WO2007018049A1 - 高リスク群ヒトパピローマウイルスの中和抗体を誘導する抗原 - Google Patents
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- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Definitions
- Antigens that induce neutralizing antibodies of high-risk group human papillomaviruses
- the present invention relates to an antigen that induces a neutralizing antibody of a high-risk group human papillomavirus.
- the present invention relates to a chimeric protein obtained by inserting a human papillomavirus L2 epitope into a human papillomavirus (HPV) type 16 L1 protein, and a capsid which is an assembly of the chimeric protein.
- HPV human papillomavirus
- the capsid of papillomavirus is an icosahedral particle composed of 360 L1 proteins and 12 L2 proteins.
- viruses with humans, lions, deer, magpies, etc. as the host have been found and infect the mucous membranes to form proliferative lesions.
- inactivated virus particles particles formed only by L1 protein (L1-capsid), particles formed by L1 protein and L2 protein (L1 / L2-capsid), in E. coli It has been shown that immunization using one of the L2 proteins produced as a vaccine antigen can protect against infection.
- Human papillomavirus has more than 80 genotypes.
- types that infect the mucous membrane at least 12 types (high risk types: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 68) It is known to cause cervical cancer.
- high risk types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 68
- cervical cancer Despite efforts to detect cervical cancer early through mass screening in Japan, 15,000 cases and 2500 deaths are reported annually.
- some penile cancer, vulvar cancer, tongue cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, and esophageal cancer are also thought to be caused by HPV infection! /. WHO estimates that 11% (450,000) of malignancies in women worldwide are affected by HPV infection and that there are 300 million HPV carriers.
- HPV particles have a structure of icosahedral capsid composed of 72 L1 protein pentamers and 12 molecules of L2 protein that wraps around the DNA genome! (Fig. 1). Capsid-like structures (L1-capsids) can be obtained when recombinant DNA technology is applied to express only L1 protein in large quantities. If L2 protein is also expressed at the same time, capsid (L1 / L L2-capsid) is formed. L1-capsid has been shown to be highly immunogenic and induces both antibody production and cellular immunity without adjuvant when inoculated into animals. This immunogenicity is specific to the HPV type, and type 16 L1-capsid immunization results in a type 16 specific response.
- HPV L 1 / L2-capsid Since there is no cultured cell line that allows HPV growth, HPV L 1 / L2-capsid has been devised with an infectious pseudovirus that incorporates an expression plasmid for a marker gene into HPV. Yes. HPV neutralizing antibodies have been measured by inhibiting infection with this infectious pseudovirus.
- Non-Patent Document 1 Koutsky et al .: A controlled trial of a human papillomavirus type 16 vaccine.N Eng J Med, 347 (21), 1645-1651, 2002 (Non-Patent Document 2) ))
- This first generation vaccine antigen has a very high type specificity, for example, type 16 L1-capsidactin can only prevent type 16 infection. Therefore, it is desired to develop a vaccine antigen that induces a common high-risk type neutralizing antibody.
- the inventors of the present invention have previously studied a mouse (BALB / c) monoclonal antibody (MAb5, 13) that recognizes an epitope (L2-epitope) in the amino acid 108-120 region of HPV16 type L2 protein, and Antisera obtained by immunizing BALB / c with a synthetic peptide having the same sequence as the amino acid 108-120 region of HPV16 type L2 protein shows that it inhibits infections of 6, 11 and 6 types as well as type 16. (Kawana. K, et al .: ommon neutralization epitope in minor capsid protein L2 of human papillomavirus types 16 and 6. J. Virology., 73, 6188-6190, 1999 (Non-Patent Document 3)).
- the present inventors connect the amino acid 108-126 region of the HPV16 type L2 protein to the fluorescent protein and add it to the cell culture medium at 4 ° C. It was found that when heated to C (Kawana. Y, et al .: Human papillomavir us type 16 minor capsid protein 12 N— terminal region containing a common neutralization epitope binds to the cell surface and enters the cytoplasm J. Virology., 75, 23 31-2336, 2001 (see Non-Patent Document 5)).
- HPV capsid is an icosahedral structure consisting of 72 L1 protein pentamers (capsomer)
- L1-capsid has a structure with 12 L2 proteins inserted. Part of the L2 molecule appears on the capsid surface and is thought to play an important function in the early stages of infection.
- the present inventors have clarified that a particle is formed even when a short peptide is inserted into three L1 protein sites, and the inserted peptide exists on the particle surface.
- a chimera particle can present 1080 epitopes. The antiserum obtained by immunizing mice with the chimera particles neutralized multiple high-risk HPVs, so file a patent application as a vaccine antigen candidate!
- the present inventors have so far developed a vaccine antigen using a high-risk type common neutralizing epitope in the amino acid 108-120 region of the HPV16 L2 protein.
- the amino acid sequence of this epitope is about 60% and 75% homologous between high-risk L2 proteins, and the induced antibody binds to multiple high-risk HPVs, but compared to HPV16. The binding ability is inferior. Therefore, the appearance of antigens with higher type commonality is desired.
- an object of the present invention is to provide an antigen that can cope with at least all types of high-risk types and has higher type commonality.
- the present invention for solving the above problems is as follows.
- a chimeric protein in which at least one L2 epitope of human papillomavirus L2 epitopes (hereinafter referred to as 64-81 L2 epitopes) is inserted into the loop site of human papillomavirus (HPV) type 16 L1 protein. Capsid is an aggregate,
- L2 Epitopu group SGTGGRTGYIPLGTRPPT, SGTGGRTGYIPLGGRSNT, SG TGGRTGWPLSTRPST ⁇ SGSGGRTGYVPIGTDPPT, SGTGGRSGYVPLGTTPPT, T GTGGRTGYIPLGGRPNT, SGSGGRTGYVPLGGRSNT, SGSGGRTGYIPLGGGGRP, AGSGGRAGYVPLSTRPPT, TGSGGRAGYVPLGSRPST, SGTGGRTGYVPLGSTPP S or Kiyapushido consisting of an amino acid group having an amino acid sequence represented by SGTGGRTGYIPLGGKPNT,.
- the L2 epitope group is an HPV antigen having an amino acid strength in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence, and having an L2 epitope based on the capsid.
- the capsid according to [1] which also has a group strength of amino acids that imparts the same antigenicity as the sex.
- the loop site for inserting the 64-81 L2 epitope is at least one force between amino acids 56 and 57, amino acids 140 and 141, amino acids 266 and 267, and amino acids 430 and 433. Capsid according to [1] or [2].
- the loop site for inserting the 109-117 L2 epitope is at least one of amino acids 56 and 57, amino acids 140 and 141, amino acids 266 and 267, and amino acids 430 and 433.
- L2 Epitopu group SGTGGRTGYIPLGTRPPT, SGTGGRTGYIPLGGRSNT, SG TGGRTGWPLSTRPST ⁇ SGSGGRTGYVPIGTDPPT, SGTGGRSGYVPLGTTPPT, T GTGGRTGYIPLGGRPNT, SGSGGRTGYVPLGGRSNT, SGSGGRTGYIPLGGGGRP, AGSGGRAGYVPLSTRPPT, TGSGGRAGYVPLGSRPST, SGTGGRTGYVPLGSTPP S, or chimeric protein comprising the amino acid group having an amino acid sequence represented by SGTGGRTGYIPLGGKPNT.
- the L2 epitope group is an HPV having an L2 epitope in a capsid that also has an amino acid strength in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence and that also constitutes the chimeric protein strength.
- the chimeric protein according to [7] which also has an amino acid group power that imparts antigenicity similar to that of.
- the loop site that inserts the 64-81L2 epitope is at least one of the strongest positions between amino acids 56 and 57, between amino acids 140 and 141, between amino acids 266 and 267, and between amino acids 430 and 433.
- the chimeric protein according to [7] or [8].
- At least one L2 epitope (hereinafter referred to as 109-117 L2 epitopes) of the L2 epitope group consisting of amino acid groups having the amino acid sequence represented by VEETSFIDA, VEESGIVDV, IEETTFIES, IEESSFIDA, IEDSSWTS ⁇ or IE ESAIINA Inserted [7 The chimeric protein according to any one of [9] to [9].
- the loop site for inserting the 109-117 L2 epitope is at least one of amino acids 56 and 57, amino acids 140 and 141, amino acids 266 and 267, and amino acids 430 and 433.
- Keyhole limpet hemocyanin and human papillomavirus L2 epitope (hereinafter referred to as 64-81 L2 epitope) complex, which is SGTGGR TGYIPLGTRPPT, SGTGGRTGYIPLGGRSNT, SGTGGRTGYVPLSTRPST, SGSGGRPTGTG , TGTGGRTGYIPLGGRPNT ⁇ SGSGG RTGYVPLGGRSNT, SGSGGRTGYIPLGGGGRP, AGSGGRAGYVPLSTRPPT, TGS GGRAGYVPLGSRPST, SGTGGRTGYVPLGSTPPS, or a complex having an amino acid sequence represented by SGTGGRTGYIPLGGKP NT.
- the present invention in addition to having a strong immunity-inducing activity in the particle structure, it is possible to strongly present HPV L2-epitopes and to provide antigens with higher type commonality. As a result, it is possible to provide an L1-capsid vaccine that can handle at least all high-risk types.
- amino acid 64-81 region and amino acid 131-144 region of HPV16 type L2 protein contain an epitope of infection neutralizing antibody, and the amino acid sequence is extremely well conserved in the high-risk HPV group.
- the best mode for carrying out the invention is capable of simultaneously inhibiting infection of high-risk HPV groups by crossing neutralizing activity
- the L1-capsid of the present invention is a loop of human papillomavirus (HPV) type 16 L1 protein. It is a capsid that is an assembly of chimeric proteins in which at least one L2 epitope (64-81 L2 epitopes) of the human papillomavirus L2 epitope group is inserted at the site.
- HPV human papillomavirus
- HPV particles form 72 icosahedron capsids by collecting 72 capsomers assembled from 5 L1 proteins.
- L1 protein When L1 protein is highly expressed in cells, L1 proteins gather in the nucleus and form capsids autonomously. Capsid formed only by L1 protein is called L1-capsid or virus-like particle (VLP).
- VLP virus-like particle
- L1 protein and L2 protein are expressed at the same time, 12 L2 proteins are incorporated into L1-capsid to form L1 / L2-capsid (or L1 / L2-VLP).
- L1-capsid and L1 / L2-capsid cannot be distinguished by electron microscopy.
- the L1-capsid of the present invention is a capsid based on an HPV16 type L1-capsid. Since HPV has many genotypes, it is generally written with the type on the display such as HPV16 or HPV58. HPV16 type L1-capsid is described as 16L1-capsid, HPV52 type L1 / L2-capsid is described as 52L1 / L2-capsid.
- the L1-capsid of the present invention is an aggregate of chimeric proteins in which HPV L2 epitopes are inserted into HPV16 type L1 protein.
- the chimeric protein means “a chimeric protein in which at least one L2 epitope of the L2 epitope group of human papillomavirus is inserted into the loop site of human papillomavirus (HP V) type 16 L1 protein”, and the present invention relates to This chimeric protein is also included.
- the L2 epitope inserted into the L1 protein to produce the chimeric protein of the present invention has 18 amino acid strengths in the amino acid 64-81 region of the HPV16 type L2 protein.
- amino acid residues of protein amino acids are also numbered in order, for example, the 50th amino acid is described as amino acid 50.
- HPV52 and 58 type L1 / L2-capsids were used as antigens to examine the cross-reactivity of antibodies.
- HPV infection is 72 hours after infecting 293TT cells by creating a pseudovirus in which the expression plasmid of the secretory alkaline phosphatase gene is incorporated into L1 / L2-capsid.
- the subsequent culture was monitored by alkaline phosphatase activity.
- the neutralization of the infection by the antibody was examined by reducing the alkaline phosphatase activity after mixing the infectious pseudovirus and the antibody and then infecting the cells (Fig. 5).
- Anti-64-81, 107-122, and 131-144 antibodies inhibited infection of cultured cells with HPV type 16 pseudovirus. Among them, the anti-6481 antibody showed the most excellent neutralizing activity.
- the amino acid sequence of the 64-81 region is very well conserved among multiple carcinogenic HPVL2s (homology rate of 75% or higher), and there is a possibility that a common type neutralizing epitope exists here (Fig. 6).
- the anti-641-81 antibody showed neutralizing activity against HPV type 18 as expected (FIG. 7).
- HPV16 pseudovirus was prepared by introducing amino acid substitution mutations into this region, and the infectivity was examined (Fig. 8). Replacing 69th arginine and 72nd Thai mouth sine with alanine significantly reduced the infectivity. Therefore, this region of the L2 protein plays an important role when HPV infects cells, and it is thought that HPV infection is inhibited by the binding of antibodies.
- the amino acid 64-81 region of the HPV16 type L2 protein can be applied as a vaccine antigen for preventing infection of a high-risk type HPV group.
- the L2 epitope (64-81 L2 epitope) group in the amino acid 64-81 region of HPV16 type L2 protein is SGTGGRTGYIPLGTRPPT (SEQ ID NO: 2), SGTGGR TGYIPLGGRSNT (SEQ ID NO: 3), SGTGGRTGYVPLSTRPST (SEQ ID NO: 4), SGSGGRTG YVPIGTDPPT (SEQ ID NO: 5), SGTGGRSGYVPLGTTPPT (SEQ ID NO: 6), TGTGGRTGYI PLGGRPNT (SEQ ID NO: 7), SGGRTGYVPLGGRSNT (SEQ ID NO: 8), SG ), AGSGGRAGYVPLSTRPPT (SEQ ID NO: 10), TGSGGRAGYV PLGSRPST (SEQ ID NO: 11), SGTGGRTGYVPLGSTPPS (SEQ ID NO: 12), or SGTGG RTGYIPLGGKP
- SGTGGRTGYIPLGGRSNT (SEQ ID NO: 3) is an HPV group 18 type L2 epitope
- SGTGGRTGYVPLSTRPST (SEQ ID NO: 4) is an HPV group 31 type L2 epitope
- SGSG GRTGYVPIGTDPPT (SEQ ID NO: 5) is an HPV group.
- Type 33 L2 epitope SGTGGRSG YVPLGTTPPT (SEQ ID NO: 6) is HPV group type 35 L2 epitope, TGTGGRTGYIPL GGRPNT (SEQ ID NO: 7) is HPV group type 39 L2 epitope, SGSGGRTGYVPLGGRS NT (SEQ ID NO: 8) Is an HPV group 45-type L2 epitope, SGSGGRTGYIPLGGGGRP (SEQ ID NO: 9) is an HPV group 51-type L2 epitope, AGSGGRAGYVPLSTRPPT (SEQ ID NO: 10) is an HPV group 52-type L2 epitope, and TGSGGRAGYVPLGSRPST (sequence) No.
- HPV group 56 type L2 epitope is the HPV group 56 type L2 epitope
- SGTGGRTGYVPLGSTPPS is the HPV group type 58 L2 epitope
- SGTGGRTGYIPLGGKPNT is the HPV group type 68 L2 epitope.
- the 64-81 L2 epitope group has one or several amino acid strength deletions, substitutions, or additions in the amino acid sequence, that is, the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 2 to 13.
- the capsids of the present invention can also have an amino acid group strength that imparts the same antigenicity as that of HPV having the L2 epitope as a base.
- the 64-81 L2 epitope group has an amino acid strength that is deleted, substituted, or added to one or several amino acid strengths in the amino acid sequence represented by SGTGGRTGYIPLGTRPPT (SEQ ID NO: 2), and
- the capsid of the present invention may include a variant of L2 epitopes having an amino acid sequence that confers HPV16 type antigenicity.
- Such variants include HPV16 / T66A, HPV16 / R69A, HPV16 / Y72A, HPV16 / P74A, HPV16 / R78A, as shown in FIG. And HPV16 / R69A / Y72A. These mutations can be similarly applied to the following HPV type 18 and the like.
- the 64-81 L2 epitope group has one or several amino acid strength deletions, substitutions or additions in the amino acid sequence represented by SGTGGRTGYIPLGGRSNT (SEQ ID NO: 3).
- the capsid of the invention may include a variant of L2 epitopes having an amino acid sequence conferring HPV18 type antigenicity.
- the 64-81 L2 epitope group has an amino acid force in which, in the amino acid sequence represented by SGTGGRTGYVPLSTRPST (SEQ ID NO: 4), several amino acids are deleted, substituted, or added,
- the capsid of the present invention may include a variant of L2 epitopes having an amino acid sequence that confers HPV31 type antigenicity.
- the 64-81 L2 epitope group consists of amino acids in which several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by SGSGGRTGYVPIGTDPPT (SEQ ID NO: 5).
- the capsid of the present invention may include a variant of L2 epitope having an amino acid sequence that confers HPV 33 type antigenicity.
- the 64-81 L2 epitope group has one or several amino acid strength deletions, substitutions or additions in the amino acid sequence represented by SGTGGRSGYVPLGTTPPT (SEQ ID NO: 6).
- the capsid of the invention may include a variant of L2 epitopes having an amino acid sequence conferring HPV35 type antigenicity.
- the 64-81 L2 epitope group has one or several amino acid strength deletions, substitutions or additions in the amino acid sequence represented by TGTGGRTGYIPLGGRPNT (SEQ ID NO: 7).
- the capsid of the invention may include a variant of L2 epitopes having an amino acid sequence conferring HPV39 type antigenicity.
- the 64-81 L2 epitope group has one or several amino acid strength deletions, substitutions, or additions in the amino acid sequence represented by SGSGGRTGYVPLGGRSNT (SEQ ID NO: 8).
- the capsid of the invention may include a variant of L2 epitopes having an amino acid sequence that confers HPV45 type antigenicity.
- the 64-81 L2 epitope group has one or several amino acid strength deletions, substitutions, or additions in the amino acid sequence represented by SGSGGRTGYIPLGGGGRP (SEQ ID NO: 9).
- the L2 epitope mutant having an amino acid strength and having an amino acid sequence imparting HPV51 type antigenicity to the capsid of the present invention can be included.
- the 64-81 L2 epitope group has one or several amino acid strength deletions, substitutions, or additions in the amino acid sequence represented by AGSGGRAGYVPLSTRPPT (SEQ ID NO: 10).
- the capsid of the invention may include a variant of L2 epitopes having an amino acid sequence conferring HPV52 type antigenicity.
- the 64-81 L2 epitope group has one or several amino acid strength deletions, substitutions, or additions in the amino acid sequence represented by TGSGGRAGYVPLGSRPST (SEQ ID NO: 11).
- the capsid of the invention can include a variant of L2 epitopes having an amino acid sequence conferring HPV56 type antigenicity.
- the 64-81 L2 epitope group has one or several amino acid strength deletions, substitutions or additions in the amino acid sequence represented by SGTGGRTGYVPLGSTPPS (SEQ ID NO: 12).
- the capsid of the invention may include a variant of L2 epitopes having an amino acid sequence conferring HPV58 type antigenicity.
- the 64-81 L2 epitope group has one or several amino acid strength deletions, substitutions, or additions in the amino acid sequence represented by SGTGGRTGYIPLGGKPNT (SEQ ID NO: 13).
- the capsid of the invention may include a variant of L2 epitopes having an amino acid sequence conferring HPV68 type antigenicity.
- the L1 protein into which the 64-81 L2 epitope is inserted is a loop site of the L1 protein.
- the loop site of the L1 protein is, for example, the amino acid 52-62, 85-97, 133-152, 171-183, 266-294, 315-325, 346-360, and 426-446 regions of the L1 protein.
- the loop site of the L1 protein into which the 64-81 L2 epitope is inserted is at least between amino acids 56 and 57, between amino acids 140 and 141, between amino acids 266 and 267, and between amino acids 430 and 433. It is preferable that it is a single place.
- the amino acid sequence of HPV16 type L1 protein is shown in SEQ ID NO: 1.
- the present inventors compared the amino acid sequences of HPV16, 18, and 6 L1 proteins side-by-side, and considered that the common part between the types is likely to be related to the structure. Inappropriate. A region with a large difference in amino acid sequence depending on the type was predicted to be not essential for capsid formation itself, and was selected as an insertion candidate region for L2 epitopes.
- L1-small particles small icosahedral particles smaller than capsids formed by the assembly of proteins excluding 10 amino acids of the amino terminal force of HPV16 L1 protein, and neutralization
- L2 epitope it is possible to insert L2 epitope outside L1 protein.
- the regions that can be recognized as one antigen are amino acids 52-62 (BC loop in HPV16 type L1-small particles), 85-97 (CD loop), 133-152 (DE loop), 171-183 (EF loop), It was estimated to be 266-294 (FG loop), 315-325 (GH loop), 346-360 (HI loop), and 426-446 (carboxy terminal) region.
- the cited documents are listed at the end of the examples.
- Site A In the region of amino acids 52-62, a report (cited reference 3) in which a hepatitis B virus epitope was inserted between amino acids 56 and 57 was helpful.
- Amino acid 50 is ferulalanin
- 51 is proline
- 52 is isoleucine and hydrophobic amino acid
- 53 and 54 are lysine
- 56, 57 and 58 are asparagine
- 59 is lysine and almost all hydrophilic amino acids
- 60 becomes hydrophobic with isotocin it was assumed that the L2 epitope inserted between 56 and 57 appeared on the surface, and was selected as the insertion site.
- Site B In the region of amino acids 133-152, a report in which amino acids 140 and 141 were inserted into hepatitis B virus epitope (Cited document 3) was helpful. Since this region contains many hydrophilic amino acid residues, it was assumed that the inserted L2 epitope appeared on the surface. We decided to insert it between amino acids 140 and 141, avoiding the immediate vicinity of the 146th cysteine residue.
- Site C In the amino acid 266-294 region, 267 palin and 269 glutamine coincided with the palin at the amino terminal of the L2 epitope, and the third glutamine, so it was inserted between 266 and 267. Even if it matches the amino acid sequence of the L1 protein, it is easy to form a capsid. is there. At the same time, a report on the insertion of a hepatitis B virus epitope (Cited document 3) was also referenced.
- Site D In the amino acid 426-446 region, 428 cysteine residues were known to be necessary for capsid formation (Reference 4), so 428 was avoided.
- the amino acids 431 and 432 are HP V16, 18 and 6 type L1 proteins, and amino acids are mixed, and insertion of L2 epitopes is considered to have little effect on capsule formation, so it was inserted between amino acids 430 and 433. .
- the chimeric L1 protein (16L1-430VA) inserted with L2 epitopes formed capsids.
- the chimeric L1 protein (16L1-140 / 266 VA) in which L2 epitopes were simultaneously inserted into site 2 and site 3 formed capsids.
- 64-81 L2 epitopes inserted into the L1 protein can be one in one L1 protein, but two or more identical 64-81 L2 epitopes are at different loop sites in one L1 protein. It can also be inserted, or it can be inserted into different loop sites of at least two different types of 64-81 L2 epitobu L1 proteins.
- the capsid of the present invention may further contain an L2 epitope other than the 64-81 L2 epitope.
- L2 epitope other than the 64-81 L2 epitope.
- VEETSFIDA SEQ ID NO: 14
- VEESGIVDV SEQ ID NO: 15
- IEETTFIES SEQ ID NO: 16
- IEESSFIDA SEQ ID NO: 17
- IEDSSWTS SEQ ID NO: 18
- IEESAIINA SEQ ID NO: 19
- a capsid in which at least one L2 epitope (109-117 L2 epitope) in the L2 epitope group having an amino acid sequence is inserted in addition to the 64 -81 L2 epitope is also a capsid of the present invention.
- V EETSFIDA (SEQ ID NO: 14) is a HPV group type 16 L2 epitope, which is particularly preferred.
- VEESGIVDV (SEQ ID NO: 15) is the HPV group type 31 L2 epitope
- IEETTFIES (SEQ ID NO: 16) is the HPV group type 52 L2 epitope
- IEESSFIDA (SEQ ID NO: 17) is the HPV group type 58
- IEDSSWTS SEQ ID NO: 18
- IEESAIINA (SEQ ID NO: 19) is a 6-type and 11-type L2 epitope.
- the 109-117 L2 epitope is similar to the 64-81 L2 epitope in the loop site of the L1 protein.
- the loop site to be inserted is at least one of amino acids 56 and 57, amino acids 140 and 141, amino acids 266 and 267, and amino acids 430 and 433. It can be a place where the force is applied and the 64-81 L2 epitopes are not inserted.
- 109-117 L2 epitopes inserted into the L1 protein can be one in one L1 protein, but two or more identical 109-117 L2 epitopes can be found at different loop sites in one L1 protein. It can also be inserted, or it can be inserted into different loop sites of at least two different types of 109-117 L2 Epitopeca S1 L1 protein. In either case, the L1 protein contains one or more 64-81 L2 epitopes.
- FIG. 9 shows an example of a combination of the 64-81 L2 epitope inserted into the L1 protein and the 109-117 L2 epitope and the insertion position. However, these are merely examples and are not intended to limit the combination of these.
- the L2 peptide (amino acids 64-81 or 109-117) was synthesized by the Fmoc solid-phase method using a 96-column automated peptide synthesizer by a conventional method.
- This peptide is KLH (keyhole limpet hemocyanin) -conjugated for the purpose of antibody production, and a cysteine residue is added to the N-terminus to prevent the peptide region from being masked by KLH. .
- the present invention is a complex of keyhole limpet hemocyanin and human papillomavirus 64-81 L2 epitope, which is SGTGGRTGYIPLGTRPPT (SEQ ID NO: 2), SGTGGRTGYIPLGGRSNT (SEQ ID NO: 3), SGTGGRTGYVPLSTRPST ( SEQ ID NO: 4), SGSGGRTGYVPIGTDPPT (SEQ ID NO: 5), SGTGGRSGYVPLGTTPPT (SEQ ID NO: 6), TGTGGRTGYIPLGGRPNT (SEQ ID NO: 7), SGGRTGYVPLGGRSNT (SEQ ID NO: 8), SGSGGRTGYIPLGGGGRP (SEQ ID NO: 9), SGSGGRTGYIPLGGGGRP (SEQ ID NO: 9) AGSGGRAGYVGRSTRPPT No.
- SGTGGRTGYVPLGSTPPS SEQ ID NO: 12
- a complex having an amino acid sequence represented by SGTGGRTGYIPLGGKPNT SEQ ID NO :.
- Keyhole limpet mosyanin and human papillomavirus L2 epitope can be bound via cysteine.
- SGTGGRTGYIPLGTRPPT SEQ ID NO: 2 is shown in FIG. [0062] (Preparation of LI protein inserted with L2 epitopes (chimeric protein))
- a chimeric L1 gene was prepared and expressed using a baculovirus vector to prepare a chimeric L1 protein and a chimeric capsid.
- the chimeric L1 gene was prepared by PCR. Details are as follows.
- the present invention includes a method for producing a capsid, which comprises forming a capsid by assembling the chimeric protein of the present invention.
- a chimeric L1 gene is produced and expressed using a baculovirus vector to produce a chimeric L1 protein.
- a chimeric capsid (capsid of the present invention) is autonomously formed.
- Expression using a baculovirus vector can be performed by a conventional method, but it is preferable to set conditions from the viewpoint of promoting autonomous formation of a chimeric capsid.
- the antigen used was a chemically synthesized peptide combined with KL H (keyhole limpet hemocyanin).
- KL H keyhole limpet hemocyanin
- Synthetic peptides were used as antigens. Antigen was added to the ELISA plate at 0.5 g / 100 1 / well, and allowed to stand at 4 ° C to bind to the antigen well.
- the antigen solution was removed, washed twice with a washing solution (0.2% Teen20 in PBS), filled with well with the washing solution, and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
- the 16L1, 16L1 / L2, 52L1, 52L1 / L2, 58L1, and 58L1 / L2 genes were expressed in a recombinant baculovirus system.
- a recombinant virus was prepared using the Bac-to-Bac baculovirus expression system (GIBCO-BRL Inc., New York, NY) and expressed in s! 9 cells (night stealing-derived cells).
- the 16L1 (as well as 52L1 and 58L1) gene was cloned into the pFastbacl vector to obtain pFsatbacl / 16Ll.
- 16L1 / L2 (52L1 / L2, 58L1 / L2) was cloned into pFastbac dual vector to obtain pFastbac dual / 16Ll / L2.
- each cFunged pFas tbac Veguta ⁇ DH10BAC Otsuki! 3 ⁇ 4 (jVlax Efficiency competent cell containing baculovirus DNA and helper plasmid, GIBCO BRL) was introduced to prepare Bacmid.
- Bacmid DNA was introduced into sf-9 using Effectene Transfection Reagent (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) to obtain a recombinant baculovirus expressing capsid protein.
- the recombinant baculovirus was infected with sf_9, and the cells were collected 72 hours later. Suspend infected cells in 0.5% NP40 solution, let stand at room temperature for 10 minutes, then centrifuge (9000 rpm, 15 minutes, 4 ° C) for nuclear fractionation (Precipitation) and cytoplasmic fraction. The nuclear fraction was suspended in a 1.28 g / ml salt / cesium-PBS solution, sonicated (Sonifier250, Branson), and then ultracentrifuged with SW50.1 roter (Beckman Coulter Inc., Fulleron, CA). 34000 rpm, 20 hours, 20 ° C). The protein collected at a specific gravity of about 1.28 g / ml in a cesium chloride gradient was collected and dialyzed with 0.5 M NaC ⁇ PBS to obtain a capsid protein solution.
- HPV16L1 protein expression plasmid HPV16L2 protein expression plasmid
- secretory alkaline phosphatase expression plasmid were transfected into 293TT cells using Lipofectamine2000. (Use 18L1 plasmid and 18L2 plasmid for preparation of type 18 infectious pseudovirus.) Cells were collected 72 hours after transfection.
- the collected supernatant is layered on 27%, 33%, 39% optiprep (AXIS-SHIELD PoC AS) solution (diluted with PBS) and ultracentrifuged at 43700 rpm for 3 hours at 16 ° C. did.
- Example 3 the same procedure as in Example 3 was performed, except that instead of the HPV16L2 protein expression plasmid, an L2 mutant HPV16L2 protein expression plasmid introduced with mutations at 64-81 shown in FIG. 6 was used. The results showing the relationship between the L2 mutant type and infectivity are shown in FIG.
- Non-Patent Documents 1 to 5 are as follows. lj Matsumoto. K, et al .: Antibodies to human papillomavirus ID, 18, 58, and D b major capsid proteins among Japanese females. Jpn. J. Cancer Res., 88, 369—375, 1997.
- Particles from chimeric proteins in which amino acids 108-120 of HPV16 L2 protein are inserted into HPV16L1 protein have strong immunogenicity and neutralizing antibody-inducing ability common to high-risk HPV groups (patent pending) ).
- a vaccine antigen capable of inducing a stronger type-common neutralizing antibody can be produced.
- FIG. 1 is a schematic diagram of a chimeric capsid for which a patent application was previously filed.
- FIG. 2 Region of the peptide antibody produced.
- the peptide was combined with KLH to obtain an immunizing antigen.
- FIG. 3 shows the titer (ELISA) of anti-peptide antibodies based on the reactivity of antisera and peptides obtained by immunizing 2 rabbits with each peptide (the results of 1 animal were shown).
- ELISA antigens are peptides only. Serum contained specific antibodies.
- FIG. 4 shows the results of binding (ELISA) of anti-peptide antibodies and HPV capsids based on the reactivity of each peptide antibody to L1- or L1 / L2-capsid.
- ELISA antigens are HPV type 16 L1 / L2-capsid (16L1 / L2), L1-capsid (16L1), etc.
- FIG. 5 Neutralizing activity of each peptide antibody against HPV type 16 (HPV 16 type infectious pseudovirus (0.0 2 1)). Anti-14-27 antibody that does not bind to the surface region of L2 protein and anti-52 type L1 antibody with high type specificity did not show neutralizing activity. Anti-64-81, 107-122 and 131-144 antibodies showed neutralizing activity. [Fig. 6] Comparison of amino acid sequences of L2 (64-81) region. Representative anti-risk HPVL2 protein was shown.
- FIG. 7 Neutralization of HPV18 infectious pseudovirus by anti-6481 antibody. The two doses of pseudovirus used were efficiently neutralized.
- FIG. 8 Infectivity of HPVl type 6 pseudovirus having a mutant with amino acid substitution in L2 (64-81) region.
- FIG. 9 shows an example of the insertion position and the combination of 64-81 L2 epitope inserted into L1 protein and 109-117 L2 epitope.
Abstract
【課題】少なくとも高リスク型のヒトパピローマウイルス（HPV）に対応でき得る抗原であって、なおかつ型共通性がより高いワクチン抗原を提供する。
【解決手段】ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウイルスのL2エピトープ群のうちの少なくとも1つのL2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシド。ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウイルスのL2エピトープ群のうちの少なくとも1つのL2エピトープを挿入したキメラ蛋白質。このキメラ蛋白質を集合させることでキャプシドを形成させることを含むキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドの製造方法。
Description
明 細 書
高リスク群ヒトパピローマウィルスの中和抗体を誘導する抗原
技術分野
[0001] 本発明は、高リスク群ヒトパピローマウィルスの中和抗体を誘導する抗原に関する。
特に本発明は、ヒトパピローマウィルス（HPV) 16型 L1蛋白質に、ヒトパピローマウィル スの L2ェピトープを挿入したキメラ蛋白質及びこのキメラ蛋白質の集合体であるキヤ プシドに関する。
背景技術
[0002] パピローマウィルスのキヤプシドは、 360分子の L1蛋白質と 12分子の L2蛋白質から 構成される正二十面体の粒子である。これまでにヒト、ゥシ、シカ、ゥサギ等を宿主と するウィルスが見つかっており、ヒフゃ粘膜に感染して増殖性の病変を形成する。ゥ シゃゥサギのパピローマウィルスでは、不活化したウィルス粒子や L1蛋白質のみで 形成される粒子 (L1-キヤプシド）、 L1蛋白質と L2蛋白質で形成される粒子 (L1/L2-キ ャプシド）、大腸菌で作った L2蛋白質のいずれかをワクチン抗原とする免疫で、感染 を防御できることが示されて 、る。
[0003] ヒトパピローマウィルスには 80以上の遺伝子型が存在する。粘膜に感染する型 (粘 膜指向性 HPV)のうち、少なくとも 12の型（高リスク型： 16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51 、 52、 56、 58、 68型）が子宮頸癌の原因となることが知られている。我が国では集団検 診で子宮頸癌の早期発見に努めているにもかかわらず、年間 15000人の発症と 2500 人の死亡が報告されている。さらに、陰茎癌、外陰癌、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、食道 癌の一部も HPV感染が原因ではな!/、かと考えられて!/、る。 WHOでは世界の女性の 悪性腫瘍の 11% (45万人）に HPV感染が関わっており 3億人の HPVキャリアーがいる と推定している。
[0004] HPV粒子は、 L1蛋白質の 5量体 (キヤプソメァ） 72個と L2蛋白質 12分子で構成され る正 20面体のキヤプシドが DNAゲノムを包む構造をして!/、る (図 1)。組換え DNA技術 を応用して L1蛋白質のみを大量に発現させるとキヤプシド様の構造 (L1-キヤプシド） ができる。 L2蛋白質も同時に発現させればウィルス粒子と組成の同じキヤプシド (L1/
L2-キヤプシド）が形成される。 L1-キヤプシドは、強い免疫原性を持ち、動物に接種 するとアジュバント無しに抗体産生と細胞性免疫の両者を誘導することが示されてい る。この免疫原性は HPVの型に特異的で、 16型の L1-キヤプシドの免疫では 16型に 特異的な反応が起こる。
[0005] HPVの増殖を許す培養細胞系が無いため、 HPVの感染をモニターするには HPVの L 1/L2-キヤプシドにマーカー遺伝子の発現プラスミド等を組み込んだ感染性偽ウィル スが工夫されている。 HPVの感染中和抗体は、この感染性偽ウィルスの感染阻害で 測定されている。
[0006] 動物パピローマウィルスがワクチンで感染予防できることから、 HPV感染もワクチン によって防ぐことができると期待されている。 HPV6、 11, 16型及び 18型の L1-キヤプシ ドを抗原とするワクチンが米国で開発され、臨床試験が行われている。 (Luisa Vilola e t al.: Prophylactic quadrivalent human papillomavirus types 6, 11, 1り, and 18) LI vir us-like particle vaccine in young women: a randomised douole— blind placebo-control led multicentre phase II efficacy trial. Lanset Oncology6, 271-278, 2005 (非特許文 献 1)、 Koutsky et al.: A controlled trial of a human papillomavirus type 16 vaccine. N Eng J Med, 347(21), 1645-1651, 2002 (非特許文献 2))
[0007] この第一世代ワクチン抗原は極めて型特異性が高ぐ例えば 16型 L1-キヤプシドヮ クチンは 16型の感染しか防がない。従って、高リスク型共通の中和抗体を誘導するヮ クチン抗原の開発が望まれている。
[0008] 本発明者らはこれまでの検討で、 HPV16型 L2蛋白質のアミノ酸 108-120領域にある ェピトープ（L2-ェピトープ）を認識するマウス（BALB/c)単クローン抗体 (MAb5、 13) 及び HPV16型 L2蛋白質のアミノ酸 108-120領域と同じ配列を持つ合成ペプチドを BA LB/cに免疫して得た抗血清は、 16型だけでなく 6、 11、型の感染を阻害することを示 してさた (Kawana. K, et al. ： し ommon neutralization epitope in minor capsid protein L2 of human papillomavirus types 16 and 6. J. Virology., 73, 6188—6190, 1999(非特 許文献 3))。
[0009] この L2領域のアミノ酸配列は粘膜指向性の HPV群で良く似ていることから、 L2-ェピ トープを認識する抗体は幅広く粘膜指向性 HPV群の感染を防ぐ可能性があることを
指摘してきた。さらに、この合成ペプチドをヒト健常者のボランティアに経鼻接種しても 安全で、一部のヒトの血清中に抗体が誘導され、少なくとも 16型と 52型を中和すること を し 7こ (Kawana. K, et al.： Safety and immunogenicity or a peptide containing the cross-neutralization epitope of HPV16 L2 administered nasally in healthy volunteers . Vaccine., 21: 4256-4260, 2003(非特許文献 4))。
[0010] 本発明者らは、 HPV16型 L2蛋白質のアミノ酸 108-126領域を蛍光蛋白質につない で 4°Cで細胞培養液に加えると、この融合蛋白質が細胞に表面に結合すること、 37°C に暖めると細胞内に侵入することを見出した（Kawana. Y, et al.： Human papillomavir us type 16 minor capsid protein 12 N— terminal region containing a common neutraliz ation epitope binds to the cell surface and enters the cytoplasm. J. Virology., 75, 23 31-2336, 2001 (非特許文献 5)参照)。
[0011] 本発明者らは、このような知見を基に、 HPV16型の L2蛋白質のアミノ酸 108-120領 域に型共通中和ェピトープが存在する（図 1)ことを見出し、このェピトープを L1蛋白 質の 3力所に組み込んで作ったキメラキヤプシドが第二世代ワクチン抗原の候補であ ることを示し、既に特許出願した。
[0012] HPVキヤプシドは L1蛋白質の 5量体 (キヤプソメァ）が 72個集合した正二十面体構造
(L1-キヤプシド）に 12分子の L2蛋白質が挿入された構造を持つ。 L2分子の一部はキ ャプシド表面に出ており、感染初期に重要な機能を担うと考えられている。本発明ら は、 L1蛋白質の 3力所に短いペプチドを挿入しても粒子が形成され、挿入したぺプチ ドが粒子表面に存在することを明らかにした。 HPV16型 L2蛋白質のアミノ酸 108-120 領域に、高リスク HPV群の感染を中和する型共通中和ェピトープが存在することを突 き止め、この領域を L1蛋白質に挿入してキメラ粒子を作った。キメラ粒子には、 1080 個のェピトープを提示できる。キメラ粒子をマウスに免疫して得た抗血清は複数の高 リスク HPVを中和したので、ワクチン抗原の候補として特許出願をして!/ヽる。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] HPVの L1-キヤプシドを動物に免疫すると、型に極めて特異的な免疫応答を誘導す る。 16型の L1-キヤプシドワクチンを用いた臨床試験の中間成績は、 16型の感染予防
に有効性が示されて 、る一方で、他の型の予防には効果が殆どな 、ことを示して!/ヽ る。従ってワクチンで子宮頸癌の発症を阻止するには、少なくとも高リスク型すべてに 対応できるワクチン抗原の開発が必要である。
[0014] 本発明者らはこれまでに HPV16型 L2蛋白質のアミノ酸 108-120領域にある高リスク 型共通中和ェピトープを用いたワクチン抗原を開発した。しかし、このェピトープのァ ミノ酸配列は、高リスク型 L2蛋白質間で約 60力 75%程度の相同性であり、誘導される 抗体は複数の高リスク型 HPVに結合するものの、 HPV16型に比べ結合能は劣る。そ こで、型共通性がより高い抗原の出現が望まれている。
[0015] そこで本発明の目的は、少なくとも高リスク型すべてに対応でき得る抗原であって、 なおかつ型共通性がより高い抗原を提供することにある。
[0016] 上記課題を解決する本発明は以下の通りである。
[1]ヒトパピローマウィルス (HPV) 16型 L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウイ ルスの L2ェピトープ群のうちの少なくとも 1つの L2ェピトープ（以下 64-81 L2ェピトー プと 、う）を挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキヤプシドであって、
前記 L2ェピトープ群は、 SGTGGRTGYIPLGTRPPT、 SGTGGRTGYIPLGGRSNT、 SG TGGRTGWPLSTRPSTゝ SGSGGRTGYVPIGTDPPT, SGTGGRSGYVPLGTTPPT, T GTGGRTGYIPLGGRPNT、 SGSGGRTGYVPLGGRSNT, SGSGGRTGYIPLGGGGRP 、 AGSGGRAGYVPLSTRPPT, TGSGGRAGYVPLGSRPST, SGTGGRTGYVPLGSTPP S、または SGTGGRTGYIPLGGKPNTで表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸群から なるキヤプシド。
[2]前記 L2ェピトープ群は、前記アミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸が、 欠失、置換、または付加されたアミノ酸力もなり、かつ前記キヤプシドに元となる L2ェ ピトープを有する HPVの抗原性と同様の抗原性を付与するアミノ酸群力もなる [1]に 記載のキヤプシド。
[3]前記 64-81 L2ェピトープを揷入するループ部位は、アミノ酸 56と 57の間、ァミノ 酸 140と 141の間、アミノ酸 266と 267の間、及びアミノ酸 430と 433の間の少なくとも一力 所である [1]または [2]に記載のキヤプシド。
[4]VEETSFIDA、 VEESGIVDV、 IEETTFIES、 IEESSFIDA、 IEDSSWTSゝまたは IEE
SAIINAで表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸群力 なる L2ェピトープ群のうちの少 なくとも 1つの L2ェピトープ (以下、 109-117 L2ェピトープという)をさらに挿入した [1] 〜 [3]の!、ずれかに記載のキヤプシド。
[5]前記 109-117 L2ェピトープを揷入するループ部位は、アミノ酸 56と 57の間、アミ ノ酸 140と 141の間、アミノ酸 266と 267の間、及びアミノ酸 430と 433の間の少なくとも一 力所であって、かつ前記 64-81 L2ェピトープを揷入していない箇所である [4]に記載 のキヤプシド。
[6] L1-キヤプシドワクチンの製造に用いられる [1]〜 [5] V、ずれかに記載のキヤプ シド。
[7]ヒトパピローマウィルス（HPV) 16型 L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウイ ルスの L2ェピトープ群のうちの少なくとも 1つの L2ェピトープ（以下 64-81 L2ェピトー プと 、う）を挿入したキメラ蛋白質であって、
前記 L2ェピトープ群は、 SGTGGRTGYIPLGTRPPT、 SGTGGRTGYIPLGGRSNT、 SG TGGRTGWPLSTRPSTゝ SGSGGRTGYVPIGTDPPT, SGTGGRSGYVPLGTTPPT, T GTGGRTGYIPLGGRPNT、 SGSGGRTGYVPLGGRSNT, SGSGGRTGYIPLGGGGRP 、 AGSGGRAGYVPLSTRPPT, TGSGGRAGYVPLGSRPST, SGTGGRTGYVPLGSTPP S、または SGTGGRTGYIPLGGKPNTで表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸群から なるキメラ蛋白質。
[8]前記 L2ェピトープ群は、前記アミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸が、 欠失、置換、または付加されたアミノ酸力もなり、かつ前記キメラ蛋白質力も構成され るキヤプシドに L2ェピトープを有する HPVの抗原性と同様の抗原性を付与するァミノ 酸群力もなる [7]に記載のキメラ蛋白質。
[9]前記 64-81L2ェピトープを揷入するループ部位は、アミノ酸 56と 57の間、アミノ酸 140と 141の間、アミノ酸 266と 267の間、及びアミノ酸 430と 433の間の少なくとも一力所 である [7]または [8]に記載のキメラ蛋白質。
[10]VEETSFIDA、 VEESGIVDV、 IEETTFIES、 IEESSFIDA、 IEDSSWTSゝまたは IE ESAIINAで表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸群力 なる L2ェピトープ群のうちの 少なくとも 1つの L2ェピトープ (以下、 109-117 L2ェピトープという)をさらに挿入した [7
]〜 [9]の 、ずれかに記載のキメラ蛋白質。
[11]前記 109-117 L2ェピトープを揷入するループ部位は、アミノ酸 56と 57の間、ァ ミノ酸 140と 141の間、アミノ酸 266と 267の間、及びアミノ酸 430と 433の間の少なくとも一 力所であって、かつ前記 64-81 L2ェピトープを揷入していない箇所である [10]に記 載のキメラ蛋白質。
[ 12] [7]〜 [ 11 ]の 、ずれかに記載のキメラ蛋白質を集合させることでキヤプシドを 形成させることを含む、 [1]〜 [5]の ヽずれかに記載のキヤプシドの製造方法。
[13]キーホールリンペットへモシァニンとヒトパピローマウィルスの L2ェピトープ（以 下 64-81 L2ェピトープという）の複合体であり、前記 64-81 L2ェピトープは、 SGTGGR TGYIPLGTRPPT、 SGTGGRTGYIPLGGRSNT、 SGTGGRTGYVPLSTRPST、 SGSGGR TGYVPIGTDPPT, SGTGGRSGYVPLGTTPPT, TGTGGRTGYIPLGGRPNTゝ SGSGG RTGYVPLGGRSNT、 SGSGGRTGYIPLGGGGRP、 AGSGGRAGYVPLSTRPPT, TGS GGRAGYVPLGSRPST、 SGTGGRTGYVPLGSTPPS,または SGTGGRTGYIPLGGKP NTで表されるアミノ酸配列を有する複合体。
[14]キーホールリンペットへモシァニンとヒトパピローマウィルスの 64- 81 L2ェピトー プはシスティンを介して結合して 、る [ 13]に記載の複合体。
発明の効果
[0017] 本発明によれば、粒子構造が強!ヽ免疫誘導活性を持つことと併せ、 HPVの L2-ェピ トープを強力に抗原提示でき、型共通性がより高い抗原を提供できる。その結果、少 なくとも高リスク型すべてに対応でき得る L1-キヤプシドワクチンを提供することも可能 になる。
[0018] HPV16型 L2蛋白質のアミノ酸 64-81領域及びアミノ酸 131-144領域は、感染中和抗 体のェピトープを含み、し力も高リスク HPV群でアミノ酸配列が極めてよく保存されて いることから、中和活性の交差性によって高リスク HPV群の感染を同時に阻害できる 発明を実施するための最良の形態
[0019] (L1-キヤプシド）
本発明の L1-キヤプシドは、ヒトパピローマウィルス（HPV) 16型 L1蛋白質のループ
部位に、ヒトパピローマウィルスの L2ェピトープ群のうちの少なくとも 1つの L2ェピトー プ (64-81 L2ェピトープ)を挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキヤプシドである。
[0020] 前述のように HPV粒子は、 5分子の L1蛋白質が集合したキヤプソメァが 72個集まつ て正 20面体のキヤプシドを形成する。 L1蛋白質を細胞で高発現させると、 L1蛋白質 は核に集まって、 自律的にキヤプシドを形成する。 L1蛋白質のみで形成されるキヤプ シドを L1-キヤプシドまたはウィルス様粒子（virus-like particle: VLP)と呼ぶ。 L1蛋白 質と L2蛋白質を同時に発現させると 12分子の L2蛋白質が L1-キヤプシドに取り込ま れて L1/L2-キヤプシド（または L1/L2-VLP)ができる。但し、 L1-キヤプシドと L1/L2- キヤプシドは、電子顕微鏡では識別できな 、。
[0021] 本発明の L1-キヤプシドは、 HPV16型の L1-キヤプシドをベースとするキヤプシドで ある。 HPVは遺伝子型が多いので、一般に HPV16や HPV58等の表示で型とともに記 載する。ここでは HPV16型の L1-キヤプシドは 16L1-キヤプシド、 HPV52型の L1/L2- キヤプシドは 52L1/L2-キヤプシドのように記載する。
[0022] 本発明の L1-キヤプシドは、 HPV16型 L1蛋白質に、 HPVの L2ェピトープを揷入した キメラ蛋白質の集合体である。以下、キメラ蛋白質とは、「ヒトパピローマウィルス (HP V) 16型 L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウィルスの L2ェピトープ群のうちの 少なくとも 1つの L2ェピトープを挿入したキメラ蛋白質」を意味し、本発明は、このキメ ラ蛋白質も包含する。
[0023] 本発明のキメラ蛋白質を作るために L1蛋白質に挿入される L2ェピトープは、 HPV16 型の L2蛋白質のアミノ酸 64-81領域の 18個のアミノ酸力 なる。
[0024] 尚、本発明においては、蛋白質のァミノ末端力も順にアミノ酸残基に番号を付け、 例えば 50番目のアミノ酸をアミノ酸 50と記載した。
[0025] HPV16型 L2蛋白質内で親水性アミノ酸の多い領域として、新たにアミノ酸 14-27、 6 4-81、 131-144領域に注目し、これらのアミノ酸配列を持つ合成ペプチドをゥサギに 免疫した（図 2)。全てのペプチドは特異的な抗体を誘導した（図 3)。
[0026] HPV16型キヤプシドを抗原とする ELISAで、抗原が粒子表面に提示されているか調 ベた。解析には、これまで注目してきた抗 107-122抗体をカ卩えた。全ての抗体は、 L1- キヤプシドには結合しな力つた (ELISAでの吸光度 0,1程度がこの測定系のバックダラ
ゥンドである）。 L1/L2-キヤプシドに対しては、抗 107-122抗体だけでなぐ抗 64-81、 及び 131-144抗体が結合し、これらのェピトープを含む領域が粒子表面に存在するこ とが示された。抗 14-27抗体は L1/L2-キヤプシドにも結合せず、この領域はキヤプシ ド内部に存在することが示された（図 4)。
[0027] さらに、 HPV52型及び 58型 L1/L2-キヤプシドを抗原として、抗体の交差性を調べた
(図 4)。抗 64-81抗体は、 2匹の抗体とも明瞭な交差性を示した。抗 107-122抗体は、 1 匹の抗体が 58型に対する反応が低ぐ抗 131-144抗体の交差性は、ゥサギ個体差が 大きかった。
[0028] HPVの増殖を許す培養細胞系が無いため、 HPVの感染は L1/L2-キヤプシドに分 泌性アルカリフォスファターゼ遺伝子の発現プラスミドを組み込んだ偽ウィルスを作り 、 293TT細胞に感染させて 72時間後の培養液のアルカリフォスファターゼ活性でモ- ターした。抗体による感染中和は、この感染性偽ウィルスと抗体を混合したのち細胞 に感染させて、アルカリフォスファターゼ活性の低下で調べた（図 5)。抗 64-81、 107- 122、 131-144抗体は、 HPV16型偽ウィルスの培養細胞への感染を阻害した。中でも 、抗 64-81抗体は最も優れた中和活性を示した。
64-81領域のアミノ酸配列は、複数の発がん性 HPVL2に極めて良く保存されており (相同率 75%以上）、ここにも型共通中和ェピトープが存在する可能性がある（図 6)。
[0029] 抗 64-81抗体は、アミノ酸配列の相同性力 期待されるとおり、 HPV18型に対しても 感染中和活性を示した (図 7)。
[0030] 64-81領域は感染成立に重要な働きを担っていると考え、この領域にアミノ酸置換 変異を導入した HPV16型偽ウィルスを作製し、感染性を調べた（図 8)。 69番目のアル ギニンと 72番目のタイ口シンのァラニンへの置換は有意に感染性を低下させた。従つ て、 L2蛋白質のこの領域は HPVが細胞に感染する際に重要な役割を担っており、抗 体が結合することで HPVの感染が阻害されると考えられる。
[0031] 以上の成績から、 HPV16型 L2蛋白質のアミノ酸 64-81領域は、高リスク型 HPV群の 感染を予防するワクチン抗原に応用できる。
[0032] 特に、本発明においては、 HPV16型 L2蛋白質のアミノ酸 64-81領域にある L2ェピト ープ（64- 81 L2ェピトープ）群は、 SGTGGRTGYIPLGTRPPT (配列番号 2)、 SGTGGR
TGYIPLGGRSNT (配列番号 3)、 SGTGGRTGYVPLSTRPST (配列番号 4)、 SGSGGRTG YVPIGTDPPT (配列番号 5)、 SGTGGRSGYVPLGTTPPT (配列番号 6)、 TGTGGRTGYI PLGGRPNT (配列番号 7)、 SGSGGRTGYVPLGGRSNT (配列番号 8)、 SGSGGRTGYIP LGGGGRP (配列番号 9)、 AGSGGRAGYVPLSTRPPT (配列番号 10)、 TGSGGRAGYV PLGSRPST (配列番号 11)、 SGTGGRTGYVPLGSTPPS (配列番号 12)、または SGTGG RTGYIPLGGKPNT (配列番号 13)で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸群カゝらなる ことが好ましい。 SGTGGRTGYIPLGTRPPT (配列番号 2)は、 HPV群の 16型 L2ェピトー プであり、特に好ましい。
[0033] また、 SGTGGRTGYIPLGGRSNT (配列番号 3)は HPV群の 18型 L2ェピトープであり、 SGTGGRTGYVPLSTRPST (配列番号 4)は HPV群の 31型 L2ェピトープであり、 SGSG GRTGYVPIGTDPPT (配列番号 5)は HPV群の 33型 L2ェピトープであり、 SGTGGRSG YVPLGTTPPT (配列番号 6)は HPV群の 35型 L2ェピトープであり、 TGTGGRTGYIPL GGRPNT (配列番号 7)は HPV群の 39型 L2ェピトープであり、 SGSGGRTGYVPLGGRS NT (配列番号 8)は HPV群の 45型 L2ェピトープであり、 SGSGGRTGYIPLGGGGRP (配 列番号 9)は HPV群の 51型 L2ェピトープであり、 AGSGGRAGYVPLSTRPPT (配列番 号 10)は HPV群の 52型 L2ェピトープであり、 TGSGGRAGYVPLGSRPST (配列番号 1 1)は HPV群の 56型 L2ェピトープであり、 SGTGGRTGYVPLGSTPPS (配列番号 12) は HPV群の 58型 L2ェピトープであり、 SGTGGRTGYIPLGGKPNT (配列番号 13)は H PV群の 68型 L2ェピトープである。
[0034] 前記 64-81 L2ェピトープ群は、前記アミノ酸配列、即ち、配列番号 2〜13のいずれ かに記載されたアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸力 欠失、置換、また は付加されたアミノ酸力もなり、かつ本発明のキヤプシドに元となる L2ェピトープを有 する HPVの抗原性と同様の抗原性を付与するアミノ酸群力もなることもできる。
[0035] 即ち、 64-81 L2ェピトープ群は、 SGTGGRTGYIPLGTRPPT (配列番号 2)で表される アミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸力 欠失、置換、または付加されたアミ ノ酸力 なり、かつ本発明のキヤプシドに HPV16型の抗原性を付与するアミノ酸配列 を有する L2ェピトープの変異体を含むことができる。そのような変異体としては、図 8 に示す HPV16/T66A、 HPV16/R69A、 HPV16/Y72A, HPV16/P74A, HPV16/R78A、
及び HPV16/R69A/Y72Aを挙げることができる。これらの変異は、以下の HPV18型等 においても同様に適用可能である。
[0036] 同様に、 64-81 L2ェピトープ群は、 SGTGGRTGYIPLGGRSNT (配列番号 3)で表さ れるアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸力 欠失、置換、または付加され たアミノ酸力もなり、かつ本発明のキヤプシドに HPV18型の抗原性を付与するアミノ酸 配列を有する L2ェピトープの変異体を含むことができる。
[0037] 同様に、 64-81 L2ェピトープ群は、 SGTGGRTGYVPLSTRPST (配列番号 4)で表され るアミノ酸配列において、ほたは数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加された アミノ酸力 なり、かつ本発明のキヤプシドに HPV31型の抗原性を付与するアミノ酸配 列を有する L2ェピトープの変異体を含むことができる。
[0038] 同様に、 64-81 L2ェピトープ群は、 SGSGGRTGYVPIGTDPPT (配列番号 5)で表され るアミノ酸配列において、ほたは数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加された アミノ酸からなり、かつ本発明のキヤプシドに HPV 33型の抗原性を付与するアミノ酸 配列を有する L2ェピトープの変異体を含むことができる。
[0039] 同様に、 64-81 L2ェピトープ群は、 SGTGGRSGYVPLGTTPPT (配列番号 6)で表さ れるアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸力 欠失、置換、または付加され たアミノ酸力もなり、かつ本発明のキヤプシドに HPV35型の抗原性を付与するアミノ酸 配列を有する L2ェピトープの変異体を含むことができる。
[0040] 同様に、 64-81 L2ェピトープ群は、 TGTGGRTGYIPLGGRPNT (配列番号 7)で表さ れるアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸力 欠失、置換、または付加され たアミノ酸力もなり、かつ本発明のキヤプシドに HPV39型の抗原性を付与するアミノ酸 配列を有する L2ェピトープの変異体を含むことができる。
[0041] 同様に、 64-81 L2ェピトープ群は、 SGSGGRTGYVPLGGRSNT (配列番号 8)で表さ れるアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸力 欠失、置換、または付加され たアミノ酸力もなり、かつ本発明のキヤプシドに HPV45型の抗原性を付与するアミノ酸 配列を有する L2ェピトープの変異体を含むことができる。
[0042] 同様に、 64-81 L2ェピトープ群は、 SGSGGRTGYIPLGGGGRP (配列番号 9)で表さ れるアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸力 欠失、置換、または付加され
たアミノ酸力もなり、かつ本発明のキヤプシドに HPV51型の抗原性を付与するアミノ酸 配列を有する L2ェピトープの変異体を含むことができる。
[0043] 同様に、 64-81 L2ェピトープ群は、 AGSGGRAGYVPLSTRPPT (配列番号 10)で表さ れるアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸力 欠失、置換、または付加され たアミノ酸力もなり、かつ本発明のキヤプシドに HPV52型の抗原性を付与するアミノ酸 配列を有する L2ェピトープの変異体を含むことができる。
[0044] 同様に、 64-81 L2ェピトープ群は、 TGSGGRAGYVPLGSRPST (配列番号 11)で表さ れるアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸力 欠失、置換、または付加され たアミノ酸力もなり、かつ本発明のキヤプシドに HPV56型の抗原性を付与するアミノ酸 配列を有する L2ェピトープの変異体を含むことができる。
[0045] 同様に、 64-81 L2ェピトープ群は、 SGTGGRTGYVPLGSTPPS (配列番号 12)で表さ れるアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸力 欠失、置換、または付加され たアミノ酸力もなり、かつ本発明のキヤプシドに HPV58型の抗原性を付与するアミノ酸 配列を有する L2ェピトープの変異体を含むことができる。
[0046] 同様に、 64-81 L2ェピトープ群は、 SGTGGRTGYIPLGGKPNT (配列番号 13)で表さ れるアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸力 欠失、置換、または付加され たアミノ酸力もなり、かつ本発明のキヤプシドに HPV68型の抗原性を付与するアミノ酸 配列を有する L2ェピトープの変異体を含むことができる。
[0047] 本発明のキメラ蛋白質において、 64-81 L2ェピトープが揷入される L1蛋白質は、 L1 蛋白質のループ部位である。 L1蛋白質のループ部位は、例えば、 L1蛋白質のァミノ 酸 52- 62、 85-97、 133-152、 171-183、 266-294、 315-325、 346-360、及び 426- 446領 域である。特に、 64-81 L2ェピトープが揷入される L1蛋白質のループ部位は、ァミノ 酸 56と 57の間、アミノ酸 140と 141の間、アミノ酸 266と 267の間、及びアミノ酸 430と 433 の間の少なくとも一力所であることが好ましい。 HPV16型 L1蛋白質のアミノ酸配列は、 配列番号 1に示す。
[0048] 本発明者らは、 HPV16L1蛋白質の構造解析、中和抗体ェピトープの分布、及びキ ャプシド形成に必須なシスティン残基の位置等の観点から、 L1蛋白質の外側にあつ て、抗原として認識されうる領域は、アミノ酸 52-62、 85-97、 133-152、 171-183、 266-
294、 315-325、 346-360、及び 426-446領域であると推定した。
[0049] 本発明者らは、 HPV16型、 18型、 6型 L1蛋白質のアミノ酸配列を並べて比較し、型 間で共通な部分は構造に関わる可能性が高いと考え、 L2ェピトープの挿入には不適 切とした。型によってアミノ酸配列が大きく異なる領域はキヤプシドの形成そのものに 必須ではないと予想し、 L2ェピトープの挿入候補領域とした。さらに、 HPV16型 L1蛋 白質のアミノ末端力 10アミノ酸を除いた蛋白質の集合で形成される L1-小型粒子（ キヤプシドより小型の正二十面体粒子)の構造解析（引用文献 2)と、中和抗体ェピト ープの分布（引用文献 3)、及びキヤプシド形成に必須なシスティン残基の位置（引用 文献 4)を参考にし、 L1タンパク質の外側にあって、 L2ェピトープの揷入が可能で、か つ抗原として認識されうる領域は、アミノ酸 52-62 (HPV16型の L1-小型粒子において BCループ)、 85- 97(CDループ)、 133- 152(DEループ)、 171- 183(EFループ)、 266-294 (FGループ)、 315-325(GHループ)、 346-360(HIループ)、及び 426-446(カルボキシ末 端)領域であると推定した。尚、引用文献は実施例の最後にリストを付す。
[0050] さらに、下記の理由力 挿入部位を絞り込み、 L2ェピトープを挿入したキメラ蛋白質 を作出してキヤプシド形成を調べた。
[0051] 部位 A：アミノ酸 52- 62領域では、アミノ酸 56と 57のあいだに B型肝炎ウィルスのェピ トープを挿入した報告（引用文献 3)が参考になった。アミノ酸 50はフエ-ルァラニン、 51はプロリン、 52はイソロイシンと疎水性のアミノ酸が続いた後に、 53と 54はリジン、 56 、 57、 58はァスパラギン、 59はリジンとほぼ全て親水性アミノ酸が続き、 60はイソ口イシ ンと疎水性になるので、 56と 57の間に挿入された L2ェピトープは表面にでると推定し 、挿入部位に選定した。
[0052] 部位 B：アミノ酸 133-152領域では、アミノ酸 140と 141のぁ 、だに B型肝炎ウィルスの ェピトープを挿入した報告（引用文献 3)が参考になった。この領域は親水性アミノ酸 残基を多く含むので、挿入された L2ェピトープは表面にでると推定した。 146番目の システィン残基のすぐそばを避け、アミノ酸 140と 141の間に挿入することとした。
[0053] 部位 C：アミノ酸 266-294領域では、 267のパリン、 269のグルタミンが L2ェピトープの ァミノ末端のパリン、 3番目のグルタミンと一致したため、 266と 267の間に挿入した。す こしでも L1蛋白質のアミノ酸配列に合えば、キヤプシドを形成しやすいと考えた力 で
ある。同時に B型肝炎ウィルスのェピトープを挿入した報告（引用文献 3)も参考にし た。
[0054] 部位 D：アミノ酸 426-446領域では、 428のシスティン残基がキヤプシド形成にかかせ ないことが知られている（引用文献 4)ので、 428を避けた。 431と 432のアミノ酸は、 HP V16、 18、 6型 L1蛋白質でアミノ酸がまちまちであり、 L2ェピトープを揷入してもキヤプ シド形成に影響が少ないと考え、アミノ酸 430と 433の間に挿入した。
[0055] そして、実際にキヤプシドの形成を試みたところ、 64-81 L2ェピトープ以外の L2ェピ トープではあるが、部位 3へ L2ェピトープを揷入したキメラ L1蛋白質（16L1-266VA)と 部位 4へ L2ェピトープを揷入したキメラ L1蛋白質 (16L1-430VA)は、キヤプシドを形成 した。部位 2と部位 3に同時に L2ェピトープを揷入したキメラ L1蛋白質 (16L1-140/266 VA)は、キヤプシドを形成した。部位 1と部位 2と部位 3に同時に L2ェピトープを挿入し たキメラ L1蛋白質 (16L1-56/140/266VA)は、キヤプシドを形成した。
[0056] L1蛋白質に挿入される 64-81 L2ェピトープは、 1つの L1蛋白質に 1つであることが できるが、同一の 64-81 L2ェピトープが 2つ以上 1つの L1蛋白質の異なるループ部位 に挿入されることもでき、あるいは、種類の異なる少なくとも 2種類の 64-81 L2ェピトー ブカ^つの L1蛋白質の異なるループ部位に挿入されることもできる。
[0057] さらに、本発明のキヤプシドは、上記 64-81 L2ェピトープ以外の L2ェピトープをさら に含むことができる。例えば、 VEETSFIDA (配列番号 14)、 VEESGIVDV (配列番号 15) 、 IEETTFIES (配列番号 16)、 IEESSFIDA (配列番号 17)、 IEDSSWTS (配列番号 18)、ま たは IEESAIINA (配列番号 19)で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸群力 なる L2 ェピトープ群のうちの少なくとも 1つの L2ェピトープ (109-117 L2ェピトープ)を、上記 64 -81 L2ェピトープに加えて、さらに挿入したキヤプシドも本発明のキヤプシドである。 V EETSFIDA (配列番号 14)は、 HPV群の 16型 L2ェピトープであり、特に好ましい。また、 VEESGIVDV (配列番号 15)は、 HPV群の 31型 L2ェピトープであり、 IEETTFIES (配列 番号 16)は HPV群の 52型 L2ェピトープであり、 IEESSFIDA (配列番号 17)は HPV群の 5 8型 L2ェピトープであり、 IEDSSWTS (配列番号 18)は HPV群の 18型 L2ェピトープでぁ り、 IEESAIINA (配列番号 19)は 6及び 11型 L2ェピトープである。
[0058] 109-117 L2ェピトープは、 64-81 L2ェピトープと同様に L1蛋白質のループ部位に
挿入することができ、具体的には、挿入するループ部位は、アミノ酸 56と 57の間、アミ ノ酸 140と 141の間、アミノ酸 266と 267の間、及びアミノ酸 430と 433の間の少なくとも一 力所であって、かつ前記 64-81 L2ェピトープを揷入していない箇所であることができ る。
[0059] L1蛋白質に挿入される 109-117 L2ェピトープは、 1つの L1蛋白質に 1つであること ができるが、同一の 109-117 L2ェピトープが 2つ以上 1つの L1蛋白質の異なるループ 部位に挿入されることもでき、あるいは、種類の異なる少なくとも 2種類の 109-117 L2 ェピトープカ S1つの L1蛋白質の異なるループ部位に挿入されることもできる。いずれ の場合も、 L1蛋白質には、 1つまたは 2つ以上の 64-81 L2ェピトープが揷入される。 L 1蛋白質に挿入される 64-81 L2ェピトープと 109-117 L2ェピトープの組み合わせと揷 入位置の例を図 9に示す。但し、これらは例示であって、これらの組合せ限定される 意図ではない。
[0060] (L2ェピトープを含むペプチドの作製）
L2ペプチド (アミノ酸 64-81または 109-117)の作製は、常法により、 96カラム自動ぺプ チド合成装置での Fmoc固相法により合成した。なお、このペプチドは抗体作製を目 的としたため、 KLH (キーホールリンペットへモシァニン)接合されており、この KLHによ るペプチド領域のマスキングを防ぐために N末にシスティン残基を付加してある。
[0061] 本発明は、キーホールリンペットへモシァニンとヒトパピローマウィルスの 64- 81 L2 ェピトープの複合体であり、前記 L2ェピトープは、 SGTGGRTGYIPLGTRPPT (配列番 号 2)、 SGTGGRTGYIPLGGRSNT (配列番号 3)、 SGTGGRTGYVPLSTRPST (配列番号 4)、 SGSGGRTGYVPIGTDPPT (配列番号 5)、 SGTGGRSGYVPLGTTPPT (配列番号 6) 、 TGTGGRTGYIPLGGRPNT (配列番号 7)、 SGSGGRTGYVPLGGRSNT (配列番号 8)、 SGSGGRTGYIPLGGGGRP (配列番号 9)、 AGSGGRAGYVPLSTRPPT (配列番号 10)、 TGSGGRAGYVPLGSRPST (配列番号 11)、 SGTGGRTGYVPLGSTPPS (配列番号 12)、 または SGTGGRTGYIPLGGKPNT (配列番号)で表されるアミノ酸配列を有する複合体 を包含する。キーホールリンペットへモシァニンとヒトパピローマウィルスの L2ェピトー プはシスティンを介して結合して 、ることができる。 SGTGGRTGYIPLGTRPPT (配列 番号 2)については、図 2に示す。
[0062] (L2ェピトープの挿入された LI蛋白質 (キメラ蛋白質)の作製）
キメラ L1遺伝子を作製し、これをバキュロウィルスベクターを用いて発現させて、キメ ラ L1蛋白質、キメラキヤプシドを作製した。キメラ L1遺伝子の作製は、 PCRによった。 詳細は以下の通りである。
[0063] (A)挿入した 、部分を持つプライマー対を作成する。
(B)挿入部分を持つプライマーの一方とプライマー 1またはプライマー 2を組み合わせ て PCRを行う。
(C)片側に挿入断片を持つ DNAを 2つ合成した。それぞれの相補部分をァニールさ せ、伸長反応を行う。
(D)挿入 DNAを持つキメラ遺伝子を作成する。
(E)この DNAを铸型にプライマー 1とプライマー 2を用いて PCRを行う。
(F)挿入遺伝子を持つ DNAを増幅できる。
[0064] 本発明は、本発明のキメラ蛋白質を集合させることでキヤプシドを形成させることを 含むキヤプシドの製造方法を包含する。上述の様に、キメラ L1遺伝子を作製し、これ を、バキュロウィルスベクターを用いて発現させて、キメラ L1蛋白質を作製する。そし て、キメラ L1蛋白質が作製されると、自律的にキメラキヤプシド (本発明のキヤプシド） が形成される。バキュロウィルスベクターを用いる発現は、常法で行うことができるが、 キメラキヤプシドの自律的な形成を促進するという観点から、条件を設定することが好 ましい。
実施例
[0065] 以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
[0066] 例 1
ゥサギペプチド杭 rfnj青の
日本白色ゥサギ (2.5kg〜3.0kg) 2羽に免疫した。抗原は化学合成したペプチドと KL H (keyhole limpet hemocyanin)を結合させたものを用いた。初回感作は 0.5mgの抗原 をコンプリートフロイントアジュバンドと共に皮下投与した。初回投与後 2週間後に 0.25 mgの抗原をコンプリートフロイントアジュバンドと共に皮下投与した。さらに 2週間後、 4 週間後、 6週間後に同様に (0.25mg)感作し計 5回感作した。最終感作の 1週間後に
全採血し血清を得た。 （株式会社スクラムに委託して行った。 )
[0067] ペプチド ELISA測定法
1.合成ペプチドを抗原とした。抗原を ELISAプレートに 0.5 g/100 1/well 加え、 4°Cでー晚静置し、抗原^ wellに結合させた。
2.抗原液を除去し、洗浄液 (0.2% Teen20 in PBS)にて 2回洗浄後、さらに洗浄液で w ellを満たし、室温で 2時間静置した。
3. wellから洗浄液除去後、希釈液（0.05% Twenn20 in PBS)にて抗血清を 1000倍か ら段階希釈したものを各 wellに 100 1カ卩え、室温で 2時間静置した。
4.血清試料を除去し、 3回洗浄し、 HRP (horse radish peroxydase)結合抗ゥサギ IgG 抗体を 10000倍希釈したものを各 wellに 100 1カ卩える。室温で 2時間静置し、溶液を液 除去後に洗浄液で 3回洗浄。
5.基質液（0 -フエ-レンジァミン 10mgをクェン酸一リン酸緩衝液 (pH 5.0)25mlにて溶 解し、 H 0 5 1カ卩えたもの） 100 1を加え、 20分間発色後に 1M H SOにて発色を停
2 2 2 4 止し Immuno readerで 490nmの波長を測定した。結果を図 3に示す。
[0068] 例 2
キヤプシド杭原の作製法
16L1、 16L1/L2、 52L1、 52L1/L2、 58L1、 58L1/L2遺伝子を組み換えバキュロウィ ルス系で発現させた。 Bac- to- Bac baculovirus expression system(GIBCO-BRL Inc.、 New York, NY)を用いて組み換えウィルスを作り、 s!9細胞 (夜盗蛾由来細胞）で発現 させた。 16L1 (52L1、 58L1も同様）遺伝子を pFastbacl vectorにクローユングして pFsa tbacl/16Llを得た。 16L1/L2 (52L1/L2、 58L1/L2も同様）は pFastbac dual vectorに クロー-ングして pFastbac dual/16Ll/L2を得た。次にそれぞれクローユングした pFas tbacベグタ ~~ DH10BAC大月易！ ¾(jVlax Efficiency competent cell containing baculovir us DNA and helper plasmid, GIBCO BRL)に導入して Bacmidを作成した。 Bacmid D NAを Effectene Transfection Reagent(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)を用いて sf— 9に導入し、キヤプシド蛋白質を発現する組み換えバキュロウィルスを得た。
[0069] 組み換えバキュロウィルスを sf_9感染させ 72時間後に細胞を回収した。感染細胞を 0.5%NP40溶液に縣濁し、 10分間室温放置後、遠心 (9000rpm、 15分、 4°C)して核分画
(沈殿）と細胞質分画に分けた。核分画を 1.28g/mlの塩ィ匕セシウム- PBS溶液に縣濁 し、超音波 (Sonifier250, Branson)破砕後、 SW50.1 roter(Beckman Coulter Inc., Fulle ron, CA)で超遠心（34000rpm、 20時間、 20°C)を行った。塩化セシウム勾配中で比重 1.28g/ml付近に集まった蛋白質を回収し、 0.5M NaC卜 PBSで透析したものを、キヤプ シド蛋白質溶液とした。
[0070] キヤプシド ELISA測定法
1.各キヤプシド抗原を 1 g/100 1/wellカ卩え、 4°Cでー晚 静置。
2.抗原液除去後にブロッキング液（5% skim milk in PBS)を 350 μ 1加え、 37°C2時間 静置した。
3.ブロッキング液除去後に洗浄液（0.05% Teen20/0.05% NP40 in PBS)に
て 3回洗净した。
4.ブロッキング液にて抗血清を 500倍希釈したものを各 wellに 50 1カ卩え、室温で 1時 間静置した。
5.血清試料を除去した後に 9回洗浄し、 HRP結合抗ゥサギ IgG抗体を 2000倍希釈し たものを各 wellに 50 1カ卩える。室温で 30分静置し、液除去後に洗浄液で 6回洗浄。
6.基質液（0 -フエ-レンジァミン 24mgをクェン酸一リン酸緩衝液 (pH 5.0)12mlにて溶 解し、 H 0 1.2 μ 1加えたもの） 50 μ 1を加え、 15分間発色後に Immuno readerで 450nm
2 2
の波長を測定した。結果を図 4に示す。
[0071] 例 3
感染件偽ウィルスの作製
1. 293TT細胞に HPV16L1蛋白質発現プラスミド、 HPV16L2蛋白質発現プラスミド、 分泌型アルカリフォスファターゼ発現プラスミドを Lipofectamine2000を用いてトランス フエクシヨンした。（18型感染性偽ウィルス作製の場合には 18L1プラスミド、 18L2ブラ スミドをそれぞれ使用）トランスフエクシヨン 72時間後に細胞を回収した。
2.回収した細胞を Detergent buffer (0.5%Briji58, 0.5%Benzonase, 1%ATP dependen t plasmid safe exonuclease C in D- PBS(CaCl ImM, MgCl 10mM)) にて懸濁し、 37
2 2
°cでー晚静置した。
3.その後、 4°C、 10分静置したのち、最終 850mM NaClとなるように、 5M NaClをカロえ
た。
4. 1500g、 10分間遠心し、上清を回収した。
5.回収した上清は、 27%, 33%, 39%の optiprep (AXIS-SHIELD PoC AS製）溶液（PBS で希釈）の上に重層し、 43700rpm、 3時間、 16°Cにて超遠心した。
6.超遠心後、底面より約 300 1ずつ分画を回収し、分画 3もしくは 4を感染性偽ウイ ルス分画として感染実験に使用した。
[0072] 中和実験
1.中和実験前日に 96穴細胞培養用プレートに 20000個/ wellの 293TT細胞を植えて おく。
2. Neautralization Buffer (フエノールレッド抜きの DMEM培地に 10%FCS、 1% non-ess entialアミノ酸、 1%L-グルタミン酸、 10mM HEPESを添カ卩したもの）で血清を希釈し感 染性偽ウィルスと混合させ 1時間 4°Cにて反応させ、前日〖こ植えておいた 293TT細胞 に加えた。
3.約 72時間培養後に上清 15 μ 1回収し、 BD clontech社の Great ESCAPE SEAP Che miluminescence Kitにてアルカリフォスファターゼ活性を Luminometerを用いて測定し た。結果を図 5及び 7に示す。
[0073] 例 4
例 3において、 HPV16L2蛋白質発現プラスミドの代りに、図 6に示す 64-81に変異を 導入した L2変異型 HPV16L2蛋白質発現プラスミドを用いた以外は、例 3と同様の操 作を行った。 L2の変異型の違いと感染性との関係を示す結果を図 8に示す。
[0074] 明細書で前記非特許文献 1〜5以外に引用した文献は下記の通りである。 lj Matsumoto. K， et al.： Antibodies to human papillomavirus ID, 18， 58， and D b major capsid proteins among Japanese females. Jpn. J. C ancer Res., 88， 369— 375, 1997.
2) Xiaojiang S. Chen, et al.： Structure of small virus-like partic les assembled fr om the LI protein of human papillomavirus 16. Mol. Cell., 5， 557—567， 2000.
3) Jean-Remy Sadeyen, et al.： Insertion of a foreign sequence on c apsid surfac
e loops of human papillomavirus type 16 virus-like par tides reduces their capac ity to induce neutralizing antibodies an d delineates a conformational neutralizin g epitope. Virology., 309 , 32—40, 2003.
4) Ishii. Y, et al,： Mutational analysis of human papillomavirus t ype 16 major ca psid protein LI: the cysteines affecting the interm olecular bonding and structur e of Ll-capsids. Virology., 308, 128— 136, 2003
産業上の利用可能性
[0075] HPV16L1蛋白質に、 HPV16型 L2蛋白質のアミノ酸 108-120領域を挿入したキメラ蛋 白質による粒子は、強い免疫原性と高リスク HPV群に共通の中和抗体誘導能を持つ (特許申請中）。このキメラ蛋白質に 64-81領域を追加することで、さらに強力な型共 通中和抗体を誘導できるワクチン抗原が作製できる。
このワクチンにより高リスク HPV群の感染予防ができれば、子宮頸癌の発生予防に つながる。
図面の簡単な説明
[0076] [図 1]先に特許出願したキメラキヤプシドの模式図。
[図 2]作製したペプチド抗体の領域。ペプチドは KLHと結合して免疫抗原とした。
[図 3]各ペプチドを 2匹のゥサギに免疫して得た抗血清とペプチドの反応性（1匹の成 績を示した）による抗ペプチド抗体の力価（ELISA)を示す。 ELISAの抗原はペプチド のみ。血清は特異的な抗体を含んでいた。
[図 4]各ペプチド抗体の L1-ないし L1/L2-キヤプシドに対する反応性による抗ぺプチ ド抗体と HPVキヤプシドの結合（ELISA)についての結果を示す。 ELISAの抗原は HPV 16型 L1/L2-キヤプシド (16L1/L2)、 L1-キヤプシド (16L1)等。 L2蛋白質の粒子表面に 出ている領域と抗体が結合する力調べた。 52型、 58型 L2蛋白質との交差による結合 も調べた。
[図 5]各ペプチド抗体の HPV16型に対する中和活性 (HPV16型感染性偽ウィルス (0.0 2 1))。 L2蛋白質の表面領域に結合しない抗 14-27抗体と型特異性の高い抗 52型 L 1抗体は中和活性を示さなかった。抗 64-81、 107-122、 131-144抗体は中和活性を 示した。
[図 6]L2 (64-81)領域のアミノ酸配列の比較。代表的な抗リスク HPVL2蛋白質を示し た。
[図 7]抗 64-81抗体による HPV18型感染性偽ウィルスの感染中和。用いた 2用量の偽 ウィルスは、効率よく中和された。
[図 8]L2 (64-81)領域のアミノ酸を置換した変異体をもつ HPVl 6型偽ウィルスの感染 性。
[図 9]L1蛋白質に挿入される 64-81 L2ェピトープと 109-117 L2ェピトープの組み合わ せと挿入位置の例を示す。
Claims
[1] ヒトパピローマウィルス (HPV) 16型 L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウィルス の L2ェピトープ群のうちの少なくとも 1つの L2ェピトープ（以下 64-81 L2ェピトープと V、う）を挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキヤプシドであって、
前記 L2ェピトープ群は、 SGTGGRTGYIPLGTRPPT、 SGTGGRTGYIPLGGRSNT、 SG TGGRTGWPLSTRPSTゝ SGSGGRTGYVPIGTDPPT, SGTGGRSGYVPLGTTPPT, T GTGGRTGYIPLGGRPNT、 SGSGGRTGYVPLGGRSNT, SGSGGRTGYIPLGGGGRP 、 AGSGGRAGYVPLSTRPPT, TGSGGRAGYVPLGSRPST, SGTGGRTGYVPLGSTPP S、または SGTGGRTGYIPLGGKPNTで表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸群から なるキヤプシド。
[2] 前記 L2ェピトープ群は、前記アミノ酸配列において、ほたは数個のアミノ酸力 欠失 、置換、または付加されたアミノ酸力もなり、かつ前記キヤプシドに元となる L2ェピトー プを有する HPVの抗原性と同様の抗原性を付与するアミノ酸群力もなる請求項 1に記 載のキヤプシド。
[3] 前記 64-81 L2ェピトープを揷入するループ部位は、アミノ酸 56と 57の間、アミノ酸 140 と 141の間、アミノ酸 266と 267の間、及びアミノ酸 430と 433の間の少なくとも一力所であ る請求項 1または 2に記載のキヤプシド。
[4] VEETSFIDA、 VEESGIVDV、 IEETTFIES、 IEESSFIDA、 IEDSSWTSゝまたは IEESAII NAで表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸群力 なる L2ェピトープ群のうちの少なく とも 1つの L2ェピトープ (以下、 109-117 L2ェピトープという)をさらに挿入した請求項 1 〜3の!、ずれ力 1項に記載のキヤプシド。
[5] 前記 109-117 L2ェピトープを揷入するループ部位は、アミノ酸 56と 57の間、アミノ酸 1 40と 141の間、アミノ酸 266と 267の間、及びアミノ酸 430と 433の間の少なくとも一力所で あって、かつ前記 64-81 L2ェピトープを揷入していない箇所である請求項 4に記載の キヤプシド。
[6] L1-キヤプシドワクチンの製造に用いられる請求項 1〜5いずれか 1項に記載のキヤプ シド。
[7] ヒトパピローマウィルス (HPV) 16型 L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウィルス
の L2ェピトープ群のうちの少なくとも 1つの L2ェピトープ（以下 64-81 L2ェピトープと いう）を挿入したキメラ蛋白質であって、
前記 L2ェピトープ群は、 SGTGGRTGYIPLGTRPPT、 SGTGGRTGYIPLGGRSNT、 SG TGGRTGWPLSTRPSTゝ SGSGGRTGYVPIGTDPPT, SGTGGRSGYVPLGTTPPT, T GTGGRTGYIPLGGRPNT、 SGSGGRTGYVPLGGRSNT, SGSGGRTGYIPLGGGGRP 、 AGSGGRAGYVPLSTRPPT, TGSGGRAGYVPLGSRPST, SGTGGRTGYVPLGSTPP S、または SGTGGRTGYIPLGGKPNTで表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸群から なるキメラ蛋白質。
[8] 前記 L2ェピトープ群は、前記アミノ酸配列において、ほたは数個のアミノ酸力 欠失 、置換、または付加されたアミノ酸力もなり、かつ前記キメラ蛋白質力も構成されるキ ャプシドに L2ェピトープを有する HPVの抗原性と同様の抗原性を付与するアミノ酸群 力 なる請求項 7に記載のキメラ蛋白質。
[9] 前記 64-81L2ェピトープを揷入するループ部位は、アミノ酸 56と 57の間、アミノ酸 140 と 141の間、アミノ酸 266と 267の間、及びアミノ酸 430と 433の間の少なくとも一力所であ る請求項 7または 8に記載のキメラ蛋白質。
[10] VEETSFIDA、 VEESGIVDV、 IEETTFIES、 IEESSFIDA、 IEDSSWTSゝまたは IEESAII NAで表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸群力 なる L2ェピトープ群のうちの少なく とも 1つの L2ェピトープ (以下、 109-117 L2ェピトープという)をさらに挿入した請求項 7 〜9のいずれか 1項に記載のキメラ蛋白質。
[11] 前記 109-117 L2ェピトープを揷入するループ部位は、アミノ酸 56と 57の間、アミノ酸 1 40と 141の間、アミノ酸 266と 267の間、及びアミノ酸 430と 433の間の少なくとも一力所で あって、かつ前記 64-81 L2ェピトープを揷入していない箇所である請求項 10に記載 のキメラ蛋白質。
[12] 請求項 7〜11のいずれか 1項に記載のキメラ蛋白質^^合させることでキヤプシドを 形成させることを含む、請求項 1〜5のいずれか 1項に記載のキヤプシドの製造方法。
[13] キーホールリンペットへモシァニンとヒトパピローマウィルスの L2ェピトープ（以下 64-8 1 L2ェピトープという）の複合体であり、前記 64-81 L2ェピトープは、 SGTGGRTGYIP LGTRPPT、 SGTGGRTGYIPLGGRSNT、 SGTGGRTGYVPLSTRPST、 SGSGGRTGYV
PIGTDPPT、 SGTGGRSGYVPLGTTPPT, TGTGGRTGYIPLGGRPNTゝ SGSGGRTGY VPLGGRSNT、 SGSGGRTGYIPLGGGGRP, AGSGGRAGYVPLSTRPPT, TGSGGRA GYVPLGSRPST、 SGTGGRTGYVPLGSTPPS、または SGTGGRTGYIPLGGKPNTで表 されるアミノ酸配列を有する複合体。
キーホールリンペットへモシァニンとヒトパピローマウィルスの 64-81 L2ェピトープはシ スティンを介して結合して 、る請求項 13に記載の複合体。
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