WO2007036074A1 - Utilisation de dérivés du phthalide - Google Patents

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WO2007036074A1
WO2007036074A1 PCT/CN2005/001627 CN2005001627W WO2007036074A1 WO 2007036074 A1 WO2007036074 A1 WO 2007036074A1 CN 2005001627 W CN2005001627 W CN 2005001627W WO 2007036074 A1 WO2007036074 A1 WO 2007036074A1
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phenylhydrazine
alkyl
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Fei Chen
Tao Wang
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Fei Chen
Tao Wang
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to the use of benzoquinone derivatives (PA) which enhance the sensitivity of drug-resistant tumor cells to chemotherapeutic drugs.
  • PA benzoquinone derivatives
  • Multi-drug resistance refers to the ability of tumor cells to cross-resistance against a variety of anticancer drugs with different chemical structures, functions, and mechanisms of action.
  • Clinical studies have shown that solid tumors such as colon cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, neurokeratoma, and kaposis sarcoma, prostate cancer, etc., are often considered to be drug-resistant tumors, and may even be resistant at the time of diagnosis.
  • Exist belongs to primary resistance (intrinsic MDR). These tumor cells often have multiple different drug resistance mechanisms at the same time, and they are widely resistant to chemotherapeutic drugs.
  • acute myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, multiple myeloma, lymphoma, breast cancer, ovarian cancer and other tumors are often sensitive to chemotherapeutic drugs at the beginning of treatment, but gradually develop resistance during treatment, especially for recurrence.
  • the degree of drug resistance increased significantly, called acquired MDR, and the effect of chemotherapy after drug resistance was significantly reduced.
  • the presence and production of MDR results in poorer conventional chemotherapy, poor prognosis, and recurrence and metastasis. In a sense, 90% of cases of cancer deaths are associated with primary or acquired resistance.
  • MDR The mechanism of MDR has been extensively studied. It is generally regulated by multiple factors and multiple mechanisms, including the efflux of ABC transporters to chemotherapeutic drugs, the increase of anti-apoptotic protein expression, and the changes in metabolic pathways and regulatory modes. , detoxification system enhancement, etc.
  • the sensitizer is phenylhydrazine of the formula (I) and derivatives thereof (including monomers and dimers thereof).
  • a phenylhydrazine represented by the formula (I) or a derivative thereof for the preparation of a sensitizer or a reversal agent for an antitumor drug
  • Rl represents hydrogen, hydroxy, C1-CS alkyl, C2-C8 alkenyl, C2-C8 alkynyl, C3-C8 cycloalkyl, C1-C8 alkoxy, C1-C4 carboxyl, halogen atom;
  • R2 is absent or represents hydrogen, hydroxy, C1-C8 alkyl, C2-C8 alkenyl, C2-C8 alkynyl, C3-C8 cycloalkyl, C1-C8 decyloxy, C1-C4 carboxyl, halogen atom;
  • R3 and R4 independently represent hydrogen, hydroxy, C1-C8 fluorenyl, C2-C8 alkenyl, C2-C8 alkynyl, C3-C8 cyclodecyl, C1-C8 alkoxy, halogen atom;
  • R5 and R8 represent hydrogen, hydroxy, C1-C8 alkyl, C2-C8 alkenyl, C2-C8 alkynyl, C3-C8 cycloalkyl, C1-C8 alkoxy, C1-C4 carboxyl, phenyl, aryl a aryl group, a 5-6 membered heterocyclic ring having 1-2 nitrogen atoms, a halogen atom;
  • R6 and R7 independently represent hydrogen, hydroxy, C1-C8 fluorenyl, C2-C8 alkenyl, C2-CS alkynyl, C1-C4 carboxy, halogen atom; or R6 and R7 are joined together to form a 5-7 membered ring;
  • alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, cycloalkyl group, decyloxy group, phenyl group, aryl group, aralkyl group and heterocyclic ring have 0-3 substituents selected from the group consisting of C1- C3 thiol, hydroxyl, halogen atom.
  • the derivative is a dihydro derivative of the formula (I), a tetrahydro derivative, or a formula
  • the phenylhydrazine or a derivative thereof has a structure selected from the group consisting of:
  • R1 to R8 are as defined above.
  • the phenylhydrazine or a derivative thereof has a structure selected from the group consisting of:
  • the antitumor drug is selected from the group consisting of: doxorubicin; vincristine; paclitaxel; cisplatin; actinomycin; bleomycin; busulfan; capecitabine; carboplatin; Statin; chlorambucil; cyclophosphamide; cytarabine; daunorubicin; epirubicin; etoposide; etoposide; etoposide; fluoroarabinoside; Fluorouracil; gemcitabine; Herceptin; hydroxyurea; idarubicin; ifosfamide; irinotecan; lomustine; cyclohexyl nitrosourea; melphalan; L-phenylalanine mustard; ; methotrexate; mitomycin; mitoxantrone; dihydroxy fluorenone; oxaliplatin; procarbazine; methyl (benzamide); rituximab;
  • the anti-tumor drug is for treating a tumor selected from the group consisting of non-small cell lung cancer, prostate cancer, intestinal cancer, liver cancer, leukemia, myeloma, lymphoma, breast cancer, ovarian cancer, Gastric cancer, esophageal cancer, colon cancer, or sarcoma.
  • a pharmaceutical composition comprising (a) an effective amount of a benzoquinone or benzoquinone derivative of the formula (I), (b) a safe and effective amount of an antitumor drug And (c) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the antitumor agent is selected from: doxorubicin; vincristine; ⁇ taxol cisplatin; actinomycin; bleomycin; busulfan; capecitabine; carboplatin; carmustine Benzene; chlorambucil; cyclophosphamide; cytarabine; daunorubicin; epirubicin; etoposide; etoposide; etoposide; fluoroarabinoside; ; gemcitabine; Herceptin; hydroxyurea; idarubicin; ifosfamide; irinote Kang; lomustine; cyclohexyl nitrosourea; melphalan; L-phenylalanine mustard; thiopurine; methotrexate; mitomycin; mitoxantrone; dihydroxy fluorenone; Liboplatin; procarbazine; methyl(benzylidene); rituximab
  • a phenylhydrazine derivative of the formula (I) for the preparation of a composition for inhibiting P-gp expression, or for inhibiting the expression of glyoxalase I, or for inhibition Composition expressed by BcI-2.
  • a method of treating a tumor comprising the steps of: administering to a mammal in need of treatment a safe and effective amount of a benzoquinone or benzoquinone derivative of the formula (work).
  • the method further comprises the steps of: administering at least one anti-tumor drug, said anti-tumor drug as described above
  • Figure 1 shows the chromatogram of a clumsy derivative.
  • Figure 2 shows the results of Bcl-2 Western blotting
  • FIG. 3 shows that PA derivatives are sensitized to Adr-induced MCF-7/Adr cell death.
  • FIG. 4 shows the FACS detection of PA-sensitizing sensitization of MCF-7/Adr when combined with Adr.
  • alkyl refers to a straight or branched chain, containing 18 carbon atoms (preferably
  • Alkenyl includes straight-chain and branched hydrocarbon groups containing at least one carbon-carbon double bond and 2-8 carbon atoms, preferably 2-6 carbon atoms.
  • Alkynyl includes straight-chain and branched hydrocarbon groups containing at least one carbon-carbon triple bond and 2-8 carbon atoms, preferably 2-6 carbon atoms.
  • aryl refers to an aromatic system, which may be monocyclic or otherwise fused or linked
  • the polyaromatic ring is such that at least a portion of the fused or linked ring forms a conjugated aromatic system.
  • Aryl groups include, but are not limited to, phenyl, naphthyl, tetrahydronaphthyl.
  • cycloalkyl refers to a cycloalkyl group having 3 to 8 carbon atoms, such as cyclopropyl, cyclopentyl, cyclohexyl and cycloheptyl.
  • alkoxy refers to an alkoxy group having from 1 to 8 carbon atoms, such as methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, pentyloxy, hexyloxy and the like.
  • heterocycle refers to a stable 4-7 membered (more preferably 5-6 membered) monocyclic or stable polycyclic heterocyclic ring which may be saturated, partially unsaturated or unsaturated. And consisting of a carbon atom and 1-4 heteroatoms selected from the group consisting of: N, 0 and S atoms. The N and S atoms can be oxidized.
  • the heterocyclic ring may also include any polycyclic ring in which any of the above heterocyclic rings may be fused to the aromatic ring.
  • Substituted aryl or “substituted heterocyclic” refers to an aryl or heterocyclic ring substituted with from 1 to 3 groups selected from the group consisting of halogen, CN, 0H, N0 2 , amino, alkyl, ring. Alkyl, alkenyl, alkynyl, decyloxy, aryloxy, substituted alkoxy, fluorenylcarbonyl, decylcarboxy, alkylamino or arylthio. Preferably, the substituent is 3 ⁇ 4, CI-C4 alkyl, alkyl, hydroxy.
  • halogen atom means a halogen element which is ⁇ , Cl, Br, or work. Active ingredient
  • the active ingredient of the present invention is a phenylhydrazine derivative of the formula (I).
  • benzoquinone derivative as used in the present invention means a phenylhydrazine derivative of the formula (I) wherein a phenylhydrazine derivative monomer having a hydrogen atom added to the benzene ring is used.
  • the term also includes dimers or multimers (more preferably dimers) formed from the phenylhydrazine of formula (I) or a hydrogenated product thereof.
  • dihydro derivative means a benzene ring of phenylhydrazine in which two hydrogen atoms are added to adjacent carbon atoms corresponding to a double bond; the "tetrahydro derivative" of the phenylhydrazine is In the benzene ring of phenylhydrazine, four hydrogen atoms are added to the carbon atom corresponding to the double bond.
  • a compound of formula (k)' is a dihydro derivative of a compound of formula (k); a compound of formula is a tetrahydro derivative of a compound of formula (k).
  • benzoquinone derivatives of the present invention are artificially synthesized or isolated from nature.
  • monomers and/or dimers of the formula (I) phenylhydrazine can be isolated from the umbelliferous plant Angelica or Chuanxiong.
  • the present invention also encompasses a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the phenylhydrazine derivative of the formula (I) of the present invention (including monomers or dimers) as an active ingredient together with one or more pharmaceutically acceptable carriers or forms Agents (such as solvents, thinners).
  • Pharmaceutically acceptable carriers useful in the present invention include various conventional solid carriers and liquid carriers.
  • solid carriers include: starch, lactose, calcium hydrogen phosphate, microcrystalline cellulose, and the like
  • the liquid carrier includes: sterile water, polyethylene glycol, and the like, as long as it is suitable for the characteristics of the active ingredient and the particular mode of administration desired.
  • compositions of the present invention can be formulated into a variety of conventional forms, for example: tablets, capsules, dispersible powders, granules or suspensions, syrups (containing, for example, about 10 to 50% sugar), and elixirs (containing about 20- Parenteral administration is carried out in the form of a sterile injectable solution or suspension (containing about 0.05 to 5% of a suspending agent in an isotonic medium).
  • these pharmaceutical preparations may contain from about 0.01 to 99. 9wt%, preferably from 2.5% to 90% by weight, more preferably from 5 to 6% by weight of the active ingredient.
  • Another preferred pharmaceutical composition also contains an antitumor drug, such as a monomer or dimer containing (a) 0.01 to 99% by weight (preferably 0.1 to 90% by weight) of a benzoquinone derivative; b) 0. 01-99 wt% (preferably 0.1-90 wt%) of an antitumor drug; (c) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • an antitumor drug such as a monomer or dimer containing (a) 0.01 to 99% by weight (preferably 0.1 to 90% by weight) of a benzoquinone derivative; b) 0. 01-99 wt% (preferably 0.1-90 wt%) of an antitumor drug; (c) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the weight ratio of the component (a) to the component (b) is 1:100 to 100:1, more preferably 10:1 to 1:10.
  • compositions may also contain other additives such as anti-pigments, preservatives, and antioxidants.
  • treatment method also provides a method of treatment comprising the steps of: administering to a mammal in need of treatment a safe or effective amount of a monomer or dimer of a phenylhydrazine derivative. Preferably, the method further comprises the step of: simultaneously combining other anti-tumor drugs (such as anti-tumor drugs as P-gp substrates) or other therapeutic means (such as chemotherapy).
  • Monomers or dimers of phenylhydrazine derivatives alone or in combination can treat a variety of different tumors.
  • Representative examples include (but are not limited to): non-small cell lung cancer, prostate cancer, colon cancer, liver cancer, leukemia, myeloma, lymphoma, breast cancer, ovarian cancer, gastric cancer, esophageal cancer, colon cancer, sarcoma, etc. .
  • the mode of administration of the monomer or dimer of the phenylhydrazine derivative is not particularly limited. It can be administered orally as well as intravenously, intramuscularly, topically, intratumorally or subcutaneously.
  • a preferred mode is oral, intravenous or intratumoral administration.
  • Both the monomer and the dimer of the phenylhydrazine derivative of the present invention have a multi-drug resistance (MDR) of a broad-spectrum sensitizing tumor cell against a cancer drug, and effectively enhance the anti-cancer drug to kill the tumor cell.
  • MDR multi-drug resistance
  • VER P-gp inhibitor
  • anti-cancer drugs such as Adrmycin (adriamycin) and against Vincristine.
  • VCR Paclitaxel
  • Cisplatin Cisplatin
  • n-hexane phase was subjected to repeated G254 silica gel column chromatography, and the eluent was eluted with petroleum ether and ethyl acetate (9: i) to a full ethyl acetate gradient to obtain S6-S8, which is shown in Fig. 1, 18, 17 peak.
  • S6-S8 which is shown in Fig. 1, 18, 17 peak.
  • Each monomer was dissolved in the corresponding polar solution, recrystallized by supersaturation at room temperature 2-3 times, and the obtained crystals were identified by NMR.
  • the obtained compounds S1-S5 are PA derivative monomers, and S6-S8 is a dimer. ⁇ o
  • the cell lines used were K56 2 (human slow myeloid leukemia cell line) and K562/Adr (cell line of K562 resistant to long-term induction of doxorubicin and other chemotherapeutic drugs by doxorubicin); KB (human oral epithelium) Cell line) and KBv200 (cell line of long-term induction of vinca alkaloids and other chemotherapeutic drugs by low-dose vincristine); MCF-7 (human breast cancer cell line) and MCF-7/Adr (MCF-7 Low-dose doxorubicin long-term induction of cell lines resistant to chemotherapy such as adriamycin, the above cell lines were purchased from the Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences.
  • the 562/Adr multidrug resistant cell line was characterized by the increased expression of P-gp and Bcl-2 family and the coexistence of multiple drug resistance mechanisms such as increased glyoxalase I activity. Resistance to doxorubicin 20 times, cross-resistance to vincristine, daunorubicin, mitoxantrone, paclitaxel.
  • the KBv200 multidrug resistant cell line also has a multi-drug resistance mechanism such as increased expression of P-gp and Bcl-2 family and enhanced activity of glyoxalase I. Resistance to vincristine over 100 times, cross-resistance to doxorubicin, daunorubicin, paclitaxel, etc.
  • the MCF-7/Adr multidrug resistant cell line is also characterized by the coexistence of multiple drug resistance mechanisms such as increased expression of P-gp and Bcl-2 family and enhanced activity of glyoxalase I.
  • the half-inhibition rate (IC50) of cell growth inhibition was analyzed using the GraphPad Prism software San Diego, CA) software using a sigmoldal drug reaction nonlinear regression model.
  • the reagents and instruments used are as follows: PA monomer and dimer solution: dissolve BMSO single crystal, dubbed the working fluid 5 mg / m l of RPMI 1640 medium and then formulated as the working fluid.
  • Adriamycin (Adr), vincristine (VIN), paclitaxel (Taxol), cisplatin (DDP), RPMI 1640, MTT, calf serum, culture plate, carbon dioxide incubator, microplate reader, high performance liquid phase Chromatograph (HPLC), flow cytometry (FACS), P-gp fluorescent antibody kit UIU2 (available from Immunotech A Coulter Company, France).
  • the logarithmic growth phase cells were collected, washed twice with PBS, and subjected to FACS to detect the expression of P-g by the instructions of the P-gp fluorescent antibody kit (UIU2), and each sample counted 10,000 cells.
  • P-gp fluorescent antibody kit UAA2
  • K562 P-gp expression positive rate 0.22%
  • K562/Adr P-gp expression positive rate - 83.6%.
  • KB P-pg expression rate was 0.37%; KBv200: P-gp expression rate was 76.3%.
  • MCF-7 P-gp expression rate was 0.36%; MCF-7/Adr: P-gp expression rate was 83.4%.
  • the cells were repeatedly frozen and thawed with ImM PMSF PBS, sonicated, centrifuged at 12000 for 20 minutes, and the supernatant was taken.
  • the GLO1 assay can be carried out by reacting 7.9 mM MG, 1 mM glutathione, 14.6 mM magnesium sulfate, 182 mM imidazole-HCl (pH 7.0) mixture, and detecting the OD value at 240 nm absorption peak. The results are shown in Table 1.
  • Cells were lysed with NP-40 cell lysate and quantified by BCA.
  • the protein was fractionated by 1.2% SDS-PAGE gel and transferred to a nitrocellulose membrane, and the primary antibody against anti-Bcl-2 (Sigma) was added for color development.
  • Logarithmic growth phase cells were prepared by using a cell suspension of RFMI 1640 medium containing 10% newborn calf serum, and 100 ul per well was added to a 96-well culture plate to make 1 ⁇ 10 4 cells per well.
  • Semi-suspended cells K562 and K562/Adr were directly added with different concentrations of doxorubicin, vincristine, paclitaxel, and cisplatin.
  • the adherent cells were inoculated for 24 hours to be fully adherent, and the above drugs were added at different concentrations.
  • Each parallel gradient was set with 6 parallel replicate wells, each with a final volume of 200 ul.
  • the insufficient fraction was supplemented with medium and cultured at 37 ° C, saturated humidity, 5% C0 2 for 8 hours.
  • IC50 drug concentration at 50% inhibition rate.
  • Drug resistance multiple (RF) two resistant cells IC50 / sensitive cells IC50 The results of determination of drug resistance of various drug-resistant cell lines to conventional chemotherapy drugs are shown in Table 2 (IC50: ug/ml).
  • Example 3 Evaluation of Cytological Utility of PA Derivatives - Growth Inhibition of Drug-Resistant Cell Lines Method Steps: Cells were seeded in 96-well plates at 1 X 10 3 cells per well, K562/Adr directly plus PA, KBV200 and After MCF-7/Adr is attached with PA, the drug is divided into 5 concentrations: 0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 20, 40, 80, 160 ug/ml c MTT is measured according to the method of Example 2, and calculated IC50. Repeat the experiment three times
  • the control group (Ctrl) only added anticancer drugs without PA
  • the drug concentration of each PA group was 10 u g /ml
  • the concentration of chemotherapy drugs increased from 0.001 ug/ml gradient to 20 ug/ml
  • each gradient was set to 6 Parallel duplicate wells
  • the final volume of each well was 200 ul
  • the insufficient fraction was supplemented with RPMI 16 40
  • cultured for 68 hours at 37 ° C, saturated humidity, 5% C0 2 The MTT was measured in the same manner as in Example 4 and the IC50 was calculated.
  • MCF-7/Adr cells were seeded in 6-well plates at 1 x 10 6 cells per well. After 24 hours of culture, PA and chemotherapeutic drugs were added as described above, and culture was continued for 72 hours. The cells were collected by 0.25% trypsinization, and the cell pellet was fixed with pre-cooled 70% ethanol and stored at 4 °C. Before the measurement, the specimen was washed three times with PBS, RNase (lg/ml) for 15 min, propidium iodide (PI, 50 mg/L) for 30 min, and then flow cytometry was used to calculate the percentage of apoptotic cells.

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Description

苯酞衍生物的用途 技术领域
本发明涉及苯酞衍生物 (PA)的用途，该类衍生物的单体和二聚体可增强耐药肿- 瘤细胞对化疗药物的敏感性。 背景技术
多药耐药 (multi-drug resistance, MDR)是指肿瘤细胞能对多种化学结构、 功能 和作用机制不同的抗癌药物产生交叉耐药 (cross-resistance)。 临床研究表明， 结肠 癌、 肾癌、肝癌、非小细胞肺癌、神经角质瘤和 kaposis肉瘤、前列腺癌等实体瘤， 常被认为是抗药性的肿瘤， 甚至可能在刚诊断时就有耐药性存在， 属于原发性耐 药 (intrinsic MDR)。这些肿瘤细胞往往有多种不同耐药机制同时发挥作用， 对化疗 药物产生广泛耐药。 而急性髓细胞性白血病、 急性淋巴细胞性白血病、 多发性骨 髓瘤、淋巴瘤、 乳腺癌、 卵巢癌等肿瘤， 开始治疗阶段往往对化疗药物比较敏感， 但治疗中逐步产生耐药， 尤其治疗复发时， 耐药程度显著上升， 称为继发性耐药 (acquired MDR), 耐药后化疗效果显著降低。 MDR的存在和产生， 致使常规化疗 效果较差、 预后不良、 易产生复发和转移。 从某种意义上说， 90%死于肿瘤的病 例都与原发性或获得性耐药有关。
MDR的发生机制已进行了较为广泛的研究， 总体看是受多因素、 多机制共同 调控， 主要包括 ABC转运蛋白类对化疗药物的外排， 抗凋亡蛋白表达增加， 代谢 途径和调控方式改变、 解毒系统增强等。
因此， 现有技术中迫切需要开发一种效果明显的化疗增敏剂。 发明内容
本发明的目的在于提供一种效果明显的化疗增敏剂及其在制备抗肿瘤化疗增 敏剂或逆转剂中的应用。所述的增敏剂是式 (I)的苯酞及其衍生物 (包括单体及其二 聚体)。 在本发明的第一方面， 提供了一种通式 (I)所示的苯酞或其衍生物的用途， 用于 制备抗肿瘤药物的增敏剂或逆转剂
Figure imgf000003_0001
式中，
Rl表示氢、 羟基、 C1-CS烷基、 C2- C8链烯基、 C2-C8炔基、 C3-C8环烷基、 C1-C8烷氧基、 C1-C4羧基、 卤原子；
R2不存在或表示氢、 羟基、 C1-C8烷基、 C2- C8链烯基、 C2-C8炔基、 C3- C8环烷基、 C1-C8垸氧基、 C1-C4羧基、 卤原子；
R3和 R4独立表示氢、羟基、 C1-C8垸基、 C2-C8链烯基、 C2-C8炔基、 C3-C8 环垸基、 C1-C8烷氧基、 卤原子；
R5和 R8表示氢、 羟基、 C1-C8烷基、 C2-C8链烯基、 C2-C8炔基、 C3-C8 环烷基、 C1-C8烷氧基、 C1-C4羧基、 苯基、 芳基、 芳烷基、 5-6元含 1-2个氮原 子的杂环、 卤原子；
R6和 R7独立表示氢、羟基、 C1-C8浣基、 C2-C8链烯基、 C2-CS炔基、 C1-C4 羧基、 卤原子； 或者 R6和 R7连接在一起形成 5-7元环；
其中， 所述的烷基、 链烯基、 炔基、 环烷基、 垸氧基、 苯基、 芳基、 芳烷基和杂 环有 0-3个选自下组的取代基： C1-C3垸基、 羟基、 卤原子。
在另一优选例中， 所述的衍生物是式 (I)苯酞的二氢衍生物、 四氢衍生物， 或式
(I)苯酞或其二氢衍生物或四氢衍生物的二聚体。
更佳地， 所述的苯酞或其衍生物具有选自以下的结构：
Figure imgf000003_0002
式中， R1〜R8如上所定义。
在另一优选例中， 所述的苯酞或其衍生物具有选自以下的结构:
Figure imgf000004_0001
(10)
Figure imgf000005_0001
更佳地， 所述的抗肿瘤药物选自： 阿霉素； 长春新碱； 紫杉醇； 顺铂； 放线 菌素； 博来霉素； 白消安； 卡培他滨； 卡铂； 卡莫司汀； 苯丁酸氮芥； 环磷酰胺； 阿糖胞苷； 柔红霉素； 表阿霉素； 依托泊甙； 足叶乙甙； 鬼臼乙叉甙； 氟阿糖腺 苷酸； 氟尿嘧啶； 吉西他滨； 赫赛汀； 羟基脲； 伊达比星； 异环磷酰胺； 依立替 康； 洛莫司汀； 环己亚硝脲； 美法仑； 左旋苯丙氨酸氮芥； 巯基嘌呤； 氨甲蝶呤； 丝裂霉素； 米托蒽醌； 二羟基蒽酮； 奥沙利铂； 丙卡巴肼； 甲 (基)苄肼； 美罗华； 类固醇； 链佐星； 链脲霉素； 紫杉醇， 泰索帝； 硫鸟嘌呤； 噻替哌； 硫替哌；三胺 硫磷； 雷替曲塞； 拓扑替康； 曲奥舒凡； 尿嘧啶； 长春碱； 长春花碱； 长春地辛； 长春瑞宾； 格列卫； 羟基喜树碱； 及其衍生物或混合物。
在另一优选例中， 所述的抗肿瘤药物用于治疗选自下组的肿瘤： 非小细胞肺 癌、 前列腺癌、 肠癌、 肝癌、 白血病、 骨髓瘤、 淋巴瘤、 乳腺癌、 卵巢癌、 胃癌、 食管癌、 结肠癌、 或肉瘤。
在本发明的第二方面， 提供了一种药物组合物， 它含有 (a)有效量的通式 (I)所 示的苯酞或苯酞衍生物， （b)安全有效量的抗肿瘤药物和 (c)药学上可接受的载体。
更佳地； 所述抗肿瘤药物选自： 阿霉素； 长春新碱； 紫杉醇 ξ 顺铂； 放线菌 素； 博来霉素； 白消安； 卡培他滨； 卡铂； 卡莫司汀； 苯丁酸氮芥； 环磷酰胺； 阿糖胞苷； 柔红霉素； 表阿霉素； 依托泊甙； 足叶乙甙； 鬼臼乙叉甙； 氟阿糖腺 苷酸； 氟尿嘧啶； 吉西他滨； 赫赛汀； 羟基脲； 伊达比星； 异环磷酰胺； 依立替 康； 洛莫司汀； 环己亚硝脲； 美法仑； 左旋苯丙氨酸氮芥； 巯基嘌呤； 氨甲蝶呤； 丝裂霉素； 米托蒽醌； 二羟基蒽酮； 奥沙利铂； 丙卡巴肼； 甲 (基)苄肼； 美罗华； 类固醇； 链佐星； 链脲霉素； 紫杉醇， 泰索帝； 硫鸟嘌呤； 噻替哌； 硫替哌；三胺 硫磷； 雷替曲塞； 拓扑替康； 曲奥舒凡； 尿嘧啶； 长春碱； 长春花碱； 长春地辛； 长春瑞宾； 格列 -卫； 羟基喜树碱； 及其衍生物或混合物。
在'本发明的第三方面，提供了通式 (I)的苯酞衍生物的用途，用于制备抑制 P-gp 表达的组合物、 或抑制乙二醛酶 I表达的组合物、 或抑制 BcI-2表达的组合物。
在本发明的第四方面， 提供了一种治疗肿瘤的方法， 包括步骤： 给予需要治 疗的哺乳动物施用安全有效量的通式（工）所示的苯酞或苯酞衍生物。
更佳地， 所述的方法还包括步骤： 施用至少一种抗肿瘤药物， 所述抗肿瘤药物 如上所述 附图说明
图 1 显示了笨酞衍生物的色谱图。
图 2显示了 Bcl-2 Western印迹法的检测结果
图 3显示了 PA类衍生物增敏 Adr诱导的 MCF-7/Adr细胞死亡。
图 4显示了 FACS检测 PA类衍生物与 Adr联合时对 MCF-7/Adr的凋亡增敏作 用。 具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究， 发现式（I )苯酞及其衍生物是一类有效的 抗肿瘤化疔增敏剂。 基于此增敏作用， 苯酞及其衍生物可有效逆转肿瘤对肿瘤药 物的多药耐药性。 在此基础上完成了本发明。 本文所用的术语 "烷基"指直链或支链饱和的、 含有 1 8个碳原子 (较佳地
1 - 6个碳原子）的脂族烃类基团； 所述的烷基可以是支链的， 如甲基、 乙基、 正丙 基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 叔丁基、 正戊基、 异戊基、 叔戊基、 己基等。 "链 烯基 "包括含有至少一个碳碳双键和 2-8个碳原子（较佳地 2-6个碳原子）的直链 和支链烃基。 "炔基"包括含有至少一个碳碳三键和 2-8个碳原子（较佳地 2 - 6 个碳原子）的直链和支链烃基。
本文所用的术语 "芳基"指芳族体系， 可以是单环或原本稠合的或连接在一 起的多芳环， 从而使至少一部分稠合或连接的环形成共轭的芳系。 芳基基团包括 (但不限制于）： 苯基、 萘基、 四氢萘基。
本文所用的 "环烷基"指具有 3至 8个碳原子的环烷基团， 如环丙基、 环戊 基、 环己基和环庚基等。
本文所用的 "烷氧基"指具有 1至 8个碳原子的烷氧基， 如甲氧基、 乙氧基、 丙氧基、 丁氧基、 戊—氧基、 己氧基等。
本文所用的术语 "杂环"指稳定的 4-7元（更佳地 5-6元）单环或稳定的多环 杂环， 该杂环可以是饱和的、 部分不饱和的或不饱和的， 且由碳原子和选自以下 的 1-4个杂原子构成： N、 0和 S原子。 N和 S原子可以被氧化。 杂环还可包括任 何多环， 其中任一上述杂环可稠合于芳环。
"取代的芳基" 或 "取代的杂环"指被 1-3个选自下组的基团所取代的芳基 或杂环： 卤素、 CN、 0H、 N02、 氨基、 烷基、 环烷基、 链烯基、 炔基、 垸氧基、 芳 氧基、 取代的烷氧基、 垸基羰基、 垸基羧基、 烷基氨基或芳硫基。 较佳地， 取代 基是 ¾素、 CI- C4烷基、 烷基、 羟基。
本文所用的 "卤原子"指卤族元素， 为¥、 Cl、 Br、 或工。 活性成分
本发明的活性成分是式（I)苯酞衍生物。
Figure imgf000007_0001
本发明所用的术语"苯酞衍生物"是指式（I)苯酞， 其中在苯环上可加成有氢 原子的苯酞衍生物单体。该术语还包括由式（I)苯酞或其加氢产物所形成的二聚体 或多聚体（更佳地为二聚体）。
本文所用的 "二氢衍生物"是指苯酞的苯环中， 在对应于双键的相邻碳原子 上加成了 2个氢原子； 所述的苯酞的 "四氢衍生物"是指苯酞的苯环中， 在对应 于双键的碳原子上加成了 4个氢原子。例如， 式 (k)'化合物是式 (k)化合物的一种二 氢衍生物； 式 化合物是式 (k)化合物的一种四氢衍生物。
Figure imgf000008_0001
本发明的苯酞衍生物人工合成或从自然界分离。 例如可从伞形科植物当归或 川芎中分离提取式 (I)苯酞的单体和 /或二聚体。 药物组合物
本发明还包括一种药物组合物， 它含有本发明的式（I)苯酞衍生物 （包括单体 或二聚体）作为活性成分以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂（如溶剂、 稀释剂） 。 可用于本发明的药学上可接受的载体包括各种常规的固态载体和液体 载体。 例如， 固态载体包括： 淀粉、 乳糖、 磷酸氢钙、 微晶纤维素等， 而液态载 体包括： 无菌水、聚乙二醇等， 只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。
本发明的药物组合物可以制成各种常规形式， 例如： 片剂、 胶囊、 可分散的粉 末、 颗粒或悬浮液、 糖浆（含有如约 10- 50%糖）、 和酏剂（含有约 20- 50%乙醇）， 或 者以无菌可注射溶液或悬浮液形式（在等渗介质中含有约 0. 05-5%悬浮剂）进行非 肠胃给药。 例如， 这些药物制剂可含有与载体混合的约 0. 01- 99. 9wt %， 较佳地 2. 5-90wt%, 更佳地 5- 6(^七％的活性成分。.
另一优选的药物组合物还同时含有抗肿瘤药物，例如含有（a) 0. 01-99wt% (较佳 地 0. l-90wt%)的苯酞衍生物的单体或二聚体； （b) 0. 01- 99wt% (较佳地 0. l-90wt%) 的抗肿瘤药物； （c)药学上可接受的载体。 通常， 组分（a)与组分 (b)的重量比为 1 : 100〜100 : 1， 更佳地为 10 : 1〜1 : 10。
药物组合物还可含有其他添加剂如抗色素、 防腐剂和抗氧化剂等。
所用的活性成分的有效剂量可随给药方案和待治疗的疾病的严重程度而变化。 然而， 通常当苯酞衍生物的单体或二聚体每天以约 0. 05- 500mg/kg体重（更佳地 0= 1- lOOmg/kg体重）的剂量给予时， 能得到令人满意的效果； 较佳地每天以 2 - 4 次分开的剂量给予， 或以缓释形式给药。 治疗方法 本发明还提供了一种治疗方法， 它包括步骤： 给需要治疗的哺乳动物施用安 全有效量的苯酞衍生物的单体或二聚体。 较佳地， 该方法还包括步骤： 同时联用 其他抗肿瘤药物（如作为 P-gp底物的抗肿瘤药物）或其他治疗手段（如化疗）。
单用或联用苯酞衍生物的单体或二聚体可治疗各种不同的肿瘤。代表性的例子 包括（但并不限于）： 非小细胞肺癌、 前列腺癌、 肠癌、 肝癌、 白血病、 骨髓瘤、 淋巴瘤、 乳腺癌、 卵巢癌、 胃癌、 食管癌、 结肠癌—、 肉瘤等。
苯酞衍生物的单体或二聚体的给药方式没有特别限制。 可通过口服以及静脉 内、 肌内、 局部、 瘤内或皮下等途径给药。 优选方式是口服、 静脉内或瘤内给药。 本发明的主要优点在于：
本发明所述的苯酞衍生物的单体和二聚体都具有广谱增敏肿瘤细胞对抗癌药 物的多药耐药性 (multidrug resistance, MDR), 有效增强抗癌药物杀伤肿瘤细胞。 实验证明， 它们在对 Adr(adriamycin，阿霉素)等抗癌药物作用于耐药肿瘤细胞具有 超过 P-gp抑制剂维拉帕米 (Verapamil, VER)的逆转效果，对长春新碱 （Vincristine, VCR), 紫杉醇 (Taxol)和顺铂 (Cispkntin, DDP)的效果比 VER高 2-5倍以上。 该类 衍生物可使肿瘤细胞的耐药性降低 5-30倍， 并且显著增强多种化疗药物诱导的肿 瘤细胞凋亡效应。 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述： 应理解， 这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 实施例 1从川芎和当归中提取苯酞衍生物
取 3kg药材 (川芎或当归)烘干， 粉碎， 过 20目筛。 粉末用 2倍体积 （v/w) 氯 仿抽提 3次， 抽提液回收氯仿制成浸膏， 用正己烷和甲醇分层萃取。 甲醇相经反 复 G254硅胶色谱柱层析， 洗脱液为正己烷和乙氰体积比 9: 1到 5: 5, 分别得到 S1-S5 , 即图 1中所示 8、 12、 7、 14、 3号峰。 正己烷相经反复 G254硅胶色普柱 层析， 洗脱液为石油醚和乙酸乙顏 ^ 9 : i到全乙酸乙酯梯度洗脱， 分别得到 S6- S8 , 即图 1中所示 16、 18、 17号峰。 各单体溶于相应极性溶液中， 过饱和室温 2-3次重结晶， 获得的晶体用 NMR进行结构鉴定。
所得化合物 S1-S5为 PA衍生物单体， S6-S8为二聚体。 ο o
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Z,∑:9l00/S00ZJSl3/X3d 1"Z,09f0/Z,00Z OAV (b,C-l l), 164.9 (C- Γ), 150.5 (C-3'), 47.6 (C-3 'a), 31.1 (C-4'), 25.8 (C-5'), 41.5 (a,C- 6')， 142.0 (C-7，)， 134.3 (C-7'a), 108.8 (C-8')， 27.5 (C-9')， 22.3 (C-10'), 13.8 (b,C-l l，)
S7:
Figure imgf000012_0001
^-NMR CDCl3) δ 2.02,2.57 (各 lH,m,H-4) 2.02,2.17 (各 lH,m，H-5) 2.55 (lH,m,H-6) 3.47 (lH,d,J=7.3,H-7) 5.21 (lH,t,J=7.8,H-8) 2.33 (2H,m，H-9) 1.50 (2H,m,H-10) 0.95 (3H,t,J=7.6,H-l l) 2.58,2.74 (各 lH,m,H-4，） 2.47,2.75 (各 lH,m,H-5' ) 5.93 (lH,dt,J=9.6,4.1, H-6') 6.17 (lH,dt,J=9.6, 1.8, H-7，） 2.94 (lH,q,J=7.8,H-8，） 1.45 (2H，m,H-9，) 1.14 (2H,m,H-10，） 0.87 (3H,t,J=7.6,H-l 1 ')
,3C-NMR(CDC13) δ 168.5 (C-l), 149.2 (C-3), 154.6 (C-3a), 19.6 (C-4), 26.2 (C- 5)， 35.0 (c，C- 6), 44.0 (C-7), 122.3 (c,C-7a)5 112.2 (C-8), 28.0 (C-9), 22.4 (C-10), 13.9 (C-11), 170.3 (C-l，)， 92.0 (C-3'), 160.1 (C-3 'a), 21.0 (c,C-4，)， 20.7 (c,C-5，)， 138.7 (C-6，)， 117.0 (C-7，)， 122.5 (d,C-7'a), 32.3 (c,C-8')， 20.0 (c,C-9'), 22.6 (C-10'), 14.1 (C-11 ')
S8:
Figure imgf000012_0002
1H-NMR(CDC13) δ 4.56 (lH，m,H-3) 1.98, 2.08 (各 lH,m,H-4) 1.53,1.90 (各 lH,m,H-5) 2.54 (lH,m,H-6) 3.18 (lH,d,J=8.9,H-7) 1.38,1.70 (各 lH,m,H-8) 1.26 (2H,m,H-9) 1.45 (2H,m,H-10) 0.93 (3H,t,J=7.34,H-l 1) 1.40,2.03 (各 lH,m,H-4，) 2.30,1.87 (各 lH,m,H-5') 2.97 (lH，m,H-6，) 7.33 (lH,d,J=6.6，H-7，） 4.98 (lH，t,J=7.3) 2.18 (2H,q,J=7.8,H-9') 1.44 (2H，m,H-10，） 0.93 (3H,t,J=7.3,H-l Γ)
13C-NM (CDC13) δ 165.0 (C-l), 82.4 (C-3), 47.3 (C-3a)， 30.9 (C-4), 25.7 (C-5), 41.6 (C-6), 141.9 (C-7), 134.5 (C-7a), 32.2 (C- 8), 26.5 (C-9), 22.3 (C-10), 13.7 (C-11), 171.9 (C-l '), 150.5 (C-2，)， 168.1 (C-3 a), 22.4 (C-4')， 28.8 (C-5，), 38.3 (C-65), 41.7 (C-7'), 127.1 (C-7a')3 108.6 (C-8'), 27.4 (C-9'), 22.2 (C-10'), 13.9 (C-115) 获得的 S1-S8的 PA衍生物单体或二聚体用于后续的试验。 所得化合物 S1-S5 为 PA衍生物单体； 所得化合物 S6-S8为 PA衍生物的二聚体。 实施例 2各细胞株的耐药性检测
所用的细胞系为 K562(人慢粒髓性白血病细胞系)及 K562/Adr(K562经低剂量 阿霉素长期诱导产生的耐阿霉素等化疗药的细胞系）； KB (人口腔上皮细胞系)及 KBv200(KB经低剂量长春新碱长期诱导产生的耐长春新碱等化疗药的细胞系）； MCF-7(人乳腺癌细胞系)及 MCF-7/Adr(MCF-7经低剂量阿霉素长期诱导产生的耐 阿霉素等化疗药的细胞系)， 以上细胞株均购自中国医学科学院血液学研究所。
562/Adr多药耐药细胞系以 P-gp、 Bcl-2家族表达升高， 乙二醛酶 I (glyoxalase I)活性增强等多种耐药机制共存为主要特征。 对阿霉素耐药 20倍， 对长春新碱、 柔红霉素、 米托蒽醌、 紫杉醇等交叉耐药。
KBv200多药耐药细胞系， 亦以 P-gp、 Bcl-2家族表达升高， 乙二醛酶 I (glyoxalase I)活性增强等多种耐药机制共存为主要特征。对长春新碱耐药 100倍以 上， 对阿霉素、 柔红霉素、 紫杉醇等交叉耐药。
MCF-7/Adr多药耐药细胞系， 同样以 P-gp、 Bcl-2家族表达升高， 乙二醛酶 I(glyoxalase I)活性增强等多种耐药机制共存为主要特征。
细胞生长抑制的半数抑制率 (IC50)采用 GraphPad Prism software San Diego, CA) 软件， 使用 sigmoldal药物反应非线形衰退模型分析。 所用的试剂和仪器如下： PA单体和二聚体溶液： 单晶用 BMSO溶解， 配成 5 mg/ml的工作液， 再用 RPMI 1640培养基配成工作液。 阿霉素 (Adr)， 长春新碱 (VIN)， 紫杉醇 (Taxol)， 顺 铂 (dsplatin, DDP)， RPMI 1640, MTT， 小牛血清， 培养板， 二氧化碳培养箱， 酶 标仪，高效液相色谱仪 (HPLC)，流式细胞仪 (FACS), P-gp荧光抗体试剂盒 UIU2(购 自 Immunotech A Coulter Company, France)。
1、 FACS检测 P-gp表达
收集对数生长期细胞， PBS洗两次， 按 P-gp荧光抗体试剂盒 (UIU2)的说明操 作， 进行 FACS检测 P-g 的表达， 每个样本计数 10， 000个细胞。
测定结果：
K562: P-gp表达阳性率 0.22%; K562/Adr: P-gp表达阳性率—83.6%。
KB: P-pg表达阳性率 0.37%; KBv200: P-gp表达阳性率 76.3%。
MCF-7: P-gp表达阳性率 0.36%; MCF-7/Adr: P-gp表达阳性率 83.4%。
上述实验结果说明所选用的细胞株主要的耐药机制可能都与高表达 P-gp有关。
2、 乙二醛酶 I(GLOl)酶活性检测
用含 ImM PMSF PBS反复冻融细胞， 并超声破碎， 12000离心 20分钟， 取上 清。 GLO1化验可用 7.9mM MG， ImM谷胱甘肽， 14.6mM硫酸镁， 182mM咪唑 -HCl(pH 7.0)混合剂反应， 在 240nm吸收峰检测 OD值， 结果见表 1。
表 1
Figure imgf000014_0001
结果说明， 所用细胞株的耐药机制之一与 GLO1活性增高有关。
3、 Bcl-2表达检测
用 NP-40细胞裂解液裂解细胞， BCA定量。 1.2%SDS-PAGE胶进行蛋白分 半干转膜至硝酸纤维素膜， 加入抗 Bcl-2的一抗 (Sigma公司）， 显色。
结果见图 2。 结果表明， 所用细胞株的耐药机制之一与 Bcl-2高表达相关。
2、 测定耐药细胞株对常规化疗药物的耐药性 取对数生长期细胞， 用含 10%新生牛血清的 RFMI 1640培养基配成细胞悬液， 每孔 100 ul加至 96孔培养板， 使每孔细胞数为 1 X 104个。 半悬浮细胞 (K562和 K562/Adr)直接加入不同浓度梯度的阿霉素、 长春新碱、 紫杉醇、 顺铂， 贴壁细胞 接种后培养 24小时使完全贴壁， 再加入不同浓度上述药物。 每浓度梯度设 6个平 行复孔，每孔终体积 200 ul，不足部分-以培养基补足，于 37°C、饱和湿度、 5% C02 条件下培养& 8小时。 每孔加 MTT 50 ul(2 mg/ml), 离心去上清， 每孔加入 DMSO 120 ul, 振荡器振荡， 充分溶解结晶， 用酶标仪在 590 nm波长下检测 OD值。
计算方法： IC50 =抑制率为 50%时的药物浓度。
耐药倍数 (RF)二耐药细胞 IC50 /敏感细胞 IC50。 各耐药细胞株对常规化疗药物的耐药性测定结果见表 2 (IC50: ug/ml)o
表 2
Figure imgf000015_0001
结果说明所选的耐药株均对常规化疗药物具有交叉耐药性， 即多药耐药性。 实施例 3 PA类衍生物的细胞学效用评价——对耐药细胞株的生长抑制作用 方法步骤： 细胞接种于 96孔板， 每孔 1 X 103细胞， K562/Adr直接加 PA, KBV200和 MCF-7/Adr贴壁后加 PA, 药物分为 5个浓度： 0，0.1， 0.5， 1， 5， 10 20， 40， 80, 160 ug/ml c 按实施例 2方法测 MTT， 并计算 IC50。 实验重复三次
PA对耐药细胞的生长抑制作用测定结果见表 3(IC50 (ug/ml))0 表 3
Figure imgf000016_0001
上述结果说明 PA类衍生物在 10 ug/ml左右浓度时无明显的细胞毒作用。 实施例 4 PA类衍生物的细胞学效用评价——对常规化疗药物的增敏效果 取对数生长期细胞， 用含 10%小牛血清的 RPMI 1640培养液配成细胞悬液， 每孔 lOO ul加至 96孔培养板， 使每孔细胞数为 2 X 103个 (悬浮细胞)或 1 X 103 (贴 壁细胞)。悬浮细胞接种后在培养板上适应 0.5小时，贴壁细胞培养使贴壁后加药。 对照组 (Ctrl)只加抗癌药物不加 PA， 各 PA组的药物浓度均为 10 ug/ml， 化疗药物 浓度从 0.001 ug/ml梯度增大到 20 ug/ml，每梯度设 6个平行复孔，每孔终体积 200 ul, 不足部分以 RPMI 1640补足， 于 37°C、 饱和湿度、 5% C02条件下培养 68小 时。 同实施例 4方法测 MTT并计算 IC50。
增敏倍数计算公式： 增敏倍数 (1^)=无增敏剂 IC50 /有增敏剂 IC50
PA(10 ug/ml)对 K562/A4r细胞的增敏作用结果见表 4。
PA(10 ug/ml)对 KBv200细胞的增敏作用见表 5。
PA(10ug/ml)对 MCF-7/Adr细胞的增敏作用见表 6。 表 4
Ctrl SI RF(Ctrl/Sl) S2 RF(Ctrl/S2)
Vin 12.13 1.599 6.214 5.690 1.757
± 0.3492 ± 0.2788 ±0.0754
Adr 7.674 0.1051 34.99 0.0748 41.12
±0.1603 ± 0.0049 ±0.0109
Taxol 0.8225 0.0342 24.04 0.0778 10.57
± 0.0073 ±0.0073 ±0.0062
DDP 5.311 ' 1.023 5.116 0.9321 5.698
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10 ±.4429320.32^o.^w^^ -Ll~
Z9'9l SSO'O 6LZ'V Ζ.ΙΙΓΟ εθ8Γθ
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½0'0 + SWOT
6Γ0Ϊ 6880Ό 906Ό IO BX
2062"0 + 9 οε·ο+ « ·ο千
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Z166"0 +
6ΓΓ9 ZVll 99ΓΙ
zs (IS/TO) IS TO
9挲
S880-0 + + Ι68Γ0 +
Figure imgf000018_0002
L5LO'0 + 9£Ι0 + εοΐθ-ο+
乙 8·ε 6LV9 96ΪΌ WIl'O
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Z9'£ τ\τ\ SOYZ "9Ζ8Ί L6VZ ΖΙ6Ί
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(8S/ 1D)JH 8S (乙 S/W。)d¾ AS (9S/TO)ja 9S .ειο·ο+ I0SO-0 + εθΐΟΌ +
ΟΙΟΐΌ 186-9 秦 8'0 88ΤΆ 179Ι8Ό daa εοιο·ο=ρ ΪΙ20Ό + 9 880Ό +
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9^0*0 +
S6'9T \ζ£·£ LEZS'O L6SI ξ\£Ζ-0
Figure imgf000018_0005
Z.i9l00/C00iM3/X d ^Ζ.09£0/Ζ.00ε 0VV ±0.0432 ± 0.0211 ±0.053
DDP 1.149 6.708 1.504 5.125 1.710 4.508
±0.4103 ±0.5031 ±0.9137
S6 RF(Ctrl/S6) S7 RF(Ctrl/S7) S8 F(Ctrl/S8)
Vin 1.064 13.22 3.673 3.831 1.466 9.597
±0.1903 ±0.5122 ±0.1152
Adr 0.5022 12.59 0.4476 14.12 1.212 5.639
± 0.2160 ±0.1297 ±0.4603
Taxol 0.2304 3.932 0.129 7.023 0.562 1.612
± 0.0307 ±0.0146 ±0.0737
DDP 3.035 2.539 1.183 6.516 1.203 6.407
±0.621 ±0.3503 ±0.3302 实施例 5 PA类衍生物的细胞学效用评价——对化疗药物诱导细胞死亡的增敏 作用
按实施例 2中所述的方法接种细胞和药物诱导， 48小时后每孔加 5 ul台盼兰 (4 mg/ml), 5分钟后显微镜下镜检， 每孔计数 500个细胞， 染成蓝色的为死细胞， 计 算存活率。
细胞存活率 (％)=[1-死细胞 (蓝色 )/500]*100。
PA类衍生物对阿霉素诱导的细胞死亡增敏作用见图 3。 S1-S8均为 10 ug/ml 浓度， Adr均为 2.5 ug/ml。 S1+-S8+表示 S(10 ug/ml)与 Adr(2.5 ug/ml)联合用药。 结果表明 PA类衍生物显著增敏 Adr诱导的细胞死亡。 实施例 6 FACS检测 PA类衍生物对化疗药物的凋亡增敏作用
MCF-7/Adr细胞接种于 6孔板， 每孔 1 X 106个细胞。 培养 24小时后按上述方 法加 PA及化疗药物， 继续培养 72小时。 0.25%胰酶消化收集细胞， 细胞沉淀用 预冷的 70%乙醇固定， 4°C保存。 测定前将标本用 PBS洗三次， RNA酶 (l g/ml) 消化 15 min， 碘化丙锭 (PI， 50 mg/L)染色 30 min， 然后用流式细胞仪检测， 计算 凋亡细胞百分比。
结果见图 4。 Adr浓度为 2.5 ug/ml, PA 10 ug/ml， S1+-S8+表示 S(10 ug/ml)与 Adr(2.5 ug/ml)联合用药。 结果表明 PA类衍生物显著增敏 Adr诱导的 MCF-7/Adr 细胞凋亡。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单 独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领 域技术人员可以对本发明作各种改动或修改 这些等价形式同样落于本申请所附 权利要求书所限定的范围。

Claims

权 利 要 求
1.一种通式 (I)所示的苯酞或其衍生物的用途， 其特征在于， 用于制备抗肿瘤药 物的增敏剂或逆转剂
Figure imgf000021_0001
式中，
R1表示氢、 羟基、 CI- C8烷基、 C2-C8链烯基、 C2-C8块基、 C3-C8环烷基、 C1-C8烷氧基、 C1-C4羧基、 卤原子；
R2不存在或表示氢、 羟基、 C1-C8烷基、 C2-C8链烯基、 C2-C8炔基、 C3- C8环烷基、 C1-C8烷氧基、 C1-C4羧基、 卤原子；
R3和 R4独立表示氢、羟基、 C1-C8烷基、 C2-CS链烯基、 C2-C8炔基、 C3-C8 环烷基、 C1-C8烷氧基、 卤原子；
R5和 R8表示氢、 羟基、 C1-C8烷基、 C2-CS链烯基、 C2-CS炔基、 C3-C8 环烷基、 C1-C8烷氧基、 C1-C4羧基、 苯基、 芳基、 芳垸基、 5-6元含 1-2个氮原 子的杂环、 卤原子；
R6禾口 R7独立表示氢、羟基、 C1-C8烷基、 C2-C8链烯基、 C2-C8炔基、 C1-C4 羧基、 卤原子； 或者 R6和 R7连接在一起形成 5-7元环；
其中， 所述的烷基、 链烯基、 炔基、 环烷基、 烷氧基、 苯基、 芳基、 芳烷基和杂 环有 0-3个选自下组的取代基： C1-C3烷基、 羟基、 卤原子。
2.如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述的衍生物是式 (I)苯酞的二氢 衍生物、 四氢衍生物， 或式 (I)苯酞或其二氢衍生物或四氢衍生物的二聚体。
3.如权利要求 1所述的用途，其特征在于，所述的苯酞或其衍生物具有选自以 下的结构：
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000022_0002
式中， R1〜RS如权利要求 1中所定义。
4. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述的苯酞或其衍生物具有选自以 下的结构-
Figure imgf000022_0003
Figure imgf000023_0001
5. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述的抗肿瘤药物选自： 阿霉素； 长春新碱； 紫杉醇； 顺铂； 放线菌素； 博来霉素； 白消安； 卡培他滨； 卡铂； 卡 莫司汀； 苯丁酸氮芥； 环磷酰胺； 阿糖胞苷； 柔红霉素； 表.阿霉素 依托泊甙； 足叶乙甙； 鬼臼乙叉甙； 氟阿糖腺苷酸； 氟尿嘧啶； 吉西他滨； 赫赛汀； 羟基脲; 伊达比星； 异环磷酰胺； 依立替康； 洛莫司汀； 环己亚硝脲； 美法仑； 左旋苯丙 氨酸氮芥； 巯基嘌昤； 氨甲蝶吟； 丝裂霉素； 米托蒽醌； 二羟基蒽酮； 奥沙利铂; 丙卡巴肼； 甲 (基)苄肼； 美罗华； 类固醇； 链佐星； 链脲霉素； 紫杉醇， 泰索帝； 硫鸟嘌吟； 噻替哌； 硫替哌；三胺硫磷； 雷替曲塞； 拓扑替康； 曲奥舒凡； 尿嘧啶； 长春碱； 长春花碱； 长春地辛； 长春瑞宾； 格列卫； 羟基喜树碱； 及其衍生物或 混合物。
5.
6. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述的抗肿瘤药物用于治疗选自 下组的肿瘤： 非小细胞肺癌、 前列腺癌、 肠癌、 肝癌、 白血病、 骨髓瘤、 淋巴瘤、 乳腺癌、 卵巢癌、 胃癌、 食管癌、 结肠癌、 或肉瘤。
7. 一种药物组合物， 其特征在于， 含有 (a)有效量的通式 (I)所示的苯酞或苯酞 衍生物， （b)安全有效量的抗肿瘤药物和 (c)药学上可接受的载体；
0 其中所述抗肿瘤药物选自： 阿霉素； 长春新碱； 紫杉醇;'顺铂； 放线菌素； 博来霉素； 白消安； 卡培他滨； 卡铂； 卡莫司汀； 苯丁酸魏芥； 环磷酰胺； 阿糖 胞苷； 柔红霉素； 表阿霉素； 依托泊甙； 足叶乙甙； 鬼白乙叉甙； 氟阿糖腺苷酸； 氟尿嘧啶； 吉西他滨； 赫赛汀； 羟基脲； 伊达比星； 异环磷酰胺； 依立替康； 洛 莫司汀； 环己亚硝脲； 美法仑； 左旋苯丙氨酸氮芥； 巯基嘌呤； 氨甲蝶呤； 丝裂5 霉素； 米托蒽醌； 二羟基蒽酮； 奥沙利铂； 丙卡巴肼； 甲 (基)苄肼； 美罗华； 类 固醇； 链佐星； 链脲霉素； 紫杉醇， 泰索帝； 硫鸟嘌吟； 噻替哌； 硫替哌;三胺硫 磷； 雷替曲塞； 拓扑替康； 曲奥舒凡； 尿嘧啶； 长春碱； 长春花碱； 长春地辛； 长春瑞宾； 格列卫； 羟基喜树碱； 及其衍生物或混合物。
8. 通式 (I)的苯酞衍生物的用途， 用于制备抑制 P-gp表达的组合物、 或抑制0 乙二醛酶 I表达的组合物、 或抑制 Bel- 2表达的组合物。
9. 一种治疗肿瘤的方法， 包括步骤： 给予需要治疗的哺乳动物施用安全有效 量的通式（I)所示的苯酞或苯酞衍生物。
10.如权利要求 9所述的方法， 其特征在于， 还包括步骤： 施用至少一种抗肿 瘤药物， 所述抗肿瘤药物选自： 阿霉素； 长春新碱； 紫杉醇； 顺铂； 放线菌素；5 博来霉素； 白消安； 卡培他滨； 卡铂； 卡莫司汀； 苯丁酸氮芥； 环磷酰胺； 阿糖 胞苷； 柔红霉素； 表阿霉素； 依托泊甙； 足叶乙甙； 鬼臼乙叉甙； 氟阿糖腺苷酸； 氟尿嘧啶； 吉西他滨； 赫赛汀； 羟基脲； 伊达比星； 异环磷酰胺； 依立替康； 洛 莫司汀； 环己亚硝脲； 美法仑； 左旋苯丙氨酸氮芥； 巯基嘌呤； 氨甲蝶呤； 丝裂 霉素—； 米托蒽醌; - 二羟基蒽酮； 奥沙利—f 丙卡巴肼； 甲 (基)苄餅； 荑罗^ ; 类0 固醇； 链佐星； 链脲霉素； 紫杉醇， 泰索帝； 硫鸟嘌呤； 噻替哌； 硫替哌;三胺硫 磷； 雷替曲塞； 拓扑替康； 曲奥舒凡； 尿嘧啶； 长春碱； 长春花碱； 长春地辛； 长春瑞宾； 格列卫； 羟基喜树碱； 及其衍生物或混合物。
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