WO2007057490A2 - Immunogenic polypeptides of presenilin-1-associated protein (psap), methods of obtaining antibodies and use of same - Google Patents

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Abstract

The invention relates to polynucleotides which code for immunogenic peptides that can produce antibodies which interact with membrane protein PSAP. The invention also relates to methods of obtaining the aforementioned antibodies and to uses of same.

Description

POLIPÉTIDOS INMUNOGÉNICOS FRENTE A PRESENILIN 1-IMMUNOGENIC POLYETHYDES AGAINST PRESENILIN 1-
ASSOCIATED PROTEIN (PSAP), MÉTODOS DE OBTENCIÓN DEASSOCIATED PROTEIN (PSAP), METHODS OF OBTAINING
ANTICUERPOS Y USO DE LOS MISMOS.ANTIBODIES AND USE OF THE SAME.
CAMPO DE LA INVENCIÓNFIELD OF THE INVENTION
La presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican para péptidos inmunogénicos capaces de producir anticuerpos que interaccionan con Ia proteína de membrana PSAP, métodos de obtención de dichos anticuerpos y usos de los mismos.The present invention relates to polynucleotides that encode immunogenic peptides capable of producing antibodies that interact with the PSAP membrane protein, methods of obtaining said antibodies and uses thereof.
ESTADO DE LA TÉCNICASTATE OF THE TECHNIQUE
La enfermedad de Alzheimer es una patología neurodegenerativa que se caracteriza a nivel celular por Ia acumulación extracelular de agregados de proteína constituidos principalmente por el péptido amiloide beta y ovillos intracelulares formados por proteína tau hiperfosforilada. Todavía no está claro qué evento es el responsable del comienzo de Ia enfermedad, pero se han encontrado varios factores posibles aparte de Ia formación de acúmulos de proteínas.Alzheimer's disease is a neurodegenerative pathology that is characterized at the cellular level by the extracellular accumulation of protein aggregates consisting mainly of beta amyloid peptide and intracellular clews formed by hyperphosphorylated tau protein. It is not yet clear which event is responsible for the onset of the disease, but several possible factors have been found apart from the formation of protein clusters.
Algunos trabajos han relacionado Ia mitocondria con Ia enfermedad de Alzheimer, observándose que algunas de las proteínas implicadas en Ia enfermedad de Alzheimer, como las presenilinas, que son proteínas que participan en Ia producción del péptido amiloide beta a partir de su proteína precursora, betaAPP, interaccionan con proteínas implicadas en el proceso de muerte celular apoptótica que ejercen su función en Ia mitocondria.Some works have related the mitochondria with Alzheimer's disease, observing that some of the proteins involved in Alzheimer's disease, such as presenilins, which are proteins that participate in the production of the beta amyloid peptide from its precursor protein, betaAPP, they interact with proteins involved in the apoptotic cell death process that exert their function in the mitochondria.
Se ha observado que PSAP (presenilin 1- associated protein) o mtcM (mitochondrial carrier homolog 1), una proteína mitocondrial que ¡nteracciona con Ia preseniϊina 1 , induce el proceso de muerte celular apoptótica cuando sus niveles intracelulares son aumentados por sobreexpresión de Ia misma en células en cultivo. Esto sugiere que PSAP está relacionada con Ia muerte celular apoptótica en Ia enfermedad de Alzheimer y podría jugar un papel importante en diversas enfermedades degenerativas, así como en diversos tipos de cánceres.It has been observed that PSAP (presenilin 1- associated protein) or mtcM (mitochondrial carrier homolog 1), a mitochondrial protein that It interacts with preseniϊin 1, induces the apoptotic cell death process when its intracellular levels are increased by overexpression of it in cultured cells. This suggests that PSAP is related to apoptotic cell death in Alzheimer's disease and could play an important role in various degenerative diseases, as well as in various types of cancers.
PSAP no es Ia única proteína que interacciona con Ia Presenilina 1 y que está relacionada con las patologías anteriormente mencionadas. Una de estas proteínas distintas de PSAP, es Ia HPAP (Human Presenilin- asociated Protein), descrita en Ia solicitud de patente norteamericana n° 09/116,640.PSAP is not the only protein that interacts with Presenilin 1 and is related to the aforementioned pathologies. One of these proteins other than PSAP, is HPAP (Human Presenilin-Associated Protein), described in US Patent Application No. 09 / 116,640.
En relación a PSAP, Ia primera referencia conocida a esta proteína y en Ia que se describe su relación con Ia Presenilina 1 fue realizada en 1999In relation to PSAP, the first known reference to this protein and in which its relationship with Presenilin 1 is described was made in 1999
(Xuemin Xu, Yong-chang Shi et al.,J Biol Chem, VoI. 274, Issue 46, 32543-(Xuemin Xu, Yong-chang Shi et al., J Biol Chem, VoI. 274, Issue 46, 32543-
32546, November 12, 1999, Identification of a Novel PSD-95/Dlg/ZO-132546, November 12, 1999, Identification of a Novel PSD-95 / Dlg / ZO-1
(PDZ)-like Protein Interacting with the C Terminus of Presenilin-1). En este artículo se describen experimentos en los que Ia detección de Ia proteína PSAP se realiza mediante Ia adición en su extremo Carboxilo terminal de un marcador ("Myc tag") sobre el cual actúan anticuerpos denominados como "anti-myc".(PDZ) -like Protein Interacting with the C Terminus of Presenilin-1). In this article, experiments are described in which the detection of the PSAP protein is carried out by the addition at its Carboxyl end of a marker ("Myc tag") on which antibodies called "anti-myc" act.
En 2002 Xuemin Xu et al. (J Biol Chem. 2002 Dec 13;277(50):48913-22. Epub 2002 Oct 10. The novel presenilin-1-associated protein is a proapoptotic mitochondrial protein) describen Ia relación de PSAP con Ia apoptosis. Los experimentos de visualización de PSAP se llevaron a cabo a través de Ia creación de una proteína quimérica de fusión entre PSAP y GFP (Green Fluorescence Protein) y Ia detección de PSAP también se realizó con anticuerpos "anti-myc", tal y como describieron Xuemin Xu et al. 1999.In 2002 Xuemin Xu et al. (J Biol Chem. 2002 Dec 13; 277 (50): 48913-22. Epub 2002 Oct 10. The novel presenilin-1-associated protein is a proapoptotic mitochondrial protein) describes the relationship of PSAP with apoptosis. The PSAP visualization experiments were carried out through the creation of a chimeric fusion protein between PSAP and GFP (Green Fluorescence Protein) and the detection of PSAP also performed with "anti-myc" antibodies, as described by Xuemin Xu et al. 1999.
Años más tarde se demostró que Ia proteína descrita por Xuemin Xu et al. no tenía el tamaño de 371 a.a. descrito inicialmente, sino que ésta poseía un tamaño de 389 a.a. (41 ,54 KDa) debido a 18 a.a. adicionales que se encontraban en su extremo amino terminal WO2004/078112, "Apoptosis inducing gene". Además, también se pudo comprobar Ia existencia de una isoforma corta de PSAP (PSAPS) generada por Ia escisión por "splicing" alternativo de un fragmento de 17 a.a., definiéndose así una nueva isoforma corta de PSAP con 372 a.a. (39,92 KDa) , junto con Ia isoforma larga (PSAPL) de los 389 a.a.Years later it was shown that the protein described by Xuemin Xu et al. it was not the size of 371 a.a. initially described, but it had a size of 389 a.a. (41, 54 KDa) due to 18 a.a. additional found at its amino terminal WO2004 / 078112, "Apoptosis inducing gene". In addition, it was also possible to verify the existence of a short PSAP isoform (PSAPS) generated by the cleavage by alternative splicing of a fragment of 17 a.a., thus defining a new short PSAP isoform with 372 a.a. (39.92 KDa), along with the long isoform (PSAPL) of 389 BC.
Hasta el momento son pocos los anticuerpos desarrollados que reaccionen directamente contra PSAP debido a Ia dificultad que entraña localizar epítopos o fragmentos antigénicos de esta proteína que funcionen correctamente por diferentes motivos:So far there are few developed antibodies that react directly against PSAP due to the difficulty of locating epitopes or antigenic fragments of this protein that work correctly for different reasons:
i) PSAP es una proteína que resulta muy tóxica cuando fragmentos de ésta o Ia proteína completa se intenta expresar en sistemas vector- célula huésped. Esta circunstancia hace muy complejo el procedimiento de obtención de anticuerpos contra PSAP, puesto que los fragmentos antigénicos de ésta que se elijan, no sólo deben ser buenos determinantes antigénicos, sino que además no deben de ser tóxicos. ii) No todos los posibles epítopos de Ia proteína se encuentran expuestos una vez Ia proteína se encuentra plegada, por Io que es necesario seleccionar aquellos que sí Io estén, para los casos en los que los métodos de detección utilicen muestras con proteínas nativas. ¡ii) Aunque con los programas informáticos existentes es posible llegar a saber cual es Ia configuración terciaria de una proteína, y con ello conocer qué epítopos deberían encontrarse expuestos partiendo de una secuencia de aminoácidos inicial, las modificaciones postraduccionales hacen que muchos de los epítopos candidatos, que a priori son adecuados, en Ia práctica no sean eficaces para Ia obtención de anticuerpos.i) PSAP is a protein that is very toxic when fragments of this or the complete protein are tried to express in vector-host cell systems. This circumstance makes the procedure for obtaining antibodies against PSAP very complex, since the antigenic fragments of this one chosen, must not only be good antigenic determinants, but also must not be toxic. ii) Not all possible epitopes of the protein are exposed once the protein is folded, so it is necessary to select those that are, for cases in which the detection methods use samples with native proteins. Ii) Although with existing software it is possible to know what the tertiary configuration of a protein is, and thereby know what epitopes should be exposed from an initial amino acid sequence, post-translational modifications make many of the candidate epitopes , which a priori are adequate, in practice are not effective for obtaining antibodies.
Estos inconvenientes son solucionados con el método y elementos proporcionados para Ia obtención de anticuerpos contra PSAP en Ia presente invención.These drawbacks are solved with the method and elements provided for obtaining antibodies against PSAP in the present invention.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓNBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
Un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica para polipéptidos con capacidad inmunogénica frente a Ia proteína PSAP: a) polinucleótido que comprenda Ia SEQ ID 1 o fragmentos de Ia misma, b) polinucleótido que comprenda Ia SEQ ID 7 o fragmentos de Ia misma, o c) polinucleótido que codifique para un polipéptido que al menos muestre un 90% de homología con cualquiera de los polipéptidos codificados por cualquiera de los polinucleótidos anteriormente mencionados. En adelante estos polinucleótidos serán denominados como polipéptidos de Ia invención.A first aspect of the present invention refers to an isolated polynucleotide encoding polypeptides with immunogenic capacity against the PSAP protein: a) polynucleotide comprising SEQ ID 1 or fragments thereof, b) polynucleotide comprising SEQ ID 7 or fragments thereof, oc) polynucleotide that codes for a polypeptide that at least shows 90% homology with any of the polypeptides encoded by any of the aforementioned polynucleotides. Hereinafter these polynucleotides will be referred to as polypeptides of the invention.
Un segundo aspecto de Ia invención se relaciona con un polipéptido aislado con capacidad inmunogénica frente a PSAP, seleccionado de cualquiera de los siguientes grupos: a) polipéptido que comprenda Ia SEQ ID 2 o un fragmento de Ia misma, b) polipéptido que comprenda Ia SEQ ID 8 (EARA) o un fragmento de Ia misma, ó c) polipéptido que al menos muestre un 90% de homología con cualquiera de los péptidos mencionados en los apartados (a) o (b) de Ia presente reivindicación. En adelante estos polipéptidos serán denominados como polipéptidos de Ia invención.A second aspect of the invention relates to an isolated polypeptide with immunogenic capacity against PSAP, selected from any of the following groups: a) polypeptide comprising SEQ ID 2 or a fragment thereof, b) polypeptide comprising SEQ ID 8 (EARA) or a fragment thereof, or c) polypeptide that at least shows 90% homology with any of the peptides mentioned in sections (a) or (b) of the present claim. Hereinafter these polypeptides will be referred to as polypeptides of the invention.
El término fragmento cuando está relacionado con polipéptidos se refiere a todas aquellas secuencias polipeptídicas de al menos 8 amino ácidos, comprendidas en cualquiera de los polipéptidos de Ia invención, capaces de ser utilizadas como determinantes antigénicos para Ia generación de anticuerpos.The term fragment when related to polypeptides refers to all those polypeptide sequences of at least 8 amino acids, included in any of the polypeptides of the invention, capable of being used as antigenic determinants for the generation of antibodies.
Un tercer aspecto de Ia invención Io constituye una proteína de fusión que comprende a cualquiera de los polipéptidos de Ia invención. Preferentemente, dicho proteína de fusión comprende Ia SEQ ID 4. En adelante nos referiremos a las proteínas de fusión anteriormente mencionadas como proteínas de fusión de Ia invención.A third aspect of the invention constitutes a fusion protein comprising any of the polypeptides of the invention. Preferably, said fusion protein comprises SEQ ID 4. Hereinafter we will refer to the aforementioned fusion proteins as fusion proteins of the invention.
Otro aspecto de Ia invención los constituye un vector que comprenda cualquiera de los polinucleótidos de Ia invención. En adelante, nos referiremos estos vectores como vectores de Ia invención.Another aspect of the invention is a vector comprising any of the polynucleotides of the invention. Hereinafter, we will refer to these vectors as vectors of the invention.
Otro aspecto de Ia invención Io constituye una célula huésped transformada con cualquiera de los vectores de Ia invención.Another aspect of the invention constitutes a host cell transformed with any of the vectors of the invention.
Otro aspecto de Ia invención Io constituyen cebadores para Ia amplificación del polinucleótido SEQ ID 1, preferentemente dichos cebadores tienen cualquiera de las secuencias SEQ ID 5 o 6.Another aspect of the invention constitutes primers for the amplification of the polynucleotide SEQ ID 1, preferably said primers have any of the sequences SEQ ID 5 or 6.
Método para Ia generación de anticuerpos específicos frente a PSAP que comprende Ia utilización de cualquiera de los polipéptidos de Ia invención como determinante antigénico. Preferentemente, dicho polipéptido comprende cualquiera de las SEQ ID 2 o SEQ ID 8. Más preferentemente el polipéptido es una proteína de fusión, perteneciente a las proteínas de fusión de Ia invención. En adelante los métodos para Ia obtención de anticuerpos serán denominados como métodos para Ia obtención de anticuerpos de Ia invención.Method for the generation of specific antibodies against PSAP comprising the use of any of the polypeptides of the invention as an antigenic determinant. Preferably said polypeptide It comprises any of SEQ ID 2 or SEQ ID 8. More preferably, the polypeptide is a fusion protein, belonging to the fusion proteins of the invention. Hereinafter, the methods for obtaining antibodies will be referred to as methods for obtaining antibodies of the invention.
Otro aspecto de Ia invención Io constituyen aquellos anticuerpos obtenidos según los métodos para Ia obtención de anticuerpos de Ia invención, o anticuerpos capaces de interaccionar específicamente frente a cualquiera de los polipéptidos de Ia invención, en adelante anticuerpos de Ia invención.Another aspect of the invention constitutes those antibodies obtained according to the methods for obtaining antibodies of the invention, or antibodies capable of interacting specifically with any of the polypeptides of the invention, hereinafter antibodies of the invention.
Otro aspecto de Ia invención está constituido por el uso de los anticuerpos de Ia invención para el diagnóstico in vitro o in vivo de enfermedades neurodegenerativas asociadas a cualquiera de las isoforma de Ia proteína PSAP. En un aspecto más preferido de Ia invención dicho anticuerpo interacciona específicamente frente a un epítopo cuya secuencia comprende cualquiera los polipéptidos SEQ ID 2, SEQ ID 8 o fragmentos de los mismos.Another aspect of the invention is constituted by the use of the antibodies of the invention for the in vitro or in vivo diagnosis of neurodegenerative diseases associated with any of the PSAP protein isoforms. In a more preferred aspect of the invention said antibody interacts specifically against an epitope whose sequence comprises any of the polypeptides SEQ ID 2, SEQ ID 8 or fragments thereof.
Otro aspecto de Ia invención Io constituye una composición farmacéutica que comprenda cualquiera de los anticuerpos de Ia invención. Preferentemente, dichos anticuerpos interaccionan con cualquiera de las SEQ ID 2, SEQ ID 8 o fragmentos de las mismas.Another aspect of the invention constitutes a pharmaceutical composition comprising any of the antibodies of the invention. Preferably, said antibodies interact with any of SEQ ID 2, SEQ ID 8 or fragments thereof.
Otro aspecto de Ia invención Io constituye el uso de cualquiera de los polipéptidos de Ia invención para Ia elaboración de una vacuna. En un aspecto preferente de Ia presente invención dicho polipéptido es cualquiera de los polipéptidos SEQ ID 2, SEQ ID 8 o fragmentos de los mismos. Un aspecto adicional de Ia presente invención Io constituye un Kit para el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas in vitro o in vivo asociada a Ia actividad de PSAP, que comprenda al menos uno de los anticuerpos de Ia invención.Another aspect of the invention constitutes the use of any of the polypeptides of the invention for the preparation of a vaccine. In a preferred aspect of the present invention said polypeptide is any of the polypeptides SEQ ID 2, SEQ ID 8 or fragments thereof. An additional aspect of the present invention constitutes a Kit for the diagnosis of neurodegenerative diseases in vitro or in vivo associated with the activity of PSAP, comprising at least one of the antibodies of the invention.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURASDESCRIPTION OF THE FIGURES
Fig 1. En el panel A de Ia figura 1 se muestra el test de expresión realizado con bacterias que expresan GST (codificada en el vector pGEX-3X) y GST- PSAP (región 1 de PSAP fusionada a GST, codificada en el vector pJAC244), sin inducir (-) o induciendo (+) Ia expresión de estas proteínas con IPTG. Los tamaños de las proteínas esperadas son de 26,9 kDa para GST y 32 kDa para GST-PSAP. La cantidad de material cargada en cada carril equivale a 80 μl de un cultivo de 2 mi. En el panel B de Ia figura 1 se muestran los pasos de purificación de GST- PSAP. Las muestras cargadas en cada carril se indican a continuación:Fig 1. Panel A of Figure 1 shows the expression test performed with bacteria that express GST (encoded in the vector pGEX-3X) and GST-PSAP (region 1 of PSAP fused to GST, encoded in vector pJAC244 ), without inducing (-) or inducing (+) the expression of these proteins with IPTG. The expected protein sizes are 26.9 kDa for GST and 32 kDa for GST-PSAP. The amount of material loaded in each lane is equivalent to 80 μl of a 2 ml crop. Panel B of Figure 1 shows the purification steps of GST-PSAP. The samples loaded in each lane are indicated below:
1- 10 μl de 5 mi de lisado bacteriano, proveniente de un cultivo de 50 mi.1- 10 μl of 5 ml of bacterial lysate, from a 50 ml culture.
2- 10 μl de 5 mi de sobrenadante tras centrifugar el lisado 20 minutos a 1600O g.2- 10 μl of 5 ml of supernatant after centrifuging the lysate for 20 minutes at 1600 g.
3- 10 μl de 800 μl de precipitado del paso anterior resuspendido en buffer con urea.3- 10 μl of 800 μl of precipitate from the previous step resuspended in buffer with urea.
4- 10 μl de 800 μl de sobrenadante de urea tras centrifugar 20 minutos a 1600O g. 5- 10 μl de 12,8 mi de sobrenadante del paso anterior diluido 12 mi de buffer sin urea.4- 10 μl of 800 μl of urea supernatant after centrifuging 20 minutes at 1600O g. 5- 10 μl of 12.8 ml of supernatant from the previous step diluted 12 ml of buffer without urea.
6- 10 μl de sobrenadante tras centrifugar Ia dilución anterior 20 minutos a 16000 g.6- 10 μl of supernatant after centrifuging the previous dilution 20 minutes at 16000 g.
7- 10 μl de material (6.4 mi) del paso anterior no unido (excluido) a 400 μl de matriz de glutation-sefarosa (suspensión al 50%). 8- 10 μl de 1 mi de buffer de lavado (primer lavado de Ia matriz).7- 10 μl of material (6.4 ml) from the previous step not bound (excluded) to 400 μl of glutathione-sepharose matrix (50% suspension). 8-10 μl of 1 ml of wash buffer (first wash of the matrix).
9- 10 μl de 200 μl de eluído de Ia matriz (tras dos lavados adicionales que no se muestran).9-10 μl of 200 μl of eluted from the matrix (after two additional washes not shown).
Fig 2. En el panel A de Ia figura 2 se muestran los resultados del western blot del ejemplo 1 en el que se usó el anticuerpo anti-PSAP para detectar dos mutantes de deleción de PSAP, fusionados a GFP (proteína fluorescente verde) en un usado de células HEK293 que expresan estos mutantes. El tamaño del mutante en el carril 1 era 52 kDa y en el carril 2 era de 63.5 kDa.Fig 2. Panel A of Figure 2 shows the results of the western blot of example 1 in which the anti-PSAP antibody was used to detect two PSAP deletion mutants, fused to GFP (green fluorescent protein) in a used of HEK293 cells that express these mutants. The mutant size in lane 1 was 52 kDa and in lane 2 it was 63.5 kDa.
En el panel B de Ia figura 2 se muestra un western blot realizado con las mismas muestras usadas en el panel A, pero usando un anticuerpo anti- GFP comercial (dos monoclonales mezclados, de Roche, cat # 11814460001), como control.Panel B of Figure 2 shows a western blot made with the same samples used in panel A, but using a commercial anti-GFP antibody (two mixed monoclonal, from Roche, cat # 11814460001), as a control.
Fig 3. La secuencia A se corresponde con el polipéptido SEQ ID 2. El polipéptido subrayado en esta secuencia, así como el polipéptido que se muestra en Ia secuencia B es el polipéptido presente en Ia isoforma larga de PSAP y ausente en su isoforma corta.Fig. 3. Sequence A corresponds to the polypeptide SEQ ID 2. The polypeptide underlined in this sequence, as well as the polypeptide shown in sequence B is the polypeptide present in the long isoform of PSAP and absent in its short isoform.
Fig 4. La secuencia A se corresponde con el extremo amino terminal de PSAP descrita por Xu y colaboradores. La secuencia B se corresponde con el extremo amino terminal de PSAP con 18 a. a. (péptido MGAS o SEQ ID 9). Los péptidos subrayados son los determinantes antigénicos MGAS (SEQ ID 9) y EARA (SEQ ID 8) que han sido empleados para Ia generación de los antisueros MGAS 95-96 y EARA 97-98. Fig. 5. Muestra los resultados obtenidos en experimentos de western blot usando los anticuerpos anti-PSAP a una dilución 1 :2000, revelados con el anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con HRP y ECL Plus de Amersham. Se indican a Ia izquierda las posiciones de marcadores de peso molecular. Los carriles L se indican que Ia muestra cargada provenía de extractos de células HEK293 transfectadas con PSAPL-GFP, los carriles C con extractos de cerebro de rata y los carriles M con mitocondrias de hígado de rata.Fig 4. Sequence A corresponds to the amino terminal end of PSAP described by Xu et al. Sequence B corresponds to the amino terminal end of PSAP with 18 aa (MGAS peptide or SEQ ID 9). The underlined peptides are the MGAS (SEQ ID 9) and EARA (SEQ ID 8) antigenic determinants that have been used for the generation of MGAS 95-96 and EARA 97-98 antisera. Fig. 5. Shows the results obtained in western blot experiments using anti-PSAP antibodies at a 1: 2000 dilution, revealed with the secondary goat anti-rabbit antibody conjugated to HRP and ECL Plus from Amersham. The positions of molecular weight markers are indicated on the left. Lanes L indicate that the loaded sample came from extracts of HEK293 cells transfected with PSAPL-GFP, lanes C with extracts of rat brain and lanes M with mitochondria of rat liver.
Fig.6. Muestra el resultado de un western blot en el que anticuerpo que interacciona específicamente con SEQ ID 8 reconoce específicamente a PSAP, tanto en muestras de corteza cerebral (isoforma larga) como en las provenientes de Ia línea celular HEK293 (ambas isoformas) para extractos celulares totales (total H), muestras carentes de mitocondrias (No Mit) y muestras con mitocondrias (Mito)Fig. 6. It shows the result of a western blot in which antibody that interacts specifically with SEQ ID 8 specifically recognizes PSAP, both in samples of cerebral cortex (long isoform) and in those from the HEK293 cell line (both isoforms) for total cell extracts (total H), samples lacking mitochondria (No Mit) and samples with mitochondria (Myth)
EXPLICACIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓNDETAILED EXPLANATION OF THE INVENTION
Diversos estudios realizados en laboratorio con Ia proteína PSAP indican que ésta, y algunos fragmentos de Ia misma, resultan tóxicos para, al menos, algunas cepas bacterianas. Esto ha determinado, en parte, Ia elección de ciertas regiones de Ia proteína para ser usadas como epítopos en Ia generación de anticuerpos, puesto que eran susceptibles de ser expresadas en bacterias.Several studies carried out in the laboratory with the PSAP protein indicate that it, and some fragments thereof, are toxic to at least some bacterial strains. This has determined, in part, the choice of certain regions of the protein to be used as epitopes in the generation of antibodies, since they were capable of being expressed in bacteria.
Otro factor que se ha tenido en cuenta a Ia hora de elegir los fragmentos es Ia topología de membrana de PSAP, predicha utilizando diversos programas de computador. Los estudios revelan que PSAP parece ser una proteína de membrana con dos dominios transmembrana, con Io cual posee tres regiones potencialmente hidrofílicas: Ia región amino terminal, por delante del primer dominio transmembrana; Ia región situada entre ambos dominios transmembrana; y Ia región carboxilo terminal, por detrás del segundo dominio transmembrana.Another factor that has been taken into account when choosing the fragments is the membrane topology of PSAP, predicted using various computer programs. Studies reveal that PSAP appears to be a membrane protein with two transmembrane domains, with which it has three potentially hydrophilic regions: the amino terminal region, ahead of the first transmembrane domain; The region located between both transmembrane domains; and the carboxyl terminal region, behind the second transmembrane domain.
Inicialmente, se pretendió Ia expresión en bacterias de PSAP completa y de fragmentos de Ia misma, sin demasiado éxito. Posteriormente, se prepararon vectores para expresar las tres regiones potencialmente hidrofílicas de PSAP como fusiones con glutation S-transferasa (GST), aunque sólo Ia región situada entre ambos dominios transmembrana (SEQ ID 2, Fig. 3), y Ia región carboxilo terminal pudieron ser expresadas de esta forma, posibilitando que se produjesen modificaciones postraduccionales en Ia SEQ ID 2 al ser expresado en bacterias y, así obtener un péptido más antigénico para Ia generación de anticuerpos que interaccionasen con PSAP.Initially, the expression in bacteria of complete PSAP and fragments thereof was intended, without much success. Subsequently, vectors were prepared to express the three potentially hydrophilic regions of PSAP as fusions with glutathione S-transferase (GST), although only the region between both transmembrane domains (SEQ ID 2, Fig. 3), and the terminal carboxyl region could be expressed in this way, allowing post-translational modifications to occur in SEQ ID 2 when expressed in bacteria, and thus obtain a more antigenic peptide for the generation of antibodies that interact with PSAP.
SEQ ID 2 incluye 45 aminoácidos de PSAPL, entre las posiciones 271 y 315 (Fig. 3 A), dentro de Ia cual está Ia región de 17 aminoácidos (Fig. 3 B) sólo presente en PSAPL; los 51 nucleótidos que los codifican se eliminan por splicing alternativo para generar PSAPS.SEQ ID 2 includes 45 amino acids of PSAPL, between positions 271 and 315 (Fig. 3 A), within which is the region of 17 amino acids (Fig. 3 B) only present in PSAPL; The 51 nucleotides that encode them are removed by alternative splicing to generate PSAPS.
Por otro lado, se generaron anticuerpos contra un péptido que comprende los primeros 18 aminoácidos (SEQ ID 9 ó MGAS) de PSAP (Fig. 4), precisamente aquellos que no estaban presentes en Ia secuencia descrita por Xuemin Xu et al 1999. Adicionalmente, también se generaon anticuerpos contra otro péptido (SEQ ID 8 ó EARA) (Fig. 4), situado muy cerca del extremo amino descrito por Xuemin Xu et al 1999.On the other hand, antibodies were generated against a peptide comprising the first 18 amino acids (SEQ ID 9 or MGAS) of PSAP (Fig. 4), precisely those that were not present in the sequence described by Xuemin Xu et al 1999. Additionally, antibodies were also generated against another peptide (SEQ ID 8 or EARA) (Fig. 4), located very close to the amino end described by Xuemin Xu et al 1999.
Con los polipéptidos SEQ ID 8 y SEQ ID 9 se inmunizaron dos conejos, siguiendo el siguiente protocolo: primera inmunización el día 1 , dosis de refuerzo los días 8, 15, 29 y 36. Sangrado y obtención del antisuero el día 43. Con el péptido MGAS se inmunizaron los conejos 95 y 96, generando dos antisueros que, en adelante, denominaremos como MGAS95 y MGAS96. Con el péptido EARA se inmunizaron los conejos 97 y 98, generando dos nuevos antisueros que, en adelante, denominaremos como EARA97 y EARA98.With the SEQ ID 8 and SEQ ID 9 polypeptides two rabbits were immunized, following the following protocol: first immunization on day 1, booster dose on days 8, 15, 29 and 36. Bleeding and obtaining the antiserum on day 43. Rabbits 95 and 96 were immunized with the MGAS peptide, generating two antisera, hereinafter referred to as MGAS95 and MGAS96. With the EARA peptide, rabbits 97 and 98 were immunized, generating two new antisera, hereinafter referred to as EARA97 and EARA98.
Para el ensayo de los antisueros obtenidos se llevaron a cabo western blots utilizando homogenados de células HEK293, que expresan PSAP recombinante, y homogenados de cerebro de rata y de mitocondria de hígado de rata .For the test of the obtained antisera, western blots were carried out using homogenates of HEK293 cells, which express recombinant PSAP, and homogenates of rat brain and mitochondria of rat liver.
Se pudo comprobar (Fig.5) que todos los antisueros reconocen perfectamente a Ia proteína recombinante PSAPL-GFP, de un peso molecular calculado de 69 kDa, (carril L) generada mediante transfección de células HEK293 (riñon embrionario humano) con un vector que codifica PSAPL fusionada a Ia proteína fluorescente verde. Además, los tres antisueros detectan una proteína adicional, menor, que podría ser Ia PSAP endógena de células HEK293 (carril L). En cerebro de rata (carril C) los antisueros detectan tres bandas en un homogenado de cerebro de rata (marcadas 1 , 2 y 3), excepto con el antisuero EARA97, que no parece detectar Ia banda número 1. En mitocondria de hígado de rata (M), MGAS95 detecta principalmente las bandas 1 y 2, mientras que MGAS96 detecta Ia 1 y Ia 3 con mayor intensidad. Con EARA97 y EARA 98 se detecta principalmente Ia 2, y en menor medida Ia 3.It was possible to verify (Fig. 5) that all the antisera perfectly recognize the recombinant PSAPL-GFP protein, of a calculated molecular weight of 69 kDa, (lane L) generated by transfection of HEK293 cells (human embryonic kidney) with a vector that encodes PSAPL fused to the green fluorescent protein. In addition, the three antisera detect an additional, minor protein, which could be the endogenous PSAP of HEK293 cells (lane L). In rat brain (lane C) the antisera detect three bands in a rat brain homogenate (marked 1, 2 and 3), except with the EARA97 antiserum, which does not appear to detect the number 1 band. In rat liver mitochondria (M), MGAS95 mainly detects bands 1 and 2, while MGAS96 detects Ia 1 and Ia 3 with greater intensity. With EARA97 and EARA 98, mainly 2 is detected, and to a lesser extent Ia 3.
Con el antisuero preinmune se detectan algunas bandas que coinciden en tamaño con las que se detectan con los antisueros (post-inmunes) pero con mucha menos intensidad. La preincubación del antisuero "posí- inmune" con los péptidos antes del western blot elimina Ia mayor parte de Ia señal, indicando que los anticuerpos que se unen al péptido son los mismos que detectan las bandas en los extractos. No obstante, estos anticuerpos, sin purificar, se unen a las proteínas de forma no específica, siendo adecuados para detectar Ia proteína recombinante, pero no para Ia endógena (poco abundante), en donde detectan con más intensidad otras proteínas.With the preimmune antiserum some bands are detected that coincide in size with those detected with the antisera (post-immune) but with much less intensity. Preincubation of the "post-immune" antiserum with the peptides before western blot eliminates most of the signal, indicating that the antibodies that bind to the peptide are the same that detect the bands in the extracts. However, these antibodies, without purification, bind to the proteins in a non-specific way, being suitable for detecting the recombinant protein, but not for the endogenous (little abundant), where they detect with more intensity other proteins.
Cabe destacar, que las bandas detectadas no se corresponden en tamaño con Io esperado para PSAPL (41 ,5 kDa) o PSAPS (39,9 kDa). Los resultados obtenidos con los anticuerpos purificados, tal y como se describe a continuación, reconocen proteínas con los tamaños esperados para ambas isoformas de PSAP, Io cual indica que los no purificados se están uniendo a otras proteínas distintas de PSAP en extractos totales, aunque reconocen bien Ia proteína recombinante sobreexpresada en células HEK293.It should be noted that the bands detected do not correspond in size with what is expected for PSAPL (41.5 kDa) or PSAPS (39.9 kDa). The results obtained with the purified antibodies, as described below, recognize proteins with the expected sizes for both PSAP isoforms, which indicates that the unpurified are binding to proteins other than PSAP in total extracts, although they recognize or the recombinant protein overexpressed in HEK293 cells.
El elevado e inesperado número de proteínas detectadas en muestras biológicas de diversa procedencia llevó a purificar los anticuerpos por afinidad para evitar su inespecificidad.The high and unexpected number of proteins detected in biological samples of diverse origin led to purification of affinity antibodies to avoid their nonspecificity.
Los anticuerpos se ensayaron con muestras de cerebro de rata y de cultivos celulares de riñon embrionario humano (línea HEK293), obteniéndose los siguientes resultados:The antibodies were tested with samples of rat brain and human embryonic kidney cell cultures (HEK293 line), obtaining the following results:
los antisueros MGAS95 y MGAS96 no detectan Ia proteína esperada en extractos totales de cerebro de rata ni en mitocondrias purificadas a partir del mismo. Esto no es sorprendente puesto que ese péptido no está perfectamente conservado en rata y humanos, y el péptido usado para las inmunizaciones contiene Ia secuencia humana. En mitocondrias de células HEK293 tampoco detecta las proteínas esperadas, aunque sí funciona satisfactoriamente en Ia detección de proteína recombinante.MGAS95 and MGAS96 antisera do not detect the expected protein in total extracts of rat brain or in mitochondria purified from it. This is not surprising since that peptide is not perfectly conserved in rat and humans, and the peptide used for immunizations contains the human sequence. In HEK293 cell mitochondria it also does not detect the expected proteins, although it does work satisfactorily in the detection of recombinant protein.
los antisueros EARA97 y EARA98 purificados por afinidad han funcionado satisfactoriamente (Fig. 6), tanto en el reconocimiento de proteína recombinante, como de Ia proteína endógena de mitocondrias de cerebro de rata y de células de riñon embrionario humano.affinity purified EARA97 and EARA98 antisera have worked satisfactorily (Fig. 6), both in the recognition of recombinant protein, as well as in the endogenous protein of rat brain mitochondria and human embryonic kidney cells.
Los datos obtenidos con los anticuerpos de los antisueros EARA97 y EARA 98 encajan perfectamente con Io esperado, ya que coinciden con los datos de expresión de las dos isoformas de PSAP, PSAPL y PSAPS, usando técnicas de PCR y cDNAS derivados de 16 tejidos humanos, que indicaban que en cerebro se expresa mayoritariamente Ia isoforma más larga (PSAPL), mientras que en riñon se expresan ambas isoformas a niveles similares.The data obtained with the antibodies of the EARA97 and EARA 98 antisera perfectly match what was expected, since they coincide with the expression data of the two isoforms of PSAP, PSAPL and PSAPS, using PCR techniques and cDNAS derived from 16 human tissues, which indicated that in the brain the longest isoform (PSAPL) is expressed, while in kidney both isoforms are expressed at similar levels.
En Ia Fig. 6 se muestra que el anticuerpo purificado procedente del antisuero EARA98 reconoce específicamente a PSAP, tanto en muestras de corteza cerebral como en las provenientes de Ia línea celular HEK293. En Ia fracción mitocondrial de ambas preparaciones se observa una banda clara de aprox. 42 kDa de peso molecular esperado para PSAPL (41 ,5kDa). En Ia muestra de HEK293, aparece además una banda de menor tamaño que corresponde a PSAPS (tamaño esperado, 39,9 kDa). Además, aparece una pequeña diferencia entre el tamaño esperado y el aparente tras Ia electroforesis, que podría indicar Ia existencia de alguna modificación post-traduccional o simplemente una migración aberrante que no es infrecuente en este tipo de análisis.In Fig. 6 it is shown that the purified antibody from the EARA98 antiserum specifically recognizes PSAP, both in samples of cerebral cortex and those from the HEK293 cell line. In the mitochondrial fraction of both preparations a clear band of approx. 42 kDa expected molecular weight for PSAPL (41.5 kDa). In the sample of HEK293, a band of smaller size corresponding to PSAPS (expected size, 39.9 kDa) also appears. In addition, there is a small difference between the expected and the apparent size after the electrophoresis, which could indicate the existence of some post-translational modification or simply an aberrant migration that is not uncommon in this type of analysis.
La ausencia de PSAPS en Ia muestra de corteza encaja con nuestros resultados previos de RT-PCR, que indicaron que esta isoforma es menos abundante que Ia isoforma larga, usando cDNA de cerebro humano. PSAP es una proteína mitocondrial por Io que queda explicada su ausencia en las muestras de "No mitocondria" (No Mit) y su enriquecimiento en Ia fracción "Mitocondria" (Mito) frente al "Homogenado Total" (Total H). La detección de PSAPL en homogenado total de cerebro y no en homogenado total de células de riñon puede ser debida a Ia mayor abundancia de PSAP y/o mitocondrias en cerebro que en riñon.The absence of PSAPS in the cortex sample fits with our previous RT-PCR results, which indicated that this isoform is less abundant than the long isoform, using human brain cDNA. PSAP is a mitochondrial protein that explains its absence in the "No mitochondria" (No Mit) samples and its enrichment in the "Mitochondria" (Myth) fraction versus the "Total Homogenate" (Total H). The detection of PSAPL in total brain homogenate and not in total kidney cell homogenate may be due to the greater abundance of PSAP and / or mitochondria in the brain than in the kidney.
Los siguientes ejemplos de realización no pretenden limitar Ia invención, sino ilustrarla para su mejor comprensión.The following examples of embodiment are not intended to limit the invention, but to illustrate it for better understanding.
EJEMPLOSEXAMPLES
EJEMPLO 1EXAMPLE 1
Para Ia obtención del fragmentos de Ia isoforma larga de PSAP que codifiquen para el péptido SEQ ID 2 se ha empleado Ia técnica de PCR preparativa de alta fidelidad con Ia ADN polimerasa de Pirococcus furiosus (Pfu polimerasa, Stratagene) y los cebadores PSAP1 y PSAPTH2 (Invitrogen, custom made).To obtain the fragments of the long PSAP isoform that code for the SEQ ID 2 peptide, the preparative high fidelity PCR technique with the Pirococcus furiosus DNA polymerase (Pfu polymerase, Stratagene) and the primers PSAP1 and PSAPTH2 ( Invitrogen, custom made).
Como ADN molde para Ia obtención de los fragmentos codificantes de SEQ ID 2 se empleó el clon CS0DE007YK11 (Invitrogen), aunque es posible utilizar también como ADN molde cDNA de diversos tejidos humanos (corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, riñon, páncreas, bazo, timo, próstata, testículo, ovario, intestino, colon y leucocito.The clone CS0DE007YK11 (Invitrogen) was used as the template DNA for obtaining the coding fragments of SEQ ID 2, although it is also possible to use as cDNA template DNA of various human tissues (heart, brain, placenta, lung, liver, kidney, pancreas) , spleen, thymus, prostate, testis, ovary, intestine, colon and leukocyte.
Las reacciones de PCR se llevaron a cabo usando un termociclador MJPCR reactions were carried out using an MJ thermal cycler.
Research Minicycler con una ADN polimerasa de alta fidelidad, Ia polimerasa de Pyrococcus furiosus (PfuTurbo DNA polimerase de Stratagene, cat # 600250). Cada reacción se realizó en un volumen de 50μl) conteniendo 100 pg de ADN molde, 5 μl de buffer de reacción de Ia polymerasa, 20 pmol de cada cebador, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dGTP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM TTP y 2.5 unidades de polimerasa. Se realizó un primer paso de desnaturalización a 940C durante 2 minutos, seguido de 30 ciclos consistentes en un paso de desnaturalización a 940C durante 30 segundos, uno de anillamiento a 6O0C durante 30 segundos y uno de extensión a 720C durante 15 segundos, terminado con una incubación a 720C durante 10 minutos. Los productos obtenidos se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa 2% en buffer TBE (0,5 M Tris base, 0,5 mM ácido bórico, 10 mM EDTA) y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio (0,5 μg/ml durante 15 minutos a temperatura ambiente) usando un transiluminador de luz ultravioleta.Research Minicycler with a high fidelity DNA polymerase, Pyrococcus furiosus polymerase (PfuTurbo DNA polymerase from Stratagene, cat # 600250). Each reaction was carried out in a volume of 50 μl) containing 100 pg of template DNA, 5 μl of polymerase reaction buffer, 20 pmol of each primer, 0.25 mM dATP, 0.25 mM dGTP, 0.25 mM dCTP , 0.25 mM TTP and 2.5 polymerase units. A first denaturation step was carried out at 94 0 C for 2 minutes, followed by 30 cycles consisting of a denaturation step at 94 0 C for 30 seconds, one ringing at 6O 0 C for 30 seconds and one extension at 72 0 C for 15 seconds, terminated with an incubation at 72 0 C for 10 minutes. The products obtained were analyzed by electrophoresis in 2% agarose gels in TBE buffer (0.5 M Tris base, 0.5 mM boric acid, 10 mM EDTA) and visualized by staining with ethidium bromide (0.5 μg / ml for 15 minutes at room temperature) using an ultraviolet light transilluminator.
Clonación en vectores pGEXCloning in pGEX vectors
El producto de PCR correspondiente a Ia SEQ ID 3 de Ia isoforma larga de PSAP se clonó en el vector pGEX-3X (Amersham), previamente linearizado con Ia enzima Sma I (Roche), mediante ligación de extremos romos. La reacción de ligación se llevó a cabo, en un volumen de 20 μl, contenía 50 ng de producto de PCR, 150 ng de vector, 66 mM Tris-HCI, pH 7,6, 6,6 mM MgCI2, 10 mM DTT, 66 μM ATP y 1 unidad de ADN ligasa de T4 (USB). La reacción se incubó a temperatura ambiente (220C) durante 16 horas. Se usaron 5 μl de Ia reacción de ligación para transformar células competentes E. coli DH5α (Invitrogen), usando procedimientos estándar.The PCR product corresponding to SEQ ID 3 of the long PSAP isoform was cloned into the vector pGEX-3X (Amersham), previously linearized with the enzyme Sma I (Roche), by blunt-end ligation. The ligation reaction was carried out, in a volume of 20 μl, containing 50 ng of PCR product, 150 ng of vector, 66 mM Tris-HCI, pH 7.6, 6.6 mM MgCl 2 , 10 mM DTT , 66 μM ATP and 1 unit of T4 DNA ligase (USB). The reaction was incubated at room temperature (0 22 C) for 16 hours. 5 μl of the ligation reaction were used to transform competent E. coli DH5α cells (Invitrogen), using standard procedures.
Las bacterias transformadas se sembraron en placas de medio LB-agarThe transformed bacteria were seeded on LB-agar medium plates
(Luria-Bertani: 10 g bacto-triptona, 5 g extracto de levadura, 10 g NaCI, pH 7,5, y 15 g de agar, por litro) conteniendo 100 μg /mi de ampicilina, y se incubaron a 370C durante al menos 16 horas. Las colonias se analizaron mediante PCR analítica utilizando una polimerasa termoestable Biotools, cat# 10.012) usando los cebadores PGEXFP (SEQ ID 5 y SEQ ID 6), y las mismas condiciones de PCR descritas anteriormente.(Luria-Bertani: 10 g bacto-tryptone, 5 g yeast extract, 10 g NaCI, pH 7.5, and 15 g agar, per liter) containing 100 μg / ml ampicillin, and They incubated at 37 0 C for at the least 16 hours. Colonies were analyzed by analytical PCR using a Biotools thermostable polymerase, cat # 10.012) using the PGEXFP primers (SEQ ID 5 and SEQ ID 6), and the same PCR conditions described above.
Las colonias que contenían el inserto de ADN en Ia orientación correcta se utilizaron para hacer preparaciones de ADN a pequeña escala (Eppendoif Plasmidprep perfect mini). Este ADN se secuenció para confirmar que correspondía a Ia construcción deseada, con el fragmento de PSAP en el mismo marco de lectura que Ia glutation S-transferasa (GST) codificada en el vector. El clon correcto se denominó pJAC244.Colonies containing the DNA insert in the correct orientation were used to make small-scale DNA preparations (Eppendoif Plasmidprep perfect mini). This DNA was sequenced to confirm that it corresponded to the desired construct, with the PSAP fragment in the same reading frame as the glutathione S-transferase (GST) encoded in the vector. The correct clone was named pJAC244.
3. Expresión de las proteínas en bacterias3. Expression of proteins in bacteria
Los vectores preparados en bacterias E. coli DH5α se utilizaron para transformar E. coli BL21Gold (DE3) de Stratagene, usando métodos estándar. Cuatro colonias de cada clon se analizaron directamente mediante inducción de expresión a pequeña escala. Para ello, se picaron cuatro colonias de cada placa y se crecieron en 4 mi de medio LB conteniendo 100 μg/ml de ampicilina, a 370C, con agitación (250 rpm) hasta una OD de 0,5 a 600 nm. Cada cultivo se dividió en dos, induciendo Ia expresión en uno de ellos y dejando el otro como control negativo. La expresión se indujo mediante adición de IPTG (Isopropiltio-β-D- galactósido, Invitrogen) 100 mM a una concentración final de 1 mM, continuando Ia expresión durante dos horas en las mismas condiciones. Como control de Ia expresión se usaron bacterias transformadas con pGEX-3X, que expresan GST sola.Vectors prepared in E. coli DH5α bacteria were used to transform E. coli BL21Gold (DE3) from Stratagene, using standard methods. Four colonies of each clone were analyzed directly by induction of small-scale expression. For this, four colonies from each plate were picked and grown in 4 ml of LB medium containing 100 .mu.g / ml ampicillin, at 37 0 C with agitation (250 rpm) to an OD 0.5 at 600 nm. Each crop was divided into two, inducing expression in one of them and leaving the other as a negative control. Expression was induced by adding 100 mM IPTG (Isopropylthio-β-D-galactoside, at a final concentration of 1 mM, continuing the expression for two hours under the same conditions. Bacteria transformed with pGEX-3X, which express GST alone, were used as control of the expression.
La expresión se determinó analizando las proteínas bacterianas mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de acrilamida (Fig. 1A) (SDS- PAGE de Laemli; 37,5:1 acrilamida:bisacrilamida) usando un aparato Mini Protean Il de BioRad. La concentración de acrilamida utilizada fue del 10% para el gel inferior y del 4% para el superior. 200 μl de bacterias se centrifugaron a 14000 g durante 1 minuto, se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron en 50 μl de buffer de carga con SDS (20 mM DTT, 62,5 mM Tris, pH 6,8, 10% glicerol, 2% SDS, 0,03 % azul de bromofenol, 0,2 M Tris base), incubando las muestras durante 5 minutos a 1000C para lisar las bacterias. Se cargaron 20 μl en cada pocilio del gel de acrilamida. Tras Ia electroforesis, los geles se tiñeron con azul de coomassie usando métodos estándar. Las proteínas de fusión recombinantes, codificadas en el vector pJAC244 produjeron bandas de proteína más intensas que las proteínas bacterianas endógenas, con tamaños que concordaban con los esperados; 32,8 kDa (280 aminoácidos) para Ia proteína codificada por pJAC244. Los clones que producían niveles más altos de proteínas recombinantes se utilizaron para hacer cultivos a mayor escala.Expression was determined by analyzing bacterial proteins by electrophoresis in acrylamide denaturing gels (Fig. 1A) (SDS- PAGE of Laemli; 37.5: 1 acrylamide: bisacrylamide) using a Mini Protean Il device from BioRad. The acrylamide concentration used was 10% for the lower gel and 4% for the upper one. 200 μl of bacteria were centrifuged at 14000 g for 1 minute, the supernatant was removed and resuspended in 50 μl of SDS loading buffer (20 mM DTT, 62.5 mM Tris, pH 6.8, 10% glycerol, 2 % SDS, 0.03% bromophenol blue, 0.2 M Tris base), incubating the samples for 5 minutes at 100 0 C to lyse the bacteria. 20 μl were loaded into each well of the acrylamide gel. After the electrophoresis, the gels were stained with coomassie blue using standard methods. Recombinant fusion proteins, encoded in the vector pJAC244 produced more intense protein bands than endogenous bacterial proteins, with sizes that matched those expected; 32.8 kDa (280 amino acids) for the protein encoded by pJAC244. Clones that produced higher levels of recombinant proteins were used to make larger scale cultures.
Para Ia expresión a una escala mayor, para purificación de proteínas, se creció primero un cultivo de 5 mi durante 16 horas a 370C en medio LB con ampicilina. Este cultivo se utilizó para inocular 250 mi de medio LB con ampicilina, incubando con agitación a 370C hasta alcanzar una OD a 600 nm de 0,5. El cultivo se enfrió a temperatura ambiente (220C), se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM y se incubó durante 3 horas a 220C con agitación (250 rpm).For the expression in a larger scale for purification of proteins, a culture of 5 ml for 16 hours at 37 0 C in LB medium with ampicillin is first grown. This culture was used to inoculate 250 ml of LB medium with ampicillin, incubated with shaking at 37 0 C until an OD 600 nm of 0.5. The culture was cooled to room temperature (22 0 C), IPTG was added to a final concentration of 1 mM and incubated for 3 hours at 22 0 C with shaking (250 rpm).
4. Purificación de proteínas recombinantes4. Purification of recombinant proteins
Las proteínas recombinantes se recogieron mediante centrifugación, se lavaron con varios volúmenes de medio STE (10 mM Tris-HCI, 150 mMRecombinant proteins were collected by centrifugation, washed with several volumes of STE medium (10 mM Tris-HCI, 150 mM
NaCI, 1 mM EDTA, 1% Tritón X-100, 5 mM DTT, 200 μM phenyl-metyl- sulphonyl fluoride) y se resuspendieron en 5 mi de medio STE. A continuación se usaron mediante sonicación y el lisado se sometió a centrifugación durante 15 minutos a 16000 g a 40C, para separar el material soluble del insoluole. La proteína recombinante era insoluble y estaba presente en el precipitado, formando cuerpos de inclusión. Estos cuerpos de inclusión se lavaron mediante resuspensión en medio STE y centrifugación varias veces, dando lugar a Ia proteína recombinante deseada con una pureza superior al 90%. Para obtener proteína más pura los cuerpos de inclusión se solubilizaron mediante resuspensión en 1 mi de medio STE conteniendo 8 M urea y se incubaron en el mismo, rotando, durante 30 minutos a 220C. El material no solubilizado se eliminó mediante centrifugación a 16000 g durante 15 minutos. La proteína desnaturalizada en urea se renaturalizó mediante dilución rápida, gota a gota, de Ia solución de urea en 25 mi de medio STE sin urea, agitando tras Ia adición de cada gota. La solución final se centrifugó 15 minutos a 16000 g a 40C para eliminar proteína insoluble. La proteína soluble se purificó mediante cromatografía de afinidad en columnas de glutation reducido unido a sefarosa (BD). El método utilizado es el conocido como método "baten" (Fig. 1 B), en el que no se utilizan columnas de cromatografía, sino que se realiza Ia unión proteína-matriz en solución, recogiendo a continuación Ia matriz con Ia proteína unida mediante centrifugación a 300 g durante 30 segundos. La matriz utilizada fue Ia Glutathione uniflow resin, de BD (cat # 635610). Usando 500 μl de suspensión de resina (50% resina) por cada 50 mi de cultivo bacteriano de partida. Los lavados se realizaron mediante resuspensión de Ia matriz en medio STE, agitación suave mediante vórtex y posterior centrifugación en las mismas condiciones, eliminado el sobrenadante tras cada lavado. Se realizaron un mínimo de tres lavados en al menos 1 mi de medio STE para eliminar proteínas unidas de forma no específica. La elución se llevó a cabo mediante resuspensión de Ia matriz en medio STE conteniendo 20 mM glutation reducido. El método también es fácilmente adaptable a Ia purificación en columna, Io que facilita Ia purificación de Ia proteína a mayor escala.NaCI, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 5 mM DTT, 200 μM phenyl-metyl-sulphonyl fluoride) and were resuspended in 5 ml of STE medium. TO They were then used by sonication and the lysate was subjected to centrifugation for 15 minutes at 16,000 g at 4 0 C, to separate the soluble material from the insoluole. The recombinant protein was insoluble and was present in the precipitate, forming inclusion bodies. These inclusion bodies were washed by resuspension in STE medium and centrifugation several times, giving rise to the desired recombinant protein with a purity greater than 90%. To obtain purer protein, the inclusion bodies were solubilized by resuspension in 1 ml of STE medium containing 8 M urea and incubated therein, rotating for 30 minutes at 22 ° C. The non-solubilized material was removed by centrifugation at 16,000 g for 15 minutes. Denatured urea protein was renatured by rapid dilution, dropwise, of the urea solution in 25 ml of STE medium without urea, stirring after the addition of each drop. The final solution was centrifuged 15 minutes at 16,000 g at 4 0 C to remove insoluble protein. The soluble protein was purified by affinity chromatography on sepharose-linked reduced glutathione (BD) columns. The method used is known as the "bat" method (Fig. 1 B), in which chromatography columns are not used, but the protein-matrix binding is performed in solution, then collecting the matrix with the protein bound by centrifugation at 300 g for 30 seconds. The matrix used was Ia Glutathione uniflow resin, from BD (cat # 635610). Using 500 μl of resin suspension (50% resin) for every 50 ml of starting bacterial culture. The washings were performed by resuspension of the matrix in STE medium, gentle agitation by vortexing and subsequent centrifugation under the same conditions, eliminating the supernatant after each washing. A minimum of three washes were performed in at least 1 ml of STE medium to remove non-specific bound proteins. Elution was carried out by resuspension of the matrix in STE medium containing 20 mM reduced glutathione. The method It is also easily adaptable to column purification, which facilitates the purification of the protein on a larger scale.
La proteína purificada fue posteriormente dializada en buffer PBS para eliminar el glutation y se empleó para formar una emulsión con adyuvante de Freund.The purified protein was subsequently dialyzed in PBS buffer to remove glutathione and was used to form an emulsion with Freund's adjuvant.
5. Inmunización de conejos5. Immunization of rabbits
Las inmunizaciones de conejos New Zeland White se llevaron a cabo mediante Ia administración de una primera dosis mediante inyección subcutánea, en el dorso del conejo, de una emulsión que contenía 500 microlitros de adyuvante de Freund completo (Sigma F-5881) y 500 microlitros de solución de proteína (2 mg) en PBS. Las dosis de refuerzo se realizaron con una emulsión similar pero que contenía adyuvante de Freund incompleto (Sigma F-5506) en lugar del completo. Cada dosis se repartió en dos inyecciones en dos zonas distintas del dorso del conejo. Se realizaron cuatro inyecciones, separadas 21 días entre sí.Immunizations of New Zeland White rabbits were carried out by administering a first dose by subcutaneous injection, on the back of the rabbit, of an emulsion containing 500 microliters of complete Freund's adjuvant (Sigma F-5881) and 500 microliters of protein solution (2 mg) in PBS. Booster doses were made with a similar emulsion but containing incomplete Freund's adjuvant (Sigma F-5506) instead of the complete one. Each dose was divided into two injections in two different areas of the rabbit's back. Four injections were made, separated 21 days from each other.
6. Obtención del suero6. Obtaining serum
Se obtuvo sangre de los conejos, entre 5 y 10 mi en cada sangrado, a través de Ia vena de Ia oreja usando agujas de venoclisis (Venofix, Braun) y jeringuillas de volúmenes adecuados, recogiendo Ia sangre en tubos de extracción de sangre al vacío (Vacutainer, BD). La sangre se dejó coagular a 4°C durante varias horas. El suero se recogió con pipetas Pasteur, evitando el coágulo, y se limpió mediante centrifugación a 14000 g durante 1 minuto. Para su almacenamiento, se distribuyó en alícuotas en microtubos de 1.5 mi (Eppendorf) y se congeló a -2O0C. 7. Western blotBlood was obtained from the rabbits, between 5 and 10 ml in each bleeding, through the vein of the ear using venoclysis needles (Venofix, Braun) and syringes of adequate volumes, collecting the blood in vacuum blood collection tubes (Vacutainer, BD). The blood was allowed to clot at 4 ° C for several hours. The serum was collected with Pasteur pipettes, avoiding the clot, and cleaned by centrifugation at 14000 g for 1 minute. For storage, it was distributed in 1.5 ml aliquots in microtubes (Eppendorf) and frozen at -2O 0 C. 7. Western blot
Para los ensayos de inmunoadsorción, usando Ia técnica de western blot, se procedió a Ia electroforesis (SDS-PAGE) de muestras de diverso origen que contenían PSAP (mutantes de deleción de PSAP, fusionados a GFPJ y posterior transferencia a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF, BioTrace) usando un Mini Trans-Blot CeII de Bio-Rad. Tras Ia transferencia, las membranas se bloquearon en solución de bloqueo (PBS conteniendo 5% Tween-20 (Q-Biogene) y 0,5% leche desnatada en polvo (Central Lechera Asturiana)) durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación se añadió el antisuero anti-PSAP a distintas concentraciones. Para Ia mayoría de los ensayos, una dilución 1:5000 dio buenos resultados. La incubación con el antisuero se realizó durante al menos tres horas en Ia misma solución de bloqueo. Tras este tiempo, las membranas se lavaron varias veces con Ia misma solución, pero sin leche, y se incubaron posteriormente con anticuerpo secundario en solución de bloqueo durante al menos una hora a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario utilizado fue un anti-conejo, preparado en cabra, y conjugado a Ia peroxidasa del rabanito (horse-radish peroxidase, hrp), de Sigma (A- 0545), usado a una dilución 1 :5000. Las membranas se lavaron varias veces en solución de bloqueo sin leche y se procedió al revelado usando Ia técnica de ECL (enhanced chemiluminescence). Para ello se utilizó el ECL Plus Western Blotting Detection System de Amersham, siguiendo las instrucciones recomendadas por el fabricante. Las imágenes se obtuvieron empleando película Hyperfilm ECL de Amersham, observándose los mismos resultados para el antisuero anti-PSAP (Fig. 2A), que los obtenidos con anticuerpos monoclonales comercias anti-GFP (Fig.2B).For immunoadsorption assays, using western blot technique, electrophoresis (SDS-PAGE) of samples of diverse origin containing PSAP (PSAP deletion mutants, fused to GFPJ and subsequent transfer to polyvinylidene fluoride membranes) was carried out (PVDF, BioTrace) using a Bio-Rad Mini Trans-Blot CeII. After the transfer, the membranes were blocked in blocking solution (PBS containing 5% Tween-20 (Q-Biogene) and 0.5% skim milk in powder (Central Lechera Asturiana)) for 30 minutes at room temperature, then the anti-PSAP antiserum was added at different concentrations.For most of the tests, a 1: 5000 dilution gave good results.The incubation with the antiserum was performed for at least three hours in the same blocking solution After this time, the membranes were washed several times with the same solution, but without milk, and subsequently incubated with secondary antibody in blo solution queo for at least one hour at room temperature. The secondary antibody used was an anti-rabbit, prepared in goat, and conjugated to horseradish peroxidase (horse-radish peroxidase, hrp), from Sigma (A-0545), used at a 1: 5000 dilution. The membranes were washed several times in blocking solution without milk and developed using the ECL technique (enhanced chemiluminescence). For this, the Amersham ECL Plus Western Blotting Detection System was used, following the instructions recommended by the manufacturer. The images were obtained using Amersham Hyperfilm ECL film, observing the same results for the anti-PSAP antiserum (Fig. 2A), than those obtained with commercial anti-GFP monoclonal antibodies (Fig. 2B).
Ejemplo 2 Obtención de los fragmentos de PSAPExample 2 Obtaining the PSAP fragments
La SEQ ID 9 (MGAS), obtenida por síntesis química, es acetilada en su extremo amino, para bloqueo y eliminación de su carga eléctrica, y se han añadido dos aminoácidos (K y C) en el extremo carboxilo. El grupo carboxilo libre de C se ha bloqueado con un grupo amida. La C se ha añadido para unir el péptido covalentemente, usando el grupo SH, a Ia proteína carrier, que en este caso ha sido Ia hemocianina de Limulus polyphemus (LPH).SEQ ID 9 (MGAS), obtained by chemical synthesis, is acetylated at its amino end, for blocking and elimination of its electrical charge, and two amino acids (K and C) have been added at the carboxyl end. The free carboxyl group of C has been blocked with an amide group. The C has been added to bind the peptide covalently, using the SH group, to the carrier protein, which in this case has been the hemocyanin of Limulus polyphemus (LPH).
La SEQ ID 8 (EARA), obtenida por síntesis química, ha sido modificada en su extremo carboxilo mediante Ia adición de un grupo amida y el extremo amino se ha dejado libre para su conjugación a Ia proteína carrier (LPH).SEQ ID 8 (EARA), obtained by chemical synthesis, has been modified at its carboxyl end by the addition of an amide group and the amino end has been left free for conjugation to the carrier protein (LPH).
Inmunización de conejosRabbit Immunization
Con cada antígeno se inmunizaron dos conejos, siguiendo el siguiente protocolo: primera inmunización el día 1 , dosis de refuerzo los días 8, 15, 29 y 36. Sangrado y obtención del antisuero el día 43. Con el péptido MGAS se inmunizaron los conejos 95 y 96, generando los antisueros MGAS95 y MGAS96. Con el péptido EARA, los conejos 97 y 98, generando los antisueros EARA97 y EARA98.Two rabbits were immunized with each antigen, following the following protocol: first immunization on day 1, booster dose on days 8, 15, 29 and 36. Bleeding and obtaining the antiserum on day 43. With the MGAS peptide, rabbits were immunized 95 and 96, generating the MGAS95 and MGAS96 antisera. With the EARA peptide, rabbits 97 and 98, generating the EARA97 and EARA98 antisera.
Purificación de anticuerposAntibody purification
Las columnas de afinidad se prepararon mediante unión covalente de los péptidos a "CNBr-activated sepharose 4B" de Amersham Biosciences, siguiendo las instrucciones suministradas por el fabricante. Los anticuerpos purificados se conservaron a -2O0C en Tris-Glicina, pH 7,5; 250 mM Nací; 0,02% thimerosal. Las concentraciones de los anticuerpos purificados fueron las siguientes: MGAS95, 0,92 ml/ml; MGAS96, 0,86 mg/ml; EARA97, 0,32 mg/ml; EARA98, 0,38 mg/ml.Affinity columns were prepared by covalently binding the peptides to "CNBr-activated sepharose 4B" from Amersham Biosciences, following the instructions provided by the manufacturer. The purified antibodies were stored at -2O 0 C in Tris-Glycine, pH 7.5; 250 mM I was born; 0.02% thimerosal. The concentrations of the purified antibodies were as follows: MGAS95, 0.92 ml / ml; MGAS96, 0.86 mg / ml; EARA97, 0.32 mg / ml; EARA98, 0.38 mg / ml.
Condiciones del western blotWestern blot conditions
De los anticuerpos purificados, EARA 98 resultó ser el más efectivo siendo ensayado con muestras de corteza cerebral de rata y de Ia línea celular HEK293. Dada Ia localización de PSAP en Ia mitocondria, se aisló Ia fracción mitocondrial en ambos casos. El anticuerpo EARA98 reconoce específicamente a PSAP en las dos muestras estudiadas. En el caso de las células HEK293, es posible observar las dos isoformas de Ia proteína (PSAP-L y PSAP-S).Of the purified antibodies, EARA 98 proved to be the most effective being tested with samples of rat cerebral cortex and the HEK293 cell line. Given the location of PSAP in the mitochondria, the mitochondrial fraction was isolated in both cases. The EARA98 antibody specifically recognizes PSAP in the two samples studied. In the case of HEK293 cells, it is possible to observe the two isoforms of the protein (PSAP-L and PSAP-S).
Corteza Cerebral: Se sacrificó una rata Sprague Dawley mediante inhalación de CO2 y se diseccionó Ia corteza cerebral en PBS pre-enfriado (20 mM NaPO4 pH 7,4 ; 150 mM NaCI). El tejido se homogenizó en 10 volúmenes de medio de homogeneización (10 mM HEPES pH 7.4 ; 0.2 M manitol ; 0.07 M sacarosa ; 1 mM EDTA) con PMSF, con 10 pases de émbolo en homogeneizador tipo dounce.Cerebral Cortex: A Sprague Dawley rat was sacrificed by CO2 inhalation and the cerebral cortex was dissected in pre-cooled PBS (20 mM NaPO4 pH 7.4; 150 mM NaCI). The tissue was homogenized in 10 volumes of homogenization medium (10 mM HEPES pH 7.4; 0.2 M mannitol; 0.07 M sucrose; 1 mM EDTA) with PMSF, with 10 plunger passes in dounce type homogenizer.
Células HEK293: Se crecieron células HEK293 hasta 90 % confluencia en medio DMEM (SIGMA D5796) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (10500-064 de GIBCO) y 0.3 mg/ml de glutamina, 100 U/ml penicilina y estreptomicina (10378 de GIBCO). Las células se lavaron con PBS frío y se recogieron en 1 mi medio de homogeneización con PMSF. Posteriormente se homogeneizaron en dounce, con 10 pases de émbolo. Aislamiento de Ia fracción mitocondrial: Ambas muestras (corteza cerebral y HEK293) se centrifugaron 5 minutos a 800 g para eliminar el tejido o células no homogeneizados. El pellet fue descartado y se tomó una alícuota del sobrenadante, etiquetada como "Homogenado Total". El resto se centrifugó a 10,000 g durante 10 minutos para obtener, en el pellet, Ia fracción enriquecida en mitocondrias (Mito). El sobrenadante fue considerado fracción no mitocondrial (No Mit).HEK293 cells: HEK293 cells were grown up to 90% confluence in DMEM medium (SIGMA D5796) supplemented with 10% fetal bovine serum (10500-064 from GIBCO) and 0.3 mg / ml glutamine, 100 U / ml penicillin and streptomycin (10378 from GIBCO). The cells were washed with cold PBS and collected in 1 ml homogenization medium with PMSF. Later they were homogenized in dounce, with 10 plunger passes. Isolation of the mitochondrial fraction: Both samples (cerebral cortex and HEK293) were centrifuged 5 minutes at 800 g to eliminate the non-homogenized tissue or cells. The pellet was discarded and an aliquot of the supernatant was taken, labeled "Total Homogenated." The rest was centrifuged at 10,000 g for 10 minutes to obtain, in the pellet, the fraction enriched in mitochondria (Myth). The supernatant was considered a non-mitochondrial fraction (No Mit).
Western blot: La cantidad de proteínas totales en las muestras se cuantificó utilizando el método de Lowry. 20 microgramos de cada una de ellas fueron separadas mediante electroforesis SDS-PAGE en un gel del 10% de acrilamida durante 45 minutos a 180 V. Como marcador de peso molecular se utilizó el Kaleidoscope Prestained Standars (161-0324 de Bio- Rad). Posteriormente, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (BioTrace 66543) durante 1 hora a 100 V. La membrana fue bloqueada durante 1 hora a temperatura ambiente con solución de bloqueo [5 % leche en polvo en PBS-T (10 mM NaPO4 pH 7,4 ; 150 mM NaCI ; 0,05 % Tween-20)], y a continuación incubada 2 horas a temperatura ambiente con el anticuerpo primario EARA98 a una dilución 1:1.000 en solución de bloqueo. Posteriormente, se lavó Ia membrana con PBS-T (3 lavados x 10 minutos) y se incubó con el anticuerpo secundario goat anti-rabbit conjugado a HRP (A-0545 de SIGMA) durante 1 hora a temperatura ambiente a una dilución 1:5.000. Tras los lavados con PBS-T (3 x 10 minutos) Ia membrana fue revelada con el kit de quimioluminiscencia de Amersham (Amersham ECL Plus RPN2132). El tiempo de exposición fue de 3 minutos. Western blot: The amount of total proteins in the samples was quantified using the Lowry method. 20 micrograms of each of them were separated by SDS-PAGE electrophoresis on a 10% acrylamide gel for 45 minutes at 180 V. The molecular weight marker used was the Kaleidoscope Prestained Standars (161-0324 from Bio-Rad). Subsequently, the proteins were transferred to a PVDF membrane (BioTrace 66543) for 1 hour at 100 V. The membrane was blocked for 1 hour at room temperature with blocking solution [5% milk powder in PBS-T (10 mM NaPO4 pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05% Tween-20)], and then incubated 2 hours at room temperature with the primary antibody EARA98 at a 1: 1,000 dilution in blocking solution. Subsequently, the membrane was washed with PBS-T (3 washes x 10 minutes) and incubated with the goat anti-rabbit secondary antibody conjugated to HRP (A-0545 from SIGMA) for 1 hour at room temperature at a dilution of 1: 5,000 . After washing with PBS-T (3 x 10 minutes) the membrane was revealed with the Amersham chemiluminescence kit (Amersham ECL Plus RPN2132). The exposure time was 3 minutes.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Polinucleótido aislado capaz de codificar para polipéptidos con capacidad inmunogénica frente Ia proteína PSAP, seleccionado de cualquiera de los siguientes grupos: a. Polinucleótido que comprenda Ia SEQ ID 1 o un fragmento de Ia misma. b. Polinucleótido que comprenda Ia SEQ ID 7 o un fragmento de Ia misma. c. Polinucleótido que codifique para un polipéptido que al menos muestre un 90% de homología con cualquiera de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos anteriormente mencionados.1. Isolated polynucleotide capable of coding for polypeptides with immunogenic capacity against the PSAP protein, selected from any of the following groups: a. Polynucleotide comprising SEQ ID 1 or a fragment thereof. b. Polynucleotide comprising SEQ ID 7 or a fragment thereof. C. Polynucleotide encoding a polypeptide that shows at least 90% homology with any of the polypeptides encoded by the aforementioned polynucleotides.
2. Polipéptido aislado de Ia proteína PSAP incluyendo cualquiera de sus isorformas o fragmentos de Ia misma, seleccionado de cualquiera de los siguientes grupos: a. polipéptido que comprenda Ia SEQ ID 2 o un fragmento de Ia misma, b. polipéptido que comprenda Ia SEQ ID 8 o un fragmento de Ia misma, ó c. polipéptido que al menos muestre un 90% de homología con cualquiera de los péptidos mencionados en los apartados (a) o (b) de Ia presente reivindicación2. Polypeptide isolated from the PSAP protein including any of its isorforms or fragments thereof, selected from any of the following groups: a. polypeptide comprising SEQ ID 2 or a fragment thereof, b. polypeptide comprising SEQ ID 8 or a fragment thereof, or c. polypeptide that at least shows 90% homology with any of the peptides mentioned in sections (a) or (b) of the present claim
3. Proteína de fusión que comprende al menos un polipéptido según Ia reivindicación 2. 3. Fusion protein comprising at least one polypeptide according to claim 2.
4. Proteína de fusión según reivindicación 3, cuya secuencia comprende Ia SEQ ID 4.4. Fusion protein according to claim 3, the sequence of which comprises SEQ ID 4.
5. Vector que comprende cualquiera de los polinucleótidos de Ia reivindicación 1.5. Vector comprising any of the polynucleotides of claim 1.
6. Célula huésped transformada con un vector según Ia reivindicación 5.6. Host cell transformed with a vector according to claim 5.
7. Cebadores para Ia amplificación del polinucleótido SEQ ID 1 cuya secuencia es SEQ ID 5 o 6.7. Primers for the amplification of the polynucleotide SEQ ID 1 whose sequence is SEQ ID 5 or 6.
8. Método para Ia generación de anticuerpos específicos frente a PSAP que comprende Ia utilización de cualquiera de los polipéptidos de Ia reivindicación 2 como determinantes antigénicos.8. Method for generating specific antibodies against PSAP comprising the use of any of the polypeptides of claim 2 as antigenic determinants.
9. Método para Ia generación de anticuerpos específicos frente a PSAP que comprende Ia utilización de cualquiera las proteínas de fusión de las reivindicaciones 3-4.9. Method for generating specific antibodies against PSAP comprising the use of any of the fusion proteins of claims 3-4.
10. Anticuerpo obtenido según cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 8-9.10. Antibody obtained according to any of the methods of claims 8-9.
11.Anticuerpo capaces de interaccionar específicamente con cualquiera de los polipéptidos de Ia reivindicación 2.11. Antibody capable of interacting specifically with any of the polypeptides of claim 2.
12. Uso de los anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 10- 11 para su uso en el diagnóstico in vitro de enfermedades neurodegenerativas asociadas a Ia actividad de PSAP. 12. Use of the antibodies according to any of claims 10-11 for use in the in vitro diagnosis of neurodegenerative diseases associated with PSAP activity.
13. Uso de los anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 10- 11 para Ia elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas asociadas a Ia actividad de Ia proteína PSAP.13. Use of the antibodies according to any of claims 10-11 for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of neurodegenerative diseases associated with the activity of the PSAP protein.
14.Kit de diagnóstico que comprende Ia utilización de cualquiera de los anticuerpos de las reivindicaciones 10-11 14. Diagnostic kit comprising the use of any of the antibodies of claims 10-11
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