WO2007012754A1 - Methode de chromatographie d' affinite d' antithrombine iii - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to an affinity chromatography column comprising the protein ATIII bound to a solid support.
  • Heparins mixtures of sulfated mucopolysaccharides of animal origin, are biologically active agents of the family of glycosaminoglycans which have particularly useful anticoagulant properties. They consist of sulfated polysaccharide linear chains very heterogeneous in size. The average weight of heparins is about 15000 Da (origin: pork mucus).
  • LMWH Low molecular weight heparins
  • HTBPM very low molecular weight heparins
  • Antithrombin III (ATIII) (Chandra et al., 1983, Proc Natl Acad Sci U. S.A., 80: 1845-1848) is a specific serpin, which has a low inhibitory activity of serine proteases controlling coagulation. This action is markedly increased in the presence of heparin that binds and activates ATIII. In particular, heparin binding results in a set of conformational changes in the culminating protein with the adoption of a highly favorable conformation to the interaction with the target serine proteases. When ATIII is in the activated conformation, the interaction with the heparin or derivative molecule that initiated the conformational change is markedly enhanced.
  • heparin and ATIII The interaction between heparin and ATIII is due to a specific pentasaccharide sequence. However, only one third of the polysaccharide strands have the specific sequences allowing a stable interaction with I 1 ATIII.
  • the heparin preparations and derivatives are therefore heterogeneous with respect to the affinity for ATIII. It is important to be able to enrich a population of affinity species oligosaccharides for ATIII, such enrichment being likely to significantly increase the anticoagulation activity of this population.
  • ATIII is grafted, in the presence of acetylated heparin, onto the CNBr-activated Sepharose B resin.
  • the purpose of the use of heparin is to prevent grafting at the heparin binding site of ATIII.
  • the heparin used to bind ATIII is acetylated heparin, so as to avoid the risk of competition with hexamines NH 2 residues.
  • the acetylation of heparin results in a significant decrease in its affinity and thus in its protective capacity with respect to the binding site, hence a decrease in the number of ATIII molecules capable of binding the affine species.
  • the present invention relates to an affinity chromatography column comprising the antithrombin III protein (ATIII) bound to a solid support characterized in that: a. the protein ATIII is the wild-type protein or a variant thereof, b. the ATIII protein was previously activated by incubation with unmodified low molecular weight heparin (LMWH) and rich in active species, c. the ATIII protein is covalently bound to a resin in a ratio of less than about 2 mg of protein per ml of hydrated resin.
  • LMWH low molecular weight heparin
  • unmodified LMWH we mean a LMWH which has not undergone any chemical or enzymatic modification after preparation and, in particular, which is not acetylated.
  • LMWH rich in active species is LMWH rich in affinity oligosaccharides for ATIII.
  • the term "resin” means a chemically inert macromolecular support on which ATIII is grafted.
  • These carriers include, but are not limited to, agarose, agarose polyacrylamide, porous glass, polyvinyl or polymethacrylate beads, on which ATIII is grafted according to manufacturers' instructions or well-known methods. those skilled in the art, including in particular the cyanogen bromide and hydrazine grafting methods. It is understood that pre-activated resins can also be used.
  • the resin used is Sepharose and the grafting technique used is that of cyanogen bromide grafting.
  • the affinity chromatography column according to the invention has a double advantage.
  • the use of unmodified LMWH to protect the ATIII binding site makes it possible to bind the protein in an activated conformation.
  • ATIII exhibits a significantly stronger and more selective affinity for affine species than ATIIIs linked via primary amines without prior activation.
  • the low concentration of ATIII allows interactions with affine species without steric hindrance between them. This property of the invention is particularly interesting when trying to separate large species.
  • the ratio between the amounts of ATIII binding sites present in LMWH and ATIII molecules is between about 5 and about 15. More specifically, the subject of the invention is affinity chromatography column as defined above characterized in that this ratio is about 10.
  • the subject of the invention is particularly an affinity chromatography column characterized in that enoxaparin® is used as LMWH to protect the ATIII binding site.
  • the invention also has the advantage of allowing better accessibility to ATIII by adjusting the graftable protein concentration on the resin.
  • the subject of the invention is an affinity chromatography column, characterized in that the ATlII / resin ratio is between about 0.5 and about 1.5 mg of protein per ml of resin.
  • ATlII / resin ratio is between about 0.5 and about 1.5 mg of protein per ml of resin.
  • this corresponds to a range of about 1.75 mg to 5.25 mg protein per g dry resin (according to the supplier's data). 1 g of dry resin gives about 3.5 ml of resin after hydration).
  • the affinity chromatography column according to the invention has a greater capacity and greater selectivity than the columns described in the state of the art.
  • ATIII affine species may be purified from a mixture of affine and non-affine species.
  • species ATIII affine means any molecule capable of binding specifically to ATIII. For example, one may want to enrich a population of heparin oligosaccharides into affine species. It may also be of interest, for example, to increase the titre of a solution of polyclonal antibodies against ATIII.
  • the affinity chromatography column according to the invention can thus be used to purify affine species of ATIII from a mixture.
  • the subject of the invention is therefore a process for purifying the affine species of ATIII in a sample comprising affine and non-affine species of ATIII, said process comprising:
  • the affine species purified by the process according to the invention are oligosaccharides constituting the heparins and their derivatives.
  • the elution of the different species may, for example, be monitored by measuring the absorbance of the different fractions using a spectrophotometer.
  • the wavelength used will be appropriate to the nature of the purified species. For example, if oligosaccharides are purified the length used will be 232 nm; if you purify proteins, it will be 280 nm.
  • composition of the elution fractions can then be analyzed according to methods well known to those skilled in the art.
  • the person skilled in the art can use the methods of analysis described in the prior art: for example and without limitation, capillary electrophoresis, MALDI-TOF mass spectrophotometry, high performance liquid chromatography.
  • a biological test such as the factor Xa inhibition test.
  • Figure 1 chromatogram of a separation of enoxaparin® on affinity chromatography ATIII.
  • Figure 2 chromatogram of a separation of enoxaparin® on ATIII affinity chromatography.
  • Curve 1 represents the injection of LMWH on column 1 (protection enoxaparin ®), curve 2 the injection of buffer on column 1 (protection enoxaparin ®), curve 3 the injection of LMWH on column 2 (protection heparin) , curve 4 column injection buffer 2 (heparin protection).
  • the solution is mixed in a 1: 2 ratio with Sepharose resin
  • the behavior of the affine species is monitored with a diode array UV detector (HP 1100) by measuring the absorbance of the fractions at 232 nm. As shown in fig. 1, the affine species are specifically retained on the column and are eluted in the presence of 3M NaCl.
  • the separation of the different polysaccharide species is followed by a diode array UV detector (HP 1100) by measuring the absorbance of the fractions at 232 nm.
  • % Species retained peak elution area / (peak area of non-retained species + peak area of retained species)
  • the affine and non-affine fractions after several injections of 427 ⁇ g of LMWH were pooled and analyzed by CTA-SAX HPLC (Mourgier et al., 2004, Anal. Biochem., 332: 299-313).
  • the affine fraction obtained is pure and complete, in that it contains no non affine species and that it has all the affine hexasaccharides.
  • the non-affine fraction is completely depleted in affine species.
  • That of the affine fraction is 818 ⁇ 10 IU / mg; for comparison, the activity of the hexasaccharide ⁇ UA- (1 ⁇ 4) ⁇ -GlcNAc (6S) - (1 ⁇ 4) ⁇ -GlcA- (1 ⁇ 4) ⁇ -GlcNS (NS, 3,6S) - ( 1 ⁇ 4) ⁇ -1dA2S- (1 ⁇ 4) ⁇ -GlcNS (NS, 6S) is about 650-700 IU / mg. On the other hand, we were totally unable to detect anti-Xa activity in the non-affine fractions.
  • affine species especially the predominant affine species, are found in the non-affine fraction: ⁇ UA- (1-4) ⁇ -GlcNAc (6S) - (1-4) ⁇ -GIcA- (I ⁇ 4) ⁇ -GlcNS (NS, 3.6S) - (1 ⁇ 4) ⁇ -1dA2S- (1 ⁇ 4) ⁇ -GlcNS (NS, 6S).

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Abstract

La présente invention a pour objet une colonne de chromatographie d'affinité comprenant la protéine ATIII liée à un support solide, caractérisée en ce que la protéine ATIII a été préalablement activée par incubation avec une héparine de bas poids moléculaire (HBPM) non modifiée et riche en espèces actives, et qu'elle est liée de façon covalente à une résine dans un rapport inférieur à environ 2 mg de protéine par ml de résine hydratée.

Description

METHODE DE CHROMATOGRAPHIE D' AFFINITE D' ANTITHROMBINE III
La présente invention a pour objet une colonne de chromatographie d'affinité comprenant la protéine ATIII liée à un support solide.
Les héparines, mélanges de mucopolysaccharides sulfatés d'origine animale, sont des agents biologiquement actifs de la famille des glycosaminoglycanes qui ont des propriétés anticoagulantes particulièrement utiles. Elles sont constituées de chaînes linéaires polysaccharidiques sulfatées très hétérogènes de par leurs tailles. Le poids moyen des héparines est d'environ 15000 Da (origine : mucus de porc).
Les héparines de bas poids moléculaire (HBPM) et les héparines de très bas poids moléculaire (HTBPM) sont préparées par coupure des chaînes polysaccharidiques longues d'héparine en chaînes plus courtes de bas poids moléculaire. Par HBPM et HTBPM on entend ainsi des chaînes dont le poids moléculaire est compris respectivement entre 3000 et 6500 Da et entre 1500 et 3000 Da.
L'Antithrombine III (ATIII) (Chandra et al., 1983, Proc. Natl. Acad. ScI. U. S.A., 80 : 1845-1848) est une serpine spécifique, qui a une faible activité inhibitrice des serine protéases contrôlant la coagulation. Cette action est nettement augmentée en présence d'héparine qui lie et active ATIII. En particulier, la liaison à l'héparine entraîne un ensemble de changements conformationnels dans la protéine culminant avec l'adoption d'une conformation hautement favorable à l'interaction avec les serines protéases cibles. Quand ATIII est dans la conformation activée, l'interaction avec la molécule d'héparine ou dérivée qui a initié le changement de conformation est nettement renforcée.
L'interaction entre l'héparine et ATIII est due à une séquence pentasaccharidique spécifique. Or, seul un tiers des brins polysaccharidiques possède les séquences spécifiques permettant une interaction stable avec I1ATIII. Les préparations d'héparine et dérivés sont donc hétérogènes en ce qui concerne l'affinité pour ATIII. Il est important de pouvoir enrichir une population d'oligosaccharides en espèces affines pour ATIII, un tel enrichissement étant susceptible d'augmenter significativement l'activité anticoagulation de cette population.
Une méthode de chromatographie d'affinité ATIII pour séparer les fractions affines et non affines de l'héparine est décrite dans Hôôk ét al. (1976, FEBS Lett, 66 : 90-93). D'autres méthodes ont été publiées mais reprennent les points essentiels de la méthode de Hôôk et al. (Hopwood et al., 1976, FEBS Lett., 69 : 51-54 ; Denton et al., 1981 , Anal. Biol., 118: 388-391 ; Pixley & Danishefsky, 1982, Thromb. Res., 26 : 129-133). Selon cette méthode, ATIII est greffée, en présence d'héparine acétylée, sur la résine Sepharose B activée au CNBr. L'utilisation d'héparine a pour but de prévenir tout greffage au niveau du site de liaison à l'héparine d'ATIII.
Cette technique a deux limitations importantes.
Tout d'abord, l'héparine utilisée pour lier ATIII est une héparine acétylée, de façon à éviter le risque de compétition avec les résidus NH2 des hexamines. Or l'acétylation de l'héparine se traduit par une baisse importante de son affinité et donc de son pouvoir protecteur vis à vis du site de liaison, d'où une diminution du nombre de molécules ATIII capables de lier les espèces affines.
D'autre part, au vu de la concentration d'ATIII utilisée (environ 7 mg de protéine/ ml de résine hydratée), il y a un risque fort de gêne stérique entre les molécules de polysaccharides susceptibles de se lier à ATIII lors d'une purification d'espèces affines pour ATIII.
La présente invention a pour objet une colonne de chromatographie d'affinité comprenant la protéine antithrombine III (ATIII) liée à un support solide caractérisée en ce que : a. la protéine ATIII est la protéine sauvage ou un variant de celle- ci, b. la protéine ATIII a été préalablement activée par incubation avec une héparine de bas poids moléculaire (HBPM) non modifiée et riche en espèces actives, c. la protéine ATIII est liée de façon covalente à une résine dans un rapport inférieur à environ 2 mg de protéine par ml de résine hydratée.
Par HBPM non modifiée, on entend une HBPM qui n'a pas subi de modification chimique ou enzymatique après préparation et, en particulier, qui n'est pas acétylée. On entend, par HBPM riche en espèces actives, une HBPM riche en oligosaccharides affins pour l'ATIII.
Par résine, on entend selon l'invention un support macromoléculaire chimiquement inerte sur lequel est greffée ATIII. Ces supports comprennent entre autres, et de façon non limitative, les billes d'agarose, de polyacrylamide d'agarose, de verre poreux, de polyvinyle ou de polyméthacrylate, sur lesquelles ATIII est greffée en suivant les indications des fabricants ou les méthodes bien connues de l'homme du métier, dont en particulier les méthodes de greffage au bromure de cyanogène et à l'hydrazine. Il est bien entendu que des résines pré-activées peuvent aussi être utilisées. Selon un mode tout particulièrement avantageux de réalisation de l'invention, la résine utilisée est de la Sepharose et la technique de greffage utilisée est celle du greffage au bromure de cyanogène. La colonne de chromatographie d'affinité selon l'invention présente un double avantage.
D'une part, l'utilisation d'une HBPM non modifiée pour protéger le site de liaison d'ATIII permet de fixer la protéine sous une conformation activée. Sous cette conformation, ATIII exhibe une affinité significativement plus forte et plus sélective vis à vis des espèces affines que les ATIII liées via les aminés primaires sans activation préalable. D'autre part, la faible concentration en ATIII permet des interactions avec les espèces affines sans gêne stérique entre elles. Cette propriété de l'invention est particulièrement intéressante quand on cherche à séparer des espèces de grande taille.
Pour que toutes les molécules ATIII soient activées, il est préférable d'utiliser une quantité saturante d'HBPM non modifiée et riche en espèces affines.
Selon un mode de mise en œuvre avantageux de l'invention, le rapport entre les quantités de sites liant ATIII présents dans HBPM et de molécules d'ATIII est compris entre environ 5 et environ 15. Plus précisément, l'invention a pour objet une colonne de chromatographie d'affinité telle que définie plus haut caractérisée en ce que ce rapport est d'environ 10.
L'invention a tout particulièrement pour objet une colonne de chromatographie d'affinité caractérisée en ce qu'on utilise l'enoxaparine® comme HBPM pour protéger le site de liaison d'ATIII.
Comme expliqué plus haut, l'invention présente aussi l'avantage de permettre une meilleure accessibilité à ATIII en jouant sur la concentration de protéine greffable sur la résine.
Selon un autre mode avantageux de réalisation, l'invention a pour objet une colonne de chromatographie d'affinité caractérisée en ce que le rapport ATlII/résine est compris entre environ 0,5 et environ 1,5 mg de protéine par ml de résine. Par exemple, pour une résine de type Sepharose B activée au bromure de cyanogène (Sigma), cela correspond à une gamme d'environ 1 ,75 mg à 5,25 mg de protéine par g de résine sèche (selon les données du fournisseur, 1 g de résine sèche donne environ 3,5 ml de résine après hydratation).
Ainsi, la colonne de chromatographie d'affinité suivant l'invention présente une plus grande capacité et une plus grande sélectivité que les colonnes décrites dans l'état de la technique.
Il existe des situations où l'on peut désirer purifier des espèces affines d'ATIII à partir d'un mélange d'espèces affines et non affines. Par espèce affine d'ATIII, on entend toute molécule susceptible de se lier spécifiquement à ATIII. Par exemple, on peut vouloir enrichir une population d'oligosaccharides hépariniques en espèces affines. Il peut aussi être intéressant par exemple d'augmenter le titre d'une solution d'anticorps polyclonaux contre ATIII.
La colonne de chromatographie d'affinité suivant l'invention peut ainsi être utilisée pour purifier des espèces affines d'ATIII à partir d'un mélange. L'invention a donc aussi pour objet un procédé de purification des espèces affines de l'ATIII dans un échantillon comprenant des espèces affines et non affines de l'ATIII, ledit procédé comprenant :
a. l'introduction dudit échantillon dans la colonne de chromatographie d'affinité pour la protéine ATIII, ladite colonne étant préalablement équilibrée dans un tampon salin approprié ; b. le lavage des espèces non spécifiquement retenues de ladite colonne par un tampon salin de lavage approprié et c. l'élution des espèces spécifiquement retenues de ladite colonne par un tampon salin d'élution approprié.
En particulier, selon un mode de réalisation tout particulièrement avantageux, les espèces affines purifiées par le procédé selon l'invention sont des oligosaccharides constituant les héparines et leurs dérivés.
L'élution des différentes espèces pourra, par exemple, être suivie en mesurant l'absorbance des différentes fractions à l'aide d'un spectrophotomètre. La longueur d'onde utilisée sera appropriée à la nature des espèces purifiées. Par exemple, si on purifie des oligosaccharides la longueur utilisée sera 232 nm ; si on purifie des protéines, elle sera de 280 nm.
La composition des fractions d'élution peut être ensuite analysée suivant des méthodes bien connues de l'homme du métier. Ainsi, si les fractions analysées comprennent des oligosaccharides, l'homme du métier pourra utiliser les méthodes d'analyse décrites dans l'art antérieur : par exemple et de façon non limitative, l'électrophorèse capillaire, la spectrophotométrie de masse MALDI-TOF, la chromatographie liquide haute performance. L'homme du métier pourra aussi utiliser un test biologique, comme le test d'inhibition du facteur Xa.
Exemples
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
Légende des figures
Figure 1 : chromatogramme d'une séparation d'enoxaparine® sur chromatographie d'affinité ATIII.
Figure 2 : chromatogramme d'une séparation d'enoxaparine® sur chromatographie d'affinité ATIII. La courbe 1 représente l'injection de HBPM sur colonne 1 (protection enoxaparine ®) , la courbe 2 l'injection de tampon sur colonne 1 (protection enoxaparine ®), la courbe 3 l'injection de HBPM sur colonne 2 (protection héparine), la courbe 4 l'injection de tampon sur colonne 2 (protection héparine).
Exemple 1 : Préparation et utilisation de la colonne
1. Préparation de la colonne
On reconstitue 10 mg d'ATIII dans 2 ml d'eau ppi, qu'on reprend ensuite dans 18ml de tampon de couplage (NaHCO3 0,2M, NaCI 0,5M, pH=8) à une concentration finale de 0,5 mg/ml (8,6 μM). On ajoute à la solution 34,4 mg d'enoxaparine® à une concentration finale de 1 ,4 mg/ml (215 μM).
La solution est mélangée dans un rapport 1 : 2 avec de la résine Sepharose
B activée au CNBr (Sigma) préparée suivant les indications du fabricant, puis est agitée doucement toute la nuit au froid. L'ensemble est ensuite transféré dans le tampon de blocage (volume à volume) et est agité pendant
16 h.
La résine est coulée dans une colonne XK16 thermostatée (Amersham) équipée de 2 pistons. Après décantation, elle est lavée 4 à 5 fois en alternant entre du tampon de blocage et du tampon de lavage. Après ce lavage, la colonne est abondamment rincée avec du tampon Tris-HCI 10 M, pH = 7,4 ; NaCI 3M, pour éliminer les molécules d'enoxaparine® complexées avec l'AT III.
Enfin, la colonne est équilibrée avec du tampon Tris HCI 10 mM, pH = 7,4 ; NaCI 0,4 M.
2. Séparation des espèces affines de l'enoxaparine® par chromatoqraphie d'affinité
On injecte dans la colonne une solution d'enoxaparine® à 1 mg/ml dans du tampon Tris HCI 10 mM, pH = 7,4 ; NaCI 0,4 M. La colonne est abondamment lavée avec le même tampon puis l'élution est réalisée avec du tampon Tris HC1 10 mM, pH = 7,4 ; NaCI 3 M.
Le comportement des espèces affines est suivi avec un détecteur UV à barrette de diode ( HP 1100) en mesurant l'absorbance des fractions à 232 nm. Comme le montre la fig. 1 , les espèces affines sont spécifiquement retenues sur la colonne et ne sont éluées qu'en présence de NaCI 3M.
Exemple 2 : Comparaison avec une autre colonne de chromatographie d'affinité
1. Capacité
Deux colonnes sont réalisées avec un protocole de greffage identique, sauf pour l'agent protecteur :
• Colonne 1 : Protection lors du greffage par 40 mg d'enoxaparine®
• Colonne 2 : Protection lors du greffage par 120 mg d'héparine La différence de quantité utilisée dans la protection est justifiée par la différence de masse moléculaire moyenne (un rapport d'approximativement 3,4). Afin de déterminer la capacité des colonnes, 400 μg d'une HBPM préparée ainsi que décrit dans l'exemple 7 de la demande internationale WO 02/08295 sont injectés dans chaque colonne, dans un tampon Tris-HCI 10 mM pH = 7,4 ; NaCI 0,2 M à un débit = 0,5 ml/min. L'élution est réalisée avec du NaCI 3M.
La séparation des différentes espèces polysaccharidiques est suivie par un détecteur UV à barrette de diode ( HP 1100) en mesurant l'absorbance des fractions à 232 nm.
Une séparation est observée sur les deux colonnes mais le profil de séparation est différent (Fig. 2). En particulier, le pic des espèces non retenues est largement traînant sur la colonne 2 (protection : héparine). De plus, la quantité éluée avec la colonne 2 (protection : héparine) semble être plus faible que celle éluée avec la colonne 1 (protection : enoxaparine®).
Pour vérifier quantitativement ce résultat qualitatif, le pourcentage d'espèces retenues est calculé grâce à l'intégration des aires effectuée sur le logiciel HP Chemstation® selon la formule :
% Espèces retenues = aire du pic d'élution / (aire du pic des espèces non retenues+aire du pic des espèces retenues)
Sachant que le pourcentage d'espèces affines dans une fraction hexasaccharidique de l'HBPM utilisée est estimé à 22-24 %, on a effectué une détermination approximative de la capacité en faisant varier la quantité injectée. La capacité correspond alors à la quantité maximale de HBPM injectée pour laquelle l'on obtient ce pourcentage de 22-24 % à l'élution.
On a ainsi trouvé que la capacité de la colonne 1 (protection : enoxaparine) est de 115,8 μg et que la capacité de la colonne 2 (protection : héparine) est de 64 μg. Sélectivité
On définit ici par sélectivité la capacité des résines à distinguer lors de la séparation les espèces polysaccharidiques affines des non affines.
Pour réaliser ces analyses, des injections de HBPM de quantité inférieure à la capacité précédemment déterminée ont été effectuées.
a. Colonne 1 (protection : enoxaparine®),
Les fractions affines et non affines après plusieurs injections de 427 μg de HBPM ont été réunies et analysées en CLHP CTA-SAX (MOURIER et al., 2004, Anal.Biochem., 332 : 299-313). La fraction affine obtenue est pure et complète, en ce qu'elle ne contient pas d'espèces non affines et qu'elle présente la totalité des hexasaccharides affins. La fraction non affine est de façon complémentaire totalement déplétée en espèce affines.
Pour corroborer l'analyse structurale, les activités anti-Xa des fractions affines et non affines séparées sur la colonne 1 (protection : enoxaparine®) ont été déterminées.
Celle de la fraction affine est égale à 818 ± 10 Ul/mg ; pour comparaison, l'activité de l'hexasaccharide ΔUA-(1→4)α-GlcNAc(6S)-(1→4)β-GlcA- (1 →4)α-GlcNS(NS,3,6S)-(1 →4)β-ldA2S-(1 →4)α-GlcNS(NS,6S) est d'environ 650-700 Ul/mg. Par contre, on a été totalement incapable de détecter une activité anti-Xa dans les fractions non affines.
Les analyses biologiques effectuées sur les fractions sont donc parfaitement en accord avec les analyses structurales.
b. Colonne 2 (protection : héparine)
Une étude similaire a été effectuée pour la colonne 2 (protection : héparine). Afin d'optimiser le fonctionnement de cette résine, les quantités injectées étaient néanmoins plus petites (60 μg), au regard de la capacité déterminée précédemment. La fraction affine n'est pas aussi pure que celle obtenue avec la colonne 1 (protection : enoxaparine®). On observe en effet la présence d'hexasaccharides non affins, en particulier d'hexasaccharides très sulfatés comme le ΔUA2S-(1→4)α-GlcNS(NS,6S)-(1→4)β-ldA2S-(1→4)α- GlcNS(NS,6S)-(1→4)β-ldA2S-(1→4)α-GlcNS(NS,6S) ou le ΔUA2S-(1→4)α- GlcNS(NS,6S)-(1 →4)β-ldA2S-(1 →4)α-GlcNS(NS,6S)-(1 →4)β-GlcA-(1 →4)α- GlcNS(NS,6S), en quantité non négligeable.
De plus, on retrouve dans la fraction non affine des espèces affines, en particulier l'espèce affine majoritaire : ΔUA-(1-»4)α-GlcNAc(6S)-(1-»4)β- GIcA-(I →4)α-GlcNS(NS,3,6S)-(1 →4)β-ldA2S-(1 →4)α-GlcNS(NS,6S).
Les titres des activités anti-Xa des fractions affines et non affines confirment les analyses structurales. En effet les fractions affines présentent une activité anti-Xa qui est seulement de 565 ± 45 Ul/mg. Par ailleurs, on observe une activité résiduelle non négligeable, d'environ 15 Ul/mg, dans la fraction non affine. Cette activité est le reflet des espèces affines résiduelles dans la fraction non affine mise en évidence lors de l'analyse structurale.
Il est donc clair que la sélectivité de la colonne 1 (enoxaparine ®) est supérieure à celle de la colonne 2 (héparine).

Claims

Revendications
1. Colonne de chromatographie d'affinité comprenant la protéine antithrombine III (ATIII) liée à un support solide caractérisée en ce que : a. la protéine ATIII est la protéine sauvage ou un variant de celle-ci, b. la protéine ATIII a été préalablement activée par incubation avec une héparine de bas poids moléculaire (HBPM) non modifiée et riche en espèces actives, c. la protéine ATIII est liée de façon covalente à une résine dans un rapport inférieur à environ 2 mg de protéine par ml de résine hydratée.
2. Colonne telle que définie à la revendication 1 caractérisée en ce que le rapport entre les quantités de sites liant ATIII présents dans HBPM et de molécules d'ATIII est compris entre environ 5 et environ 15.
3. Colonne telle que définie à la revendication 2 caractérisée en ce que ce rapport est d'environ 10.
4. Colonne telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la HBPM est l'enoxaparine ®.
5. Colonne telle que définie à la revendication 1 caractérisée en ce que le rapport ATMI/résine est compris entre 0,5 et 1 ,5 mg de protéine par ml de résine.
6. Procédé de purification des espèces affines de l'ATIII dans un échantillon comprenant des espèces affines et non affines de l'ATIII, ledit procédé comprenant : a. l'introduction dudit échantillon dans la colonne de chromatographie d'affinité selon la revendication 1 , ladite colonne étant préalablement équilibrée dans un tampon salin approprié ; b. le lavage des espèces non spécifiquement retenues de ladite colonne par un tampon salin de lavage approprié et c. l'élution des espèces spécifiquement retenues de ladite colonne par un tampon salin d'élution approprié.
7. Procédé de purification des espèces affines de l'ATIII selon la revendication 6 caractérisé en ce que lesdites espèces sont des oligosaccharides.
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