ml (30 and 37% lipid membrane protection, respectively).
  • Erythrodiol a molecule contained in the triterpene fraction of the unsaponifiable extract, exhibits good antioxidant activity with a dose-dependent effect. Erythrodiol is active from 0.3 ⁇ g / ml (33% protection). The anti-radical effect of erythrodiol at 3 ⁇ g / ml is very important and comparable to Vitamin E.
  • the in vitro model presented in this study reflects the consequences due to a major oxidative stress on the main cellular target that is the plasma membrane. So the The lipid peroxidation assay is a good marker of oxidative stress and allows the evaluation of the antioxidant action, with respect to the hydroxyl radical, of active principles at the level of the cell membrane.
  • Vitamin E an antioxidant molecule
  • DNA is a target of RLOs that induce base modification (oxidation, nitration, deamination: G. Guetens et al Clin Lab ScL 2002, 39: 331-457), the formation of strand breaks (abasic sites or ⁇ -elimination) and bridging DNA-proteins or DNA-hydroperoxides.
  • the alteration of genomic material induces a cascade of cellular reactions (replication fork blocking, activation of key proteins, cell cycle arrest) that lead to the induction of repair mechanisms.
  • Bases modified by oxidative stress are thus mainly supported by the base repair system or BER for Base Excision Repair (Friedberg E.C. et al DNA repair and mutagenesis, ASMPress, Washington DC 1995). This system acts quickly and efficiently according to three key steps:
  • RLOs can be produced in such quantities that cellular defense and repair systems can be saturated. If the effectors of apoptosis are activated, the damaged cell dies. But, in the case where DNA damage is poorly repaired, there may be a generation of deleterious mutations that are then involved in the initiation stage of carcinogenesis. Therefore, the biological impact of oxidative stress (mortality or mutagenesis) conditions longer-term events such as aging and cancer.
  • Example 3 Following Example 3 and in order to control the antiradical activity of erythrodiol on another model, the authors of the invention analyzed its protective effect with respect to genomic DNA damage induced by stress. oxidative, in comparison with the unsaponifiable extract of argan fruit pulp and other triterpenic molecules also contained in said extract.
  • the 3D test is based on the repair of DNA lesions using purified human cell extracts. During the repair step, a marker is incorporated into the DNA and this incorporation, a quantitative reflection of the number of repaired lesions, is then revealed by chemiluminescence.
  • the principle is as follows: After damage to the genomic DNA (oxidative treatment), the cells are lysed. The lysate is deposited on a microplate coated with polylysine:
  • the protocol for carrying out the test is followed according to the instructions of the kit supplier (Solyscel 3D Test - Ref: SFRIDNO 13 - AES Laboratory). At the end of the reaction, the plate is read in a luminometer (MITHRAS LB940 - BERTHOLD).
  • Example 3 The results obtained in Example 3 showed that erythrodiol has the strongest anti-radical activity at 3 ⁇ g / ml (6.78 ⁇ M). Therefore, the authors chose to test all tripterpenes (lupeol, ⁇ -amyrin, ⁇ -amyrin and erythrodiol) and the unsaponifiable extract of argan fruit pulp at 3 ⁇ g / ml on the 3D test "DNA Damage Detection ". Said unsaponifiable extract was obtained according to the method of Example 2. The results obtained are shown in Table IV below. The values indicated in this table are the percentage inhibition (or% protection) of the DNA lesions following exogenous oxidative stress, compared to the "basal control" (100%) and “stressed H 2 " cells. O 2 "(0%).
  • the unsaponifiable extract of argan fruit pulp effectively protects the DNA against oxidative stress.
  • Erythrodiol a molecule contained in said unsaponifiable extract, at 3 ⁇ g / ml has a very good antioxidant activity with 99% protection of DNA against the formation of oxidative lesions.
  • erythrodiol is the most active.
  • L ⁇ SP72 is a major protein of the HSP70 family, expressed in cutaneous keratinocytes and fibroblasts and inducible by many stressors (heat, UV, etc.) (Trautinger F. et al J. Invest Dermatol 1993; 334-38, Charveron M. et al, Cell Biol Toxicol 1995, 11: 161-65). 2) Experimental protocol
  • the authors of the present invention have chosen to analyze the level of induction, by thermal stress, of the HSP72 proteins in IM-90 fibroblasts (fibroblast lineage) during senescence, and this in order to evaluate the "anti-inflammatory" properties.
  • the authors set up and validated a model of cellular aging by inducing the senescence of fibroblasts by oxidative stress.
  • FIG. 1 shows the analysis of the induction rate of HSP72 in fibroblasts
  • FIG. 2 shows the Western Blot analysis of the level of HSP72 proteins in the IMR-90 cells treated with different concentrations of the Argan fruit pulp extract according to the invention.
  • FIG. 3 shows the semi-quantitative analysis of the induction rate of HSP72 proteins (normalized by the expression level of ⁇ -actin) in the senescent IMR-90 fibroblasts pre-treated with different concentrations of the extract of Argan fruit pulp according to the invention.
  • the cells cultured at 37 ° C. are incubated for 1 h at 45 ° C. and are then incubated at 37 ° C. for 2 h (mRNA analysis) or for 4 h (protein analysis): Expression of the protein (Western Blot)
  • Intracellular proteins extracted from fibroblasts, were analyzed by the Western Blot technique, using an anti-HSP72 antibody (monoclonal antibody, CHEMICON) and an indirect luminescence revelation system. The membrane is analyzed and the intensity of the bands is quantified by densitometry (ImageMaster TotalLab AMERSHAM software). The expression level of HSP72 is normalized by that of a constitutively expressed protein, ⁇ -Actin.
  • FIG. 1A shows the semi-quantitative Western blot analysis of the induction rate of HSP72 proteins in the young (H) and early-aging (B) IMR-90 (H 2 O 2 -induced senescence) IMR-90.
  • FIG. 1A clearly shows that the level of HSP72 protein is induced by thermal stress in young IMR-90 fibroblasts. This induction of HSP72 is decreased in senescent IMR-90 fibroblasts.
  • HSP72 expression at the transcriptional level by quantifying mRNAs by the real-time PCR technique.
  • the level of expression of the gene of interest HSP72 is calculated in the samples treated with heat stress and the control samples.
  • the level of expression of the HSP72 gene is then normalized using three reference genes [ ⁇ -actin, GAPDH (Human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) and YWHAZ (tyrosine-3-monooxygenase, tryptophan-5-monooxygenase activation protein zeta polypeptide )], the expression of which is constitutive.
  • Figure 1B presents the quantitative real-time PCR analysis of the induction rate of HSP72 mRNAs in the young (H) and IMR-90 senescent (B) IMR-90s (H 2 O 2 -induced senescence).
  • Figure IB clearly shows that the induction of HSP72 mRNAs is also greatly diminished during the induced senescence of IMR-90 fibroblasts.
  • the authors of the invention used the induced senescence model (SIPS) with the IMR-90 fibroblastic line to evaluate the extract of Argan fruit pulp prepared according to Example 2.
  • the cells were incubated with the extract of Argan fruit pulp at concentrations of 1 and 3 ⁇ g / ml for 24 hours. Then they underwent the oxidative stress inducing senescence.
  • SIPS induced senescence model
  • FIG. 2 shows the Western Blot analysis of the level of HSP72 proteins in the IMR-90 cells treated with different concentrations of the unsaponifiable extract prepared according to Example 2.
  • the "T” and “ST” indications respectively mean "control”. And "Thermal Stress”.
  • Analyzes A, B, C, and D respectively relate to young IMR-90 fibroblasts, senescent IMR-90 fibroblasts (H 2 O 2 induced senescence), senescent IMR-90 fibroblasts incubated with the unsaponifiable 1 ⁇ g / ml and finally senescent IMR-90 fibroblasts incubated with the unsaponifiable extract at 3 ⁇ g / ml.
  • FIG. 3 shows the semi-quantitative analysis of the induction rate of HSP72 proteins (normalized by the level of expression of D-actin) in the senescent IMR-90 fibroblasts pre-treated with the unsaponifiable extract at 1 ⁇ g. ml (C) and 3 ⁇ g / ml (D). Also shown are the induction rates of the HSP72 proteins in the young IMR-90 fibroblasts (A) and in the senescent IMR-90 fibroblasts (B) (H 2 O 2 induced senescence).
  • Table V gives the induction factor (after normalization) of the HSP72 mRNAs in senescent fibroblasts pretreated with different concentrations of argan tree fruit pulp extract.
  • This table confirms the results obtained at the transcriptional level and shows the almost complete restoration of the induction of HSP72 mRNAs by the extract of Argan fruit pulp. It is at a concentration of 3 ⁇ g / ml that this extract is the most active.
  • HSP72 proteins are proteins inducible by many stresses (heat ..) and are strongly involved in adaptive response processes. It is recognized that the reliability of HSP72 proteins, at the cutaneous level and in other tissues, decreases with age and in particular during cellular senescence. In addition, it is accepted that aging is associated with a reduction in the response to environmental stress resulting in age-related pathologies.

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Abstract

Utilisation d'un extrait insaponifiable de pulpe végétale dans le traitement du vieillissement cutané. Le domaine de la présente invention concerne l'utilisation d'un extrait insaponifiable de pulpe végétale pour la préparation d'un produit cosmétique, pharmaceutique ou nutraceutique destiné à traiter et/ou à prévenir les désordres cutanés associés au vieillissement.

Description

Le domaine de la présente invention concerne l'utilisation d'un extrait insaponifiable de pulpe végétale pour la préparation d'un produit cosmétique, pharmaceutique ou nutraceutique destiné à traiter et/ou à prévenir les désordres cutanés associés au vieillissement. Le vieillissement est un phénomène inévitable, lentement évolutif et irréversible entraînant des modifications anatomiques et histologiques responsables d'anomalies fonctionnelles des organes. Les premiers signes visibles se manifestent au niveau du tissu cutané par des altérations de la texture, de la couleur, de la transparence et par l'apparition de rides. Ces manifestations peuvent être potentialisées par des facteurs extrinsèques comme le soleil, le tabac...
L'importance des radicaux libres oxygénés (RLO) dans les processus impliqués dans le vieillissement est retenue comme une des théories majeures.
Au niveau cutané, les RLO sont décrits comme les médiateurs précoces de pathologies inflammatoires et du vieillissement (Kress M. et al. Pain 1995; 62:87-94). Au cours du vieillissement, toutes les structures de la peau se modifient. Mais les altérations fondamentales prédominent dans le derme et ce sont les fibroblastes et la matrice extracellulaire qui en sont les principales cibles et les principaux acteurs. Les fibroblastes sont capables d'entrer en sénescence. En conséquence, leur nombre diminue, leur fonction est ralentie et leur phénotype est modifié. Ils participent alors activement à la dégradation de la matrice extracellulaire dermique. De plus, lors de la sénescence, les fibroblastes perdent leur réactivité et voient leur régulation modulée. En effet, il est admis que le vieillissement est associé à une réduction voire une perte de la réponse au stress environnemental et, de ce fait, à une apparition de maladies infectieuses, auto- immunes et de cancers (Gardner LD. Rev. Infect. Dis. 1980; 2: 801-10). L'apparition des rides est un des signes les plus précoces du vieillissement. Elle constitue, pour certaines personnes, un véritable problème dans leurs relations avec l'extérieur. Ainsi aujourd'hui, de nombreux produits cosmétiques visant le traitement du vieillissement cutané sont mis à la disposition du public. Principalement, ces spécialités sont à base d'extraits végétaux. L'Arganier, connu dans la nomenclature botanique internationale sous l'appellation à'Argania spinosa (L.) Skells, a notamment été valorisé par l'industrie cosmétique, et plus particulièrement l'amande de la graine. L'Arganier est un arbre trapu de 6 à 10 mètres de haut, dont le port rappelle celui de l'Olivier.
Le port de la couronne foliaire est quelque peu variable, pouvant être dressé ou pleureur. Les rameaux, très épineux, portent de toutes petites feuilles lancéolées, alternes, étroites, courtes (environ 2 cm), souvent regroupées en fascicules.
Le feuillage de l'Arganier est généralement persistant, mais il arrive qu'en période de grande sécheresse, il devienne caduc.
Les fleurs, de coloration jaune-verdâtre, hermaphrodites (étamines et pistils sur la même fleur) et pentamères (5 pétales, 5 sépales...), sont regroupées en inflorescences de type glomérule. Elles s'épanouissent de mai à juin.
L'Arganier fructifie dès l'âge de 5 ans. Le fruit est une baie sessile jaune et ovale de 4 à 5 cm de long. Elle est formée d'un péricarpe charnu (aussi appelé pulpe), renfermant une sorte de « faux noyau » très dur de couleur marron. Cet élément est constitué en réalité de 2 à 3 graines aplaties soudées entre elles et renfermant chacune une amande oléagineuse. Les applications les plus valorisées ont pour origine l'amande de la graine. Celle-ci fournit une huile puis dans un second temps un tourteau.
L'huile issue des graines a fait l'objet de plusieurs brevets d'invention : obtention de l'huile par solvant (FR 2 553 788), l'huile d'argan enrichie en insaponifiable (FR 2 724 663). Des substances autres que l'huile ont également été brevetées. C'est le cas de peptides issus des tourteaux des graines obtenus après extraction de l'huile : association de l'huile et de peptides de tourteaux pour le traitement des troubles liés au vieillissement cutané (FR 2 756 183). La feuille de l'Arganier, les protéines et les saponines de tourteaux ont également fait l'objet de brevets d'invention : EP 1 213 025 concerne des extraits de feuilles, EP 1 213 024 traite des protéines de tourteaux et EP 1 430 900 des saponines de Tourteaux.
Les pulpes de fruits de l'Arganier ont fait l'objet plus récemment de la demande de brevet WO2005/039610. Le fruit de l'Arganier est une fausse drupe. Il est donc constitué d'un péricarpe charnu appelé pulpe (55 à 75 % du fruit) et d'un noyau pourvu d'une coquille très dure contenant une à trois amandes. De ces dernières est extraite l'huile. La pulpe du fruit a fait l'objet d'études chimiques. Elle est constituée de glucides dont la cellulose, du glucose, fructose et saccharose (Charrouf Z. Guillaume D., Ethnoeconomical, ethnomedical, and phytochemical study of Argania spinosa (L.) Skeels., Journal of Ethnopharmacology, 1999, 67, 1, 7-14 - Sandret F.G., Etudes préliminaires des glucides et du latex de la pulpe du fruit d' Argan (Argania spinosa) : variation au cours de la maturation, Bulletin de la Société de Chimie Biologique, 1957, 39, 5-6, 619-631). Les lipides y sont également présents. Leur teneur est de 6 %. Dans la fraction insaponifiable de ces lipides ont été identifiés 5 alcools triterpéniques = érythrodiol, lupéol, α et β-amyrine, bétulinaldéhyde et 2 stérols = α spinostérol et schotténol (Charrouf Z., Fkih-Tetouani S., Charrouf M., Mouchel B., Triterpènes et stérols extraits de la pulpe d'Argania spinosa, Plantes Médicinales et Phytothérapie, 1991, 25, 2-3, 112-117).
La demande de brevet WO2005/039610 a trait, d'une manière générale, à l'utilisation de composition à base de pulpes de fruits d'arganier pour la préparation de produits cosmétiques. L'extrait des pulpes de fruits a été plus ou moins purifié. En effet, les inventeurs ont testé l'extrait à différentes étapes du procédé. Ainsi, c'est préférentiellement l'utilisation d'un extrait de pulpes de fruits obtenu suite à une extraction à l'hexane qui est décrit (page 15). Puis suite à une classique étape de saponification connue de l'homme du métier, les auteurs ont testé la fraction insaponifibale ainsi recueillie. Enfin, les auteurs ont également envisagé une étape de fractionnement de Finsaponifiable par chromatographie en prenant soin d'écarter le composé triterpénique érythrodiol.
Ce raisonnement a vraisemblablement été guidé par les résultats obtenus notamment par le fait que l' érythrodiol seul est présenté comme toxique (exemple 1) à une dose plus faible que la fraction triterpénique telle que définie dans le document : fraction A dépourvue d'érythrodiol (page 38). De plus, l'érythrodiol seul ne présente qu'un bénéfice médiocre vis à vis des UVA et UVB (exemples 3 et 4), par rapport à ladite fraction triterpénique. L'enseignement général de ce document porte donc sur l'utilisation de la fraction triterpénique d'un extrait de pulpe de fruits d'arganier pour la préparation de produits cosmétiques et préférentiellement dans le traitement des peaux agressées par les UVA et UVB via la stimulation du métabolisme des fïbroblastes.Plus spécifiquement, ce document enseigne que ladite fraction triterpénique telle que divulguée dans WO2005/039610 sera d'autant plus active que la quantité d'érythrodiol sera faible.
De manière surprenante et inattendue, les auteurs de la présente invention ont mis en évidence un effet d'inhibition de la sénescence des fibroblastes de peaux matures avec - A -
un extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier riche en érythrodiol ; ledit extrait étant susceptible d'être obtenu par une extraction acétonique suivie d'une étape classique de saponification. Cependant, on peut raisonnablement envisager que les bénéfices de la présente invention puissent être étendus à tout extrait insaponifiable de pulpe végétale présentant une fraction triterpénique dont la composition en ses composés majoritaires est proche de celle issue des pulpes de fruits d'arganier.
La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait insaponifiable de pulpe végétale comprenant une fraction triterpénique, caractérisé en ce que ladite fraction triterpénique comprend de l' érythrodiol, de l'α-amyrine, de la β-amyrine et du lupéol, pour la préparation d'un produit cosmétique, pharmaceutique ou nutraceutique destiné à prévenir et/ou traiter des désordres cutanés associés au vieillissement cutané. De façon préférentielle, ledit extrait est obtenu par une extraction acétonique suivie d'une étape classique de saponification. Cet extrait insaponifiable, encore appelé insaponifiable initial, peut être solubilisé dans un excipient pour faciliter sa formulation.
Préférentiellement ledit extrait est obtenu à partir d'un végétal choisi dans la famille des Sapotaceae ; et encore plus préférentiellement ledit extrait est obtenu à partir de pulpes de fruits d'arganier. Un avantage de l'extraction acétonique réside dans le fait que l'on peut s'affranchir du latex, qui représente la très grande majorité de la fraction lipidique, et ainsi être plus concentré en substances insaponifiables dans la fraction lipidique. La composition de l' insaponifiable selon la présente invention se différencie à la fois qualitativement et quantitativement de celle décrite préférentiellement dans la demande de brevet WO2005/039610.
Les extraits selon la présente invention sont caractérisés par leur teneur en substances triterpéniques. Ces dernières peuvent être analysées par chromatographie en phase gazeuse selon une méthode appropriée classique qui permet d'identifier la β- amyrine, l'érythrodiol. Par contre l'α-amyrine et le lupéol ne sont pas séparés par cette méthode, ces molécules peuvent alors être dosées communément.
Avantageusement, la fraction triterpénique dudit extrait est composée d' érythrodiol dont la fraction massique est comprise entre environ 7% et environ 40% de l'insaponifiable initial, de β-amyrine dont la fraction massique est comprise entre environ 5% et environ 30% de l'insaponifiable initial, de α-amyrine et de lupéol dont la somme de ces deux fractions massiques est comprise entre environ 10% et environ 50% de l'insaponifiable initial.
De façon avantageuse, ladite fraction massique d'érythrodiol est comprise entre environ 10% et environ 20% de l'insaponifiable initial ; et de façon encore plus avantageuse est égale à environ 15% de l'insaponifiable initial.
De façon avantageuse, ladite fraction massique de β-amyrine est comprise entre environ 7% et environ 20% de l'insaponifiable initial ; et de façon encore plus avantageuse est égale à environ 10% de l'insaponifiable initial. De façon avantageuse, la somme desdites fractions massiques de α-amyrine et de lupéol est comprise entre environ 15% et environ 30% de l'insaponifiable initial ; et de façon encore plus avantageuse est égale à environ 20% de l'insaponifiable initial. Les teneurs en ces différentes molécules dépendent des conditions d'extraction. Ces valeurs seront moins importantes dans le produit cosmétique, pharmaceutique ou nutraceutique en fonction du ou des excipients qui seront ajoutés à l'insaponifiable initial.
Un point remarquable de la présente invention est la contribution importante de Férythrodiol dans les propriétés anti-vieillissement de l'extrait insaponifiable selon la présente invention. Les RLO jouant un rôle important dans le processus de vieillissement cutané, l'effet antiradicalaire (anti-RLO) de l'érythrodiol a été évalué en comparaison avec l'insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier selon la présente invention. Les dommages créés par les RLO au sein des cellules se traduisent par l'altération des composants lipidiques de la membrane plasmique (lipoperoxydation), des protéines (dénaturation et dégradation) et du matériel génétique ou ADN (mutations). Les essais réalisés in vitro ont porté sur la détermination: de l'efficacité de protection par l'érythrodiol et par l'extrait insaponifiable contre l'oxydation de lipides membranaires (exemple 3); et du pouvoir protecteur de l'érythrodiol et d'autres molécules triterpéniques (lupéol, α et β-amyrine) vis à vis de l'altération de l'ADN génomique (exemple 4). Ces essais ont permis de mettre en évidence que l'érythrodiol est une molécule qui possède un potentiel anti-oxydant important.
Dans un mode particulier de réalisation de la présente invention, l'extraction peut être réalisée comme suit : les pulpes de fruit d'Arganier séchées sont broyées puis extraites avec de l'acétone. On peut également utiliser un mélange acétone-eau. L'extraction est menée sous agitation ou de façon statique, dans un ratio plante/solvant pouvant varier de 1/2 à 1/20, à des températures variant de la température ambiante à la température d'ébullition du solvant et sur une durée pouvant aller de 30 minutes à 24 heures.
Une fois extrait, le résidu solide de plante est séparé de la solution extractive par filtration ou centrifugation. La solution peut être plus ou moins concentrée jusqu'à l'obtention d'un extrait sec. Dans ce dernier cas, la matière sèche peut être solubilisée dans un alcool pour permettre la saponification. A la solution, est ajouté un hydroxyde métallique, en particulier la soude ou la potasse à des concentrations variant de 0,1 à 10 N. La saponification est menée à des températures variant de la température ambiante à l'ébullition, sous agitation et sur une durée variant de 15 minutes à 48 heures selon la température. La purification est menée par une extraction liquide/liquide. On rajoute alors au milieu d'hydrolyse un solvant non miscible qui peut être de l'eau saturée ou non en sels [NaCl, (NH4)2 SO4] et ajustée à des pH variant de 3 à 9. Ce solvant peut être un éther oxyde, un ester, un alcane, un hydrocarbure halogène, ou un mélange de ces solvants. Une, deux ou trois extractions liquides/liquides successives sont réalisées. Les phases organiques sont réunies puis lavées avec de l'eau saturée ou non en sels et à des pH variant de 3 à 9. Cette phase de lavage peut être répétée plusieurs fois.
Après purification, les phases organiques sont traitées de façon à éliminer le solvant. Ce traitement peut être effectué par évaporation en contrôlant la pression. L'étape d'évaporation peut mener à un produit de consistance lipidique plus ou moins cireuse, Pinsaponifïable initial. On peut rajouter un excipient qui peut être une cire animale (abeille par exemple) ou végétale (cire de Carnauba, de Candellila ou de Jojoba) une huile végétale (maïs, carthame, sésame, argan...) la glycérine, des produits d'origine synthétique comme l'huile de vaseline, les polyols (comme le propylène glycol, le butylène glycol, le glycérol...) des triglycérides estérifiés (comme le miglyol 812, le myritol 318, le neobee MJ) les polymères oxypropylénés de formule H (OCH2-CHCH3)n OH ou les polymères oxyéthylénés de fonnule H (OCH2-CH2)n OH, les diesters d'alcool gras de longueur variable, de Ci à C40. Les proportions de l'insaponifiable initial de pulpes de fruits d'Arganier et de l'excipient peuvent varier de 1/99 à 99/1. De façon avantageuse, la présente invention permet une valorisation des pulpes de fruits dans le traitement anti-vieillissement, à un coût de revient raisonnable. L'extrait insaponifiable est utilisé sans étape de purification supplémentaire, qui est très coûteuse. La composition selon la présente invention peut donc être obtenue à l'aide d'un procédé faisant intervenir des étapes classiques d'extraction et de saponification connues de l'homme du métier.
L'utilisation d'un extrait insaponifiable de pulpe végétale selon la présente invention permet de prévenir et/ou traiter les désordres cutanés qui se manifestent par des altérations de texture, de couleur, de la transparence de la peau et par l'apparition des rides.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les désordres cutanés sont consécutifs à une réduction ou une perte de réponse au stress environnemental, notamment causé par le soleil ou le tabac. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les désordres cutanés sont consécutifs à une réduction ou une perte d'inductibilité des protéines HSP72. Les protéines HSP pour « Heat Shock Protein » sont exprimées constitutivement dans de nombreuses cellules et possèdent des fonctions indispensables dans le maintien des protéines, d'où leur nom de protéines « chaperon ». En effet, elles inhibent l'agrégation des protéines dénaturées, empêchent des associations non appropriées de protéines et elles sont impliquées dans le transport intracellulaire et dans le maintien sous forme inactive de certaines protéines (Morris S.D. Clin. Exp. Dermatol. 2002; 27: 220-224). Les HSPs jouent également un rôle essentiel dans la réponse au stress et notamment dans les processus de protection cellulaires mettant en jeu la réponse adaptative (Maytin E. V. J. Invest. Dermatol. 1995; 104: 448-55). De façon inattendue, l'utilisation d'un extrait selon la présente invention permet de restaurer l'induction des protéines HSP72 dans les fibroblastes sénescents.
Dans le cadre de la présente invention, le produit cosmétique, pharmaceutique ou nutraceutique, renfermant un extrait selon l'invention, est administré par voie orale ou par voie topique, et préférentiellement par voie topique. Pour une administration par voie topique, la forme galénique est choisie dans le groupe comprenant les crèmes, les gels, les pommades et les sprays.
Avantageusement, la forme orale est choisie parmi le groupe comprenant des comprimés, des gélules et des poudres pour suspensions buvables. De façon avantageuse, la quantité dudit extrait dans le produit cosmétique final est comprise entre environ 0,001% et environ 50%, préférentiellement entre environ 0,01% et environ 10%; et encore plus préférentiellement entre environ 0,1% et environ 2% en poids du poids total de la préparation. La préparation peut en outre contenir d'autres actifs bien connus de l'homme du métier pour le traitement et/ou la prévention des désordres cutanés associés au vieillissement cutané. Avantageusement, ladite préparation contient d'autres substances issues de l'arganier connues pour leur action « anti-âge » telles que l'huile obtenue à partir de l'amande de la graine et les peptides de tourteaux par exemple. L'exemple ci-dessous d'une composition selon l'invention est donné à titre indicatif et non limitatif. Les pourcentages sont donnés en poids par rapport au poids total de la composition.
EXEMPLE 1 : soin anti-relâchement visage - Extrait insaponifiable de pulpe de fruits d'arganier 0,1 à 2%
Huile d'argan enrichie 1 à 5%
- Peptides d'argan 0,1 à 1%
- Dérivé de vitamine E 0,1 à 0,5%
- Ester glycérique de vitamine F 0,1 à 0,5% - Palmitate vitamine A 0,1 à 1%
- Stéarate méthyl glucose 1 à 5%
- Triglycérides caprique caprylique 2 à 8% Paraffine liquide 5 à 12% Parfum qs - Eau purifiée q.s.p. 100g
Les exemples suivants illustrent la présente invention sans toutefois en limiter la portée.
EXEMPLE 2 : procédé d'obtention d'un extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier
1 tonne de pulpes de fruits d'Arganier séchées est broyée puis extraite dans un réacteur par 5 tonnes d'acétone. L'extraction est menée sous agitation pendant une heure à reflux. Une fois refroidie, la solution est récupérée par filtration puis concentrée sous vide jusqu'à l'obtention d'un extrait huileux désolvanté. Ce résidu est repris dans 500 1 d'éthanol à 95 % v/v. On y ajoute 100 1 de lessive de soude 10 N et on porte à reflux sous agitation pendant une heure.
Après refroidissement, la solution hydrolysée est placée dans un décanteur, on y ajoute
500 1 d'heptane et 300 1 d'eau. L'extraction liquide/liquide est menée avec précaution. Après décantation, on récupère la phase organique. On répète 2 extractions nouvelles avec 500 1 d'heptane. Les 3 phases heptaniques sont regroupées et lavées 3 fois avec 500
1 d'eau chaque fois. Les phases organiques lavées sont désolvantées. On récupère ainsi une pâte cireuse. Cet extrait, qui correspond à l'insaponifiable initial, est dosé pour sa teneur en substances triterpéniques. Il contient 10 % de β amyrine, 15 % en érythrodiol et 20 % du mélange lupéol-α amyrine.
EXEMPLE 3 : analyse de l'effet anti-radicalaire de l'érythrodiol - analyse de la peroxydation lipidique
1) Introduction La membrane plasmique constitue la principale et la première cible des RLO et, étant riche en lipides, elle est le site d'une peroxydation accrue (Girotti A.W. J. Free Radie.
Biol. Med. 1985 ; 1 : 87-95). Les peroxydes générés au cours de cette oxydation lipidique sont aussi très réactifs et capables de dégrader le matériel protéique et génomique.
Pour évaluer l'altération membranaire, les auteurs de l'invention ont mesuré la peroxydation lipidique par un dosage in vitro des complexes entre les produits d'oxydation lipidique et l'acide thiobarbiturique. Ces complexes sont appelés TBARS
(pour Thiobarbituric Acid Reactive Substances) et donnent le nom au test : Test des
TBARS.
Afin de mimer un stress oxydatif chimique, on a traité la lignée de fibroblastes, L929, par un complexe composé de peroxyde d'hydrogène (H2O2) et de fer (Fe2+/Fe3+) reconstituant ainsi la réaction de Fenton, source de RLO et plus particulièrement de radical hydroxyle (OH0) (Vessey D. A. et al J. Invest. Dermatol. 1992 ; 99 : 859-63) :
H2O2 + Fe2+ -» OH0 + OH" + Fe3+.
2) Méthodologie
O Produits testés :
Les produits ont été évalués sur la lignée de fibroblastes murins L929. Les cellules sont prétraitées avec les différentes concentrations de produits (Tableau I) pendant 16 heures et sont ensuite stimulées avec le complexe H2O2-Fe +/Fe3+ pendant 1 heure. Le lot LK0304 d'extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier a été préparé selon l'exemple 2.
Tableau I : Présentation des solutions testées
Figure imgf000011_0001
(*Molécule de Référence Anti-radicalaire)
La peroxydation des lipides membranaires est analysée en mesurant les TBARS (selon Morlière P. et alBiochim. Biophys. Acta. 1991 ; 1084 : 261-268). O Principe du test : En milieu acide, à 950C, se forment des complexes, notés TBARS pour Thio Barbituric Acid Reactive Substance, entre les produits d'oxydation lipidiques (malondialdéhyde ou MDA) et l'acide thiobarbiturique (TBA) qui peuvent être dosés en fluorescence par rapport à une gamme étalon avec le MDA. Le dosage des TBARS est alors exprimé en pmole/μg de protéines. Les protéines et TBARS sont dosés dans le milieu intracellulaire. O Calcul du pourcentage de protection des membranes cellulaires :
A partir du calcul des TBARS en pmole/μg protéines, l'efficacité protectrice des différents produits contre l'oxydation des lipides membranaires a été calculé comme suit.
[TBARS contrôle] - [TBARS (+ produits) ] % de protection = X 100
[TBARS contrôle]
3) Résultats - Discussion
Après un traitement de 16h avec les divers produits à tester, le modèle de stress radicalaire utilisé dans cette expérience (réaction de Fenton) induit une peroxydation lipidique importante dans les fibroblastes L929. Cette décharge massive de radical hydroxyle OH° génère donc un stress oxydatif au niveau cellulaire et notamment au niveau des membranes. Cependant, dans ce type de réaction oxydative, les produits issus de la peroxydation lipidique sont internalisés dans les cellules et les TBARS sont alors dosés dans le milieu intracellulaire. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau II ci-dessous.
Tableau II: Analyse de la peroxydation lipidique
Figure imgf000012_0001
La vitamine E, constituant la molécule de référence anti-radicalaire, diminue la peroxydation lipidique induite par le complexe H2O2-Fe24VFe3+, et protège très efficacement les membranes cellulaires (56% environ).
L'extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier préparé selon l'exemple 2 présente une activité anti-radicalaire aux concentrations de 1 et 3μg/ml (30 et 37% de protection des membranes lipidiques, respectivement).
L' erythrodiol, molécule contenue dans la fraction triterpénique de l'extrait insaponifiable, présente une bonne activité anti-oxydante avec un effet dépendant de la dose. L'érythrodiol est actif dès 0,3μg/ml (33 % de protection). L'effet anti-radicalire de P erythrodiol à 3μg/ml est très important et comparable à la Vitamine E.
4) Conclusion
Le modèle in vitro présenté dans cette étude reflète les conséquences dues à un stress oxydatif majeur sur la principale cible cellulaire qu'est la membrane plasmique. Ainsi le dosage de la peroxydation lipidique constitue un bon marqueur du stress oxydatif et permet l'évaluation de l'action antioxydante, vis à vis du radical hydroxyle, de principes actifs au niveau de la membrane cellulaire.
La Vitamine E, molécule anti-oxydante, permet la validation de ce modèle. Dans ces conditions expérimentales, il a été observé que l'extrait selon la présente invention contenant l'érythrodiol ainsi que l'érythrodiol lui-même possèdent un potentiel anti-oxydant important.
EXEMPLE 4 : analyse de l'effet anti-radicalaire de l'érythrodiol - analyse de l'atteinte génomique
1) Introduction
L'ADN est une cible des RLO qui induisent la modification de bases (oxydation, nitration, déamination : Guetens G. et al Clin. Lab. ScL 2002 ; 39 : 331-457), la formation de cassures de brins (sites abasiques ou β-élimination) et de pontage ADN- protéines ou ADN-hydroperoxydes. L'altération du matériel génomique induit une cascade de réactions cellulaires (blocage fourche de réplication, activation de protéines clés, arrêt dans le cycle cellulaire) qui aboutissent à l'induction des mécanismes de réparation. Les bases modifiées par un stress oxydatif sont ainsi prises en charge majoritairement par le système de réparation des bases ou BER pour Base Excision Repair (Friedberg E.C. et al DNA repair and mutagenesis, ASMPress ; Washington DC 1995). Ce système agit vite et efficacement selon trois étapes clés :
1- reconnaissance de la base altérée;
2- incision et excision de la lésion;
3- resynthèse de la brèche. Les RLO peuvent être produits en quantité telle que les systèmes de défense et de réparation cellulaires peuvent être saturés. Si les effecteurs de l'apoptose sont activés, la cellule endommagée meurt. Mais, dans le cas où les lésions à l' ADN sont mal réparées, il peut y avoir génération de mutations délétères qui sont alors impliquées dans l'étape d'initiation de la carcinogenèse. C'est pourquoi, l'incidence biologique d'un stress oxydatif (mortalité ou mutagenèse) conditionne des événements à plus long terme comme le vieillissement et le cancer.
De nombreuses études ont démontré la forte corrélation entre le vieillissement et l'accumulation progressive et irréversible de dommages oxy datifs au niveau des macromolécules cellulaires. Plusieurs groupes de recherche ont montré, chez le rongeur, que les taux de 8-OxoGuanine, mesuré dans différents tissus tels que la peau, augmentent avec l'âge (Tahara S. et al Mech. Ageing Dev. 2001 ; 122 : 415-426). Les travaux de Mecocci P. et al (Free Radie. Biol. Med. 1999 ; 26 : 303-8) sur le muscle squelettique chez l'homme, montrent que des lésions oxydantes sur l'ADN ou sur les lipides s'accumulent avec l'âge. La même équipe a également montré que chez des sujets atteints de maladie d'Alzheimer, les taux de bases oxydées dans l'ADN des lymphocytes et les taux d' antioxydants dans le plasma sont significativement plus hauts et plus bas respectivement, que chez les sujets sains (Mecocci P. et al Arch. Neurol. 2002 ; 59 : 794- 8).
2) Objectif
Suite à l'exemple 3 et afin de contrôler l'activité antiradicalaire de l'érythrodiol sur un autre modèle, les auteurs de l'invention ont analysé son pouvoir protecteur vis à vis de l'altération de l'ADN génomique induite par un stress oxydatif, en comparaison avec l'extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier et d'autres molécules triterpéniques contenues également dans ledit extrait.
Ils ont choisi de générer des lésions à l'ADN par un stress H2O2 et d'analyser indirectement les dommages ainsi formés en analysant la réaction de réparation. Pour cela, un kit appelé test 3D pour DNA Damage Détection, a été utilisé. Cet essai biochimique mime in vitro la réaction de réparation par excision (Salles B. et al Anal.
Biochem. 1995 ; 232 : 37-42 et Salles B. et al Biochimie 1999 ; 81 : 53-58). Le test 3D a pour base la réparation des lésions de l'ADN au moyen d'extraits cellulaires humains purifiés. Au cours de l'étape de réparation, un marqueur est incorporé à l'ADN et cette incorporation, reflet quantitatif du nombre de lésions réparées, est ensuite révélée par chimiluminescence .
3) Méthodologie
O Produits testés : Les produits ont été évalués sur la lignée de fîbroblastes murins L929. Les cellules sont prétraitées avec les produits (Tableau III) pendant 16 heures et sont ensuite stimulées avec H2O2 (Peroxyde d'Hydrogène 3% - Réf. GIFRER - Laboratoire Gifrer Barbezat) à lOOμM pendant 30 minutes. Tableau III : Présentation des solutions testées
Figure imgf000015_0001
O Υest3D :
Le principe est le suivant: Après endommagement de l'ADN génomique (traitement oxydatif), les cellules sont lysées. Le lysat est déposé sur une microplaque coatée avec de la polylysine :
1- Adsorption de l'ADN
2- Incubation de l'ADN avec un extrait protéique (enrichi en enzymes de réparation) et un pool de nucléotides dont un nucléotide est marqué à la biotine (dUTP- Biotine) - Réparation des lésions et incorporation dans l'ADN des nucléotides marqués « dUTP-Biotine ».
3- Incubation avec un complexe enzymatique « Avidine-Peroxydase » - Reconnaissance par l'avidine des dUTP -Biotine incorporés.
4- Addition d'un substrat de la peroxydase luminescent et quantification du signal émis proportionnel au nombre de lésions réparées.
Le protocole de réalisation du test est suivi selon les instructions du fournisseur du kit (Test 3D Solyscel - Réf : SFRIDNO 13 - AES Laboratoire). A la fui de la réaction, la plaque est lue dans un luminomètre (MITHRAS LB940 - BERTHOLD).
O Calcul du pourcentage de protection de l'ADN: Le rapport ci-dessous permet de calculer, pour chaque concentration de produit testé, le % de protection contre l'induction de lésions sur l'ADN par un stress oxydatif (l'Intensité de Luminescence - ou IL - exprime la quantité de lésions de l'ADN).
IL (H2O2) - IL (produit)
% Protection de l'ADN ≈ X 100
IL (H2O2) - IL (témoin) 4) Résultats et conclusion
Les résultats obtenus à l'exemple 3 ont montré que l'érythrodiol présente l'activité anti- radicalaire la plus forte à 3μg/ml (6,78μM). C'est pourquoi, les auteurs ont choisi de tester tous les tripterpènes (lupéol, α-amyrine, β-amyrine et érythrodiol) et l'extrait insaponifîable de pulpes de fruits d'arganier à 3μg/ml sur le test 3D « DNA Damage Détection ». Ledit extrait insaponifiable a été obtenu suivant le procédé de l'exemple 2. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau IV ci-dessous. Les valeurs indiquées dans ce tableau sont les pourcentages d'inhibition (ou % de protection) des lésions à l'ADN suite à un stress oxydatif exogène, par rapport aux cellules « témoin basai » (100%) et aux cellules « stressé H2O2 » (0%).
Tableau IV: Protection de l'ADN par l'Erythrodiol
Figure imgf000016_0001
Le traitement par H2O2 induit une forte proportion d'oxydation au niveau de la Guanine avec formation en particulier de 8-oxo-7,8-dihydro-2'-desoxyguanosine (8- OxoGuanine) (Dizdaroglu M. et al Arch. Biochem. Biophys. 1991 ; 285 : 388-390). Le test 3D montre une forte augmentation de luminescence après traitement à l'H2O2, reflétant une forte activité de réparation et par conséquent un taux important de bases endommagées sur l'ADN.
L'extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier protège efficacement l'ADN vis à vis du stress oxy datif.
L'érythrodiol, molécule contenue dans ledit extrait insaponifiable, à 3 μg/ml présente une très bonne activité anti-oxydante avec 99% de protection de l'ADN vis à vis de la formation de lésions oxydatives.
En comparant les molécules triterpéniques à concentration molaire équivalente (environ 7μM), c'est l'érythrodiol qui est le plus actif.
EXEMPLE 5 : Modèle d'étude in vitro de l'effet de l'extrait insaponifiable selon l'invention sur l'induction des protéines HSP72
1) Bibliographie
Différents travaux ont montré la perte d'inductibilité des protéines HSP72 lors du vieillissement. Chez des patients âgés, l'induction de la protéine HSP72 par la chaleur est réduite de façon importante au niveau cutané (Muramatsu T. et al. Br. J. Dermatol. 1996; 134: 1035-1038). D'autre part, Gustmann-Conrad A. et al. (Exp. CeIl. Res. 1998; 241: 404-413) ont montré que l'induction de la protéine HSP72 par un stress thermique, est significativement diminuée dans des fibroblastes issus de la peau de sujets âgés par rapport à ceux issus de sujets jeunes. Dans cette même étude, il a été montré que le niveau d'induction d'HSP72 est également réduit dans des fibroblastes (issus de peau jeune) ou dans des lignées de fibroblastes (IMR-90) devenus sénescents au cours des divisions cellulaires.
Un premier stress modéré suffit à induire in vitro les protéines HSPs afin qu'elles protègent la cellule vis à vis de nouveaux stress (Morris S.D. et al. J. Clin. Invest. 1996; 97: 706-12). LΗSP72 est une protéine majoritaire de la famille des HSP70, exprimée dans les kératinocytes et les fibroblastes cutanés et inductible par de nombreux agents stressants (chaleur, UV..) (Trautinger F. et al. J. Invest. Dermatol. 1993; 101: 334-38 ; Charveron M. ét al. CeIl. Biol. Toxicol. 1995; 11: 161-65). 2) Protocole expérimental
Les auteurs de la présente invention ont choisi d'analyser le niveau d'induction, par un stress thermique, des protéines HSP72 dans des fibroblastes IMR-90 (lignée fîbroblastique) lors de la sénescence, et ceci afin d'évaluer les propriétés « anti-âge » d'un extrait de pulpes de fruit d'Arganier préparé selon l'exemple 2, soit contenant 10 % de β amyrine, 15 % d'érythrodiol et 20 % du mélange lupéol - α amyrine. Dans un premier temps, les auteurs ont mis en place et validé un modèle de vieillissement cellulaire en induisant la sénescence des fibroblastes par un stress oxydatif. - Modèle de sénescence induite : Les fibroblastes se divisent jusqu'à un stade critique qu'on appelle la sénescence réplicative et qui s'assimile à un vieillissement cellulaire. Mais la sénescence peut également être induite notamment par un stress oxydatif, il s'agit de la « Stress-Induced Prématuré Sénescence ou SIPS » (Dumont et al Free Radie. Biol. Med. 2000 ; 28 : 361- 373). Modèle utilisé : L'induction de la sénescence dans la lignée de fibroblastes IMR-90 jeunes a été mise en évidence en traitant les cellules 2h avec de l'H2O2. 72h après ce stress, les cellules IMR-90 sont sénescentes.
Dans un second temps, ils ont montré la diminution du niveau d'induction des HSP72 suite à un stress thermique, dans des fibroblastes sénescents comparés à des fibroblastes jeunes. Finalement, ils ont évalué les propriétés d'un extrait de pulpes de fruit d'Arganier préparé selon l'exemple 2, soit contenant 10 % de β amyrine, 15 % d'érythrodiol et 20 % du mélange lupéol - α amyrine sur ce modèle de sénescence.
3)Résultats L'invention sera mieux comprise et les buts, avantages et caractéristiques de celle-ci apparaîtront plus clairement de la description qui suit et qui est faite en référence aux dessins annexés sur lesquels :
- la figure 1 présente l'analyse du taux d'induction des HSP72 dans les fibroblastes
IMR-90 au niveau transcriptionnel et traductionnel. - la figure 2 présente l'analyse par Western Blot du taux de protéines HSP72 dans les cellules IMR-90 traitées avec différentes concentrations de l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier selon l'invention. Ia figure 3 présente l'analyse semi-quantitative du taux d'induction des protéines HSP72 (normalisée par le niveau d'expression de la β-actine) dans les Fibroblastes IMR-90 sénescents pré-traités avec différentes concentrations de l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier selon l'invention.
- Analyse de l'induction des HSP72 par un stress thermique au cours de la sénescence des fibroblastes IMR-90 :
Les cellules cultivées à 370C sont incubées Ih à 450C et sont ensuite incubées à 37°C pendant 2h (analyse des ARNm) ou pendant 4h (analyse des protéines) : * Expression de la protéine (Western Blot)
Les protéines intracellulaires, extraites des fibroblastes, ont été analysées par la technique du Western Blot, en utilisant un anticorps anti-HSP72 (Anticorps monoclonal, CHEMICON) et un système de révélation indirecte en luminescence. La membrane est analysée et l'intensité des bandes est quantifiée par densitométrie (Logiciel ImageMaster TotalLab AMERSHAM). Le niveau d'expression de HSP72 est normalisé par celui d'une protéine exprimée de façon constitutive, la β-Actine.
La figure IA présente l'analyse semi-quantitative par Western Blot du taux d'induction des protéines HSP72 dans les IMR-90 jeunes (H) et IMR-90 sénescents (B) (sénescence induite par H2O2). Ainsi, la figure IA montre clairement que le taux de protéines HSP72 est induit par un stress thermique dans des fibroblastes IMR-90 jeunes. Cette induction d'HSP72 est diminuée dans des fibroblastes IMR-90 sénescents.
* Expression des ARNm (PCR en temps réel)
Les auteurs ont analysé l'expression HSP72 au niveau transcriptionnel en quantifiant les ARNm par la technique de PCR en temps réel. Le niveau d'expression du gène d'intérêt HSP72 est calculé dans les échantillons traités par un stress thermique et les échantillons témoins. Le niveau d'expression du gène HSP72 est ensuite normalisé en utilisant trois gènes de référence [β-actine, GAPDH (Human glyceraldehyde-3 -phosphate deshydrogenase) et YWHAZ (Tyrosine-3- monooxygenase, tryptophane-5-monooxygenase activation protein zêta polypeptide)], dont l'expression est constitutive.
Enfin, en fixant le niveau d'expression dans les échantillons témoins à 1, il est alors possible de déterminer le facteur d'induction du gène HSP72. La figure IB présente l'analyse quantitative par PCR en temps réel du taux d'induction des ARNm HSP72 dans les IMR-90 jeunes (H) et IMR-90 sénescents (B) (sénescence induite par H2O2). La figure IB montre clairement que l'induction des ARNm HSP72 est également très diminuée lors de la sénescence induite des fibroblastes IMR-90.
- Analyse de l'efficacité de l'extrait de pulpes de fruits d'Arganier :
Les auteurs de l'invention ont utilisé le modèle de sénescence induite ou SIPS (Stress Induced Prématuré Sénescence) avec la lignée fibroblastique IMR-90 pour évaluer l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier préparé selon l'exemple 2. Les cellules ont été incubées avec l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier aux concentrations de 1 et 3 μg/ml pendant 24h. Puis elles ont subi le stress oxydatif induisant la sénescence.
Tous les traitements ont été comparés à un lot de cellules IMR90 «jeunes » et un lot de cellules « sénescentes » (sénescence induite) non pré-traitées par l'extrait de pulpes de fruits d'Arganier.
Trois jours (72h) après le stress oxydatif, les HSP72 ont été induites par la chaleur. Finalement, les ARN et les protéines HSP72 ont été analysées par PCR en temps réel et Western Blot, respectivement. La figure 2 présente l'analyse par Western Blot du taux de protéines HSP72 dans les cellules IMR-90 traitées avec différentes concentrations de l'extrait insaponifiable préparé selon l'exemple 2. Les mentions « T » et « ST » signifient respectivement « Témoin » et « Stress Thermique ». Les analyses A, B, C, et D se rapportent respectivement à des fibroblastes IMR-90 jeunes, des fibroblastes IMR-90 sénescents (sénescence induite par H2O2), des fibroblastes IMR-90 sénescents incubés avec l'extrait insaponifiable à 1 μg/ml et enfin des fibroblastes IMR-90 sénescents incubés avec l'extrait insaponifiable à 3 μg/ml.
La figure 3 présente l'analyse semi-quantitative du taux d'induction des protéines HSP72 (normalisée par le niveau d'expression de la D-actine) dans les fibroblastes IMR-90 sénescents pré-traités avec l'extrait insaponifiable à 1 μg/ml (C) et à 3 μg/ml (D). Sont également représentés les taux d'induction des protéines HSP72 dans les fibroblastes IMR-90 jeunes (A) et dans les fibroblastes IMR-90 sénescents (B) (sénescence induite par H2O2).
Ces Figures 2 et 3 montrent qu'il n'y a plus d'induction des protéines HSP72 dans les fibroblastes IMR-90 devenus sénescents, mais que l'extrait de pulpes de fruits d'Arganier, aux concentrations de 1 et 3 μg/ml, restaure l'induction des HSP72 par le stress thermique.
Enfin, le tableau V ci-dessous donne le facteur d'induction (après normalisation) des ARNm HSP72 dans des fibroblastes sénescents pré-traités avec différentes concentrations d'extrait de pulpes de fruits d'Arganier.
Tableau V : Facteur d'induction
Figure imgf000021_0001
Ce tableau confirme les résultats obtenus au niveau transcriptionnel et montre la restauration quasi-totale de l'induction des ARNm HSP72 par l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier. C'est à la concentration de 3 μg/ml que cet extrait est le plus actif.
4) Conclusion
Les protéines HSP72 sont des protéines inductibles par de nombreux stress (chaleur..) et sont fortement impliquées dans les processus de réponse adaptative. Il est reconnu que Finductibilité des protéines HSP72, au niveau cutané et dans d'autres tissus, diminue avec l'âge et notamment lors de la sénescence cellulaire. De plus, il est admis que le vieillissement est associé à une réduction de la réponse au stress environnemental entraînant des pathologies liées à l'âge.
A partir d'un modèle de sénescence induite dans des fibroblastes en culture, les auteurs ont évalué la capacité de l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier à moduler la diminution d'induction des HSP72 par la chaleur.
L'ensemble des résultats confirme d'une part qu'il y a une forte diminution de l'induction des HSP72 (par un stress thermique) dans des fibroblastes sénescents en comparaison avec des fibroblastes jeunes. D'autre part, ces travaux montrent que l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier restaure l'induction des protéines HSP72 dans les fibroblastes sénescents. Dans ce modèle d'étude in vitro, l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier limite les conséquences biologiques de la sénescence cellulaire et donc présente des propriétés anti-vieillissement.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un extrait insaponifîable de pulpe végétale comprenant une fraction triterpénique, caractérisé en ce que ladite fraction triterpénique comprend de Pérythrodiol, de l'α-amyrine, de la β-amyrine et du lupéol, pour la préparation d'un produit cosmétique, pharmaceutique ou nutraceutique destiné à prévenir et/ou traiter des désordres cutanés associés au vieillissement cutané, la quantité d'érythrodiol étant comprise entre 7 et 40% en poids de l'extrait insaponifîable.
2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que la fraction massique de β- amyrine est comprise entre 5% et 30% de l'extrait insaponifîable.
3. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que la somme des fractions massiques d'α-amyrine et de lupéol est comprise entre 10% et 50% de l'extrait insaponifîable.
4. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que la quantité dudit extrait dans le produit cosmétique final est comprise entre 0,001% et 50%, préférentiellement entre 0,01% et 10%, et encore plus préférentiellement entre 0,1 et 2% en poids du poids total de la préparation.
5. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit extrait est obtenu à partir d'un végétal choisi dans la famille botanique des Sapotaceae.
6. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit extrait est obtenu à partir de pulpes de fruits d'arganier.
7. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que les désordres cutanés se manifestent par des altérations de texture, de couleur, de la transparence de la peau et par l'apparition des rides.
8. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que les désordres cutanés sont consécutifs à une réduction ou une perte de réponse au stress environnemental.
9. Utilisation selon la revendication 8 caractérisée en ce que le stress environnemental est causé par le soleil, le tabac.
10. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que les désordres cutanés sont consécutifs à une réduction ou une perte d'inductibilité des protéines HSP72.
11. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que le produit cosmétique, pharmaceutique ou nutraceutique est sous forme orale ou topique, préférentiellement sous forme topique.
12. Utilisation selon la revendication 11 caractérisée en ce que la forme topique est choisie parmi le groupe comprenant des crèmes, des gels, des pommades et des sprays.
13. Utilisation selon la revendication 11 caractérisée en ce que la forme orale est choisie parmi le groupe comprenant des comprimés, des gélules et des poudres pour suspensions buvables.
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