WO2007018236A1 - 家族性筋萎縮性側索硬化症の発症又は進行を抑える化合物のスクリーニング方法、及び家族性筋萎縮性側索硬化症の診断方法 - Google Patents

家族性筋萎縮性側索硬化症の発症又は進行を抑える化合物のスクリーニング方法、及び家族性筋萎縮性側索硬化症の診断方法 Download PDF

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amyotrophic lateral
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Akira Nakagawara
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Shigenobu Mochizuki
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a compound that suppresses the onset or progression of familial amyotrophic lateral sclerosis.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing familial amyotrophic lateral sclerosis.
  • ALS Amyotrophic Lateral Sclerosis
  • FALS Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis
  • SOD-1 superoxide dismutase 1
  • Non-patent Document 9 NED L1 was discovered as a HECT-type E3 ligase that binds to mutant SOD-1 and ubiquitinates.
  • NEDL1 has the ability to ubiquitinate mutant SOD-1 and promote degradation in the proteasome. It does not ubiquitinate wild-type SOD-1.
  • mutant SOD— 1 has been known to bind to translocon-associated protein- ⁇ (TRAP- ⁇ ), one of the components of hydrophilic 'translocon' on the rough endoplasmic reticulum.
  • TRAP- ⁇ translocon-associated protein- ⁇
  • NEDL1 also binds to Dishevelled-1 (DV L1), which is a key molecule of the Wnt signaling system, and has been shown to be ubiquitin. From these results, it is speculated that NEDL1 forms a ubiquitinated complex with mutant SOD, TRAP- ⁇ , Dvll, and that the toxicity of this complex may cause exercise-euron to die. .
  • DV L1 Dishevelled-1
  • HIF-1 hypoxia-inducible factor-1
  • ARNT aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator
  • HIF-l iS HIF prolyl hydroxylase
  • PDH HIF prolyl hydroxylase
  • PDH1 to 4 PDH prolyl hydroxylases
  • PDH hydroxylates the 402nd and 564th proline residues in the HIF-1 ⁇ protein.
  • HIF-1a hydroxylated at the proline residue is ubiquitinated by the E3-ubiquitin ligase complex consisting of von Hippel Lindau protein (pVHL), elongin B, elongin C, CUL and RBX1, and the 26S proteanome Decomposes quickly.
  • HIF-1 ⁇ is not degraded and can be detected as a protein.
  • DFO desferrioxamine
  • Non-Patent Document 13 A / P564A is not decomposed since no longer hydroxide by p DH, behaves as a so-called constitutive activation mutants (constitutive active mutant) (Non-Patent Document 13).
  • HIF-la has several growth factors (eg, insulin, insulin-like growth factors 1 and 2, epithelial cell growth factor, fibroblast growth factor 2, platelet-derived growth factor, transforming growth factor / 3 1 Etc.) and inflammatory site force-in (for example, IL1, TNFa, etc.) induce expression even under normal oxygen (Non-patent Documents 11 and 15).
  • growth factors eg, insulin, insulin-like growth factors 1 and 2, epithelial cell growth factor, fibroblast growth factor 2, platelet-derived growth factor, transforming growth factor / 3 1 Etc.
  • inflammatory site force-in for example, IL1, TNFa, etc.
  • HIF-1 binding sequence 5 ′-(A / G) CGTG-3 ′ has been reported (Non-patent Document 11).
  • Non-Patent Document 1 Rosen DR et al. Nature 364: 59—62, 1993
  • Non-Patent Document 2 Wong PC et al. Neuron 14: 1105-1116, 1995
  • Non-Patent Document 3 Liu D et al "FASEB J. 13: 2318-2328, 1999
  • Non-Patent Document 4 Said Ahmed M et al., J Neurol Sci. 176: 88-94, 2000
  • Non-Patent Document 5 Jung C et al., Neurosci Lett. 304: 157-160, 2001
  • Non-Patent Document 6 Di Matteo V and Esposito E., Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 2: 95-107, 2003
  • Non-Patent Document 7 Hensley K et al., J Neurochem. 82: 365-374, 2002
  • Non-Patent Literature 8 Yoshihara T et al "J Neurochem. 80: 158-167, 2002
  • Non-Patent Document 9 Miyazaki K et al "J Biol Chem. 279: 11327-11335, 2004
  • Non-Patent Document 10 Wang GL and Semenza GL. J. Biol Chem. 268: 21513-21518, 1993
  • Non-Patent Document 11 Zagorska A and Dulak J. Acta Biochim. Pol. 51: 563-585, 2004
  • Non-Patent Document 12 Wang GL and Semenza GL.Blood 82: 3610-3615, 1993
  • Non-patent document 13 Yu F et al. Proc Natl Acad Sci USA. 98: 9630-9635, 2001
  • Non-patent document 14 Chandel NS et al. Proc Natl Acad Sci USA. 95: 11715-11720, 1998
  • Non-patent document 15 T Hell-B et al, Blood 94: 1561-1567, 1999
  • one of the objects of the present invention is to find a path that controls the expression of NEDL1.
  • Another object of the present invention is to provide a screening method for compounds that suppress the onset or progression of FALS.
  • another object of the present invention is to provide a FALS diagnostic method.
  • the present invention measures the step of culturing cells under the respective conditions in the presence and absence of the test compound, and measures the expression level of HIF-1 ⁇ in each cultured cell. And the expression level of HIF-1 ⁇ in cells cultured in the presence of the test compound is less than the expression level of HIF-1 ⁇ in cells cultured in the absence of the test compound! And a step of determining that the test compound is a compound that suppresses the onset or progression of FALS, and a method for screening a compound that suppresses the onset or progression of FALS.
  • This screening method is based on the mechanism that NEDL1 expression is regulated downstream of HIF-1. By this screening method, it is possible to obtain a compound that suppresses the onset or progression of FALS, which has a different mechanism of action. Powerful compounds can be applied to FALS treatment 'preventive drugs'
  • the present invention provides a step of measuring the expression level of HIF-1a in nerve cells from which patient power has also been collected, and determines that a patient having a high expression level of HIF-1 ⁇ is suffering from FALS.
  • a FALS diagnostic method is provided. This diagnostic method is based on the mechanism that NEDL1 expression is regulated downstream of HIF-1. It is possible to make a diagnosis of FALS with different criteria.
  • the screening method of the present invention it is possible to obtain a compound that suppresses the onset or progression of FALS, which has a different mechanism of action than before.
  • the FALS diagnosis method of the present invention there is a possibility that FALS can be diagnosed according to a different judgment standard than before, and can be used for the initial stage diagnosis of FALS.
  • FIG. 1 is a graph showing the expression level of NEDL1 mRNA in SK-N-BE (2) C cells cultured under hypoxia (2% oxygen).
  • FIG. 2 is a graph showing the expression level of NEDL1 mRNA in SK-N-BE (2) C cells cultured under various conditions.
  • FIG. 3 is a graph showing the expression level of NEDL1 mRNA in C cells.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of the present invention showing the relationship with HIF-1 and NEDL1.
  • the method for screening a compound that suppresses the onset or progression of FALS of the present invention comprises a step of culturing cells under the respective conditions in the presence and absence of a test compound, and a method for culturing each cultured cell.
  • HIF-1 ⁇ expression level and HIF-1 ⁇ expression level in cells cultured in the presence of the test compound HIF-1a in cells cultured in the absence of the test compound Determining that the test compound is a compound that suppresses the onset or progression of FALS when the amount is less than the expression level.
  • Cells used in the present screening method is not particularly limited constant as long as the cell expresses HIF 1 alpha, for example, SK-N- BE (2) human neuroblastoma C cells.
  • the cells are cultured under the respective conditions in the presence and absence of the test compound.
  • the expression level of HIF-1a in each cultured cell is measured.
  • the expression level of HIF-1a refers to the expression level of HIF-1a mRNA and Z or HIF-1a protein.
  • the expression level of HIF-1 ⁇ can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, mRNA can be measured by Northern blotting, quantitative or semi-quantitative RT-PCR, RNase protection assay, and the like. In addition, protein measurement can be performed by Western blot or the like.
  • the expression level of HIF-1 ⁇ in the cells cultured in the presence of the test compound is the expression level of HIF-1 ⁇ in the cells cultured in the absence of the test compound. If there are fewer, the test compound can be determined to be a compound that suppresses the onset or progression of FALS.
  • the FALS diagnostic method of the present invention comprises a step of measuring the expression level of HIF-la in a neuron collected from patient power, and a patient with a high expression level of HIF-1 ⁇ suffering from FALS. And a step of determining that.
  • Nerve cells are collected from the patient according to methods known to those skilled in the art.
  • the expression level of HIF-1a is measured by the method for measuring the expression level of HIF-la described above, and it is determined whether FALS is present according to the expression level. For example, if the expression level of HIF-1a in a neuron collected from healthy subjects is the reference value and the expression level of the patient's HIF-1a exceeds the reference value by a predetermined multiple, the patient is treated with FALS. It can be determined that there is.
  • HIF-1a cDNA (GenBank accession number: NM-001530) cloned in pBluescript KS (-) was obtained from Dr. Gassmann. HIF-la cDNA was excised from this plasmid using EcoRV and Notl, electrophoresed on an agarose gel, and then purified using Gel Extraction Kit (Qiagen). This was subcloned into the EcoRV / Notl site of pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) to produce plasmid pcDNA 3ZHIF-1 ⁇ .
  • HIF-1aP4 2A / P5 64A in which the 402th and 564th prolines ( ⁇ ) were converted to alanine ( ⁇ ) was prepared by the following method. First, using Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) and primers for mutagenesis 5'- CTTGGAGATGTTAGCTG CCTATATCCCAATGGATGA-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5' -TCATCCATTGGGATATA GGCAGCTAACATCTCCAAG-3 '(SEQ ID NO: 2) According to the manufacturer's instructions, pcDNA3 / HIF-la P564A was prepared by converting pcDNA3 / HIF-1a 564th proline to alanine.
  • Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) and primers for mutagenesis 5'- CTTGGAGATGTTAGCTG CCTATATCCCAATGGATGA-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5' -T
  • pcDNA3 / HIF-1 ⁇ ⁇ 4 ° 2 ⁇ / ⁇ 564 ⁇ which was obtained by converting the 402nd plin of pcDNA3 / HIF- 1a P564A to alanine, was used as a mutagenesis primer 5'-CTTTGCTGGCCGCAGCCGCTGGAG-3 '(SEQ ID NO: 3) and 5′-CTCCAGC GGCTGCGGCCAGCAAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 4) were used in the same manner.
  • DFO Sigma treatment was performed by exposing the cells to 250 M DFO for 24 hours.
  • the gene was introduced into the cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the following procedure.
  • Cells were seeded in a 6 cm-diameter culture dish (# 3002; Falcon) at a density of about 70% at the time of gene introduction, and cultured at 37 ° C. 4 ⁇ L of Lipofe ctamine 2000 was placed in 100 L of Opti-MEM medium (Invitrogen) in a polystyrene tube (# 2058; Falcon) and allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • Opti-MEM medium Invitrogen
  • zg plasmid DNA pcDNA3.1, pcDNA3 / HIF-1a or pcDNA3 / HIF-1a P402A / P564A ) dissolved in 100 L of Opti-MEM medium, and 15 minutes at room temperature. The mixture was allowed to stand to form a DNA-ribosome complex. The cell culture medium was replaced with 3 mL of Opti-MEM medium, and the DNA-ribosome complex was added to the whole culture dish. After incubation at 37 ° C for 5 hours, 0.6 mL of FBS and 2.4 mL of Opti-MEM medium were added. On the next day, replace the medium with DMEM medium containing 10% FBS and grow for another 48 hours.
  • RNA was prepared from untreated, hypoxia treated, DFO treated cells and transgenic cells using TRIZOL reagent (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. RT-PCR was performed according to the following procedure. The prepared total RNA (1 ⁇ g / 2. 5 L) was incubated at 75 ° C. for 5 minutes, and then allowed to stand on ice for 5 minutes.
  • RNA was added to the solution, and incubated at room temperature for 10 minutes, at 37 ° C for 45 minutes, and at 95 ° C for 3 minutes to prepare cDNA.
  • cDNA Make the cDNA as a cage and use the following PCR conditions and primers to CDNA fragments of EDL1 and ⁇ -actin genes were amplified. 1 ⁇ L cDNA, 2 5 X buffer, 0.5 L dNTPs (2 mM each), 0.05 L GoTaq DNA polymerase (5 units ZmL; Promega) and 0.5 ⁇ L each sense and anti Sense primer (10 ⁇ ) was mixed and water was added to make a total volume of 10 ⁇ L. PCR was performed using GeneAmp PCT System 9700 (Applied Biosystems).
  • PCR conditions are as follows: first heat denaturation at 95 ° C for 2 minutes, then heat denaturation (95 ° C, 15 seconds), annealing (60 ° C, 15 seconds) and extension (72 ° C, 20 seconds) This cycle was repeated 32 to 35 times, incubated at 72 ° C for 6 minutes, and then cooled to 10 ° C.
  • the base sequences of the primers used are as follows.
  • NEDL1 Sense primer 5'- CCAGGGAACCAAAGCATAGA-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • Antisense primer 5'- GTGGATGCGGATGTAGTGCG-3' (SEQ ID NO: 6)
  • ⁇ -actin sense primer 5 TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCT A-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • Antisense primer 5 CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • the amplified PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel containing ethidium bumumid and the DNA band was observed in a UV illuminator.
  • RNA was prepared from SK-N-BE (2) C cells cultured at 0, 3, 6, 12 and 24 hours under 2% oxygen concentration, and the expression of NEDLl mRNA was semi-quantified.
  • NEDLl mRNA expression increased in response to hypoxia (Fig. 1).
  • NEDLl mRNA expression was also increased by treatment with 1% oxygen and DFO treatment (Fig. 2).
  • NEDLl mRNA In order to examine whether the increased expression of NEDLl mRNA is mediated by HIF-1, it is a vector that expresses wild-type or constitutively activated HIF-1a in cells pcDNA3Z HIF1-- or pcDNA3 / the HIFl- ⁇ ⁇ 402 ⁇ / ⁇ 564 ⁇ after the introduction gene NEDL1 heritage The expression of the gene was examined. As a result, in the cells into which pcDNA3 / HIFl- P4 ° 2A / P564A was introduced, a clear increase in NEDLl mRNA expression was observed (FIG. 3). The force that was not observed to be upregulated in the cells into which pcDNA3 / HIF-1 was introduced was considered to be due to the degradation of wild-type HI F-la.
  • the screening method of the present invention it is possible to obtain a compound that suppresses the onset or progression of FALS, which has a different mechanism of action.
  • the FALS diagnosis method of the present invention there is a possibility that FALS can be diagnosed according to a different judgment standard than before, and can be used for the initial stage diagnosis of FALS.

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Abstract

　以下の工程を備えるスクリーニング方法： 被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件において細胞を培養する工程； 培養したそれぞれの細胞における、ＨＩＦ－１αの発現量を測定する工程；及び 被検化合物の存在下において培養した細胞におけるＨＩＦ－１αの発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるＨＩＦ－１αの発現量よりも少ない場合に、当該被検化合物を家族性筋萎縮性側索硬化症の発症又は進行を抑える化合物であると判定する工程。

Description

明 細 書
家族性筋萎縮性側索硬化症の発症又は進行を抑える化合物のスクリー ニング方法、及び家族性筋萎縮性側索硬化症の診断方法
技術分野
[0001] 本発明は、家族性筋萎縮性側索硬化症の発症又は進行を抑える化合物のスクリー ユング方法に関する。また、本発明は、家族性筋萎縮性側索硬化症の診断方法に 関する。
背景技術
[0002] 筋萎縮'性側索硬ィ匕症 (ALS ; Amyotrophic Lateral Sclerosis)はネ申経難病の一つで あり、脊髄の運動ニューロンの脱落により発症後数年で歩行困難となり、最後には死 に至る悲惨な疾患である。 ALSの原因はいまだ不明であり、予防 '治療法もないのが 現状である。 1993年にポジショナルクローニングにより、常染色体優性遺伝の家族 性 ALS (FALS ; Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis)の約 20%がスーパーォキ シドジスムターゼー 1 (SOD— 1)の変異で発症することが報告された (非特許文献 1) 。 SOD— 1は細胞質で活性酸素腫 (ROS ; Reactive Oxygen Species)から過酸化水 素への反応を触媒する酵素である。し力し、 FALSにおいて、 SOD— 1活性レベルと 病状との間に相関が見出されないことから (非特許文献 2)、変異 SOD— 1の示す tox ic-gain-of-fonctionが FALSの原因であろうと考えられ、原因解明が大きな注目を集 めている。
[0003] FALSにおいて SOD— 1活性レベルと病状との間に相関が認められないが、運動 ニューロンにおいては、酸化還元系の以上のために ROSが過剰に産生されており、 これが FALSの発症に深く関与して 、ることを示す報告がなされて 、る（非特許文献 3、 4)。また、 ROSの発生を抑制する抗酸化剤が ALSの発症を遅延させる可能性も 指摘されて!ヽる (非特許文献 5、 6)。
[0004] FALSモデルマウスの脊髄中には、炎症性サイト力インである腫瘍壊死因子 α (Τ NF a )やインターロイキン 1 (IL1)が発症前に多く含まれて!/、ることが報告されており 、運動-ユーロンの細胞死に炎症反応が関与していることが示唆されている（非特許 文献 7、 8)。
[0005] 最近、変異 SOD— 1と結合し、ュビキチン化する HECT型 E3リガーゼとして NED L1が発見された (非特許文献 9)。 NEDL1は変異 SOD— 1をュビキチンィ匕しプロテ ァソームにおける分解を促進する力 野生型 SOD— 1をュビキチン化しない。また、 数種の異なる変異 SOD— 1により発症した FALSの重症度と、各々の変異 SOD— 1 と NEDL1との結合の程度とが、正の相関を示した。以前から、変異 SOD— 1は粗面 小胞体上の親水'性チヤネノレ (translocon)の成分の一つである translocon- associated protein- δ (TRAP - δ )と結合することが知られていた力 NEDL1も TRAP— δと 結合する。一方、 NEDL1は Wntシグナル伝達系の鍵分子である Dishevelled-1 (DV L1)とも結合し、ュビキチンィ匕することが明らかになった。これらの結果から、 NEDL1 は変異 SOD、 TRAP - δ、 Dvllとュビキチン化複合体を形成し、この複合体が有 する毒性のために運動-ユーロンが死に至るのではな 、かと推測されて 、る。
[0006] 一方、細胞が低酸素条件に曝露されると、低酸素応答シグナル伝達経路の鍵分子 である hypoxia- inducible factor- 1 (HIF— 1)が誘導されることが知られている（非特許 文献 10) HIF—1は、 HIF - l aと HIF1— β /ARNT (aryl hydrocarbon receptor n uclear translocator)の 2つのサブユニットで構成され、両サブユニットともに PASドメ インを有する basic helix-loop-helix (bHLH)型転写因子サブファミリーに属する（非 特許文献 11)。 HIF— 1 α分子中には 2ケ所の転写活性ィ匕領域が存在する。 HIF— 1 aは、 mRNAレベルでは常に発現している力 タンパク質は合成されるとすぐに分 解されるため、通常は検出限界以下である。これに対して、 HIF - l iSは恒常的に発 現している。 HIF— 1 αの分解には、 HIF prolyl hydroxylase (PDH)が関与している。 現在までに 4つの PDH (PDH1〜4)が発見されている。 PDHは HIF— 1 αタンパク 質中の 402番目と 564番目のプロリン残基を水酸化する。プロリン残基が水酸化され た HIF— 1 aは、 von Hippel Lindauタンパク質（pVHL)、 elongin B、 elongin C、 CUL 及び RBX1からなる E3—ュビキチンリガーゼ複合体によりュビキチン化され、 26Sプ 口テアノームで速やかに分解される。しかし、低酸素下では、酸素分子要求性の PD Hの活性が低下するために HIF— 1 αが分解されなくなり、タンパク質として検出され るようになる。また、 PHDを抑制する作用を有するデスフェリォキサミン (DFO)に細 胞を曝露すると、通常酸素下でも HIF— 1 aが検出されるようになる（非特許文献 12 )。 402番目と 564番目のプロリンをァラニンに変換させた HIF— l a (HIF— 1 α P4 2
A/P564A)は、もはや pDHにより水酸化されなくなるため分解されず、いわゆる構成的 活性化変異体（constitutive active mutant)としての挙動を示す（非特許文献 13)。
[0007] HIF— 1 αの安定ィ匕に ROSが関与しているという報告がなされている。低酸素下で は、ミトコンドリアにおける ROSの発生が増加し、これが HIF— 1 αの安定ィ匕に寄与 することが見出された (非特許文献 14)。ミトコンドリア呼吸鎖の阻害剤の中で、 ROS の産生を抑制する阻害剤を細胞に作用させると、 HIF— 1活性が阻害され、逆に RO Sの産生を促進する阻害剤を細胞に作用させると、 HIF- 1活性が通常酸素下でも 増加した (非特許文献 14)。また、ミトコンドリア DNA欠損細胞では、低酸素下でも Η IF— 1の活性ィ匕は起こらな力つた。さらに、過酸ィ匕水素の産生を増加させる SODを 細胞で過剰発現させると HIF— 1が活性ィ匕された。これらの結果は、 HIF— 1 αの安 定化に ROSが関与して!/、ることを示して!/、る。
[0008] HIF- l aはいくつかの増殖因子（例えばインスリン、インスリン様増殖因子 1及び 2 、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子 2、血小板由来増殖因子、トランスフォ 一ミング増殖因子 /3 1など)及び炎症性サイト力イン (例えば、 IL1、 TNF aなど)など により、通常酸素下においても発現が誘導される（非特許文献 11、 15)。
[0009] これまでに、 HIF—1により転写が活性ィ匕される遺伝子が数多く見出されている。例 えば、血管新生を促進する血管内皮増殖因子、赤血球産生を促進するエリスロポェ チン、エネルギー代謝に関与する解糖系酵素（乳酸デヒドロゲナーゼゃアルドラーゼ Aなど）やグルコーストランスポーター 1、アポトーシスを促進する BNIP3などの遺伝 子の転写が活性ィ匕される。これらの多くの遺伝子の中に、 HIF—1結合配列 5'-(A/G )CGTG-3'が存在することが報告されて 、る（非特許文献 11)。
[0010] 上記のように、 FALSの発症には、変異 SODl、 NEDL1、 ROS及び炎症性サイト 力イン (IL1や TNF o;など）が密接に関与していることが考えられる。しかし、 FALSの 発症には、これらの分子それぞれ単独では不十分であると考えられ、これらの物質を 機能的に結びつける何らかの分子が存在することが予想される。
[0011] 非特許文献 1： Rosen DR et al. Nature 364:59— 62, 1993 非特許文献 2 : Wong PC et al. Neuron 14:1105—1116, 1995
非特許文献 3 : Liu D et al" FASEB J. 13: 2318-2328, 1999
非特許文献 4 : Said Ahmed M et al., J Neurol Sci. 176: 88-94, 2000
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非特許文献 10 : Wang GL and Semenza GL. J. Biol Chem. 268: 21513—21518, 1993 非特許文献 11 : Zagorska A and Dulak J. Acta Biochim. Pol. 51: 563-585, 2004 非特許文献 12 : Wang GL and Semenza GL.Blood 82: 3610-3615, 1993
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発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] NEDL1の発現を制御する経路を見出すことができれば、 FALSの治療.予防薬の 開発につながる可能性がある。したがって、本発明の目的の一つは、 NEDL1の発 現を制御する経路を見出すことである。また、本発明の別の目的は、 FALSの発症 又は進行を抑える化合物のスクリーニング方法を提供することである。さらに、本発明 の別の目的は、 FALSの診断方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明者らは、ヒト神経芽腫における HIF— 1の標的遺伝子を探索する目的で、低 酸素で発現の変化する遺伝子を DNAチップ (神経芽腫由来の約 11 , 000個の遺伝 子を搭載)を用いて検討したところ、驚 ヽたことに NEDL1遺伝子の発現が増加する ことを見出した。さらに RT—PCR法などを用いた実験結果から、 NEDL1の発現が HIF—1の下流で制御されていることを見出した。そして、以上の知見から、本発明 者らは本発明を完成するに至った。
[0014] すなわち、本発明は、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件にお いて細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞における、 HIF— 1 αの発現 量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞における HIF— 1 αの発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞における HIF—l α の発現量よりも少な!/ヽ場合に、当該被検化合物を FALSの発症又は進行を抑える化 合物であると判定する工程と、を備える FALSの発症又は進行を抑える化合物のスク リーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、 NEDL1の発現が HIF— 1の 下流で制御されているというメカニズムに基づくものである。このスクリーニング方法に より、今までとは作用機序が異なる FALSの発症又は進行を抑える化合物を得ること が可能である。力かる化合物は、 FALSの治療 '予防薬に応用することが可能である
[0015] また、本発明は、患者力も採取した神経細胞における、 HIF- 1 aの発現量を測定 する工程と、 HIF— 1 αの発現量が多い患者を FALSに罹患していると判定するェ 程と、を備える FALSの診断方法を提供する。この診断方法は、 NEDL1の発現が H IF— 1の下流で制御されているというメカニズムに基づくものである。今までとは異な る判断基準で FALSの診断を下すことが可能である。
発明の効果
[0016] 本発明のスクリーニング方法によれば、今までとは作用機序が異なる FALSの発症 又は進行を抑える化合物を得ることが可能である。また、本発明の FALSの診断方 法によれば、今までとは異なる判断基準により FALSの診断を下せ、 FALSの初期 段階の診断に利用できる可能性がある。
図面の簡単な説明
[0017] [図 1]低酸素下（2%酸素）で培養した SK— N— BE (2) C細胞における NEDL1 m RNAの発現量を表す図である。
[図 2]様々な条件下で培養した SK— N— BE (2) C細胞における NEDL1 mRNA の発現量を表す図である。
[図 3]野生型及び構成的活性ィ匕型の HIF— 1 αを発現させたときの SK—N— BE (2 ) C細胞における NEDL1 mRNAの発現量を表す図である。
[図 4]HIF— 1及び NEDL1との関係を表す、本発明の概略図である。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
[0019] (FALSの発症又は進行を抑える化合物のスクリーニング方法）
本発明の FALSの発症又は進行を抑える化合物のスクリーニング方法は、被検化 合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件にぉ 、て細胞を培養する工程と、培 養したそれぞれの細胞における、 HIF— 1 αの発現量を測定する工程と、被検化合 物の存在下において培養した細胞における HIF—1 αの発現量力 被検化合物の 非存在下において培養した細胞における HIF— 1 aの発現量よりも少ない場合に、 当該被検化合物を FALSの発症又は進行を抑える化合物であると判定する工程と、 を備える。
[0020] 本スクリーニング方法に用いる細胞は、 HIF— 1 αを発現する細胞であれば特に限 定されず、例えば、ヒト神経芽腫の SK—N— BE (2) C細胞が挙げられる。この細胞 を被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で培養する。
[0021] 次に、培養したそれぞれの細胞における HIF— 1 aの発現量を測定する。ここで、 HIF- 1 aの発現量とは、 HIF- 1 a mRNA及び Z又は HIF— 1 a タンパク質の 発現量を指す。 HIF— 1 αの発現量の測定は、当業者にとって公知の方法で行うこと ができる。例えば、 mRNAの測定は、ノーザンブロッテイング、定量的又は半定量的 RT— PCR、 RNaseプロテクションアツセィなどで行うことができる。また、タンパク質 の測定は、ウェスタンブロットなどで行うことができる。
[0022] 測定の結果、被検化合物の存在下にお 、て培養した細胞における HIF— 1 αの発 現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞における HIF—1 αの発現 量よりも少な ヽ場合に、当該被検化合物を FALSの発症又は進行を抑える化合物で あると判定できる。
[0023] (FALSの診断方法）
本発明の FALSの診断方法は、患者力も採取した神経細胞における、 HIF- l a の発現量を測定する工程と、 HIF— 1 αの発現量が多い患者を FALSに罹患してい ると判定する工程と、を備える。
[0024] 当業者にとって公知の方法に従い、患者から神経細胞を採取する。次に、上述の HIF- l aの発現量の測定方法により、 HIF- 1 aの発現量を測定し、発現量に応じ て FALSか否かを判定する。例えば、健常者力 採取した神経細胞における HIF— 1 aの発現量を基準値として、患者の HIF— 1 aの発現量が基準値の所定倍数上回 つて 、る場合に、その患者を FALSであると判定できる。
実施例
[0025] 以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施 例に限定されるものではない。
[0026] (HIF- 1 a発現ベクターの作製）
pBluescript KS (-)にクロー-ングされたヒト HIF— 1 a cDNA (GenBank受 入番号： NM— 001530)は、 Gassmann博士から入手した。このプラスミドから HIF - l a cDNAを EcoRVと Notlを用いて切り出し、ァガロースゲルで電気泳動した 後、 Gel Extraction Kit (キアゲン社）を用いて精製した。これを pcDNA3. 1 ( + ) (インビトロジェン社）の EcoRV/Notl部位にサブクローユングし、プラスミド pcDNA 3ZHIF— 1 αを作製した。
[0027] 402番目及び 564番目のプロリン（Ρ)をァラニン (Α)に変換した HIF— 1 a P4 2A/P5 64Aを以下の方法で作製した。まず、 Quick Change Site - Directed Mutagen esis Kit (ストラタジーン社）と変異導入用プライマー 5'- CTTGGAGATGTTAGCTG CCTATATCCCAATGGATGA- 3' (配列番号 1)及び 5 '-TCATCCATTGGGATATA GGCAGCTAACATCTCCAAG- 3' (配列番号 2)を用いて、製造業者の使用説明書 に従って pcDNA3/HIF— 1 aの 564番目のプロリンをァラニンに変換した pcDNA 3/HIF- l a P564Aを作製した。次に、 pcDNA3/HIF- 1 a P564Aの 402番目のプ 口リンをァラニンに変換した PCDNA3/HIF— 1 α Ρ4°2Α/Ρ564Αを、変異導入用プライ マー 5'- CTTTGCTGGCCGCAGCCGCTGGAG- 3' (配列番号 3)及び 5'- CTCCAGC GGCTGCGGCCAGCAAAG-3 ' (配列番号 4)を用いて同様の方法で作製した。
[0028] (細胞培養）
ヒト神経芽腫 SK— N— BE (2) C細胞は、 10%熱処理済みゥシ胎児血清 (FBS)を 含むダルベッコ最小必須培地 (DMEM)中で培養した。低酸素下培養は、細胞をナ プコ自動 O ZCO細胞培養装置 (和研薬株式会社）中に入れ、 2%酸素濃度下で
2 2
行った。 DFO (シグマ社）処理は、細胞を 250 Mの DFOに 24時間さらすことにより 行った。
[0029] (遺伝子導入）
細胞への遺伝子導入は、 Lipofectamine2000 (インビトロジェン社）を用いて、以 下の手順で行った。遺伝子導入時に約 70%の密度になるように細胞を直径 6cmの 培養シャーレ ( # 3002 ;ファルコン社）に播き、 37°Cでー晚培養した。 4 μ Lの Lipofe ctamine2000をポリスチレンチューブ（ # 2058；ファルコン社）中の 100 Lの Opti — MEM培地 (インビトロジェン社）にカロえ、室温で 5分静置した。これに、 100 Lの Opti— MEM培地に溶解した 2. 5 ;z gのプラスミド DNA (pcDNA3. 1、 pcDNA3 /HIF- 1 a又は pcDNA3/HIF— 1 a P402A/P564A)を加え、室温で 15分間静置し 、 DNA—リボソーム複合体を形成させた。細胞の培地を 3mLの Opti— MEM培地 に交換し、そこに DNA—リボソーム複合体を培養シャーレ全面にいきわたるように添 カロした。 37°Cで 5時間培養した後、 0. 6mLの FBSと 2. 4mLの Opti— MEM培地を 添カロした。翌日に、培地を 10%FBSを含む DMEM培地に交換し、さらに 48時間培 し 7こ。
[0030] (逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT— PCR) )
TRIZOL試薬 (インビトロジェン社)を用いて、製造業者の使用説明書に従って、未 処理、低酸素処理、 DFO処理した細胞及び遺伝子導入細胞から全 RNAを調製した 。 RT—PCRは以下の手順で行った。調製した全 RNA (1 μ g/2. 5 L)を 75°Cで 5分間インキュベートし、その後、氷上で 5分間静置した。 0. 5 Lの RNase阻害剤（ 40ユニット Z L ;東洋紡社） 0. 5 μ Lの Μ— MLV逆転写酵素（200ユニット Ζ L ; インビトロジェン社）、 1 Lの 50 X dNTPs (各 2mM)、 0. 5 Lのオリゴ（dT)プライ マー（0. 5mgZmL ;インビトロジェン社）、 2 /z Lの 5 Xファーストストランド緩衝液 (ィ ンビトロジェン社)及び l ;z Lの 0. 1Mジチオスレィトールの混合液に、用意した RNA を加え、室温で 10分間、 37°Cで 45分間、 95°Cで 3分間インキュベートし、 cDNAを 作製した。作製した cDNAを铸型にして、下記の PCR条件とプライマーを用いて、 N EDL1及び βーァクチン遺伝子の cDNA断片を増幅した。 1 μ Lの cDNA、 2 の 5 X緩衝液、 0. 5 Lの dNTPs (各 2mM)、 0. 05 Lの GoTaqDNAポリメラーゼ ( 5ユニット ZmL；プロメガ社）及び 0. 5 μ Lずつのセンス及びアンチセンスプライマー ( 10 Μ)を混合し、水をカ卩えて全量を 10 μ Lにした。 PCRは GeneAmp PCT Sy stem 9700 (アプライドバイオシステムズ社）を用いて行った。 PCRの条件は、まず 、 95°Cで 2分間熱変性を行った後、熱変性（95°C、 15秒）、アニーリング（60°C、 15 秒）及び伸長（72°C、 20秒）のサイクルを 32〜35回行い、 72°Cで 6分間インキュべ ートした後、 10°Cに冷却した。用いたプライマーの塩基配列は次の通りである。
NEDL1 センスプライマー： 5'- CCAGGGAACCAAAGCATAGA- 3' (配列番号 5) アンチセンスプライマー： 5'- GTGGATGCGGATGTAGTGCG- 3' (配列番号 6) β ーァクチン センスプライマー： 5し TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCT A-3' (配列番号 7)
アンチセンスプライマー： 5し CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG -3' (配列番号 8)
増幅した PCR産物を、ェチジゥムブ口ミドを含む 1 %ァガロースゲルで電気泳動した 後、 UVイルミネーター中で DNAバンドを観察した。
[0031] (実施例 1)
正常酸素下及び低酸素下（2%酸素）で 24時間培養した SK— Ν— BE (2) C細胞 カゝら調製した全 RNAを用いて、発現の変化して ヽる遺伝子を DNAチップを用いて 解析したところ、 NEDL1遺伝子の発現が増加して 、た (データは示さな!/、)。
[0032] 次に、 2%酸素濃度下で、 0、 3、 6、 12及び 24時間培養した SK— N— BE (2) C細 胞から全 RNAを調製し、 NEDLl mRNAの発現を半定量 RT— PCRを用いて検 討したところ、低酸素に応答して NEDLl mRNAの発現が増加することが確認され た（図 1)。また、 1 %酸素の条件や DFO処理によっても、 NEDLl mRNAの発現が 増加した（図 2)。
[0033] NEDLl mRNAの発現亢進が HIF— 1を介するものかどうかを検討するため、細 胞に野生型又は構成的活性化型 HIF— 1 aを発現するベクターである pcDNA3Z HIF1—ひ又は pcDNA3/HIFl— α Ρ402Α/Ρ564Αを遺伝子導入した後に NEDL1遺 伝子の発現を調べた。その結果、 pcDNA3/HIFl - ひ P4°2A/P564Aを導入した細胞 において、明らかな NEDLl mRNAの発現亢進が認められた（図 3)。 pcDNA3/ HIF—1ひを導入した細胞では発現亢進が認められな力つた力 これは、野生型 HI F- l aが分解されるためだと考えられる。
産業上の利用可能性
本発明のスクリーニング方法によれば、今までとは作用機序が異なる FALSの発症 又は進行を抑える化合物を得ることが可能である。また、本発明の FALSの診断方 法によれば、今までとは異なる判断基準により FALSの診断を下せ、 FALSの初期 段階の診断に利用できる可能性がある。

Claims

請求の範囲
[1] 被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件にぉ ヽて細胞を培養するェ 程と、
培養したそれぞれの細胞における、 HIF- 1 aの発現量を測定する工程と、 被検化合物の存在下において培養した細胞における HIF— 1 αの発現量力 被検 化合物の非存在下において培養した細胞における HIF— 1 aの発現量よりも少ない 場合に、当該被検化合物を家族性筋萎縮性側索硬化症の発症又は進行を抑える化 合物であると判定する工程と、
を備える、家族性筋萎縮性側索硬化症の発症又は進行を抑える化合物のスクリー二 ング方法。
[2] 患者力も採取した神経細胞における、 HIF- l aの発現量を測定する工程と、
HIF- l aの発現量が多 、患者を家族性筋萎縮性側索硬化症に罹患して!/、ると 判定する工程と、
を備える、家族性筋萎縮性側索硬化症の診断方法。
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