WO2007080178A2 - Composition pour la stabilisation d'échantillons biologiques et procédé de stabilisation - Google Patents

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WO2007080178A2
WO2007080178A2 PCT/EP2007/050228 EP2007050228W WO2007080178A2 WO 2007080178 A2 WO2007080178 A2 WO 2007080178A2 EP 2007050228 W EP2007050228 W EP 2007050228W WO 2007080178 A2 WO2007080178 A2 WO 2007080178A2
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • composition for the stabilization of biological samples and stabilization process Composition for the stabilization of biological samples and stabilization process
  • the present invention relates to a new composition for the stabilization of biological samples, in particular nucleic acids, allowing their conservation for several months without necessarily having to keep them at low temperature.
  • the most used methods in biology are those for amplifying the information present in nucleic acid sequences, such as techniques derived from PCR. Quantitation and detection of the information present in the nucleic acid sequences have multiple applications, for example the identification of biological markers with potential applications in terms of diagnosis, prognosis or patient follow-up.
  • a good procedure for extraction and purification of nucleic acids from biological samples is essential to obtain the information resulting from molecular biology experiments.
  • the procedures for analyzing biological samples generally comprise a set of steps for obtaining pure nucleic acids, and then proceed to molecular biology analyzes: Step 1: Lysis of the cells.
  • Step 2 Degradation of proteins (inactivation, proteolysis). - Step 3: Elimination of proteins and contaminants (cell lysate ). Step 4: Recovery of the DNA or RNA. Step 5: Storage (if necessary). Step 6: Molecular biology experiment (PCR, quantitative PCR ).
  • the first four steps are performed sequentially (different manipulations and different reagents). These four steps must also be performed in the same time space because of the impossibility of stopping the process, at the risk of changing the reaction efficiency (which would not then allow to have a standardized nucleic acid manipulation between each treated sample).
  • Step 1 These kits and procedures allow a short stabilization of a few hours at room temperature, to several days for storage at controlled temperatures. Such kits and procedures are described in the documents accompanying the marketing of these products, such as the Stratagene SideStep TM kits, the company's RNAlater TM
  • the present invention thus relates to a new ready-to-use composition, making it possible to implement a simplified method for stabilizing and storing biological samples.
  • it makes it possible to reduce steps 1 and 2 described above in a single step.
  • it is possible to preserve the samples thus treated over a long period of time.
  • composition according to the invention also brings a significant economic advantage, in particular because the storage can be carried out at ambient temperature.
  • the present invention thus relates to a composition for the stabilization of biological samples, this composition comprising
  • stabilizing composition is preferably meant according to the invention a composition comprising the above constituents, and if necessary below, before incorporating the biological sample to be stabilized.
  • composition according to the invention does not comprise said biological sample.
  • composition according to the invention may be stored in solid form or in aqueous solution. It will be used in aqueous form for the stabilization of biological samples.
  • the pH preferably of this solution will be between 4 and 11. Depending on the deactivating agent selected, the preferred pH may vary. Thus, for a detergent, the pH will more preferably be between 4 and 5, even more preferably close to 4.5.
  • a chelating agent it will more preferably be between 7 and 11, even more preferably between 8 and 10, advantageously close to 9.
  • the pH may be adjusted to the preferred values by the use of a base or an appropriate acid.
  • the composition in the form of a solution may also comprise a buffer or an acid or a base (D) so as to adjust and / or stabilize the pH to the desired value.
  • solution is meant according to the invention an aqueous composition comprising, in addition to water, the constituents (A) to (C) and, where appropriate, the buffer (D) in the form of a true solution, or else a suspension, or an emulsion, or any other physical form resulting from the mixing of the various constituents in the water.
  • the composition according to the invention when it is a ready-to-use stabilizing solution, it comprises, in addition to water, the components (A) to (D) in the following proportions: deactivating agent (A): from 1/4 to 1/6 by volume of the total volume of the solution, preferably 1/5 by volume for a detergent and between 175 and 225 mM for a chelating agent.
  • deactivating agent (A) from 1/4 to 1/6 by volume of the total volume of the solution, preferably 1/5 by volume for a detergent and between 175 and 225 mM for a chelating agent.
  • chaotropic agent or denaturing agent B): from 5 to 5 M (mole / l), preferably 6 M.
  • peptidase (C) from 1.5 to 2 mg / ml, preferably 1.8 mg / ml, and, where appropriate buffer (D): to adjust the pH between 4 and 1.
  • the proportions of the components (A) to (D) are suitable to allow the preparation of a solution as defined above.
  • the stabilizing solution according to the invention is advantageously prepared by adding to a given quantity of water, the constituents (A) and (B), then to adjust the pH by adding the buffer (D) before adding the peptidase (C).
  • the composition may be prepared extemporaneously, each of its constituents being mixed for the preparation of the aqueous composition.
  • pre-mixtures of constituents may be prepared and stored, for example the deactivation agent (A), the chaotropic agent (B) and / or the denaturing agent (B) on the one hand, and peptidase (C) on the other hand.
  • the premix comprising the deactivating agent (A), the chaotropic agent (B) and / or if appropriate, the denaturing agent (B) and / or the buffer (B), is also called a mixture 1 in the present patent application.
  • premixes can be in liquid form, a premix solution, or in solid form.
  • the solid forms of premixes such as the composition of according to the invention, can be prepared by adding the various pure components in appropriate proportions for the preparation of the stabilizing solution, or by preparing a solution comprising the various constituents in the appropriate proportions, and then removing the water in a suitable manner. Substantial by any suitable means, for example by usual lyophilization techniques.
  • the peptidase (C) also lyophilized, can be added.
  • This freeze-dried stabilization premix can be stored at controlled temperature, around 4 ° C.
  • the invention therefore also relates to a stabilization kit for biological samples comprising the constituents of the composition, isolated or premixed in proportions suitable for producing a solution according to the invention, ready for use.
  • the kit may further comprise a container, for example a sample tube, a plate or a laboratory-on-a-chip, in which the biological sample mixed with the solution according to the invention will be treated and then preserved.
  • the "lab on chip” or “Lab on Chip” is advantageously a consumable on a “chip” type support, said “chip” comprising freeze-dried reagents distributed on its surface or in appropriate volumes formed in said support, the mixture being extemporaneously with the passage of the sample to be analyzed.
  • the appropriate volumes or freeze-dried reagents are distributed in a standardized manner on the support, plate or "chip".
  • the amounts of each constituent in the premixes and in the kit according to the invention are so-called “ready-to-use” quantities, that is to say appropriate to obtain a stabilizing solution comprising the preferred proportions of each component discussed above, without having to perform new assays.
  • detergent is meant according to the invention a compound having detergent or chelating properties, that is to say selected from detergents or chelating agents.
  • detergent is meant according to the invention any compound for which the hydrophilic / hydrophobic balance is substantially balanced and which allows the lysis of the bi-lipidic membrane of the cells.
  • Such detergents may be neutral, anionic, cationic or zwitterionic and are well known to those skilled in the art.
  • the following compounds are particularly suitable:
  • the detergent is a nonionic detergent, considered a non-denaturing average activity detergent, often used in biochemical applications to solubilize proteins, lyse cells, and not necessarily having an antimicrobial property.
  • the nonionic detergent is a detergent of the "Triton X" series, produced by polymerization of octylphenol with ethylene oxide, more preferably Triton X-100 (Triton X-100 is a product of Union Carbide Triton is a registered trademark of Rohm and Haas Company, Philadelphia, PA, USA).
  • Triton X-100 is a product of Union Carbide Triton is a registered trademark of Rohm and Haas Company, Philadelphia, PA, USA.
  • nonionic detergents such as Igepal and Nonidet may advantageously be employed in the composition according to the invention.
  • chelating agent any hydrocarbon molecule having the ability to combine with ions to form complexes.
  • Chelating agents are well known to those skilled in the art and generally include amino acids linked by non-peptide bonds. It is in particular polyamines, preferably diamines, aliphatic, each amino group being substituted by at least one hydrocycarbonyl-alkyl radical.
  • the preferred chelating agents according to the invention may be represented by the general formula (i):
  • n independently represents an integer from 1 to 3.
  • Compound B is either a "chaotropic agent” or a “denaturing agent” or a mixture of both.
  • the term "chaotropic agent” is intended to mean an agent which makes it possible to separate / isolate the nucleic acids from their protein part which makes it possible to protect the nucleic acids from proteins which can damage them, in particular DNAses and RNases.
  • chaotropic agents are well known to those skilled in the art, and more particularly the guanidine salts (Cox, RA, The Use of Guanidinium Chloride in the Isolation of Nucleic Acids, Methods in Enzymology, 12B, 120-129 (1968) Data for Biochemical Research, 3rd ed., Dawson, RMC, et al, Oxford University Press (New York, NY: 1986), pp.
  • denaturing agent is understood according to the invention an agent leading to protein denaturation, more particularly resulting from the modification (disruption) of the native conformation (biologically active conformation) of a protein, without rupture of peptide bond (hydrolysis) by modification of one or more physicochemical parameters of its environment It may be said that the denaturing agents "unwind" the globular proteins The denaturing agent (D) thus makes it possible to alter the activity of the enzymes present in the biological sample, as DNAses or RNAses that would be likely to degrade nucleic acids in biological samples.
  • proteases are proteases or proteolytic enzymes, enzymes that cleave the peptide bonds of proteins. This process is called proteolytic cleavage.
  • proteases are well known to those skilled in the art (http://www.expasy.ch/cgi-bin/lists7peptidas.txt or http://merops.sanger.ac.uk/).
  • the peptidase is Proteinase K. Proteinase K is a stable and highly reactive plant serine protease (Ebling,
  • Proteinase K has no hydrolysis effect on nucleic acids (Sweeney, PJ and Walker, J.M., Burrell, M. M., Enzymes of Molecular Biology). It hydrolyzes proteins of all origins in a few hours with a preference for peptide bonds located after hydrophobic amino acids (eg leucine). Proteinase K is used in nucleic acid preparation and purification techniques to digest tissues / cells, membranes, etc.
  • Buffers (D) used in the field of biology are well known to those skilled in the art. They preferably have the following characteristics: soluble in water, without interference with biological processes and preferably non-toxic. We can mention the following buffers:
  • pH of the prepared solution can be adjusted, in addition to the use of the buffer, with the addition of an appropriate amount of acid, such as hydrochloric acid.
  • the buffer according to the invention is a Tris HCl buffer (mixture tris (hydroxymethyl) aminomethane and HCl), or a buffer based on citric acid or acetic acid.
  • the water used for its preparation will preferably be treated water so as to eliminate any biological contamination and more preferably biological, organic and mineral, more particularly distilled or deionized water, as recommended by good laboratory practice.
  • the water used for the preparation of the liquid sample may also be the water contained in the biological sample taken, for example when this sample is a blood sample.
  • the stabilizing composition comprises
  • composition according to the invention corresponding to this first embodiment is an aqueous stabilization solution comprising, in addition to water, the following constituents:
  • the pH is usually adjusted by adding the buffer and optionally the acid before adding the peptidase to the premix.
  • the invention therefore also relates to a premix, or mixture 1, for producing a solution comprising: Triton X-100 1/5 of the final volume (v / v) guanidine-HCl 5.9M 10 mM Urea
  • the mixture 1 is a lyophilizate of a solution comprising the components (A), (B), (D) in the proportions above.
  • the stabilization composition comprises:
  • composition according to this second mode may comprise an appropriate amount of alkali metal salt, in particular sodium chloride.
  • the pH is preferably adjusted to between 7 and 11, more preferably between 8 and 10, and even more preferentially around 9 by the addition of an organic or inorganic base, preferably sodium hydroxide.
  • the pH can also be adjusted by adding an appropriate buffer defined above.
  • the composition according to the invention corresponding to this second embodiment is a solution which comprises, in addition to water, the following elements:
  • the pH is generally adjusted by adding the buffer and optionally the base before adding the peptidase to the premix.
  • the invention therefore also relates to a premix, or mixture 1, for producing a solution comprising:
  • the mixture 1 is a lyophilizate of a solution comprising the components (A), (B), (D) and (E) in the proportions above.
  • the invention also relates to a stabilization kit comprising, on the one hand, the mixture 1 defined above, and on the other hand an appropriate quantity of proteinase K, allowing the production of a stabilization solution comprising 1.8 mg / ml of this peptidase.
  • the techniques for taking biological samples, processing, recovering DNA or RNA and any subsequent use of the stabilized samples remain unchanged compared to prior techniques.
  • the stabilization solution according to the invention makes it possible to simplify the process by combining the lysis of the cells and the degradation of the proteins in a single step. It allows above all to keep the samples thus treated for several months without the need to control the storage temperature.
  • the samples may be stored at ambient temperature, preferably below 30 ° C., more preferably below 25 ° C.
  • the samples treated in the stabilizing solution according to the invention can be stored for more than 12 months at 25 ° C. Of course, they can be stored in a temperature controlled environment of about 4 ° C, allowing even longer storage, until at least 18 months.
  • the invention therefore also relates to a method for preparing stabilized biological samples, said method comprising the following steps: mixing a stabilized biological sample with a stabilization composition according to the invention, incubating the mixture to allow cell lysis and degradation of the proteins, and storage of the stabilized mixture obtained previously.
  • the incubation conditions are conditions common to those skilled in the art, advantageously at a temperature greater than 30 ° C., more preferably greater than 30 ° C.
  • the duration of the incubation step will depend on the incubation temperature. For a temperature of 70 ° C., the incubation will be carried out between
  • the storage is carried out at room temperature for a duration of more than 2 days.
  • the stabilization solution according to the invention it is possible to store the biological samples at room temperature for more than 3, 4 or 5 days, and according to the uses more than one week, or even more than 2, 3 or 4 weeks, or more from one month to more than one year, without observing any substantial degradation of the DNA contained in the biological sample taken.
  • the stabilizing solution and the method according to the invention are particularly suitable for the collection and preservation of samples containing genomic DNA.
  • the biological sample used in the method according to the invention comprises any biological sample taken from an organism, living or not, especially from fresh whole blood, frozen blood, bone marrow tissues, oral cells, cell cultures. , liquid samples etc
  • the incubation step is carried out when the stabilizing composition according to the invention comprising the sample is in a liquid form.
  • the composition according to the invention used in the process is an aqueous composition.
  • the composition is in a solid form, for example in freeze-dried form, to which a biological sample in liquid form, for example blood or any other liquid sample, is added. water being optionally added to obtain the desired volume.
  • the liquid biological sample is added to a premix according to the invention, and the volume is then completed, if necessary, with water, and the peptidase (C) is then added. .
  • the stabilization method can be implemented in a "high speed" type application.
  • the "Mix 1" solution in liquid form can be deposited at the bottom of the plate (96/384 wells or other standardized formats used for the collection of biological samples) and then the proteinase (C) is added.
  • the biological sample can then be added in a systematic and standardized way.
  • the stabilized samples according to the invention can then be processed in the usual manner to extract the DNA, in particular the gDNA or RNA contained in the biological sample according to different methods: extraction kit using a silica column. extraction kit using an affinity column (Anion-exchange methods). extraction kit using an extraction method with organic solvents. extraction kit using a cesium chloride density gradient method, extraction kit using a precipitation method (Desalting method). extraction kit using magnetic beads, in particular coated with silica.
  • Figure 1 shows the general scheme for the preparation of samples stabilized with the method and the solution according to the invention.
  • FIGS 2 to 4 show the results of the conservation tests of the stabilized biological samples.
  • An Eppendorf tube (a tube for a sample).
  • Figure 4 shows the 180-day photo-radiograms of the high-molecular-weight controls and control gene amplification for samples stored at 4 ° C ( Figure 4.A), and 30 days at room temperature ( Figure 4.B).
  • the control gene is the HPRT for samples stored at 40 ° C. and at room temperature. at.
  • Migration on agarose gel 0.8 to 1% after purification verification of the absence of smear (which would indicate a degradation of the gDNA) and conversely, the presence of a band of very high molecular weight greater than 15 Kb (Fig. 4.1 High PM).
  • b. PCR test on control gene, example HPRT, Actin ... Fig. 4.2 Control gene: shows that after stabilization and purification, the enzymatic reactions are possible.
  • vs. Spectrometric analysis (Fig 2 and 3)

Abstract

La présente invention concerne une nouvelle composition pour la stabilisation d'échantillons biologiques, en particulier d'acides nucléiques, permettant leur conservation plusieurs mois sans nécessairement devoir les conserver à basse température. Cette composition comprend: - un agent de desactivation - un agent chaotrope, et - une peptidase. Outre ces trois constituants, la composition selon l'invention peut comprendre un agent de dénaturation et de solubilisation doux.

Description

Composition pour la stabilisation d'échantillons biologiques et procédé de stabilisation
La présente invention concerne une nouvelle composition pour la stabilisation d'échantillons biologiques, en particulier d'acides nucléiques, permettant leur conservation plusieurs mois sans nécessairement devoir les conserver à basse température.
Les procédés les plus utilisés en biologie sont ceux permettant d'amplifier l'information présente dans les séquences d'acides nucléiques, comme les techniques dérivées de la PCR. La quantification et la détection des informations présentes dans les séquences d'acides nucléiques ont de multiples applications, comme par exemple l'identification de marqueurs biologiques avec des applications potentielles en terme de diagnostic, pronostic ou suivi de patient.
Une bonne procédure d'extraction et de purification des acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques (biopsie, sang, ...) est essentielle à l'obtention de l'information résultant d'expériences de biologie moléculaire. Les procédures d'analyse des échantillons biologiques comprennent généralement un ensemble d'étapes pour l'obtention d'acides nucléiques purs, pour procéder ensuite à des analyses de biologie moléculaire : Etape 1 : Lyse des cellules.
Etape 2 : Dégradation des protéines (inactivation, protéolyse). - Etape 3 : Elimination des protéines et des contaminants (lysat cellulaire...). - Etape 4 : Récupération de l'ADN ou ARN. Etape 5 : Stockage (si nécessaire). Etape 6 : Expérience de biologie moléculaire (PCR, PCR quantitative...).
Les quatre premières étapes sont effectuées de façon séquentielle (différentes manipulations et différents réactifs). Ces quatre étapes doivent également être effectuées dans un même espace temps du fait de l'impossibilité d'arrêter le processus, au risque de changer le rendement de la réaction (ce qui ne permettrait pas alors d'avoir une manipulation d'acides nucléiques normalisée entre chaque échantillon traité).
Ces étapes généralement automatisées nécessitent un appareillage associé et sont réalisées avec des solutions « standard » commercialisées généralement sous forme de kits.
Il existe également des kits et procédures commercialisés permettant une stabilisation temporaire des acides nucléiques avant ou juste après l'étape de lyse cellulaire
(Etape 1). Ces kits et procédures permettent une stabilisation courte de quelques heures à température ambiante, à plusieurs jours pour un stockage à températures contrôlées. De tels kits et procédures sont décrits dans les documents accompagnant la commercialisation de ces produits, comme les kits SideStep™ de la société Stratagene, RNAlater™ de la société
Quiagen, PAXgene™ de la société PreAnalytix, ou encore dans la demande de brevet WO
2005/093065. Une autre approche pour stabiliser les acides nucléiques consiste à appliquer l'échantillon biologique sur une carte en cellulose traitée, permettant la lyse des cellules et la conservation d'ADN sur le long terme, mais rendent difficile l'analyse semi- quantitative, et conduisent au final à un rendement d'extraction faible en acides nucléiques (Etape 4). De tels kits et procédures sont décrits dans les documents accompagnant la commercialisation de ce produit, nommé FTA, de la société Whatman.
En outre, le stockage des acides nucléiques récupérés nécessite une conservation à température contrôlée, de l'ordre de -200C, pour éviter toute dégradation.
De nombreux protocoles d'extraction d'acides nucléiques d'échantillons biologiques sont connus, employant divers milieux d'extraction et de conservation. On citera notament les documents suivants : WO 02/056030, WO 99/16781, WO
2005/093065, EP 1 524317, WO 2005/075642, WO 00/29618, WO 00/09746. Toutefois, aucun d'eux ne décrit ni ne propose l'usage d'un milieu prêt à l'emploi, comprenant un ensemble de composants permettant une conservation de l'ADN, et plus particulièrement de l'ADN génomique à température ambiante pendant plusieurs mois, sans dégradation substantielle.
La présente invention concerne donc une nouvelle composition prête à l'emploi, permettant de mettre en œuvre une méthode simplifiée de stabilisation et de stockage d'échantillons biologiques. Elle permet en particulier de réduire les étapes 1 et 2 décrites ci-dessus en une unique étape. En plus de l'avantage apporté par la simplification des étapes de lyse de cellules et de dégradation des protéines, il est possible de conserver sur une longue période les échantillons ainsi traités.
L'utilisation de la composition selon l'invention apporte également un avantage économique important, en particulier du fait que le stockage peut être réalisé à température ambiante.
La présente invention concerne donc une composition pour la stabilisation d'échantillons biologiques, cette composition comprenant
(A) un agent de désactivation choisi parmi un détergent ou un agent chélatant,
(B) un agent chaotrope et/ou un agent de dénaturation et de solubilisation doux, et (C) une peptidase.
Par « composition de stabilisation », on entend préférentiellement selon l'invention une composition comprenant les constituants ci-dessus, et le cas échéant ci-dessous, avant d'y incorporer l'échantillon biologique à stabiliser.
De fait, la composition selon l'invention ne comprend pas ledit échantillon biologique.
La composition selon l'invention peut être conservée sous forme solide ou encore en solution aqueuse. Elle sera employée sous forme aqueuse pour la stabilisation d'échantillons biologiques. Le pH, de préférence de cette solution sera compris entre 4 et 11. Selon l'agent de désactivation sélectionné, le pH préféré pourra varier. Ainsi, pour un détergent, le pH sera plus préférentiellement compris entre 4 et 5, encore plus préférentiellement voisin de 4,5.
Pour un agent chélatant, il sera plus préférentiellement compris entre 7 et 11, encore plus préférentiellement entre 8 et 10, avantageusement voisin de 9.
Le pH pourra être ajusté aux valeurs préférées par l'emploi d'une base ou d'un acide approprié. La composition sous forme d'une solution pourra également comprendre un tampon ou un acide ou une base (D) de manière à ajuster et/ou stabiliser le pH à la valeur souhaitée. Par solution, on entend selon l'invention une composition aqueuse comprenant outre de l'eau, les constituants (A) à (C) et le cas échéant le tampon (D) sous la forme d'une solution vraie, ou encore d'une suspension, ou d'une émulsion, ou de toute autre forme physique résultant du mélange des différents constituants dans l'eau.
De manière avantageuse, lorsque la composition selon l'invention est une solution de stabilisation prête à l'emploi, elle comprend outre de l'eau, les composants (A) à (D) en proportions suivantes : agent de désactivation (A) : de 1/4 à 1/6 en volume du volume total de la solution, de préférence 1/5 en volume pour un détergent et entre 175 et 225mM pour un agent de chélatant. - agent chaotrope ou agent dénaturant (B) : de 5 à 5 M (mole/1), de préférence 6 M. peptidase (C) : de 1,5 à 2 mg/mL, de préférence 1,8 mg/mL, et, le cas échéant tampon (D) : pour ajuster le pH entre 4 etl 1.
Dans la composition sous forme solide, les proportions des constituants (A) à (D) sont appropriées pour permettre la préparation d'une solution telle que définie ci-dessus. La solution de stabilisation selon l'invention est avantageusement préparée en ajoutant à une quantité déterminée d'eau, les constituants (A) et (B), puis à ajuster le pH par l'ajout du tampon (D) avant d'ajouter la peptidase (C).
Pour son utilisation dans un procédé de stabilisation et de conservation d'un échantillon biologique selon l'invention, la composition pourra être préparée de manière extemporanée, chacun de ses constituants étant mélangé pour la préparation de la composition aqueuse. Bien entendu, des pré-mélanges de constituants pourront être préparés et conservés, par exemple l'agent de désactivation (A), l'agent chaotrope (B) et/ou l'agent de dénaturation (B) d'une part, et la peptidase (C) d'autre part.
Le pré-mélange, comprenant l'agent de désactivation (A), l'agent chaotrope (B) et/ou le cas échéant, l'agent de dénaturation (B) et/ou le tampon (B), est également appelé Mélange 1 dans la présente demande de brevet.
Ces pré-mélanges peuvent être sous forme liquide, une solution de pré-mélange, ou encore sous forme solide. Les formes solides des pré-mélanges, comme la composition de stabilisation selon l'invention, peuvent être préparées en ajoutant les différents composants purs en proportions appropriées pour la préparation de la solution de stabilisation, ou encore en préparant une solution comprenant les différents constituants dans les proportions appropriées, puis en éliminant l'eau de manière substantielle par tout moyen approprié, par exemple par des techniques usuelles de lyophilisation.
Au Mélange 1 lyophilisé, pourra être ajoutée la peptidase (C) également lyophilisée. Ce pré-mélange de stabilisation lyophilisé pourra être conservé à température contrôlée, vers 4°C.
Additionné à une quantité appropriée d'eau, il permettra la préparation extemporanée de la solution stabilisatrice selon l'invention.
L'invention concerne donc également un kit de stabilisation d'échantillons biologiques comprenant les constituants de la composition, isolés ou en pré-mélanges dans des proportions adaptées pour la réalisation d'une solution selon l'invention, prête à l'emploi. Le kit peut en outre comprendre un récipient, par exemple un tube à échantillon, une plaque ou un laboratoire sur puce, dans lequel sera traité puis conservé l'échantillon biologique mélangé à la solution selon l'invention.
Le « laboratoire sur puce » ou « Lab on Chip » est avantageusement un consommable sur un support de type « puce », ladite « puce » comprenant des réactifs lyophilisés répartis à sa surface ou dans des volumes appropriés ménagés dans ledit support, le mélange se faisant de manière extemporanée avec le passage de l'échantillon à analyser. De manière avantageuse, les volumes appropriés ou les réactifs lyophilisés sont répartis de manière normée sur le support, plaque ou « puce ».
De préférence, les quantités de chaque constituant dans les pré-mélanges et dans le kit selon l'invention sont des quantités dites « prêtes à l'emploi », c'est à dire appropriées pour permettre d'obtenir une solution de stabilisation comprenant les proportions préférées de chaque constituant exposées ci-dessus, sans avoir à effectuer de nouveaux dosages.
Par « agent de désactivation (A) », on entend selon l'invention un composé ayant des propriétés détergentes ou chélatantes, c'est-à-dire choisi parmi les détergents ou les agents chélatants. Par « détergent », on entend selon l'invention tout composé pour lequel la balance hydrophile/hydrophobe est sensiblement équilibrée et qui permet la lyse de la membrane bi-lipidique des cellules. De tels détergents peuvent être neutres, anioniques, cationiques ou encore zwitterioniques et sont bien connus de l'homme du métier. On citera notamment les composés suivants :
Figure imgf000006_0001
De manière préférentielle, le détergent est un détergent non ionique, considéré comme un détergent d'activité moyenne non dénaturant, souvent utilisé dans des applications biochimiques pour solubiliser les protéines, lyser les cellules, et ne possédant pas forcement de propriété antimicrobienne. De préférence, le détergent non ionique est un détergent de la série « Triton X », produit par polymérisation de l'octylphénol avec l'oxyde d'éthylène, plus préférentiellement le Triton X-100 (Triton X-100 est un produit de Union Carbide. Triton est une marque déposée de Rohm and Haas Company, philadelphia, PA, USA).
D'autres détergents non ioniques comme Igepal et Nonidet peuvent avantageusement être employés dans la composition selon l'invention.
Par « agent chélatant », on entend selon l'invention toute molécule hydrocarbonée ayant la capacité de se combiner avec des ions pour former des complexes. Les agents chélatants sont bien connus de l'homme du métier et comprennent généralement des acides aminés reliés par des liaisons non peptidiques. Il s'agit en particulier de polyamines, préférentiellement diamines, aliphatiques, chaque groupe aminé étant substitué par au moins un radical hydrocycarbonyle-alkyle. Les agents chélatents préférés selon l'invention peuvent être représentés par la formule générale (i) :
Figure imgf000007_0001
dans laquelle m représente un entier allant de 2 à 6, et n représente indépendamment les un des autres un entier allant de 1 à 3.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'agent chélatant est l'EDTA m = 2 et n = 1).
Le composé B est soit un « agent chaotrope » soit un « agent de dénaturation », soit un mélange des deux.
Par « agent chaotrope », on entend selon l'invention un agent permettant de séparer/isoler les acides nucléiques de leur partie protéique permettant de protéger les acides nucléiques des protéines pouvant les endommager, notamment les DNAses et RNases. De tels agents chaotropes sont bien connus de l'homme du métier, et plus particulièrement les sels de guanidine (Cox, R. A., The use of Guanidinium Chloride in the Isolation of Nucleic Acids, Methods in Enzymology, 12B, 120-129 (1968); Data for Biochemical Research, 3rd éd., Dawson, R.M.C, et al, Oxford University Press (New York, NY: 1986), pp. 322-323), en particulier le thiocyanate (SCN-) de guanidium, le chlorure (CV) de guanidium ou le sulfate (SO42")de guanidium. De manière préférée, le sel de guanidium est le chlorure de guanidium. Par « agent de dénaturation » on entend selon l'invention un agent conduisant à la dénaturation protéique, plus particulièrement résultant de la modification (disruption) de la conformation native (conformation biologiquement active) d'une protéine, sans rupture de liaison peptidique (hydrolyse) par modification d'un ou plusieurs paramètres physicochimiques de son environnement. On peut dire que les agents dénaturants "déroulent" les protéines globulaires. L'agent dénaturant (D) permet donc d'altérer l'activité des enzymes présentes dans l'échantillon biologique, comme les DNAses ou les RNAses qui seraient susceptibles de dégrader les acides nucléiques dans les échantillons biologiques.
De tels agents dénaturants sont bien connus de l'homme du métier comme l'urée, agent dénaturant préféré pour la composition selon l'invention. Les « peptidases (C) » sont des protéases ou enzymes protéolytiques, enzymes qui clivent les liaisons peptidiques des protéines. Ce processus est appelé clivage protéolytique. Ces peptidases sont bien connues de l'homme du métier (http://www.expasy.ch/cgi-bin/lists7peptidas.txt ou http://merops.sanger.ac.uk/). De manière préférentielle, la peptidase est la Protéinase K. La protéinase K est une protéase à Serine végétale stable et très réactive (Ebling,
W., et al. Eur. J. Biochem. 47, 91, (1974)). La protéinase K n'a aucun effet d'hydrolyse sur les acides nucléiques (Sweeney, PJ. and Walker, J.M., Burrell, M.M., Enzymes of molecular biology). Elle hydrolyse les protéines de toutes origines en quelques heures avec une préférence pour les liaisons peptidiques situées après les acides aminés hydrophobes (leucine, par exemple). La protéinase K est utilisée dans les techniques de préparation et de purification des acides nucléiques pour digérer les tissus/cellules, membranes, etc.
Les tampons (D), employés dans le domaine de la biologie sont bien connus de l'homme du métier. Ils ont de préférence les caractéristiques suivantes : solubles dans l'eau, sans interférence avec les processus biologiques et de préférence non toxiques. On pourra citer les tampons suivants :
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
II est entendu que le pH de la solution préparée peut être ajusté, outre par l'usage du tampon, avec l'addition d'une quantité appropriée d'acide, comme l'acide chlorhydrique.
De manière avantageuse, le tampon selon l'invention est un tampon Tris HCl (mélange tris (hydroxymethyl) aminomethane et HCl), ou encore un tampon à base d'acide citrique ou d'acide acétique.
Il est entendu qu'au regard de l'usage de la solution de stabilisation selon l'invention, l'eau employée pour sa préparation sera de préférence de l'eau traitée de manière à éliminer toute contamination biologique et plus préférentiellement biologique, organique et minérale, plus particulièrement de l'eau distillée ou de l'eau permutée, telle que préconisée selon les bonnes pratiques de laboratoire.
L'eau employée pour la préparation de l'échantillon liquide peut également être l'eau contenue dans l'échantillon biologique prélevé, par exemple lorsque cet échantillon est un prélèvement sanguin.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la composition de stabilisation comprend
(A) un détergent
(B) un agent chaotrope et un agent de dénaturation et de solubilisation doux,
(C) une peptidase et
(D) un tampon pour ajuster le pH à une valeur comprise entre 4 et 5. Avantageusement, la composition selon l'invention répondant à ce premier mode est une solution aqueuse de stabilisation comprenant outre de l'eau les constituants suivants :
Triton X-IOO 1/5 du volume final (v/v) guanidine-HCl 5,9M Protéinase K 20mg/ml Urée 1O mM Tris HCl ajustement pH 4,5 à 25°C. Le pH est généralement ajusté par l'ajout du tampon et le cas échéant de l'acide avant d'ajouter la peptidase au pré-mélange. L'invention concerne donc également un pré-mélange, ou Mélange 1, permettant de réaliser une solution comprenant : Triton X- 100 1/5 du volume final (v/v) guanidine-HCl 5,9M Urée 10 mM
Tris HCl ajustement pH 4,5 à 25°C
De manière préférentielle, le Mélange 1 est un lyophilisât d'une solution comprenant les composants (A), (B), (D) dans les proportions ci-dessus.
Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, la composition de stabilisation comprend :
(A) un agent chelatant
(B) un agent chaotrope et/ou un agent de dénaturation et de solubilisation doux, et
(C) une peptidase.
La composition selon ce deuxième mode peut comprendre une quantité appropriée de sel de métaux alcalins, en particulier de chlorure de sodium.
Pour la composition en solution, le pH est ajusté de préférence entre 7 et 11, plus préférentiellement entre 8 et 10, encore plus préférentiellement autour de 9 par l'ajout d'une base organique ou minérale, de préférence de la soude. Le pH peut également être ajusté par l'ajout d'un tampon approprié défini précédemment. Avantageusement, la composition selon l'invention répondant à ce deuxième mode de réalisation est une solution qui comprend outre de l'eau, les éléments suivants :
(A) EDTA, de 175 à 225 mM, de préférence 200 mM
(B) Urée, de 3,8 à 4,5 M, de préférence 4,1 M, ou chlorure de guanidine, de 2,3 à 2,6 mM, de préférence 2,4 M (C) Protéinase K, de 1,5 à 2 mg/mL, de préférence 1,8 mg/mL et, le cas échéant
(D) Tris HCl ou NaOH pour ajuster le pH entre 8 et 10, de préférence voisin de 9 et, le cas échéant
(E) NaCl, de préférence 25 mM.
Le pH est généralement ajusté par l'ajout du tampon et le cas échéant de la base avant d'ajouter la peptidase au pré-mélange.
L'invention concerne donc également un pré-mélange, ou Mélange 1, permettant de réaliser une solution comprenant :
(A) EDTA, de 175 à 225 mM, de préférence 200 mM
(B) Urée, de 3,8 à 4,5 M, de préférence 4,1 M, ou chlorure de guanidine, de 2,3 à 2,6 mM, de préférence 2,4 M
(D) Tris HCl ou NaOH pour ajuster le pH entre 8 et 10, de préférence voisin de 9 et, le cas échéant
(E) NaCl, de préférence 25 mM. De manière préférentielle, le Mélange 1 est un lyophilisât d'une solution comprenant les composants (A), (B), (D) et (E) dans les proportions ci-dessus.
L'invention concerne aussi un kit de stabilisation comprenant d'une part le Mélange 1 défini précédemment, et d'autre part une quantité appropriée de protéinase K, permettant la réalisation d'une solution de stabilisation comprenant 1 ,8 mg/ml de cette peptidase.
Les techniques de prélèvement d'échantillons biologiques, de traitement, de récupération de l'ADN ou de l'ARN et tout usage ultérieur des échantillons stabilisés (PCR, PCR quantitative, etc.), restent inchangés par rapport aux techniques antérieures. La solution de stabilisation selon l'invention permet de simplifier le procédé en combinant la lyse des cellules et la dégradation des protéines en une seule étape. Elle permet surtout de conserver les échantillons ainsi traités pendant plusieurs mois sans nécessité de contrôler la température de stockage.
Les échantillons peuvent être stockés à température ambiante, de préférence inférieure à 300C, plus préférentiellement inférieure ou égale à 25°C.
Ainsi, les échantillons traités dans la solution stabilisatrice selon l'invention peuvent être stockés plus de 12 mois à 25°C. Bien entendu, ils pourront être stockés dans un environnement à température contrôlée, de 4°C environ, permettant une conservation encore plus longue, jusqu'à au moins 18 mois. L'invention concerne donc aussi un procédé de préparation d'échantillons biologiques stabilisés, ledit procédé comprenant les étapes suivantes de : mélange d'un échantillon biologique stabilisé avec une composition de stabilisation selon l'invention, incubation du mélange pour permettre la lyse cellulaire et la dégradation des protéines, et, stockage du mélange stabilisé obtenu précédemment.
Les conditions d'incubation sont des conditions usuelles pour l'homme du métier, avantageusement à une température supérieure à 300C, plus préférentiellement supérieure à
500C, avantageusement d'environ 7O0C. La durée de l'étape d'incubation dépendra de la température d'incubation. Pour une température de 700C, l'incubation sera effectuée entre
15 et 40 minutes, avantageusement de 40 minutes.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le stockage est effectué à température ambiante pour une durée de plus de 2 jours. On peut avec la solution de stabilisation selon l'invention stocker les échantillons biologiques à température ambiante pendant plus de 3, 4 ou 5 jours, et selon les usages plus d'une semaine, voire plus de 2, 3 ou 4 semaines, voire plus d'un mois, jusqu'à plus d'un an, sans observer de dégradation substantielle de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique prélevé. La solution de stabilisation et le procédé selon l'invention sont particulièrement adaptés pour le prélèvement et la conservation d'échantillons contenant de l'ADN génomique.
L'échantillon biologique employé dans le procédé selon l'invention comprend tout échantillon biologique prélevée sur un organisme, vivant ou non, notamment à partir de sang total frais, de sang congelée, des tissus de moelle osseuse, des cellules buccales, des cultures cellulaires, des échantillons liquides etc
L'étape d'incubation est réalisée lorsque la composition de stabilisation selon l'invention comprenant l'échantillon est sous une forme liquide. De manière préférentielle, la composition selon l'invention employée dans le procédé est une composition aqueuse.
Selon un mode particulier de réalisation du procédé selon l'invention, la composition est sous une forme solide, par exemple sous forme lyophilisée à laquelle on ajoute un échantillon biologique sous forme liquide, par exemple du sang ou tout autre échantillon liquide, de l'eau étant éventuellement ajoutée pour obtenir le volume souhaité.
Selon un autre mode particulier de l'invention, on ajoute à un pré-mélange selon l'invention l'échantillon biologique liquide, puis on complète, si nécessaire, le volume avec de l'eau, puis on ajoute la peptidase (C).
L'homme du métier saura adapter le procédé selon l'invention aux différentes possibilités offertes par la composition selon l'invention.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé de stabilisation peut être mis en œuvre dans une application de type « haut débit ».
Dans une application haut débit, automatisée, la solution « Mélange 1 » sous forme liquide peut être déposée en fond de plaque (96/384 puits ou d'autres formats standardisés utilisés pour la collection d'échantillons biologiques) puis la protéinase (C) y est ajoutée.
L'échantillon biologique peut y être ensuite ajouté de façon systématique et normalisée.
Cela est également possible avec l'ajout dans l'ordre inverse, de la protéinase (C) puis du
«Mélange 1 ». Le même procédé peut être mis en œuvre avec un « Mélange 1 » lyophilisé en fond de plaque (stockable et transportable à température ambiante) auquel il faut ajouter la protéinase (C). Le même procédé peut être mis en œuvre avec le « Mélange de stabilisation » comprenant le « Mélange 1 » et la protéinase (C) lyophilisés en fond de plaque pré-remplie.
Les échantillons stabilisés selon l'invention peuvent ensuite être traités de manière usuelle pour extraire l'ADN, en particulier l'ADNg ou TARN contenu dans l'échantillon biologique selon différentes méthodes : kit d'extraction utilisant une colonne de silice. kit d'extraction utilisant une colonne d'affinité (Anion-exchange methods). kit d'extraction utilisant une méthode d'extraction par des solvants organiques. kit d'extraction utilisant une méthode de gradient de densité de chlorure de césium, kit d'extraction utilisant une méthode de précipitation (Desalting method). kit d'extraction utilisant des billes magnétiques, notamment enrobées de silice.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée.
La Figure 1 représente le schéma général de préparation des échantillons stabilisés avec le procédé et la solution selon l'invention.
Les Figures 2 à 4 représentent les résultats des tests de conservation des échantillons biologiques stabilisés.
Matériel Solution de Stabilisation
- Triton X-100 1/5 du volume final (v/v)
- guanidine-HCl 5,9M - Urée 1O mM
- Tris HCl ajustement pH 4,5 à 250C
- - Protéinase K 1,8 mg/ml Matériels supplémentaires :
Un tube de 5mL pour dissoudre la Protéinase K lyophilisée si nécessaire. - Un tube Eppendorf (un tube pour un échantillon).
Méthode
1- Inactivation cellulaire
Déposer au plus 1 volume d'échantillon dans un tube Eppendorf, ajouter 1 volume de solution de stabilisation. Homogénéisation et incubation
Vortexer vigoureusement pendant au moins 30 secondes et incuber pendant 40 minutes à 700C.
2- Stockage ou envoi de l'échantillon
Une fois l'incubation terminée, bien veiller à identifier et conditionner l'échantillon en l'entourant de parafilm™ par exemple. Par précaution, le maintenir dans un endroit non directement exposé aux rayons solaires (UV pouvant endommager l'ADNg). Cet échantillon peut ensuite être stocké, ou envoyé indifféremment à 4°C ou 25 0C. La période de conservation est supérieure à 12 mois.
3- Tests de conservation La figure 4 reprend les photo-radiogrammes des gels à 180 jours pour les contrôles de haut poids moléculaire et d'amplification de gènes de contrôle pour des échantillons conservés à 4°C (Figure 4.A), et à 30 jours à température ambiante (Figure 4.B). Le gène de contrôle est l'HPRT pour les échantillons conservés à 40C et à température ambiante. a. Migration sur gel d'agarose 0,8 à 1% après purification : vérification de l'absence de smear (qui indiquerait une dégradation de l'ADNg) et à l'inverse, de la présence d'une bande de très haut poids moléculaire supérieur à 15 Kb (Fig. 4.1 Haut PM). b. Test de PCR sur gène contrôle, exemple HPRT, Actine... (Fig. 4.2 Gène de Contrôle) : montre qu'après stabilisation puis purification, les réactions enzymatiques sont possibles. c. Analyse spectrométrique (Fig 2 et 3)
Conservation à 4°C
Les résultats d'analyse spectrométrique sont reproduits sur la figure 2. Ils montrent que la qualité des échantillons est satisfaisante après trois mois de conservation dans la solution de stabilisation selon l'invention à 4°C. Conservation à température ambiante
Les résultats d'analyse spectrométrique sont reproduits sur la figure 3. Ils montrent que la qualité des échantillons est satisfaisante après un mois de conservation dans le tampon de lyse à T0C ambiante.
Précautions d'emploi
Exercer les précautions normales requises pour manipuler tous les réactifs de laboratoire. Utiliser des gants.
Éviter le contact du tampon de lyse avec la peau, les yeux, ou les membranes muqueuses. Si le contact se produit, laver immédiatement avec une grande quantité d'eau. Des brûlures peuvent se produire si la surface touchée n'est pas traitée. Si le réactif se renverse, diluez avec de l'eau avant d'essuyer. Utiliser seulement les réactifs et tampons préconisés dans ce kit.

Claims

Revendications
1. Composition pour la stabilisation d'échantillons biologiques, cette composition comprenant : (A) un agent de désactivation choisi parmi un détergent ou un agent chélatant,
(B) un agent chaotrope et/ou un agent de dénaturation et de solubilisation doux, et
(C) une peptidase et, le cas échéant
(D) un tampon ou un acide ou une base de manière à stabiliser le pH d'une solution comprenant les composés (A) et (B) à un pH compris entre 4 et 11.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'agent de désactivation (A) est un agent détergent.
3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que le détergent est un détergent non ionique, de préférence le Triton X-IOO.
4. Composition selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisée en ce que le pH de la solution comprenant les constituants (A) et (B) est compris entre 4 et 5, de préférence voisin de 4,5.
5. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'agent de désactivation (A) est un agent chélatant.
6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'agent chélatant est l'EDTA.
7. Composition selon l'une des revendications 5 ou 6, charactérisée en ce qu'elle comprend en outre un sel de métal alcalin (E), de préférence le NaCl.
8. Composition selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que le pH de la solution comprenant les constituants (A) et (B) est compris entre 8 et 10, de préférence voisin de 9.
9. Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'agent chaotrope est un sel de guanidine, de préférence le chlorure de guanidine.
10. Composition selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que l'agent de dénaturation (B) est l'urée.
11. Composition selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la peptidase (C) est la Protéinase K.
12. Composition selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que le tampon (D) est choisi parmi le Tris HCl, l'acide citrique ou l'acide acétique.
13. Composition selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme solide ou en solution aqueuse.
14. Composition selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle est sous une forme lyophilisée.
15. Composition de pré-mélange pour la préparation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend les composés (A) et (B) et le cas échéant le tampon ou l'acide ou la base (D) et/ou le sel (E).
16. Kit de stabilisation d'échantillons biologiques, caractérisé en ce qu'il comprend les constituants (A) à (E) de la composition selon l'une des revendications 1 à 14, isolés ou en pré-mélanges dans des proportions adaptées pour la réalisation d'une solution de stabilisation prête à l'emploi.
17. Kit selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend d'une part un pré-mélange selon la revendication 15 et d'autre part la peptidase (C).
18. Kit selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que les constituants (A) à (E), isolés ou en pré-mélanges sont sous une forme lyophilisée.
19. Kit selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend un récipient, par exemple un tube à échantillon, une plaque ou un laboratoire sur puce, dans lequel sera traité puis conservé l'échantillon biologique mélangé à la solution de stabilisation selon l'invention.
20. Procédé de préparation d'échantillons biologiques stabilisés, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes de : mélange d'un échantillon biologique préalablement prélevé avec une composition de stabilisation selon l'une des revendications 1 à 14, - incubation du mélange pour permettre la lyse cellulaire et la dégradation des protéines, et - stockage du mélange stabilisé obtenu précédemment.
21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le mélange stabilisé est stocké pendant plus de 5 jours.
22. Procédé selon l'une des revendications 20 ou 21, caractérisé en ce que l'échantillon biologique comprend de l'ADN génomique.
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