WO2007074727A1 - 口腔カンジダ症治療剤 - Google Patents

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WO2007074727A1
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oral
oral candidiasis
candida albicans
candidiasis
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Hitomi Ohta
Madoka Taniai
Tadao Tanimoto
Toshio Ariyasu
Shigeharu Fukuda
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Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for oral candidiasis, and particularly relates to a therapeutic agent for oral candidiasis comprising tumor necrosis factor (TNF-a) as an active ingredient.
  • TNF-a tumor necrosis factor
  • Oral candidiasis is a disease in which white moss or ulcers are recognized on the oral mucosa and tongue mucosa as clinical symptoms. It often occurs in patients who receive wide-area antibacterial agents. The cause is Candida albino force, an infection of resident fungi in humans, which is said to cause disease with a decrease in immunity, and can also be caused by administration of anticancer drugs, corticosteroids, antibiotics, immunosuppressants, etc. There is a case.
  • an azole antifungal agent such as fluconazole, an antibacterial organic substance such as triclosan, or salt cetyl pyridinium has been used.
  • JP 2003-89652 discloses a plant essential oil
  • JP 2001-149388 discloses a sugar alcohol such as erythritol
  • JP 9-20680 discloses a combined use of an azole antifungal agent and lysozyme. Strength Proposed as a treatment for oral candidiasis.
  • these methods only temporarily prevent the growth of Candida and it is difficult to achieve radical healing.
  • the most effective azole antifungal agents may not be used due to the use of other therapeutic agents.
  • TNF-a was found as a kind of site force-in having an antitumor effect, it has not yet been clinically applied.
  • Necrosis Factor Alpha Has a Protective Role in a Murine Model of Systemic Candidiasis J, Infuxion 'and' Immunity, 62nd, No. 7, pages 2761 to 2772, 1994. 'Albicans growth It is reported that it is blocking.
  • it is unclear whether oral administration of TNFa is effective in treating oral candidiasis.
  • an object of the present invention is to provide a therapeutic agent for oral candidiasis.
  • the present invention solves the above problems by providing a therapeutic agent for oral candidiasis comprising human TNF-a as an active ingredient.
  • the present invention is effective in treating oral candidiasis and exhibits a synergistic effect when used in combination with a conventionally used azole antifungal agent such as fluconazole.
  • TNF-a used in the present invention examples include TNF-a derived from mammals, preferably human-derived TNF- ⁇ .
  • any method may be selected as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • natural TNF- ⁇ produced by treating human cells with an appropriate inducer.
  • it may be a recombinant TNF produced by introducing a TNF- ⁇ gene into cells such as animals and plants, bacteria such as E. coli and yeast.
  • natural TNF-a has a sugar chain in the molecule, and thus has excellent stability and is advantageously used in the present invention.
  • Examples of the method for producing natural TNF- ⁇ include the method described in JP-A-62-236495.
  • TNF-R1 type 1 TNF receptor
  • the therapeutic agent for oral candidiasis according to the present invention when administered orally, TNF-a as an active ingredient per day is 0.02 to 200 ⁇ g Zkg body weight, preferably 0.2 to 100 ⁇ g Zkg body weight, more preferably Should be administered or ingested within the range of 2 to 20 gZkg body weight. If the body weight is less than 0.02 / z gZkg, the desired effect will not be exerted. If the body weight exceeds 200 / z gZkg, side effects may be more serious than the effect.
  • the therapeutic agent for oral candidiasis of the present invention is administered in the oral cavity alone or in combination with other antifungal agents.
  • the therapeutic agent for oral candidiasis of the present invention can be used in combination with a conventional antifungal agent whose antibacterial effect has been confirmed against fungi such as Candida albicans.
  • Antifungal agents used in combination include polyenes such as amphotericin B, fluoropyridines such as flucytosine, and azole antifungals such as miconazole, fluconazole and itraconazole.
  • fluconazole is advantageously used, and its dose is usually 1 to 2 mgZkg body weight or more, and up to 8 mgZkg body weight can be administered when severe or refractory fungal infection is diagnosed.
  • the therapeutic agent for oral candidiasis of the present invention it is administered at 0.001 to 2 mgZkg body weight, preferably 0.01 to 1 mgZkg body weight.
  • the present invention in order to prevent or reduce the onset or worsening of oral candidiasis.
  • the oral candidiasis therapeutic agent can be advantageously administered orally 1 day to several days ago, preferably 1 day to 5 days ago, more preferably 1 day to 3 days ago.
  • the present invention can also be applied to fungi that develop in the oral cavity, such as Candida genus other than Candida albicans, Talyptococcus genus, Aspergillus genus, Trichophyton genus, Malassezia genus, and Coccidioides genus.
  • the therapeutic agent for oral candidiasis includes a composition in the form of food and drink, pharmaceutical, quasi-drug, health food, feed or feed, which may be TNF-a alone as an active ingredient.
  • Compositions include components that are acceptable in the above forms, such as water, alcohol, starch, protein, dietary fiber, carbohydrates, lipids, vitamins, minerals, flavorings, colorants, sweeteners, seasonings, spices, May contain stabilizers, antioxidants, preservatives, etc. it can.
  • plants such as interferons and interleukins, flavonoids such as rutin, hesperidin, quercetin and isoflavones or glycosides thereof, hinoki chinore, citraronore, citronellore, citronellore, geraninore, linalore Essential oil components, tea tree oil, geraum oil, rose oil, lavender oil, thyme oil, peppermint oil, spearmint oil, sandalwood oil and other plant essential oils, calcium salts such as calcium lactate and calcium phosphate phosphate, vitamin A , Vitamin B, vitamin B, vitamin
  • vitamins such as vitamin B, vitamin B, vitamin C, vitamin D, vitamin E or their derivatives
  • Body manoleose, trenorose, manoletosinoretrenorose, lactosucrose, nigerose, isomaltose, -gelooligosaccharide, isomaltoligosaccharide, cyclodextrin and other sugars, darcosamine, galactosamine, mannosamine and other amino sugars, hyaluronic acid, Chondroitin Glycosaminodarlicans such as sulfuric acid and heparan sulfate, sugar alcohols such as sorbitol and maltitol, hormones such as calcitonin, estrogen, and anabolic hormones, Photoelement 101, Photosensitive element 201, Photosensitive element 301, Photosensitizers such as Photosensitizer 401, Indigo, Perilla, Chinese Parsley, Paffia, Kakukaku Reishi, Agaritas, Meshimakobu and other plants, fungi or their extracts, as well as B
  • the dosage form of the therapeutic agent for oral candidiasis of the present invention may be any form as long as it is administered into the oral cavity, but in order to exert the effects of the present invention more effectively, TN F—A longer residence time is desired.
  • powders, fine granules, granules, pills, syrups, troches, knockers, solutions, chewables, aerosols, throat sprays, haptics, ointments, gargles, sprays, Examples include inhalants. It can also be in the form of quasi-drugs such as mouthwash and toothpaste, and foods such as chewing gum and candy.
  • TNF-a as an active ingredient activates macrophage cells and enhances its phagocytic activity, thereby increasing the anti-Candida albicans action.
  • Candida albicans usually takes two forms: a spherical form and a mycelial form. It is only the form of the fungus, and the mycelium form of the fungus is hardly phagocytosed. Therefore, in the treatment of oral candidiasis via macrophage cells, it is very important to make the bacteria spherical.
  • human TNF-a acts directly on Candida albicans that only activates macrophage cells, thereby suppressing the morphological change from the spherical form to the mycelial form.
  • human TNF-a exhibits an anti-Candida albicans action in the normal in vivo environment, that is, in the presence of macrophage cells.
  • Human acute leukemia lymphocyte cells 8 8 1 ⁇ -1 cells (1 x 1 ⁇ 80071) were transplanted subcutaneously into a newborn hamster treated with immunosuppression and bred for 3 to 4 weeks.
  • the cell mass was extracted from the hamster subcutaneously, cut into small pieces, suspended in RPMI1640 medium, and adjusted to a cell concentration of 5 ⁇ 10 6 Zml.
  • Sendai virus (HVJ) was added to this cell suspension so as to be lOOHAZml, and cultured at 35 ° C. for 20 hours.
  • the culture solution was centrifuged, and the supernatant was collected. From this supernatant, human TNF-a was purified by anti-human TNF- ⁇ antibody sepharose according to a conventional method to obtain a human TNF-a standard (specific activity about 7 ⁇ 10 8 U / mg).
  • Candida 'albicans cryopreserved product After thawing the Candida 'albicans cryopreserved product, it is suspended in Difco Sabouraud dextrose medium (Betaton' Dickinson 'and' Kampa-Company ') to a concentration of 5 ⁇ 10 4 cells at 37 ° C. Then, static culture was performed in an incubator for 24 hours. After incubation, collect 1 X 10 8 cells, remove the supernatant by centrifugation, float in RPMI1640 medium supplemented with 10 (vZv)% urine fetal serum, and perform sonication for 5 minutes. The body was dispersed. Mouse macrophage-established cells RAW264.
  • Difco Sabouraud dextrose medium Betaton' Dickinson 'and' Kampa-Company '
  • Human TNF-a was added to Candida albicans (2.5 ⁇ 10 6 cells / ml) prepared in Experiment 2 to a final concentration of 0.001 to 10 ⁇ g / ml. This was then seeded on a 24-well plate in 0.3 ml Z-wells. This 24 well plate is 37 ° C, CO incubator
  • TNF-a has an effect of inhibiting the mycelia formation rate of Candida albicans from 64% to 53%. Since the fungi are not phagocytosed by the macrophage cells, it was thought that the action by macrophage cells was enhanced by inhibiting the morphological change of TNF- ⁇ to fungi. Therefore, from the results of Experiments 2 and 3, TNF-a has an indirect effect of activating macrophage cells and a direct effect of inhibiting Candida albicans morphological changes to fungi. It became clear that
  • mice macrophage cells were pretreated with human TNF—a at a concentration of 0 to 1 ⁇ gZml, and TNF—a at a concentration of 0 to 0.2 / z gZm 1 fluconazole (“
  • TNF—a at a concentration of 0 to 0.2 / z gZm 1 fluconazole
  • Table 3 shows the number of relative colonies obtained from a mouse macrophage cell-only system without adding TNF- ⁇ and fluconazole.
  • BALL-1 cells were treated with Sendai virus to prepare natural human TNF-s.
  • This product can treat or prevent oral infections caused by fungi such as Candida albicans.
  • This product also exhibits a synergistic effect when used in combination with existing antifungal agents such as fluconazole.
  • Example 2 20 ⁇ g of natural human TNF described in Example 1 ( ⁇ , 2 ⁇ g of fluconazole was mixed with lg of maltose, and then tableted according to a conventional method to obtain a tablet.
  • Oral infections caused by fungi such as Candida albicans can be treated or prevented by oral administration of an amount corresponding to the symptoms of oral candidiasis, followed by crushing and dissolving in saliva.
  • the therapeutic agent for oral candidiasis of the present invention is effective for the treatment or prevention of oral candidiasis. Furthermore, when used in combination with conventional antifungal agents such as fluconazole, a synergistic effect is exhibited.

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Abstract

　口腔カンジダ症の治療剤を提供することを課題とし、有効成分として腫瘍壊死因子を含んでなる口腔カンジダ症治療剤を提供することによって、課題を解決する。

Description

明 細 書
口腔カンジダ症治療剤
技術分野
[0001] 本発明は口腔カンジダ症治療剤に関するものであり、とりわけ、有効成分として腫 瘍壊死因子 (TNF— a )を含んでなる口腔カンジダ症治療剤に関するものである。 背景技術
[0002] 口腔カンジダ症は、臨床症状として、口腔粘膜や舌粘膜に白苔あるいは潰瘍を認 める病気であり、発生した白苔を擦ると容易に出血し、痛みを伴い、高齢者、エイズ 患者などの広域抗菌剤投与患者などによく発生する。その原因はカンジダ ·アルビ力 ンスというヒトにおける常在真菌の感染であり、免疫力の低下とともに発病すると言わ れており、抗癌剤、副腎皮質ホルモン、抗生物質、免疫抑制剤などの投与によっても 発病する場合がある。
[0003] 口腔カンジダ症の治療方法としては、フルコナゾールなどのァゾール系抗真菌剤、 トリクロサン、塩ィ匕セチルピリジ-ゥムなどの抗菌性有機物質などが用いられてきた。 また、近年、特開 2003— 89652号公報において植物精油、特開 2001— 149388 号公報においてエリスリトールなどの糖アルコール、特開平 9 20680号公報にお Vヽてァゾール系抗真菌剤とリゾチームとの併用力 口腔カンジダ症の治療法として提 案されている。し力しながら、これらの方法は、一時的にカンジダ菌の増殖を阻止す るのみであり、根本的な治癒を達成することは難しい。また、最も有効とされるァゾー ル系抗真菌剤は、他の治療薬の使用により、使用できない場合がある。
[0004] 一方、 TNF— aは、抗腫瘍効果を有するサイト力インの一種として見出されたもの の、未だ臨床応用に至っていない。近年、アーノルド 'ルイエ、アルドナ 'エル'バルチ ュ、レイモンド 'ピ^ ~ ·スミス、マリ^ ~ ·エイ.フランケ、ウィリアム'ジエイ'リッツ、ジャスヮ ント'ケィ'シン、モリス ·エイ 'ゴードン、 「Tumor Necrosis Factor Alpha Has a Protective Role in a Murine Model of Systemic CandidiasisJ、ィ ンフエクシヨン 'アンド'ィムニティー、第 62卷、第 7号、 2761乃至 2772頁、 1994年 において、内在性の TNF— αが各種臓器におけるカンジダ 'アルビカンスの増殖を 阻止していることが報告されている。しかしながら、口腔カンジダ症の治療に、 TNF aの口腔内投与が有効であるか否かは不明である。
発明の開示
[0005] 斯かる状況に鑑み、本発明は、口腔カンジダ症治療剤を提供することを課題とする
[0006] 本発明者等が鋭意研究したところ、ヒト TNF—αを口腔内投与することにより、口腔 内のカンジダ'アルビカンスの増殖を抑制することを発見した。また、その作用は、マ クロファージ細胞を活性ィ匕して貪食作用を亢進することによって発揮されること、さら には、ヒト TNF— aは直接的にカンジダ'アルビカンスに作用し、菌糸形態変化を阻 害することによって発揮されることを発見し、本発明を完成するに至った。
[0007] すなわち、本発明は、有効成分としてヒト TNF— aを含んでなる口腔カンジダ症治 療剤を提供することによって、前記課題を解決するものである。
[0008] 本発明によれば、口腔カンジダ症の治療に効果的であり、従来用いられているフル コナゾールなどのァゾール系抗真菌剤との併用で相乗的な効果を発揮する。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明で用いられる TNF— aとしては、哺乳類由来の TNF— a、好ましくは、ヒト 由来の TNF— αが挙げられる。その製造方法は、本発明の効果を損ねない限り、い ずれの方法を選択してもよぐ例えば、ヒト細胞を適宜の誘導剤で処理することによつ て産生させた天然型 TNF— αであっても、動物、植物などの細胞、大腸菌、酵母な どの細菌などに TNF— αの遺伝子を導入して産生させた組換型 TNF ひであって もよい。このうち、天然型 TNF— aは、分子内に糖鎖を有していることから、安定性に 優れており、本発明において有利に用いられる。天然型 TNF— αの製造方法として は、特開昭 62— 236495号公報に記載の方法が挙げられる。また、安定性を向上さ せる観点において、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子をィ匕学的に結合させ ることも有利に実施できる。例えば、特開 2004— 2251号公報に開示されるポリェチ レンダリコール結合の TNF— α変異体は特に有利に利用できる。さらに、国際公開
WO2005Z066206号公報で開示されるヒト TNF— αの変異体蛋白質のうち、タイ プ 1の TNF受容体 (TNF— R1)にのみ選択的に結合する TNFァゴ-ストは、本発明 にお ヽて有利に利用できる。
[0010] 本発明の口腔カンジダ症治療剤は、口腔内投与により、 1日当たり有効成分として の TNF— aを 0. 02乃至 200 μ gZkg体重、好ましくは 0. 2乃至 100 μ gZkg体重 、さらに好ましくは 2 g乃至 20 gZkg体重の範囲内で投与又は摂取すればよい。 0. 02 /z gZkg体重未満だと、所期の効果が発揮されず、 200 /z gZkg体重を超える と、効果に対して副作用のほうが重篤になる恐れがある。
[0011] 本発明の口腔カンジダ症治療剤の使用方法としては、それ単独または他の抗真菌 剤と併用して口腔内投与される。本発明の口腔カンジダ症治療剤は、カンジダ'アル ビカンスなどの真菌に対して抗菌効果が確認されている従来の抗真菌剤と併用する ことができる。併用される抗真菌剤としては、アムホテリシン Bなどのポリェン系、フル シトシンなどのフルォロピリジン系、ミコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール などのァゾール系抗真菌剤が挙げられる。このうち、フルコナゾールが有利に用いら れ、その投与量は、通常 1乃至 2mgZkg体重以上であり、重症又は難治性真菌感 染症と診断される場合には最大 8mgZkg体重まで投与可能である。本発明の口腔 カンジダ症治療剤に併用される場合は、 0. 001乃至 2mgZkg体重、好ましくは 0. 0 1乃至 1 mgZkg体重で投与される。
[0012] また、抗癌剤や免疫抑制剤の投与により、口腔カンジダ症が発病又は悪ィ匕すること が予想される場合、 口腔カンジダ症の発病又は悪ィ匕を予防又は軽減させるために、 本発明の口腔カンジダ症治療剤を 1日乃至数日前、好ましくは 1日乃至 5日前、さら に好ましくは 1日乃至 3日前に口腔内投与することが有利に実施できる。また、口腔 内で発症する真菌類、例えば、カンジダ 'アルビカンス以外のカンジダ属、タリプトコッ カス属、ァスペルギルス属、トリコフイトン属、マラセチア属、コキディオイデス属などの 真菌に対しても適用できる。
[0013] 本発明の口腔カンジダ症治療剤は、有効成分としての TNF— a単独であってもよ ぐ飲食物、医薬品、医薬部外品、健康食品、飼料又は餌料などの形態の組成物と することもできる。組成物としては、上記形態において許容される成分、例えば、水、 アルコール、澱粉、蛋白質、食物繊維、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着 色料、甘味料、調味料、香辛料、安定剤、酸化防止剤、防腐剤などを配合することが できる。例えば、インターフェロン、インターロイキンなどのサイト力イン類、ルチン、へ スぺリジン、ケルセチン、イソフラボンなどのフラボノイド又はそれらの配糖体、ヒノキチ ォーノレ、シトラローノレ、シトロネラーノレ、シトロネローノレ、ゲラニォ一ノレ、リナローノレなど の植物精油成分、ティートリー油、ゼラ -ゥム油、バラ油、ラベンダー油、タイム油、ぺ パーミント油、スペアミント油、サンダルウッド油などの植物精油、乳酸カルシウム、グ リセ口リン酸カルシウムなどのカルシウム塩、ビタミン A、ビタミン B、ビタミン B、ビタミ
1 2 ン B、ビタミン B 、ビタミン C、ビタミン D、ビタミン Eなどのビタミン類またはその誘導
6 12
体、マノレトース、トレノヽロース、マノレトシノレトレノヽロース、ラクトスクロース、ニゲロース、 イソマルトース、 -ゲロオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、サイクロデキストリンなどの糖類、 ダルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミンなどのアミノ糖、ヒアルロン酸、コンドロイチン 硫酸、へパラン硫酸などのグリコサミノダリカン、ソルビトール、マルチトールなどの糖 アルコール、カルシトニン、エストロゲン、蛋白質同化ホルモンなどのホルモン類、感 光素 101号、感光素 201号、感光素 301号、感光素 401号などの感光色素、藍、シ ソ、中国パセリ、パフィァ、鹿角霊芝、ァガリタス、メシマコブなどの植物、菌類又はそ の抽出物、さらには、ビフィズス菌増殖糖質、粉末ミルク、貝殻粉末、珊瑚粉末、プロ ポリスエキス、ローヤルゼリー、蜂蜜、 Lーァスコルビン酸 2—ダルコシドなどを配合す ることがでさる。
[0014] 本発明の口腔カンジダ症治療剤の剤形としては、口腔内に投与される形態ならば どのようなものでもよいが、本発明の効果をより発揮させるためには、口腔内での TN F— ひの滞留時間がより長い形態のものが望まれる。例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤 、丸剤、シロップ剤、トローチ剤、ノ ッカル剤、液剤、チユアブル剤、エアゾール剤、の ど用スプレー剤、ハツプ剤、軟膏剤、含嗽剤、噴霧剤、吸入剤などが挙げられる。ま た、マウスゥォッシュ、歯磨などの医薬部外品、チューインガム、キャンディーなどの 食品の形態とすることもできる。
[0015] 本発明の口腔カンジダ症治療剤の作用メカニズムを説明するに、有効成分としての TNF- aは、マクロファージ細胞を活性ィ匕して、その貪食能を亢進することにより抗 カンジダ'アルビカンス作用を発揮する。また、カンジダ 'アルビカンスは、通常、球状 形態と菌糸形態の 2形態をとるが、マクロファージ細胞によって貪食されるのは球状 形態の菌のみであり、菌糸形態の菌はほとんど貪食されない。したがって、マクロファ ージ細胞を介した口腔カンジダ症の治療においては、菌を球状形態にすることが非 常に重要である。本発明者等は、ヒト TNF— aは、マクロファージ細胞を活性ィ匕する だけでなぐカンジダ'アルビカンスに直接的に作用して、球状形態から菌糸形態へ の形態変化を抑制することにより、球状形態の割合を増加させるという知見を独自に 発見した。この知見から、ヒト TNF— aは、通常の生体内環境すなわちマクロファー ジ細胞存在下において、抗カンジダ 'アルビカンス作用を発揮すると考えられる。
[0016] 以下、この発明の実施の形態につき、実験に基づいて説明する。
[0017] <実験 1 :ヒト TNF— αの調製 >
免疫抑制処理した生後間もないハムスターの皮下に、ヒト急性白血病リンパ球細胞 8八1^ー 1細胞(1じ1^80071)を移植し、 3乃至 4週間飼育した。上記細胞の塊をハ ムスター皮下より摘出し、細切した後、 RPMI1640培地に浮遊させ、細胞濃度 5 X 1 06個 Zmlに調製した。この細胞浮遊液にセンダイウィルス (HVJ)を lOOHAZmlと なるように添加し、 35°Cで 20時間培養した後、培養液を遠心分離して上清を採取し た。この上清は、常法にしたがい、抗ヒト TNF— α抗体セファロースによりヒト TNF— aを精製し、ヒト TNF— a標品（比活性約 7 X 108U/mg)を得た。
[0018] く実験 2 :カンジダ 'アルビカンスに対するインビトロでの TNF— αの効果（マクロファ ージ細胞の貪食能の亢進） >
カンジダ 'アルビカンス凍結保存品を融解後、 Difcoサブローデキストロース培地（ ベタトン'ディッキンソン'アンド'カンパ-一社製）中に、菌体濃度 5 X 104個 Zmlとな るように懸濁し、 37°C、インキュベータ一中で 24時間静置培養した。培養後、 1 X 10 8個の菌体を採取し、遠心して上清を除去後、 10 (vZv) %ゥシ胎児血清を補足した RPMI1640培地に浮遊させ、超音波処理を 5分間行ない、菌体を分散させた。 マウスマクロファージ榭立細胞 RAW264. 7 (ATCC :TIB— 71)を 10 (vZv) %ゥ シ胎児血清を含む RPMI 1640培地で培養し、 EDTA—トリプシン溶液で剥離後、同 培地で、 1 X 106個/ mlの懸濁液を調製した。この RAW264. 7細胞懸濁液を 96ゥ エルプレートに 0. lmlZゥエルずつ播種し、さらに、実験 1で調製したヒト TNF— αを 最終濃度が 0. 001乃至 10 gZmlになるように 0. lmlZゥエルずつ添カ卩した後、 一夜 COインキュベーターで培養した。培養後、各ゥエルから上清を吸引除去した後
2
、 0. 001乃至 10 μ g/mlの TNF— a、及び、至適濃度のカンジダ 'アルビカンスを 含有する RPMI 1640培地を 200 μ 1ずつ添カ卩して、 COインキュベータ一中で 2日
2
間培養した。対照として、同濃度のカンジダ 'アルビカンスを含有する RPMI 1640培 地を添カ卩したゥエルを用意した。顕微鏡 (40乃至 100倍率)でカンジダ ·アルビカンス のコロニー数をカウントした。対照のコロニー数に対する各試料での相対コロニー数 ( %)を求め、その結果を表 1に示す。
[0019] [表 1]
Figure imgf000007_0001
[0020] 表 1の結果が示すとおり、マウスマクロファージ細胞の存在により、カンジダ.アルビ カンスの相対菌数を 13%まで減じるところ、この系に TNF—ひを添加することにより、 用量依存的に、 8乃至 12%までにコロニー数を減じた。この結果は、 TNF— aはマ クロファージ細胞によるカンジダ.アルビカンスの貪食能を高めることを示している。
[0021] <実験 3 :カンジダ.アルビカンスに対するインビトロでの TNF— αの効果（菌糸形態 変化の阻害） >
実験 2で調製したカンジダ'アルビカンス（2. 5 X 106個/ ml)に、最終濃度 0. 001 乃至 10 μ g/mlとなるように、ヒト TNF— aを添カ卩した。次いで、これを 24ゥエルプレ ートに 0. 3mlZゥエルずつ播種した。この 24ゥエルプレートを 37°C、 COインキュべ
2 一ター中で 3時間培養した後、プレートに付着したカンジダ ·ァノレビカンスを十分ピぺ ッティングで剥離した後、顕微鏡 (40乃至 100倍率）により菌の形状を観察し、球状 菌数及び菌糸状菌数をカウントした。総菌数 (球状菌数と菌糸状菌数の和）に対する 菌糸状菌の割合を求め、それを菌糸形成率 (％)とし、その結果を表 2に示す。 [0022] [表 2]
Figure imgf000008_0001
[0023] 表 2に示すとおり、 TNF- aはカンジダ'アルビカンスの菌糸形成率を 64%から 53 %にまで阻害する作用を有することが判明した。菌糸状菌は、マクロファージ細胞に より貪食されにくいことから、 TNF— αの菌糸状菌への形態変化を阻害してマクロフ ァージ細胞による作用を増強していると考えられた。したがって、実験 2及び 3の結果 から、 TNF- aは、マクロファージ細胞を活性ィ匕するという間接的な作用と、カンジダ •アルビカンスの菌糸状菌への形態変化を阻害するという直接的な作用を有している ことが明らかになった。
[0024] <実験 4：インビトロ系におけるフルコナゾールとの併用効果 >
実験 2に記載の方法にしたがって、濃度 0乃至 1 μ gZmlのヒト TNF— aでマウス マクロファージ細胞を前処理し、それと同濃度の TNF— aと濃度 0乃至 0. 2 /z gZm 1フルコナゾール (『ジフルカン静注液』、フアイザ一製薬販売）との併用による効果を 調べた。処理 2日後、顕微鏡 (40乃至 100倍率）により観察し、カンジダ 'アルビカン スのコロニー数をカウントした。なお、 TNF— α及びフルコナゾールを添カ卩せず、マ ウスマクロファージ細胞のみの系を対照とし、それに対する相対コロニー数を求め、 その結果を表 3に示す。
[0025] [表 3]
Figure imgf000008_0002
[0026] 表 3の結果に示すとおり、 0. 1乃至 1 μ gZmlの TNF— aは、 0. 05乃至 0. 2 g Zmlのフルコナゾールとの併用により、カンジダ 'アルビカンスのコ口-一数は相乗 的に減少した。この結果は、マクロファージ細胞存在下という通常の生体内環境にお いて、 TNF— aとフルコナゾールは、相乗的に抗カンジダ'アルビカンス作用を発揮 することを示している。
[0027] く実験 5 :プレドニゾロン投与によるマウス口腔カンジダモデルにおける TNF—ひの 効果 >
150mgZkgのプレドニゾロン (塩野義製薬株式会社販売）を 4日に 1回皮下注射し て免疫抑制した 10週齢雌性 ICRマウスに、 1 X 108個のカンジダ 'アルビカンスをロ 腔内接種した。接種後 1日後から毎日、マウスにヒト TNF— αを 0. 02 gZkg体重 乃至 200 gZkg体重ずつ口腔内投与した。飼育期間中、 0. 83mgZmlの塩酸テ トラサイクリン^水に加えて自由摂取させた。試験開始 7日後に、マウスを安楽死さ せた後、無菌的条件下で、舌を摘出した。摘出した舌を 5 (vZv) %ゥシ胎児血清を 含む RPMI 1640培地に浸漬し、ホモジナイズした後、 0. 25 (wZv) %3ラゲナーゼ を添加し、 37°Cで 30分間処理した。これを、遠心分離し、上清を採取し、生理食塩 水で段階希釈してクロムァガープレートに播き、 37°Cで 48時間培養した後、コロニー 数を計測して、舌内の生菌数を求めた。また、対照として、 TNF— αを投与しない以 外は同様な処理をしたマウスを用意した。対照のマウスのコロニー数に対する各試料 のコロニー数の割合を求め、相対生菌数を求めた。その結果を表 4に示す。
[0028] [表 4]
Figure imgf000009_0001
表 4の結果から、カンジダ'アルビカンスの相対コロニー数は、 0. 02乃至 2 gZkg 体重の TNF—ひ投与により、用量依存的に減少した。この結果は、インビボモデル である口腔カンジダ症モデルマウスに対して、 TNF— aの口腔内投与によりカンジ ダ ·アルビカンスの生菌数を減じる効果が発揮されることを示して ヽる。
[0030] 以下、実施例により、本発明の形態の詳細を示す。
実施例 1
[0031] <口腔カンジダ症治療剤 >
実験 1に記載の方法に準じて、 BALL— 1細胞をセンダイウィルスで処理し、天然 型ヒト TNF—ひを調製した。本品は、カンジダ 'アルビカンスなどの真菌による口腔感 染症を治療または予防することができる。また、本品は、フルコナゾールなどの既存 の抗真菌剤と併用することにより、相乗的な効果を発揮する。 実施例 2
[0032] く液剤〉
lOOgの実施例 1に記載の天然型ヒト TNF— a、 lgのフルコナゾール、及び、 10 gのトレハロースを lmlの生理食塩水に溶解し、常法にしたがい、除菌濾過して液剤 を得た。本品は、口腔カンジダ症の症状に応じた量を投与し、さらに、うがいなどをす ることにより、カンジダ'アルビカンスなどの真菌による口腔感染症を治療または予防 することができる。
実施例 3
[0033] く錠剤〉
20 μ gの実施例 1に記載の天然型ヒト TNF— (χ、2 μ gのフルコナゾールを lgのマ ルトースに混合した後、常法にしたがって打錠し、錠剤を得た。本品は、口腔カンジ ダ症の症状に応じた量を口腔内投与し、さらに、嚙み砕き、唾液に溶かすことにより、 カンジダ 'アルビカンスなどの真菌による口腔感染症を治療または予防することがで きる。
産業上の利用可能性
[0034] 叙述のとおり、本発明の口腔カンジダ症治療剤は、口腔カンジダ症の治療または予 防に有効である。さらに、フルコナゾールなどの従来の抗真菌剤との併用により、相 乗的な作用が発揮される。

Claims

請求の範囲
[1] 有効成分として腫瘍壊死因子を含んでなる口腔カンジダ症治療剤。
[2] ァゾール系抗真菌剤と併用することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の口腔力 ンジダ症治療剤。
[3] 腫瘍壊死因子を口腔カンジダ症の患者に口腔内投与することを特徴とする口腔カン ジダ症の治療方法。
[4] さらに、ァゾール系抗真菌剤を口腔内投与することを特徴とする請求の範囲第 3項に 記載の口腔カンジダ症の治療方法。
[5] 腫瘍壊死因子及びァゾール系真菌剤を含んでなる口腔カンジダ症治療用組成物。
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