WO2007046538A1 - Rnaポリメラーゼの共通サブユニットをユビキチン化する方法 - Google Patents

Rnaポリメラーゼの共通サブユニットをユビキチン化する方法 Download PDF

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WO2007046538A1
WO2007046538A1 PCT/JP2006/321199 JP2006321199W WO2007046538A1 WO 2007046538 A1 WO2007046538 A1 WO 2007046538A1 JP 2006321199 W JP2006321199 W JP 2006321199W WO 2007046538 A1 WO2007046538 A1 WO 2007046538A1
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brca1
cells
ubiquitination
ubiquitin
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PCT/JP2006/321199
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Tomohiko Ohta
Wenwen Wu
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St. Marianna University School Of Medicine
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)

Definitions

  • the present invention relates to the field of RNA polymerase ubiquitination, and in particular to the function of BRCA1 to control ubiquitination.
  • BRCA1 a suppressor protein of breast cancer and ovarian cancer, acts as a hub protein in many cellular pathways that prevent cancer progression. Approximately 80% of the lifetime risk associated with breast cancer is due to mutations in this important gene in the germline (King et al., 2003). Thus, it is not difficult to imagine that down-regulation of this protein by other mechanisms causes sporadic breast cancer (Baldassarre et al., 2003; Catteau and Morris, 2002). All cells that are deficient in BRCA1 exhibit genomic instability as evidenced by DNA damage, the presence of chromosomal abnormalities, and heterozygosity at multiple loci (sensitivity to loss of 4).
  • BRCA1 is involved in many cellular pathways That is, with ubiquitin ligase (E3)
  • E3 ubiquitin ligase
  • BRCA 1 has the potential to interact with a number of protein substrates and, in many ways, affects cellular biological responses.
  • BRCA 1 contains the N RING finger domain, a common motif found in ubiquitin ligases.
  • BRCA 1 is another ring ring that is structurally similar to RING. Acquires important ubiquitin ligase activity when bound to the Nnger protein BARD1 (Baer and Ludwig, 2002; Brzovic et al., 2003; Chen et al., 2002; Hashizume et al., 2001; Mallery et al., 2002). Ubiquitin ligase catalyzes the formation of a polyubiquitin chain bound to a substrate protein via a peptide bond using ubiquitin molecules sequentially activated by enzymes E1 and E2 (Hershko and Ciechanover, 1998).
  • the most common polyubiquitin chain binds to Lys48 of ubiquitin in most cases and serves as a signal for rapid substrate degradation by the proteasome-dependent protein pathway (Chau et al., 1989).
  • BRCAl-BARDl has a special function that catalyzes the production of Lys6-binding polyubiquitin chains (Morris and Solomon, 2004; Nishikawa et al., 2004; Wu_Baer et al., 2003). These chains are recognized by the 26S proteasome in vitro, but not because of ⁇ but because they are sensitive to ubiquitin aldehyde and deubiquitinate (Nishikawa et al., 2004).
  • a deleterious missense mutation in the RING finger domain of BRCA1 found in familial breast cancer causes loss of BRCA1-BAED1 ⁇ 3 ligase activity (Brzovic et al., 2003; Hashizume et al., 2001; Ruffiier et al., 2001). This indicates that E3 ligase activity is important for its role as a BRCA1 tumor suppressor protein.
  • BRCA1 RNA polymerase II (pol ll) holoenzyme
  • pol ll RNA polymerase II
  • BRCA1 interacts specifically with the majority of the highly phosphorylated progressive ⁇ 110 (110) rather than the hypophosphorylated pol II dlA found in the promoter (Krum Et al. 2003).
  • BRCA1 is phosphorylated by ATM / ATR family monokinase (Cortez et al., 1999; ibbetts et al., 2000) and dissociates from the progressive pol II complex (Krum et al., 2003).
  • phosphorylated BRCA1 Works with Rad50-Mrell-Nbsl repair complex, or Rad51 or PCNA to repair damaged DNA (Scully et al., 1997b; Zhong et al., 1999).
  • BRCA1 has been proposed to bind to the pol 110 complex as part of the genome scanning function (Lane, 2004). However, even if this is the case, it has not been clarified how much BRCA1 affects the pol II complex during the initial stage after DNA damage and before BRCA1 enters the repair mechanism. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a method for ubiquitinating a common subunit of RNA polymerase, a method for inhibiting ubiquitination, and a method for establishing a cell susceptible to DNA damage.
  • the present inventor has found that the ring dimer (BRCA1-BARD1) of the ring finger protein BRCA1 and another ring finger protein BARD1 is common to various RNA polymerases. It was found that the subject to be submitted was ubiquitous. Further, the present inventor has found that the ubiquitination can be suppressed by mutating the amino acid sequence of the RNA polymerase subunit. Furthermore, it has been found that such inhibition of ubiquitination confers sensitivity to the DNA damage environment caused by ultraviolet rays (UV). The present invention has been completed based on such findings. That is, the present invention is as follows.
  • a method for ubiquitination of a common subunit of the RNA polymerase which comprises converting the RNA polymerase to BRCA1-BAED1.
  • RNA polymerase A common subunit of RNA polymerase is RPB8.
  • a method for treating cancer comprising bringing RNA polymerase into contact with BRCA1-BARD1.
  • the above-mentioned cancer treatment utilizes the point that anti-cancer activity is imparted in vivo by ubiquitination of the common subunit of the RNA polymerase.
  • a pharmaceutical composition comprising BRCA1-BARD1.
  • the medical difficult product of the present invention is used for the treatment of cancer. Brief description of the drawings
  • Figure 1 shows the results of screening for proteins that are affected by epilubicin treatment.
  • T47D cells panels A and B and HCC1937 cells (panels C and D) were either not treated at all or treated with 0.2 g / ml of epilubicin for 3 hours and lysed in a buffer containing 7M urea / 2M thiourea, respectively.
  • Cells not treated with Ebirubishin labeled respectively Oyopi protein from cells treated with Epirubishin (50 ⁇ ⁇ ) fluorescent dye Cy3 (panels A and C) and Cy5 (panels B and D).
  • the labeled samples were mixed together, separated with 2D genoles (pH range 3-10 from left to right), and scanned with a fluorescence image analyzer.
  • the yellow arrow indicates a protein spot, and the level of the spot was greatly changed by the treatment with epirubicin.
  • the red arrows indicate proteins that were significantly reduced only in T47D cells by epilubicin treatment.
  • the protein that migrated slowly was identified as RPB8, and the protein that migrated rapidly was identified as the myosin light chain.
  • '' Fig. 2 shows the result of immunoblotting after RPB8 modification after epilubicin treatment.
  • T47D cells or HCC1937 cells were either untreated (control) or treated with 0.2 g / ml of epilubicin for 3 hours and lysed in a buffer containing 7M urea / 2M thiourea, respectively. Lysates (500 mu [delta]) were separated by 2D gel ( ⁇ ⁇ 3-10). A part of the gel was subjected to immunoblotting with an anti-RPB antibody. The arrow indicates RPB8.
  • FIG. 3 shows the results of immunoblotting for the interaction of RPB8 with BRCA1-BARD1 using immunoplotting with anti-RPB8 antibody or anti-tubulin antibody.
  • RPB8 interacts with BRCA1-BARD1.
  • a predetermined plasmid was transfected into 293T cells.
  • ⁇ Tabs lysates (upper 3 panels) or immunoprecipitates (lower 3 panels) were subjected to immunoblotting using a given antibody.
  • the anti-HA / Myc antibody is an anti-HA antibody and specifies immunoprotting followed by reprobing with the anti-Myc antibody.
  • Endogenous RPB8 interacts with BAED1.
  • Cell lysate prepared from a given cell line is immunoprecipitated using anti-RPB1 antibody, anti-RPB8 antibody, or pre-immune rabbit serum (Pre) for anti-RPB8, and immunoblotting using the given antibody is performed. Analyzed more.
  • His-BARD 114 (4 ⁇ g) was mixed with 4 GST or GS RPBS, incubated with dartathione beads for 2 hours, and then washed thoroughly. Proteins bound to the beads were separated by SDS-PAGE and stained with Sypro Ruby.
  • RPB8 interacts with BRCA1 after UV irradiation.
  • MCF10A cells are untreated (lane 1), or 5 minutes (lane 2), 10 minutes (lane 3), 60 minutes (lane) after UV irradiation (35 J / m2). 4) or after 360 minutes (lane 5) was used.
  • the arrow indicates the modified form of BRCA1, and the arrowhead indicates the normal position of BRCA1 in straight immunoplotting.
  • Asterisk Non-specific reaction product.
  • T47D cells were untreated (lane 1) or collected 10 minutes after UV irradiation (35 J / m 2 ) (lanes 2 and 3). Cell lysates immunoprecipitated with anti-RPB8 antibody (lanes 1 and 2) or an antibody obtained from a pre-immunized animal (lane 3) were analyzed by immunoplotting with a predetermined antibody.
  • T47D cells were transfected with either control siRNA (lanes 1-3) or BRCA1 siRNA (lanes 4-6). Cells are Mock-treated 1 and 4), or those collected 10 minutes (lanes 2 and 5) or 60 minutes (lanes 3 and 6) after UV irradiation (35 J / m 2 ). ⁇ Tapid lysates (top two panels) or anti-RPB8 antibody immunoprecipitates (bottom two panels) were analyzed by immunoplotting using the given antibodies.
  • FIG. 4 shows the results of immunoplotting of RPB8 for ubiquitination and stabilization by BRCA1-BARD1 in vivo.
  • D In 293T cells, a plasmid encoding FLAG-RPB8 (0.2 g) and an empty pcDNA3 vector (2 g, upper panel) or Myc-BRCAl 1 772 and HA-BARD1 plasmid (1 ⁇ , lower panel, respectively) ) Transfected one of these. The cells were incubated in cyclohexamide (10 ⁇ ) and followed for a predetermined time. The cell lysate was then immunoplotted using an anti-FLAG antibody.
  • IgG Figure 5 shows BRCA1-dependent polyubiquitin of RPB8 in response to UV irradiation It is a figure which shows the result of having carried out the immune plotting about crystallization.
  • HeLa cell line that stably expresses wild type (lanes 1-3) or 5KR mutant of FLAG-RPB8 (lanes 4-6) is irradiated with UV (35 J / m 2 ) It was collected.
  • the ubiquitinated RPB8 was detected by the same method as shown in Fig. 4A, except that an anti-ubiquitin antibody was used for immunoplotting (upper panel).
  • the membrane was reprobed with anti-RPB8 antibody (lower panel).
  • B HeLa cell line that stably expresses wild-type FLAG-RPB8 infected with control siRNA (lane 1) or BRCA1 siRNA (lane 2) transfection, or retrovirus expressing control shRNA (lane 3), Alternatively, infection with a retrovirus expressing shRNA for BRCA1 (lane 4) was performed. Cells were then UV irradiated (35 J / m 2 ) and harvested 10 minutes after irradiation. Boil cells in 1% SDS buffer and use either anti-BRCA1 antibody (upper panel) or anti-tubulin antibody (middle panel), immunoblotting, or RPB8 ubiquitination using the same method as A For detection (lower panel). '
  • FIG. 6 shows the construction of a ubiquitin-resistant RPB8 mutant and the results of its RNA polymerase activity test.
  • RPB8 mutant construct A: RPB8 mutant construct. 'As shown, the Lys (K) residue of RPB8 was replaced with an Arg (R) residue.
  • B Myc-BRCA1 1 772 , BARD1, HA ubiquitin was cotranfected into either 293T cells using wild-type or mutant FLAG-RPB8. Polyubiquitination of RPB8 was detected by the same method as shown in FIG. 4A.
  • IP immunoprecipitate
  • IB immunoblotting
  • asterisk IgG
  • Figure 7 shows that ubiquitin resistant RPB8 causes UV sensitivity.
  • A Cell lysates from two clones of HeLa cells stably expressing either wild-type (WT1 and WT2) or 5 RPB8 mutants (5KR-1 and 5KR-2), and HeLa cells The cell lysate obtained from the parent strain was immunoprecipitated using an anti-RPB8 antibody, followed by immunoblotting using the anti-RPB8 antibody.
  • HeLa cell line indicated by A was irradiated with UV at a predetermined dose. 48 hours after irradiation, cell viability was measured by trypan blue exclusion. The number of cells at 0 hours (shown as 0 J / m2) is taken as 100%. Shown are the average and SD values of the measurements made in triplicate. At least two experiments were repeated with similar results. '
  • C and D Cellular viability of a given HeLa cell before (cont., Left panel) or after 48 hours (UV, right panel) of 35 J / m2 UV observation (C) or Lillie's Observation was either with crystal violet staining (D).
  • Figure 8 shows that ubiquitin-resistant RPB8 induces long-term hyperphosphorylation of RPB1 after UV irradiation after UV irradiation.
  • HeLa cells stably expressing either wild type or 5FLAG mutants of FLAG-RPB8 were irradiated with UV (35 J / m2) and cultured for a predetermined time.
  • the immunoprecipitate (bottom two panels) of anti-FLAG antibody generated from the rice culture (upper two panels) or an equal volume of the rice husk lysate is used for immunoblotting using a specific antibody. did.
  • RPB8 Protein screening identified RPB8 as a modified protein in BRCA1 positive 14 cells after epilubicin treatment.
  • RPB8 interacted with the BRCA1-BARD1 complex, was sensitive to RNAi-induced BRCA1 knockdown, and was polyubiquitinated shortly after UV irradiation.
  • RPB8 retained its polymerase activity but was no longer ubiquitinated.
  • the HeLa cell line which is stably expressed as this ubiquitin-resistant form of RPB8, was sensitive to UV and prolonged RNA polymerase II phosphate after UV-induced DNA damage.
  • the method for converting RNA polymerase to BRCA1-BARD1 is not particularly limited, and RNA polymerase may be allowed to act on BRCA1-BARD1 obtained from the BRCA1-BARD1 expression plasmid by genetic engineering techniques.
  • the working conditions of RNA polymerase can be determined by those skilled in the art. For example, there is a method of reacting with an appropriate buffer at 37 degrees for 1 hour or more.
  • the cell is sensitive to the DNA damage. Sex can be imparted.
  • a method for producing a cell imparted with sensitivity to such a DNA damage environment is also included in the present invention.
  • the type of cells to be used is not particularly limited, and examples include various cells such as normal cells and cancer cells.
  • the cell is preferably derived from a mammal.
  • Mutations in the amino acid sequence can be made using conventional site-directed mutagenesis that introduces mutations into the DNA that encodes them.
  • mutation introduction kits using site-directed mutagenesis methods such as Kunkel method and Gapped duplex method, specifically QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System ( Manufactured by Invitrogen Corporation), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: Takara Bio, etc.).
  • BRCA1 is a tumor suppressor gene for breast cancer and ovarian cancer, and is one of the most important genes in the field of breast cancer research. BRCA1 also acquires high ubiquitin ligase activity when it forms a RING heterodimer (complex) with BARD1. Target disruption of the mouse ⁇ Src gene results in centrosome overamplification and genomic instability. BRCA 1 localizes to the centrosome during mitosis. BRCA1 has also been reported to bind to y-tubulin.
  • BARD 1 was identified as a RING finger protein that binds to BRCA1 (BRCA1 associated Rin Domainl).
  • BRCA1 and ⁇ BARD1 bind to each other to form a complex and form a dimeric ubiquitin ligase to RING.
  • This ligase is caused by a missense mutation in BRCA 1 that causes familial breast cancer. The activity is completely deactivated.
  • BRCA1-BARD1 regulates various cellular processes such as DNA repair, cell cycle progression and centrosome replication.
  • NPM nucleophosmin
  • BRCA1 and BARD1 are present in the nucleus other than the nucleolus. In the mitotic phase, they turn into nuclei and centrosomes (spindles) near the pituitary.
  • the thymidine-nocodazole block puts the cell cycle in division Tests with synchronized HeLa cells have revealed that NPM is polyubiquitinated in a short period from the mitotic phase to the G1 phase.
  • Rabbit polyclonal antibodies against the C-terminus of BAED1 can be prepared and used to observe intracellular localization during the cell cycle and NPM.
  • Cell cycle synchronization can be monitored by flow cytometry, and NPM ubiquitination in ⁇ w'ra can be assessed by IP-Western analysis.
  • polyubiquitin chains catalyzed by BRCA1-BAED1 are Lys- 6- linked ubiquitin chains rather than the traditional Lys- ⁇ s-linked chains that function as protein signals by the 26S proteasome.
  • 2.3 is de Yubikichin by force 3 ⁇ 46S proteasome.
  • NPM is also ubiquitinated and stabilized by BRCA1-BARD1 in i rao, but this ubiquitination does not function as a 26S proteasome-dependent protein signal.
  • the base sequence of the gene encoding BRCA1 used in the present invention is shown in SEQ ID NO: 6, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the base sequence of the gene encoding BAED1 is shown in SEQ ID NO: 8, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 9.
  • BRCA1 and BARD1 used in the present invention are not limited to those having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 8, but may be a coding region or a part thereof.
  • the BRCA1 coding region is, for example, the region 195-2294 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the BARD1 coding region is the region 74-2407 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • a gene encoding a protein that hybridizes under stringent conditions with a sequence complementary to these base sequences and has an activity to ubiquitinate RPB8 is also included.
  • Stringent conditions refers to a salt concentration of 100 to 500 mM, preferably 150 to 300 mM, and 50 to 70 at the time of washing in hybridization.
  • the base sequence having at least 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 97% or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 8 Can also be used in the present invention.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 9 one or several amino acids are deleted, substituted, or added, or a combination thereof:
  • a protein having a mutated amino acid sequence and having an activity to ubiquitinate RPB8 can be used.
  • an amino acid sequence for example, (i) 1 to 9 (for example, 1 to 5, preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 9 are deleted.
  • amino acids are added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 9, (iv ) An amino acid sequence mutated by the combination of (i) to (iii) above.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 9 one or several amino acids are substituted ⁇ , and it is desirable to substitute an amino acid having a property similar to that of the amino acid before substitution. Therefore, for example, substitution between amino acids with similar properties, such as acid amino acids or salts
  • the number and position of amino acids to be substituted are not particularly limited.
  • a protein having at least 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more identity (homology) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 9. can also be used in the present invention. Furthermore, it is also possible to use a partial sequence of these amino acid sequences.
  • a mutation introduction kit using a site-directed mutagenesis method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, for example, QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagenene: h), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: Takara Bayone: fc), etc.
  • BRCA1-BARD can be obtained by expressing a gene encoding each protein to produce a protein and mixing them.
  • BRCA1 and O3 ⁇ 4ARD can also be revealed.
  • NPM is a substrate for BRCA1-BARD1 ubiquitin ligase. All cells have various biological activities such as ribosome biosynthesis, apoptosis inhibition, and histone chaperone function.
  • Nucleophosmin includes, for example, nucleophosmin / B23 / N038 (NPM).
  • ubiquitination means rapid and reversible post-translational modification of intracellular proteins by polyubiquitin chains, and includes ubiquitin activating enzyme (El), ubiquitin conjugating enzyme (El Enzymes such as E2) and ubiquitin ligase (E3) cooperate to bind ubiquitin to the substrate protein one after another.
  • El ubiquitin activating enzyme
  • El Enzymes such as E2
  • E3 ubiquitin ligase
  • This process begins with the formation of a thiol ester bond between E1 and the C-terminus of Ub, and then Ub is transferred to Cys, the active site of E2.
  • the formation of a peptide bond between the C-terminus of Ub and the lysine residue of the substrate involves a protein or protein complex known as E3.
  • E3 recognizes E2 and promotes the transfer of Ub from the E2 force to the substrate.
  • E3 plays an important role in catalyzing the formation of the Ub molecular chain on the substrate and is very important in recognition by the p3 theasome.
  • Ubiquitin a 76-residue polypeptide, performs essential functions in eukaryotes through covalent bonds with other intracellular proteins.
  • the most characteristic role in this modification is to target Lys-48 on ubiquitin after the transfer of at least four ubiquitin chains of the unit by the 26S proteasome. Via ubiquitin-ubiquitin connection. This is called polyubiquitination.
  • polyubiquitination In recent years, it has been reported that one ubiquitin is added to one protein site (monoubiquitination) or one ubiquitin is added to multiple protein sites (multiubiquitination).
  • RNA polymerase means an enzyme that synthesizes mRNA in the 5 ′-> 3 ′ direction using a DNA strand as «.
  • RNA polymerases include naturally occurring RNA polymerases and mutant enzymes having the activities described above. For example, RNA polymerase I, RNA polymerase II, and RNA polymerase ⁇ .
  • RNA polymerase I RNA polymerase I
  • RNA polymerase II RNA polymerase II
  • RNA polymerase III RNA polymerase III
  • DNA damage environment refers to any environment that undergoes structural changes that occur in DNA molecules due to 3 ⁇ 4l ⁇ line, etc., ie, DNA synthesis, transcription from DNA to RNA, and subsequent protein translation. Is an environment in which RNA polymerase inactivation, DNA polymerase inactivation, DNA ligase inactivation, nucleotide excision repair function suppression, DNA methylation, etc. occur.
  • RNA damage environments include ultraviolet (UV) irradiation, X-ray irradiation, chemical substances, and active oxygen.
  • UV ultraviolet
  • X-ray irradiation examples of such DNA damage environments
  • active oxygen examples of such DNA damage environments.
  • Ubiquitination of RNA polymerase common subunit by BRCA1-BARD1 BRCA1 functions biochemically as a ubiquitin ligase, but its biological significance is not well known, especially in DNA damage reactions.
  • the present inventor has identified the mechanism underlying UV sensitivity in BRCA1-deficient cells.
  • BRCA1 which ubiquitinates RPB8
  • the result is a DNA damage reaction Not only emphasizes the importance of ubiquitin ligase activity of BRCA1 in, but allows further analysis of the role that RNA polymerase plays in carcinogenesis.
  • the results of the present inventors can be applied clinically and lead to successful cancer treatment by providing a means for predicting the sensitivity of breast cancer to anticancer agents that cause DNA damage.
  • BRCA1 is localized in the foci of dispersed nuclei during S phase. After DNA damage, BRCA1 is phosphorylated by ATM / ATR family monokinase (Cortez et al., 1999; Tibbetts et al., 2000) and BRCAl foci is dispersed in 30 minutes (Scully et al., 1997b). These foci gradually reassociate to different foci, where BRCA1 cooperates with Rad50-Mrell-Nbsl complex (Zhong et al., 1999) or Rad51 and PCNA (Scully et al., 1997b) to repair damaged DNA. To do.
  • Foci begins to be observed approximately 1 hour after the occurrence of DNA damage, reaches a peak after 6 to 8 hours, and remains up to 12 hours after damage (Zhong et al., 1-99).
  • the S-phase foci is progressive, composed of BRCA1, and consists of highly phosphorylated pol II, which dissociates upon DNA damage (Krum et al., 2003).
  • Pol II plays a very important role in the transcription-coupled DNA repair pathway. Pol II quickly recognizes damaged DNA sites and signals the presence of damage by staying at that site. Pol II is CSA (Cockayne syndrome group A) and CSB (Cockayne syndrome group B), followed by TFIIH (Transcription factor II H), and XPG (pigmentary pigmentosis). (xeroderma pigmentosum) G group gene product), XPF (xeroderma pigmentosum group F gene product), and ERCC1 excision repair cross-complementing rodent repair denciency 'complementation group 1) ⁇ (van den Boom et al., 2002). In intact cells, the highly phosphorylated form of pol II is then dephosphorylated for incorporation into a new region of the pre-initiation complex.
  • BRCA1 associates with the progressive pol II complex (Krum et al., 2003), it is thought to exist with the pol II complex when the pol II complex remains in the cell. Thus, BRCA1 appears to function as a DNA damage sensor (Lane, 2004). However, after DNA damage, before BRCA1 dissociates from S phase foci (retained pol II Early-stage phenomena (including the role of BRCA1 for) were not clear. In the present invention, BRCA1 force is shown to polyubiquitinate RPB8, which is an element of the pol II complex, at an early stage after this DNA damage. The timing of this phenomenon coincides with the period before BRCA1 dissociates from the remaining pol II.
  • a ubiquitin-resistant mutant of RPB8 can form active RNA polymerase, but remained bound to the highly phosphorylated form of RPpi for 6 hours after UV irradiation.
  • Cells lacking BRCA1 function are well known to be sensitive to a range of DNA damaging agents, including IR and UV irradiation (Abbott et al., 1999; Venkitaraman, 2002). However, the mechanism underlying this phenomenon is not fully understood.
  • This mechanism may be characterized by a lack of checkpoint function, which may cause susceptibility, but selective suppression of the S-phase checkpoint and the selective suppression of the G2 checkpoint itself are also responsible for cell survival after DNA damage. It has been reported that this is not attributable to a decline in the rate (Xu et al., 2002a; Xu et al., 2002]). Thus, it has been proposed that several functions other than the cell phase regulatory function of BRCA1 during S phase or G2 phase may affect cell viability after DNA damage (Xu et al., 2002b).
  • RPB8 ubiquitination is caused by BRCA1 and is thought to have the effect of stopping transcription during DNA damage and preventing cell apoptosis.
  • the DNA is sensitive to IR and UV irradiation, and the RPB8 ubiquitin-resistant strain (ie, a mutant that does not undergo ubiquitination) is also UV sensitive. Is shown. This result may indicate that RPB8 ubiquitin via BRCA1 is involved in UV resistance in cells.
  • RPB1 and RPB8 can be temporarily and simultaneously ubiquitinated by BRCA1, which can result in dissociation of the pol II holoenzyme from the site of DNA damage. Supporting this is that RPB1 interacts directly with RPB8 in the pol II complex (Cramer et al., 2001). Late stage RPB1 ubiquitination and degradation may be mediated by other E3 ligases such as Rsp5 (Huibregtse et al., 1997) (Bea denon et al., 1999). NCBI database:
  • RPB8 amino acid sequence substitution of 5 Lys residues with Arg residues causes susceptibility to DNA damage, although the expression level is small compared to the endogenous wild-type protein. Therefore, RPB8 SNPs may cause mild genetic instability leading to cancer. These SNPs can also cause susceptibility to anticancer drugs. The clinical relevance of these SNPs for their ability to ubiquitinate is one of the most important matters to be clarified.
  • RPB8 is common to all three classes of RNA polymerase (Briand et al., 2001; Shpakovski et al., 1995).
  • pol II synthesizes only about 5% of the total RNA
  • pol I and pol III are the remaining 95% of the total RNA rRNA, tRNA, and all untranslated short chains Synthesize RNA. Therefore, modification of these complexes may have a huge impact on cellular conditions, rather than pol II. For example, recent studies have revealed an important role for transcription by pol III, (White, 2004) in cancer development.
  • RPB1 has been actively studied, the role of RPB8 in the DNA damage response is often unknown.
  • ubiquitination of RPB8 mediated by BRCA1 provides further evidence for the role of RNA polymerase in carcinogenesis, both in response to DNA damage or non-damage, and to BRCA1 cancer. New knowledge on the suppression function.
  • the present invention can be used in the field of apoptosis and transcriptional regulation by RNA polymerase ubiquitin, and by controlling the ubiquitination of RPB8 via BRCA1, it changes the sensitivity of cells to DNA damage. It is useful in that it can be used for the treatment of cancer with drugs that cause DNA damage.
  • the present invention includes BRCA1-BARD1, or a gene encoding BRCA1-BARD,
  • the present invention relates to a method for treating cancer, and a medical difficulty for treating cancer.
  • BRCA1-BAED1 suppresses cancer by ubiquitinating RPB8. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention is used for treating cancer.
  • diseases to which the medical product of the present invention is applied include cell proliferative diseases such as cancer.
  • the disease may be a single case or a combination of multiple diseases.
  • the type of cancer is not particularly limited, and brain cancer, tongue cancer, pharyngeal cancer, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, stomach cancer, intractable cancer, biliary tract cancer Gallbladder cancer, duodenal cancer, large cancer, liver cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, renal cancer, bladder cancer, rhabdomyosarcoma, fibrosarcoma, osteosarcoma, chondrosarcoma, skin cancer, various leukemias (eg acute Myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, adult T-cell
  • leukemias eg acute Myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, adult T-cell
  • the cancer may be the primary lesion, metastasis, or other disease. '
  • the medical composition of the present invention is used in such a form that BRCA1-BAED is taken into cells in the affected area or cells of the target tissue.
  • the administration form of the medical difficult product of the present invention can be either oral or parenteral.
  • oral administration it can be administered in an appropriate dosage form, eg 'tablets, pills, dragees, capsules,' solutions, gels, syrups, slurries, suspensions.
  • parenteral administration »dosage forms (for example, those using a nephriser, etc.), nasal administration forms, administration forms (eg, ointments, creams), injection forms and the like can be mentioned.
  • 3 ⁇ 4lt dosage form it can be administered directly or indirectly to the affected area, for example, by intravenous or intramuscular injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, or the like.
  • BRCA1-BARD1 may be used in the form of expressing BRCA1 and BAED, or may be used as a fusion gene so as to encode the BRCA1-BARD1 complex.
  • the above vectors include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, henorepesui / res vector, vaccinia vinores vector, retrowinore vector There are lentiviral vectors, etc., and these viral vectors can be used for efficient administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention into a phospholipid endoplasmic reticulum such as a ribosome and administer the endoplasmic reticulum.
  • the endoplasmic reticulum holding the medical product of the present invention is introduced into a predetermined cell by the lipolysis method. Then, the obtained cells are systemically administered, for example, intravenously or from an artery. It can also be administered locally to the brain or the like.
  • a commercially available gene introduction kit for example, Adeno Express: Clontech
  • lipids to form the ribosome structure generally phospholipids are preferred, and phosphatidylcholine, phosphatidinoserine, phosphatidinoregliceronore, phosphatidino Examples thereof include natural phospholipids such as reinositonoreth, phosphadylethanolamine, phosphatidic acid, cardiolipin, sphingomyelin, egg yolk lecithin, soybean lecithin, lysolecithin, and hydrogenated substances according to a conventional method. Dicetyl phosphate, distearoyl phosphatidylcholine, dipalmitoyl phosphatidylcholine, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine,. Synthetic phospholipids can be used.
  • the method for producing the liposome is not particularly limited as long as the gene is retained, and a conventional method such as a reverse phase evaporation method (Szoka, F et al., Biochim. Biophys. Acta, Vol. 601 559 ( 1980)), ether injection method (Deamer, DW: Ann. NY Acad. Sci., Vol. 308 250 (1978)), surfactant method (Brunner, J et al .: Biochim. Biop. Acta, Vol. 455 322 (1976)) and the like.
  • a reverse phase evaporation method Szoka, F et al., Biochim. Biophys. Acta, Vol. 601 559 ( 1980)
  • ether injection method Deamer, DW: Ann. NY Acad. Sci., Vol. 308 250 (1978)
  • surfactant method Brunner, J et al .: Biochim. Biop. Acta, Vol. 455 322 (1976)
  • Lipids containing these phospholipids can be used in warworms, but two or more can be used in combination.
  • the binding rate of electrically negative genes can be increased by using a substance having a proton group in the molecule such as ethanolamine or choline.
  • additives such as cholesterols, stearylamine, and ⁇ -tocopherol, which are generally known as additives for liposome formation, can also be used.
  • Membrane fusion-promoting substances such as Sendai virus, inactivated Sendai virus, membrane fusion-promoting protein purified from Senda virus, polyethylene dalcol, etc. can be added.
  • the medical composition of the present invention may be formulated according to a conventional method and may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a carrier may be an additive, such as water, pharmaceutically acceptable organic solvent, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, carboxymethyl cellulose sodium, poly Sodium acrylate, sodium anoleate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol Vaseline, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose, and surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • the additive is selected from among the above-mentioned insects according to the type of treatment of the present invention;
  • the purified BRCA1 BARD or its gene is dissolved in a solvent (for example, physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.), and then ween80, Tween 20, gelatin, human serum Those added with albumin or the like can be used.
  • a solvent for example, physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • ween80, Tween 20, gelatin, human serum Those added with albumin or the like can be used.
  • it may be freeze-dried to obtain a dosage form that dissolves before use.
  • lyophilization excipients include the following.
  • sugars such as mannitol, glucose, ratatoose, sucrose, mannitol, sorbitol, starch such as corn, wheat, rice, potato or starch derived from other plants, methylcellulose, hydroxypropyl methylcellulose or carboxymethylcellulose sodium, etc.
  • collapsing or solubilizing agents such as cross-linked polyvinyl pyrrolidone, agar, alginic acid or a salt thereof (for example, sodium alginate) can be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on age, sex, symptom, administration route, administration frequency, and dosage form.
  • the administration method is appropriately selected according to the patient's age and symptoms.
  • An effective dose is an amount that reduces the signs or conditions of the disease.
  • the therapeutic effect of the pharmaceutical composition is cell culture Or standard pharmacological procedures in laboratory animals, eg ED50 (therapeutically effective use in 50% of the group *), or use that is lethal to 50% of the LD50 group :! ) Can be determined.
  • the dose ratio between therapeutic and toxic effects is healing; it is a number and can be expressed as ED50ZLD50.
  • the dosage of the medical difficulty and the composition of the present invention is, for example, 0.1 ⁇ g to 100 mg, preferably 1 to LO g per 1 k body weight at a time. However, the above treatment is not limited to these doses.
  • the dose of adenovirus administration is 10 6 to once per day: about 13 L0, and is administered at intervals of 1 to 8 weeks.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not limited to these doses.
  • 2D-DIGE analysis was performed according to the instruction manual (Amersham). In other words, either lep, cells or treated cells were collected by treatment with epirubicin, and either one of them was collected and washed with cold washing buffer (10 mM Tris-HCl ( ⁇ 8 ⁇ 0), 5 mM MgAc). The sample was solubilized by sonication in lysis buffer (7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 30 mM Tris-HCl (pH 8.0)). Solubilized solution was 12,000 g, 4 °.
  • IPG isoelectric focusing gel
  • IPG strip 6M urea, 30% glycerol, 2% SDS, 0.05 M
  • the solution was digested with Tris-HCl (pH 8.0) and 0.5% DTT for 15 minutes, and blocked by replacing DTT with a buffer containing 4.5% chloroacetamide.
  • the target protein was separated by 12.5% polyacrylamide gel (SDS-PAGE) o 2D separation gel was scanned using Typhoon 9400 (registered trademark) Image Analyzer (Amersham). Protein spots significantly different between the control sample and the epilubicin-treated sample were identified by Decyder® version 5.01 software (Amersham) using the mixed protein labeled with Cy, 2 as an internal standard.
  • the full length cDNA of human RPB8 was amplified by PCR from the HeLa cell cDNA library using P & polymerase (Stratagene). The amplified full-length cDNA of human RPB8 was subcloned in frame into pcDNA3 vector having a FLAG tag at the N-terminal side or 6 pGEX vector having a GST tag at the N-terminal side.
  • pcDNA3 vector having a FLAG tag at the N-terminal side
  • 6 pGEX vector having a GST tag at the N-terminal side.
  • Known mammalian expression plasmids for BRCA1, BAED1, ubiquitin, and mutants thereof were used (Hashizume et al., 2001; Nishikawa et al., 2004).
  • a point mutation was introduced in which the Lys residue of RPB8 was replaced with an Arg residue by site-specific mutation (Stratagene). All plasmids used were sequenced by DNA sequencing.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium
  • DMEM with normal human epithelial cells MCF10A supplemented with 2.5% fetal calf serum, 100 ng ml cholera toxin 20 ng / ml EGF, 500 ng / ml hydrocortisone, 10 g / ml insulin, and 1% antibacterial-antifungal agent Growing in / Ham's F12 (1: 1) medium.
  • Respect Epirubishin treatment bleb predetermined time incubated at Epirubishi emissions (Pfizer) containing medium 0.2 ⁇ ⁇ / ⁇ .
  • Pfizer Epirubishi emissions
  • 293T cells were tranfected using standard calcium phosphate precipitation. For each transfection, the total plasmid DNA amount was adjusted to the same amount by adding pcDNA3 empty vector.
  • pcDNA3 encoding each protein was used with HeGEN cells using FuGENE6 (Roche) (Roche). Transformed. '
  • the cell suspension was diluted, seeded and selected with 0.5 mg / ml G418. After two weeks of culture, transformant colonies were obtained and the cloned cells were further expanded and maintained at 0.25 mg / ml G418.
  • UV irradiation experiments the cells were washed with PBS, irradiated with UV light (254 nm; UVP Inc, Upland, Calif.) At a predetermined dose, and cultured in a batch medium for a predetermined period. Cell viability was measured by phase contrast observation, Triban blue exclusion method, or Lillie's crystallographic bioret staining.
  • HA (12CA5, Boehringer, Mannheim).
  • Myc (9E10, BabCo), FLAG (M2, Sigma), Ubiquitin (FK1, AffinitiX Phospho-S5 RPB1 (H14, COVA CE), o- and ⁇ -tubulin (DMIA + BMIB , Neomarkers), and mouse monoclonal antibodies against actin (C2, Santa Cruz), and rabbit antibody polyclonal antibodies against BRCA1 (C20, Santa Cruz) and RPB1 (8WG16, COVANCE) were purchased commercially.BAED1 and RPC155 each ⁇ heron polyclonal antibodies to have been re-Chiya one mode. Bear Dr. (Dr. Richard Baer) and cold spring Harbor Laboratory of Noria Hernandez Dr. (Dr.
  • the SMART pool® BRCA1 siRNA mixture and the control siRNA mixture were purchased from Dharmacon Research, Inc. Double-stranded RNA (final concentration 50 nM) was tranfected into cells using OHgofectamine® (Invitrogen) according to the instructions for use.
  • the pSINsi-hU6 retroviral vector previously subcloned was cotransfected into 293T according to the instruction manual (TaKaRa).
  • the supernatant containing the retrovirus was stored at -80 ° C until use.
  • HeLa cells cultured on 150 mm plates were mixed 1:10 with virus-containing supernatant and fresh cell culture medium containing 8 ⁇ ⁇ ⁇ polyprene (Sigma). Cultured in 15 ml of the solution. Cells were analyzed 48 hours after transfection or infection.
  • GST or GST-fused full-length RPB8 protein was expressed in bacteria BL21 by standard techniques and purified by dartathion affinity chromatography.
  • 4 g of GST fusion protein contains 4 g of His-BARD 1 "-189, and 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5% ⁇ ⁇ 40, 150 mM NaCl, .50 mM NaF and 1 mM dithiothreitol.
  • run-off transcription method used was in accordance with known methods (Krum et al., 2003).
  • run-off target ⁇ M is a ⁇ 5-mer oligonucleotide: '
  • Run-off transcription reaction (20 ⁇ ) consists of 8.25 mM MgCl 2 , 5 bovine serum anolebumin, 250 nM NTPs, 5 unit Rnase inhibitor, 50 n poly (dI-dC), 0.05% Nonidet ⁇ ⁇ 40, Contains 1 pmol of annealed oligonucleotide and 0.5 ⁇ of [a-32P] CTP.
  • LC MS / MS nanoscale capillary liquid chromatography-tandem mass spectrometry
  • LC MS MS MS nanoscale capillary liauid chromatoeraphvtandem mass spectrometry
  • LC MS / MS analysis revealed that these samples were RPB8, a common subunit of three RNA polymerases, and myosin light chain.
  • RPB8 is a small protein with a very high acidity of 14 degrees, a calculated molecular weight of 17.1 kDa, and an isoelectric point of pi 4.34 (Shp0kovski et al., 1995).
  • the present inventors produced a rabbit anti-GST 1PB8 polyclonal antibody for use in immunoplotting.
  • Cells were treated with epilubicin, and ⁇ immunoblotting analysis was performed on proteins separated by 2D gel.
  • RPB8 was again markedly reduced by epilubicin treatment only in T47D cells (Fig. 2).
  • Fig. 2 shows that several protein ladders reactive to anti-RPB8 antibody were detected, which were transferred to the higher molecular weight region and more basic ⁇ region after epilubicin treatment. Since these ladders could not be detected by Ruby staining, the present inventors concluded that these proteins were present only in small amounts. '.
  • FIG. 3B upper panel
  • the lower panel of Figure 3B shows the results for MCF10A, but the same results were observed in all four cell lines used for testing, including MCF7, T47D and 293T. .
  • Both BRCA1 and BARD1 interact with pol ll holoenzyme (Ciba and Parvin, 2002). Therefore, the holoenzyme may crosslink BRCA1 BARD1 and RPB8.
  • the present inventor considered that recombinant GS RPB8 protein expressed in bacteria and recombinant His-BARDl 4- 189) The protein was purified.
  • the His-BARDl (14-189) protein lacks 13 amino acids on the N-terminal side of the full-length amino acid sequence of BARD1.
  • GS RPBS was coprecipitated with His-BARDl (14-189).
  • GST was not detected (Figure 3C). This result suggests that RPB8 force interacts directly with the N-terminus of S BARD1.
  • BARD1 binds to BRCA1 and forms an active E3 ligase.
  • the present inventor detected a large amount of BAED1 in the RPB8 immunoprecipitate, but could not detect BRCA1. The inventor therefore speculated that BRCA1 may interact with BARD1 and RPB8 only under special conditions such as DNA damage.
  • the present inventors UV-irradiated MCF10A cells and recovered the cells at several different times after irradiation. The collected cells were lysed, and the cell lysate was subjected to immunoprecipitation using an anti-RPB8 antibody, followed by immunoplotting using an anti-BRCA1 antibody, anti-BARD1 antibody, or anti-RPB8 antibody.
  • BAED1 was able to easily detect immune complexes of anti-RPB8 antibody at all time points analyzed.
  • BRCA1 was clearly detected 10 minutes after irradiation. There was very little detection after a minute (Figure 3D).
  • Figures 3E and 3F show the results for MCF10A cells. Similar results were observed when they were observed on T47D cells, MCF7 cells, HeLa cells and MDA-MB435 cells. Curiously, BRCA1 co-purified with RPB8 migrated more slowly than BRCA1 obtained from whole cell extracts. Therefore, the present inventor decided to prove that this protein is actually BRCA1 by using siRNA.
  • T47D cells were transfected with either control siRNA or BRCAl siRNA and then irradiated with UV light 48 hours after transfection.
  • FLAG-RPB8 was cotransfected into 293T cells with HA ubiquitin, Myc-BRCAl (1-772), and BAED1. Cells were harvested 36 hours after transfection, boiled in buffer containing 1% SDS, and FLAG-RPB8 was immunoprecipitated. The RPB8 precipitate separated by SDS-PAGE was subjected to immunoplotting using an anti-HA antibody. As a result, a ladder characteristic of polyubiquitinated RPB8 was shown ( Figure 4A).
  • BRCA1 / BAED1 is the only known E3 ligase that catalyzes Lys6-linked polyubiquitin chains. (Morris and Solomon, 2004; Nishikawa et al., 2004; Wu'Baer et al., 2003). To prove that RPB8 ubiquitin ladder in vivo is directly due to BRCA1 / BARD1 ligase activity, the present inventor has determined whether RPB8 is modified by binding ubiquitin to Lys6.
  • the BRCA1 / BAED1 catalyst that BRCA1 itself or NPM is lys6-linked polyubiquitinated is not a signal for ⁇ ?
  • the proteanome Hashizume et al., 2001; Nishikawa et al., 2004; Sato et al. , 2004. Therefore, the present inventor analyzed whether or not this was also applicable to BRCA1 / BARD1-dependent RPB8 ubiquitination, that is, whether RPB8 ubiquitin was also a signal of ?? by the proteasome.
  • BRCA1 has long played a role in transcription * 3 ⁇ 4 DNA repair (Abbott et al., 1999; Le Page et al., 2000). And the unit of RPB1, the largest component of pol II Biquitination has been demonstrated in response to DNA damage (Beaudenon et al., 1999; Bregman et al., 1996; Kleiman et al., 2005; Lee et al., 2002; Starita et al., 2005). Therefore, the inventor tested the ability of RPB8 to be ubiquitinated in response to DNA damage. '
  • the inventor Rather than continually exposing cells to epirubicin, he employed UV irradiation to accurately determine when RPB8 ubiquitination after DNA damage.
  • the inventor established a HeLa cell line stably expressing FLAG-RPB8 (FIG. 7A), and analyzed the anti-FLAG immunoprecipitate ubiquitin. Cells were collected at several different time points after UV irradiation, boiled in 1% SDS-containing buffer, and FLAG-RPB8 was immunoprecipitated. Next, FLAG-RPB8 was eluted from the antibody together with the FLAG peptide, and the eluate was subjected to immunoblotting using an anti-ubiquitin antibody.
  • the detected ladder was confirmed to be ubiquitinated RPB8 (FIG. 5A, lower panel).
  • Such a ladder was not detected at all using a HeLa cell line stably expressing a ubiquitin-resistant mutant, FLAG-RPB85KR— (described later) (FIG. 5A, lanes 4-6).
  • RNAi was re-adopted to knock down endogenous BRCA1 expression, with the goal of requiring BRCA1 for UV irradiation-induced ubiquitination of RPB8.
  • Two approaches were used for RNAi expression.
  • BRCA1-specific siENA was transfected into HeLa cells stably expressing FLAG-RPB8.
  • the present inventor constructed a retrovirus designed to express shRNA against BRCA1. 48 hours after transfection or infection, the cells were irradiated with UV (35 J / m 2 ), and the cells were collected 10 minutes later.
  • RPB8 has 8 Lys residues throughout the protein.
  • the present inventor first introduced a mutation into one Lys residue of RPB8, and tested the possibility that it was ubiquitinated.
  • RPB8 ubiquitination was not dramatically reduced with each single residue mutation ( Figure 6B, lanes 2 and 7). Instead, RPB8 ubiquitination decreased as the number of substitutions from Lys to Arg increased. This result reproduces what we observed during studies on BRCA1 self-ubiquitination and BRCA1-mediated NPM ubiquitination.
  • Wild-type FLAG-RPB8 or 5KR was transfected into 293T cells and anti-FLAG immune complexes were isolated. Bound proteins were separated by SDS-PAGE and analyzed by immunoplotting using anti-RPB1 antibody or anti-RPC155 antibody. RPB1 and RPC155 was both detected in abundance in FLAG-5KR and in wild-type immune complexes ( Figure 6C).
  • the present inventor measured the catalytic activity of the immunoprecipitate using the anti-FLAG antibody using the run-off transcription method.
  • the 5KR mutant immune complex has the same ability to produce in transcripts as the wild-type immune complex ( Figure 6D).
  • the 5KR mutant of RPB8 constitutes an ino-effective RNA polymerase complex while maintaining polymerase activity. This indicates that ubiquitination of RPB8 by BRCA1-BAED1 does not require RNA polymerase activity.
  • BRCA1 deficiency causes susceptibility to DNA damage (Abbott et al., 1999; Ruf & ier et al., 2001; Shen et al., 1998).
  • BRCA1-deficient strains do not ubiquitinate RPB8 and cause the same phenotype as the 5KR mutant. Since RPB8 is ubiquitinated by BRCA1 after UV irradiation (Fig. 5), this ubiquitination may cause the same phenotype.
  • the inventors established a HeLa cell line that stably expresses the 5KR mutant of FLAG-RPB8.
  • the cell survival rate of 5KR clones after UV irradiation at 20 or 35 J / m 2 was about 38% and 23%, respectively, compared to untreated cells at 0 hours, whereas In the case of live clones, they were about 72% and 53%, respectively (Figure 7B).
  • the parental HeLa cell line showed similar cell viability as the wild type clone (FIG. 7B).
  • FIG. 7C shows cells observed by phase contrast microscopy 48 hours after UV irradiation (35 J / m 2 ), and
  • FIG. 7D shows a culture plate stained with Lillie's crystal biolet staining.
  • cocaine syndrome group A (CSA) and CSB proteins play an important role in replacing the RNA polymerase complex from the site of damage. This makes it possible to later mobilize repair complexes containing TFIIH (Rockx et al., 2000; van den Boom et al., 2002).
  • RPB1 becomes highly phosphorylated in the C-terminal domain (CTD) during RNA elongation, and BRCA1 interacts with this form, perhaps as a sensor for DNA damage.
  • CTD C-terminal domain
  • pol ll remains at the site of injury, pol ll maintains its highly phosphorylated state for approximately 1 hour after UV irradiation. Complexes dephosphorylate (within 6 hours of UV irradiation) when replaced with CSA / CSB (Rockx et al., 2000). This process is important for cell survival, and long-term pol II retention in the damaged site in a phosphorylated form is very cytotoxic (Ljungman and Zhang et al., 1996; van den Boom et al., 2002).
  • the UV sensitivity of cells expressing the 5KR mutant of RPB8 is of interest to determine whether the 5KR mutant of RPB8 causes long-term phosphorylation of RPB1 after UV injury.
  • UV irradiation was performed on HeLa cell lines that stably express either wild-type or 5KR mutant FLAG-RPB8. Cells were collected 1 or 6 hours after UV irradiation and subjected to immunoplotting using an H14 antibody that recognizes RPB1 phosphorylated at Ser5 in CTD repeats.
  • BRCA1 expression restores radiation resistance in BRCA1 -defective cancer cells through enhancement of transcription- coupled DNA repair.J Biol Chem 274, 18808.18812.
  • the RING heterodimer BRCAl-BAEDl is a ubiquitin ligase inactivated by a breast cancer-derived mutation.J Biol Chem 276, 14537-14540.
  • BRCAl BARDl induces the formation of conjugated ubiquitin structures, dependent on K6 of ubiquitin, in cells during DNA replication and repair.Hum Mol Genet 13, 807-817. 28) Nishikawa, H “Ooka, S” Sato, K “Arima, K., Okamoto, J., Klevitance R. E "Fukuda, M., and Ohta, T. (2004). Mass spectrometric and mutational analyzes reveal Lys-6-linked polyxibiquitin chains catalyzed by BRCAI BARDI ubiquitin ligase.J Biol Chem 279, 3916-3924.
  • UV-induced inhibition of transcription involves repression of transcription initiation and phosphorylation of RNA polymerase II.Proc Natl Acad Sci USA 97, 10503-10508.
  • Nucleophosmin / B23 is a candidate substrate for the BRCAl -BARD 1 ubiquitin ligase.J Biol Chem 279, 30919-30922.
  • BRCAl is a component, of the RNA polymerase II holoenzyme.
  • RNA polymerase are functionally interchangeable between Homo sapiens and Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 15, 4702-4710.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing BRCA1-BAED1.
  • the method of the present invention can be used in the field of apoptosis and transcriptional control by RNA polymerase ubiquitination.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful for the treatment of cancer. .

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Abstract

本発明はRNAポリメラーゼをBRCA1-BARD1に接触させることを含む、RNAポリメラーゼをユビキチン化する方法を提供する。

Description

明 細書
RNAポリメラーゼの共通サブュニットをュビキチン化する方法 技術分野
本発明は、' RNAポリメラーゼのュビキチン化の分野に関し、 特にュビキチン化 を制御する BRCA1の機能に関する。 背景技術
乳癌おょぴ卵巣癌の抑制タンパク質である BRCA1は 癌の進行を防止する多く の細胞経路のハブタンパク質として働く。乳癌に関する生涯リスクのおよそ 80%が、 生殖系列におけるこの重要な遺伝子の変異が原因である（Kingら、 2003)。従って、 他のメカニズムによるこのタンパク質のダウンレギユレーションが散発性の乳癌を 引き起こすこと.を想像するのは難しくない （Baldassarreら、 2003; Catteauおよ ぴ Morris、 2002)。 BRCA1を欠損しているすべての細胞は、 DNA損傷、 染色体 異常の存在、 および多数の遺伝子座におけるへテ.口接合 (4の消失への過敏性によつ て明らかなようにゲノム不安定性を示す（Al-Wahibyおよび Slijepcevic、 2005； Xu ら、 1999)。 これらの結果は、 DNA損傷の修復、 転写制御、 アポトーシス誘導、 S 期中または G2-M期のチェックポイント機能、および中心体複製の制御において機 能する BRCA1の欠損から生じた可能性が高レ、 (Deng、 2002； Ohta及ぴ Fukuda、 2004； Venkitaraman. 2002; Zhengら、 2000)。 BRCAl.を介した娜な細胞機構 を解読することは、 乳癌おょぴ卵巣癌の発癌を理解する上で、 さらに言い換えると これらの癌の効果的な治療法を開発する上で、 必須のステップである。 BRCA1が多数の細胞経路に関与することは、 ュビキチンリガーゼ （E3) として の酵素的機能により理論的に示された。 この酵素的機能について、 BRCA 1は多数 のタンパク質基質と相互作用する可能性を有し、 さらに、 多くの点で細胞の生物学 的反応に影響する可能性を有する。 BRCA 1は、 ュビキチンリガーゼに見られる共 通モチーフである N の RINGフィンガードメィンを含む。
BRCA 1は、 RINGへテ口ダイマーとして高次構造的に類似する別の RINGフィ ンガータンパク質である BARD1に結合した場合に、 重要なュビキチンリガーゼ活 性を獲得する （Baer及び Ludwig、 2002； Brzovic ら、 2003; Chen ら、 2002; Hashizumeら、 2001; Malleryら、 2002)。 ュビキチンリガーゼは、 酵素 E1およ び E2により連続的に活性化されたュビキチン分子を用いてィソぺプチド結合を介 して基質タンパク質に結合したポリュビキチン鎖の形成を触媒する（Hershkoおよ び Ciechanover、 1998)。 最も一般的なポリュビキ fン鎖は、 ほとんどの場合でュ ビキチンの Lys48に結合し、プロテアソーム依存性タンパク質 経路による速や かな基質の分解のシグナルとして機能する （Chau ら、 1989)。 しかしながら、 BRCAl-BARDlは、 Lys6結合性のポリュビキチン鎖の生成を触媒する特殊な機能 を有している （Morris及び Solomon、 2004； Nishikawaら、 2004; Wu_Baerら、 2003)。これらの鎖は ώ vitroにおいて 26Sプロテアソームによつて認識されるが、 ^のためではなく、 ュビキチンアルデヒドに対して感受性を有し、 脱ュビキチン 化するためである（Nishikawaら、 2004)。自己ュビキチン化した BRCA1を含む、 BRCA1の Lys6結合 14ュビキチン化の基質は、 in w oでは、 分解きれずに安定化 することが示された （Hashizume ら、 2001; Sato ら、 2004)。 これらの知見は、 BRCAl-BARDl を介したュビキチン化が、 分解以外のプロセスへのシグナルとな ることができるという可能性を示唆する。 '
家族性乳癌で発見された BRCA1の RINGフィンガードメインにおける有害なミ スセンス変異は、 BRCA1-BAED1 の Ε3 リガーゼ活性を失わせるものである (Brzovicら、 2003; Hashizumeら、 2001; Ruffiierら、 2001)。そしてこのことは、 E3 リガーゼ活性が BRCA1め癌抑制タンパク質としての役割を果たすために重要 であることを示している。
BRCA1の最も重要な機能的特徴の一つは、それが RNAポリメラーゼ II (pol ll) ホロ酵素の構成要素であることである （Chibaおよび Parvin、 2002； Scullyら、 1997a)。 非損傷細胞においては、 BRCA1は、 プロモーターで見出された低リン酸 化 pol II dlA)よりもむしろ高リン酸化された進行的 ροΙ Π (110)の大部分と特異的 に相互作用する （Krum ら 2003)。 DNA障害を受けると、 BRCA1は ATM/ATR ファミリ一キナーゼによりリン酸化され（Cortezら、 1999; ibbettsら、 2000)、 進行的 pol II複合体から解離する （Krumら、 2003)。 続いて、 リン酸化 BRCA1 は、 Rad50-Mrell-Nbsl修復複合体、 又は、 Rad51または PCNAと協同し、 損傷 した DNAを修復する （Scullyら、 1997b; Zhongら、 1999)。
BRCA1は、 ゲノムスキャニング機能の一部として、 pol 110複合体と結合するこ とが提唱されてきた （Lane、 2004)。 しかしながら、 仮にそのようなことがあった としても、 DNA損傷後 BRCA1が修復機構へ銜する前の初期段階の間に、 BRCA1 が pol II複合体にどの程度影響するのかは解明されていない。 発明の開示
本発明は、 RNAポリメラーゼの共通サブユニットをュビキチンィ匕する方法、 ュ ビキチ^化を抑制する方法、 及び DNA損傷に対する感受性細胞を樹立する方法を »することを目的とする。
本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 RINGフィンガー タンパク質である BRCA1と別の RINGフィンガータンパク質である BARD1との へテ口ダイマー （BRCA1-BARD1) が各種 RNAポリメラーゼに共通するサブュ- ットをュビキチンィ匕することを見出した。 また、 本発明者は、 RNAポリメラーゼ のサブュニッ..トのァミノ酸配列を変異させると上記ュビキチン化を抑制し得ること を見出した。 さらに、 このようにュビキチン化を抑制すると、 紫外線 (UV) など による DNA損傷環境に対し感受性を付与することを見出した。 本発明は、 このよ うな知見により完成されたものである。 すなわち、 本発明は以下に示すとおりであ る。
( 1 ) RNAポリメラーゼを BRCA1-BAED1に させることを含む、 当該 RNA ポリメラーゼの共通サブュニットをュビキチン化する方法。
RNAポリメラーゼの共通サブュニットとしては、 RPB8が挙げられる。
( 2 ) RPB8 のアミノ酸配列のうちリシン残基を変異させることを特徴とする、 RPB8の BRCA1によるュビキチン化を抑制する方法。
( 3 )細胞内の RPB8のァミノ酸配列を変異させて RPB8のュビキチンィ匕を抑制す ることにより、 当該細胞に、 DNA損傷環境に对する感受性を付与することを特徴 とする、 DNA損傷環境に対する感受性細胞を作製する方法。
(4 ) RNAポリメラーゼを BRCA1-BARD1に接触させることを含む、癌の治療方 法。 上記癌の治療は、 当該 RNAポリメラーゼの共通サブュニットをュビキチン化す ることにより生体内に抗癌活性が付与される点を利用するものである。
( 5 ) BRCA1-BARD1を含む医薬組成物。
( 6 ) BRCA1をコードする遺伝子及び BAKD 1をコードする遺伝子を含む医翻且 成物。
本発明の医難成物は、 癌の治療に使用される。 、 図面の簡単な説明
図 1はェピルビシン処理によって影響を受けるタンパク質のスクリーニング結果 を示す図である。
T47D細胞（パネル Aおよび B)および HCC1937細胞（パネル Cおよび D)を 全く処理しないか、 あるいは 0.2 g/mlのェピルビシンで 3時間処理し、 それぞれ 7M尿素 /2Mチォ尿素含有緩衝液で溶解した。ェビルビシンで処理していない細胞、 およぴェピルビシンで処理した細胞から得たタンパク質 （50 μδ) 蛍光色素 Cy3 (パネル Aおよび C) および Cy5 (パネル Bおよび D) でそれぞれ標識した。 標 識したサンプレを共に混合し、 2D ゲノレ （pH幅は左から右に 3-10) で分離し、 蛍 光イメージアナライザーでスキャンした。 黄色矢印はタンパク質のスポットを示し ており、 そのスポットのレベルはェピルビシン処理により大きく変化した。 赤矢印 は、 ェピルビシン処理によって T47D細胞でのみ著しく減少したタンパク質を示し ている。 ゆつくり移動したタンパク質は RPB8と同定し、 速く移動したタンパク質 はミオシン軽鎖と同定した。 ' ' 図 2はェピルビシン処理後の RPB8修飾にっレヽて免疫ブロッティングを行つた結 果を示す図である。
A: T47D細胞または HCC1937細胞を、処理しない（対照）か、あるいは 0.2 g/ml のェピルビシンで 3時間処理し、 それぞれ 7M尿素 /2Mチォ尿素含有緩衝液で溶解 した。溶解液 (500 μδ) を 2Dゲル（ρΗ Ψ畐 3-10)で分離した。ゲルの一部は抗 RPB 抗体で免疫ブロッティングに供した。 矢印は RPB8を示している。
B: T47D細胞または HCC1937細胞を 0.2 g/mlのェピルビシンで所定時間処理 し、 0.5% NP-40含有緩衝液で溶解し、 12.5% SDS-PAGEによつて分離し、 その後 抗 RPB8抗体または抗チューブリン抗体で免疫プロッティングを行った, 図 3は RPB8の BRCA1-BARD1との相互作用について免疫ブロッティングを行 つた結果を示す図である。
A: トランスフエタトした RPB8は BRCA1-BARD1と相互作用する。 293T細胞 に所定のプラスミドをトランスフエクトした。 ^田胞溶解液 （上部 3パネル） また は免疫沈降物 （下部 3パネル） を、 所定の抗体を用いた免疫ブロッテイングに供し た。 抗 HA/Myc抗体は抗 HA抗体で免疫プロッティング及びそれに続く抗 Myc抗 体でのリプローブを指定する。
B: 内在性 RPB8は BAED1と相互作用する。 所定の細胞株から調製した細胞溶 解液を抗 RPB1抗体、 抗 RPB8抗体、 または抗 RPB8についての免疫前ゥサギ血 清 (Pre) を用いて免疫沈降させ、 所定の抗体を使用した免疫ブロッテイングによ り分析した。
C: RPB8と ^AEDlとの ώ vitroでの相互作用。 His-BARD114 (4 μg) を 4 の GST又は GS RPBSと混合し、ダルタチオンビーズと 2時間ィンキュベートし、 ' 続いて十分に洗浄した。 ビーズに結合したタンパク質は SDS-PAGE で分離し、 Sypro Ruby染色を行つた。
D: UV照射後、 RPB8は BRCA1と相互作用する。 MCF10A細胞は、未処理（レ ーン 1) のもの、 又は UV照射 (35 J/m2)してから 5分後 （レーン 2)、 10分後 （レ ーン 3)、60分後（レーン 4)または 360分後（レーン 5)に回収したものを用いた。 ^田胞溶解液 （上部 2つのパネル） または抗 RPB抗体の免疫沈降物 （下部 3つの パネル） を所定の抗体を用いた免疫ブロッテイングにより分析した。 矢印は、 修飾 された形態の BRCA1を示しており、 矢じりはストレート免疫プロッティングにお ける BRCA1の通常の移動位置を示している。ァステリスク:非特異的な反応生成物。
E： T47D細胞は、 未処理のもの （レーン 1) または UV照射 (35 J/m2)から 10分 後に回収したもの （レーン 2および 3) を用いた。 抗 RPB8抗体（レーン 1 および 2)または免疫前動物から得た抗体 （レーン 3) で免疫沈降した細胞溶解液は、 所定 の抗体で免疫プロッティングにより分析した。
F: T47D細胞に、 对照 siRNA (レーン 1-3) または BRCA1の siRNA (レーン 4-6) のいずれかをトランスフエタトした。 細胞は Mock処理を施したもの （レー ン 1及び 4)、 または UV照射 （35 J/m2) から 10分後 （レーン 2及び 5) または 60分後 （レーン 3及び 6) に回収したものを用いた。 ^田胞溶解液 （上部 2つのパ ネル） または抗 RPB8抗体の免疫沈降物 （下部 2つのパネル） を所定の抗体を用い て免疫プロッティングにより分析した。
IP:免疫沈降物、 IB:免疫ブロッテイング 図 4は、 RPB8の in vivoにおける BRCA1-BARD1によるュビキチン化及ぴ安定 化について免疫プロッティングを行った結果を示す図である。
A:所定のプラスミ ドをトランスフエタトした 293T細胞を 1% SDS溶解緩衝液 中で煮沸し、 0.1% SDSに希釈し、抗 FLAG抗体架橋ビーズを用いて免疫沈降した。 FLAG-RPB8を FLAGぺプチドで溶出し、 12.5% SDS-PAGEで分離し、 抗 HA抗 体を用いて免疫ブロッテイングを行った。
B: RPB8のポリュビキチン化は図に示す一個の Lys残基を有する HA-Ubをトラ ンスフエタトしたことを除き、 Aと同様の方法で検出した （レーン 1-3)。 細胞溶解 液の一部を、 抗 HA抗体を用いた免疫ブロッテイングに供し、 タンパク質発現の対 照として細胞内の全 HA-Ub結合タンパク質を検.出した （レーン 4-6)。
C:pl00プレート中の 293T細胞に、 FLAG-RPB8をコードするプラスミド（レー ン 1-4、 0.3 g)、 並びに量を増加させた Myc-BRCAl1—772および HA-BARD1 (レ ーン 2、 2 μ ; レーン 3、 4 g; レーシ 4、 7.35 g) をトランスフエタトした。 全プ ラスミ ド DNAの量を、空の pcDNA3ベクターを加えることにより、 プレート当た り 15 gになるよう調整した。 各タンパク質の定常状態レベルを、 抗 Myc抗体、 抗 HA抗体、 抗 FLAG抗体、 又は抗チューブリン抗体を用いて分析した。
D: 293T細胞に、 FLAG-RPB8をコードするプラスミド （0.2 g)、 並びに空の pcDNA3ベクター （2 g、 上部パネル） 又は Myc-BRCAl1 772及ぴ HA-BARD1プ ラスミド （それぞれ 1 μζ, 下部パネル） のいずれか一つをトランスフエクトした。 細胞はシクロへキサミド （10 μΜ) 中でインキュベートし、 所定時間追跡した。 細 胞溶解液は、 次に抗 FLAG抗体を用いて免疫プロッティングした。
IP;免疫沈降物、 IB;免疫ブロッテイング、 アステリスク; IgG 図 5は、 UV照射に対する反応における RPB8の BRCA1依存性ポリュビキチン 化について免疫プロッティングをした結果を示す図である。
A:野生型 （レーン 1-3) 又は FLAG-RPB8の 5KR変異体 （レーン 4-6) を安定発 現する HeLa細胞株を UV照射 （35 J/m2) し、 照射して所定時間後に回収した。 ュビキチン化した RPB8は、抗ュビキチン抗体を免疫プロッティングに用いた点を 除いて、 図 4Aで示した方法と同様の方法で検出した （上部パネル)。 膜は抗 RPB8 抗体でリプローブした （下部パネル)。 ，
B:野生型 FLAG-RPB8を安定発現する HeLa細胞株に、対照 siRNA (レーン 1) または BRCA1用 siRNA (レーン 2) のトランスフエクシヨン、 または对照 shRNA を発現するレトロウイルスの感染 （レーン 3)、 あるいは BRCA1用 shRNAを発現 するレトロウイルスの感染 （レーン 4) のいずれかを行った。 次に細胞を UV照射 (35 J/m2) し、 照射から 10分後に回収した。 細胞を 1% SDS緩衝液中で煮沸し、 抗 BRCA1抗体 （上部パネル） または抗チューブリン抗体 （中部パネル） のいずれ かを用レ、た免疫ブロッテイング、あるいは Aと同様の方法による RPB8ュビキチン 化の検出 （下部パネル） に供した。 '
IP:免疫沈降物、 IB:免疫ブロッテイング、 アステリスク： IgG 図 6はュビキチン抵抗性 RPB8変異体の構築およびその RNAポリメ.ラーゼ活性 試験の結果を示す図である。
A:RPB8変異体のコンストラクト。'図示する通り、 RPB8の Lys (K)残基を Arg (R) 残基に置換した。
B: Myc-BRCA11 772、 BARD1、 HAュビキチンを、野生型又は変異型 FLAG-RPB8 を用いて 293T細胞のいずれかにコトランフエクトした。 RPB8のポリュビキチン 化は図 4Aに示したのと同様の方法で検出した。
C:293T細胞に、空の pcDNA3ベクター（一）、野生型または FLAG-RPB8の 5KR 変異体をトランスフエタトした。 ^田胞溶解液 （上部 4つのパネル） 又は等量の全 細胞溶解液から生成した抗 FLAG抗体による免疫沈降（下部 3つのパネル） を、所 定の抗体を用いた免疫プロッティングに供した。
D:図 Cで示した方法で得た抗 FLAG抗体による免疫沈降物を、 45ヌクレオチド の RNA転写産物を生成するよう設計された,二本鎖 DNAを用いた in vitroラ ン -オフ転写ァッセィに供した。 標識した RNA生成物を 12% ポリアクリル アミドゾ尿素ゲノレで分離し、 Typhoon 9400 (登録商標） イメージアナライザーでス キャンした。
IP:免疫沈降物、 IB:免疫ブロッテイング、 アステリスク： IgG 図 7はュビキチン抵抗性 RPB8は UV感受性を引き起こすことを示す図で'ある。 A:野生型 （WT1及び WT2) または RPB8の 5 Ι 変異体 （5KR-1及び 5KR-2) のいずれかを安定発現する HeLa細胞のそれぞれ 2つのクローンから得た細胞溶解 液、および HeLa細胞の親株から得た細胞溶解液を抗 RPB8抗体を用いて免疫沈降 し、その後抗 RPB8抗体を用いた免疫ブロッティングを行った。矢印： FLAG-RPB8, 矢じり： PB8
B:Aで示した HeLa細胞株を所定の線量で UV照射した。 照射から 48時間後、 細胞生存率をトリパンブルー排除法により測定した。 0時間 （0 J/m2として示す） での細胞数を 100%とする。 3つ組で行った測定値の平均値および SD値を示す。 少なくとも 2回の実験を繰り返したが、 結果は同様であった。 '
Cおよび D: 35 J/m2の UV照射の前 （cont.、 左パネル） 又は 48時間後 （UV、 右パネル） の所定の HeLa細胞の細胞生存率をィ立相差顕微鏡観察 (C) 又は Lillie's クリスタルバイオレット染色 （D) のいずれかで観察した。 . 図 8は、 ュビキチン抵抗性 RPB8は UV照射後に長期間の RPB1の高リン酸化 を UV照射後に引き起こすことを示す図である。
野生型又は FLAG-RPB8の 5KR変異体のいずれかを安定発現する HeLa細胞を UV照射 （35 J/m2) し、 所定時間培養した。 田胞培養液 （上部 2つのパネル） 又 は等量の^田胞溶解液から生成した抗 FLAG抗体による免疫沈降物（下部 2つのパ ネル） を、 所定の抗体を用いた免疫ブロッテイングに供した。
p-S5: RPB1のリン酸化 Ser5を認識するリン酸化特異的抗体 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本明細書で引用したすべての特許出願、 特許、 文献およびウェブサイトは、 参照 することにより全体として本明細書に組み込まれる。 本発明者は、 DNA損傷に対する反応において BRCA1が 3種の RNAポリメラー ゼのすべてに共通するサブュニットである RPB8 (hRPB17または POLR2Hとも 呼ばれる） をュビキチン化することを示した。
タンパク質のスクリ一二ングにより、 ェピルビシン処理後の BRCA1陽 14細胞中 で修飾されたタンパク質として RPB8を同定した。 RPB8は BRCA1-BARD1複合 体と相互作用し、 RNAiによる BRCA1のノックダウンに感受性であり、 UV照射 後すぐにポリュビキチン化された。 これに対し、 RPB8の 5つのリシン残基をアル ギニン残基に置換することによって、 RPB8はそのポリメラーゼ活性は保持しつつ、 ュビキチン化されなくなった。 興味深いことに、 RPB8のこのュビキチン抵抗性の 形態として安定発現している HeLa細胞株は、 UVに感受性であり、 UVによる DNA 損傷後における RNAポリメラーゼ IIのリン酸ィ匕を長期化させた。 この特徴は、 コ ケイン症候群細胞に留まった（stalled) pol llとして観察することができる （Rockx ら、 2000; van den Boomら、 2002)。 この結果は、 BRCA1力 RPB8を新規基質 として E3リガーゼ活性を媒介し、 DNA損傷に反応する新しい機構を示唆するもの である。 RPB、8の BRCA1によるュビキチンィ匕〖ま、 転写 DNA修復経路を適切 に処理するのに非常に重要である。 本発明においては、 RNAポリメラーゼを BRCA1-BARD1に ¾ させることによ り、 当該 RNAポリメラーゼの共通サブュニットをュビキチンィ匕する方法を»す る。また、 RPB8のァミノ酸配列のうちリシン残基を変異させることにより、 RPB8 の BRCA1によるュビキチン化を抑制する方法も»する。
本発明において、 RNAポリメラーゼを BRCA1-BARD1に させる方法は特に 限定されるものではなく、 遺伝子工学的手法により BRCA1-BARD1発現プラスミ ドから得られた BRCA1-BARD1に RNAポリメラーゼを作用させればよい。 RNA ポリメラーゼの作用条件は当業者が適: 定することができる。 例えば、 適切な緩 衝剤と供に 37度 1時間以上反応させる方法もある。 また本発明においては、細胞内の RPB8のァミノ酸配列を変異させて RPB8のュ ビキチン化を抑制することにより、 当該細胞に、 上記 DNA損傷 に対して感受 性を付与することができる。 このような DNA損傷環境に対して感受性が付与され た細胞を作製する方法も、 本発明に含まれる。
使用する細胞の種類は特に限定されるものではなく、 正常細胞、 癌細胞など各種 細胞が挙げられる。 細胞は哺乳動物由来のものであることが好ましい。
ァミノ酸配列の変異は、 それをコードする DNAに変異を導入する通常の部位特 異的突然変異誘発法を利用することができる。例えば Kunkel法や Gapped duplex 法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、 具体的には QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (ス トラタジーン社製）、 GeneTailor™ Site-Directed Mutagenesis System (インビトロジェン社製）、 TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K、 Mutan- Super Express Km等：タカラバイオ 等を用いて行うことができる。
1 . 定義
BRCA1は、 し癌及び卵巣癌の癌抑制遺伝子であり、乳癌研究の分野で最も重要な 遺伝子の一つである。 また、 BRCA1は、 BARD1と共に RINGヘテロダイマー （複 合体） を形成すると、.高いュビキチンリガーゼ活性を獲得する。 マウスの ^Src 遣 伝子の標的破壊により中心体の過剰増幅とゲノム不安定性がおこる。 分裂期の間に BRCA 1は中心体に局在する。 また、 BRCA1は y -チューブリンと結合することが 報告されている。
BARD 1は、 BRCA1と結合する RINGフィンガー蛋白質 （BRCA1 associated Rin Domainl) として同定された。
BRCA1及^ BARD1は、 互レ、に結合して複合体を形成し、 RINGへテ口ダイマー 型ュビキチンリガーゼを形成するが、 家族性乳癌の原因となる BRCA 1におけるミ スセンス変異により、 このリガーゼ活性は完全に失活する。
BRCA1-BARD1は、 DNA修復、 細胞周期の進行及び中心体の複製等の様々な細 胞の過程を調節する。免疫細胞染色実験によれば、細胞周期の各期の NPM (ヌクレ ォフォスミン)、 BRCA1及び BARD1の挙動は以下の通りである。 すなわち、 間期に おいて NPMは核小体に存在する力 BRCA1と BARD1は核小体以外の核内に存在す る。 しカゝし、 分裂期には、 それらは、 紡垂体付近の核周辺及ぴ中心体 （紡錘 ） に する。 さらに、チミジン-ノコダゾールブロックによって細胞周期を分裂期に 同調させた HeLa細胞を用いた試験により、 NPMは、分裂期から G1期に衡する短 期間にポリュビキチン化されることが判明した。 細胞周期の間の細胞内局在及び NPMとの を観察するために、 BAED1の C末端に対するゥサギポリクローナノレ 抗体を調製して用いることができる。 細胞周期の同調はフローサイトメトリーでモ 二ターし、 ώ w'raでの NPMュビキチン化を IP-ゥエスタン解析により評価すること ができる。
さらに、 BRCA1-BAED1によって触媒されるポリュビキチン鎖は、 26Sプロテア ソームによるタンパク質 のシグナルとして機能する従来の Lys-^s結合型ではな く Lys-6結合型のュビキチン鎖であり、 ώ ではこれらの鎖力 ¾6Sプロテアソーム によって脱ュビキチン化される2.3。 NPMも、 i ra oで BRCA1-BARD1によりュビ キチン化され、 安定化するが、 このュビキチン化は、 26Sプロテアソーム依存性タ シパク質 のシグナルとしては機能しない。 ここで、 本 明において使用される BRCA1をコードする遺伝子の塩基配列を配 列番号 6、 アミノ酸配列を配列番号 7に示す。 また、 BAED1 をコードする遺伝子 の塩基配列を 列番号 8、 ァミノ酸配列を配列華号 9に示す。
本発明において使用される BRCA1及び BARD1は、 上記配列番号 6又は 8に示 す塩基配列を有するものに限定されるものではなく、 コード領域又はその一部であ つてもよレ、。 BRCA1 のコ一ド領域は、 例えば配列番号 6に示す塩基配列のうち 195-2294番の領域であり、 BARD1のコード領域は、配列番号 8に示す塩基配列の 74-2407番の領域である。 さらに、 これらの塩基配列に相補的な配列とストリンジ ヱントな条件下でハイブリダィズし、 かつ、 RPB8をュビキチン化する活性を有す るタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。 「ストリンジェントな条件」 とは、ハ イブリダイゼ一ションにおいて洗浄時の塩濃度が 100〜500 mM、 好ましくは 150 〜300 mMであり、 が 50〜70。C、 好ましくは 55〜65°Cの条件を意味する。 さ らに、 配列番号 6又は 8で示される塩基配列と少なくとも 80%以上、 好ましくは 90%以上、 より好ましくは 95%以上、 さらに好ましくは 97%以上の同一性 （相同 性） を有する塩基配列も本発明において使用し得る。
また、 本発明においては、 配列番号 7又は 9で示されるアミノ酸配列において、 1又は数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加され、 又はそれらの組^:によ り変異されたァミノ酸配列であって RPB8をュビキチン化する活性を有するタンパ ク質を使用することができる。 このようなァミノ酸配列としては、例えば、 (i)配列 番号 7又は 9で示されるアミノ酸配列中の 1〜9個 （例えば、 1〜5個、 好ましく は 1〜3個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （ii)配列番号 7又は 9で示され るアミノ酸配列中の 1〜9個 （例えば、 1〜5個、 好ましくは 1〜3 ) のアミノ酸 が他のァミノ酸で置換されたァミノ酸配列、 (ϋϊ)配列番号 7又は 9で示されるアミ ノ酸配列に 1〜 9個 （例えば、 1〜5個、 好ましくは:！〜 3個） のアミノ酸が付加 したァミノ酸配列、 (iv) 上記 (i)〜(iii)の組合せにより変異されたァミノ酸配列など が挙げられる。 配列番号 7又は 9で示されるアミノ酸配列において 1又は数個のァ ミノ酸が置換される^^、 置換前のアミノ酸の性質に似た性質のアミノ酸に置換す ることが望ましい。 したがって、 例えば、 酸 ίίアミノ酸同士、 塩 |4アミノ酸同士 など、 性質の似たアミノ酸間の置換は、 タンパク質の性質を保持する置換として好 ましい。 置換されるアミノ酸の数及び部位は特に限定されない。 さらに、 配列番号 7又は 9で示されるァミノ酸配列と少なくとも 80%以上、 好ましくは 90%以上、 より好ましくは 95%以上、 さらに好ましくは 97%以上の同一性 （相同性） を有す るタンパク質も本発明において使用し得る。 さら,に、 これらのアミノ酸配列の一部 の配列を使用することも可能である。
配列番号 7又は 9で示されるァミノ酸配列にぉレ、て、 1又は数個のァミノ酸に欠 失、 置換又は付加などの変異の生じたアミノ酸配列をコードする DNA は、 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.J (Cold Spring Harbor Press (1989) )、 「 Current Protocols in Molecular Biology」 (John Wiley & Sons (1987-1997) )、 Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、 Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763'6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法 に従って調製する。
また、 上記のように変異を有するタンパク質を調製するために DNAに変異を導 入するには、 Kunkel法や Gapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用 した変異導入用キット、例えば QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (ス トラタジーンネ: h )、 GeneTailor™ Site-Directed Mutagenesis System (ィンビト ロジェン社製）、 TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K、 Mutan-Super Express Km等：タカラバイォネ： fc ) 等を用いて行うことができる。 BRCA1-BARDは、 それぞれをコードする遺伝子を発現させてタンパク質を産生 させ、 それらを混合することにより得ることができる。 また、 BRCA1及 O¾ARD を 現させることもできる。 これらの手法は、 当分野において周知である (「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ea.J (Cold Spring Harbor Press (1989) 等を参照） 。
NPMは、 BRCA1- BARD1ュビキチンリガーゼの基質である。 全ての細胞におい て、 リボゾーム生合成、 アポトーシス抑制、 ヒストンシャペロン機能など、 多様な 生物学的活性を有する。 ヌクレオフォスミンには、 例えば、 ヌクレオフォスミン/ B23/ N038 (NPM)が含まれる。
' 本明細書において、 「ュビキチン化」 （Ubィ匕） とは、 ポリュビキチン鎖による細 胞内タンパク質の迅速かつ可逆性の翻訳後修飾を意味し、 ュビキチン活性化酵素 (El)、 ュビキチン結合酵素 (E2)およびュビキチンリガーゼ (E3)などの酵素が協同し て、 基質となるタンパク質にュビキチンを次々と結合させていく過程である。
この過程は E1と Ubの C末端とのチオールエステル結合の形成で開始し、 その 後 E2の活性部位である Cysに Ubが転移する。 この過程のほとんどの.部分にっレヽ て、 Ubの C末端と基質のリシン残基と.のィソぺプチド結合の形成は、 E3として知 られるタンパク質またはタンパク質複合体を伴う。 E3は E2を認識し、 E2力 ら基 質への Ubの転移を促進する。 E3は、基質における Ub分子鎖の形成を触媒するう えで重要な役割を果たし、 プ t3テアソームによる認識において非常に重要である。
76残基を有するポリペプチドであるュビキチンは、他の細胞内タンパク質との共 有結合を介して真核生物において本質的な機能を果たす。 この修飾における最も特 徴的な役割は、 少なくとも 4つのュニットのュビキチン鎖が転移した後に、 26Sプ 口テアソームによりタンパク質を^?するための標的にすることであり、 ュビキチ ン上の Lys-48を介したュビキチン-ュビキチン連結による。 これはポリュビキチン 化と呼ばれる。 近年、 一つのタンパク質部位への一つのュビキチンの付加 （モノュ ビキチン化)、または複数のタンパク質部位に一つのュビキチンが付加すること （マ ルチュビキチン化） が報告されている。 また、 最近、 BRCA1-BAED1 が従来とは 異なる Lys-6結合型ポリュビキチン鎖の形成を触媒することが見出されたが、 それ は、 ^の標的とされる代わりに、 n 'roにおいて、 精製 26Sプロテアソームに より脱ュビキチンィ匕されるというものである。 「ュビキチン化を抑制する」 とは、 上記ュビキチン化が完全に又は部分的に起こ らないようにすることを意味する。 本明細書において、 「： NAポリメラーゼ」 とは、 DNA鎖を «として用いて 5' →3'方向に mRNAを合成する酵素を意味する。 RNAポリメラーゼは、 天然に存在 する RNAポリメラーゼおよび上述した活性を有する変異型酵素を含む。 例えば、 RNAポリメラーゼ I、RNAポリメラーゼ II、および RNAポリメラーゼ ΠΙを含む。 本明細書において、 「共通サブユニット」 とは、 すべての RNAポリメラーゼ （例 えば RNAポリメラーゼ I、 RNAポリメラーゼ II、 および RNAポリ'メラーゼ III) が共有するサブユニットを意味する。 本明細書において、 「DNA損傷環境」 とは、 ¾l†線等により DNA分子に生じる 構造変化を起こす環境、 すなわち、 DNA合成、 DNAから RNAへの転写、 及びそ れに続くタンパク質翻訳のいずれかが阻害される環境を意味し、 RNAポリメラー ゼの不活性化、 DNAポリメラーゼの不活性化、 DNAリガーゼの不活性化、 ヌクレ ォチド除去修復機能の機能抑制、 DNAメチル化などが生じる環境をいう。 このよ うな DNA損傷環境としては、 例えば紫外線 (UV) 照射、 X線照射、 化学物質、 活 性酸素などが挙げられる。 2. BRCA1-BARD1による RNAポリメラーゼの共通サブュニットのュビキチン化 BRCA1 はュビキチンリガーゼとして生化学的に機能するが、 その生物学的な重 要性は特に DNA損傷反応においてあまり知られていなレ、。
本発明者は、 BRCA1欠損細胞における UV感受性の根底にあるメカニズムを同 定した。 RPB8をュビキチン化する BRCA1の欠損によって、 RNAポリメラーゼ IIの長期間のリン酸ィ匕に加えて UV感受性が生じる。 この結果は、 DNA損傷反応 における BRCA1のュビキチンリガーゼ活性の重要性を強調するだけではなく、 発 癌において RNAポリメラーゼが果たしている役割を更に分析することを可能にす る。 さらに、 本発明者の結果は、 DNA損傷を起こす抗癌剤に対する乳癌の感受性 を予測する手段を することにより、 臨床に応用して癌の治療の成功につなげる ことができる。
BRCA1は S期の間、 分散した核の fociに局在する。 DNA損傷後、 BRCA1は ATM/ATRファミリ一キナーゼによってリン酸化され （Cortezら、 1999; Tibbetts ら、 2000)、 BRCAl fociは 30分で分散する （Scullyら、 1997b)。 これら病巣は異 なる foci に徐々に再会合し、 その場所で BRCA1 は Rad50-Mrell-Nbsl複合体 (Zhongら、 1999) または Rad51および PCNA (Scullyら、 1997b) と協同し、 損傷した DNAを修復する。 fociは、 DNA損傷が発生してからおよそ 1時間後に観 察され始め、 6 時間から 8時間後にピークに達し、 損傷後 12 時間まで残存する (Zhongら、 1?99)。 ほとんどの部分は、 S期の fociは BRCA1で構成されて進行 的であり、高リン酸化された pol IIからなり、それは DNA損傷で解離する （Krum ら、 2003)。 、
pol IIは、転写共役 DNA修復経路において非常に重要な役割を果たす。 pol IIは、 損傷した DNA部位を迅速に認識し、 その部位に留まることにより損傷の存在をシ グナル提示する。 pol II は CSA ( ケイン症候群 A群遺伝子産物 （Cockayne syndrome group A) ) およひ CSB (Cockayne syndrome group B) で さォし、 その後 TFIIH (Transcription factor II H) ,並びに XPG (色素性乾皮症 (xeroderma pigmentosum) G群遺伝子産物）、 XPF (色素性乾皮症 F群遺伝子産物）、及び ERCC1 excision repair cross-complementing rodent repair denciency' complementation group 1) を含む複合体が動員され、 ヌクレオチド除去修復機能 を^^する （van den Boomら、 2002)。 無傷の細胞では、 pol IIの高リン酸化形態 はその後、 前開始複合体の新しい領域に組み込まれるために脱リン酸化される。
BRCA1は、 進行的 pol II複合体と会合するため （Krumら、 2003)、 pol II複合 体が細胞に留まるときに、 pol II 複合体と共に存在すると考えられる。 従って、 BRCA1は DNA損傷のセンサーとして機能するようである （Lane、 2004)。 しか しながら、 DNA損傷後、 BRCA1が S期の fociから解離する前 （留まった pol II に対する BRCA1の役割を含む）に起こる初期段階の現象は、明らかではなかった。 本発明においては、 BRCA1力 この DNA損傷後の初期段階において pol II複 合体の要素である RPB8をポリュビキチン化することを示すものである。 この現象 のタイミングは、 留まった pol IIから BRCA1が解離する前の期間と一致する。 重 要なことに、 RPB8のュビキチン抵抗性変異体は活性型 RNAポリメラーゼを形成 することができるが、 UV照射から 6時間の間、 RPpiの高リン酸化形態に結合し たままであった。 このことは、 BRCA1による RPB8のュビキチン化は、損傷 DNA から ροΙ Πの解離を引き起こすことを示すものである。 BRCA1の機能を欠損した細胞は、 IRや UV照射を含む一連の DNA損傷剤に感 受性を示すことがよく知られている （Abbott ら、 1999; Venkitaraman、 2002)。 しかしながら、 この現象の根底にあるメカニズムは十分に理解されていなレ、。 この メカニズムとして、 チェックポイント機能が欠損すると感受性の原因となる、 とい う可能性があるが、 S期チェックポイントの選択的抑止も G2チェックポイントそ れ自身の選択的抑止も DNA損傷後の細胞生存率の低下に帰するものではないこと が報告されてきた （Xuら、 2002a; Xuら、 2002] )。 従って、 BRCA1の S期また は G2期の細胞周期調節機能以外のいくつかの機能が DNA損傷後の細胞生存率に 影響し得ることが提唱されてきた （Xuら、 2002b)。
本発明においては、 RPB8のュビキチン抵抗性変異体を安定発現する細胞は UV 感受性を有することが示された。 したがって、 本発明は、 従来明確にされていなか つた理論的不備を補う BRCA1の機能を«するものであ,る。
本発明におレ、て、 変異体 RPB8を含む pol II複合体を UV照射すると、 RPB1の 長期間の高リン酸化が観察された。 これは、 損傷部位に留まったポリメラーゼとし て特徴付けられる形態に類似しており（Rockxら、 2000; van den Boomら、 2002)、 極めて毒性の高い DNA損傷により生ずる効果である （van den Boomら、 2002)。 さらに、 UV照射により転写の阻害が引き起こされるが、 転写が阻害されると、 ァ ポトーシスを強力に誘導する （Ljungmanおよび Zhang、 1996)。
ュビキチン抵抗性 RPB8変異細胞にぉレ、て、かなりの量の内在性野生型 RPB8の 発現が見られることは興味深い （図 7A)。 このことは、 細胞の生存に非常に重要な 遺伝子を沈黙させて RNAポリメラーゼの回復を部分的に抑制するだけで、 細胞死 を誘導することができることを示している。また、損傷部位に留まった変異型 RPB8 を含む pol II複合体は、 続いて野生型複合体の後にさらなる足止めを引き起こす可 能性がある。 この考えを支持する根拠としては、 核においてマイクロビームを用い た UV照射により局所的損傷を誘導することによって、 核の至る所で転写阻害が引 き起こされたことが挙げられる （Takedaら、 1967)。 最近、 BRCA1-BARD1によるリン酸化 RPB1のュビキチン化が 2つのグループ から報告された （Kleiman ら、 2005; Starita ら、 2005)。 一つのグループは、 RPB1-CTD (RPB1の C末端側ドメイン） の Ser5の高リン酸化形態の選択的ュビ キチン化を示した （Staritaら、 2005)。 RPB1の CTD中にある 8つの Lys残基す ベての変異は、 UV照射後においてュビキチン化に影響しなかったので、 このュビ ^チンィ匕は既に報^されている DNA損傷後の RPB1のュビキチン化と異なる可能 性が高い （Ratnerら、 1998)。 もう一つのグループは、 ポリメラーゼ複合体中のリ ン酸化した RPB1のュビキチン化を示した （Kleimanら、 2005)。 彼らの条件下で は切断された高リン酸化型 RPB1-CTD断片のュビキチンィ匕は検出されなかった。 BRCA1及び BARD1をダブルノックダウンす と、 UV照射により抑制されてき たリン酸化 01'11の発現レべルが回復したので、：811〇 1-8^101は、留まった RPB1 の を開台し得ることが提唱された。 しかしながら、 BRCA1/BAED1 ダブルノ ックダウンは、 UV照射後におけるリン酸化型 RPB1のュビキチンィ匕には影響しな かった。
従って、 BRCA1/BARD1ダブルノックダウンによるリン酸化 pol IIの発現レべ ルの回復は、 間接的な影響による可能性があった （Kleimanら、 2005)。
本発明の結果を考慮すると、 UV照射後におけるリン酸化 RPB1の発現レベルの 上昇は、 RPB8のュビキチン化の欠損による可能性があった（図 8)。しかしながら、 BRCA1-BARD1によるリン酸化 RPB1の in vitroでのュビキチン化 (Kleimanら、 2005) は、 その直接的な役割を強く支持する。
すなわち、 RPB8のュビキチン化は BRCA1によって生じ、 DNA損傷時に転写 を停止させ、 細胞のアポトーシスを防ぐ作用があると考えられる。
BRCA1欠損株では DNAは IRや UV照射に対して感受 '14を有し、 また、 RPB8 のュビキチン抵抗株 （即ちュビキチン化が起こらない変異体） でも UV照 感受性 を示している。 この結果は、 BRCA1を介した RPB8のュビキチンィ匕が細胞におけ る UV抵抗性に関与することを示すものと考えられる。
また、 RPB8のュビキチ 化に対し抵抗性を示す細胞では、 長時間の UV照射に よる RPB1の高リン酸化が検出されている。
Kleimらの実験から、 U V照射による BRCA1-BARD1欠損株の RPB1のリン酸 化は、 間接的な影響によるものと示唆される。 、
つまり、 後述の実施例で示された結果は、 RPB1のリン酸化と、 BRCA1-BARD1 を介した RPB8のュビキチンィ匕との間には関連がある事を強く示唆したものである。 言い換えると、 BRCA1-BARD1により RPB8がュビキチンィ匕されることによりリ ン酸ィ匕を受けた RPB1もュビキチンィ匕され される。 実施例のデータは、 UV照 射等により DNAが損傷を受けた状態では、 ポリメラーゼ IIとの解離が生じ、 転写 がストップするという事を示唆したものである。 この点を解析する方法は、 in vivoでの RPB1のュビキチン化のタイミングを分 析することである。以前の報告で示された RPB1のュビキチン化は UV照射後 2時 間で起こり、、そのとき BRCA1は、 すでに pol II力 ら解離し、 DNA修復機構に再 局在するというものであった （Cortezら、 1999; Tibbettsら、 2000)。
DNA損傷後初期の段階で、 RPB1及び RPB8は BRCA1によって一時的に、 同 時にュビキチン化される可能性があり、 このことは DNA損傷部位から pol IIホロ 酵素を解離する結果となり得る。 これを支持する根拠として、 RPB1が pol II複合 体において RPB8と直接相互作用することが挙げられる （Cramerら、 2001)。 後 期段階で生じる RPB1のュビキチン化および分解は、 Rsp5などの他の E3 リガ一 ゼによつて媒介される可能性がある（Huibregtseら、 1997) (Bea denonら、 1999)。 NCBIデータベース：
http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=searcn&DB=snp
においては、 ヒト RPB8の翻訳領域において、 RPB8のアミノ酸配列の 13番目 のリシンをァスパラギン酸に変異させる置換を有する多型 (K13E) 及ぴ RPB8 のアミノ酸配列の 19番目のァラニンをグリシンに変異させる置換を有する多型 (A19G) という 2つの一塩基多型 (SNPs) が存在することは注目に値する。 BRCA1による RPB8のュビキチン化は、 K13が変異した場合わずかに減少した (図 6)。 A19Gの置換もまた、 それが連続した 2つのリシン残基である K20/K21 の直前にある場合にュビキチン化に影響する可能性がある。
RPB8のアミノ酸配列のうち、 5個の Lys残基を Arg残基に置換すると、 内在性 の野生型タンパク質と比較して少ない発現量ではあるが、 DNA損傷に対する感受 性を引き起こす。 従って、 RPB8の SNPsは、癌につながる軽度の遺伝的不安定性 を引き起こす可能性がある。 また、 それらの SNPsは抗癌剤に対する感受性を引き 起こし得る。 これらめ SNPsのュビキチン化能についての臨床的関連性は、 明らか にすべき最も重要な事項の一つである。
' RPB8が RNAポリメラーゼの 3種のクラス全てに共通することは注目すべきで ある （Briandら、 2001; Shpakovskiら、 1995)。 pol IIは全 RNAのうち約 5%に 過ぎない mRNAを合成するのに対し、 pol I及ぴ pol IIIは、 全 RNAのうち残り 95%を構成する rRNA、 tRNA、及び全ての非翻訳短鎖 RNAを合成する。従って、 それらの複合体の修飾は、 pol IIよりもむしろ、 細胞条件に非常に大きな影響を与 えるかもしれなレ、。 例えば、 最近の研究により、癌発生において pol III,による転写 (White, 2004) に関する重要な役割が明らかにされた。
RPB1は活発に研究されてきたが、 DNA損傷反応における RPB8の役割は不明 なことが多い。 しかしながら、本発明において、 BRCA1によって媒介される RPB8 のュビキチン化は、 DNA損傷時又は非損傷時に対する反応のいずれに対しても、 発癌における RNA ポリメラーゼの役割について更なる証拠を提供するとともに BRCA1の癌抑制機能に新しい知見を »するものである。
したがって、 本発明は、 RNAポリメラーゼのュビキチンィ匕によるアポトーシス および転写制御の分野に使用することができ、 BRCA1を介する RPB8のュビキチ ン化を制御する事により、 細胞の DNA損傷に対する感受性を変ィ匕させ、 DNA損 傷を引き起こす薬剤による癌などの治療に利用できる点で有用である。
3. BRCA1-BARDを含む医觀且成物
本発明は、 BRCA1-BARD1、 又は BRCA1-BARD をコードする遺伝子を含む、 癌を治療する方法、及び癌を治療ための医難成物に関する。 BRCA1-BAED1は、 RPB8をュビキチンィ匕して癌を抑制する。 したがって、 本発明の医薬組成物は、 癌 を治療するため用いられる。
本発明の医藤成物の適用疾患としては、癌などの細胞増殖性疾患が挙げられる。 本発明の医薬組成物を疾患に適用するにあたり、 上記疾患は単独の場合であっても 複数の疾患が併発した場合であってもよい。
本発明の医毅且成物を癌の治,として使用する場合は、 癌の種類は特に限定さ れず、 脳腫瘍、 舌癌、 咽頭癌、 肺癌、 乳癌、 食道癌、 胃癌、 難癌、 胆道癌、 胆嚢 癌、 十二指腸癌、 大 癌、 肝癌、 子宮癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 腎癌、 膀胱癌、 横紋 筋肉腫、，線維肉腫、 骨肉腫、 軟骨肉腫、 皮膚癌、 各種白血病 （例えば急性骨髄性白 血病、 急性リンパ性白血病、 慢性骨髄性白血病、 慢性リンパ性白血病、 成人型 T細
Jfe白血病、 悪性リンノ腫） 等を対象として適用される。 '
上記癌は、 原発巣であっても、 転移したものであっても、 他の疾患と併発したも のであってもよ,い。 '
本発明の医学的組成物は、 BRCA1-BAEDが患部の細胞内または目的とする組織 の細胞内に取り込まれるような形態で用いられる。
本発明の医難成物の投与形態は、 経口、 非経口投与のいずれでも可能である。 経口投与の は、 適当な剤型、 例えは'錠剤、 丸剤、 糖衣剤、 カプセル、 '液剤、 ゲ ル、 シロップ、 スラリー、 懸濁物により投与が可能である。 非経口投与の場合は、 »剤型（例えばネフライザ一などを用いたもの）、経鼻投与剤型、 投与剤型（例 えば軟膏、 クリーム剤)、注射剤型等が挙げられる。 ¾lt剤型の場合は、例えば点滴 等の静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射等により全身又は局部的に直 接的又は間接的に患部に投与することができる。
本発明の医藤且成物を遺伝子治,として使用する場合は、 本発明の医 »成物 を ¾ttにより直接投与する方法のほか、 核酸力 S組込まれたベクターを投与する方法 が挙げられる。 この 、 BRCA1-BARD1は、 BRCA1及び BAEDを 現させ る形態で使用することも、 BRCA1-BARD1複合体をコードするように融合遺伝子 として使用してもよい。
上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、 へノレぺスウイ/レスベクター、 ワクシニアウイノレスベクター、 レトロゥイノレスべクタ 一、 レンチウィルスベクター等が挙げられ、 これらのウィルスベクターを用いるこ とにより効率よく投与することができる。
また、 本発明の医薬組成物をリボソームなどのリン脂質小胞体に導入し、 その小 胞体を投与することも可能である。 本発明の医猶且成物を保持させた小胞体をリポ フエクシヨン法により所定の細胞に導入する。 そして、 得られる細胞を例えば静脈 内、 動脈内等から全身投与する。 脳等に局所投与することもできる。 本発明の医薬 組成物を目的の繊又は器官に導入するために、 市販の遺伝子導入キット （例えば アデノエクスプレス ：クローンテック社） を用いることもできる。 リボソーム構造 を形成するための脂質としては、 リン脂質、 コレステロール類や窒素脂質等が用い られる力 —般に、 リン脂質が好適であり、 ホスファチジルコリン、 ホスファチジ ノレセリン、 ホスファチジノレグリセローノレ、 ホスファチジノレイノシトーノレ、 ホスファ ジルエタノールァミン、 ホスファチジン酸、 カルジォリピン、 スフインゴミエリ ン、 卵黄レシチン、 大豆レシチン、 リゾレシチン等の天然リン脂質、 あるいはこれ らを定法に従って水素添加したものが挙げられる。 また、 ジセチルポスフエート、 ジステアロイルホスファチジルコリン、 ジパルミ トイルホスファチジルコリン、 ジ パルミ トイルホスファチジルエタノールァミン、 .ジパルミ トイルホスファチジノレセ リン、 エレォステアロイルホスファチジルコリン、 エレォステアロイルホスファチ ジルェタノールァミン等の合成リン脂質を用いることができる。
リポソームの製造方法は、 遺伝子が保持されるものであれば特に限定されるもの ではなく、慣用の方法、例えば、逆相蒸発法 (Szoka、Fら、 Biochim. Biophys. Acta, Vol. 601 559 (1980))、 エーテル注入法 (Deamer、D.W.: Ann. N. Y. Acad. Sci.， Vol.308 250 (1978))、界面活性剤法 (Brunner、 Jら: Biochim. Biop ys. Acta, Vol. 455 322 (1976))等を用いて製造できる。
これらのリン脂質を含む脂質類は戦虫で用いることができるが， 2種以上を併用 することも可能である。 このとき、 エタノールアミンゃコリン等の陽 14基をもつ原 子団を分子内に有するものを用いることにより、 電気的に陰性の遺伝子の結合率を 増加させることもできる。 これらリボソーム形成時の主要リン脂質の他に一般にリ ポソーム形成用添加剤として知られるコレステロール類、 ステアリルァミン、 α— トコフエロール等の添加剤を用いることもできる。 このようにして得られるリポソ ームには、患部の細胞又は目的とする組織の細胞内への取り込みを促進するために、 膜融合促進物質、 例えば、 センダイウィルス、 不活化センダイウィルス、 センダウ ィルスから精製された膜融合促進タンパク質、 ポリエチレンダルコール等を添加す ることができる。
本発明の医 且成物は、 常法にしたがって製剤化することができ、 医薬的に許容 されるキャリアーを含むものであってもよレ、。 このようなキャリア一は添加物であ つてもよく、'水、 医薬的に許容される有機溶剤、 コラーゲン、 ポリビエルアルコー ノレ、 ポリビニルピロリ ドン、 カルボキシビ二ルポリマー、 カルポキシメチルセル口 ースナトリウム、 ポリアクリル酸ナトリウム、 ァノレギン酸ナトリウム、 水溶性デキ ストラン、 カルポキシメチルスターチナトリウム、 ぺクチン、 メチルセルロース、 ェチルセルロース、 キサンタンガム、 アラビアゴム、 カゼイン、 寒天、 ポリエチレ ングリコール、 ジグリセリン、 グリセリ,ン、 プロピレングリコール、 ワセリン、 パ ラフィン、 ステアリルアルコール、 ステアリン酸、 ヒ ト血清アルブミン、 マンニト ール、 ソルビトール、 ラクトース、 医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙 fられる。 '
上記添加物は、 本発明の治； Mの剤型に応じて上記の中から^?虫で又は適: ¾且み 合わせて選ばれる。 例えば、 注射用製剤とレて使用する場合、 精製された BRCA1 BARD又はその遺伝子を溶剤 (例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等) に溶解し、 これに ween80、 Tween 20、 ゼラチン、 ヒト血清アルブミン等を加え たものを使用することができる。 あるいは、 使用前に溶解する剤形とするために凍 結乾燥したものであってもよい。 凍結乾燥用賦形剤としては、 例えば以下のものが 挙げられる。 すなわち、 マンニトール、 ブドウ糖、 ラタトース、 スクロース、 マン 二トール、 ソルビトール等の糖類、 トウモロコシ、 コムギ、 イネ、 ジャガイモまた は他の植物由来のデンプン等のデンプン、 メチルセルロース、 ヒドロキシプロピル メチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリゥム等のセルロース、 ァ ラビアゴム、 トラガカントゴム等のゴム、 ゼラチン、 コラーゲン等などである。 所望により、架橋されたポリビニルピロリ ドン、寒天、アルギン酸又はその塩（例 えば、 アルギン酸ナトリウム） 等の崩翻又は可溶化剤を使用することができる。 本発明の医薬組成物の投与量は、 年齢、 性別、 症状、 投与経路、 投与回数、 剤型 によって異なる。 投与方法は、 患者の年齢、 症状により適宜選択する。 有効投与量 は、 疾患の徴候又は状態を軽減する量である。 医薬組成物の治療効果は、 細胞培養 又は実験動物における標準的な薬学的手順、 例えば ED50(^団の 50%において治 療的に有効な用 *)、 あるいは LD50樓団の 50%に対して致死的である用:！)によつ て決定され得る。
治療効果と毒性効果との間の用量比は治；^数であり、 ED50ZLD50として表さ れ得る。 本発明の医難且成物の投与量は、 例えば 1回につき体重 1 k あたり 0.1 μ g〜： 100 mg、 好ましくは 1〜： LO gである。 但し、 上記治,はこれらの投与量に 制限されるものではない。 アデノウイルスを投与する の投与量は、 1日 1回あ たり 106〜： L013個程度であり、 1週〜 8週間隔で投与される。 但し、本発明の医薬組 成物はこれらの投与量に制限されるものではなレ、。
.以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら実 愈例に限定される,ものではない。 実施例 '
1 . 材料と方法
まず、 本実施例において採用された各種実験手法を以下に示す。
( 1 ) 2D-DIGE
2D-DIGE解析は、 使用説明書 （Amersham) に従って実施した。 すなわち、 ェ ピルビシンで処理してレヽなレ、細胞又は処理した細胞のレ、ずれか一方を回収し、 冷洗 灘衝液 (10 mM Tris-HCl (ρΗ 8·0)、 5 mM MgAc) で 3回" ぎ、 溶解緩衝液 (7M尿素、 2Mチォ尿素、 4% CHAPS, 30 mM Tris-HCl (pH 8.0)) 中で超音波 処理により可溶ィ匕した。 可溶化液は 12,000g、 4°Cで 10分間遠心分離し、 上清を回 収した。 ェピルビシンで処理していないサンプル、 処理したサンプル、 又はそれら の両方を 1 : 1で混合したサンプノレのいずれかから得られた 50 μgのタンパク質を それぞれ蛍光色素 Cy3、 Cy5、 または Cy2で標識した。
異なる標識をした 3つのサンプルすべてを混合し、 一次元電気泳動による分離に 関しては 24 cmのシグモイド固定化 pH勾配等電点電気泳動ゲル (IPG) (ρΗ 3·10; Amersham) ス トリ ップにアプライした。 等電点電気泳動は Multiphor II (Amersham) を用いて実施した。
次に IPG ストリップを、 6M尿素、 30% グリセロール、 2% SDS、 0.05 M Tris-HCl (pH8.0) 及び 0.5% DTTを含有する謹で 15分間 化し、 DTTを 4.5%のョ一ドアセトアミド含有 ¥ &緩衝液で置換することによりブロックした。 次に、 目的タンパク質を 12.5% ポリアクリルアミ ドゲルにより分離した (SDS-PAGE)o 2D分離ゲルば Typhoon 9400 (登録商標） イメージアナライザー (Amersham) を用いてスキャンした。 対照サンプルとェピルビシン処理したサン プルとで有意に異なるタンパク質のスポットを、 Cy、2で標識した混合タンパク質を 内部標準として用いて Decyder (登録商標） version 5.01 software (Amersham) により同定した。
タンパク質の同定のためには、 ェピルビシンで処理してレヽなレ、細胞と処理した細 胞との混合物 lmg を上記の 2D ゲルによって分離し、 Sypro Ruby (Molecular Probe) で染色した。 目的のタンパク質のスポットはゲルから切り出し、 In Gel Digest Kit (MiDipore) を用いて使用説明書に従いトリプシンで消ィヒした。ぺプチ ド断片は上記 LC/MS/MS解析に供した（Nishikawaら、 2004)。 National Center for Biotechnology Information (NCBI)のタンパク質データベースで検索して得ら れた衝突誘起解離スぺク トノレを Mascot software program (Matrix Science ^ London, UK) で 祈した。
( 2 ) プラスミド
ヒト RPB8の全長 cDNAは、 P&ポリメラーゼ （Stratagene) を用いて HeLa 細胞の cDNAライブラリ一から PCRにより増幅した。 増幅したヒト RPB8の全長 cDNAを、 N末端側に FLAGタグを有する pcDNA3べクターまたは N末端側に GST タグを有す 6 pGEXベクターにインフレームでサブクローニングした。 BRCA1、 BAED1、 ュビキチン、 およびその変異体の哺乳類発現プラスミドは公知のものを 使用した （Hashizumeら、 2001 ; Nishikawaら、 2004)。
RPB8の Lys残基を部位特異的変異（Stratagene) により Arg残基に置換する点 突然変異を導入した。 使用したプラスミドはすべて DNAシークェンシングにより 配列を ½¾、した。
( 3 ) 細胞培養およびトランスフエクシヨン
T47D、 MCF7、 HCC 1937乳癌由来細胞株、 HeLa子宮頸癌由来細胞株、 および 形質転換されたヒト腎臓由来細胞株 293T を、 10%牛胎児血清および 1% 抗菌- 抗真菌剤 （Life Tfechnologies, Inc) を添加した Dulbecco's Modified Eagle's培地 (DMEM)で 5% C02、 37 °Cで.培養した。正常ヒト上皮細胞 MCF10Aを 2.5%牛胎 児血清、 100 ng mlコレラ毒素 20 ng/ml EGF、 500 ng/mlヒ ドロコルチゾン、 10 g/mlインスリン、 および 1%抗菌-抗真菌剤を添加した DMEM/Ham's F12 (1:1) 培地で増殖させた。 ェピルビシン処理に関しては、 胞は 0.2 μδ/πύのェピルビシ ン （Pfizer) 含有培地において所定時間インキュベートした。 in vivoでのタンパク 質の半減期を調べるために、 細胞を 10 g/ml シクロへキサミド （Wako) 中で所定 期間インキュベートした。 293T細胞は、 標準的なリン酸カルシウム沈殿法を用い てトラ スフエタトした。 それぞれのトランスフエクシヨンに関し、 全プラスミド DNA量は、 pcDNA3空べクターを加えることで等量に調整した。野生型 RPBまた 変異型 FLAG-RPB8のいずれ力一方を安定発現する細胞株を作製するために、そ れぞれのタンパク質をコードする pcDNA3を、 FuGENE6 (登録商標） （Roche)を 用いて HeLa細胞にトランスフエタトした。 '
トランスフエクシヨンから 48時間後に細胞懸濁液を希釈し、播種し、 0.5 mg/ml G418で選別した。 2週間培養を行った後形質転換体のコロニーを得て、 クローン 化した細胞をさらに増殖させ、 0.25 mg/ml G418で維持した。 UV照射実験に関し ては、 細胞を PBSで洗浄し、 所定の線量で UV光 (254nm； UVP Inc, Upland, CA) を照射し、 纏培地で所定期間培養した。 細胞生存率を位相差顕纖観察、 トリバ ンブルー排除法、 又は Lillie'sクリスタノレバイォレツト染色により測定した。
(4 ) 抗体 ，
HA (12CA5, Boehringer, Mannheim). Myc (9E10, BabCo)、 FLAG (M2, Sigma)、 ュビキチン (FK1， AffinitiX ホスホ -S5 RPB1 (H14、 COVA CE), o -及び β-チュー ブリン（DMIA+BMIB, Neomarkers), 並びにァクチン (C2, Santa Cruz)に対する 各マウスモノクローナル抗体と、 BRCA1 (C20, Santa Cruz)及び RPB1 (8WG16, COVANCE)に対する各ゥサギポリクローナル抗体は市販品を購入した。 BAED1及 び RPC155に対する各ゥサギポリクローナル抗体は、それぞれコロンビア大学のリ チヤ一ド.ベア博士（Dr. Richard Baer)およびコールドスプリングハーバー研究所 のノーリア ·ヘルナンデス博士 （Dr. Nouria Hernandez) カゝら供与された。 ゥサギ 抗 RPB8ポリクローナル抗体は、 全長ヒト GS RPBSを抗原として作製した。 免 疫したゥサギから得られた粗精製の血清を、 GST結合グノレタチオンァガロースビー ズとともにィンキュベートして抗 GST抗体を精製除去し、 次にプロティン Aァガ ロースクロマトグラフィーを行った。 対照の免疫前ゥサギ血清も同様に処理した。
( 5 ) siRNA
SMART pool (登録商標） BRCA1の siRNA混合物および対照 siRNA混合物は Dharmacon Research, Inc.から購入した。 二本鎖 RNA (最終濃度 50 nM) は、 OHgofectamine (登録商標） (Invitrogen) を用いて使用説明書に従って細胞にトラ ンスフキク トした。 レトロウイルスが発現する、 BRCA1 の mRNA の配列： 5'CUAGAAAUCUGUUGCUAUG3' (配列番号 1 )
' を標的とする shENAは、 pGPベクター、 pE-ampho ベクター、 及ぴオリゴヌ クレオチド：
5'GATCCGCTAGAAATCTGTTGCTATGTTCAAGAGACATAGCAACAGATTT CTAGCTTTTTTAT3' (配列番号 2 )
をあらかじめサブクローニングした pSINsi-hU6 レトロウイルスベクターを、 使用説明書 （TaKaRa) に従って 293Tへコトランスフエクトすることにより した。
オリゴヌクレオチド：
5'GATCCGTAAGGCTATGAAGAGATACTTCAAGAGAGTATCTCTTCATAGC CTTACTTTTTTAT3' (配列番号 3 )
は、 レトロウィルスが発現する対照 shRNAに使用した。
レトロウイルスを含む上清は、 使用するまで- 80°Cで保存した。 細胞への感染に 関して、 150 mmのプレートで培養した HeLa細胞は、ウィルス含有上清と、 8 μ^πιΐ ポリプレン （Sigma) を含有する新しレヽ培養培地とを 1:10で混合した混合液 15 ml で培養した。 細胞はトランスフエクシヨン又は感染を行ってから 48時間後に分析 した。
( 6 ) 免疫沈降および免疫ブロッテイング
免疫沈降法および免疫プロッティング法は、煮沸した 1% SDS含有緩衝液を用い て in vivoでュビキチンィ匕された基質を検出することを含むものであり、 公知方法 に従った （Nishikawaら 2004; Satoら、 2004)。
2Dゲル電気泳動後の免疫ブロッティング解析に関しては、細胞を上記の 7 M尿 素 /2 Mチォ尿素含有緩衝液で溶解した。
( 7 ) GSTプルダウンアツセィ
GSTまたは GST融合全長 RPB8タンパク質は、細菌 BL21において標準的な手 法により発現させた後、 ダルタチオンァフィ二ティークロマトグラフィ一により精 製した。 4 gの GST融合タンパク質は、 4 gの His-BARD 1"-189、並びに 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、 0.5% ΝΡ·40、 150 mM NaCl、 . 50 mM NaF及び 1 mMジ チォスレイトールを含む 1 mlの緩衝液中 25 μΐのダルタチオンァガロースビーズと 合した。 4。じで 2時間回転混合させた後、 ダルタチオン-ァガロースビーズに結 合した GST融合タンパク質を 3回洗浄し、 その後 SDS-PAGE ローディングバッ ファーで溶出 Lた。 '
( 8 ) ラン-オフ転写法
使用したラン-オフ転写法は公知方法に従った （Krumら、 2003)。 概要を説明す ると、 ラン-オフの対象となる^ Mは、 β5マーのオリゴヌクレオチド： '
5'ATTGGGTAAAGGAGAGTATTTGAGCGGAGGACAGTACTCCGGGTCCCCC CCCCCCCCCCCCCCCC3' (配列番号 4 ) 及び
相補的な 45マーのォリゴヌクレオチド：
5'GACCCGGAGTACTGTCCTCCGCTCTTTTACTCTCCTTTACCCAAT3' (酉己歹 IJ 番号 5 )
を、それぞれ 50 pmolずつ、 200 μΐのァニーリング混合液 (20 mM Tris (pH 7.4)、 l mM EDTA、 及び 0.2 M NaCl) 中で、 ァニールさせて ^Mした。
ラン-オフ転写反応物 (20 μΐ) は、 8.25 mM MgCl2、 5 牛血清ァノレブミン、 250 nM NTPs、 5 unitの Rnase阻害剤、 50 n の poly (dI-dC)、 0.05% Nonidet Ρ·40、 1 pmolのァニールしたォリゴヌクレオチド、及び 0.5 μαの [a-32P]CTPを含む。
M2ビーズ（10 μΐ) に結合した FLAG-RPB8免疫複合体を平衡化したものを、反 応液（20 μΐ)に添加し、 30 °Cで 40分間ィンキュペートし、 50 μΐの ΡΚ緩 液（300 mM酢酸ナトリウム、 0.2% SDS、 10 mM EDTA、 100 n の tRNA、及ぴ 10 の proteinase K) で反応を停止した。 次に、反応混合物を 55°Cで 20分間ィンキュベ ートし、 フエノール zクロ口.ホルムで転写産物を抽出した後、 エタノールを用いて 沈殿させた。 1本鎖 RNA転写産物を、 12% ポリアクリルアミドブ尿素ゲル上の変 性条件下で分離し、 Typhoon 9400 (登録商標）ィメージアナライザー（Amersham) でスキャンじた。
2 . 結果
( 1 ) ェピルビシン^;理後の BRCA1 ¾ ^胞中で,を受けたタンパク質である RPB8の同定
DNA損傷に反応する BRCA1-BARD1 E3リガーゼの候補基質を探索するために、 発明者は、 蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動 (2 DIGE)技術 ( fluorescence two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology) を用レヽた 0
乳癌由来の BRCA1陽 14 T47D細胞及び BRCA1欠損 HCC1937細胞を、 トポィ ソメラーゼ II. (DNAの二本鎖の切断を誘導す ） の阻害剤であるェピルビシン存 在下で 3時間ィンキュベートした。 細胞は 7M尿素 /2Mチォ尿素含有緩衝液で溶 解し、 そのプロテオームを 2D-DIGE法により^ fし、 ェピノレビシンで処理してい ない細胞のプロテオームと比較した。
興味深いことに、 T47D細胞においては、 ェピルビシン処理により発現レベルに 影響を受けたタンパク質はほんのわずかであつたのに対し、 HCC1937細胞 （図 1) においては、約 100種類のタンパク質の発現レベルが変ィ匕した （図 1、黄矢印)。 さ らに興味深いことには、 T47Dにおいて発現レべノレが著しく低下した二種類のタン パク質は、 HCC1937細胞においては発現量が変化しなかった （図 1、 左下隅の 2 つの赤矢印)。 同様の結果は、他の BRCA1無傷の細胞株においても得られた。従つ て、 本発明者は、 発現量の低下は BRCA1の存在に依存するのではないかと推測し た。
タンパク質のスポットはゲル中で消化し （in-gel-digested)、 ナノスケールキヤピ ラリ一の液体ク口マトグラフ-タンデム質量分析 (LC MS/MS) (nanoscale capillary liauid chromatoeraphvtandem mass spectrometry (LC/MS MS) analysis) 【こ供 した。 LCMS/MS分析により、 これらのサンプルは 3種の RNAポリメラーゼの共 通サブュニットである RPB8、 およびミオシン軽鎖であることが明らかとなった。 RPB8は非常に酸 14度が高ぐ、算出した分子量が 17.1 kDaの小タンパク質であり、 等電点は pi 4.34である （Shp0kovskiら、 1995)。 pol IIホロ酵素は BRCA1と 相互作用することから、 また、 pol II 中最大のサブュニットである RPB1 は BRCA1-BARD1 E3リガーゼの基質の可能性が高いことから、本発明者は RPB8に 注目して更なる分析を行った。
質量分析データの確かさを ¾ ^するために、 本発明者は免疫プロッティング に用いるゥサギ抗 GST 1PB8 ポリクローナル抗体を作製した。 細胞はェピルビシ ン処理し、 2D ゲルにより分離したタンパク質につい τ免疫ブロッテイング解析を 行った。 その結果、 タンパク質のスポットが実際に RPB8であることを確認した。 RPB8は T47D細胞 （図 2Α) においてのみェピルビシン処理によって再び著しく 減少した。 興味深いことに、 抗 RPB8抗体に反応性のある数種類のタンパク質ラダ 一が検出され、 このラダーは、 ェピルビシン処理後に高い分子量領域であってより 塩基性の ρΗ領域に移動したものである。 これらのラダ一は Ruby染色では検出で きなかつたの 、 本発明者はこれらのタンパク質が少量でしか存在していないもの と結論づけた。' .
タンパク質が少量でし力存在しない理由のひとつの可能性として、 それらのタン パク質が、ュビキチンと共有結合修飾を受けた RPB8の形態を示しているというこ とが考えられる。 しかしながら、 細胞を 0.5% NP-40含有緩衝液により溶解し、 一 次元 SDS-PAGEにより分離した^ \ RPB8の発現レベルの低下もタンパク質ラ ダーも免疫ブロッテイングにより検出されなかった （図 2B)。 このことは、 2Dゲ ル分析により観察された RPB8の発現レベルの低下は、 タンパク質^?によるもの ではなく、 むしろ、 DNA損傷に応じて RPB8 が BRCA1依存性の共有結合修飾を 受けた形態に変換したことによるものであることを示している。
( 2 ) RPB8の BRCA1-BARD1との相互作用
観察された RPB8 の修飾についての分子基盤を分析するために、 本発明者は、 RPB8 と BRCAl-BAEDlとの相互作用を、 外来性の発現タンパク質を用いて試験 した。 293T細胞に Myc-BRCAl1—772 HA-BAED1、 及び FLAG-RPB8をコトランスフ ェタトし、 BRCA1/BARD1の免疫沈降物から FLAG-RPB8の存在を探索した。 そ の結果、 対照と比較して多量の FLAG-RPB8を、 抗 Myc抗体および抗 HA抗体に よる免疫複合体の両者において検出した。 これに対し、 FLAG-RPB8 の免疫複合体 と共精製した HA-BARD1は対照と同じく検出しなかった （図 3A)。
次に本発明者は、細胞内在性の RPB8が BRCA1および BARD1と相互作用する 力 かを試験した。 BAKD1は、 対照と比較して、 未処理の HeLa細胞から単離し た RPB8と極めて多量に共免疫沈降した （図 3B、 上パネル)。 図 3Bの下パネルは MCF10Aについての結果を示すが、 MCF7、 T47D及び 293Tを含む、 試験に用 いたす 4ての細胞株において同じ結果が観察された。 .
BRCA1及び BARD1の両者は、いずれも pol ll ホロ酵素と相互作用する（C iba 及び Parvin、 2002)。従って、 ホロ酵素は BRCA1 BARD1と RPB8とを架橋して いる可能性がある。 BAED1と RPB8との相互作用が直接のものであるカゝ否かを検 ff Tるため、 本発明者は、 細菌で発現させた組換え型 GS RPB8 タンパク質及ぴ 組換え型 His-BARDl 4- 189)タンパク質を精製した。 His-BARDl (14-189)タン パク質は、 BARD1の全長ァミノ酸配列のうち、 N末端側 13個のァミノ酸を欠如さ せたものである。 そして、 GS RPBS を His-BARDl (14-189) と共沈させた。 しカゝしながら、 GSTは検出されなかった （図 3C)。 この結果は、 RPB8力 S BARD1 の N末端に直接相互作用していることを示唆している。
BARD1は BRCA1に結合し、 活性型 E3 リガーゼを形成する。 本発明者は多量 の BAED1を RPB8の免疫沈降物において検出したが、 BRCA1は検出できなかつ た。 従って、 本発明者は、 BRCA1は DNA損傷などの特別の条件下においてのみ BARD1及び RPB8と相互作用するのかもしれないと推測した。このことを試験す るために、 本発明者は MCF10A細胞を UV照射し、 照射後いくつかの異なるタイ ミングで細胞を回収した。 回収した細胞を溶解し、 細胞溶解液は、 抗 RPB8抗体を 用いた免疫沈降に供し、 続いて抗 BRCA1抗体、 抗 BARD1抗体、 又は抗 RPB8抗 体を用いて免疫プロッティングを行った。
BAED1は、 分析したすべての時点で、 抗 RPB8抗体の免疫複合体を容易に検出 することができた。 一方、 BRCA1は、 照射から 10分後では明確に検出したが、 60 分後にはほんのわずかの検出であった （図 3D)。 図 3E及び 3Fは MCF10A細胞 についての結果を示す力 T47D細胞、 MCF7細胞、 HeLa細胞及び MDA-MB435 細胞にぉレヽても同様の結果が観察された。 不思議なことに、 RPB8 と共精製した BRCA1 は、 全細胞抽出物から得られた BRCA1 よりもゆっくりと移動した。 従って、 本発^者は、 このタンパク質が実際 に BRCA1であることを siRNAの使用により証明することとした。
T47D細胞に対照 siRNAまたは BRCAl siRNAのいずれか一方をトランスフエ タトし、 次に UVをトランスフエクシヨンから 48時間後に照射した。
免疫ズロッテイングによって、 BRCA1 の発現は、 ^田胞抽出物と比較して特異 的に減少することが ½mされた （図 3F最上パネル)。 さらに、 UV照射から 10分 食に RPB8と共に検出できる BRCA1タンパク質は BRCAl siRNAにより除去され た力 対照 siRNAによっては除去されなかった （下から 2番目のパネル、 レーン 2 と 5とを比較)。 このことは、 RPB8免疫沈降物中のゆつくりと移動した生成物は、 BRCA1の修飾された形態であることを するものである。
( 3 ) in vivoにおける、 BRCA1-BARD1 による RPB8のュビキチン化およぴ安定 化
本発明者は次に、 ώ vivoにおいて RPB8が BRCA1-BAED1によりュビキチン化 する力否かを試験した。
FLAG-RPB8を HAュビキチン、 Myc-BRCAl (1-772) 、 及び BAED1 と共に 293T細胞にコトランスフエクトした。細胞をトランスフエクトしてから 36時間後 に回収し、 1% SDS 含有緩衝液中で煮沸し、 FLAG-RPB8 を免疫沈降した。 SDS-PAGEで分離した RPB8沈降物を、 抗 HA抗体を用いた免疫プロッティング にかけた。その結果、ポリュビキチン化した RPB8に特徴的なラダーが示された（図 4A) o
FLAG-RPB8, HAュビキチン、 Myc-BRCAl (1-772)又は BARD 1のいずれか を除いた場合は、 すべて RPB8 ラダーが消失した。 この結果は、 RPB8 が BRCA1-BARD1依存的にュビキチンィ匕されるという考えを支持するものである。
BRCA1/BAED1は、 Lys6結合ポリュビキチン鎖を触媒する唯一の公知 E3 リガ ーゼである（Morris及び Solomon、2004; Nishikawaら、 2004; Wu'Baerら、 2003)。 in vivoでの RPB8ュビキチンラダ一が直接 BRCA1/BARD1リガーゼ活性によるも のであることを証明するために、 本発明者は、 ュビキチンが Lys6に結合すること により RPB8が修飾されるかどうかを ½ ^した。
in vivoでのュビキチン化ァッセィのため、 結合可能な 1つの Lys残基を有する、 HA タグを'付けたュビキチンを使用した。 予想したとおり、 RPB8 の BRCAl-BAKDl依存性ポリュビキチン化は、 Lys48または Lys63ではなく Lys6 のみが結合可能な HAュビキチンを 現させた場合に、 大部分が検出された （図 4 B)。 従って、 この結果により、 観察された ώ w oにおける RPB8のポリュビキ チン化は、 BRCA1-BARD1によって直擬虫媒される とが示された。
ところで、 BRCA1/BAED1触媒によりその基質である BRCA1自身又は NPMが Lys6結合ポリュビキチン化されることは、プロテアノームによる^?のためのシグ ナノレではない （Hashizumeら、 2001; Nishikawaら、 2004; Satoら、 2004)。 従つ て、 本発明者は、 これが BRCA1/BARD1依存性 RPB8ュビキチン化の もあて はまるの力否か、 すなわち RPB8のュビキチンィ匕も、 プロテアソームによる^?の シグナルではないのかどうかを分析した。
293T 細胞に Myc-BRCAl (1-772) 及び BARD1 を共発現させた場合の、 FLAG-RPB8の定常状態レベル及びタンパク質半減期を試験した。 FLAG-RPB8の 定常状態レべノレは、用量依存的な BRCA1-BARD1の共発現により增カ卩した（図 4C)。 細胞をシク口へキサミドで処理しても、 BRCA1-BAED1 は RPB8を安定化した（図 4D) 0 これらの知見は、 本発明者が報告してきた他の基質 （Hashizume ら、 2001; Nishikawaら、 2004; Satoら、 2004) と同様に、 RPB8の BRCA1-BARD1-媒介 ュビキチン化が、非タンパク質^ W構により RPB8の機能に影響することを示す ものである。
(4 ) UV照 t†¾の、 RPB8の BRCA1依存性ュビキチン化
RPB8の BRCA1-媒介ュビキチン化は、 本発明者にこの活性の生物学的な意義を 研究するよう促すものである。
BRCA1は、転写 *¾ DNA修復において長期間役割を果たしてきた (Abbottら、 1999； Le Pageら、 2000)。 そして pol IIの最大のサブュニットである RPB1のュ ビキチン化は、 DNA損傷に対する反応にぉレ、て示されてきた (Beaudenonら、 1999; Bregmanら、 1996; Kleimanら、 2005; Leeら、 2002; Staritaら、 2005)。 従つ て、 本発明者は、 DNA損傷に対する反応において RPB8がュビキチン化されるか どう力を試験した。 '
細胞をェピルビシンに継続的に曝すよりも、 本癸明者は UV照射を採用して、 DNA損傷後の RPB8 のュビキチン化の時期を正確に決定した。 本発明者は FLAG-RPB8を安定発現する HeLa細胞株を樹立し （図 7A)、 抗 FLAG免疫沈降 物のュビキチンィ匕を分析した。 UV照射後のいくつか異なる時点で細胞を回収し、 1% SDS含有緩衝液中で煮沸し、 FLAG-RPB8を免疫沈降した。次に、 FLAG-RPB8 を FLAGぺプチドとと-もに抗体から溶出し、溶出液は抗ュビキチン抗体を用いて免 疫ブロッティングした。 RPB1のュビキチン化は UV照射後 1-2時間で起こること が報告されてきたため （Bregmanら、 1996; Kleimanら、 2005; Ratnerら、 1998; Starita ら、 2005)、 本発明者はこれらの時点を分析した。 しかしながら、 FLAG-RPB8のュビキチン化は何ら検出されなかった。
これに対し、 ュビキチンィ匕した FLAG-RPB8は UV照射から約 10分後に容易に 現れた（図 5A、上パネル、 レーン 3)。 この約 10分というタイムポイントは、 RPB8 が BRCA1と相互作用するのに必要とされる条件、 すなわち UV照射 10分後に反 応する結果 （図 3D、 レーン 3) と一致する。
さらに、抗 RPB8抗体で膜をリプローブすることにより、検出したラダーがュビ キチン化した RPB8であることを確認した （図 5A、 下部パネル)。 そのようなラダ 一は、 ュビキチン抵抗性変異体、 FLAG-RPB85KR— (後述） を安定発現する HeLa 細胞株を対 として用いた^ま全く検出されなかった （図 5A、 レーン 4-6)。
RPB8の UV照射誘導性ュビキチン化には、 BRCA1が必要とされることを する目的で、 RNAi を再度採用して内在性 BRCA1 の発現をノックダウンした。 RNAiの発現には 2つの手法を採用した。 1つは、 FLAG-RPB8 を安定発現する HeLa細胞に、 BRCA1特異的 siENAをトランスフエタトした。 もう 1つの手法と して、 本発明者は BRCA1に対する shRNAを発現するように設計されたレトロゥ ィルスを構築した。 トランスフエクシヨンまたは感染から 48時間後、 細胞に UV (35J/m2) を照射し、 その 10分後に細胞を回収した。
siRNAをトランスフエタトした細胞、および shRNAを発現するレトロウイルス を感染した細胞の両者とも、 対照と比較して BRCA1の発現を沈黙させることに成 功した （それぞれ、 〉90%および 〉75% の減少） （図 5B、 上パネル)。 予想した とおり、 UV照射後の RPB8のュビキチン化は、 BRCA1のノックダウンによって 両者とも劇的に減少した （図 5B、 下パネル)。 28-30 kDa周辺に移動した顕著な二 重のバンドは BRCA1のノックダウンによって完全に消失した。 これらの結果は、 DNA損傷の初期段階において、 RPB8が BRCA1-BARD1によってポリュビキチン 化されるという考えをさらに支持するものである。
( 5 ) RPB8のュビキチ/ ½抗+ ^態とそのポリメラーゼ活性との関係
UV照射後の RPB8の BRCA1-媒介ュビキチンィ匕によって引き起こされる生理学 的結果を調べる目的で、 本発明者は、 BRCA1-BARD1 によってュビキチン化され なレヽ RPB8変異体を作製した。 RPB8はタンパク質全体で 8つの Lys残基を有する。 本発明者は最初、一つの RPB8の Lys残基に変異を導入し、それがュビキチンィ匕さ れ¾可能性を試験した。 しかしながら、 RPB8のュビキチン化はそれぞれ一つの残 基の変異では劇的に減少しなかつた（図 6B、レーン 2及び 7)。その代わりに、 RPB8 のュビキチン化は Lys残基から Arg残基への置換数が増加するにつれて減少した。 この結果は、 本発明者が、 BRCA1 の自己ュビキチン化に関する研究、 および BRCA1-媒介 NPMュビキチン化に関する研究の間に観察したことを再現するもの である。
8 つの Lys 残基中 5 つの残基を Arg に置換した場合 （5KR)、 RPB8 の
BRCA1-BAED1への結合能は減少しなレ、が、 RPBュビキチン化は検出不可能にな つた （図 6 B、 レーン 5)。
ュビキチンィ匕に抵抗性の RPB8を作製するために必要とされる多くの変異を導入 しても、 RNAポリメラーゼのサブュニットとしての基本的機能は障害を受けない ことを するために、 本発明者は 5KR変異体が RPB1または RPC155 (それぞ れ ροΙ Πおよび IIIの最大サブュニットである）に n oで結合できるかどうかを 確認した。
野生型 FLAG-RPB8または 5KRを 293T細胞にトランスフエタトし、 抗 FLAG 免疫複合体を単離した。 結合タンパク質は SDS-PAGEで分離し、 抗 RPB1抗体ま たは抗 RPC155抗体を用いた免疫プロッティングにより分析した。 RPB1 及び RPC155は、 両者とも FLAG-5KR中および野生型免疫複合体中で多量に検出され た （図 6C)。
次に本発明者は、 抗 FLAG抗体を用いた免疫沈降物の触媒活性をラン-オフ転写 法を用いて測定した。 5KR変異体の免疫複合体は、 野生型免疫複合体と同等の in 転写物生成能を有する （図 6D)。 従って、 RPB8の 5KR変異体は、 ポリメラ ーゼ活性を維持しながら、 in oで有効な RNAポリメラーゼ複合体を構成する。 このことは、 BRCA1-BAED1による RPB8のュビキチン化が RNAポリメラーゼ 活性を必要としていないことを示している。 ( 6 ) I^PB8のュビキチン抵抗性変異体の UVに対する感受性
RPB8の 5KR変異体を安定発現すると、 内在性の BRCA1が存在していても、 ΪΙΡΒ8のュビキチン化は生じない。
一方、 BRCA1 が欠損すると、 DNA損傷に対する感受性を引き起こす （Abbott ら、 1999; Ruf&ierら、 2001; Shenら、 1998)。 BRCA1欠損株は、 RPB8をュビ キチン化しないため、 5KR変異体と同じ表現型の原因になる。 RPB8は UV照射後 に BRCA1によってュビキチン化されるため （図, 5)、 このュビキチン化されないこ とが同じ表現型の原因となる可能性がある。 この可能性を試験するために、 本発明 者は、 FLAG-RPB8の 5KR変異体を安定発現する HeLa細胞株を榭立した。 2種の野生型のクローン （W 1及び および 2種の 5KR変異体 （5KR-1 及ぴ 5KR-2) の細胞株を得だ。 これらのクロ"ンにおける FLAG-RPB8の発現を 確認した （図 7A)。 これらの細胞を用いて、 本発明者は変異型 RPB8の発現が UV 照射後の細胞生存率に影響する力 かを試験した。 細胞生存率は UV照射から 48 時間後にトリパンブルー排除法により測定した。
その結果、 20または 35 J/m2の UV照射後の 5KRクローンの細胞生存率は、 0 時間の未処理の細胞と比較して、 それぞれ約 38%及び 23 %であったのに対し、 野 生型クローンの場合はそれぞれ約 72%及び 53 %であった （図 7B)。 HeLa細胞の 親株は野生型クローンと同様の細胞生存率を示した（図 7B)。 UV照射（35 J/m2) から 48時間後に位相差顕微鏡観察により観察された細胞を図 7Cに、および Lillie's クリスタルバイオレツト染色により染色した培養プレートを図 7Dに示した。 これらの結果から、ュビキチン抵抗性の RPB8の発現は、細胞に UV感受性を引 き起こすと 、える。
( 7 ) RPB8のュビキチン抵抗性変異体における UV照射後の長期間の RPB1のリ ン酸化
本発明者は次に、 RPB8の 5KR変異体細胞株の UV感受性に関し根底にあるメ 力二ズムを解析した。 DNA損傷に関する転写共役修復経路において、 コケイン症 候群 A (CSA) タンパク質および CSBタンパク質は、 RNAポリメラーゼ複合体を 損傷部位から置換する上で重要な役割を果たしている。 このことは、後に TFIIHを 含む修復複合体を動員することを可能にする（Rockxら、 2000; van den Boomら、 2002)。 RPB1は、 RNA伸長の間、 C末端ドメイン （CTD) において高リン酸化の 状態になり、 BRCA1は、 おそらくは DNA損傷のセンサーとして、 特にこの形態 と相互作用する。 pol llが損傷部位に残存した場合、 pol llはその高リン酸化状態を UV照射後およそ 1時間維持する。 複合体は CSA/CSBに置換した場合、 脱リン酸 化する （UV照射から 6時間以内に） （Rockxら、 2000)。 この過程は細胞の生存 に重要であり、 損傷部位に pol IIをリン酸化形態で長期間留めることは非常に細胞 毒性が高い （Ljungman及び Zhangら、 1996; van den Boomら、 2002)。
RPB8 の 5KR変異体を発現する細胞が有する UV感受性によって、 RPB8の 5KR 変異体は UV傷害の後に RPB1の長期間のリン酸化を引き起こすのかどうかが興味 の対象となる。
そこでこの点を するため、 野生型または 5KR変異 FLAG-RPB8のいずれか 一方を安定発現する HeLa細胞株を UV照射した。細胞を UV照射から 1又は 6時 間後に回収し、 CTDリピート中の Ser5がリン酸化した RPB1を認識する H14抗 体を用いた免疫プロッティングに供した。
その結果、 野生株と変皿の両方にぉレ、て、 リン酸化 RPB1の量は UV照射後 1 時間でわずかに増加し、 続いて照射後 6時間の時点で減少した （図 8、 1段目のパ ネル)。
リン酸化 RPB1の電気泳動移動度は UV照射後減少するが、 このことは、それぞ れの分子におけるリン酸ィ匕部位の数も増加していることを示している。 これらの結 果は、 UV照射後の留まった pol IIならびにその後に続く置換および脱リン酸化に ついての報告（Rockxら、 2000) と一致する。 しかしながら、 FLAG-RPB8の 5KR 変異体の免疫沈降物中の RPB1リン酸化状態は、対照として用いた野生型複合体で 起こる通常の脱リン酸化と対照的に、 UV照射後 6時間の時点でもリン酸化状態の ままであった （図 8、 3段目のパネル)。 このことは、 5KR細胞に存在する RPB1 の大部分は内在性の野生型 RPB8 と相互作用し （正確には脱リン酸化され)、，一方 5KR変異体の複合体中の RPB1は相互作用しなかったことを示している。
同時に、 この結果は、 DNA損傷部位から pol IIを置換する上で重要な役割を果 たす BRCA1により RPB8がュビキチン化されるという仮説と一 る。このこと はさらに、 ポリメラ一ゼを脱リン酸化し、 再利用して次の前開始複合体に組み A L ることを可能にする。この過程がなければ、留まった pol llは細胞死を引き起こす。
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産業上 利用可能性
本発明により、RNAポリメラーゼの共通サブュニットをュビキチン化する方法、 ビキチン化を抑制する方法、 及び DNA損傷に対する感受性細胞を樹立する方法 が # ^される。 また、 本発明により、 BRCA1-BAED1 を含む医薬組成物が さ れる。 本発明の方法は、 RNAポリメラーゼのュビキチン化によるアポトーシスお ょぴ転写制御の分野に使用することができ、 BRCA1を介する RPB8のュビキチン 化を制御する亊により、細胞の DNA損傷に対する感受性を変化させ、 DNA損傷を 弓 Iき起こす薬剤による癌などの治療に利用できる点で有用である。 また、 本発明の 医薬組成物は、 癌の治療に有用である。 .

Claims

請求 の範囲
1 . RNAポリメラーゼを BRCA1-BARD1に接触させることを含む、 当該 RNAポ リメラーゼの共通サブゴニットをュビキチンィヒする方法。
2. RNAポリメラーゼの共通サブュニットが RPB8である請求項 1に記載の方法。
3. RPB8のァミノ酸配列のうちリシン残基を変異させることを特徴とする、 RPB8 . の BRCA1によるュビキチン化を抑制する方法。
4.細胞内の RPB8のァミノ酸配列を変異させて RPB8のュビキチン化を抑制する ことにより、 当該細胞に、 DNA損傷環境に対する感受性を付与することを特徴 とする、' DNA損傷環境に対する感受性細胞を作製する方法。
5. BliCAl-BARDl又はその遺伝子を含む医薬組成物。
6 . 癌を治療するための請求項 5に記載の医猶且成物。
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