WO2007043346A1 - 核移植卵子の作製方法 - Google Patents

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WO2007043346A1
WO2007043346A1 PCT/JP2006/319311 JP2006319311W WO2007043346A1 WO 2007043346 A1 WO2007043346 A1 WO 2007043346A1 JP 2006319311 W JP2006319311 W JP 2006319311W WO 2007043346 A1 WO2007043346 A1 WO 2007043346A1
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egg
cell
nuclear transfer
treatment
cells
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PCT/JP2006/319311
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Satoshi Kishigami
Teruhiko Wakayama
Kazuhiro Saeki
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Riken
Kinki University
Japan Science And Technology Agency
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/04—Cells produced using nuclear transfer

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a nuclear transfer egg. Specifically, the present invention relates to a method for improving the incidence in somatic cell nuclear transfer techniques and artificial insemination techniques using sperm cells. Background art
  • mice-derived NT-ES cells nuclear transfer embryonic stem cells
  • fibroblasts as donor cells can be obtained in the presence of drugs such as trichostatin A, an inhibitor of histone deacetylase, and 5'-aza-2 'deoxycytidine, an inhibitor of DNA methylase.
  • drugs such as trichostatin A, an inhibitor of histone deacetylase, and 5'-aza-2 'deoxycytidine, an inhibitor of DNA methylase.
  • trichostatin A an inhibitor of histone deacetylase
  • 5'-aza-2 'deoxycytidine an inhibitor of DNA methylase
  • Non-patent Document 2 discloses immortalized rabbit milk epithelial cell lines (MECL) and rabbit embryo fibroblasts (BFF) with sodium butyrate, a histone deacetylase inhibitor, followed by nuclear transfer. It has also been reported that the rate is improved (Non-patent Document 2). These studies attempted to improve the incidence by reprogramming the nucleus after bringing the nucleus of the donor cell closer to the nucleus of the fertilized egg before the nuclear transfer. However, the effect was small and the power was not improved to the practical level.
  • MECL immortalized rabbit milk epithelial cell lines
  • BFF rabbit embryo fibroblasts
  • ROSI round spermatid injection
  • the somatic cell cloning technique is extremely useful for increasing the production of specific ushi having high economic traits and for efficiently producing a transgenic ushi useful for the production of pharmaceuticals and the like.
  • the incidence of ushi clone embryos is extremely low (Non-patent document 16, Non-patent document 17). If the incidence of cyclone embryos can be improved, the recipient females used for transplantation can be greatly saved, and their production efficiency can be significantly improved.
  • To improve the incidence adjust the cell cycle of donor somatic cells to G1 phase (Non-patent document 18, Non-patent document 19, Patent document 1), and examine gene expression in the cloned embryos produced High generation efficiency!
  • Patent Document 2 There is a method (Patent Document 2) for selecting an embryo.
  • these methods require skilled techniques to adjust the cell cycle and require special equipment to examine gene expression. Therefore, there has been a demand for improving the incidence of clonal embryos by easy methods and techniques.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-052369
  • Patent Document 2 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2006-166828
  • Non-Patent Document l Enright, B.P. et al, Biol. Reprod., 69: 896-901 (2003)
  • Non-Patent Document 2 Shi, W. et al., Biol. Reprod., 69: 301-309 (2003)
  • Non-Patent Document 3 Ma, J. et al., Biol. Reprod., 64: 1713-1721 (2001)
  • Non-Patent Document 4 Chen, Y. et al., Cell Research, 13: 251-263 (2003)
  • Non-Patent Document 5 Wakayama, T. et al., Nature, 394: 369-374 (1998)
  • Non-Patent Document 6 Kishigami, S. et al., Biol. Reprode., 70: 1863-1869 (2004))
  • Non-Patent Document 7 Christman, J.K., Oncogene, 21: 5483-5495 (2002)
  • Non-Patent Document 8 De Ruijter, AJM et al., Biochem. J., 370: 737-749 (2003)
  • Non-Patent Document 9 Santos, F. et al., Curr. Biol., 13: 1116—1121 ( 2003)
  • Non-patent literature 10 Wakayama, T. et al., J. Reprod. FertiL, 112: 11-17 (1998)
  • Non-patent literature ll Wakayama, T. et al., Nat. Genet., 22: 127-128 (1999)
  • Non-Patent Document 12 Hooper, M. et al., Nature, 326: 292-295 (1987)
  • Non-Patent Document 13 Kishigami, S. et al., Biol. Reprod., 70: 1863-1869 (2004)
  • Non-Patent Document 14 Kishigami et al., Zygote, 12: 321-327 (2004)
  • Non-Patent Document 15 Dean, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 13734-13738 (2001)
  • Non-Patent Document 16 Hill, JR et al., Biol. Reprod., 63: 1787-1794 (2000)
  • Non-Patent Document 17 Heyman, Y., et al., Biol. Reprod., 66: 6-13 (2002)
  • Non-patent document 18 Kasinathan, P. et al., Nat. BiotechnoL, 12: 1176-1178 (2001)
  • Non-patent document 19 Urakawa, M. et al., Theriogenology, 62: 714-728 (2004)
  • Non-Patent Document 20 Robl, J.M. et al., J. Anim. Sci., 64: 642-647 (1987)
  • Non-Patent Document 21 Tervit, H.R. et al., J. Reprod. FertiL, 30: 493-497 (1972)
  • Non-Patent Document 22 Takahashi, Y. et al., Theriogenology, 37: 963-978 (1992)
  • the present inventors diligently studied to solve the above problems.
  • the inventors of the present invention have used a sperm cell as a model animal, and that excessive methyl moths occur after nuclear transfer in the ovum, and that the nuclear transfer ovum is treated with an anti-methylation agent after the nuclear transfer.
  • Can suppress excessive methylo wing this treatment improves the in vitro development of cloned embryos and the birth rate of cloned animals, and the same treatment can improve the development of embryos obtained using sperm cells.
  • the present invention has been found by finding it effective.
  • the donor cells before nuclear transfer are treated with an anti-methylating agent as in the prior art, and then transferred to an oocyte and then treated with an anti-methylating agent to suppress excessive DNA methylation. This can greatly improve the low incidence of nuclear transfer embryos.
  • the main object of the present invention is to provide a method for improving the incidence in somatic cell nuclear transfer techniques and artificial insemination techniques using sperm cells.
  • a method for producing a nuclear transfer ovum comprising the following steps:
  • a method for producing a cloned animal comprising the following steps:
  • the method of the present invention improves the nuclear transfer technology used for a wide range of purposes, such as the creation of cloned animals, the establishment of ES cells (NT-ES cells) from cloned embryos, and infertility treatment using sperm cells. Useful for.
  • FIG. 1 shows blastocyst formation when treated with various concentrations of trichostatin A.
  • FIG. 2 is a graph showing the blastocyst formation rate when treated with various concentrations of trichostatin A
  • FIG. 3 shows blastocyst formation when treated with trichostatin A for various times.
  • FIG. 4 is a graph showing the blastocyst formation rate when treated with trichostatin A for various times.
  • FIG. 5 is a graph showing the blastocyst formation rate when treated with trichostatin A for various times.
  • FIG. 6 is a diagram showing a cloned mouse fetus and placenta (left) immediately after childbirth, a cloned mouse (black) and a temporary parent (white) (right) after 3 weeks.
  • FIG. 7 shows blastocyst formation of an egg transplanted with nuclei of various donor cells. Left: No TS A treatment, right: 50 nM TSA treatment.
  • FIG. 8 is a graph showing the blastocyst formation rate of an egg transplanted with nuclei of various donor cells. Shaded bars: cumulus cells, black bars: fibroblasts, white bars: ES cells.
  • FIG. 9 is a graph showing the influence of methylation on DNA and histone by TSA treatment.
  • the method for producing a nuclear transfer egg of the present invention includes the following steps:
  • a cloned animal is produced by further transplanting an egg into which an nucleus treated with an antimethylating agent obtained by the above method has been transplanted. Moreover, the nuclear transfer egg produced by the above method is also provided by the present invention.
  • any ovum having a developmental ability can be used as an ovum. Egg collection can be carried out according to a normal method. For example, an ovum can also collect animal power that has been superovulated. When using somatic cells as donor cells, it is preferable to remove the nucleus of the egg in advance (enucleation).
  • cytochalasin B may be added to destroy the cytoskeleton and prevent the polar body from being released.
  • the activation of the ovum is the force confirmed by the release of the second polar body and the formation of the two pronuclei of both sexes in the case of a normal fertilized egg. Therefore, it is judged only by pronucleus formation.
  • any cell having a nucleus can be used as the donor cell.
  • donor cells include cumulus cells, fibroblasts, nerve cells, somatic cells such as blood cells (such as T cells), germ cells such as sperm cells, and ES cells.
  • somatic cells such as blood cells (such as T cells)
  • germ cells such as sperm cells
  • ES cells ES cells.
  • nuclei obtained with somatic cells may be injected into the ovum, or the nucleus region of sperm cells may be injected into the ovum.
  • the donor cell and the ovum may be derived from the same species or different species.
  • a combination of donor cells and eggs derived from the same kind of mammal can be preferably used in the present invention.
  • the eggs of Usagi and Usushi have the ability to accept heterogeneous somatic nuclei, and the NT-ES cells were established by injecting the nuclei of human donor cells into Usagi eggs.
  • Non-patent Document 4 it is also possible to inject nuclei derived from organisms of species different from ova. Such heterogeneous nuclear transfer makes it possible to substitute eggs of other species, for example, to make up for the lack of human eggs to produce human NT-ES cells.
  • Injection of a donor cell-derived nucleus into an ovum can be performed according to a known method. Injection of somatic cell nuclei into an enucleated egg is performed, for example, according to the method described in Non-Patent Document 5. Can. Injection of a sperm cell nucleus region into an egg can be performed according to the method described in Non-Patent Document 6. Alternatively, as described in Patent Document 2, a nucleus derived from a donor cell can be injected into an egg by cell fusion between a donor cell and an enucleated egg. In addition, a cloned animal can be produced by transplanting a nuclear transfer embryo into an oviduct of an animal according to a known method as described in the above document.
  • any antimethylating agent can be used.
  • Antimethylating agents are agents that directly or indirectly inhibit DNA methylation.
  • a methylase inhibitor or a histone deacetylase inhibitor can be used as an antimethylating agent.
  • the methylase inhibitor 5'-azacitidine, 5'other 2 'deoxycytidine and the like can be used.
  • 5-Azacytidine is known to be a strong inhibitor of DNA methyltransferase, a methylating enzyme (Non-patent Document 7).
  • the histone deacetylase inhibitor trichostatin A, Apicidin, or the like can be used.
  • various drugs that can be used as histone deacetylase inhibitors are known (Non-patent Document 8). According to the present invention, these can be used alone or in any combination!
  • the concentration of the anti-methylation agent in the medium can be set appropriately using the effect of the present invention, that is, the improvement in the incidence, as an index.
  • the concentration is, for example, 0.5 to 500 nM, preferably 5 to 50 nM.
  • the appropriate concentration may vary depending on the animal species and somatic cell types used. One skilled in the art can determine an appropriate concentration based on the description herein.
  • the treatment period with the anti-methylation agent is preferably set so as not to inhibit the suppression of genes important in the normal developmental process.
  • treatment with an anti-methylation agent may cause the re-programming of the genome (the process of returning somatic cells and other nuclei to fertilized egg-like nuclei, also referred to as “initialization”). It is preferable to suppress the methylation of DNA and to terminate it before the start of embryonic gene activity following reprogramming.
  • the treatment with an anti-methylating agent is performed, for example, after the nuclear transfer and before the end of remethylation. The end of remethylation can counteract methylation levels in developing embryos.
  • the treatment with an anti-methylation agent is carried out for a period of time after the nuclear transfer and up to 20 hours after the ovum activity, more preferably after the nuclear transfer and up to 10 hours after the ovum activity. Is called. If treatment with an anti-methylation agent is too long, gene repression important for normal development (due to remethylation or histone deacetylation) will not be performed properly, and rather development may be inhibited.
  • the appropriate duration of treatment with an antimethylating agent may vary depending on the animal species used. A person skilled in the art can determine an appropriate processing period based on the description in this specification.
  • the timing of performing the step (b) of treating the nucleus-transplanted egg with an anti-methylation agent is not particularly limited as long as it is before embryo transfer of the egg. What is necessary is just to set suitably according to. However, in order to eliminate the possibility that the efficiency of embryo development will not be sufficiently improved due to excessive or insufficient processing time, it is preferably in the period before the end of the blastocyst stage, more preferably in the period before the end of the 32 cell stage. More preferably, it is desirable to perform the treatment in the period before the end of the 16-cell stage, 8-cell stage, 4-cell stage, 2-cell stage, and 1-cell stage.
  • the improvement in the incidence by the method of the present invention can be confirmed based on the birth rate of cloned animals (ratio of the number of fetal cloned animal embryos to the number of transplanted embryos).
  • the effect of the method of the present invention can be examined by using as an index the formation rate of expanded blastocysts (the ratio of blastocyst development to the number of nuclear transplanted eggs) when cultivating nuclei-transferred eggs.
  • blastocyst formation rate of, for example, at least 30%, preferably 40% or more, more preferably 50% or more, and further preferably 60% or more can be achieved.
  • a birth rate of at least 3%, preferably 4% or more, more preferably 10% or more, and even more preferably 20% or more can be achieved.
  • the blastocyst formation rate and the birth rate are, for example, at least 1.5 times, preferably 2 times or more, more preferably 3 times or more, even more preferably compared with the case where treatment with an antimethylating agent is not performed. Improve more than 5 times.
  • the degree of methyli in the paternal (that is, donor cell) genome is low.
  • the degree of paternal genome methylation can be expressed as a percentage of the paternal genome's methylation level relative to the maternal (ie, egg-derived) genome. Methyl levels can be determined by measurement using the anti-5-methylcytidine antibody described above.
  • the above value in a nuclear transplanted egg produced by the method of the present invention is, for example, 30 to 60%, preferably 40 to 55%.
  • the percentage (%) of the level of paternal genome methylation relative to the maternal genome is, for example, at least 20%, preferably 30% or more, more preferably 40% or more, compared to the case without treatment with an anti-methylation agent. descend.
  • Cloning mice including nuclear transfer embryos were prepared according to the method described in Non-Patent Document 5. Specifically, first of all, for the treatment of superovulation, a female mouse (manufactured by SLC Japan) of B6D2Fl (C57BLZ6xDBAZ 2) strain 8 weeks old was administered pregnancy horse serum gonadotropin (PM SG) for 48 hours. Later, human chorionic gonadotropin (hCG) was administered, and eggs were collected 16 hours later. From the collected unfertilized eggs, the nuclei were removed using a micropulator in the presence of 5 gZml of cytochalasin B (enucleation).
  • PM SG pregnancy horse serum gonadotropin
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • the obtained nuclear transfer egg was cultured in a CO incubator at 37 ° C for 30 minutes to 1 hour.
  • Non-patent Document 10 It was transferred to a CZB-containing medium (Non-patent Document 10)) and the development of the egg was started by artificially activating the egg. After 6 hours from the start of the active silkworm, confirm that the egg was activated using the pronucleus formation as an index, and the active silkworm transplanted egg was placed in a KSOM medium (Specialty Medicine) containing TSA at the same concentration as above. Moved. The culture was further continued for 14 hours (20 hours after activation). As a control, dimethyl sulfoxide (DMSO) used for dissolving TSA was used at the same concentration instead of TSA as a control.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the nuclear transfer embryo at the 2-cell stage was activated in KSOM medium without TSA until 96 hours after lapse of activity.
  • the cells were cultured and observed to develop into expanded blastocysts. Confirmation of the development in the expanded blastocyst was performed after 96 hours of culture after activation, and the blastocyst with a blastocoel was enlarged and enlarged, and the zona pellucida became thin under a microscope. This was done by observing. More than 80 embryos were examined in each experimental group.
  • the ratio of blastocyst development (blastocyst formation rate (%)) to the number of used nuclear transfer eggs was determined.
  • the ratio (% blastocyst formation rate) that developed into expanded blastocysts relative to the number of ova that started cleavage (ie, that developed into the 2-cell stage) among the reconstructed nuclear transfer eggs was determined.
  • FIG. 1 The results are shown in FIG. 1 and FIG. As shown in Fig. 2, the blastocyst incidence increased when treated with TSA at concentrations of 5, 50, and 500 nM, compared to when TSA treatment was used.
  • Nuclear transplantation prepared by injecting cumulus cell nuclei into enucleated ova by the same method as in Example 1. Oocytes were transferred to KSOM medium containing 5 nM TSA for various times (0, 24 from activation). 48 or 72 hours) and cultured in TSA-free KSOM medium for up to 96 hours after activation, and observed for development into expanded blastocysts to determine the rate of blastocyst formation.
  • FIG. 3 and FIG. As shown in Fig. 4, the blastocyst development rate increased when treated with TSA for 24 hours or 48 hours after activation, compared with the case where TSA treatment was performed without force, especially at 24 hours.
  • the treatment showed an approximately 4-fold increase.
  • the incidence decreased rather.
  • 24 hours after activation corresponds to the 2-cell stage
  • 48 hours corresponds to the 4-16 cell stage
  • 72 hours corresponds to the blastocyst formation period (see Fig. 4).
  • Nuclear transplantation prepared by injecting cumulus cell nuclei into enucleated ova by the same method as in Example 1. Oocytes were transferred to KSOM medium containing 5 nM TSA for various times (from 0 hours to activation). (6 hours, 10 hours after activation, 10 hours after activation, 24 hours after activation, or 24 hours after activation) After culturing in TSA-free KSOM medium for 96 hours, The blastocyst formation rate was determined by observing the development of the cysts.
  • TSA concentration Treatment time Number of transplanted embryos Number of fetuses delivered Childbirth rate
  • the birth rate increased with 10 or 20 hours of TSA treatment.
  • high yields (over 6 times the control) were obtained at both 5 nM and 50 nM concentrations.
  • the 10th hour after activation corresponds to the 1-cell stage.
  • fibroblasts and embryonic stem cells were obtained by culturing mouse tail fragments (Non-patent Document 11). E14 cells were used as ES cells (Non-patent Document 12). Oocytes transplanted with nuclei derived from each donor cell were treated with TSA for 20 hours, then cultured in TSA-free KSOM medium for 96 hours after activating, and observed to develop into expanded blastocysts. The blastocyst formation rate was determined. More than 30 embryos were examined per experimental group of each cell.
  • human chorionic gonadotropin hCG was administered to female mice of B6D2F1 strain (manufactured by Japan SLC), and the eggs collected after 16 hours were placed in CZB medium. The eggs were then transferred to KSOM medium and incubated at 37 ° C in the presence of 5% CO.
  • nuclei of round sperm cells collected from male mice of C57BL / 6 strain (manufactured by SLC Japan) (characterized by a diameter of about 10 m and a clear nucleus located in the center; Non-Patent Document 14) was injected into the ovum.
  • the birth rate increased by about 4 times when TSA was treated compared to the control without TSA treatment.
  • the cultured nuclear-injected ovum was immobilized at 4 ° C in PBS containing 4% paraformaldehyde, washed with PBS containing 0.1% polybulal alcohol (PVA), and washed with 3% Blocking was performed at 4 ° C in PBS containing serum serum albumin (BSA) and 0.2% Triton X-100. The following steps were performed at room temperature. Permeabilized nuclear injected ova were treated with 0.2% Triton X-100 in PBS at room temperature. Next, this was treated with 2N HC1 at room temperature for 50 minutes, neutralized with lOOmM Tris-HC1 buffer (pH 8.0) (Non-patent Document 15), and thoroughly washed with PBS containing 1% BSA.
  • PVA polybulal alcohol
  • BSA serum serum albumin
  • the cells were then incubated with anti-5-methylcytidine antibody (Eurogentec) for 2-3 hours in PBS containing 0.1% PVA. After thorough washing, the eggs stained with Alexa Fluor-488 secondary antibody (Molecular Probes) are stained with 5 ⁇ g / ml 4, 6, 1-diamidino-2 ferruindol (DAPI) for 30 minutes, Sealed with Vectashield (Vector Laboratories). The specimen was observed using an Olympus BX51 microscope (Olympus). All images were taken with a DP70 Olympus digital camera using Olympus Analysis software and the DAPI-stained DNA and combined images were colored.
  • Alexa Fluor-488 secondary antibody Molecular Probes
  • DAPI 1-diamidino-2 ferruindol
  • a cumulus cell-derived cloned embryo was prepared, and in the presence or absence of 500 nM TSA, 15 hours (including the activation time) ) Cultured. Thereafter, the nuclear transfer embryo was fixed, and DNA methylation (DNA metC) and histone H3 Lys9 methylation (H3K9 trimet) were examined using each antibody. In addition, DNA was DAPI stained. 15 cloned embryos were used each. The results are shown in Fig. 9 together with the merged image (Merge).
  • Ushio ovaries collected from sushi carcasses at the slaughterhouse were stored in 25 ° C physiological saline and transported to the laboratory within 6-8 hours after slaughter.
  • a 21G needle (Terumo, Tokyo, Japan) and a 10 ml syringe (Terumo)
  • the eggs were collected and collected together with the follicular fluid from follicles 2-5 mm in diameter on the ovary ovary surface. From the collected follicular fluid, only the oocyte cumulus cell complex with 2-4 layers of cumulus cells attached was selected and recovered.
  • the recovered oocyte cumulus cell complex is 50 ⁇ l of 5% ( ⁇ / ⁇ ) neonatal urine serum (New Born Calf Serum, NBCS, Gibco, NY, USA) under mineral oil (Sigma, USA), 25 mM HEPES buffered TCM-199 (Earle, s salts (Gibco, m—TCM199E) supplemented with 25 ⁇ g / ml gentamicin solution (Sigma), 0.002 AUZml follicle stimulating hormone (FSH, Antolin, Kawasaki Pharmaceutical, Kanagawa, Japan) ) And 1 ⁇ g / ml estradiol 17- ⁇ (Sigma), then introduced into a small drop of maturation medium and cultured at 39 ° C, 5% CO, 95% air, saturated humidity for 21 hours. Nourished.
  • the removed egg cytoplasm was transferred to m-TCMl 99E containing 20 g / ml Hoechst 33342 (Sigma), stained for 30 minutes at 39 ° C, 5% CO, 95% air, saturated humidity, and UV Under irradiation
  • nuclei The presence or absence of nuclei was determined in the egg cytoplasm enucleated in. In the subsequent experiments, only enucleated ova whose nuclei were confirmed in the enucleated egg cytoplasm were used as recipient enucleated ova.
  • Fibroblasts derived from Japanese black sardine pinna were used as donor cells for nuclear transfer.
  • Donor cells were treated with 10% (vZv) Fetal bovine serum (FBS, Funakoshi, Tokyo, Japan).
  • Dullbecco's modified Eagle medium, DMEM, Tokyo In Japan) the culture medium was replaced with 0.4% FBS-added DMEM, and serum starvation culture was performed for 7 days.
  • serum-starved cultured cells were removed from the culture dish with 0.25% (wZv) trypsin (Sigma) solution containing 0.04% (wZv) ethylenediamin tetraacetic acid dihydrogen nitrate (EDTA, Nacalai Testa, Kyoto, Japan).
  • a microelectrode (unique Medical Imada, Liaocheng, Japan) was set in the micro-manipulator and connected to a BTX cell fusion device (ECM200, BTX, Holliston, MA, USA).
  • ECM200, BTX, Holliston, MA, USA The recipient enucleated ovum into which the cells had been introduced was gently transferred into a Zimmermann cell fusion solution (Non-patent Document 20, Table 4 shows the composition of the Zimmermann cell fusion solution). Hold the microelectrode, ovum cytoplasm and donor cells from both poles in a straight line, and apply DC 2.7 kV / cm, 11 sec twice to fuse the enucleated ovum and donor cells to create a reconstructed embryo Made.
  • reconstructed embryos were transferred into 50 1 m-TCM199E droplets and incubated for 30 minutes at 39 ° C, 5% CO2, 5% 02, 90% N2, saturated humidity .
  • the fusion between the donor cell and the egg cytoplasm was confirmed under a stereomicroscope. Confirmation of cell fusion was determined by the presence or absence of donor cells in the follicular cavity, and an egg whose cell could not be confirmed was used as a reconstructed embryo.
  • the reconstructed embryo is 0.1% (WZV) polyulbalcohol (Polyvinyl alcohol, PVA, Sigma) and Dulbecco's phosphate buffered saline (D—PBS, Gibco).
  • the solution was transferred to the added 5 ⁇ M ionomycin (Sigma) solution and allowed to stand for 5 minutes.
  • SOFM synthetic oviduct fluid medium
  • Non-Patent Document 21 The modified culture solution (Non-patent Document 22) also removes inorganic phosphate and added 10 ⁇ m to the culture solution (modified SOFM, mSOFM, Table 5 shows the composition of the modified synthetic fallopian tube culture medium (mSOFM)).
  • Basal medium eagle 100 x (Modified) Amino acids 1% (v / v) wi thout L-glutamine d
  • TSA trichostatin A
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • mSOFM dimethyl sulfoxide
  • TSA was treated at concentrations of 5 nM, 50 nM and 500 nM. 48 hours after activation TSA treatment After the treated reconstructed embryos were washed twice with mSOFM, 20-30 pieces of embryos were transferred to a small drop of the same culture solution 50 1, 39 ° C, 5% CO, 5% 0, 90% N, saturated. Cultured under humidity.
  • the cleavage rate is the ratio of the number of cracked embryos in the embryos cultured 48 hours after activation, and the incidence of blastocysts is the scutellum occupying 168 hours (7 days) after activation. It was taken as a percentage of the number of cells.
  • the blastocysts were stained with Hoechst 33342 for 30 minutes, and the number of nuclei was counted.
  • the experiment was repeated three times.
  • the cleavage rate, the incidence of blastocysts and the number of blastocysts were analyzed by ANOVA, followed by Fisher's PLSD test (Stat View ver. 5.0, SAS Institute Ltd., Cary, NC, USA) Compared.
  • TS A in the culture medium exerted no influence on the cleavage rate (ratio of the number of cleavage embryos per culture embryo (%)) and the number of blastocyst cells. .
  • the incidence of blastocysts was 40% in the 50nM TSA group and higher than 19% in the TSA-free cocoon group ( P ⁇ 0. 05).
  • the incidence of blastocysts in the 500nM TSA group was 7%, which was lower than the 5nM and 50nM TSA groups (33% and 40%, respectively).
  • TSA concentration (nM) Number of cultured embryos Number of cleavage embryos «) b Number of blastocyst stage embryos «) c Number of cells ⁇ SEM
  • b cleavage rate (ratio of split embryos per cultured embryo (%)) in parentheses
  • c incidence of blastocyst [percentage of blastocyst stage embryos per cleavage embryo (% )) In parentheses
  • d to f Significant difference between different signs (P ⁇ 0. 05).
  • the present invention provides a method for improving the incidence in somatic cell nuclear transfer techniques and artificial insemination techniques using sperm cells.

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Abstract

　体細胞核移植技術や精子細胞を用いた人工授精技術における発生率を向上させる方法の提供。ドナー細胞の核を卵子に移植する工程および核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程を包含する核移植卵子の作製方法。

Description

明 細 書
核移植卵子の作製方法
技術分野
[0001] 本発明は核移植卵子の作製方法に関する。詳細には、本発明は体細胞核移植技 術や精子細胞を用いた人工授精技術における発生率を向上させる方法に関する。 背景技術
[0002] 近年、様々な種 (ヒッジ、マウス、ゥシなど）につ 、て体細胞の核移植技術を用いて クローン動物の作製に成功した例が報告されている。また、体細胞核移植によって得 られたクローン胚を培養することによってマウス由来の NT— ES細胞（nuclear transfe r embryonic stem cell)、すなわち体細胞由来の ES細胞を榭立することが可能になつ た。
[0003] 従来の体細胞核移植技術の最も大きな問題点は核移植後の胚の低!、発生率であ つた。その後の研究から、クローン胚においては DNAやヒストンのメチル化修飾が通 常の受精卵と比べて異常に高 、ことが報告され、これが低 、発生率の原因であるとさ れてきた。
[0004] この過剰なメチル化に起因する核移植胚 (クローン胚)の低 ヽ発生率を向上させる ために、現在までに以下のような試みがなされている。例えば、ドナー細胞としての繊 維芽細胞を、ヒストン脱ァセチルイ匕酵素の阻害剤であるトリコスタチン Aや DNAメチ ルイ匕酵素の阻害剤である 5'—ァザ 2' デォキシシチジン等の薬剤の存在下で核 移植前に培養することによって胚盤胞発生率が向上することが報告されている（非特 許文献 1)。また、不死化ゥシ乳上皮細胞株 (MECL)、ゥシ胎児繊維芽細胞 (BFF) をヒストン脱ァセチルイ匕酵素阻害剤である酪酸ナトリウムで処理した後に核移植に供 することによって胚盤胞発生率が向上することも報告されている（非特許文献 2)。こ れらの研究は、ドナー細胞の核を核移植前に受精卵の核に近づけた上で核を再プ ログラムすることによって発生率を向上させようとするものであった。し力しながら、そ の効果は小さく実用レベルまでの改善には至っていな力つた。
[0005] 一方、近年、生殖補助技術が発展し、 ROSI (round spermatid injection)と呼ばれる 核移植技術が開発された。この技術によって精子の前駆体であり本来受精能力のな い精子細胞を用いて人工的受精をし、個体を作製できることが、ヒトゃマウスについ て報告されている。しかし、精子細胞を用いて得られた胚の発生率は低ぐその原因 はこれまで不明であつた。
[0006] 高い経済形質を有する特定のゥシの増産や、医薬品などの生産に有用な遺伝子 導入ゥシを効率的に生産するために、体細胞クローン技術は極めて有用である。し かし、ゥシのクローン胚の発生率は極めて低い (非特許文献 16、非特許文献 17)。ゥ シクローン胚の発生率を改善できれば、移植に用いる受胚雌を大幅に節約でき、そ の生産効率は著しく向上する。発生率を改善する方法として、ドナーとなる体細胞の 細胞周期を G1期に調整する方法 (非特許文献 18、非特許文献 19、特許文献 1)や 、作製したクローン胚での遺伝子発現を調べることで発生効率の高！ヽ胚を選別する 方法 (特許文献 2)などがある。しかし、これらの方法は、細胞周期を調整するために 熟練した技術を必要としたり、遺伝子の発現を調べるのに特殊な機器を要する。従つ て、容易な方法および技術によりゥシのクローン胚の発生率を向上させることが求め られていた。
[0007] 特許文献 1：特開 2003— 052369号公報
特許文献 2 :特開 2006— 166828号公報
非特許文献 l : Enright, B.P. et al, Biol. Reprod., 69:896-901 (2003)
非特許文献 2 : Shi, W. et al., Biol. Reprod., 69:301-309 (2003)
非特許文献 3 : Ma, J. et al., Biol. Reprod., 64:1713-1721 (2001)
非特許文献 4 : Chen, Y. et al., Cell Research, 13:251-263 (2003)
非特許文献 5 :Wakayama, T. et al., Nature, 394:369-374 (1998)
非特許文献 6 : Kishigami, S. et al., Biol. Reprode., 70: 1863-1869 (2004)) 非特許文献 7 : Christman, J.K., Oncogene, 21:5483-5495 (2002)
非特許文献 8 : De Ruijter, A.J.M. et al., Biochem. J., 370:737-749 (2003) 非特許文献 9 : Santos, F. et al., Curr. Biol., 13:1116—1121 (2003)
非特許文献 10 :Wakayama, T. et al., J. Reprod. FertiL, 112:11-17 (1998) 非特許文献 l l :Wakayama, T. et al., Nat. Genet., 22:127-128 (1999) 非特許文献 12 : Hooper, M. et al., Nature, 326:292-295 (1987)
非特許文献 13 : Kishigami, S. et al., Biol. Reprod., 70:1863-1869 (2004)
非特許文献 14 : Kishigami et al., Zygote, 12:321-327 (2004)
非特許文献 15 : Dean, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:13734-13738 (2001) 非特許文献 16 : Hill, J.R. et al., Biol. Reprod., 63:1787-1794 (2000)
非特許文献 17 : Heyman, Y.， et al., Biol. Reprod., 66:6-13 (2002)
非特許文献 18 : Kasinathan, P. et al., Nat. BiotechnoL, 12: 1176-1178 (2001) 非特許文献 19 : Urakawa, M. et al., Theriogenology, 62:714-728 (2004)
非特許文献 20 : Robl, J.M. et al., J. Anim. Sci., 64:642-647 (1987)
非特許文献 21 : Tervit, H.R. et al., J. Reprod. FertiL, 30:493-497 (1972)
非特許文献 22 : Takahashi, Y. et al., Theriogenology, 37:963-978 (1992)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した。本発明者らは、マウスをモ デル動物として精子細胞を用いた研究カゝら過剰なメチルイ匕が卵子内で核移植後に 起こること、核移植後に抗メチル化剤で核移植卵子を処理することにより過剰なメチ ルイ匕を抑制できること、この処理によりクローン胚の試験管内の発生やクローン動物 の出産率が改善されること、精子細胞を用いて得られた胚についても同様の処理が 発生改善に有効であることを見出し、本発明を完成した。すなわち、従来技術のよう に核移植前のドナー細胞を抗メチル化剤で処理するのではなぐ卵子へ核移植した 後に抗メチル化剤での処理を実施して過剰な DNAのメチルイ匕を抑制することにより 、核移植胚の低い発生率を大きく改善することができる。
[0009] なお、受精後の卵子を抗メチル化剤の一種であるヒストン脱ァセチルイ匕酵素の阻害 剤、トリコスタチン Aで処理すると発生率が低下することが知られていたので (非特許 文献 3)、本発明者らによるこのような知見は予想外であった。
[0010] 本発明の主な目的は体細胞核移植技術や精子細胞を用いた人工授精技術にお ける発生率を向上させる方法を提供することにある。
課題を解決するための手段 本発明は、
[I]以下の工程を包含する核移植卵子の作製方法：
(a)ドナー細胞の核を卵子に移植する工程;および
(b)核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程、
[2]工程 (b)の処理が核の移植以降かつ胚移植前までの期間に行われる [1]の方 法。
[3]工程 (b)の処理が核の移植以降かつ胚盤胞期終了以前の期間に行われる [1] の方法。
[4]工程 (b)の処理が核の移植以降かつ 32細胞期終了以前の期間に行われる [1 ]の方法。
[5]工程 (b)の処理が核の移植以降かつ 4細胞期終了以前の期間に行われる [1] の方法。
[6]工程 (b)の処理が核の移植以降かつ胚性遺伝子の活性ィ匕以前の期間に行わ れる [1]の方法。
[7]工程 (b)の処理が核の移植以降かつ再メチルイ匕終了以前の期間に行われる [ 1]の方法。
[8]抗メチル化剤がヒストン脱ァセチルイ匕酵素阻害剤である [1]の方法、
[9]ヒストン脱ァセチルイ匕酵素阻害剤がトリコスタチン Aまたは Apicidinである [8] の方法、
[10]卵子が除核卵子である [1]の方法、
[I I]ドナー細胞が卵丘細胞、繊維芽細胞および ES細胞からなる群より選択される [10]の方法、
[ 12]ドナー細胞が精子細胞である [ 1 ]の方法、
[13]以下の工程を包含するクローン動物作製方法：
(a)ドナー細胞の核を卵子に移植する工程；
(b)核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程；および
(c)抗メチル化剤で処理した核を移植した卵子を動物に移植する工程、
[14] [1]の方法で作製された核移植卵子、 に関する。
発明の効果
[0012] 本発明の方法は、クローン動物の作製、クローン胚からの ES細胞（NT— ES細胞） の榭立、精子細胞を用いた不妊治療などの幅広い目的に使用される核移植技術の 改善に有用である。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]種々の濃度のトリコスタチン Aで処理した場合の胚盤胞形成を示す図である。
左上： OnM、右上： 0. 5nM、左下： 5nM、右下： 50nM。
[図 2]種々の濃度のトリコスタチン Aで処理した場合の胚盤胞形成率を示す図である
[図 3]種々の時間トリコスタチン Aで処理した場合の胚盤胞形成を示す図である。左 上： 0時間、右上： 24時間、左下: 48時間、右下： 72時間。
[図 4]種々の時間トリコスタチン Aで処理した場合の胚盤胞形成率を示す図である。
[図 5]種々の時間トリコスタチン Aで処理した場合の胚盤胞形成率を示す図である。
[図 6]出産直後のクローンマウス胎児と胎盤 (左)および 3週間後のクローンマウス (黒 )と仮親（白）（右)を示す図である。
[図 7]種々のドナー細胞の核を移植した卵子の胚盤胞形成を示す図である。左: TS A処理なし、右： 50nM TSA処理。
[図 8]種々のドナー細胞の核を移植した卵子の胚盤胞形成率を示す図である。斜線 棒:卵丘細胞、黒棒:繊維芽細胞、白棒: ES細胞。
[図 9]TSA処理による DNAおよびヒストンにおけるメチル化の影響を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明の核移植卵子の作製方法は以下の工程を包含する：
(a)ドナー細胞の核を卵子に移植する工程;および
(b)核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程。
[0015] 本発明によれば、さらに上記方法で得られた抗メチル化剤で処理した核を移植した 卵子を動物に移植することによりクローン動物が作製される。また、上記方法で作製 された核移植卵子も本発明により提供される。 [0016] 本発明にお 、て、卵子としては発生能力を有して 、る任意の卵子を使用することが できる。採卵は通常の方法に従って実施することができる。例えば、卵子は過排卵処 理した動物力も採取することができる。ドナー細胞として体細胞などを使用する場合 は卵子の核を予め取り除いておく（除核する)ことが好ましぐ一方、ドナー細胞として 精子細胞を使用する ROSIのような場合は除核の必要はない。卵子は通常精子との 受精で活性化され発生を開始するが、精子を使用しない場合は人為的に活性化さ せる必要がある。例えば、ドナー細胞の核を移植 (注入)する前、移植と同時または 移植の後に卵子を活性ィ匕する。卵子の活性ィ匕は卵子を塩化ストロンチウム（SrCl )
2 の存在下で培養することによって行うことができる。さらに、ドナー核の細胞周期によ つては細胞骨格を壊し、極体の放出を防ぐためにサイトカラシン Bなどの薬剤を添カロ してもよい。卵子の活性化は、通常の受精卵の場合は第 2極体の放出と雌雄 2つの 前核の形成によって確認される力 クローン胚の場合は上記のように極体の放出を 薬剤で抑えて 、るので前核形成のみで判断する。
[0017] 本発明において、ドナー細胞としては核を有する任意の細胞を使用することができ る。ドナー細胞の例としては、卵丘細胞、繊維芽細胞、神経細胞、血球細胞 (T細胞 など)などの体細胞、精子細胞などの生殖細胞、 ES細胞が挙げられる。本発明によ る核移植においては、例えば体細胞力 得られた核を卵子へ注入してもよぐまた精 子細胞の核領域を卵子へ注入してもよ ヽ。
[0018] ドナー細胞と卵子とは同種の生物に由来してもよぐ異種の生物に由来してもよい。
例えば、同種の哺乳動物に由来するドナー細胞と卵子の組合せを本発明に好ましく 使用することができる。あるいは、ゥサギやゥシの卵子は異種の体細胞核を受け入れ る能力を有していることが知られており、ゥサギの卵子にヒトドナー細胞の核を注入し て NT— ES細胞を榭立した例が報告されていることから (非特許文献 4)、卵子とは異 なる種の生物由来の核を注入することも可能である。このような異種間の核移植によ り、例えばヒト NT— ES細胞を作製するためのヒト卵子の不足を補うために他の種の 卵子で代用することが可能になる。
[0019] ドナー細胞由来の核の卵子への注入は公知の方法に従って実施することができる 。体細胞核の除核卵子への注入は例えば非特許文献 5記載の方法に従って実施す ることができる。精子細胞の核領域の卵子への注入は非特許文献 6記載の方法に従 つて実施することができる。あるいは、特許文献 2に記載されるようにドナー細胞と除 核卵子との細胞融合によってドナー細胞由来の核を卵子へ注入することもできる。ま た、上記文献に記載されているような公知の方法に従って核移植胚を動物の卵管に 移植してクローン動物を作製することもできる。
[0020] 本発明にお 、て任意の抗メチル化剤を使用することができる。抗メチル化剤は直接 的または間接的に DNAのメチルイ匕を阻害する薬剤である。例えば、メチル化酵素阻 害剤またはヒストン脱ァセチルイ匕酵素阻害剤を抗メチル化剤として使用することがで きる。特に、ヒストン脱ァセチルイ匕酵素阻害剤を使用することが好ましい。メチル化酵 素阻害剤としては 5'—ァザシチジン、 5 ' ァザー 2' デォキシシチジンなどを使用 することができる。 5—ァザシチジンはメチル化酵素である DNAメチルトランスフェラ ーゼの強力な阻害剤であることが知られている（非特許文献 7)。ヒストン脱ァセチル 化酵素阻害剤としてはトリコスタチン A、 Apicidin (アビシジン)などを使用することが できる。さらに、ヒストン脱ァセチルイ匕酵素阻害剤として使用可能な種々の薬剤が知ら れている（非特許文献 8)。本発明によれば、これらを単独でまたは任意の組合せで 用!/、ることができる。
[0021] 抗メチル化剤の培地中の濃度は、本発明の効果、すなわち発生率の向上を指標と して適切に設定することができる。例えば、トリコスタチン Aの場合、濃度は例えば 0. 5〜500nM、好ましくは 5〜50nMである。ただし適切な濃度は使用する動物種や 体細胞の種類などによって変動し得る。当業者は本明細書の記載に基づいて適切 な濃度を決定することができる。
[0022] 抗メチル化剤での処理期間を、通常の発生過程において重要な遺伝子の抑制を 阻害しないように設定することが好ましい。詳細には、抗メチル化剤での処理を、ゲノ ムの「再プログラミング」（体細胞などの核を受精卵様の核にもどす過程、「初期化」と もいう）に際してヒストンのメチルイ匕または DNAのメチルイ匕を抑制するように行い、か つ再プログラミングに続く胚性遺伝子の活性ィ匕が始まる前に終了させることが好まし い。抗メチル化剤での処理は、例えば核の移植以降かつ再メチル化終了以前の期 間に行われる。再メチルイ匕の終了時期は発生中の胚におけるメチル化レベルを抗 5 ーメチルシチジン抗体を用いた蛍光抗体法により経時的に 5—メチルシトシンを測定 することによって調べることができる。ただし、この方法により定量性が困難なため正 確な終了時間の決定が難しい場合は、胚盤胞までの任意の時間において処理を終 了し (拡張)胚盤胞への発生率が最も高力 た処理時間を採用することが望ましい。 発生の時期との関係でいえば、処理を核の移植後に開始し、胚盤胞までの任意の時 点で終了することができる。マウスの場合、抗メチル化剤での処理は、例えば核の移 植以降かつ 1細胞期終了以前の期間に、 1細胞期のゲノムの再プログラムに際してヒ ストンまたは DNAのメチルイ匕を抑制するように行われる。具体的な処理時間も適切 に設定することができる。マウスの場合、抗メチル化剤での処理は、核の移植以降か つ卵子活性ィ匕の 20時間後までの期間、より好ましくは核移植以降かつ卵子活性ィ匕 の 10時間後までの期間行われる。抗メチル化剤での処理が長すぎると通常の発生 に重要な遺伝子抑制（再メチルイ匕またはヒストン脱ァセチルイ匕による）が適切に行わ れず、むしろ発生が阻害される可能性がある。抗メチル化剤での適切な処理期間は 使用する動物種などによって変動し得る。当業者は本明細書の記載に基づいて適 切な処理期間を決定することができる。
[0023] 核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程 (b)を行うタイミングは、当該卵 子を胚移植する前までであれば特に限定されるものではなぐ対象となる動物種など に応じて適宜設定すればよい。但し、処理時間の過不足により胚発生の効率が充分 には向上しなくなる虞を排除するために、好ましくは胚盤胞期終了以前の期間に、よ り好ましくは 32細胞期終了以前の期間に、さらに好ましくは 16細胞期、 8細胞期、 4 細胞期、 2細胞期、 1細胞期終了以前の期間に処理を行うことが望まれる。
[0024] なお、抗メチル化剤での処理効率は、胚性遺伝子の活性化 (zygotic gene activatio n)以前に処理を行うことで特に著しく向上する傾向があるようである。その理由は必 ずしも定かではないが、例えばトリコスタチン Aは胚性遺伝子の活性ィ匕後に続いて起 こる遺伝子発現の抑制状態（transcriptionally repressive state)を妨げ、その後の胚 発生を阻害することが知られている (非特許文献 3)。これと同様の機構が核移植胚 においても働いていると推察される。この観点力 考えると、マウスの場合には 1細胞 期終了以前に、ゥシの場合には 4細胞期終了以前に行うことが極めて好ましいと言え る。
[0025] 本発明の方法による発生率の向上を、クローン動物の出産率 (移植胚数に対する 出産クローン動物胎児数の比率）に基づいて確認することができる。あるいは、核移 植した卵子を培養した際の拡張胚盤胞の形成率 (核移植卵子数に対する胚盤胞発 生の比率)を指標として本発明の方法の効果を調べることができる。これらの方法は 下記実施例に詳細に記載されている。例えば、拡張胚盤胞への発生の確認は、活 性ィ匕後 96時間培養後、胞胚腔のある胚盤胞のうち胚の容積が増大して膨大化し、 透明帯が薄くなつたものを顕微鏡下で観察することによって行われる。本発明の方法 によれば、例えば少なくとも 30%、好ましく 40%以上、より好ましくは 50%以上、さら に好ましくは 60%以上の胚盤胞形成率を達成することができる。また、本発明によれ ば、例えば少なくとも 3%、好ましくは 4%以上、より好ましくは 10%以上、さらに好ま しくは 20%以上の出産率を達成することができる。胚盤胞形成率、出産率は、抗メチ ル化剤での処理をしない場合と比較して、例えば少なくとも 1. 5倍、好ましくは 2倍以 上、より好ましくは 3倍以上、さらに好ましくは 5倍以上向上する。
[0026] 本発明の方法で作製された精子細胞核移植卵子にお!ヽては、父性 (すなわちドナ 一細胞由来)ゲノムのメチルイ匕の程度が低くなる。父性ゲノムのメチル化の程度は母 性 (すなわち卵子由来)ゲノムに対する父性ゲノムのメチルイ匕レベルの百分率（％)と して表すことができる。メチルイ匕レベルは上記の抗 5—メチルシチジン抗体を使用し た測定によって決定ことができる。例えば、精子細胞の核領域を注入した卵子におい て、本発明の方法で作製された核移植卵子における上記値は例えば 30〜60%、好 ましくは 40〜55%である。母性ゲノムに対する父性ゲノムのメチル化レベルの百分 率（％)は、抗メチル化剤での処理をしない場合に比較して、例えば少なくとも 20%、 好ましくは 30%以上、より好ましくは 40%以上低下する。
[0027] 抗メチル化剤での処理を行わない場合、精子細胞核移植卵子においてはゲノム D NA全体の高メチルイ匕が観察される。これに対して、抗メチル化剤での処理を含む本 発明の方法で作製された精子細胞核移植卵子においては動原体周囲以外の染色 体部分に DNAの低メチルイ匕が観察される。一方、体細胞クローンについては、抗メ チル化剤での処理を行わない場合にゲノム DNA全体の高メチルイ匕およびヒストン H 3 Lys9の高メチルイ匕が観察され、これらの両方が抗メチル化剤での処理によって低 下する。従って、本発明の方法で作製された核移植卵子を、ゲノム DNAの低メチル ィ匕 (特に、動原体周囲以外の部分における）によって、さらにはヒストン H3 Lys9の 低メチルイ匕によって特徴付けることができる。
[0028] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例 に限定されるものではない。
実施例 1
[0029] 核移植胚の作製を含むクローンマウスの作製は、非特許文献 5記載の方法に従つ た。詳細には、まず、過排卵処理のために 8週齢の B6D2Fl (C57BLZ6xDBAZ 2)系統の雌マウス（日本エスエルシー社製）に妊娠ゥマ血清性腺刺激ホルモン (PM SG)を投与し、 48時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン (hCG)を投与し、 16時間 後に採卵を行った。採取した未受精卵から、 5 gZmlのサイトカラシン B存在下でマ イクロマピュレーターを用いて核を除 、た（除核)。
[0030] 次 、で、 1. 2%ポリビュルピロリドン (PVP)溶液中に浮遊させたドナー体細胞とし ての B6D2F1マウス由来の卵丘細胞の細胞膜を注入用のピペッティングにより破壊 し、核をマイクロマニピュレーターを用いて除核卵子に注入した (核移植)。なお、核 の注入のために必要な透明帯や細胞膜の穿孔のためのピエゾパルスの発生にはピ ェゾドライブ装置 (プリマハム社製)を用いた。
[0031] 得られた核移植卵子を COインキュベーター内で 37°Cで 30分〜 1時間培養し、 0.
2
5、 5、 50または 500nMのトリコスタチン A (以下、 TSA)を含む卵子活性化溶液（5m M 塩化ストロンチウム（SrCl )及び 5 μ gZmlのサイトカラシン Βを補充した Ca2+不
2
含 CZB培地 (非特許文献 10) )に移し、人工的に卵子の活性ィ匕を行って発生を開始 させた。活性ィ匕開始から 6時間後に前核形成を指標として卵子が活性化されたことを 確認し、活性ィ匕核移植卵子を上記と同濃度の TSAを含む KSOM培地 (Specialty M edia社製）に移した。この培地中でさらに 14時間 (活性化から 20時間)培養した。な お、コントロールとして TSAの代わりに TS Aの溶解に使用したジメチルスルホキシド（ DMSO)を同濃度になるように用いた。
[0032] その後、 2細胞期の核移植胚を TSA不含 KSOM培地中で活性ィ匕後 96時間まで 培養し、拡張胚盤胞への発生を観察した。拡張胚盤胞への発生の確認は、活性ィ匕 後 96時間培養後、胞胚腔のある胚盤胞のうち胚の容積が増大して膨大化し、透明 帯が薄くなつたものを顕微鏡下で観察することによって行った。各濃度の実験区につ き胚を 80個以上調べた。使用した核移植卵子数に対する胚盤胞発生の比率 (胚盤 胞形成率 (％) )を求めた。再構築した核移植卵子のうち卵割を開始した (すなわち 2 細胞期へ発生した)卵子数に対する拡張胚盤胞へと発生した比率 (胚盤胞形成率（ %) )を求めた。
[0033] 結果を図 1および図 2に示す。図 2に示すように、 TSA処理をしな力つた場合に比 較して、 5、 50、 500nMの濃度の TSAで処理した場合に胚盤胞発生率が増加した 実施例 2
[0034] 実施例 1と同様の方法により卵丘細胞の核を除核卵子に注入して作製した核移植 卵子を 5nMの TSAを含有する KSOM培地中で種々の時間（活性化から 0、 24、 48 または 72時間）培養した後 TSA不含 KSOM培地中で活性ィ匕後 96時間まで培養し 、拡張胚盤胞への発生を観察し、胚盤胞形成率を求めた。
[0035] 結果を図 3および図 4に示す。図 4に示すように、 TSA処理をしな力つた場合に比 較して、活性ィ匕後 24時間または 48時間 TSAで処理した場合には胚盤胞発生率が 増加し、特に 24時間の処理では約 4倍の増加が見られた力 活性化後 72時間処理 した場合は、むしろ発生率は低下した。なお、活性化後 24時間目は 2細胞期に相当 し、 48時間目は 4〜16細胞期に相当し、 72時間目は胚盤胞の形成時期に相当する (図 4参照)。
実施例 3
[0036] 実施例 1と同様の方法により卵丘細胞の核を除核卵子に注入して作製した核移植 卵子を 5nMの TSAを含有する KSOM培地中で種々の時間（0時間、活性化から 6 時間、活性化から 10時間、活性化後 10時間目力も 24時間目、または活性化から 24 時間)培養した後 TSA不含 KSOM培地中で活性ィ匕後 96時間まで培養し、拡張胚 盤胞への発生を観察し、胚盤胞形成率を求めた。
[0037] 結果を図 5に示す。図 5に示すように、 TSA処理をしな力つた場合に比較して、活 性ィ匕後 10時間 TSAで処理した場合に最も高 ヽ胚盤胞発生率が見られた。
実施例 4
[0038] 上記実施例 3の結果に基づき TSA処理の胎児出産率に対する効果を調べた。 5n Mまたは 50nM TSAで活性ィ匕後 10時間または 20時間処理した核移植卵子を TS A不含 KSOM培地に移した後、核移植胚を TSA不含 KSOM培地に移し、移植ま でこの培地中で培養した。クローンマウスを作製するために、核移植の翌日に 2細胞 期の胚を偽妊娠マウス (仮親、 0. 5日目）の卵管に移植した。偽妊娠処理は、発情前 期の ICR系雌マウスを精管結紮雄および ICR系雄マウスと 1体 1で交配させることに より行い、交配の成立はプラグ形成の有無により確認した。胚の移植後 19日目に帝 王切開によりクローンマウスを出産させ、移植胚数に対する出産クローンマウス胎児 数の比率（出産率)を求めた。図 6に出産直後のクローンマウス胎児と胎盤 (左）、およ び 3週間後のクローンマウス (黒)と仮親（白）（右)を示す。結果を表 1に示す。
[0039] [表 1]
T S A濃度 処理時間 移植胚数 出産胎児数 出産率
( n M) ( h ) (%)
0 1 0 1 7 6 2 1 . 1
5 1 0 2 8 9 1 8 6 . 2
5 2 0 2 7 4 9 3 . 2
5 0 1 0 9 1 7 7 . 7
5 0 2 0 8 1 2 2 . 5
[0040] 表 1に示すように、 10時間または 20時間の TSA処理により出産率は増加した。特 に、 10時間 TSAで処理した場合に 5nMおよび 50nMのいずれの濃度でも高い出 産率 (コントロールの 6倍以上）が得られた。なお、活性化後 10時間目は 1細胞期に 相当する。
実施例 5
[0041] 卵丘細胞に加え、繊維芽細胞および胚性幹細胞 (ES細胞）をドナー細胞として用 いて実施例 1と同様の操作を行った。繊維芽細胞を、マウスの尻尾の断片を培養して 得た (非特許文献 11)。 ES細胞としては E14細胞を使用した (非特許文献 12)。 それぞれのドナー細胞由来の核を移植した卵子を TSAで 20時間処理した後、 TS A不含 KSOM培地で活性ィ匕後 96時間まで培養し、拡張胚盤胞への発生を観察し、 胚盤胞形成率を求めた。各細胞の実験区につき胚を 30個以上調べた。
[0042] 結果を図 7および 8に示す。図 8に示すように、いずれのドナー細胞由来の核を移 植した場合も、 TSA処理をしなカゝつた場合に比較して高 ヽ胚盤胞発生率が見られた 実施例 6
[0043] TSAの代わりに 5 μ Μの Apicidin (Sigma)を用いて実施例 1と同様に核移植卵子 の拡張胚盤胞への発生を観察したところ、コントロールの胚盤胞形成率 29. 7%に対 して Apcidin処理した場合は 69. 0%であり、 Apicidin処理した場合に胚盤胞発生 率が約 2倍増カロした。
実施例 7
[0044] 本発明による TS A処理の円形精子細胞注入法 (ROSI)に対する効果を調べた。 R OSIは非特許文献 13記載の方法に従った。
詳細には、まず、 B6D2F1系統の雌マウス（日本エスエルシー社製）にヒト絨毛性 性腺刺激ホルモン (hCG)を投与し、 16時間後に採取した卵子を CZB培地中に入れ た。次いで卵子を KSOM培地に移し、 37°Cで 5%CO存在下でインキュベートした
2
[0045] 卵子を 5mM塩化ストロンチウム（SrCl )を補充した Ca2+不含 CZB培地中で 20分
2
間インキュベートすることによって活性ィ匕した。 40〜80分後〖こ、 C57BL/6系統の 雄マウス（日本エスエルシー社製)から採取した円形精子細胞の核領域 (約 10 m の直径および中央に位置する明確な核によって特徴付けられる；非特許文献 14参 照）を卵子に注入した。
[0046] 核を注入した卵子を、 5nM TSAを含む KSOM培地に移し、活性化の 10時間後 に TS A不含 KSOM培地に移した。
[0047] 精子細胞注入の翌日に 2細胞期の胚を偽妊娠マウス (仮親、 0. 5日目）の卵管に 移植した。胚の移植後 19日目に帝王切開により胎児を得、移植胚数に対する出産 胎児数の比率（出産率)を求めた。結果を表 2に示す。
[0048] [表 2] T S A濃度 移植数 出産数 出産率
( n M) (% )
0 3 4 2 5 . 9
5 3 8 1 0 2 6 . 3
[0049] その結果、 TSA処理をしないコントロールに比較して TSA処理した場合に出産率 が約 4倍増カロした。
実施例 8
[0050] ROSIによって得られた円形精子細胞の核領域を注入した卵子を 20ngZmlデメコ ルチンの存在下で、 10 M 5 ァザシチジン（5— aza)、または 500nM TSAを 抗メチル化剤として含有する培地中で 20時間培養した。同様に、成熟精子の注入を 実施した（ICSI (intracytoplasmic sperm injection) )。詳細には、頭部一尾部連結部 にピエゾドライブピペット（PrimeTech)によってパルスをかけることによって尾部力も分 離した精子の頭部を卵子に注入した。この際、卵子の活性ィ匕は行わな力つた。
[0051] 培養した核注入卵子を 4%パラホルムアルデヒドを含有する PBS中 4°Cでー晚固定 化した後、 0. 1%ポリビュルアルコール（PVA)を含有する PBSで洗浄し、 3%ゥシ血 清アルブミン（BSA)および 0. 2%Triton X— 100を含有する PBS中 4°Cでー晚ブ ロッキングした。以下の工程は室温で実施した。固定ィ匕した核注入卵子を PBS中 0. 2%Triton X— 100で室温で処理することによって透過処理した。次いでこれを 2N HC1で室温で 50分間処理し、 lOOmM Tris— HC1緩衝液（pH 8. 0)で中和し（ 非特許文献 15)、 1%BSAを含有する PBSで十分に洗浄した。
[0052] 次いで 0. 1%PVA含有 PBS中、抗 5—メチルシチジン抗体（Eurogentec)と共に 2 〜3時間インキュベートした。十分に洗浄した後、 Alexa Fluor— 488二次抗体 (Mo lecular Probes)で染色した卵子を、 5 μ g/ml 4，， 6，一ジアミジノ 2 フエ-ルイ ンドール（DAPI)で 30分間染色し、 Vectashield (Vector Laboratories)を用いて封 入した。標本を Olympus BX51顕微鏡 (ォリンパス）を用いて観察した。全ての画像 を Olympus Analysisソフトウェアを使用して DP70 Olympusデジタルカメラでと らぇ、 DAPI染色 DNAおよび結合画像に彩色を施した。
[0053] 前核 DNAメチルイ匕レベルの定量分析のために、蛍光画像をアメリカ国立衛生研究 所 (National Institute of Health)のプログラム Image—J (http://rsb.info.nih.gov/ij/) を使用した濃度分析に供した。各々の前核について、父性ゲノムの相対的メチルイ匕 強度を、母性ゲノムの蛍光強度の百分率として算出した。結果を表 3に示す。なお表 3にお 、て (a)抗メチル化剤無添加の場合対 (b)抗メチル化剤を添加した場合につ いて、データを統計プログラム SPSS version 12. 0 (SPSS Inc.)を使用した多重平 均比較のためのシェフェ検定によって解析した。全ての百分位数データを統計解析 前に逆正弦変換に供した。
[0054] [表 3]
注入雄生殖細胞 抗メチル化剤 核移植 母性ゲノムに対する父性ゲ 士 S E M
卵子数 ノムのメチノレ化レべノレの比
率 （％)
成熟精子（ICSI) なし 5 2 3 4 . 9 3 1 . 5 成熟精子（ICSI) 5— a z a 2 3 1 7 . 5 b 1 . 7 成熟精子（ICSI) T S A 1 3 8 . 2 b 1 . 1 精子細胞（R0SI) なし 3 2 7 7 . 0 a 2 . 0 精子細胞（R0SI) 5— a z a 1 8 5 4 . 9 b 3 . 0 精子細胞（R0SI) T S A 2 3 4 2 . 5 b 3 . 3
[0055] 表 3に示すように成熟精子を注入した場合 (ICSI、抗メチル化剤なし）に比較して精 子細胞を注入した場合 (ROSI、抗メチル化剤なし）、父性ゲノムのメチルイ匕レベルが 高!ヽことが確認された。精子細胞を導入した場合に見られる過剰なメチルイ匕にっ ヽ て経時的に調べたところ、注入 6時間目までは精子細胞および成熟精子のいずれの 場合も脱メチルがおこり、高度にメチルイ匕されたままの母性ゲノムに比較して低 、メチ ル化を示した。しかし、 10時間目では精子細胞を注入した場合に成熟精子に比較し て高いメチルイ匕が観察された。すなわち、精子細胞を注入した場合には父性ゲノム はー且脱メチルイ匕された後に過剰にメチルイ匕されることが示された。
[0056] 表 3に示すように、上記の精子細胞を注入した場合に観察された父性ゲノムの過剰 なメチルイ匕は ヽずれの抗メチル化剤を使用した場合も低下した。
[0057] なお、 TSAで処理した場合、父性ゲノムに見られる DNAメチルイ匕は主に各染色体 のヒストン H3の Lys9の高メチル化によって示される動原体周囲領域に限られていた 。すなわち、母性ゲノムのメチルイ匕は TSA処理に耐性であるのに対し、父性ゲノムの メチル化の大部分は TSA処理に感受性である力 ヒストン H3の Lys9の高メチル化 によって示される動原体周囲領域における DNAのメチルイ匕は TSAに対して耐性で あった。
実施例 9
[0058] 実施例 1に記載の方法で作製した B6D2F1系統マウス由来の卵子を用いて卵丘 細胞由来のクローン胚を作製し、 500nM TSA存在下または非存在下で 15時間（ 活性化時間を含む)培養した。その後、核移植胚を固定し、 DNAのメチル化 (DNA metC)及びヒストン H3 Lys9のメチル化（H3K9 trimet)を各抗体を用いて調べ た。さらに DNAを DAPI染色した。各々 15個のクローン胚を使用した。結果を結合 画像（Merge)とともに図 9に示す。
[0059] TSA未処理の実験区（図 9左、「無」）では、これまで報告されているように（非特許 文献 9) DNA及びヒストン H3 Lys9の両方の高いメチル化が染色体全体に認めら れた。一方、 TSA処理した実験区（図 9右、「有」）では、実施例 8に記載の精子細胞 を用いた場合と同様に、動原体周囲ではいずれのメチル化も顕著な低下はみられな 力つたものの、それ以外の染色体部分では両方のメチルイ匕の低下が観察された。 実施例 10
[0060] ゥシ再構築胚の作製とトリコスタチン Aによる処理
(1)ゥシ卵子の採取と体外成熟
食肉処理場にてゥシ屠体より採取したゥシ卵巣を 25°Cの生理食塩水に保存し、屠 殺後 6〜8時間以内に研究室まで輸送した。ゥシ卵巣表面の直径 2〜5mmの卵胞か ら 21Gの注射針 (テルモ、東京、日本）と 10mlシリンジ (テルモ）を用いてゥシ卵子を 卵胞液と共に吸引し回収した。回収した卵胞液から、 2〜4層の卵丘細胞が付着した 卵子卵丘細胞複合体のみを選別し回収した。回収した卵子卵丘細胞複合体は、ミネ ラルオイル（Sigma、 USA)下の 50 μ 1の 5% (ν/ν)新生子ゥシ血清（New Born Calf Serum、 NBCS、 Gibco、 NY、 USA)、 25 μ g/ml gentamicin solution (Sigma)添加の 25mM HEPES緩衝 TCM— 199 (Earle， s saltsゝ Gibco、 m— TCM199E)に、 0. 02AUZml卵胞刺激ホルモン（FSH、アントリン、川崎製薬、神 奈川、 日本)および 1 μ g/mlエストラディオール 17— β (Sigma)を添加した成熟用 培養液の小滴に導入し、 39°C、 5%CO、 95%空気、飽和湿度下で 21時間成熟培 養した。
[0061] (2)核移植
(a)ゥシ卵子の裸化と除核
21時間成熟培養した卵子卵丘細胞複合体を 5%NBCS、 25 μ g/ml gentamic in solution (Sigma)添カ卩の 25mM HEPES緩衝 TCM— 199 (Hank， s saltsゝ Gibco、 m— TCM199H)に 0. 25% (wZv)ヒアル口-ダーゼ（Sigma)を添カ卩した 溶液内で 5分間静置した。その後、卵子の周囲に付着した卵丘細胞をピぺティング 操作により完全に除去した。
[0062] 卵丘細胞を除去した卵子を m— TCM199H内に移し、倒立顕微鏡下で第一極体 が放出された卵子のみを選別した。卵子の核を除去するため、第一極体付近の透明 帯を微細なガラス-一ドルで切開し、これら卵子を 5 gZmlサイトカラシン B (Sigma )添加 m— TCM199Hに移し 15分間静置した。その後、透明帯を切開したガラス- 一ドルで卵子を上力 押さえ、第一極体およびその周辺の卵細胞質を透明帯切開 部位力も卵子細胞質の容量の約 10〜20%を除去することで除核した。除核の確認 は、除去した卵細胞質を 20 g/ml Hoechst 33342 (Sigma)含有 m—TCMl 99Eに移し、 39°C、 5%CO、 95%空気、飽和湿度下で 30分間染色し、 UV照射下
2
で除核した卵細胞質内に核の有無を判定した。なお、以後の実験では、レシピエント 除核卵子として除核した卵細胞質において核が確認できた除核卵子のみを供した。
[0063] (b)ドナー細胞の調製と除核卵子への導入
核移植に用 、るドナー細胞には、黒毛和種子ゥシ耳介由来の繊維芽細胞を使用し た。ドナー細胞を、 10% (vZv)胎児ゥシ血清（Fetal bovine serum, FBS、フナ コシ、東京、 日本）添カ卩ダルベッコ変法イーグル培地（Dullbecco' s modified Ea gle medium, DMEM、-ッスィ、東京、 日本）で 80%コンフルェント状態まで培養 した後、 0. 4%FBS添加 DMEMに培養液を交換し、 7日間血清飢餓培養を行った 。これら血清飢餓培養細胞を、 0. 04% (wZv)エチレンジァミン四酢酸二水素ニナト リウム（EDTA、ナカライテスタ、京都、 日本）添加の 0. 25% (wZv)トリプシン（Sigm a)溶液により培養皿から単離し、遠沈管で遠心処理により遠沈し細胞を回収した後、 10% (w/v)ポリビ-ルピロリドン（polyvinylpyrrolidone、 PVP、ナカライテスタ）を 添カ卩したリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline、 PBS、 Gibco) (— )溶液中に懸濁した。単離した細胞を細胞導入用の微小ガラスピペットに吸引して、 レシピエント除核卵子の透明帯切開部位力 囲卵腔内に導入した。
[0064] (c)電気融合処理
マイクロマ-ュピレーターに微小電極 (ユニークメディカル イマダ、宫城、 日本）を セットし、 BTX細胞融合装置（ECM200、 BTX、 Holliston、 MA、 USA)に接続し た。細胞を導入したレシピエント除核卵子を Zimmermann細胞融合液 (非特許文献 20、表 4に Zimmermann細胞融合液の組成を示す）内に静かに移した。微小電極、 卵子細胞質およびドナー細胞が一直線になるように両極から挟み、直流 2. 7kV/c m, 11 secを 2回印加することで除核卵子とドナー細胞とを融合して再構築胚を作 製した。融合処理を行った後、再構築胚を 50 1の m— TCM199Eの小滴内へ移し 、 39°C、 5%CO 2、 5%02、 90%N 2、飽和湿度下で 30分間培養した。培養後、実体 顕微鏡下でドナー細胞と卵子細胞質との融合を確認した。なお、細胞融合の確認は 、囲卵腔内のドナー細胞の有無により判定し、細胞を確認できない卵子を再構築胚 とした。
[0065] [表 4]
表 4 Z i mm e r m a n n細胞融合液の組成
成分
スクロース a 2 8 0 0 mM
酢酸マグネシウム β 0 5 mM
酢酸カルシゥム 3 0 1 mM
リン酸水素二力リウム 0 mM
ダルタチオン b 0 mM
ゥシ血淸アルブミン b 0 0 1 m g ,
：ナカライテスタ、 b ： S g m a
(d)活性化処理
再構築胚は、 0. 1% (WZV)ポリビュルアルコール（Polyvinyl alcohol, PVA, S igma)添カ卩ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco' s phosphate buffered saline, D— PBS、 Gibco)〖こ添加した 5 μ Mィオノマイシン（Sigma)溶液へ移し、 5分間静置した。胚を直ちに、合成卵管液培養液（synthetic oviduct fluid me dium、 SOFM、非特許文献 21)に 20種類の必須および非必須アミノ酸を添カ卩して 修正した培養液 (非特許文献 22)力もさらに無機リン酸塩を除 、た培養液 (modified SOFM、 mSOFM、表 5に修正合成卵管液培養液（mSOFM)の組成を示す）に 1 0 μ gZmlシクロへキシミド（Sigma)を添加した培養液 50 μ 1の小滴内に移し、 39°C 、 5%CO、 5%0、 90%N、飽和湿度下で 6時間処理し、活性ィ匕処理を行った。
2 2 2
[0067] [表 5]
表 5 修正合成卵管液培養液 （m S O F M) の組成
成分
塩化ナトリ ウム a 107. 70 mM 塩化力リウム 3 7. 16 mM 塩化カルシウム b 1. 71 mM 塩化マグネシウム b 1. 49 mM 炭酸水素ナトリ ウム 3 25. 07 mM グノレコース b 1. 50 mM ピノレビン酸ナトリウム 3 0. 33 mM 乳酸ナトリ ゥム' 3. 30 mM
L 一グルタミン c 1. 00 mM
Basal medium eagle 100 x (Modified) Amino acids 1 % (v/v) wi thout L-glutamined
Mi nimum es sential medium 100 x Non-Ess entia l Amino acids d 1 % {v/v) 抗菌抗カビ剤溶液 ε 1 % {v/v) フエノーノレレツ ド e 1. 0 mg/ml ゥシ血清ァノレブミン 3. 0 mg/ml
：ナカライテスタ、 b ：関東化学、 東京、 日本、 c : S i g m a、 d ：大日本住友製 、 大阪、 日本、 e ： G i b c o
[0068] (e)体外培養
活性化処理を行った再構築胚を mSOFMに移し、 2回洗浄した。その後、胚を同 培養液 50 1の/ J、滴内に 20〜30個ずつ移し、 39。C、 5%CO、 5%0、 90%N、
2 2 2 飽和湿度下で 168時間（7日間）培養した。
[0069] (f)トリコスタチン A処理
再構築胚のトリコスタチン A (TSA、 Sigma)処理は、活性化処理から 48時間行つ た。 TSAはジメチルスルフォキシド（DMSO、 Sigma)で溶解し、活性化処理の溶液 および mSOFMにそれぞれ添カ卩した（DMSOの最終濃度は 0. 05%とした)。対照 区として 0. 05%の DMSOのみを活性化処理の溶液および mSOFMに添カ卩した。 T SAは 5nM、 50nMおよび 500nMの濃度で処理した。活性化後 48時間に TSA処 理した再構築胚を mSOFMで 2回洗浄した後、胚を同培養液 50 1の小滴に 20〜3 0個ずつ移し、 39°C、 5%CO、 5%0、 90%N、飽和湿度下で培養した。
2 2 2
[0070] (g)胚発生の評価
卵割率は、活性ィ匕後 48時間において培養した胚に占める卵割胚数の割合、胚盤 胞への発生率は、活性化後 168時間（7日）における卵割胚に占める胚盤胞数の割 合とした。また、胚盤胞は、 Hoechst 33342で 30分間染色し、核数を数えることで 細胞数を測定した。
[0071] (h)統計処理
実験は 3回反復した。卵割率、胚盤胞への発生率および胚盤胞の細胞数は、分散 分析（ANOVA)後、 Fisherの PLSDテスト（Stat View ver5. 0、 SAS Institut e Ltd.、 Cary、 NC、 USA)により比較した。
[0072] (3)結果
培養液への TSAの添加がゥシ再構築胚の初期発生に及ぼす影響について調べ た。その結果、表 6に示すように、培養液中の TS Aは卵割率 (培養胚あたりの卵割胚 数の割合 (％) )および胚盤胞の細胞数には影響を及ぼさな力つた。しかし、胚盤胞 への発生率 (卵割胚あたりの胚盤胞期胚数の割合（％) )は、 50nM TSA区では 40 %と TSA無添カ卩区の 19%に比べ高かった（P< 0. 05)。一方、 500nM TSA区で は胚盤胞への発生率は 7%であり、 5nMおよび 50nM TSA区に比べて低下した（ それぞれ 33%および 40%)。
[0073] [表 6]
表 6 培養液への T S Aの添加がゥシ再構築胚の初期発生に及ぼす影響3
TSA濃度 (nM) 培養胚数 卵割胚数 «) b 胚盤胞期胚数 «) c 細胞数 ± SEM
0 103 70 (68) 13 ( 19) d ' e 87 ± 9
5 106 85 (80) 28 (33) d ' f 89 ± 6
50 97 73 (75) 29 (40) f 83 ± 6
500 97 73 (75) 5 ( 7 92 ± 8
3回反復実験。 b ：卵割率 （培養胚あたりの卵割胚数の割合 （％) ) を括弧内に示 c ：胚盤胞への発生率 〔卵割胚あたりの胚盤胞期胚数の割合 （％) ) を括弧内に示 d〜f ：異符号間に有意差あり （P < 0 . 0 5 ) 。
[0074] 以上のように、ゥシクローン胚にある適当な時間、一定濃度の TSAに暴露させるこ とで、胚盤胞期への発生率が 2倍程度向上することが示された。 産業上の利用可能性
本発明により体細胞核移植技術や精子細胞を用いた人工授精技術における発生 率を向上させる方法が提供される。

Claims

請求の範囲
[I] 以下の工程を包含する核移植卵子の作製方法：
(a)ドナー細胞の核を卵子に移植する工程;および
(b)核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程。
[2] 工程 (b)の処理が核の移植以降かつ胚移植前までの期間に行われる請求項 1記 載の方法。
[3] 工程 (b)の処理が核の移植以降かつ胚盤胞期終了以前の期間に行われる請求項 1記載の方法。
[4] 工程 (b)の処理が核の移植以降かつ 32細胞期終了以前の期間に行われる請求項 1記載の方法。
[5] 工程 (b)の処理が核の移植以降かつ 4細胞期終了以前の期間に行われる請求項 1 記載の方法。
[6] 工程 (b)の処理が核の移植以降かつ胚性遺伝子の活性ィ匕以前の期間に行われる 請求項 1記載の方法。
[7] 工程 (b)の処理が核の移植以降かつ再メチルイ匕終了以前の期間に行われる請求 項 1記載の方法。
[8] 抗メチル化剤がヒストン脱ァセチルイ匕酵素阻害剤である請求項 1記載の方法。
[9] ヒストン脱ァセチルイ匕酵素阻害剤がトリコスタチン Aまたは Apicidinである請求項 8 記載の方法。
[10] 卵子が除核卵子である請求項 1記載の方法。
[II] ドナー細胞が卵丘細胞、繊維芽細胞および ES細胞力 なる群より選択される請求 項 10記載の方法。
[12] ドナー細胞が精子細胞である請求項 1記載の方法。
[13] 以下の工程を包含するクローン動物の作製方法：
(a)ドナー細胞の核を卵子に移植する工程；
(b)核を移植した卵子を抗メチル化剤で処理する工程；および
(c)抗メチル化剤で処理した核を移植した卵子を動物に移植する工程。
[14] 請求項 1記載の方法で作製された核移植卵子。
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